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WO2001019335A2 - Compositions destinees a une administration par voie muqueuse - Google Patents

Compositions destinees a une administration par voie muqueuse Download PDF

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Publication number
WO2001019335A2
WO2001019335A2 PCT/FR2000/002523 FR0002523W WO0119335A2 WO 2001019335 A2 WO2001019335 A2 WO 2001019335A2 FR 0002523 W FR0002523 W FR 0002523W WO 0119335 A2 WO0119335 A2 WO 0119335A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vesicles
antigen
use according
composition
administration
Prior art date
Application number
PCT/FR2000/002523
Other languages
English (en)
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WO2001019335A3 (fr
Inventor
Sophie Gaubert
René LAVERSANNE
Original Assignee
Capsulis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Capsulis filed Critical Capsulis
Priority to EP00962621A priority Critical patent/EP1212043A2/fr
Priority to CA002384876A priority patent/CA2384876A1/fr
Priority to JP2001522970A priority patent/JP2003509352A/ja
Priority to AU74284/00A priority patent/AU782653B2/en
Publication of WO2001019335A2 publication Critical patent/WO2001019335A2/fr
Publication of WO2001019335A3 publication Critical patent/WO2001019335A3/fr

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • compositions for mucosal administration are provided.
  • the present invention relates to novel compositions for administration via the mucosa. More particularly, it relates to a pharmaceutical composition, in particular a vaccine composition intended for administration by the mucous route.
  • It also relates to a method for producing antibodies, in particular IgA.
  • Mucosal administration non-invasive administration of the antigen to a mucous site, for example
  • Mucosal response response of the immune system to the mucous membranes characterized by production of IgA (isotype in high concentration in the mucous membranes) and of IgG and / or a cellular response within the mucous site and the draining glands.
  • Svstemic response generalized immune system response resulting in the presence of circulating antibodies (IgG and also IgA) and / or a cellular response (Thelper or CTL) in secondary lymphoid organs (spleen, lymph nodes).
  • Dissemination of the response installation of a mucosal response in other compartments than that of induction, due to the circulation and relocation of the induced lymphocytes to the site of administration (vaginal IgA after nasal administration for example).
  • Adjuvant substance added to the antigen so as to amplify and orient the specific immune response of this antigen.
  • Synthetic vector / vectorization inco oration of the antigen in or on the surface of a particle or vesicle, so as to protect the antigen and / or facilitate its capture by competent cells of the immune system and / or facilitate the preparation of the antigen by said cells, and thus to boost the immune response.
  • the addition of an empty vector to the free antigen provides little or no amplification.
  • mucous surfaces are considerable, on the one hand because they are present at the level of all the tracts and on the other hand because they are the first line of defense against the invasion of pathogenic agents.
  • the protection of the mucous surfaces is ensured both by innate or non-adaptive defense mechanisms (peristalsis, ciliated movements and mucus) and by the implementation of an adaptive cellular and humoral immune response specific to the pathogen which can generalize to other lymphoid organs. It is the lymphoid tissue associated with the mucous membranes (MALT) which is responsible for the specific component.
  • mucosal vaccination represents a considerable challenge .
  • HIV hepatitis
  • mucosal immunology For a fairly complete review of mucosal immunology, reference may be made to the "Handbook of mucosal immunology", edited by Pearay Ogra et al, 1994, Académie press, Inc. san Diego California, USA.
  • liposomes - low stability (liposomes), - low efficiency (liposomes).
  • Immunoglobulins or antibodies (Ac), associated with cellular components, are essential actors in the wild immune response against a pathogen.
  • Ig are highly specific proteins of the antigen
  • IgG In the blood compartment, the majority of the Ig produced are circulating IgG (subdivided into different subclasses), IgA and IgE remaining very minority. Conversely, the major isotype in the mucous membranes is IgA which is produced by the IgA plasma cells of the mucous lymphoid system and actively secreted by the epithehum of the mucous membrane.
  • IgA are specialized antibodies adapted to the defense of mucous surfaces constantly exposed to pathogens Adapts because, because of their biochemical structure (glycosylation, polymerization, secretory), they resist the effects of proteases secreted by microorganisms and because, unlike other isotypes, they limit the inflammatory reactions in these compartments in a state of constant activation Specialized, because they act several secreted levels, they agglutinate pathogens, limit by neutralizing the effects of toxins and the entry of pathogens; they can also act within the epithelium during their transcytosis or in the lamina prop ⁇ a. They therefore represent an essential active barrier which, associated with non-specific mechanisms, limit invasion by pathogens. Naturally, with the antibody response, there are associated cytotoxic and specific cellular responses which aim to eliminate the pathogen. If the local response is not sufficient, a systemic response is triggered.
  • parenteral administration of an antigen leads to the induction of specific circulating antibodies, of the IgG type. This type of injection does not make it possible to induce IgA within the mucous (or systemic) compartments. It is very clear that parenteral vaccination will not strengthen the local natural defenses necessary to fight against many respiratory or genital infections for example
  • mucous membrane requires, in relation to parenteral administration, the management of the antigen in the mucosa and therefore the penetration of the antigen, which implies that the antigen must be optimally presented in order to overcome non-specific defense mechanisms (ciliated movements, mucus) and to resist enzymes present in the mucosa or on its surface. It appears that these parameters are optimized by the structure of the vesicles during mucosal administration. These functions of the vesicles in mucosal administration were not necessarily present during parenteral administration, where the injection makes it possible to directly reach areas more favorable for capture by the cells of the immune system.
  • vesicles identical to those found in international application WO 99/16468 incorporating an antigen provoke an immune response much stronger than the administration of the free antigen
  • their administration incorporated within multilamellar vesicles with onion structure, makes it possible to induce a quite remarkable response
  • the induced response is found not only locally in the mucous compartment (response mucosa) but also in the blood circulation (systemic response)
  • these multilamellar vesicles are prepared from biocompatible constituents known for their harmlessness.
  • the preparation process is simple to implement and only uses common chemical devices. The fact that the process uses an initial lamellar phase at thermodynamic equilibrium gives it excellent reproducibility and allows great stability of the vesicles obtained
  • the invention relates to the use of multilamellar vesicles with an onion structure having an internal liquid-crystal structure formed by a stack of concent ⁇ que bilayers based on amphiphilic agents alternating with layers of water, aqueous solution or solution of a polar liquid and within which is found inco ⁇ or at least one antigen, for the manufacture of a composition, more particularly pharmaceutical, and in particular vaccine, intended for administration by mucous route.
  • the antigen (s) are an integral part of the entity formed by the vesicle. Indeed, one can find molecules of antigen (s) in any layer between the center and the periphery of said vesicle.
  • compositions used according to the invention allow the preparation of a mucous vaccine intended to induce a serum mucosal and or systemic response.
  • the onion-structured vesicles as defined above inco ⁇ orating an antigen induce, when administered by mucosa, in humans or animals, the production of antico ⁇ s.
  • one of the advantages of the invention is to induce a very large production of antico ⁇ s characterized by the presence of IgA and IgG. This implies an increase in the frequency of lymphocytes carrying IgA or IgG specific for the antigen.
  • the preparation can therefore be used for activation and differentiation of antigen-specific B lymphocytes which can then be used in cell fusion in order to produce monoclonal antibodies.
  • the specific lymphocytes present in large quantities in the ganglia draining the administration site can be immortalized by fusion with a non-secreting myeloma and lead to hybridomas secreting monoclonal antico ⁇ s.
  • the invention by its capacity to amplify and increase the antico ⁇ s responses, can also be used for the purpose of producing antico ⁇ s in particular polyclonal IgA, isotype difficult to generate in conventional procedures, or polyclonal IgG .
  • These antico ⁇ s can be used for non-therapeutic purposes, for example for research, more particularly for research in biology or immunology.
  • the invention also relates to a process for producing antico ⁇ s. and more particularly of IgA. Furthermore, it has been demonstrated that the composition of the invention, when administered via the mucous membrane, induces protection of the organism with regard to the infection for which the antigen incorporated in said is responsible. composition.
  • the invention relates to a method of treatment of human or animal co ⁇ s by vaccination by mucosa, according to which a composition containing multilamellar vesicles with onion structure having an internal c ⁇ stalquid structure formed is administered. of a stack of concentric bilayers based on amphiphilic agents alternating with layers of water, aqueous solution or solution of a polar liquid and within which there is inco ⁇ orated at least one antigen
  • compositions of the invention in which the antigen is found inco ⁇ orated in a vesicle with onion structure, as defined above allow, when 'They are administered via the mucosa, to elicit a mucosal immune response and to stimulate the lymphoi ' tissue of common mucosa.
  • Such capacities prove to be of particular importance when dealing with antigens with vaccinating potential, in the face of mvasive pathogens with mucous tropism.
  • the results obtained in the context of the invention demonstrate that the invention not only makes it possible to amplify the antico ⁇ s response, but that it also generates an immune response with protective efficacy against infection.
  • the invention is therefore applicable both to the production of antico ⁇ s, and to vaccination
  • the results obtained make it possible to affirm that the vesicles administered by mucous route, in particular by nasal route, can be used in order to induce or amplify the antico ants response in the mucous compartments, to disseminate this response to other sites more away from the administration site and generate a systemic response
  • the vesicles used according to the invention generally have diameters between 0.1 and 25 ⁇ m, preferably between 0.2 and 15 ⁇ m.
  • the vesicles used according to the invention preferably consist of several layers of amphiphilic agents alternating with layers of aqueous or polar phase.
  • the thickness of each of these layers is a molecular thickness, typically of the order of 5 to 10 nanometers.
  • a comp ⁇ s diameter between 0.1 ⁇ m and a few tens of micrometers. This is what is observed experimentally, the vesicles being observable by optical microscopy (in polarized light in order to have a better contrast linked to their birefringence), either as unresolved points for the smallest of them, or as birefringent spheres for larger ones.
  • the size profile can be studied using a laser granulometer (using the static scattering of a laser beam, analyzed from several angles).
  • a laser granulometer using the static scattering of a laser beam, analyzed from several angles.
  • the vesicles in which the antigen is found have, as previously explained, a multilamellar onion structure and are made up, from their center to their periphery, of a succession of lamellar layers separated by a liquid medium. These vesicles can be obtained by a process comprising the preparation of a crystalline lamellar phase and its transformation by application of a shear. Such a method is in particular described in patent WO 93/19735 from French patent FR-2 689 418 or WO 95/18601 introduced here by reference.
  • Such vesicles have, among other things, the advantage of being able to be prepared by a particularly simple preparation process making it possible to use a large variety of surfactants.
  • Another advantage hey also essentially to the process used to prepare the onion-structure vesicles used according to the invention, lies in the fact that the ingredients and the additives are incorporated prior to the formation of the vesicles, which allows a excellent encapsulation yield, hence better efficiency and very significant savings for extremely expensive molecules.
  • Such structures are advantageously obtained by inco ⁇ oration of at least one antigen in a c ⁇ stalquide lamellar phase comprising at least one surfactant, then transformation of this lamellar c ⁇ stalquide phase into a dense phase of small multilamellar vesicles.
  • the vesicles used according to the invention can be obtained according to a process according to which a lamellar crystal-liquid phase is incorporated which inco ⁇ or at least one antigen and the said crystal-liquid phase is reacted in multilamellar vesicles by application of a shear
  • This shear pou ⁇ a be a homogeneous shear, which has the advantage of leading to vesicles of perfectly homogeneous size.
  • simple mechanical stirring may prove to be sufficient to lead to the formation of the multilamellar vesicles of the invention.
  • the antigen may be any molecule for which it is desired to generate an immune response, whether it has an exogenous source such as an infectious pathogenic organism, parasites or microorganisms (yeasts, fungi, bacteria or viruses) or an intrinsic natural origin. (case of autoimmune diseases or cance ⁇ sation) It can be of different biochemical natures. It can, in particular, be an antigen chosen from the group consisting
  • the multilamellar vesicles with onion structure are prepared according to the methods previously described, in particular in international application WO 99/16468
  • the amphiphilic molecules used for their preparation will be chosen, without this being an obligation, from among the molecules described in the pharmacopoeia, or already used in drugs applied to the mucous membranes.
  • the membranes of the vesicles contained in the compositions of the invention contain at least one surfactant chosen from the group consisting of:
  • - Cg to C30 fatty acids saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, in the form of the acid or salt of an alkali, alkaline earth metal or of an amine, - esters, ethoxylated or not , of these same fatty acids and
  • - C 1 to C 30 fatty alcohols saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, ethoxylated or not, - ethers, ethoxylated or not, of these same fatty alcohols and
  • - copolymers of polyethylene glycol and of alkyl glycol for example the family of ELFACOS from AKZO NOBEL
  • - di- or triblock copolymers of ethers of polyethylene glycol and of polyalkylene glycol for example the family of ARLACELL from ICI
  • Co-surfactants may be added to these surfactants which can be used alone or as a mixture in order to improve the viscosity and the tightness of the membranes forming the vesicle.
  • these molecules there may be mentioned: - cholesterol and its derivatives, in particular charged or neutral cholesterol esters such as cholesterol sulfate
  • the formulation advantageously involves a mixture of surfactant molecules. It is generally used at least two different surfactants having different hydrophilic-lipophilic scales, which makes it possible to continuously adjust the properties of the bilayers and thus to control the appearance of the instability which governs the formation of multilamellar vesicles.
  • two surfactants having relatively different properties in particular a different hydrophilic-lipophilic balance (HLB).
  • the first surfactant will advantageously have a hydrophilic-lipophilic balance comp ⁇ se between 1 and 6, preferably between 1 and 4, while the second surfactant will have a hydrophilic-lipophilic balance between 3 and 15, preferably between 5 and 15
  • the preparation obtained after transformation of the c ⁇ stal-hquide lamellar phase into multilamellar vesicles can then be diluted, in particular with an aqueous solvent such as. for example, a buffer solution, a saline solution or a physiological solution, thereby obtaining an aqueous suspension of vesicles
  • an aqueous solvent such as. for example, a buffer solution, a saline solution or a physiological solution
  • the encapsulation technique used according to the present invention makes it possible to easily achieve very high encapsulation yields, or even close to 100%. However, such yields are not always essential depending on the intended applications.
  • the encapsulation yield of the antigen (s) in the compositions of the invention is advantageously greater than 50%, preferably greater than 80%
  • the structure of the vesicles is responsible for the particularly advantageous results obtained, and that the multilamellar vesicles of the invention allow the antigen to arrive intact up to the antigen presenting cells (APC) and to promote its capture. by these cells. So it looks good that the function of the vesicles of the invention is to vectorize, protect and improve the capture of the antigen by the immune system.
  • APC antigen presenting cells
  • Another advantage of the technology is that we can add to this formulation natural or artificial polymers such as polysaccha ⁇ des (alginates, chitosan, etc.) in order to strengthen the solidity of the vesicle, and allow it to stay longer on the site of administration or in the organism, thus delivering the antigen over a longer time.
  • These polymers can be incorporated in the vesicle as well as deposited around it in the form of a coating.
  • the vesicle or the particle formed from vesicles coated in the polymeric mat ⁇ ce has a diameter greater than that of the vesicles alone.
  • These polymers can optionally be crosslinked to further strengthen their solidity.
  • the formulation can be supplemented by the addition of immunomodulating molecules (chitosan, interleukmes 7) which will reinforce by their intrinsic properties the amplification and the orientation of the immune response.
  • immunomodulating molecules chitosan, interleukmes
  • the vesicles inco ⁇ orating the antigens are advantageously prepared in a process consisting in preparing, firstly, the lamellar phase. This is obtained by simple mixing of the ingredients, in an order determined by the experimenter according to the miscibihtees of each of the constituents. It may be necessary to heat certain pasty or solid constituents in order to facilitate their inco ⁇ oration.
  • the antigen is added preferably at the end of the mixture in order to avoid it being subjected to an excessively high temperature. It is also possible to prepare a mixture of all the constituents except for the antigen or its aqueous solution in the form of a “stock” mixture which will be used as necessary to prepare the lamellar phase.
  • the aqueous solution can contain different constituents intended to ensure its biological compatibility and in particular buffer mixtures but also different antigens.
  • the lamellar phase thus prepared is then subjected to moderate shearing (from 0 to 1000 s ⁇ 1 ) for a limited time (from 0 to 60 minutes).
  • this shearing is obtained directly by the action of the device used for mixing.
  • it can be obtained by hand by mixing the preparation using a microspatula in an Eppendorf type tube.
  • the sheared lamellar phase is then dispersed in a final medium, in the form of water. or a stamp, identical or different from that used during of the preparation of the lamellar phase.
  • This dispersion is advantageously carried out at room temperature (20-25 ° C) by slow addition of the medium to the lamellar phase with constant stirring.
  • a preservative and possibly other additives intended to complete the galenical formulation can be added to the product.
  • compositions previously determined comprising at least one inco ⁇ orated antigen within the vesicles with a lamellar structure onion have the advantage of being able to be used for administration by mucous route and very particularly by nasal route and of inducing a mucosal response and / or systemic.
  • Figures 1 and 2 given with reference to this example bring together the responses obtained on the one hand in different mucous samples (Figure 1) and on the other hand in the sera of animals (group II) in comparison with those obtained by administration either of compositions in which the same antigen is free (group II), or of compositions containing the same but empty vesicles (group III).
  • Example II illustrates a method of immunization with FHA. The results obtained in this example are illustrated by Figures 3, 4 and 5 which respectively show
  • HSA human serum albumin
  • the components are sterilized by UV irradiation for 60 min.
  • Containers and accessories (spatulas, stirrers ...) are sterilized with the flame just prior use.
  • the constituents O to ⁇ are introduced into a piluher, in an indifferent order, then heated at 80 ° C. for 60 min with very strong magnetic stirring. The total dissolution of the constituents ⁇ and ⁇ is checked by microscopic observation.
  • the preparation is then dispersed at 33.33% in sterile 1x PBS.
  • the sou ⁇ s were divided into 4 groups noted I to IV, group IV constituting a control group (unimmunized mice also called naive mice) and the other groups being subjected to an immunization protocol as defined above using the following products • - group I:
  • Encapsulated HSA 20 ⁇ l per nostril of vesicles according to the invention inco ⁇ orating HSA which corresponds to 80 ⁇ g of HSA per mouse
  • mice The trachea of the mice is cannulated using a probe and 750 ⁇ l of PBS are injected slowly so as not to create hemorrhage, the lungs are thus washed 3 times with the same solution, the sample is then centrifuged in order to remove lung cells and separate into aliquots kept at -20 ° C until assay.
  • Intestinal washes The intestine is removed, released from the mesentery and rinsed in water to remove outside blood. It is then cut longitudinally and incubated on ice in 1 ml of a washing solution enriched in protease inhibitor. The whole is centrifuged and the supernatant is collected and frozen at -20 ° C.
  • the specific HSA antico danss present in the sera and secretions are assayed by ELISA technique in which the IgA and IgG specific for HSA are determined (biotinylated anti-IgA / Streptavidin peroxidase, anti-IgG peroxidase).
  • the results are expressed in mean titer determined relative to a reference serum of naive mouse and corresponding to the inverse of the dilution equal to the reference threshold.
  • the specific isotype response of HSA predominant in the intestine and the vagina is IgA.
  • IgG H + L titration of IgG H + L could not be performed in vaginal lavage, experiments similar tests performed with another antigen indicate the predominance of IgA in vaginal secretions.
  • the FHA protein is a filamentous adhesin from Bo detella pertussis. pertussis bacteria Unlike HSA previously used, FHA is more immunogenic and therefore capable of inducing an antico ⁇ s response by itself This protein is one of the protective antigens contained in commercial pertussis vaccines Finally, the mu ⁇ n model can be infects with Bordetella pertussis and it is thus possible to carry out an infection test following mucosal immunization and to show the protective character of the response induced by the immunization A - Induction of antibodies
  • the operating procedure for the preparation is similar to that of Example 1.
  • the finished product has an FHA concentration of 3 ⁇ g per 40 ⁇ l.
  • the mucosal immunization and sampling protocol is identical to what was described in Example 1. Two groups of 5 animals were formed, the group I receiving the antigen encapsulated in the vesicles, and group II receiving the non-encapsulated antigen, in solution in PBS. At each immunization, each animal receives 3 ⁇ g of FHA, divided into two instillations, one in each nostril.
  • the specific FHA antico ⁇ s present in the serums and secretions are doses by ELISA technique according to a protocol identical to that dec ⁇ t in Example 1, with the reagents specific to the FHA antigen.
  • FIGS. 3 and 4 The results are presented in FIGS. 3 and 4, where the mean titers of IgA and IgG antico ⁇ s in the mucous secretions (FIG. 3) and in the serum (FIG. 4) are given for the two groups I and II.
  • the mucous secretions are respectively studied as in Example I, from broncho-alveolar washes (A), intestinal washes (B) and vaginal washes (C).
  • mice immunized with the antigen incorporated in the vesicles of the invention (FIG. 3) all of the animals respond to the antigen whereas when the free antigen is administered, only 1/5 of the animals are responders and this in a very weak way.
  • results of this example 2 completely confirm those obtained on HSA. They make it possible to affirm that the vesicles administered by the nasal route can be used in order to induce or amplify the antico ⁇ s response in the mucous compartments. disseminate this response to other sites further away from the administration site and generate a systemic response.
  • the formulation and the preparation of the vesicles are stnctement identical to that previously used for the caracté ⁇ sation of the response antico ⁇ s.
  • mice Three groups of mice are used:
  • mice Sou ⁇ s immunized with the inco ⁇ orated antigen in the vesicles of the invention IL Mice immunized with free antigen in solution in PBS III. Unimmunized mice
  • Each group consists of 4 mice, immunized at the same time, with the same batch of antigen, in order to be able to carry out all the infection measurements under the same conditions.
  • mice Four weeks after the second immunization, the mice are anesthetized and infected with Bordetella pertussis by the nasal route (5.10 7 bacteria / mice administered in 20 ⁇ l) and the initial infectious load is checked as early as 3 hours after infection.
  • mice are sacrificed and their lungs are removed at various times after infection and diluted in PBS until a homogeneous suspension is obtained. Different dilutions of the suspension are spread on a specific nutet medium of Bordetella and the colonies are counted after three days of growth.
  • mice immunized with the inco incorated antigen in vesicles of the invention mice immunized with the inco incorated antigen in vesicles of the invention.
  • Group II mice immunized with free antigen in solution in
  • Group III non-immunized mice.
  • mice immunized with the antigen inco ⁇ oré in the vesicles of the invention have a lower bacterial load (factor of 2) than that of mice immunized with the free antigen, and much lower than that of unimmunized mice (factor 8).
  • factor 2 the bacterial load
  • the mice immunized with the free antigen as well as the non-immunized mice see their bacterial load increase, the mice immunized with the incororated antigen in the vesicles of the invention have fewer bacteria on D5 than on D3 indicating a favorable evolution of the disease.
  • the number of bacterial colonies in the group immunized with the inco ⁇ orated antigen in the vesicles of the invention is 6 times lower than in the group immunized with free FHA and 13 times lower than in the group not immune indicating good protection.

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle utilisation de vésicules multilamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqeuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène, pour la fabrication d'une composition notamment pharmaceutique et plus particulièrement vaccinale destinée à une administration par voix muquese pour induire une réponse muqueuse et/ou systémique sérique et/ou pour protéger l'organisme à l'égard de l'infection dont est responsable ledit antigène. L'invention concerne également un procédé de vaccination par voie muqueuse et un procédé de production d'anticorps, notamment d'IgA. L'invention s'applique tout particulièrement dans le cas d'une administration par voie nasale.

Description

Compositions destinées à une administration par voie muqueuse.
La présente invention concerne de nouvelles compositions destinées à une administration par voie muqueuse. Plus particulièrement, elle concerne une composition pharmaceutique, notamment vaccinale destinée à une administration par voie muqueuse.
Elle concerne également un procédé de production d'anticorps, notamment d'IgA.
On donne ci-après quelques définitions : Administration par voie muqueuse : administration non invasive de l'antigène à un site muqueux, par exemple
- aire naso-pharyngée
- aire buccale
- arbre bronchique - intestin
- tractus uro-génital
- oreille interne
- conjonctive
- glandes mammaires, salivaires et lacrymales. Parmi ces différents constituants du tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT), certaines voies d'introduction sont d'un accès et d'une acceptabilité plus aisés : nasale, buccale, gastro-intestinale, rectale et vaginale. Réponse muqueuse : réponse du système immunitaire au niveau des muqueuses caractérisée par une production d'IgA (isotype en concentration importante dans les muqueuses) et d'IgG et/ou une réponse cellulaire au sein du site muqueux et des ganglions drainants.
Réponse svstémique : réponse du système immunitaire généralisée se traduisant par la présence d'anticorps circulants (IgG et aussi IgA) et/ou une réponse cellulaire (Thelper ou CTL) dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions).
Dissémination de la réponse : installation d'une réponse muqueuse dans d'autres compartiments que celui de l'induction, du fait de la circulation et de la relocalisation des lymphocytes induits au site d'administration (IgA vaginales après administration nasale par exemple). Adjuvant : substance ajoutée à l'antigène de manière à amplifier et orienter la réponse immunitaire spécifique de cet antigène. Vecteur synthétique/vectorisation : inco oration de l'antigène dans ou à la surface d'une particule ou vésicule, de manière à protéger l'antigène et/ou à faciliter sa capture par les cellules compétentes du système immunitaire et/ou à faciliter l'apprêtement de l'antigène par lesdites cellules, et ainsi à amplifier la réponse immunitaire. L'addition d'un vecteur vide à l'antigène libre n'apporte pas ou peu d'amplification.
Jusqu'à récemment, les vaccins étaient obtenus à partir de microorganismes tués, atténués ou moins virulents. L'industrie pharmaceutique aujourd'hui cherche à éviter cette approche à la fois pour des raisons de limitation des effets secondaires, de facilité de production, de sécurité d'administration et d'efficacité.
Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la production industrielle de sous-unités de ces micro-organismes en particulier des protéines dites recombinantes, qu'elles soient membranaires, nucléaires ou cytoplasmiques. Malheureusement ces sous-unités ne sont pas assez immunogènes par elles-mêmes pour apporter une réponse suffisante dans l'optique de la vaccination.
Elles ont besoin d'être adjuvantées ou vectorisées pour induire une réponse suffisante.
Aujourd'hui, les seuls adjuvants acceptés en médecine humaine sont l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium ainsi que le phosphate de calcium. Ces sels se présentent sous la forme d'une suspension de grains de sel d'aluminium ou de calcium, à la surface desquels est adsorbé l'antigène. Ils présentent plusieurs inconvénients : ils induisent des réactions locales inflammatoires et la production d'IgE. ils ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et ils sont incapables d'engendrer des réactions à médiation cellulaire de type CTL. De fait, ils ne sont pas utilisés jusqu'à présent dans le cas d'administration par voie muqueuse.
Or, l'importance des surfaces muqueuses est considérable, d'une part parce qu'elles sont présentes au niveau de tous les tractus et d'autre part parce qu'elles sont la première ligne de défense contre l'invasion des agents pathogènes. La protection des surfaces muqueuses est assurée à la fois par des mécanismes de défense innés ou non adaptatifs (péristaltisme, mouvements ciliés et mucus) et par la mise en place d'une réponse immune cellulaire et humorale adaptative spécifique de l'agent pathogène qui peut se généraliser aux autres organes lymphoïdes. C'est le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) qui est responsable de la composante spécifique. A cet égard, la vaccination par voie muqueuse représente un enjeu considérable.
Aujourd'hui, tous les vaccins sauf celui contre la poliomyélite sont injectables, ce qui implique : - Une médicalisation
- Un mauvais accueil
- Un inconfort (fièvre, douleur au site d'injection...)
- Des πsques de contamination (HIV, hépatites)
- Un coût élevé dans les pays en voie de développement L'administration par voie muqueuse présenterait un avantage pour différentes raisons :
- des coûts de production moins élevés liés a des conditions de préparation moins contraignantes que celles pour un vaccin injectable
- son caractère non invasif qui élimine les problèmes liés à l'injection décrits ci-dessus
Pour cela, elle devrait :
- procurer une immunité aux sites d'administration muqueux, permettant de renforcer par une réponse spécifique la barrière muqueuse, d'où un intérêt pour les infections transmissibles par voie muqueuse (aériennes, génitales....)
- procurer une immunité systemique et une réponse effectπce généralisée suite a une administration aisée
- ne pas entraîner d'effets secondaires (irritation locale).
Pour une revue assez complète sur l'immunologie des muqueuses on pourra se reporter au "Handbook of mucosal immunology", édité par Pearay Ogra et al, 1994, Académie press, Inc. san Diego Californie, USA.
De nombreux essais et études ont été réalisés afin de développer de nouveaux adjuvants et vecteurs capables d'induire une réponse muqueuse et systemique efficace en terme de protection contre l'agent pathogène. Différents travaux portent sur l'utilisation de vecteurs vivants recombinants (bactéries ou virus atténués), de vecteurs synthétiques (complexes immunostimulants encore appelés iscoms, ce qui correspond à une abréviation de l'expression anglaise "immunostimulating complexes", liposomes, microsphères...) ou de toxines de micro-organismes (toxine choléπque -CT- ou toxine thermolabile d'E. Coli -LT-) Cependant, une grande partie de ces études est encore au stade de la mise au point et la majorité des formulations présentent des inconvénients : - haute toxicité (CT et LT) et donc impossibilité d'utilisation chez l'homme,
- difficultés de préparation (microsphères),
- faible stabilité (liposomes), - faible efficacité (liposomes).
Plusieurs brevets concernent l'administration par voie muqueuse d'antigènes, vectorisés ou adjuvantes par différents systèmes. On peut citer :
- EP 0 440 289 (Duphar) qui décrit l'utilisation de liposomes en mélange avec un antigène pour la vaccination contre la grippe. Il s'agit là d'un effet adjuvant des lipides, le même résultat étant obtenu lorsque l'antigène est mélangé extemporanément avec les liposomes vides.
- WO 98/10748 (The School of Pharmacy) utilisant des liposomes cationiques, dans le cas d'une injection ou d'une administration par voie muqueuse, - US 5,679,355 (Proteus) décrivant des vésicules non ioniques, qui peuvent être administrées par voie parentérale ou muqueuse (surtout orale).
D'autre part, une très abondante littérature scientifique décrit l'utilisation de microparticules polymères comme vecteur d'antigène par voie muqueuse. Une bonne revue de cette littérature peut être trouvée dans : D. T. O'HAGAN, Adv. Drug Deliv. Rev., 34 ( 1 198) 305-320.
Cependant, aucune de ces technologies n'a abouti aujourd'hui à un produit sur le marché. Les méthodes de présentation de l'antigène doivent donc encore être améliorées et le développement de nouveaux adjuvants ou vecteurs d'antigènes demeure un besoin urgent dans l'industrie du vaccin. Parmi les vésicules, objets sphériques formés d'arrangement moléculaires de molécules amphiphiles, les vésicules multilamellaires à structure en oignon ont fait l'objet d'importantes recherches et ont donné lieu à plusieurs brevets (WO 93/19735 ; WO 95/18601 ; WO 97/00623 ; WO 98/02144 ; WO 99/16468). Elles se distinguent des liposomes par : - leur mode de préparation qui part d'une phase lamellaire à l'équilibre thermodynamique
- leur structure interne cristal-liquide formée d'un empilement régulier de bicouches concentriques d'amphiphiles alternant avec des couches d'eau ou de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire (glycérol, par exemple) - la nature variée des molécules amphiphiles qui peuvent être utilisées pour les constituer, seules ou en mélange. La demande internationale WO 99/16468 décπt des vésicules à structure en oignon incorporant en leur sein un antigène et permettant d'amplifier la réponse immunitaire de cet antigène. Cette demande internationale qui décπt pour la première fois l'incorporation (également désignée dans ce document par encapsulation) d'antigènes au sein d'une vésicule multilamellaire à structure en oignon montre clairement dans ses exemples qu'une telle encapsulation permet très nettement d'amplifier la réponse immunitaire lors d'une administration parentérale d'un antigène encapsulé dans une vésicule multilamellaire à structure en oignon. Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert que l'administration par voie muqueuse, en particulier nasale, des compositions du type de celles décπtes dans la demande WO 99/16468, engendre une réponse immunitaire non seulement au sein de différents sites muqueux mais également dans le compartiment systemique Cette réponse est caractéπsée par l'induction d'immunoglobuline A (IgA). Un tel résultat n'était nullement évident au vu de la demande WO 99/16468 puisque dans les conditions où était faite l'injection dans les exemples de cette demande, l'antigène, même sous forme encapsulée, n'induisait pas de réponse IgA détectable.
Les immunoglobulines (Ig) ou anticorps (Ac), associés a des composants cellulaires, sont des acteurs essentiels dans la réponse immunitaire dingee contre un pathogène. Les Ig sont des protéines hautement spécifiques de l'antigène
Différentes classes d'anticorps ont ete répertoriées, qui se distinguent par leur mode d'induction, leur localisation et leur fonction (reconnaissance, neutralisation d'activité toxique ou enzymatique)
Dans le compartiment sanguin, la majorité des Ig produites sont des IgG circulantes (sub-divisees en différentes sous-classes), les IgA et les IgE restant très minoritaires. A l'inverse, l'isotype majeur dans les muqueuses est l'IgA qui est produite par les plasmocytes a IgA du système lymphoide muqueux et sécrétée activement par l'epithehum de la muqueuse
Les IgA sont des anticorps spécialises et adaptes à la défense des surfaces muqueuses constamment exposées aux pathogènes Adaptes, car, du fait de leur structure biochimique (glycosylation, polymérisation, pièce secretoire), ils résistent aux effets des proteases sécrétées par les micro-organismes et car, contrairement aux autres isotypes, ils limitent les reactions inflammatoires dans ces compartiments en état d'activation constant Spécialises, car ils agissent a plusieurs niveaux sécrétés, ils agglutinent les pathogènes, limitent par neutralisation les effets des toxines et l'entrée des pathogènes ; ils peuvent également agir au sein de l'épithélium au cours de leur transcytose ou dans la lamina propπa. Ils représentent donc une barrière active essentielle qui, associée à des mécanismes non spécifiques, limitent l'invasion par les pathogènes. Naturellement, à la réponse anticorps, s'associent des réponses cellulaires cytotoxiques et spécifiques qui visent à éliminer le pathogène. Si la réponse locale ne suffit pas, une réponse systemique est enclenchée.
Une des caractéπstiques très intéressantes du système immunitaire muqueux est la recirculation des lymphocytes B et T induits à un site muqueux et leur possible domiciliation dans d'autres sites que ceux de l'induction, propageant ainsi la réponse spécifique aux autres tractus Ce phénomène est très intéressant en terme de vaccination
Alors que les mécanismes d'induction d'une réponse immune muqueuse sont en cours d'élucidation, il reste souvent extrêmement difficile d'induire une réponse muqueuse par l'administration parentérale d'un antigène (adjuvante ou non) et même par administration muqueuse de l'antigène. En effet, l'administration par voie parentérale d'un antigène conduit à l'induction d'anticorps spécifiques circulants, de type IgG. Ce type d'injection ne permet pas d'induire des IgA au sein des compartiments muqueux (ni systemique). Il est très clair que la vaccination parentérale ne renforcera pas les défenses naturelles locales nécessaires pour lutter contre beaucoup d'infections respiratoires ou génitales par exemple
Pour ces différentes raisons, il est tout à fait surprenant, même au vu de l'enseignement de WO 99/16468 que le même antigène incorporé dans les mêmes vésicules, administrées par voie muqueuse (nasale) induise non seulement une réponse systemique (IgG dans les serums) confirmant par une autre voie les précédents résultats, mais également une réponse dans les sites muqueux L'incorporation de l'antigène dans les vésicules a structure en oignon engendre la production d'IgA dans le compartiment hé au site d'administration (broncho- pulmonaire) mais aussi dans les autres compartiments muqueux avec une prédominance dans les sécrétions génitales De plus, il faut noter que l'albumine de sérum humain (HSA). utilisée a titre d'exemple, est un antigène très faiblement immunogene, qui, administré par voie nasale, seul, sans être incorporé dans des vésicules est incapable d'induire une quelconque réponse qu'elle soit muqueuse ou systemique De plus, on peut remarquer que l'administration par voie muqueuse nécessite par rapport à l'administration parentérale la prise en charge de l'antigène dans la muqueuse et donc la pénétration de l'antigène, ce qui implique que l'antigène doit être présenté de manière optimale afin de dépasser les mécanismes de défense non spécifiques (mouvements ciliés, mucus) et de résister aux enzymes présents dans la muqueuse ou à sa surface. Il apparaît que ces paramètres sont optimisés par la structure des vésicules lors de l'administration muqueuse. Ces fonctions des vésicules dans l'administration muqueuse n'étaient pas nécessairement présentes lors de l'administration parentérale, où l'injection permet d'atteindre directement des zones plus favorables a une capture par les cellules du système immunitaire.
Le résultat observe par administration muqueuse n'est donc pas une simple extrapolation du résultat obtenu par administration parentérale, mais la mise en évidence d'une nouvelle fonctionnalité des vésicules à structure en oignon.
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert que des vésicules identiques à celles décπtes dans la demande internationale WO 99/16468 incorporant un antigène provoquaient une réponse immunitaire beaucoup plus forte que l'administration de l' antigène libre De plus, pour certains antigènes qui n'induisent aucune réponse par administration muqueuse, leur administration, incorpores au sein de vésicules multilamellaires a structure en oignon, permet d'induire une réponse tout a fait remarquable Enfin la réponse induite se retrouve non seulement au niveau local dans le compartiment muqueux (réponse muqueuse) mais aussi dans la circulation sanguine (réponse systemique seπque)
D'autre part, ces vésicules multilamellaires sont préparées a partir de constituants biocompatibles connus pour leur innocuité De plus, le procédé de préparation est de mise en œuvre simple et ne fait appel qu'a des appareils courants de la chimie Le fait que le procédé fasse appel a une phase lamellaire initiale a l'équilibre thermodynamique lui donne une excellente reproductibihte et permet une grande stabilité des vésicules obtenues
Ainsi, selon l'une de ses caracteπstiques essentielles, l'invention concerne une utilisation de vésicules multilamellaires a structure en oignon présentant une structure interne cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentπques a base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incoφoré au moins un antigène, pour la fabrication d'une composition, plus particulièrement pharmaceutique, et notamment vaccinale, destinée à une administration par voie muqueuse.
Par le terme "incoφoré" dont l'utilisation nous semble préférable à celle du terme "encapsulé", on entend que le ou les antigènes font partie intégrante de l'entité constituée par la vésicule. En effet, on peut trouver des molécules d'antigène(s) dans n'importe quelle couche comprise entre le centre et la périphérie de ladite vésicule.
Comme cela ressort de la description détaillée qui suit ainsi que des exemples, les compositions pharmaceutiques utilisées selon l'invention permettent la préparation d'un vaccin muqueux destiné à induire une réponse muqueuse et ou systemique sérique.
Ainsi que cela ressort clairement des exemples, les vésicules à structure en oignon telles que définies précédemment incoφorant un antigène induisent, lorsqu'elles sont administrées par voie muqueuse, chez l'homme ou l'animal, la production d'anticoφs.
Comme il a été indiqué, un des avantages de l'invention est d'induire une production d'anticoφs très importante caractérisée par la présence d'IgA et d'IgG. Cela implique une augmentation de la fréquence des lymphocytes portant des IgA ou des IgG spécifiques de l'antigène. La préparation peut donc être utilisée à des fins d'activation et de différenciation de lymphocytes B spécifiques de l'antigène qui peuvent alors être utilisés en fusion cellulaire afin de produire des anticoφs monoclonaux. En effet, les lymphocytes spécifiques, présents en grande quantité dans les ganglions drainant le site d'administration peuvent être immortalisés par fusion avec un myélome non sécréteur et conduire à des hybridomes sécréteurs d'anticoφs monoclonaux.
L'invention, de par sa capacité à amplifier et augmenter les réponses anticoφs, peut être utilisée également à des fins de production d'anticoφs en particulier d'IgA polyclonales, isotype difficile à générer dans les modes opératoires classiques, ou d'IgG polyclonales. Ces anticoφs peuvent être utilisés pour des buts non thérapeutiques, par exemple pour la recherche, plus particulièrement pour la recherche en biologie ou en immunologie.
Les méthodes de prélèvement et de purification des anticoφs sont connues de l'homme de l'art. Ainsi donc, l'invention concerne également un procédé de production d'anticoφs. et plus particulièrement d'IgA. Par ailleurs, il a été mis en évidence que la composition de l'invention, lorsqu'elle est administrée par voie muqueuse, induit une protection de l'organisme à l'égard de l'infection dont est responsable l'antigène incoφoré dans ladite composition. Ainsi, selon une autre de ses caractéπstiques essentielles, l'invention concerne un procédé de traitement du coφs humain ou animal par vaccination par voie muqueuse selon lequel on administre une composition contenant des vésicules multilamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cπstal- quide formée d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incoφoré au moins un antigène
Comme cela ressort de la descπption et des exemples qui suivent, il s'est avère que les compositions de l'invention dans lesquelles l'antigène se trouve incoφoré dans une vésicule à structure en oignon, telle que définie ci-dessus, permettent, lorsqu'elles sont administrées par voie muqueuse, d'engendrer une réponse immune muqueuse et de stimuler le tissu lymphoi'de muqueux commun. De telles capacités se révèlent d'une importance particulière lorsque l'on s'adresse à des antigènes à potentiel vaccinant, face à des pathogènes mvasifs a tropisme muqueux
La double possibilité d'induire à la fois une réponse muqueuse et une réponse systemique présente un grand intérêt en vaccination car elle simplifie l'administration tout en offrant une immunité a plusieurs niveaux muqueux pour défendre les voies d'accès aux micro-organismes et systemiques pour les infections plus disséminées ou généralisées
Par ailleurs, les résultats obtenus dans le cadre de l'invention, démontrent que l'invention permet non seulement d'amplifier la réponse anticoφs, mais qu'elle génère de plus une réponse immunitaire a efficacité protectrice contre l'infection L'invention est donc applicable aussi bien à la production d'anticoφs, qu'à la vaccination
Les résultats obtenus permettent d'affirmer que les vésicules administrées par voie muqueuse, en particulier par voie nasale, peuvent être utilisées afin d'induire ou d'amplifier la réponse anticoφs dans les compartiments muqueux, de disséminer cette réponse a d'autres sites plus éloignes du site d'administration et de générer une réponse systemique Les vésicules utilisées selon l'invention, ont généralement des diamètres compris entre 0,1 et 25 μm, de préférence entre 0,2 et 15 μm.
Plus précisément, les vésicules utilisées selon l'invention sont de préférence constituées de plusieurs couches d'agents amphiphiles alternant avec des couches de phase aqueuse ou polaire. L'épaisseur de chacune de ces couches est une épaisseur moléculaire, typiquement de l'ordre de 5 à 10 nanomètres. Pour un empilement d'une dizaine à quelques centaines de couches, on obtient donc un diamètre compπs entre 0,1 μm et quelques dizaines de micromètres. C'est ce qui est observé expéπmentalement, les vésicules étant observables en microscopie optique (en lumière polarisée afin d'avoir un meilleur contraste lié à leur biréfringence), soit comme des points non résolus pour les plus petites d'entre elles, soit comme des sphères biréfringentes pour les plus grosses. Le profil de tailles peut être étudié à l'aide d'un granulomètre laser (utilisant la diffusion statique d'un faisceau laser, analysée sous plusieurs angles). On obtient en général un profil gaussien centré sur une valeur vaπant entre 0,1 et 25 μm montrant une faible hétérogénéité de la taille pour une formulation donnée, dans des conditions opératoires de préparation données.
Les vésicules dans lesquelles se trouve incoφoré l'antigène ont, comme exposé précédemment, une structure multilamellaire en oignon et sont constituées, de leur centre jusqu'à leur péπphéπe, d'une succession de couches lamellaires séparées par un milieu liquide. Ces vésicules peuvent être obtenues par un procédé comprenant la préparation d'une phase lamellaire cπstal- quide et sa transformation par application d'un cisaillement. Un tel procédé est en particulier décrit dans le brevet WO 93/19735 issu du brevet français FR-2 689 418 ou WO 95/18601 introduits ici par référence.
Selon le brevet français FR-2 689 418, cette transformation peut être faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la phase cπstal-hquide. ce qui conduit à des vésicules encore appelées microcapsules de taille contrôlée. Toutefois, en jouant sur la formulation de la phase lamellaire cristal-liquide, en particulier sur la nature des tensioactifs entrant dans sa composition, la transformation de cette phase cπstal- quide en vésicules peut être obtenue par simple sollicitation mécanique, en particulier lors du mélange des constituants.
De telles vésicules présentent, entre autres, l'avantage de pouvoir être préparées par un procédé de préparation particulièrement simple permettant d'utiliser une grande vaπété de tensioactifs. Un autre avantage, hé lui aussi essentiellement au procédé utilisé pour préparer les vésicules à structure en oignon utilisées selon l'invention, réside dans le fait que l'on incoφore les actifs et les additifs préalablement à la formation des vésicules, ce qui permet un excellent rendement d'encapsulation, d'où une meilleure efficacité et une économie très importante pour des molécules extrêmement coûteuses.
De telles structures sont avantageusement obtenues par incoφoration d'au moins un antigène dans une phase lamellaire cπstal- quide comprenant au moins un agent tensioactif puis transformation de cette phase cπstal- quide lamellaire en une phase dense de vésicules multilamellaires de petite taille.
Ainsi, les vésicules utilisées selon l'invention peuvent être obtenues selon un procédé selon lequel on prépare une phase cristal-liquide lamellaire incoφorant au moins un antigène et on provoque le reaπangement de ladite phase cristal-liquide en vésicules multilamellaires par application d'un cisaillement Ce cisaillement pouπa être un cisaillement homogène, ce qui présente l'avantage de conduire à des vésicules de taille parfaitement homogène. Toutefois, une simple agitation mécanique pourra s'avérer suffisante pour conduire à la formation des vésicules multilamellaires de l'invention.
L'antigène pourra être toute molécule pour laquelle on souhaite engendrer une réponse immunitaire, qu'il ait une oπgine exogène tel qu'un organisme pathogène infectieux, parasites ou micro-organismes (levures, champignons, bactéries ou virus) ou une origine naturelle intrinsèque (cas des maladies auto-immunes ou de la canceπsation) Il peut être de différentes natures biochimiques. II peut, en particulier, s'agir d'un antigène choisi dans le groupe constitué
- des protéines, en particulier des protéines extraites ou recombinantes, glycosylees ou non,
- des peptides, - des popeptides,
- des polysacchaπdes, ou représentant un mélange de plusieurs de ces composants
Les vésicules multilamellaires a structure en oignon sont préparées selon les méthodes decπtes précédemment, en particulier dans la demande internationale WO 99/16468 Les molécules amphiphiles utilisées pour leur préparation seront choisies, sans que cela soit une obligation, parmi les molécules faisant l'objet d'une description dans la pharmacopée, ou déjà utilisées dans des médicaments appliqués aux muqueuses.
Selon une variante avantageuse, les membranes des vésicules contenues dans les compositions de l'invention contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué :
- des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés,
- des acides gras en Cg à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, sous forme d'acide ou de sel d'un métal alcalin, alcalino-terreux ou d'une aminé, - des esters, éthoxylés ou non, de ces mêmes acides gras et
. de saccharose,
. de sorbitan,
. de mannitoi,
. de glycérol ou de polyglycérol, . de glycol,
- des mono-, di- ou triglycérides ou des mélanges de glycérides de ces mêmes acides gras,
- des alcools gras en C^ à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, éthoxylés ou non, - des éthers, éthoxylés ou non, de ces mêmes alcools gras et
. de saccharose,
. de sorbitan,
. de mannitoi,
. de glycérol ou de polyglycérol, . de glycol,
- des huiles végétales polyéthoxylées, hydrogénées ou non hydrogénées,
- des polymères séquences de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène (poloxamères),
- de l'hydroxystéarate de polyéthylèneglycol, - des alcools à squelette stérol tel que le cholestérol, le sistostérol,
- des sphyngolipides,
- des polyalkylglucosides,
- des copolymères de polyéthylèneglycol et d'alkylglycol (par exemple la famille des ELFACOS de AKZO NOBEL), - des copolymères di- ou tribloc d' éthers de polyéthylèneglycol et de polyalkylèneglycol (par exemple la famille des ARLACELL de ICI). A ces tensioactifs qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange, on peut éventuellement ajouter des co-tensioactifs afin d'améliorer la πgidité et l'étanchéité des membranes formant la vésicule. Parmi ces molécules, on peut citer : - le cholestérol et ses déπvés, en particulier les esters de cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol
- les autres déπvés à squelette stérol, en particulier ceux d' oπgine végétale (sitostérol, sigmastérol...)
- les céramides. La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de molécules tensioactives II est généralement utilisé au moins deux tensioactifs différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet de régler en continu les propπétés des bicouches et ainsi de contrôler l'apparition de l'instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires. Ainsi, on choisira avantageusement parmi les tensioactifs ci-dessus, deux tensioactifs présentant des propriétés relativement différentes, en particulier une balance hydrophile-lipophile (HLB) différente. Le premier tensioactif présentera avantageusement une balance hydrophile-lipophile compπse entre 1 et 6, de préférence entre 1 et 4, alors que le deuxième tensioactif aura une balance hydrophile-lipophile comprise entre 3 et 15, de préférence comprise entre 5 et 15
La préparation obtenue après transformation de la phase lamellaire cπstal-hquide en vésicules multilamellaires peut ensuite être diluée, en particulier avec un solvant aqueux tel que. par exemple, une solution tampon, une solution saline ou une solution physiologique, pour obtenir ainsi une suspension aqueuse de vésicules
La technique d'encapsulation utilisée selon la présente invention permet d'atteindre aisément des rendements d'encapsulation très élevés, voire voisins de 100 % Toutefois, de tels rendements ne sont pas toujours indispensables en fonction des applications visées. Ainsi, le rendement d'encapsulation du (ou des) antιgene(s) dans les compositions de l'invention est avantageusement supéπeur a 50 %, de préférence supérieur a 80 %
Il semble que la structure des vésicules soit responsable des résultats particulièrement avantageux obtenus, et que les vésicules multilamellaires de l'invention permettent à l'antigene d'arriver intact jusqu'aux cellules présentatrices de l'antigene (CPA) et de favoriser sa capture par ces cellules. Il semble donc bien que la fonction des vésicules de l'invention est de vectoriser, de protéger et d'améliorer la capture de l'antigène par le système immunitaire.
Un autre avantage de la technologie est que l'on peut rajouter à cette formulation des polymères naturels ou artificiels tels que les polysacchaπdes (alginates, chitosan, etc.) afin de renforcer la solidité de la vésicule, et lui permettre de rester plus longtemps sur le site d'administration ou dans l'organisme, délivrant ainsi l'antigène sur un temps plus long. Ces polymères peuvent être aussi bien incoφorés dans la vésicule, que déposés autour sous la forme d'un enrobage. Dans ce cas la vésicule ou la particule formée des vésicules enrobées dans la matπce polymère a un diamètre supéπeur à celui des vésicules seules. Ces polymères peuvent éventuellement être réticulés pour renforcer encore leur solidité.
De plus, et c'est un des autres avantages de la technologie, la formulation peut être complétée par l'addition de molécules immuno-modulatrices (chitosan, interleukmes...) qui renforceront par leurs propriétés intrinsèques l'amplification et l'orientation de la réponse immunitaire.
Les vésicules incoφorant les antigènes sont avantageusement préparées dans un procédé consistant à préparer, dans un premier temps, la phase lamellaire. Celle-ci s'obtient par simple mélange des ingrédients, dans un ordre déterminé par l'expérimentateur d'après les miscibihtés de chacun des constituants. Il peut être nécessaire de chauffer certains constituants pâteux ou solides afin de faciliter leur incoφoration. Dans ce cas on additionne l'antigene de préférence en fin de mélange afin de lui éviter de subir une température trop élevée. On peut aussi préparer un mélange de tous les constituants sauf de l'antigène ou sa solution aqueuse sous forme d'un mélange « stock » qu'on utilisera selon les besoins pour préparer la phase lamellaire. La solution aqueuse peut contenir différents constituants destinés à assurer sa compatibilité biologique et en particulier des mélanges tampons mais également différents antigènes. La phase lamellaire ainsi préparée est ensuite soumise à un cisaillement modéré (de 0 à 1000s"1) pendant un temps limité (de 0 à 60 minutes).
Dans la plupart des cas, ce cisaillement est obtenu directement par l'action du dispositif ayant servi au mélange. Pour les très petites quantités, il peut être obtenu a la main par mélange de la préparation à l'aide d'une microspatule dans un tube de type Eppendorf La phase lamellaire cisaillée est ensuite dispersée dans un milieu final, en gênerai de l'eau ou un tampon, identique ou différent de celui ayant servi lors de la préparation de la phase lamellaire. Cette dispersion se fait avantageusement à température ambiante (20-25°C) par addition lente du milieu sur la phase lamellaire sous agitation constante.
Un conservateur et éventuellement d'autres additifs destinés à compléter la formulation galénique peuvent être ajoutés au produit.
Toutes les compositions décπtes précédemment comprenant au moins un antigène incoφoré au sein des vésicules à structure lamellaire en oignon présentent l'avantage de pouvoir être utilisées pour une administration par voie muqueuse et tout particulièrement par voie nasale et d'induire une réponse muqueuse et/ou systemique séπque.
L'exemple I donné ci-après met clairement en évidence un tel effet avec HSA
Les figures 1 et 2 données en référence a cet exemple rassemblent les réponses obtenues d'une part dans différents prélèvements muqueux (figure 1 ) et d'autre part dans les sérums des animaux (figure 2) après une administration par voie nasale de compositions selon l'invention (groupe I) en comparaison avec ceux obtenus par administration soit des compositions dans lesquelles le même antigène est libre (groupe II), soit de compositions contenant les mêmes vésicules mais vides (groupe III). L'exemple II illustre un procédé d'immunisation avec la FHA. Les résultats obtenus dans cet exemple sont illustres par les figures 3, 4 et 5 qui montrent respectivement
- Figure 3 les réponses anticoφs dans différents sites muqueux.
- Figure 4 . les réponses anticoφs dans les sérums, - Figure 5 : la charge bactéπenne pulmonaire des souris infectées par
Bordetella pertussis
EXEMPLES
EXEMPLE I : PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIOUES DE HSA
I - Préparation de vésicules contenant l'albumine de sérum humain (HSA)
Formulation (en pourcentage en poids)
O Potassium oleate (FLUKA) 05,0 % θ Alcool lauπque éthoxylé à 4 oxydes d'éthylene (SEPPIC) 02,0 % θ Cholestérol de lanoline (FLUKA) 05.0 % O Cholestérol 3-sulfate (SIGMA) : 02,5 %
© PBS lx stéπle (LIFE TECHNOLOGIES) : 20,0 %
© Lécithme de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN) : 45,5 %
© Albumine humaine (SIGMA) à 30 mg/ml dans du PBS lx : 20,0 %
Mode opératoire
Les composants sont stéπlisés par irradiation UV pendant 60 mn. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs...) sont stérilisés à la flamme juste avant utilisation. Les constituants O à θ sont introduits dans un piluher, dans un ordre indifférent, puis chauffés à 80°C pendant 60 min sous très forte agitation magnétique. La solubi sation totale des constituants © et © est véπfiée par observation microscopique.
On introduit à température ambiante dans un tube Eppendorf de 1,5 ml stéπle la quantité désirée du mélange © à θ puis on rajoute les constituants © et ©. L'ensemble est homogénéisé à l'aide d'une aiguille stéπle, puis laissé au repos
Figure imgf000017_0001
La préparation est ensuite dispersée à 33,33 % dans du PBS lx stérile.
II - Protocole d'immunisation
Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration muqueuse, des souπs BALB/c femelles de 6-8 semaines ont reçu, par voie nasale, deux fois (à J0 et J30), différentes préparations décrites ci- dessous. L'administration par voie nasale nécessite l'anesthésie des animaux par une solution, mélange de Kétamme, Valium et Atropine, injectée par voie intra- péπtonéale. Un mois après la dernière immunisation, les animaux sont sacrifiés, les sérums sont collectes et les prélèvements des sécrétions muqueuses effectués, a l'exception des lavages vaginaux qui sont prélevés sur la souris vivante pendant les trois jours précédents la fin de l'expéπmentation.
Groupes d'immunisation
Les souπs ont été reparties en 4 groupes notés I à IV, le groupe IV constituant un groupe témoin (souris non immunisées également dénommées souris naïves) et les autres groupes étant soumis à un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants • - groupe I :
* HSA encapsulée : 20μl par narine de vésicules selon l'invention incoφorant HSA ce qui coπespond à 80 μg de HSA par souris
- groupe II : * HSA : 20μl par narine d'une solution de HSA correspondant à
80 μg par souris
- groupe III :
* Vésicules vides : 20μl par narine de vésicules selon l'invention vides
Prélèvements des sécrétions
Tous les prélèvements sont effectués avec des solutions froides (4°C) et sont entreposés sur glace au fur et à mesure afin de limiter les dégradations par les enzymes protéolytiques.
Lavages broncho-alvéolaires :
La trachée des souris est canulée à l'aide d'une sonde et 750μl de PBS sont injectés lentement afin de ne pas créer d'hémorragie, les poumons sont lavés ainsi 3 fois avec la même solution, le prélèvement est ensuite centrifugé afin d'éliminer les cellules pulmonaires et séparé en fractions aliquotes conservées à -20°C jusqu'au dosage.
Lavages vaginaux
Ces prélèvements sont réalisés sur la souris vivante non anesthésiée, par injection de 50μl de PBS dans l'orifice du vagin, le vagin est lavé 3 fois avec la même solution. Ce type de prélèvement est renouvelé durant 3 jours consécutifs afin de couvrir les variations dues au cycle hormonal de la souris. Les sécrétions sont groupées et conservées à -20°C.
Lavages intestinaux L'intestin est prélevé, libéré du mésentère et rincé dans l'eau afin d'éliminer le sang extérieur. Il est ensuite découpé longitudinalement et incubé sur glace dans 1 ml d'une solution de lavage enrichie en inhibiteur de protéases. L'ensemble est centrifugé et le surnageant est récupéré et congelé à -20°C. Dosage des anticorps
Les anticoφs spécifiques de HSA présents dans les sérums et sécrétions sont dosés par technique ELISA où l'on détermine les IgA et IgG spécifiques de HSA (anti-IgA biotinylé/Streptavidine peroxydase, anti-IgG peroxydase). Les résultats sont exprimés en titre moyen déterminé par rapport à un sérum de référence de souris naïve et correspondant à l'inverse de la dilution égale au seuil de référence.
III - Résultats Les résultats du dosage des anticoφs spécifiques sont présentés sous la forme de 2 figures (figure 1 et figure 2) illustrant respectivement les réponses anticoφs obtenues dans les prélèvements muqueux pour la réponse associée aux muqueuses et dans les sérums des animaux (réponse systemique).
Sur ces figures, on a également indiqué dans chaque cas le nombre de souris ayant réagi au protocole d'immunisation par rapport au nombre de souris soumises à ce protocole (la mention "n/m" signifiant que n souris ont réagi sur m souris soumises au protocole d'immunisation).
Il apparaît clairement au vu de ces deux figures que l'administration par voie nasale de vésicules selon l'invention incoφorant HSA entraîne une production importante d'anticoφs dans les poumons (Figure 1). Seule l'immunisation sous la forme encapsulée engendre une réponse immune pulmonaire d'isotype IgA et IgG (l'existence au niveau pulmonaire de ces deux isotypes est rapportée dans différentes publications). Bien que cette voie d'administration ne soit pas la plus aisée chez l'animal, tous les animaux immunisés par voie nasale avec les vésicules selon l'invention sont répondeurs.
L'analyse des autres prélèvements muqueux révèle la présence d'IgA spécifique de HSA dans le vagin et l'intestin des animaux immunisés par les vésicules selon l'invention incoφorant HSA, muqueuses très distantes du site d'administration avec une prédilection pour la muqueuse vaginale. Ces réponses indiquent une généralisation de la réponse induite dans le tissu lymphoïde muqueux pulmonaire ou nasal et la circulation et la redistribution des lymphocytes activés et différenciés près du site d'administration.
A la différence de la muqueuse pulmonaire, la réponse isotype spécifique de HSA prédominante dans l'intestin et le vagin est l'IgA. Bien que le titrage des IgGH+L n'ait pu être réalisé dans les lavages vaginaux, des expériences similaires réalisées avec un autre antigène indique la prédominance des IgA dans les sécrétions vaginales.
Seule la forme vectoπsee de l'antigene conduit a une réponse intense et spécifique. Les quelques animaux présentant une réponse IgA détectable dans les groupes immunisés par HSA libre (titre de 3 contre 650 dans les sécrétions vaginales avec les vésicules selon l'invention contenant HSA ) ne sont pas differentiables du groupe vésicules selon l'invention vides.
L'étude des sérums des animaux (Figure 2) indique que les vésicules selon l'invention incoφorant HSA administrées par voie nasale sont capables d'engendrer une réponse systemique caractérisée par la présence majoritaire d'IgG mais également par un taux important d'IgA serique Seule la forme vectoπsee conduit a cette production (IgA HSA seule = 35 , IgA vésicules selon l'invention HSA = 17 620) Il est remarquable d'obtenir une réponse systemique de l'antigene vectoπsé Rappelons qu'il est extrêmement difficile d'induire une réponse IgA serique par immunisation systemique avec un antigène seul ou accompagné d'un adjuvant autoπsé en usage humain.
En conclusion de ces résultats, non seulement la forme dite encapsulée engendre une réponse immune pulmonaire mais aussi, seule cette forme permet la dissémination de la réponse induite dans le tractus respiratoire vers d'autres muqueuses indiquant que les vésicules selon l'invention sont des puissants vecteurs pour induire une immunité muqueuse, en favorisant la pnse en charge et l'induction de la réponse au sein d'un site et en la redistπbuant a d'autres sites
EXEMPLE II : PRODUCTION D'ANTICORPS SPECIFIOUES DE FHA ET PROTECTION CONTRE BORDETELLA PERTUSSIS
La protéine FHA est une adhesine filamenteuse de Bo detella pertussis. la bactérie de la coqueluche Contrairement a HSA précédemment utilisée, la FHA est plus immunogene et donc susceptible d'induire par elle-même une réponse anticoφs Cette protéine fait partie des antigènes protecteurs contenus dans les vaccins commerciaux contre la coqueluche Enfin le modèle muπn peut être infecte par Bordetella pertussis et il est ainsi possible de réaliser un test d'infection suite a l'immunisation muqueuse et de montrer le caractère protecteur de la réponse induite par l'immunisation A - Induction d'anticorps
I - Préparation des vésicules contenant FHA
Formulation
© Oléate de potassium (FLUKA) : 5,0 % θ Ether laurique du PEG-4 (Simulsol P4, SEPPIC) : 2,0 % θ Cholestérol de lanoline (FLUKA) : 5,0 %
O Cholestérol 3-sulfate (SIGMA) : 2,5 % θ PBS lx stéπle (LIFE TECHNOLOGIES) : 20,0 %
© Lécithme de soja (Phosphohpon 90G, NATTERMANN) : 45,5 % θ FHA de Bordetella pertussis dans PBS ( 1 mg/ml) : 20.0 %
Le protocole opératoire de la préparation est similaire à celui de l'exemple 1. Le produit fini a une concentration en FHA de 3 μg pour 40 μl.
II - Protocole d'immunisation Pour l'étude de la réponse anticoφs, le protocole d'immunisation par voie muqueuse et de prélèvement est identique à ce qui a été décrit dans l'exemple 1. Deux groupes de 5 animaux ont été constitués, le groupe I recevant l'antigène encapsulé dans les vésicules, et le groupe II recevant l'antigène non encapsulé, en solution dans du PBS. A chaque immunisation, chaque animal reçoit 3 μg de FHA, répartis en deux instillations, une dans chaque narine.
Prélèvements des sécrétions
Les prélèvements sont réalisés de manière strictement identique à ce qui est décrit dans l'exemple 1.
Dosage des anticorps Les anticoφs spécifiques de FHA présents dans les sérums et sécrétions sont doses par technique ELISA selon un protocole identique a celui décπt dans l'exemple 1, avec les réactifs spécifiques à l'antigene FHA.
III - Résultats
Les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4, où les titres moyens en anticoφs IgA et IgG dans les sécrétions muqueuses (figure 3) et dans le sérum (figure 4) sont donnés pour les deux groupes I et II. Les sécrétions muqueuses sont respectivement étudiées comme dans l'exemple I, à partir des lavages broncho-alvéolaires (A), des lavages intestinaux (B) et des lavages vaginaux (C).
Dans le groupe I de souris immunisées par l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention (Figure 3) la totalité des animaux répondent à l'antigène alors que lorsque l'antigène libre est administré, seul 1/5 des animaux sont répondeurs et ce de manière très faible.
Comme dans le cas de HSA de l'exemple 1, on observe une très forte amplification de la réponse anticoφs dans les sites muqueux. L'immunisation par voie nasale avec l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention permet d'induire une réponse muqueuse (IgA) dans les poumons, proche du site d'administration (titre en IgA pour l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention 8 925 par rapport à 4,25 pour l'antigène libre) mais également une réponse muqueuse disséminée aux autres compartiments sécrétoires (intestin et vagin) (Titre en IgA vaginales 13 500 pour l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention par rapport à 2,5 pour l'antigène libre). De plus des IgG ont été détectés à des niveaux significatifs dans les trois compartiments muqueux étudiés.
Comme dans le cas de HSA, on observe des titres importants en anticoφs IgA et IgG dans la circulation (figure 4) suite à l'administration nasale de l'antigène incoφoré dans les vésicules (Titre en IgA pour l'antigène dans les vésicules de l'invention 1 300 par rapport à 39,2 pour l'antigène libre ; Titre en IgG
1 265 000 par rapport à 3 000).
Les résultats de cet exemple 2 confirment complètement ceux obtenus sur HSA. Ils permettent d'affirmer que les vésicules administrées par voie nasale peuvent être utilisées afin d'induire ou d'amplifier la réponse anticoφs dans les compartiments muqueux. de disséminer cette réponse à d'autres sites plus éloignés du site d'administration et de générer une réponse systemique.
B - Test de protection Afin de vérifier si l'immunisation obtenue est protectrice, il a été procédé à un test de protection, dit "challenge test". Dans cette expérience, des souris préalablement immunisées ont été infectées par voie nasale par un nombre défini de Bordetella pertussis, puis les animaux ont été sacrifiés à différents temps, pour observer la progression de l'infection. La mesure est faite par comptage des colonies dans les poumons. I - Préparation des vésicules contenant FHA
La formulation et la préparation des vésicules sont stnctement identiques à celle préalablement utilisées pour la caractéπsation de la réponse anticoφs.
II - Protocole d'immunisation
Le protocole d'immunisation et les doses d'antigènes administrées sont identiques à ceux utilisés pour l'induction d'anticoφs. Trois groupes de souris sont utilisés :
I. Souπs immunisées par l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention IL Souris immunisées par l'antigene libre en solution dans du PBS III. Souris non immunisées
Chaque groupe est composé de 4 souris, immunisées en même temps, avec le même lot d'antigène, afin de pouvoir réaliser toutes les mesures d'infection dans les mêmes conditions.
III - Protocole d'infection
Quatre semaines après la deuxième immunisation, les souris sont anesthésiées et infectées par Bordetella pertussis par voie nasale (5.107 bactéries/ souris administrées dans 20 μl) et la charge infectieuse initiale est vérifiée dès 3 heures après l'infection.
IV - Protocole de mesure de la charge infectieuse
Les souris sont sacrifiées et leurs poumons sont prélevés à différents temps après l'infection et dilacérés dans du PBS jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Différentes dilutions de la suspension sont étalées sur milieu nutπtif spécifique des Bordetella et les colonies sont comptées après trois jours de croissance.
V - Résultats
Les résultats sont présentés sur la figure 5 ou est indiqué le nombre de colonies de Bordetella pertussis dans les poumons des souπs, 3 jours (J3, baπe pleine) et 5 jours (J5, baπe creuse) après l'infection en millions de colonies bactériennes pour les trois groupes de souris ci-dessous : Groupe I : souris immunisées par l'antigène incoφoré dans des vésicules de l'invention.
Groupe II : souris immunisées par l'antigène libre en solution dans du
PBS.
Groupe III : souris non immunisées.
On observe que, dès le 3eme jour après l'infection, les souris immunisées par l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention ont une charge bactérienne inférieure (facteur 2) à celle des souris immunisées par l'antigène libre, et très inférieure à celle des souris non immunisées (facteur 8). Remarquablement, alors que 5 jours après l'infection, les souris immunisées avec l'antigène libre ainsi que les souris non immunisées voient leur charge bactérienne augmenter, les souris immunisées avec l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention présentent moins de bactéries à J5 qu'à J3 indiquant une évolution favorable de la maladie. De plus, à ce stade, le nombre de colonies bactériennes dans le groupe immunisé avec l'antigène incoφoré dans les vésicules de l'invention est 6 fois plus faible que dans le groupe immunisé par FHA libre et 13 fois plus faible que dans le groupe non immunisé indiquant une bonne protection.
Ces résultats démontrent que l'invention permet non seulement d'amplifier la réponse anticoφs, mais qu'elle génère de plus une réponse immunitaire à efficacité protectrice contre l'infection. L'invention est donc applicable aussi bien à la production d'anticoφs, qu'à la vaccination.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de vésicules multilamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incoφoré au moins un antigène, pour la fabrication d'une composition destinée à une administration par voie muqueuse.
2. Utilisation selon la revendication 1. caractérisée en ce que ladite composition est une composition destinée à induire une réponse muqueuse.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite composition est une composition destinée à induire une réponse systemique serique.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite composition est une composition destinée à induire la production d'anticoφs.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite composition est une composition pharmaceutique, notamment vaccinale, destinée à induire une protection de l'organisme à l'égard de l'infection dont est responsable ledit antigène.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit antigène a une origine exogène ou naturelle intrinsèque.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 6, caractérisée en ce que ledit antigène est choisi dans le groupe constitué : - des protéines, en particulier des protéines extraites ou recombinantes, glycosylées ou non,
- des peptides,
- des lipopeptides,
- des polysaccharides, ou représente un mélange de plusieurs de ces composants.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdites vésicules contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué :
- des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, - des acides gras en Cg à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, sous forme d'acide ou de sel d'un métal alcalin, alcalino-teπeux ou d'une aminé,
- des esters, éthoxylés ou non, de ces mêmes acides gras et . de saccharose,
. de sorbitan, . de mannitoi,
. de glycérol ou de polyglycérol, . de glycol, - des mono-, di- ou triglycérides ou des mélanges de glycérides de ces mêmes acides gras,
- des alcools gras en C à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou ramifiés, éthoxylés ou non,
- des éthers, éthoxylés ou non, de ces mêmes alcools gras et . de saccharose,
. de sorbitan, . de mannitoi,
. de glycérol ou de polyglycérol, . de glycol, - des huiles végétales polyéthoxylées, hydrogénées ou non hydrogénées,
- des polymères séquences de polyoxyéthylene et de polyoxypropylène (poloxamères),
- de l'hydroxystéarate de polyéthylèneglycol,
- des alcools à squelette stérol tel que le cholestérol, le sistostérol, - des sphyngolipides,
- des polyalkylglucosides,
- des copolymères de polyéthylèneglycol et d'alkylglycol,
- des copolymères di- ou tribloc d'éthers de polyéthylèneglycol et de polyalkylèneglycol.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que lesdites vésicules contiennent en outre au moins un co-tensioactif destiné à améliorer la rigidité et ou l'étanchéité des membranes desdites vésicules.
10. Utilisation selon la revendication 9. caractérisée en ce que ledit co- tensioactif est choisi dans le groupe constitué : - du cholestérol et de ses dérivés, en particulier les esters de cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol - des dérivés à squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale tels que le sitostérol ou le sigmastérol,
- des céramides.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que lesdites vésicules contiennent en outre une substance immuno-modulatrice.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 1 1, caractérisée en ce que lesdites vésicules ont un diamètre compris entre 0, 1 et 25 μm, de préférence entre 0,2 et 15 μm.
13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les bicouches desdites vésicules comprennent au moins deux agents tensioactifs dont l'un présente une balance hydrophile-lipophile (HLB) comprise entre 1 et 6, de préférence comprise entre 1 et 4, et l'autre une balance hydrophile- lipophile (HLB) comprise entre 3 et 15, de préférence comprise entre 5 et 15.
14. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le rendement d'encapsulation de l'antigène (ou des antigènes) au sein desdites vésicules est supérieur à 50 %, de préférence supérieur à 80 %.
15. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite administration par voie muqueuse est une administration par voie nasale.
16. Procédé de traitement du coφs humain ou animal par vaccination, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration par voie muqueuse d'une composition telle que définie dans l'une des revendications 1 à 15.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ladite administration est réalisée par voie nasale.
18. Procédé de production d'anticoφs, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction dans un organisme hôte, par voie muqueuse, de vésicules lamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incoφoré au moins un antigène et, le prélèvement et la purification de ces anticoφs.
19. Procédé de production d'IgA , caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction dans un organisme hôte, par voie muqueuse, de vésicules multilamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cristal- liquide formée d'un empilement de bicouches concentriques à base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incoφoré l'antigène approprié et, le prélèvement et la purification de ces immunoglobulines.
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