WO2001014552A1

WO2001014552A1 - Proteine meg-1

Info

Publication number: WO2001014552A1
Application number: PCT/JP2000/005551
Authority: WO
Inventors: Toshio Miyata
Original assignee: Kurokawa, Kiyoshi
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2001-03-01
Also published as: KR20020033763A; CA2376404A1; AU6596500A; NO20020794L; AU776341B2; CN1377409A; EP1209231A1; EP1209231A4; NO20020794D0

Description

明細書メグ一 1タンパク質技術分野

本発明は、遺伝子工学の分野に属し、特に腎細胞の遺伝子の単離に関する。背景技術

体内の 60兆個もの様々な細胞が、本質的に同一のゲノム DNAを有している。正常な生理学的機能のために、これらの遺伝子の発現は、細胞系統、および細胞が受容するシグナルにより厳密に制御されている。従って、個々の細胞型に発現している遺伝子を解明することは極めて重要である。

メサンギゥム細胞 (mesangi al ce l l)は、腎糸球体の構造および機能の維持に中心的な役割を果たしている。そしてメサンギゥム細胞は、各種腎炎においても中心的な病態生理学的意義を有する。例えばメサンギゥム細胞の増殖、および細胞外の糸球体間質マトリックスの蓄積は、慢性腎炎および糖尿病性腎症のような様々な糸球体疾患の患者の糸球体硬化症の重要な病理所見である。従って、メサンギゥム細胞で発現している遺伝子を見いだしその機能を明らかにすることは、メサンギゥム細胞の生物学的性質の解明、メサンギゥム細胞に関連する疾患の原因の究明、ひいては、メサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効である。

メサンギゥム細胞のマーカ一としては、ラットでは Thyl抗原が知られている。しかしこの遺伝子はメサンギゥム細胞特異的ではないうえ、ヒトではメサンギゥム細胞には発現していない (Miyata T. e t al . , Immuno l ogy (1989)； 67 : 531-5 33 ; Miyat a T. e t al . , Immuno l ogy (1990)； 69 : 391-395) 。また、メサンギゥム細胞は活性化されるとひ平滑筋ァクチンを発現することが知られているが、この遺伝子もメサンギゥム細胞特異的ではない。このように、メサンギゥム細胞に特徴的な遺伝子については、従来報告がなかった。

なお本発明者は、先にメサンギゥム細胞に特異的に発現しているタンパク質としてメグシンを報告している (J . C l i n. Inves t , 1998 Aug 15, 120 : 4, 828-36) 。本発明は、このメグシンとも明確に異なった構造を持つ新規なタンパク質に関する。発明の開示

本発明は、メサンギゥム細胞で高度に発現される遺伝子を単離することを課題とする。

本発明者は、ヒトメサンギゥム細胞のインビトロ培養物から niRNAを単離し、 3 '側の cDNAライブラリーを作成した。そしてこの cDNAライブラリ一に含まれる多数のクローンをランダムに選択してその塩基配列を決定した。次いで決定した塩基配列を、種々の臓器及び細胞から得られた既知の 3'側の cDNAクローンの塩基配列と比較することによって、メサンギゥム細胞で特異的に発現しているクローンを選択した。そのうち、メサンギゥム細胞において特に出現頻度の高い 1クローンを選択し、 5' 1½ 6法にょって完全長じ0^ (3928& ）を単離した。この完全長 cDNAの全塩基配列を決定して本発明を完成した。更に Kozakの翻訳開始コドンを明らかにし、オープンリーディングフレーム（0RF)を推定した。この推定ァミノ酸配列を持つ本発明によるタンパク質を、本発明者はメグ一 1 (Meg-1 )と命名した。ヒト ·メグ— 1の cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、ヒト ·メグ一 1 の推定アミノ酸配列を配列番号： 2に示した。

このアミノ酸配列について、 Swi ssPro tデータベースのアミノ酸配列とホモ口ジー検索を行い、メグ一 1が新規なタンパク質であることを確認した。更に本発明のメグ一 1の推定アミノ酸配列についてモチーフ検索を試みたところ、多くの既知のプロテインホスファターゼに共通するモチーフが見られた。また、核局在シグナル（nuc l ear local i zat ion s ignal)スコアが高く、核タンパク質である可能性が示唆された。

更にノーザンプロッティングによりメグ一 1の組織分布をみたところ、メグ一 1は、心および胎盤、次いで脳、骨格筋、腎および膝において高度な発現が観察された。その他に肝で弱い発現が観察され、肺での発現はほとんど観察されなかつた。初代継代培養細胞の中では、メサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが特徴的であつた。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。即ち、本発明は具体的には以下のポリヌクレオチド、タンパク質、並びにそれらの用途に関する。

〔1〕下記（a ) から（d ) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

( a ) 配列番号： 1に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド。

( b ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

( c ) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチド。

( d ) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

〔2〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされる蛋白質。〔3〕〔1〕に記載されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクタ一。

〔4〕〔1〕に記載されたポリヌクレオチドのいずれか、または〔3〕に記載のベクターを保持する形質転換体。〔5〕〔4〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、

〔2〕に記載の蛋白質の製造方法。

〔6〕配列番号： 1に記載された塩基配列、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる 1 5ヌクレオチド以上の鎖長を持つオリゴヌクレオチド。

〔7〕〔6〕に記載のオリゴヌクレオチドと被検試料を接触させ、このオリゴヌクレオチドのハイブリダィズを観察する工程を含む、配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの検出方法。

〔8〕〔6〕に記載のオリゴヌクレオチドと被検試料を接触させ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程を含む、配列番号： 1 に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの合成方法。

〔9〕〔6〕に記載のオリゴヌクレオチドを含むメサンギゥム細胞の検出用試薬。〔1 0〕生体試料中における〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム増殖性腎炎を検出する方法。

〔1 1〕生体試料がメサンギゥム細胞である〔1 0〕に記載の方法。

〔1 2〕発現レベルを、配列番号： 1に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなる mRNAを指標として測定する〔1 0〕に記載の方法。

〔1 3〕発現レベルを、〔2〕に記載のタンパク質またはその断片を指標として測定する〔1 0〕に記載の方法。

〔1 4〕〔1〕に記載のポリヌクレオチド、またはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド。

〔1 5〕〔2〕に記載の蛋白質を認識する抗体。

〔1 6〕配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つ夕ンパク質の一部を認識する〔1 5〕に記載の抗体。〔1 7〕〔1 5〕に記載の抗体と〔2〕に記載のタンパク質、またはその断片との免疫学的な結合に基づいて〔2〕に記載のタンパク質またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

〔18〕〔1 5〕に記載の抗体を含む〔2〕に記載のタンパク質またはその断片の免疫学的測定用試薬。

〔1 9〕メグ一 1をコードする遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジエニック非ヒト脊椎動物。

〔20〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔19〕に記載のトランスジェニック非ヒ卜脊椎動物。

〔2 1〕メグ一 1をコードする遺伝子の発現が抑制されたノックアウトマウスである〔20〕に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。前記課題を達成するために本発明者は、 3'領域 cDNAライブラリー（3'-directe d cDNA library)を用いた。この方法により、 cDNAの大きさを反映するクロー二ング効率の変動を回避することができる。 3'領域の配列は遺伝子に特有なものであり、約 200〜300bpの配列データは、遺伝子の特徴を明らかにするのに充分である（Yasuda, Y.， Miyata, T. et al. , Kidney Int, 1998 Jan, 53:1， 154-8)。本発明のヒト ·メグ一 1をコードするポリヌクレオチドは、メサンギゥム細胞から mRNAを調製した後、既知の方法により二本鎖 cDNAに変換することにより得ることができる。 mRNAの調製はグァニジンイソチオシァネート—塩化セシゥム法 [Chirwin, et al. Biochemistry 18, 5294 (1979)] 、デォキシリボヌクレア —ゼ存在下に界面活性剤処理、フエノール処理を行なう方法 [Berger & Birkenm eier, Biochemistry 18， 5143 (1979)] などを用いることができる。全 RNAからの poly(A)⁺RNAの調製はオリゴ (dT)を結合した担体（例えばセファロース、セルロースやラテックス粒子等）を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどを用いて行なうことができる。得られた mRNAを铸型として、 3'端にある poly(A) 鎖に相補的なオリゴ（dT)、ランダムプライマー、あるいはメグ一 1のアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素で処理することによって cDNA l s t s t rand)を得ることができる。 mRNAとそれに相補的な cDNAとで構成されるハイブリッドの mRNAを E. Co l i RNase Hで部分的に切断し、これをプライマーとして E. Co l i DNA po lymerase Iにより cDNA (2nd s t r and)が合成される。最終的に E. Co l i DNA L igaseで処理することにより、二本鎖 cDNAを得ることができる。

ヒト ·メグ— 1遺伝子塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、メサンギゥム細胞 po ly (A) ⁺RNAを铸形にして RT - PCR法によりクローニングすることも可能である。また、 PCRによらず、ヒト ·メグ— 1遺伝子塩基配列をもとにプローブを合成し、直接 cDNAライブラリーをスクリーニングし、目的とする cDNAを得ることもできる。本発明の遺伝子は、これらの方法により得られた遺伝子の中から、その遺伝子の塩基配列を確認することにより、選択することができる。マウスとラット等、ヒト以外の種におけるメグ一 1のホモログについても、同様の手法により cDNAの取得が可能である。

あるいは、メグ— 1のホモログの cDNAを以下のような手法によって単離することも可能である。すなわち、前記ヒト ·メグ— l cDNAの塩基配列をプローブとして用い、 cDNAライブラリーをコロニーハイブリダィゼーシヨンやプラークハイブリダィゼ一シヨンによってスクリーニングして、メグ— 1のホモログをコ —ドする cDNAを単離することができる。 cDNAライブラリ一は、マウス、ラットの組織や、培養メサンギゥム細胞等から抽出した mRNAを铸型として合成することができる。あるいは、市販 cDNAライブラリー（フナコシ製等）を用いることもできる。この他に、本発明によるヒト 'メグ一 1の cDNAをもとに、 0RFの前後にディジエネレーティブプライマーを設計し、これを利用した PCRによってホモログの cDNAを増幅する方法を用いることもできる。実施例にはこのような手法に基づいて取得されたメグ— 1のラットにおけるホモログが開示されている。ヒ卜 ·メグ一 1ゲノムは、ゲノミックライブラリーのスクリーニングによって得ることができる。ゲノミックライブラリ一は、たとえばヒト Bリンパ芽球からゲノムを調製し、 Sau3で部分的に切断した DNAをファージベクターである EMBL3 に組み込むことにより合成することができる（Blood, vol 83, No 11, 1994: pp 3126-3131) 。このようなゲノミックライブラリーについて、プラークハイブリダイゼ一シヨン法（新細胞工学実験プロトコ一ル、秀潤社、 pp79- 92、参照）を行えば、目的とするゲノムを含むクローンを取得できる。プローブとしては、メグー 1 cDNAの 0RF全ての領域（2850bp) 、または cDNA部分をプライマーとしてヒトゲノム DNAを PCR法を用いて増幅することにより得られた各ェキソン—ィントロン部分を用いることができる。また、同時に調節領域に関しても、ヒト培養メサンギゥム細胞由来 mRNA、もしくはヒト腎臓 niRNA (Clontech社より購入）を铸型として、 5' RACE法（5' -Full RACE Core Set (宝酒造（株）の方法に従う））を用いて 5' UTRの配列決定を行うことができる。

本発明の遺伝子は、例えばホスホアミダイド法 [Mattencci, M.D. &Caruthers， M. H. J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] 、ホスファイト ' トリエステル法 [Hunkapiller, . et al. Nature 310, 105 (1984)] 等の核酸の化学合成を用いる常法に従つて製造することもできる。

なお、一般に、真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子で知られているように多形現象を示すことが多い。この多形現象によって、アミノ酸配列に 1 個あるいはそれ以上のアミノ酸の置換を生じても、通常タンパク質の活性は維持される。また一般に、 1個または数個のアミノ酸の改変では、タンパク質の活性は維持される場合が多いことが知られている。従って、配列番号： 2に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドは、該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り、すべて本発明に含まれる。また、配列番号： 2に示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、本発明のタンパク質の特徴を有する限り、すべて本発明に含まれる。

その他、本発明のタンパク質には、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列、またはこれらアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、および Zまたは挿入されたアミノ酸配列を含み、本発明によるメグ一 1と機能的に同等なタンパク質が含まれる。なお本発明において機能的に同等とは、メグ一

1と同等の生物学的特性を持つことを意味する。本発明者は、メグ一 1にたとえば以下のような生物学的な特性を見出している。

まず、メグ— 1はそのアミノ酸配列において、ヒトのみならず様々な種属のプ口ティンフォスファターゼ 2 A ( P P 2 A) の Aユニット（調節ユニット）と 2 0— 3 0 %のホモロジ一を有する。一方 P P 2 Aでは、 Aユニットの C末端側に Cユニット（酵素活性の有る触媒ユニット）、そして N末端側には Bユニット (組織や細胞に特異的なもう一つの調節ュニッ卜）とが結合して 3量体を形成することが知られている。そして Aュニットゃ Cュニッ卜が組織や細胞の間で共通の構造を持つのに対して、 Bュニットは組織や細胞に特異的な構造を持つと考えられている。これらの情報に基づけば、 P P 2 Aとのホモロジ一を持つ本発明のメグ— 1を Aュニッ卜とする Bュニットは、メサンギゥム細胞に特異的なタンパク質である可能性が推測される。メグ一 1を Aュニッ卜とする Bュニッ卜には、 P P 2 Aとは異なった、メサンギゥム細胞に特異的な活性制御機構が伴っているものと考えられる。

またメグ一 1の発現特性は、メサンギゥム初代培養細胞で特に高度に発現していることが特徴的であった。その他の初代培養細胞では、皮膚繊維芽細胞ゃ腎皮質上皮細胞で発現が観察され、臍帯静脈内皮細胞、平滑筋細胞においてはわずかな発現が観察された。組織間の比較においては、心および胎盤、次いで脳、骨格筋、腎および膝において高度な発現が観察された。その他に肝で弱い発現が観察され、肺での発現は観察されなかった。培養癌細胞株においては HeLa細胞 S3、慢性骨髄性白血病 K-562、リンパ芽球白血病 MOLT- 4、大腸腺癌 SW480、および肺癌 A549で強い発現が観察され、前骨髄白血病 HL-60、黒色腫 G361でも発現が見られた。 Burki t tリンパ腫 Raj iでは、ほとんど発現が見られなかった。またラット ·メグ一 1のラットにおける発現解析の結果、メグ一 1は、ヒトとラットに共通して腎臓（特にメサンギゥム細胞）に高発現していることから、メサンギゥム細胞の機能に関与する機能遺伝子の一つである可能性が考えられる。各組織や培養細胞におけるメグ一 1の発現状態は、たとえば配列番号： 1から選択された塩基配列を持つプローブによって、各組織から調製した mRNAを試料としてノーザンブロットアツセィを行うことによって知ることができる。

以上のような生物学的特性について、機能的に同等なタンパク質は、いずれも本発明によるメグ一 1を構成する。したがって、具体的に構造を明らかにしたヒトのメグ— 1のみならず、構造的にあるいは機能的に同等な他の種のホモログは本発明に含まれる。

ホモ口ジーサーチによつて確認された公知のァミノ酸配列のうち、もっともメグー 1に近い構造を持ったものは、 PP4_R, (J . B i o l . Chem. 274 (9) , 5339-5347, 1999) である。しかし PP4_R,は、ゥシの小腸から単離されたタンパク質セリン Zスレオニンフォスファタ一ゼ 4調整ュニットのヒト ·ホモログとして報告されたタンパク質である。その構造においては、 PP4_R1の N末端から 1 8位に存在する Sが、メグ一 1では FGVDDYSSESDVI I IPSAの 1 8アミノ酸残基となっており、両者は異なった構造を持つタンパク質である。また機能的に見ても、メサンギゥム細胞に高度に発現するメグ一 1に対して、 PP4_RIはゥシ小腸由来のタンパク質のァミノ酸配列に基づいて単離された神経上皮細胞由来のタンパク質であることから、両者は異なったタンパク質である。両者の間で相違するアミノ酸配列が連続していることから、メグ一 1と PP4_R1とは互いに複数の遺伝子にコードされるアイソフオームゃスプライシング変異体である可能性が考えられる。また、本発明のポリヌクレオチドには、これらの機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 cDNAのみならずゲノム DNAや合成 DNA、 RNA、更にはヌクレオチド誘導体で構成された人工的なポリヌクレオチド分子であることもできる。また、所望のアミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる [Grantham, R. et al. ucleic Acids Res. 9, r43 (1981)] 。従って、コドンの縮重を考慮して、塩基を適宜改変したものもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的変位導入法 (sitespecific mutagenesis) [Mark, D.F. e t al. Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81,5662 (1984)] 等にしたがって、これら塩基配列のコドンを一部改変することができる。

更に、配列番号： 1に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダィズすることができ、かつそのポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が本発明によるメグ一 1に特徴的な機能を有する限り、そのポリヌクレオチドは本発明によるポリヌクレオチドに含まれる。ストリンジェントな条件下で特定配列にハイプリダイズすることができる配列は、特定配列がコードするタンパク質と類似した活性を持つものが多いと考えられる。ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、 4 XSS (；、 6 5ででハイブリダィゼーシヨンさせ、 0. 1 XSSCを用いて 6 5T:で 1時間洗淨する。ストリンジエンシーを大きく左右するハイブリダィゼーシヨンや洗浄の温度条件は、融解温度 (Tm)に応じて調整することができる。 Tmはハイブリダィズする塩基対に占める構成塩基の割合、八イブリダィゼーシヨン溶液組成（塩濃度、ホルムアミドゃドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジエンシーを与える条件を経験的に設定することができる。変異体も含め本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列は、公知の技術に基づいてさまざまな用途に利用することができる。

このようにしてクローン化されたメグ一 1をコ一ドするポリヌクレオチドは適当な発現べク夕一 DNAに組み込むことにより、他の原核細胞または真核細胞の宿主を形質転換させることができる。さらに、これらの発現ベクターに適当なプロモーターおよび形質発現に係る配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現することが可能である。発現ベクターとしては、例えば大腸菌の場合は、 ET-3 [Studier & offatt, J. Mol. Biol. 189, 113(1986)] 等が、 COS細胞の場合は pEF-BOS [Nucleic Acids Research 18,5322 (1990)] 、 pS V2-gpt [Mulligan & Berg, Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 2072 (1981)] 等が、 CHO細胞の場合は pVYl [国際公開第 89/03874号公報] 等がそれぞれ挙げられる。また、目的とする遺伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結して融合タンパク質として発現させることにより、精製を容易にし、その後目的タンパク質を切り出すことも可能である。融合させるタンパク質としては、ヒスチジンタグ、 C- mycタグ、 MBP-タグ、あるいは GST -タグ等が知られている。これらのタグを融合させた状態でィンサートを発現させることができるベクターは巿販されている。

本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli) が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物の宿主細胞としては、例えばサッカロミセス ·セレビシェ一（Saccharomyces cerevisi ae) 等が挙げられる。一方哺乳動物由来の宿主細胞としては、例えば COS細胞、 CH0細胞、 BHK細胞等が挙げられる。なお、本発明の形質転換体の培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行なえばよい。

以上のようにして目的とするメグ一 1をコードするポリヌクレオチドで形質転換した形質転換体を培養し、産生されたメグ一 1は、細胞内または細胞外から分離し均一なタンパク質にまで精製することができる。なお、本発明の目的タンパク質であるメグ一 1の分離、精製は、通常のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトダラフィ一等を適宜選択し、組み合わせれば、メグ一 1を分離、精製することができる。

なお、上述の他、本発明の遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該べクタ一による形質転換体および該遺伝子を用いたメグ一 1の製造過程における遣伝子操作の処理手段は、「Mo l ecu l ar C l oning- A Laborat ory Manual j (Co l d Sp r ing Harbor Laboratory, N. Y. ) に記載の常法に従って行うことができる。

この他、配列番号： 1に記載の塩基配列に基づいて、メグ一 1遺伝子を検出するためのプローブを設計することができる。あるいは、これらの塩基配列を含む DNAや RNAを増幅するためのプライマ一を設計することができる。与えられた塩基配列をもとに、プローブやプライマーを設計することは当業者が日常的に行つていることである。設計された塩基配列を持つオリゴヌクレオチドは化学合成によって得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、さまざまなフォ一マツ卜のハイブリダィゼーシヨンアツセィに利用することができる。あるいは、 PCRのような核酸の合成反応に利用することができる。プローブやプライマーに利用するオリゴヌクレオチドは、少なくとも 15塩基、好適には 25-50塩基の長さとするのが望ましい。大部分の塩基配列を共有している PP4_R1との間で構造上の違いとなっている 1 8アミノ酸残基をコードする領域 ( 7 4 - 1 2 7 ) に相当する部分から選択した塩基配列を含むようにすれば、両者の識別が可能なプローブ（あるいはプライマー）を設計することができる。本発明は、配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、 A: T (RNAにおいては Tを！]に読みかえる）、 G : Cの塩基対からなる 2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70% 、好ましくは少なくとも 8 0% 、より好ましくは 90% 、さらに好ましくは 95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、本明細書に記載したアルゴリズムにより決定することができる。メグ一 1がメサンギゥム細胞で高度な発現を示すことから、本発明によるメグ一 1遺伝子を検出するためのプローブやプライマーは、メサンギゥム細胞の同定や検出に利用することができる。特にプライマーは、メグ一 1 遺伝子の増幅においても有用である。本発明によるオリゴヌクレオチドには、必要に応じて標識や結合性のタグを付与することができる。

また本発明は、メグ一 1の発現レベルを指標とする、メサンギゥム増殖性腎炎の検出方法を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、メサンギゥム増殖性腎炎を発症した腎組織のメサンギゥム細胞において発現が亢進している。このことは実施例において、抗 Thylモノクローナル抗体の投与によってメサンギゥム増殖性腎炎を誘導されたラットのメサンギゥム細胞において、ラット ·メグ— l mRNA の強い発現が観察されたことからも裏付けられている。したがって、生体試料中のメグ一 1の発現レベルを測定し、正常な状態にある生体試料の測定結果と比較して発現が亢進している場合に、メサンギゥム増殖性腎炎を検出することができる。生体試料としては、メサンギゥム細胞や、尿、血液などを用いることができる。メグ一 1の発現レベルは、 mRNAや、その翻訳生成物であるメグ一 1蛋白質、あるいはそれらの断片を測定することにより比較することができる。生体試料中の、これらの成分を測定する方法は公知である。たとえば、メグ— l mRNAはノ —ザンブロット法ゃ RT- PCR法によって検出、あるいは測定することができる。またメグ一 1蛋白質やその断片は、メグ一 1を認識する抗体によって検出することができる。メサンギゥム細胞を生体試料とする場合には、 i n s i tuハイブリダィゼーシヨンや、免疫組織学的な検出方法を利用することにより、細胞内でのこれらの成分の局在を明らかにすることもできる。更に本発明が明らかにしたメグ— 1をコードする遺伝子の塩基配列に基づいて、メグ一 1の発現を制御しうるアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドは、メグ— 1のメサンギゥム細胞における役割を明らかにするための重要なツールとなる。あるいはメグ一 1の発現亢進によってもたらされる病態の制御に有用である。アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイプリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAとのハイプリッド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハイブリツド形成によるスプライシング抑制、スプライソソ —ム形成部位とのハイプリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイプリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ（A)付加部位とのハイプリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイプリッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域ゃポリソ一ム結合部位とのハイブリツド形成によるタンパク質鎖に伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリツド形成による遺伝子発現抑制、などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座 2 核酸 I V 遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人， PP. 319-347， 1993)。

本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。し力 ^し、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるァンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された DNAは、公知の方法で、所望の宿主へ形質転換できる。アンチセンスポリヌクレオチドの配列は、形質転換する宿主が持つ内在性遺伝子（あるいはその相同遺伝子）、またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。

アンチセンスポリヌクレオチドを铸型として転写された RNAが、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90 、最も好ましくは 95 の相補性を有するように設計する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスポリヌクレオチドの長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス RNAの長さは 2. 5kbよりも短い。

更に本発明が提供するメグ一 1の cDNA塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在するメグ一 1遺伝子のプロモーター領域、ェンハンサー領域を取得することができる。具体的には、特開平 6- 181767号公報、「The Journal of Immuno l ogy (199 5) 155, 2477-2486, Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA (1995) , 92， 3561-3565」等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可能である。なお、本明細書において、プロモーター領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御する D NA領域を、ェンハンサー領域とはイントロンまたは 3' UTRに存在する遺伝子の発現を制御する DNA領域をいう。

具体的には、プロモーター領域は、例えば、以下の方法によって取得することができる。

1 ) メグ一 1の cDNAの 5'末端側をプロ一ブとし、ヒトゲノムライブラリ一よりメグー 1のプロモーター領域をクローニングする。 2) 制限酵素消化してメグ一 1遺伝子の翻訳開始コドンを含むその上流部分（2 〜5kbp) のプロモーター領域を含む DNAを得、塩基配列を決定する。ヒトメサンギゥム細胞から調製した poly(A)⁺RNAを銬型とし、メグ— 1遺伝子の 5'末端側 cDNA配列より選択したプライマー DNAを用いたプライマー伸長法により、転写開始点（+ 1) を決定する。塩基配列から転写因子結合配列を検索し、プロモ一夕一活性を有する可能性がある箇所を予想する。

3) 2) で得た DNAからメグ一 1遺伝子のコード領域を除いた DNA断片をプラスミド上にサブクローニングし、この DNA断片の 2〜5kbp下流に、レポーター遺伝子としてのクロラムフエニコールァセチル転位酵素（CAT) 遺伝子、あるいは、ルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポータープラスミドを構築する。同様に、プロモーター領域の可能性がある各箇所を含むような形で、制限酵素消化により、或いは、 PCRにより、 5'末端側及び 3'末端側を順次削ったメグ— 1遺伝子上流部分の様々な部位に該当する DNA断片を作成し、これらの下流に、レポーター遺伝子としての CAT遺伝子、あるいは、ルシフェラーゼ遺伝子を連結したレポ一夕一プラスミドを構築する。

4) 3) で作製したレポータープラスミドで形質転換した動物細胞の CAT或いはルシフェラーゼ活性を測定することにより、メグ一 1遺伝子上流部分に存在するプロモーター領域を得る。

また、 3' UTR、イントロン中のェンハンサー領域は、メグ一 lcDNAをプロ一ブとし、ヒトゲノムライブラリーよりヒト ·メグ一 1のゲノム遺伝子をクロー二ングし、上述のプロモータ一に関する方法と同様にして、ェンハンサー活性を有する領域を得ることができる。

メグ一 1遺伝子の発現を制御している転写因子は、「新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）」、「バイオマニュアルシリーズ 5転写因子研究法（羊土社）」、「DNA & Cell Biology, 13, 731-742 (1994)」に記載の方法等の公知の方法、例えば、ァフィ二ティーカラムを用いた方法、サウスウエスタン法、フットプリンティング法、ゲルシフト法、または one- hybr i d法で得ることができる。なお、本明細書において、転写因子とはメグ一 1遺伝子の転写を調節している因子で、転写の開始反応を誘導する転写開始因子と、転写を正または負に調節する転写調節因子をさす。

ァフィ二ティーカラム法を用いる場合は、前述の方法で得た、プロモーター領域、ェンハンサー領域をセファロース或いはラテックスビーズに固定化したカラムに、核抽出液をかけ、カラムを洗浄後、カラムに固定化した配列と同様の配列を有する DNAを用い、結合した転写因子を溶出することによって、メグ— 1遺伝子の発現を制御している転写因子を得ることができる。

また、サウスウエスタン法を用いる場合は、大腸菌の発現ベクター（例えば λ gt l l ) に挿入した cDNAの発現産物を標識プローブによってスクリーニングする。たとえばスクリ一ニングすべき cDNAを /3 _ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させ、これをニトロセルロース膜に吸着させる。次いで放射性同位元素で標識されたプロモーター領域ゃェンハンサー領域の DNA断片をプローブにし、結合活性をもつ融合タンパク質を合成するファージを選択することによって、メグー 1遺伝子の発現を制御している転写因子を得ることができる。

ゲルシフト法は、遊離の DNAがタンパク質と結合したときにポリアクリルアミドゲルによる電気泳動の移動度に差を生じる現象に基づいている。プロモーター領域ゃェンハンサー領域の DNA断片をプローブとし、転写因子が含まれる試料

(たとえば核タンパク質抽出液）と混合して、低イオン強度の元で電気泳動分析する。転写因子の結合は、遊離の DNAとは違った移動度のバンドとして検出される。ゲルシフト法は、タンパク質の混合物から高い感度で転写因子を分離することができる。

ゲルシフト法によって得られた DNAと転写因子の複合体を、更にフットプリント法によって解析すると、転写因子の結合部位を決定することができる。フットプリント法は、 DNA上にタンパク質が結合すると DNase Iの消化から保護される現象を利用している。すなわち、末端を³² Pで標識したプロモーター領域ゃェンハンサー領域の DNAを、転写因子の共存化で DNase Iによって部分消化し、これを塩基配列決定用の変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。転写因子の無い状態で同様の処理を行った結果と比較すると、転写因子の結合によってバンドの消失が観察されることから、その結合部位の推定が可能となる。

本発明はまた、メグ一 1を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には、例えば、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体が含まれる。メグ一 1または本発明のメグ一 1の部分ペプチドに対する抗体（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清は、本発明のメグ一 1、本発明のメグ— 1の部分ペプチド、あるいは本発明による C- myc- (Hi s) ₆- Tag-メグー 1や MBP-メグ— 1のような融合タンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

本発明のメグ— 1、または本発明のメグ一 1の部分ペプチドは、温血動物に対して投与による抗体産生が可能な部位に、公知の担体や希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常〜 6週毎に 1回ずつ、計 2〜10回程度行われる。抗体産生に用いられる温血動物としては、例えばサル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、あるいはニヮトリ等が挙げられるが、マウスおよびゥサギが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化メグ一 1と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495 (19 75) ) に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGが用いられる。

骨髄腫細胞としては例えば X- 63Ag8、 NS-K P3UK SP2/0、 AP - 1などが挙げられるが、 X-63Ag8が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 20〜20： 1であり、 PEG (好ましくは P EG1000〜PEG6000) が 10〜8 (^程度の濃度で添加され、 20〜40で、好ましくは 30 〜37 で 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗メグー 1抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばメグ一 1抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリド一マ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体）が用いられる。またはプロテイン Aを加え、固相に結合した抗メグー 1モノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロプリン抗体又はプロティン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したメグ一 1を加え、固相に結合した抗メグー 1モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。

抗メグー 1モノクローナル抗体の選別およびクローニングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行われる。選別、クロー二ングおよび育種用培地としては、ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。例えば、 1〜20%、好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地（大日本製薬（株））、 1〜10%の牛胎児血清を含む GIT培地 (和光純薬工業（株））、またはハイプリドーマ培養用無血清培地（SFM- 101、日水製薬（株） ) などを用いることができる。培養温度は、通常 20〜40で、好ましくは約 37 である。培養時間は、通常 5日〜 3週間、好ましくは 1週間〜 2 週間である。培養は、通常^炭酸ガス下で行われる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗メグー 1抗体価の測定と同様にして測定できる。クロ一ニングは、通常半固体アツガー法や限界希釈法などのそれ自体公知の方法で行うことができ、クローン化されたハイプリドーマは、好ましくは無血清培地中で培養され、至適量の抗体をその上清に与える。目的のモノクローナル抗体は腹水化して得ることもできる。

本発明によるモノクローナル抗体は、メグ一 1に特異的なェピトープを認識するものを選択することによって他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的に、そのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも 7以上のアミノ酸残基、望ましくは 10- 20アミノ酸のアミノ酸配列によつて提示されるェピトープは、そのタンパク質に固有のェピトープを示すといわれている。したがって、配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列から選択され、かつ連続する少なくとも 7ァミノ酸残基からなるアミノ酸配列を持つペプチドによって構成されるェピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明におけるメグ— 1特異的なモノクローナル抗体といえる。より具体的には、たとえば前記 PP4_R1との構造上の違いをもたらしている 1 8アミノ酸残基（N末端から 1 8— 3 5位）からなる領域を認識し、たとえば PP4_R1のような相同性の高いタンパク質との構造的な違いを識別する抗体は、本発明によるメグ一 1を認識する抗体の望ましい態様と言う事ができる。

抗メグー 1モノク口一ナル抗体の分離精製は通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例えば DEAE) による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロティン Aまたはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を示すことができる。このようにして得られたメグ一 1を認識する本発明によるモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体は、メサンギゥム細胞に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。またメグ一 1がメサンギゥム細胞に高度に発現しているタンパク質であることから、メサンギゥム細胞の同定や検出のためのツールとしても、これらの抗体を利用することができる。細胞が持つタンパク質を免疫学的に検出する方法は公知である。またこれらの抗体を用いてメグ一 1を測定する方法としては、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりメグ一 1 を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識ヒト ·メグ一 1と検体中のヒト由来メグ一 1を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のヒト由来メグ一 1を測定する競合法等を示すことができる。

サンドイッチ法によるメグ一 1の測定においては、まず、固定化抗体とメグ— 1とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体ーメグー 1標識化抗体を形成させる 2ステツプ法、もしくは固定化抗体、標識化抗体およびメグ一 1を同時に混合する 1ステップ法などを用いることができる。

測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、ァガロース等の多糖類、ガラス、金属などが挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えば卜レイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。

抗体の固相化は、公知の化学結合法又は物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては例えばダルタルアルデヒドを用いる方法、 N-スクシ二イミジル -4- (N-マレイミドメチル）シクロへキサン- 1-カルボキシレート及び N-スクシニイミジル- 2-マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、卜ェチル- 3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド塩酸などを用いるカルポジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾィル -N-ヒドロキシサクシニミドエステル法、 N-サクシミジル- 3- (2-ピリジルジチォ）プロピオン酸法、ビスジァゾ化べンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とェピトープの異なる 2種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第 3の抗体を上記の方法で固相化させておいて捕捉することも可能である。

標識物質は、免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。具体的には、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、金属キレート等を使用することができる。好ましい標識酵素としては、例えばペルォキシダ一ゼ、アルカリフォスファタ一ゼ、 /3 - D-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナ一ゼ、ブドウ球菌ヌクレア一ゼ、デル夕- 5-ステロイドイソメラーゼ、 α -グリセ口 —ルホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフエ一トイソメラ一ゼ、西洋わさびパーォキシダ一ゼ、ァスパラギナーゼ、グルコースォキシダ一ゼ、リボヌクレアーゼ、ゥレアーゼ、力夕ラーゼ、グルコース一 6—ホスフェートデヒド口ゲナ一ゼ、ダルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼ等が挙げられる。好ましい蛍光物質としては、例えばフルォレセインイソチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシァニン、ァロフィコシァニン、およびオルトフタルアルデヒド等が挙げられる。好ましい発光物質としてはイソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族ァクリジニゥムエステル、イミダゾール、ァクリジニゥム塩及びその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびェクオリン等が挙げられる。そして好ましい放射性物質としては、 I、 ¹²⁷I、 I、 ^l4C、 ¾、 ³²P、あるいは³⁵ S等が挙げられる。

前記標識物質を抗体に結合する手法は公知である。具体的には、直接標識と間接標識が利用できる。直接標識としては、架橋剤によって抗体、あるいは抗体断片と標識とを化学的に共有結合する方法が一般的である。架橋剤としては、 Ν, Ν' -オルトフエ二レンジマレイミド、 4- (Ν-マレイミドメチル）シクロへキサン酸 . N-スクシンイミドエステル、 6-マレイミドへキサン酸 · N-スクシンイミドエステル、 4， 4' -ジチォピリジン、その他公知の架橋剤を利用することができる。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。この他、抗体にピオチン、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンのような低分子ハプテンを結合させておき、これを認識する結合成分によって間接的に標識する方法を採用することもできる。ピオチンに対してはアビジンやストレプトアビジンが認識リガンドとして利用される。一方、ジニトロフエニル、ピリドキサール又はフルォレサミンについては、これらのハプテンを認識する抗体が標識される。抗体を標識する場合、西洋わさびペルォキシダーゼを標識化酵素として用いることができる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができるので有利である。また、抗体としては場合によっては、そのフラグメント、例えば Fab'、 Fab、 F (ab' ) ₂を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体はァフィ二ティ一クロマトグラフィ一等の公知の方法にて精製すれば更に感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、防腐剤としてチメロサール (Th imerosal)等を、そして安定剤としてグリセリン等を加えて保存する。標識抗体は、凍結乾燥して冷喑所に保存することにより、より長期にわたって保存することができる。

標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、基質溶液として H₂0₂を用い、発色剤として 2， 2' -アジノ-ジ - [3 -ェチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニゥム塩（ABTS) 、 5-ァミノサリチル酸、オルトフエ二レンジァミン、 4-ァミノアンチピリン、 3，3' , 5，5' _テトラメチルべンジジン等を使用することができる。酵素にアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合は、基質としてオルトニトロフエニルフォスフエ一ト、パラニトロフエ二ルリン酸等を使用することができる。酵素に 3 -D-ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルォレセイン-ジ- （)3 - D-ガラクトピラノシド）、 4-メチルゥンベリフエニル - j3 - D -ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明は、また、前述のモノクローナル抗体、あるいはポリクロ一ナル抗体を標識して、あるいは固相化してメグ一 1の免疫学的測定用試薬としたもの、更にはこの試薬に標識検出用の指示薬や対照試料等をキット化したのものをも含むものである。

本発明におけるメグ一 1の測定対象は、血漿、血清、血液、尿、組織液、あるいは脳脊髄液等の体液等、メグ— 1、あるいはメグ一 1の前駆体や断片を含む生体試料であれば限定されない。

加えて本発明は、メグ一 1遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物に関する。ここでメグ一 1遺伝子とは、メグ一 1をコードする cDNA、ゲノム DNAあるいは合成 DNAを含む。また、遺伝子の発現には、転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。本発明によるトランスジエニック動物は、メグー 1の機能あるいは発現調節の研究、ヒトのメサンギゥム細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング ·安全性に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。

本発明においては、メグ— 1遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位（ェンハンサー、プロモーター、イントロン等）の一部に欠失、置換、挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に上昇または下降するように修飾することができる。このような修飾は、メグ一 1遺伝子の転写の調節である。一方、ェキソンの一部を欠損させたり、翻訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、タンパク質への翻訳を修飾することもできる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができ、トランスジエニック動物を得ることができる。

トランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンス RNAを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス ' トランスジエニック動物や、胚性幹細胞（ES細胞）を用いて特定の遺伝子をノックアウトさせた動物、点突然変異 DNAを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。本明細書中でいうトランスジエニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む。

トランスジエニック動物の作製方法は、遺伝子と卵を混合させてリン酸カルシゥムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第 48731 91号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用する方法などがある。その他、レトロウイルスべクタ一に遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等が開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M. Lav i t ranoe t ら Ce l l , 57, 71 7, 1989) 。

あるいはバクテリオファージ P Iの c re/l oxPリコンビナーゼ系や Saccharomyc es cerev i s i aeの FLPリコンビナーゼ系等の i n v i voにおいて部位特異的遺伝子組み換えを用いることもできる。また、レトロウイルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。

マイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作製方法は、例えば以下に示すようにして行われる。まず、発現制御に関わるプロモー夕一、特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリ Aシグナルから基本的に構成されるトランスジーンが必要である。プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジエニック動物は系統間で異なるため、各系統間で発現様式 ·発現量を確認する。非翻訳領域ゃスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリ Aシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス (5〜6週齢）、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。

効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよい。受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵の雄性前核にインジェクシヨンピペット中の遺伝子を注入する。注入した卵を輸卵管に戻すための動物（偽妊娠雌マウス等）を用意し、一匹に対して約 10〜15個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否か、尾の先端部からゲノム DNAを抽出し、サザン法あるいは PCR法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を挿入したポジティブクローニング法により選択することができる。さらに、トランスジ一ンの発現を確認するため、ノザン法もしくは RT-PCR法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質に対する特異的抗体によって、ゥェスタンプロッティング法による検出も可能である。

本発明のノックァゥトマウスは、マウスメグ— 1遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックァゥトマウスとは相同組換え技術で任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジエニックマウスをいう。胚性幹細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や 8 細胞期胚に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス（キメラとは、 2 個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう）と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変 ·破壊されたへテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。本発明によるトランスジエニック動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体のいずれをも含むものである。

相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別には PCRを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして使った PCR反応を行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明する。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。図面の簡単な説明

図 1は、正常ヒト糸球体組織の、メグ一 1特異的なプローブによるインサイチュハイブリダィゼーシヨンの結果を示す顕微鏡写真（40倍）である。

図 2は、正常ヒト糸球体組織の、メグ一 1特異的なプローブによるインサイチュハイブリダィゼーシヨンの結果を、図 1の場合と比較して、より高倍率で示す顕微鏡写真（80倍）である。

図 3は、抗 Thyl抗体によりメサンギゥム増殖性腎炎を誘発したラッ卜の糸球体から調製した全 RNAの泳動結果を示す写真（図中、「t o t a l RNA」で示す）、およびそれらのメグ— 1特異的なプローブによるノーザンブロット解析の結果を示す写真（図中、「ra t Meg- 1」で示す）である。発明を実施するための最良の形態

以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。 [実施例 1] ヒトメサンギゥム細胞の初代培養

58才の男性から摘出した正常なヒト腎臓から、ヒト糸球体腎臓メサンギゥム細胞を単離した。腎皮質を、無菌条件下で分離し、細分化し、いくつかの篩を通過させた。用いる篩は、段階的に孔径を小さくしていった。 75〜200/ mの孔径の篩に捕捉された糸球体を、洗浄し、 100/ig/mLのコラゲナーゼ（Washington B iochemical社製）と共に 37 で 20分間インキュベートした。洗浄後、糸球体を、 25mM HEPES, 10¾ Nu-serum (Collaborative Biomedical Products社， Bedford, MA) および抗生物質（lO g/mLのペニシリン、ストレプトマイシン、およびフアンギゾン）を含む培地 199 (Gibco BRL社， Gai thersburg, MD) に再懸濁させ、 5%C0₂インキュベーター内でインキュベートした。 3継代目に、メサンギゥム細胞を、典型的な形態学的特徴、トリプシン、ピューロマイシンおよび D-バリンに対する耐性、ァクチン（Zymed Laboratories社， San Francisco, CA) 、抗 VL A(very late ant igen)-l, 3, 5 (I匪 unotech) の免疫染色に対して陽性を示すこと、ならびに第 VIII因子（Dako社， CA) の免疫染色に陰性を示すことなどの一連の基準により同定した。

[実施例 2] ヒト培養メサンギゥム細胞からの mRNAの単離

6継代目に、グァニジンイソチオシァネート（GTC) 法を用いて、全 RNAをヒトメサンギゥム細胞から単離した。即ち、実施例 1の細胞の血清を含む培養液中のメサンギゥム細胞コンフルェント培養物をリン酸緩衝生理食塩水（PBS) で洗浄し、 5.5mM GTC溶液中で溶解させた。 DNAは 18ゲージの針を通過させることにより除去した。核およびその他の細胞破片は 5, OOOXgで 90秒間遠心分離することにより沈殿させた。上清をセシウムトリフルォロアセテート（CsTFA) 層に注意深く載せ、 15Τ 125， OOOXgで 24時間遠心分離した。 RNAペレットを TEバッファーに溶解させた。オリゴ dTセルロースカラム（フアルマシア社）により、 p oly(A)⁺RNAを分離した。

[実施例 3] 3'領域 cDNAライブラリーの構築 poly(A)⁺RNAを铸型として、 pUC19を基礎とするベクタープライマ一 [Norrande r J.,et al.，Gene，26, 10卜106(1983)]を用いた cDNA合成を行った。このべクタ一プライマー DNAは、 HincII末端、および Tテールをもつ Pstl末端を有し、 Mbo I部位（GATC) でダム 'メチル化（dam- methylated) されていた。第 2鎖の合成の後、 cDNA配列、およびベクターの lacZ遺伝子内の単一 BamHI部位を、それぞれ Mbolおよび BamHIで切断し、次に、低 DNA濃度で環状化およびライゲーションを行った。ライゲーシヨン混合物のうちの一部を大腸菌に形質転換した。得られた形質転換体をランダムに選択し、簡単に加熱することにより個別に溶解させた。 cDNA挿入配列を、 PUC19クロ一ニンダサイトに隣接するプライマ一（5'- TGT AAAACGACGGCCAGT-3' /配列番号： 3および 5' -ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3 ' /配列番号： 4) を用いたペアード PCRにより増幅させた。得られた短い二本鎖 DNAを、サイクル配列決定反応に用い、自動配列決定機で解析した。

[実施例 4] メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子の単離

メサンギゥム細胞で特異的に発現している遺伝子を同定するため、本発明者は、大規模な DNA配列決定およびコンピュータによるデータ処理を行った。このことにより、様々な異なる細胞および臓器における転写産物を同時に比較することがでさた (Y. Yasuda et al. , Kidney Internatinal 53:154-158, 1998; K. Matsub ara et al. , Gene. 135, 265 (1993)； K. Okubo et al. , Nat. Gen. 2, 173 (19 92)) 。ヒト培養メサンギゥム細胞の 3'領域 cDNAライブラリーの大規模 DNA配列決定を行い、ランダムに選択した 1836個のクローンの部分配列を決定した。クローンの配列相同性を、相互に比較し、さらに FASTAプログラムを用いて DNA データバンク GenBankと比較した。様々な臓器および細胞からの mRNAをドットブロット解析することにより、メサンギゥム細胞で特異的に発現しているクロ一ンが選択された。その結果、本発明者のメサンギゥム細胞 cDNA

おいてきわめて高い頻度で検出されるいくつかのクローンが得られた。

[実施例 5] 5' RACE法による完全長 cDNAのクローニング「5'- Full RACE Core Set」（宝酒造（株）製）を用いて、下記の実験を行つた。 0.5mLマイクロチューブにヒト培養メサンギゥム細胞から調製した poly(A) + RNA (O. g/ l) 4.0 L、 10XRTバッファ一 1.5 L、 RNaseインヒビ夕一（40 Wfil) 0.5 L、 AMV Reverse Transcriptase XL (W ml) L, 5'末端リン酸化 RTプライマー (5' - pTCAGAGAGGTCATTC/配列番号： 5、 200PDIO1/ D Lを加え、 RNase Free dH₂0 7 で全量を 15 Lとした。この反応液を「Takara PC R Thermal Cyclerj (宝酒造（株）製）にセットし、 30で10分、 50で60分、 8 0 2分、 4°C10分インキュベーションし、第 1鎖 cDNAを得た。

反応液から 15 Lを 5Xハイブリッド RNA変性バッファー 15 L、 H₂0 45 を含む 0.5mLマイクロチューブ中に加えた。 RNaseH 1 Lを加え、 30°Cで 1時間反応させた。反応終了後、エタノール 150 Lを加え - 70でで 30分冷却後、遠心し、上清を除去し、沈殿物を集めた。

得られた沈殿物に 5XRNA (ssDNA) ライゲーシヨンバッファ一8 し 40% PEG #600 20 L、 H₂0 を加え、よく混ぜ、 T4リガーゼを L加えて 16 で 1 5時間反応し、環化一本鎖 cDNAを得た。

得られた環化一本鎖 cDNAを TEバッファーで 10倍希釈したものを铸型とし、一次 PCRをおこなった。反応条件は、 10XLA PCRバッファ一 II (Mg plus) dNTP混合物（2.5mM) 8^L、一次 PCR SIプライマー（5' - TCATTGATGGGTCCTCM/ 配列番号： 6、 20pmol/ L)0.5 一次 PCR A1プライマー（5' - AGATTCTTGAGCT CAGAT/配列番号： 7、 20pmol/ iL) 0.5 し TaKaRa LA TaqTM (5U/ L) 0.5 L、減菌水で全量を 50^Lとした。「Takara PCR Thermal Cyclerj にセットし、 9 4で3分加熱後、 94 30秒、 60°C30秒、 72 2分を 25サイクル反応させた。

一次 PCR反応溶液から 1 /Lを铸型とし、 10XLA PCR TMバッファー II (Mg²⁺pl us) 5 し dNTP混合物（2·5πιΜ) 8 L、二次 PCR S2プライマー（5' - AATGGTGGCA TAMCATG/配列番号： 8、 20pmol/ L) 0.5 L, 二次 PCR A2プライマー（5' - ACA GACAMTTGMCTTC/配列番号： 9、 20pmol/ L) 0.5^し TaKaRa LA TaqTM (5U//X L) 0.5 L、減菌水で全量を 50 Lとした。「Takara PCR Thermal Cyclerj にセットし、 94°C30秒、 60°C30秒、 72で 2分で 30サイクル反応させた。

0.75 %ァガロースゲル電気泳動法でバンドが得られていることを確認し、反応溶液中からを「0riginal TA Cloning Kitj (Invitrogen社）を用いてサブクローニングし、得られたプラスミドに挿入された遺伝子断片の塩基配列をジデォキシターミネ一シヨン法により決定した。

その結果、得られた塩基配列は、遺伝子産物の N末部分をコードする領域を含み 5'非翻訳領域として約 50ヌクレオチドを含んでいた。予想される開始コドン ATGの位置が、コンセンサス配列と一致し、最長の 0RF ( 「the first ATG rul e」を満足する）を与えた。この cDNAの塩基配列において最も長い 0RFに基づく 950アミノ酸残基を遺伝子産物の推定アミノ酸配列とした。このアミノ酸配列を持つタンパク質を本発明者はメグ一 1 (Meg- 1)と名づけた。 meg- 1 cDNAの塩基配列を配列番号： 1に、 meg-1の推定アミノ酸配列を配列番号： 2に示す。

[実施例 6] メサンギゥム特異的遺伝子の機能解析（1)

SwissProtデータベースで FASTAプログラムによりアミノ酸ホモロジ一検索を行ったところ、このメグ一 1が新規なタンパク質であることを確認した。またホモロジ一を持つタンパク質としては、プロテインセリンノスレオニンフォスファ夕一ゼ 4関連タンパク質 PP4_R1が確認された。メグ— 1と PP4_RIは、アミノ酸配列において 97. 9 、 cDNAの塩基配列においては 98. 3%のホモロジ一を持つ。その他、配列番号： 2として示すアミノ酸配列の一部（778位— 950位の 1 73アミノ酸残基）は、胎児脳由来の ESTとして登録された cDNAの塩基配列 (HSU79267)と塩基配列で 99.4¾、アミノ酸配列で 100%—致している。このクローンは IMAGE consortiumによる Soares library 1NIBに由来するもので、単に塩基配列の一部を決定したにすぎず、その機能やボディマッピングについてはまつたく知られていない。続いてメグ— 1のアミノ酸配列をモチーフ検索した。検索には、 PSORT WWW Se rver (http://psort.nibb. a jp: 8800/)、および MOTIF (ht tp：〃 www. mot i f . genom e.ad. jp/)を利用した。その結果、メグ— 1はいくつかのリン酸化モチーフを含んでいることが明らかとなった。具体的には、以下のリン酸化酵素によるリン酸化モチーフの存在が確認された。その他に、 6つの N-グリコシレーシヨン部位が認められた。更に核移行シグナルの存在が示唆され、推測される核局在は 52. 2%であった。

cAMP/cGMP依存性夕ンパク質リン酸化部位： 1

カゼィン ·カイネース II リン酸化部位： 2 2

プロテイン力イネ一ス Cリン酸化部位： 1 1

チロシンカイネースリン酸化部位： 2

また、これらの事実に基づいて、 950アミノ酸残基からなる上記推定アミノ酸配列がメグ一 1のアミノ酸配列であることが確認された。このアミノ酸配列からなるタンパク質の p Iの理論値は 4.49である。

[実施例 7] メグ一 1の機能解析（2) —組織分布

メグ一 1のノーザンブロット解析は、以下のようにして行った。 3'領域 cDNA ライブラリー（実施例 3) のポジティブクローンのインサートを、ランダム DNA ラベリングによって RI標識しプローブとして用いた。試料として以下の細胞から単離した poly(A)⁺RNA (2 fig) を、 2.2Mホルムアミドを含むァガロースゲルで分離し、ニトロセルロースフィルターへ転写した。フィルターを Rapid Hyb 溶液 (Amersham ¾：, Arlington Heights, IL) 中でノ、イブリタィズさ "た。ノ、ィブリダィズ後に、 60°Cで、 0.1XSSPE/0. SDSという最終ストリンジエンシーで洗浄した。

ヒ卜の複数の初代培養細胞および組織のノーザンブロット、ヒ卜の癌細胞株のノーザンブロットのための試料は、 Clontech (Palo Alto, CA) から購入した。初代培養細胞としては、メサンギゥム細胞、ヒト皮膚上皮細胞、ヒト腎皮質上皮細胞、ヒ卜臍帯静脈内皮細胞、およびヒ卜平滑筋細胞の初代培養細胞由来の 2 gの poly(A)⁺RNAを試料とした。ヒトの癌細胞株のノーザンプロットには、前骨髄球白血病 HL-60、 HeLa細胞 S3、慢性骨髄性白血病 K- 562、リンパ芽球白血病 M 0LT- 4、 Burkitt リンパ腫 Raj i、大腸腺癌 SW480、肺癌 A549、および黒色腫 G361 由来のの P0ly(A)+RNAを試料とした。組織のノーザンブロットには、心、脳、胎盤、肺、肝、骨格筋、腎、および降由来の 2/ gの poly(A)⁺RNAを試料とした。ハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄は上記と同様にして行った。結果は表 1—表 3に示すとおりである。

表 1

初代培養細胞

ヒトメサンギゥム細胞

ヒト皮膚繊維芽細胞 + +

ヒト腎皮質上皮細胞 +

ヒト臍帯静脈内皮細胞土〜 +

ヒト平滑筋細胞土〜_ h 表 2

ヒト癌細胞株

前骨髄球白血病 HL-60 + +

HeLa細胞 S3

慢性骨髄性白血病 K- 562

リンパ芽球白血病 M0LT-4

Burkitt リンパ腫 Raj i 土

大腸腺癌 SW480 + + +

肺癌 A549 + + +

黒色腫 G361 + + 表 3

ヒト組織

、

脳 + +

胎盤 + + +

肺

肝 +

骨格筋 + +

+ +

塍 + +

メグ一 1 cDNAプローブを用いたノーザンブロット解析で、メサンギゥム培養細胞に単一の転写産物（約 4. 5kb) が検出された。ヒ卜の初代培養細胞においては、メグ一 1遺伝子がメサンギゥム細胞で特に高度に発現していることが特徴的であった。その他の初代培養細胞では、皮膚繊維芽細胞ゃ腎皮質上皮細胞で発現が観察され、臍帯静脈内皮細胞、平滑筋細胞においてはわずかな発現が観察された。組織間の比較においては心および胎盤、次いで脳、骨格筋、腎および Ji萃において高度な発現が観察された。その他に肝で弱い発現が観察され、肺での発現は観察されなかった。培養癌細胞株においては HeLa細胞 S3、慢性骨髄性白血病 K- 562、リンパ芽球白血病 MOLT - 4、大腸腺癌 SW480、および肺癌 A549で強い発現が観察され、前骨髄白血病 HL-60、黒色腫 G361でも発現が見られた。 Burki t tリンパ腫 Raj iでは、ほとんど発現が見られなかった。

[実施例 8 ] メグ— 1の機能解析（3) —インサイチュハイブリダィゼーショ健常人の腎臓から得られたヒト腎組織を用いたインサイチュハイブリダィゼーシヨンにより、メグ— 1の mRNAの組織内における発現状態を評価した。インサイチュハイブリダィゼ一シヨンは、公知の方法により行った（Kidney Int., 52，

111 (1997)) 。ヒト ·メグー1の 2879〜 29 1 2位の塩基配列（配列番号： 10) をプローブとして用いた。図 1および図 2に示すように、糸球体のメサンギゥム領域の細胞がメグー 1 mRNA陽性であることを確認した。

[実施例 9] ラット ·メグ一 1

メグ一 1のラッ卜におけるホモログの取得を試みた。

ラットの腎メサンギゥム細胞から全 RNAを採取し、 cDNAを合成した。この cDNA を铸型として、ヒトメグー 1の塩基配列に基づいて各種の degenetative primer を用いて PC Rを行った。 degenetative primerは、ヒト ·メグ— 1における以下の領域に相当する部分に設定した。

センス鎖： lnt-18nt

アンチセンス鎖： 2852nt-2872nt

予測された大きさの増幅産物をクローニングし、塩基配列を決定した。更に、 3末端は marathorn法（メグシンを単離同定したときと同様の方法）によって、一部の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列番号： 1 1に、また推定アミノ酸配列を配列番号： 12に示す。

その結果、これまで報告されていない新規な塩基配列からなるラット ·メグ一 1ホモログが単離された。ラット ·メグ— 1は、遺伝子レベルで 74.3%、蛋白レベルで 86.3%と、ヒト ♦メグ一 1に対して高度に保存された構造を有する。更に、ラットにおけるラット ·メグ一 1の細胞、組織局在を、試料とプローブが異なる他は実施例 7と同様の方法により解析した。結果は次のとおりである。脳 +

肺 +++

、臓 +

肝臓 + 脾臓 ++

腎臓 ++

平滑筋 -〜 +

メサンギゥム細胞 +++

腎上皮細胞 -〜十

腎内皮細胞 -〜 +

メグ— 1は、ヒトにもラットにも種を越えて腎臓（特にメサンギゥム細胞）に高発現していることから、メサンギゥム細胞の機能に関与する機能遺伝子の一つである可能性が考えられる。

[実施例 10] メサンギゥム増殖性腎炎を誘発させた糸球体におけるメグ一 1 の特異的発現

ラットにおいて、ラット Thyl抗原に対するモノクローナル抗体の投与によりメサンギゥム増殖性腎炎が誘発されることが知られている（Yagi M, Yamamoto T,

Nagano N, Kato S, Kusaka M, Kawasaki K， Yaoita E, Kihara T: Transient e xpress ion of type I collagen in glomeruli with antト Thy - 1 ant i ody- indue ed mesangial proliferative lesions. Pathol Int 45: 409-414, 1995) 。この方法によりメサンギゥム増殖性腎炎を誘発させたラッ卜の糸球体におけるメグ—

1の発現をノーザンブロット解析により検出した。

抗ラット Thylモノクローナル抗体の調製は、この抗体を産生するハイプリド一マ（European Collection of Animal Cell Cultures (Sulisbury, UK)より購入) を用レ、て行った (Salant DJ， Darby C, Couser WG: Experimental membrano us glomerulonephritis in rats. J Clin Invest 66: 71-81, 1980) 。すなわち、このハイブリドーマを RPMI- 1640培地（10% ゥシ胎児血清を含む）で培養したのち、 1X10⁶個の細胞を RPMI- 1640培地 0.5mLに懸濁し、 7日前にあらかじめ不完全フロイントアジュバントを腹腔内にィンジェクシヨンしておいた Balb/cマウス（ォス、 10週齢）の腹腔に接種した。接種後 2週間以内にこのマウスから腹水を得、遠心で不溶物を除いたのち、上清を回収した。この上清を PBSに対して透析し、 IgGを多く含む画分を 50% 飽和の硫酸アンモニゥムにより沈殿させた。 IgGを精製するために、粗製抗体を HiTrap Pro te i n Aカラム（Pharmac i a Bi ote ch (Tokyo, Japan) ) にかけた。カラムに吸着した IgGは溶出液（0. 1 M クェン酸ナトリウム， pH5) にて溶出し、 PBSに対して透析したのち、実験に用いた。メサンギゥム増殖性腎炎を誘発させたラッ卜の糸球体におけるメグ— 1 mRNA の発現は以下のように検出した。なお、すべての動物実験は Gu i de for An ima l Exper imentat i on (東京大学医学部）に従って行った。まず、ウイス夕一ラット (ォス、 6週齢、 Char l es Ri ver lapan (Yokohama, Japan)より購入）を 1週間飼育したのち、体重 lkgあたり 1. 2mgの IgGl マウスモノクローナル抗 Thyl抗体（0X7) を静脈内注射により投与した。また、コントロールとして媒体のみを同様に投与したラットも用意した。投与前、および投与後 2, 4, 7, 14および 2 8日目にそれぞれ 6匹のラッ卜から腎臓を摘出し、細分化して篩を通過させることにより、糸球体を分離した。この糸球体から全 RNAを単離し、ノーザンブロット解析にかけた。その際、プロ一ブとして、ラット ·メグ一 1の 841〜1979位の塩基配列（配列番号： 1 3 ) を持つフラグメントを用いた。この領域はプロティンフォスファターゼ 2A (PP2A) の Aユニット（調節ユニット）とはホモロジ一が低く、プローブとして適している。プローブの調製は、ラットメサンギゥム細胞の cDNAを铸型にした PCRにより増幅した断片を pGEM- T easyにサブクロー二ングし、 EcoRIで切り出すことにより行った。

ノーザンブロット解析の結果、抗 Thyl抗体によりメサンギゥム増殖性腎炎が誘発された糸球体において、メグ一 1の発現が著しく増加していることが確認された（図 3 ) 。産業上の利用の可能性本発明により、メサンギゥム細胞に高頻度に発現している DNA、該 DNAのコードするタンパク質、該タンパク質に結合する抗体等が提供された。これらはメサンギゥム細胞に特異的な生理活性に深く関与していると推測され、メサンギゥム細胞の同定、メサンギゥム細胞の異常の検出などに有用である。更に、該タンパク質の機能からメサンギゥム細胞の機能が明らかになり、メサンギゥム細胞に関連する疾患の原因究明への展開が期待される。また、メサンギゥム増殖性腎炎のようなメサンギゥム細胞に関連する疾病の治療、診断等への応用が期待される。具体的には、たとえばメグ一 1の人為的な調節によって、糸球体腎炎の発症や進展を制御できる可能性がある。あるいはメサンギゥム細胞や体液中のメグ一 1 タンパク質や mRNAの定量によって、糸球体腎炎などの腎疾患の診断が可能となることが期待できる。糸球体腎炎ではメサンギゥム領域の機能異常が見られ、メサンギゥム細胞の増殖、あるいは細胞からのマトリックス基質の産生亢進が起きている。これらの病態にメグ一 1が関与している可能性は十分に考えられる。本発明によるメグ— 1は、メサンギゥム細胞で高度に発現しているという点では、本発明者が先に報告したメグシンと共通の特徴を備えている。しかしながら本発明によるメグ一 1はホスファタ一ゼとの相同性を示し、核移行シグナルを持つた核タンパク質である可能性が示唆されるのに対して、メグシンはプロテア一ゼインヒビ夕一である SERPINスーパ一ファミリーとの相同性を持つタンパク質である。また本発明によるメグ一 1が比較的広範囲な組織において発現が観察されている点は、メグシンのメサンギゥム細胞に特異的に発現しているという特徴と相違する。したがって本発明によるメグ _ 1は、メサンギゥム細胞の機能を支える重要なタンパク質である可能性を持っている。このような重要なタンパク質の存在を明らかにした本発明の意義は大きい。

Claims

請求の範囲

1. 下記（a) から（d) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

(a) 配列番号： 1に記載された塩基配列の蛋白質コード領域を含むポリヌクレオチド。

(b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

(d) 配列番号： 1に記載された塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。

2. 請求項 1に記載のポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされる蛋白質。

3.請求項 1に記載されたポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター。

4.請求項 1に記載されたポリヌクレオチドのいずれか、または請求項 3に記載のベクターを保持する形質転換体。

5.請求項 4に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項 2に記載の蛋白質の製造方法。

6.配列番号： 1に記載された塩基配列、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる 15ヌクレオチド以上の鎖長を持つオリゴヌクレオチド。

7. 請求項 6に記載のオリゴヌクレオチドと被検試料を接触させ、このオリゴヌクレオチドのハイプリダイズを観察する工程を含む、配列番号： 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの検出方法。請求項 6に記載のオリゴヌクレオチドと被検試料を接触させ、このオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程を含む、配列番号： 1 に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの合成方法。

請求項 6に記載のォリゴヌクレオチドを含むメサンギゥム細胞の検出用試薬。. 生体試料中における請求項 1に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、正常試料から得られた測定値と比較することによってメサンギゥム増殖性腎炎を検出する方法。

. 生体試料がメサンギゥム細胞である請求項 1 0に記載の方法。

. 発現レベルを、配列番号： 1に記載の塩基配列から選択された塩基配列からなる mRNAを指標として測定する請求項 1 0に記載の方法。

. 発現レベルを、請求項 2に記載のタンパク質またはその断片を指標として測定する請求項 1 0に記載の方法。

. 請求項 1に記載のポリヌクレオチド、またはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド。

. 請求項 2に記載の蛋白質を認識する抗体。

. 配列番号： 2のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を持つタンパク質の一部を認識する請求項 1 5に記載の抗体。

. 請求項 1 5に記載の抗体と請求項 2に記載のタンパク質、またはその断片との免疫学的な結合に基づいて請求項 2に記載のタンパク質またはその断片を測定する免疫学的測定方法。

. 請求項 1 5に記載の抗体を含む請求項 2に記載のタンパク質またはその断片の免疫学的測定用試薬。

. メグ一 1をコードする遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物。

. 非ヒト脊椎動物がマウスである請求項 1 9に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。

. メグ— 1をコードする遺伝子の発現が抑制されたノックァゥトマウスである請求項 2 0に記載のトランスジエニック非ヒト脊椎動物。