UA73071C2

UA73071C2 - Improved method for processing activated protein c

Info

Publication number: UA73071C2
Application number: UA99105788A
Authority: UA
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2005-06-15
Also published as: CZ381099A3; EG23685A; PL336889A1; PT875252E; AU743531B2; ZA983496B; TWI242443B; SV1998000051A; BR9809304A; JP2001524111A; ZA983497B; CN1227025C; WO1998048822A1; AU740753C; AU7161898A; US6162629A; AU740753B2; IN187157B; NZ500346A; UA55448C2

Description

Опис винаходу

Цей винахід, у загальному плані, має відношення до способу зниження саморозкладу активованого білку С 2 підчас обробки та очищення.

Білок С є сериновою протеазою та природним антикоагулянтом, який відіграє роль у регулюванні гомеостазу шляхом інактивації Факторів Ма та МПа у системі згортання крові. Людський білок С утворюється іп мімо головним чином у печінці у вигляді одноланцюгового поліпептиду, який складається з 461 амінокислоти. Ця молекула-попередник піддається численним посттрансляційним модифікаціям, до яких належить 1) гідроліз 70 д2-амінокислотної сигнальної послідовності; 2) протеолітичне видалення з одноланцюгового зимогену залишку лізину у положенні 156 та залишку аргініну у положенні 157 з одержанням молекули 2-ланцюгової форми (тобто легкого ланцюгу з 155 амінокислотних залишків, який приєднано через дисульфідний місток до важкого ланцюгу з 262 амінокислотних залишків, до складу якого входить серинова протеаза); 3) залежне від вітаміну К карбоксилювання дев'яти залишків глутамінової кислоти, згрупованих у перших 42 амінокислотах згаданого 12 легкого ланцюгу, наслідком чого є одержання дев'яти залишків гамма-карбоксиглутамінової кислоти (01 А); та 4) приєднання вуглеводу у 4 місцях (одне у згаданому легкому ланцюзі та три у згаданому важкому ланцюзі). До складу згаданого важкого ланцюгу входить добре відома серинпротеазна триада Авр257, Ніз211 та Зегзбо. І, нарешті, циркулюючий 2-ланцюговий зимоген активується іп мімо тромбіном на поверхні фосфоліпіду У присутності іону кальцію. Активація є наслідком видалення додекапептиду на М-кінцевій ділянці згаданого важкого ланцюгу з утворенням активованого білку С (аРС), який має ферментну активність. У злагоді з іншими білками, активований білок С функціонує як, можливо, найважливіший негативний регулятор згортання крові, наслідком якого є тромбоз.

На жаль, аРС може також саморозкладатись, наслідком чого є зниження його функціональності, як антикоагулянта. Визнаним шляхом розкладу активованого білку С у цій галузі є протеолітична вирізка на с згаданому лізиновому залишку у положенні 308 важкого ланцюгу, наслідком чого є утворення фрагменту зі 111 Ге) амінокислот. Цей продукт розкладу у данній галузі називають фрагментом ЕАК.

Увагу під час здійснення попередніх спроб зниження саморозкладу було концентровано на зведенні утворення згаданого фрагменту ЕАК до мінімального рівня. Найбільшої уваги заслуговує спосіб зменшення саморозкладу аРс до мінімального рівня, який було розкрито Проті (Ргошіу) та іншими, ЕР 0662513 від 12 червня -- 1995 року, суть якого полягає у регулюванні рН у межах від приблизно 6,3 до 7,0; інкубуванні аРС у ЗМ - сечовині; або підданні аРС впливу граничних концентрацій солі (вище 0,4М або нижче 0,05М).

Заявники відкрили другий важливий шлях розкладу - наслідком саморозкладу М-кінцевої ділянки згаданого о легкого ланцюгу може бути вирізка на будь-якій стороні згаданого гістидинового залишку у положенні 10. Цей со шлях розкладу веде до утворення двох інактивованих продуктів. Згадана М-кінцева вирізка перших дев'яти залишків згаданого легкого ланцюгу дає дез(1-9)активований білок С, згадана М-кінцева вирізка перших десяти в залишків згаданого легкого ланцюгу дає дез(1-10)активований білок С. Цей шлях розкладу, про який раніше не повідомлялось, веде до втрати антикоагуляційної активності внаслідок видалення критичних залишків карбоксиглутамінової кислоти у положеннях б та 7. Таким чином, зведення до мінімуму рівня продуктів « саморозкладу дез(1-9) та дез(1-10)активованого білку С є важливою умовою для одержання активної З 50 фармацевтичної лікарської форми активованого білку С високого рівня чистоти. Ці варіанти були раніше с невідомими продуктами розкладу і їх надзвичайно важко, якщо взагалі можливо, видалити за допомогою

Із» традиційних способів очистки. Умови зведення їх утворення до мінімального рівня були раніше невідомими.

Ідентифікація Заявниками цього важливого шляху саморозкладу активованого білку С надала можливість відкриття умов обробки та одержання лікарських форм для підвищення рівня чистоти та активності згаданого активованого білку С Заявники продемонстрували, що при низьких рівнях рН (наприклад, нижче 6,3), згаданий це. шлях саморозкладу, який сприяє дез(1-9заРС або дез(1-10)аРС, домінує над згаданим 308-309 шляхом оз саморозкладу, однак застосування підвищених концентрацій хлориду натрію (більше, ніж 150мММ) при рН нижче 6,3, суттєво зменшує об'єм реакції саморозкладу згаданого дез(1-99аРС та/або дез(1-10)аР С. ші Відповідним чином, цей винахід надає спосіб обробки активованого білку С при іонній силі вище, ніж 150ММ -і 20 та при рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. Утворення дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС за цих умов значно зменшується. Цей винахід, таким чином, надає поліпшений спосіб обробки водного розчину активованого та білку С без небажаного розкладу.

На Фіг. наведено первинну структуру активованого людського білюку С для полегшення ілюстрування згаданого у цьому описі шляху саморозкладу, опис якого наводиться. Основу термінології, прийнятої у цьому 29 описі, складає числове позначення основної послідовності людського активованого білку С. Фахівцю у цій галузі

ГФ) зрозуміло, що основна послідовність інших видів активованого білку С може незначно змінюватись, наслідком чого є термінологічні зміни, визначені у цьому описі. о Цей винахід надає водні розчини активованого білку С та поліпшений спосіб обробки таких розчинів, який включає обробку при іонній силі, яка перевищує 150ОММ, та при рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3. 60 Цей винахід додатково надає спосіб очищення активованого білку С шляхом хроматографічного розподілу, який включає елюювання згаданого активованого білку С під час згаданого хроматографічного розподілу за допомогою водного елюювального розчину, який має іонну силу над 150мМ та рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3.

Цей винахід додатково надає спосіб концентрування розчину активованого білюу С шляхом фільтрування, бо який включає подачу згаданого активованого білку С на фільтрувальну мембрану у вигляді водного розчину,

який має іонну силу над 150мМ та рН у межах від приблизно 5,5 до менше, ніж 6,3.

Цей винахід надає також активований білок С, одержаний за допомогою способів, опис яких наведено.

Цей винахід, врешті-решт, надає фармацевтичні лікарські форми активованого білку С, до складу яких

Входить менше 10965 (мас.) дез(1-99аРС та/або дез(1-10)аР С.

Усі скорочені позначення амінокислот, які використано у розкритті цього винаходу, відповідають прийнятим

Патентним відомством США, згідно до 51.822(8)(2) 37 Зводу федеральних правил.

Для цілей цього винаходу, які розкрито та заявлено у цьому описі, використано наведені терміни, визначення яких наведено далі. 70 Термін аРС або активований білок С означає білок С, який було одержано рекомбінантними способами або з плазми. аРС включає та є, переважно, людським білком С, хоча аРС може включати також білок інших видів або похідні, які мають протеолітичну, амідолітичну, ефіролітичну та біологічну (антикоагулянтну або профібринолітичну) активність білку С. Приклади похідних білку С наведено у патенті США Мо5,453,373, який було видано на ім'я Герліца (Сегій) та інших, та у патенті США Мо5,516,650, який було видано на ім'я Фостера 7/5 (Еозвіег) та інших; описи до згаданих патентів включено до цього опису у повному об'ємі як посилання.

АРТТ - тромбопластиновий час (час утворення згустку плазми при доданні частково активованого тромбопластину).

Термін "водний" означає суміші розчинників, а також застосування тільки води, як розчиннику. Термін "водний", за переважним варіантом, означає лише воду, як розчинник.

Термін "хроматографічний розподіл" означає спосіб хроматографування, який визнано і який застосовується у цій галузі, у тому числі, витіснювальне хроматографування, аніонне хроматографування, катіонне хроматографування, гідрофобне хроматографування, хроматографування з оберненою фазою і т.ін.

Термін "проточна фільтрація" означає розподіл за допомогою тангенціального потоку через фільтрувальну мембрану, причому згаданий продукт затримується згаданою мембраною (наприклад, фільтрація з метою с ов Концентрування або діафільтрація) або проходить через мембрану (наприклад, фільтрація з метою видалення вірусу). і)

РОС - зимоген білку С.

Термін "обробка" означає типові фізичні процеси хімічної технології, які застосовуються при одержанні активованого білку С, наприклад, хроматографування на колонках, фільтрація (проточна вздовж потоку, «- зо проточна, кінцева), ліофілізація, перекачування або зберігання. г-аРсС - рекомбінантний активований білок С, який було одержано шляхом активування зимогену білку С іп - міго або шляхом безпосередньої секреції активованої форми білку С прокаріотичними клітинами, еукаріотичними о клітинами або трансгенними тваринами, у тому числі, наприклад, секрецією із лінії клітин 293 нирок людини у вигляді зимогену, з подальшим очищенням та активуванням за методами, добре відомими досвідченому о фахівцю та наведеними у патенті США Мо4,981,952, який було видано на ім'я Яна (Мап), та МО 97/20043 на ім'я М

Коттінхема (Соціпдпат).

Цей винахід має відношення до поліпшеного способу обробки активованого білку С. Цей винахід, зокрема, має відношення до обробки активованого білку С ж шляхом здійснення операцій збагачення білку або концентрування та очищення білку з одночасним зменшенням рівня саморозкладу. Цей винахід відрізняється « присутністю такої обробки, і, зокрема, таких операцій модифікування, збагачення та очищення, які здійснюються з с з використанням водного розчину згаданого білку за умов, опис яких наведено. . Комбінація умов, які заявлено у цьому описі, зводить до мінімуму утворення дез(1-9)аРсС та дез(1-10)аР С. и? Дез(1-99аРсС та дез(1-10)аРС надзвичайно важко видалити за допомогою відомих способів очищення, тому їх утворення під час виготовлення фармацевтичних лікарських препаратів аРС бажано звести до мінімального

Вівня. Активований білок С, одержаний за згаданих заявлених умов, є по суті вільним від варіантів дез(1-УаРС -І та дез(1-10)аРсС. Взагалі, фармацевтичні лікарські форми аРсС, одержані за згаданих умов, є по суті вільними від дез(1-9)аРС та дез(1-10)аРС і, взагалі, мають менше 1095(мас), за переважним варіантом менше 8(мас), за о більш переважним варіантом менше 5О0о(мас.) і за найбільш переважним варіантом менше Зоб(мас.) цих о варіантів, індивідуально або у комбінації. Ліофілізовані фармацевтичні лікарські форми, одержані з застосуванням аРС, одержаного, як описано та заявлено у цьому описі, демонструють поліпшену стійкість у

Ш- розчиненому стані (перед ліофілізацією) та 24-48-годинну стійкість після відновлення. Не більше 595 зниження як активності спостерігається у межах часу до п'яти днів при температурі від 2 С до 89С, до 50 годин при температурі 159С, та до 40 годин при температурі 259С. Раніше, до появи цього винаходу, подібна стійкість була недосяжною.

Завдяки старанному регулюванню рн, іонної сили та, за переважним варіантом, температури, саморозклад активованого білку С у водних розчинах під час обробки та одержання лікарських форм може бути знижено до

Ф, рівнів, раніше недосяжних, зокрема, за відсутності сечовини або інших агентів денатурування, гістидину, ко гідрохлориду лізину або альбуміну.

У більш широких межах практичного втілення цього винаходу передбачається, що обробка білку С включає 60 різноманітні типові фізичні процеси хімічної технології, операції фізичного відокремлення та очищення, у тому числі, обробку хроматографічними засобами та засобами проточної фільтрації, наприклад, для очищення білкової композиції, концентрування білкового розчину або для заміни розчиннику, а також можливі способи хімічної та ферментної обробки. Обробка білку, яка передбачається цим винаходом, включає, зокрема, очищення стандартними хроматографічними способами, наприклад, іонообмінним хроматографуванням, 65 гідрофобним хроматографуванням і т.Ін., та концентрацію білку шляхом ультрафільтрації та подібних способів.

Обробка білку передбачає також включення зберігання згаданого білкового розчину у баках для збереження і тому подібні етапи, які є підготовчими до згаданого очищення та концентрування. З метою зменшення нестійкості, уся обробка згаданого розчину активованого білку С, у тому числі різні етапи очищення та концентрування білку, здійснюється за умов, опис яких наведено. Такі етапи обробки спрямовано на кінцеве виділення згаданого білку, як правило, у вигляді ліофілізованого порошку, з метою його введення до складу фармацевтичної лікарської форми. рН згаданого водного оброблювального розчину знаходиться на рівні від приблизно 5,5 до менш, ніж 6,3. За більш переважним варіантом на рівні від 5,7 до менш, ніж 6,3. За ще більш переважним варіантом рн знаходиться на рівні від приблизно 5,6 до приблизно 6,2. За ще більш переважним варіантом рН знаходиться у /о межах від приблизно 5,8 до приблизно 6,2. За ще більш переважним варіантом рН знаходиться у межах від приблизно 5,9 до приблизно 6,1. Найбільш переважний рН дорівнює приблизно 6,0. До складу репрезентативних буферних систем для забезпечення ефективного регулювання рН входять Трис-буфер-ацетат, цитрат натрію, цитрат калію, цитрат-гліцин та фосфат натрію. До складу більш переважних буферних систем входять цитрат натрію та фосфат натрію. Найпереважнішим буфером є цитрат натрію. Переважна молярність згаданої буферної /5 бистеми знаходиться у межах від 10мММ до 50мММ. Найбільш переважна молярність знаходиться у межах від 20ММ до 40мММ. Досвідченому фахівцю відомі численні інші доступні буферні системи, які також можна використати для підтримки рН у згаданих межах.

Іонна сила згаданих оброблювальних розчинів є другим критичним елементом цього винаходу. Іонну силу, як правило, одержують шляхом додання фармацевтично прийнятних солей, за переважним варіантом хлориду 2о натрію або хлориду калію. Іонну силу за переважним варіантом, яка перевищує або дорівнює 150мММ, одержують за допомогою концентрації солі у буферному розчині, яка перевищує 150мММ. Для полегшення процесу у цілому (від початку до кінця) концентрація солі за переважним варіантом не повинна перевищувати 1000мММ. За більш переважним варіантом концентрація солі повинна знаходитись у межах від приблизно 200ММ до 1000мММ. Раніше гадали, що концентрації вище 50мММ та нижче 400мММ є неприйнятними. сч

Додатковою умовою для забезпечення мінімального рівня саморозкладу є температура. За переважним варіантом робоча температура під час обробки розчину повинна знаходитись у межах від 02С до 102С, за більш і) переважним варіантом вона повинна знаходитись у межах від 22С до 82С; за межами згаданих температур відбувається суттєвий саморозклад активованого білку С. Припустимим, однак, без пошкодження цілісності згаданого активованого білку С, є нетривале перевищення температури 1090. --

Концентрація активованого білку С не є критичною для цього винаходу.

Суттєвим є те, що можливість обробки білку з високими концентраціями значно підвищується за умов, опис - яких наведено. Переважна концентрація білку складає від приблизно мг/мл до приблизно 5Омг/мл, за більш («в переважним варіантом від Тмг/мл до ЗОмг/мл, за ще більш переважним варіантом від мг/мл до 2Омг/мл, і за найбільш переважним варіантом від 1мг/мл до 1Омг/мл, хоча придатними вважаються і більш високі або більш Шк низькі концентрації. ч-

Активований білок С, одержаний згідно до наведеного опису, є придатним для лікування різноманітних набутих хворобливих станів, які залучають внутрішньосудинне згортання, у тому числі тромботичну апоплексію, глибокий венозний тромбоз, емболію легеневої артерії, тромбоз периферичних артерій, емболи серцевого та « периферичноартеріального походження, гострий інфаркт міокарду, генералізований тромбогеморагічний 470 синдром та гострі перед- або посткапілярні оклюзії, у тому числі, трансплантаційний тромбоз або тромбоз - с сітківки ока. а Активований білок С є ідеально придатним до введення в лікарські форми у ліофілізованому стані з "» наповнювачем. Наповнювач, за переважним варіантом, підбирають таким чином, щоб він поліпшував стійкість молекули у твердому стані. До прикладів таких наповнювачів належать цукроза, трегалоза та рафіноза. Досвідченому фахівцю відомо багато інших доступних наповнювачів, які також можуть бути застосовані у -і активованому білку С. Концентрація наповнювача у лікарській формі є критичною змінною процесу о ліофілізування. Переважним наповнювачем є цукроза з концентрацією у розчині, який призначено до ліофілізування, від 15мг/мл до ЗОмг/мл. Найпереважніша концентрація цукрози у згаданому розчині, який (ав) призначено до ліофілізування, складає 15мг/мл у лікарській формі з вмістом аРС, який дорівнює 2,5мг/мл. -1 50 Найпереважніша концентрація цукрози у згаданому розчині, який призначено до ліофілізування, складає ЗОмг/мл у лікарській формі з вмістом аРсС, який дорівнює 5,Омг/мл. - Наведені далі приклади представлено для ілюстрування та пояснення винаходу. Об'єм цього винаходу не повинен розглядатись, як такий, що обмежується цими прикладами. У разі, якщо не вказано інше, усі посилання на частини та відсотки засновано на масі та усі температури виражено у градусах за Цельсієм.

Препарат 1 Одержання людського білку С

Рекомбінантний людський білок С (зимоген) було одержано з лінії клітин 293 людських нирок за способами, і) добре відомими досвідченому фахівцю, наприклад, за способами, які викладено у патенті США Мо4,981,952, який іме) було видано на ім'я Яна (мап), опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Ген, який кодує людський білок С, розкрито та заявлено у патенті США Мо4,775,624, який було видано на ім'я Бенга (Вапа) бо та інших, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Плазмідою, яку було використано для експресування людського білку С у лінії клітин 293, була плазміда рі РС, яку розкрито у патенті США

Мо4,992,373, який було видано на ім'я Бенга (Вапо) та інших, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Опис конструкції плазміди ріРС наведено також у Європейській патентній публікації

Мо0445939 та у роботі Гріннелла (СгіппеїЇ) та інших, 1987, Віо/Гесппоіоду 5: 1189-1192. які також включено у 65 повному об'ємі до цього опису, як посилання. Стисло, згаданою плазмідою було трансфектовано лінію клітин 293, після чого стійкі трансформанти було виявлено, субкультивовано та вирощено у безсироваткових живильних середовищах. Після зброджування безклітинне живильне середовище було одержано шляхом мікрофільтрування.

Згаданий людський білок С було відокремлено від культуральної рідини за способом Яна (Хап), патент США

Мо4,981,952, опис якого у повному об'ємі включено до цього опису як посилання. Освітлене живильне середовище розводили до 4мММ у етилендіамінтетраоцтовій кислоті (ЕОТА) перед тим, як його було абсорбовано аніонообмінною смолою (Раві-Ріом/ С), компанія РІагтасіа). Після промивання 4 об'ємами колонки 20ММ

Трис-буфером, 200мМ Масі, рнН7,4, та 2 об'ємами колонки 20мММ Трис-буферу, 150мММ масі, рн7,4, зв'язаний зимоген рекомбінантного людського білю»у С елюювали 20мММ Трис-буферу, 150МмМ Масі, 10мМ Сасі», рнН7 4. 7/0 Чистота одержаного елюйованого білку, за даними електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію, перевищувала 95905.

Додаткове очищення згаданого білку здійснювали шляхом його розчинення (ЗМ) у Масі, з подальшим адсорбуванням на гідрофобну інтерактивну смолу (Тоуореагі РПпепу! 65ОМ, компанія ТозоНааз), яку було урівноважено за допомогою 20ММ Трис-буферу, ЗМ Масі, 10мМ Сасі», рН7,4. Після промивання 2 об'ємами 7/5 Колонки урівноваженого буферу без Сасі», одержаний зимоген рекомбінантного людського білку С елюювали за допомогою 20мММ Трис-буферу, рН7,.4. Одержаний елюйований білок готували до активування шляхом видалення залишкового кальцію. Згаданий зимоген пропускали через металеву афінну колонку (Спеїех-100, компанія Віо-Кай) з метою видалення кальцію та поновно зв'язували з аніонообмінною смолою (Раві Ріом/ СО), компанія РНагтасіа). Обидві згадані колонки розміщували послідовно та урівноважували за допомогою 20ММ

Трис-буферу, 150мМ Масі, 5мМ ЕОТА, рН7,4. Після завантаження згаданого білку, колонку СПеїех-100 промивали одним об'ємом колонки того ж самого буферу перед її відокремленням від згаданої послідовності.

Згадану аніонообмінну колонку промивали З об'ємами колонки урівноважувального буферу перед елююванням білку за допомогою 0,4М Масі, 20мММ суміші Трис-буферу-ацетату, рНб,5. Концентрації білку рекомбінантного людського білку С вимірювали шляхом визначення екстинкції ультрафіолетового випромінювання на сч дв 28Онм. 011,81, о

Препарат 2 Активація рекомбінантного людського білку С

Тромбін великої рогатої худоби сполучали з активованою сефарозою (Асіїмаїеа СН-Зерпагозе 4В (компанія

РІПаптасіа)) у присутності 50мММ ГЕПЕС-буферу, рН7У,5 при температурі 42С. Згадану реакцію сполучення здійснювали на смолі, якою вже було заповнено колонку, з використанням приблизно 5000 одиниць тромбіну/мл -- смоли. Розчин тромбіну циркулював через колонку впродовж приблизно З годин перед доданням 2-аміноетанолу (МЕА) до концентрації О,бмл/л циркуляторного розчину. Одержаний розчин, який вміщував МЕА, додатково - піддавали циркуляції впродовж 10-12 годин для забезпечення повного блокування на смолі амінів, які не (ав) прореагували. Після блокування тромбін, зв'язаний зі смолою, промивали 10 об'ємами колонки 1М Масі, 20мММ

Трис-буфером, рНб,5 для видалення усього неспецифічно зв'язаного білку, та використовували у реакціях о активування після урівноважування у активаційному буфері. ї-

Очищений гНРС розчиняли (5мММ) у ЕОТА (для утворення хелатних сполучень з будь-яким залишковим кальцієм) та розбавляли до концентрації 2мг/мл за допомогою 20мММ Трис-буферу, рН7,4 або 20мММ суміші

Трис-буферу-ацетату, рНб,5. Цей матеріал пропускали через тромбінову колонку, урівноважену при температурі « 372С за допомогою 50мМ Масі та 20ММ Трис-буферу, рН7,4, або 20мММ суміші Трис-буферу-ацетату, рнб,5.

Швидкість потоку регулювали таким чином, щоб забезпечити приблизно 20-хвилинну тривалість контактування - с ІНРС та тромбіну на смолі. Потік, який витікав, збирали та негайно перевіряли на амідолітичну активність. У ч разі, якщо одержаний матеріал не мав специфічної активності (амідолітичної), порівняно до встановленого я стандарту аРС, його поновно пропускали через згадану тромбінову колонку для завершення активування гНРС.

Після цього одержаний матеріал розбавляли 1:1 за допомогою 20мММ буферу, як згадувалось перед тим.

Антикоагулянтну активність активованого білку С визначали вимірюванням подовження часу згортання у -і аналізі косагулювальної активності крові при доданні частково активованого тромбопластину (АРТТ). Стандартну сю криву було одержано у буфері для розбавлення (мг/мл сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (ВЗА) (чистого для радіоїмунологічних проб), 20мММ Трис-буфер, рН7,4, 150ммМ Масі, 0,0295 Мам з) з концентрацією (ав) білку С у межах 125-100Онг/мл, у той час як проби було виготовлено у декількох розведеннях у згаданому -1 50 діапазоні концентрацій. До кожної кювети з пробою додавали 5Омкл холодної конячої плазми та 5Омкл відновленого частково активованого тромбопластинового реактиву (АРТТ Кеадепі, компанія Зідта), та -. інкубували при температурі 376С впродовж 5 хвилин. Після інкубування до кожної кювети додавали 5Омкл відповідних проб або стандартів. Для визначення основного часу згортання крові замість проби або стандарту додавали буфер до розбавлення. Таймер фіброметру (СоА Зсгеепег Нетозіавзіз Апаїугег, компанія Атегісап |арог) запускали після додання до кожної проби або стандарту 5бОмкл ЗОММ Сасі о (температура 372С).

Ф! Концентрацію активованого білку С у пробах вираховували за допомогою лінійного рівняння регресії зі стандартної кривої. Час згортання представляє собою середнє як мінімум трьох повторів, у тому числі зразків о стандартних кривих. Концентрації білку рекомбінантного людського білюу С вимірювали шляхом визначення екстинкції ультрафіолетового випромінювання на 280нм. Е9О-1-1,85, бо Приклад 1

Хроматографічний розподіл аРсС

Розчин аРС (електропровідність приблизно 14мСм та рН5,7) вносили до колонки (9,5см (висота)хУсм (ширина)) 5-Зерпагозе Раві РіІом/ з катіонообмінною смолою, яку було послідовно з'єднано з колонкою (25смМ (висота)х14см (ширина)) О-Зерпагозе Раві Ріом/у з аніонообмінною смолою. Обидві колонки було попередньо бо урівноважено за допомогою 20мММ цитрату натрію, рНб, та 150мМ Масі. Навантаження згаданої колонки становило 10 грамів аРС на літр аніонообмінної смоли. Згадану колонку промивали 22 об'ємами колонки урівноваженого буферу та піддавали ступінчастому елююванню за допомогою 20мММ цитрату натрію, рНб,О, та 400мМ Масі. Усі операції здійснювали при температурі 2-82С та при лінійній швидкості потоку бОсм/годину.

Незважаючи на те, що аРс мав високу активність (53б0одиниць/мг за результатами АРТТ проби) та достатньо високу концентрацію під час хроматографування (пік 220г/л) та у загальному головному потоці (1Ограмів/л), одержаний продукт залишався стійким. Результати цих спостережень було підтверджено за допомогою відновлювальної та невідновлювальної мас-спектрометрії легкого ланцюгу, гідролізованого трипсином, яка майже не виявила («295) ізоформ, до складу яких входив згаданий 308-309 ендопротеолітичний виріз, та 70 присутності дез(1-9)аРС та дез(1-10)аР С («596).

Приклад 2

Фільтрація вірусу

Активований білок С (4мг/мл) у буфері, до складу якого входив 20ММ Трис-буфер, 150мММ Масі та 20мММ

ЕОТА, піддавали проточній фільтрації вздовж потоку (мембрана МійПіроге МігизоЇметм 180). Проходження аРс 75 Через згаданий фільтр полегшувалось завдяки застосуванню діафільтраційного буферу. До складу згаданого діафільтраційного буферу входив 20мМ цитрат натрію та 150мМ Масі. Фільтрували розчин (1Ол) 4мг/мл аРсС у буфері, до складу якого входив 20мММ Трис-буфер, 150ММ Масі та 20ММ ЕОТА. Згаданий натрійцитратний та натрійхлоридний буфер було застосовано, як діафільтраційний буфер для одержання кінцевого об'єму розчину агРс 21,5л.

Приклад З

Ліофілізація

Розчин готували у ампулі шляхом додання відповідної кількості цукрози, хлориду натрію та цитрату натрію до наперед визначеного об'єму г-аРсС з метою одержання 2,5мг/мл аРс, 15мг/мл цукрози, 325мММ хлориду натрію та 20мМ цитрату натрію при рНб,О. Одержаний розчин ліофілізували за допомогою традиційної ліофільної су сушарки з одержанням ампул з ліофілізованим аРс, придатним для відновлення та введення пацієнту. Одержані о ліофілізовані лікарські форми мали менше, ніж 1095 дез(1-99аРС та дез(1-10)аР С.

Приклад 4

Ліофілізація

Розчин готували у ампулі шляхом додання відповідної кількості цукрози, хлориду натрію та цитрату натрію -- до наперед визначеного об'єму г-аРсС з метою одержання 5мг/мл аРС, ЗОмг/мл цукрози, 650мММ хлориду натрію та 40мМ цитрату натрію при рНб,0О. Одержаний розчин ліофілізували за допомогою традиційної ліофільної т сушарки з одержанням ампул з ліофілізованим аРсС, придатним для відновлення та введення пацієнту. Одержані «з ліофілізовані лікарські форми мали менше, ніж 1095 дез(1-99аРС та дез(1-10)аР С.

Опис принципів, переважних варіантів втілення та форм здійснення операції за цим винаходом було о з5 наведено у передуючому описі. Винахід, який призначено для захисту цим описом, однак, не розглядається, як рч- такий, що обмежується конкретними розкритими формами, оскільки вони повинні розглядатись, скоріше, як ілюстративні, а не обмежувальні. Фахівцями у цій галузі можуть вноситись варіації та зміни без відходження від духу цього винаходу. « кір й 1130

РА с мо 450 З с Моб св МРАМКЕРсСаНВРЖКАМЕККА,, 152 то Ка т, ие в н» «німе ев М " мс КО СУ «і, за я К я і -2то

Кс бак Не А ввів ві. фжосею а до Я М азоумо - й і пе т щу бо Я с Є плн и я а же дет

Ге) Унг не ба Ко ІЕ жів КОКО хто нс: Ка т я К м мк (ав) й Я дет з те п--200 снів годе Кк і-й ен Зв І о -І га -- зо щу в- ме ? зо АВЕНБТМ в х м ву вия Р - ГУ му Му є Ге СУ о т Яр ж . дише ДК: є ї і й зво.5у жо КОД залу і. 320 БК бе баЕ9 709000 Рала

Кк Ме с. З5о0 -с т;

А КІРМУРННЕ Асибркавряе бунт т «я 330 зво сет у ту зв у в ШЕ ІЕЗМА Фіг.

Ф) ! іме)

Claims

Формула винаходу

1. Спосіб ліофілізації водного розчину активованого білка С, який включає здійснення такої ліофілізації при іонній силі від 150 мМ до 400 мМ та при рН від приблизно 5,5 до 6,3.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що рН становить від 5,6 до 6,2.

3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що рН становить від 5,9 до 6,1. бо

4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що рН встановлюють із застосуванням натрій-цитратного буфера.

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що згаданий розчин додатково містить хлорид натрію.

б. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що білюм С є людський рекомбінований активований білок С.

7. Ліофілізована фармацевтична композиція, яка містить активований білок С, одержаний способом за п.1, та наповнювач, в якій сумарний вміст дез(1-9У)активованого білка С та дез(1-10)активованого білка С становить менше ніж приблизно 10 мас.9о. 70

8. Ліофілізована фармацевтична композиція за п. 7, яка відрізняється тим, що сумарний вміст дез(1-9У)активованого білка С та дез(1-10)активованого білка С становить менше ніж приблизно 5 мас.9о.

9. Ліофілізована фармацевтична композиція за п. 7 або 8, яка відрізняється тим, що білком С є людський рекомбінований активований білок С. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «- ча «в) (зе) і - -

с . и? -І (95) («в) -І - іме) 60 б5