[go: up one dir, main page]

EA002149B1 - Улучшенные способы приготовления активированного белка с - Google Patents

Улучшенные способы приготовления активированного белка с Download PDF

Info

Publication number
EA002149B1
EA002149B1 EA199900980A EA199900980A EA002149B1 EA 002149 B1 EA002149 B1 EA 002149B1 EA 199900980 A EA199900980 A EA 199900980A EA 199900980 A EA199900980 A EA 199900980A EA 002149 B1 EA002149 B1 EA 002149B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
activated protein
protein
solution
less
activated
Prior art date
Application number
EA199900980A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900980A1 (ru
Inventor
Джеффри Клэйтон Бейкер
Эндрю Дэвид Карлсон
Лихуа Хуанг
Теодор Арсэй Шелига
Original Assignee
Эли Лилли Энд Компани
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эли Лилли Энд Компани filed Critical Эли Лилли Энд Компани
Publication of EA199900980A1 publication Critical patent/EA199900980A1/ru
Publication of EA002149B1 publication Critical patent/EA002149B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4866—Protein C (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение в общих чертах направлено на способ снижения автодеградации активированного белка С в процессе его приготовления и очистки. Настоящее изобретение представляет водные растворы активированного белка С и улучшенный способ получения таких растворов, включающий осуществление такого получения при ионной силе раствора на уровне выше 150 мМ и при рН на уровне примерно 5,5 и не более чем 6,3.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в общих чертах касается способа снижения автодеградации активированного белка С в процессе приготовления и очистки.
Предпосылки для изобретения
Белок С, являющийся сериновой протеазой, - это естественно встречающийся антикоагулянт, играющий важную роль в регуляции гомеостаза за счет инактивации факторов Уа и У111а свертывания крови. Белок С человека в основном вырабатывается в печени в виде единственного полипептида, состоящего из 461 аминокислоты. Эта молекула-предшественник претерпевает множественные посттрансляционные модификации, включая 1) отщепление 42аминокислотного сигнального участка; 2) протеолитическое отщепление от одной цепи зимогена остатка лизина по 156-му положению и остатка аргинина по 157-му положению с образованием 2-цепочечной формы данной молекулы (т.е. легкая цепь, состоящая из 155 аминокислотных остатков, присоединена через дисульфидный мостик к тяжелой цепи, состоящей из 262 аминокислотных остатков, включающей домен собственно сериновой протеазы); 3) карбоксилирование с участием витамина К по 9 остаткам глутаминовой кислоты, которые кластеризованы на начальном 42-аминокислотном участке легкой цепи, в результате чего образуются девять остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты (СБЛ); и 4) присоединение углеводных остатков по четырем сайтам (один в составе легкой цепи и три в составе тяжелой цепи). В составе тяжелой цепи находится высококонсервативная для сериновых протеаз трипептидная триада - аспарагиновая кислота-257, гистидин211 и серин-360. Наконец, циркулирующий двухцепочечный зимоген активируется ίη νίνο с участием тромбина на поверхности фосфолипидной мембраны в присутствии иона кальция. Активация происходит в результате отщепления додекапептида от Ν-конца тяжелой цепи с образованием активированного белка С (абС), обладающего соответствующей каталитической активностью. При взаимодействии с другими белками белок С функционирует, по-видимому, как самый важный негативный регулятор процесса свертывания крови, приводящего к тромбозам.
К сожалению, активированный белок С способен саморазрушаться, в результате чего снижается его функциональная активность, как антикоагулянта. В данной области техники определен механизм деструкции активированного белка С: он связан с протеолитическим расщеплением по остатку лизина в 308-м положении тяжелой цепи, в результате чего образуется 111аминокислотный фрагмент. Этот продукт расщепления обозначается как фрагмент ЕАК.
Предыдущие попытки снизить уровень самопроизвольного расщепления были сфокуси рованы на минимизации уровня образования фрагмента ЕАК. Наиболее заметной является заявка на европейский патент 0662513 (Ргои1у с1 а1.) от 12 июля 1995 г., в которой предлагается минимизировать саморасщепление активированного белка С путем контроля за величиной рН в пределах примерно от 6,3 до 7,0; инкубирования абС в 3М мочевине; или подвергая абС действию экстремальных солевых условий, которые определяются в пределах выше 0,4М или ниже 0,05М.
Заявители установили второй важный механизм деградации, связанный с саморасщеплением в Ν-концевой области легкой цепи, проявляющийся в образовании разрыва с любой из сторон от остатка гистидина в 10-м положении. В результате этого механизма расщепления образуются два неактивных продукта. Νконцевое отщепление девяти первых остатков легкой цепи приводит к образованию де(1-9)активированного белка С, а Ν-концевое отщепление десяти первых остатков легкой цепи приводит к образованию де(1 -10)-активированного белка С. Этот механизм расщепления, о котором ранее известно не было, приводит к утрате антикоагулянтной активности из-за удаления функционально ключевых гликозилированных остатков СЬА, находящихся в положениях 6 и 7. Следовательно, минимизация уровня образования продуктов разрушения -де(1-9)- и де(1-10)активированного белка С - является важной для получения фармацевтических препаратов, включающих активный высокочистый активированный белок С. Ранее такие варианты продуктов разрушения известны не были, поэтому, очевидно, весьма трудно, если невозможно, удалить их с помощью стандартных процедур очистки. Условия минимизации уровня их образования ранее известны не были.
Установление заявителями этого важного механизма саморасщепления активированного белка С позволяет установить и условия получения и обработки с целью повышения чистоты и активности активированного белка С. Заявители показали, что при низком значении рН (например, менее 6,3) механизм самопроизвольного расщепления, приводящий к образованию продуктов де(1-9)- и де(1-10)-абС, преобладает над механизмом деструкции с расщеплением по остаткам 308-309, в то время как применение повышенных концентраций хлорида натрия (более 150 мМ) при рН < 6,3 в значительной степени снижает уровень реакции саморасщепления с образованием де(-19)- и де(1-10)-абС.
Соответственно, настоящее изобретение представляет способ обработки активированного белка С при ионной силе раствора свыше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3. В таких условиях образование продуктов де(1-9)- и де(1 -10)-абС в существенной степени снижено. Таким образом настоящее изобретение представляет способ получения водного раство ра активированного белка С, характеризующегося отсутствием нежелательного саморасщепления.
Описание чертежей
Фиг. 1 показывает первичную структуру активированного белка С человека и призвана проиллюстрировать описываемые в данном тексте механизмы самопроизвольного расщепления. Применяемая здесь номенклатура основана на нумерации первичной (аминокислотной) последовательности полипептида активированного белка С человека. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что другие виды активированного белка С могут в незначительной степени варьироваться по своей аминокислотной последовательности, тем самым определяя изменения в применяемой здесь номенклатуре.
Резюме изобретения
Настоящее изобретение представляет водные растворы активированного белка С и улучшенный способ получения таких растворов, включающий проведение процесса получения при ионной силе раствора выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3.
Также настоящее изобретение представляет способ очистки активированного белка С с помощью хроматографического разделения, включающий элюирование упомянутого активированного белка С в ходе упомянутого хроматографического разделения с применением водной элюции раствором с ионной силой выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3.
Также настоящее изобретение представляет способ концентрирования раствора активированного белка С путем фильтрации, включающий нанесение упомянутого активированного белка С на фильтрующую мембрану в виде водного раствора с ионной силой выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3.
Также настоящее изобретение представляет активированный белок С, полученный с применением описанных здесь способов.
Наконец, настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции с активированным белком С, характеризующимся содержанием продуктов де(1-9)-абС и/или де(110)-абС менее 10% по весу.
Подробное описание изобретения
Все сокращенные обозначения аминокислот, использованные в данной заявке, соответствуют тем, которые приняты Официальной службой патентования и регистрации торговых марок США: они перечислены в п.37 С.Р.К, параграф 1.822 (В) (2).
Для целей изложения настоящего изобретения, как описано здесь и использовано в формуле изобретения, определены нижеследующие термины.
Понятие активированный белок С, или абС, относится как к выделенному из плазмы крови, так и к рекомбинантному белку С. абС включает в себя и предпочтительно является белком С человека, хотя абС также включают другие виды или производные, обладающие протеолитической, амидолитической, эфиролитической и биологической (антикоагулянтной или профибринолитической) активностью белка
С. Примерами производных белка С являются те белки, которые описаны в патенте США № 5453373 (бегШх е! а1.) и в патенте США № 5516650 (Ро81ег е! а1.), полное содержание которых включено здесь в виде библиографической ссылки.
АРТТ - время частичной активации тромбопластина.
Понятие водный включает сорастворительные системы, равно как и использование в качестве растворителя только воды. Предпочтительно термин водный обозначает использование в качестве растворителя только воду.
Понятие хроматографическое разделение включает хроматографические методики, известные и применяемые в данной области техники, включая гель-фильтрацию, анионобменную, катион-обменную, гидрофобную хроматографию, хроматографию в обратной фазе и подобное.
Понятие фильтрация в перекрестных потоках обозначает разделение с помощью тангенциального по отношению к фильтрующей мембране потока таким образом, что продукт либо остается на этой мембране (при концентрировании или повторной фильтрации), либо проходит через мембрану (как в случае с вирусной клиренс-фильтрацией).
РС обозначает зимоген белка С.
Понятие приготовление обозначает отдельные операции, применяемые в производстве активированного белка С, такие как хроматография на колонках, фильтрация (тангенциальная, в перекрестных потоках, до конечной точки), лиофилизация, пампинг или хранение.
Аббревиатура р-абС обозначает рекомбинантный активированный белок С, полученный путем активации РС ίπ νίίτο или путем прямой секреции активированной формы белка С прокариотическими клетками, эукариотическими клетками или трансгенными животными, включая, например, секрецию почечными клетками человека линии 293 в виде зимогена, который затем очищают и активируют с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, что продемонстрировано в патенте США № 4981952 (Уап) и в заявке АО 97/20043 (СоФпдйат).
Настоящее изобретение касается улучшенного способа приготовления активированного белка С. Изобретение, в частности, касается приготовления активированного белка С путем обогащения или концентрирования белка и методов белковой очистки, обеспечивающих снижение интенсивности саморазрушения. На стоящее изобретение характеризуется описанием такого приготовления, а особенно таких модификаций процессов обогащения и очистки, проводимых с использованием водного раствора данного белка в таких условиях, которые описаны в данном тексте.
Сочетание условий, заявляемых в настоящем изобретении, минимизирует образование вариантов де(1-9)-абС и де((1-10)-абС. С применением известных методик удаление де(1-9)абС и де(1-10)-абС чрезвычайно затруднительно, поэтому желательным является минимизировать образование этих вариантов в ходе производства фармацевтических композиций, включающих активированный белок С. Активированный белок С, полученный в заявляемых условиях, по существу свободен от вариантов де(1-9)-абС и де(1-10)-абС. В целом, фармацевтические композиции, содержащие абС, приготовленный в данных условиях, в существенной степени свободны от де(1-9)-абС и де(1-10)-абС, в целом, включая их менее 10%, предпочтительно менее 8%, более предпочтительно менее 5%, а наиболее предпочтительно - менее 3% этих вариантов по отдельности или вместе в расчете на вес препарата. Лиофилизованные фармацевтические препараты, включающие абС, полученные в заявляемых условиях, проявляют улучшенные показатели стабильности в растворенном виде (до проведения лиофилизации) и стабильности спустя 24-38 ч после реконституции. Уровень утраты функциональности не превышает 5% после 5-дневного хранения при 2-8°С, после 50-часового хранения при 15°С и 40-часового хранения при 25°С. До настоящего изобретения такие показатели стабильности были недостижимы.
При тщательном соблюдении величины рН, ионной силы и предпочтительной температуры саморазрушение активированного белка С в водных растворах в ходе приготовления и получения фармацевтических препаратов может быть снижено до уровней, ранее не достигавшихся: в частности, в отсутствие мочевины или других денатурирующих агентов, гистидина, лизингидрохлорида или альбумина.
С точки зрения практики настоящего изобретения представляется, что приготовление белка С включает широкий круг отдельных операций, физического разделения и этапов очистки, включая хроматографию и перекрестное фильтрование, например, в связи с очисткой белковой композиции, концентрирование белкового раствора в связи с заменой растворителя, а также вероятные химические и ферментные обработки. Представляемая настоящим изобретением выработка белка, в частности, включает очистку с помощью стандартных хроматографических методов, таких как ион-обменная хроматография, гидрофобная хроматография и подобное, а также концентрирование белка путем ультрацентрифугирования и сходных про цедур. Приготовление белка также должно включать сохранение белкового раствора в специальных резервуарах и подобном, необходимых для приготовления к этапам концентрирования и очистки. Для целей снижения нестабильности весь процесс приготовления раствора активированного белка С, включая различные этапы очистки и концентрирования белка, проводят в условиях, которые описаны в данном тексте. Эти этапы приготовления направлены на то, чтобы обеспечить обязательное выделение данного белка, как правило, в виде лиофилизованного порошка, для использования в приготовлении фармацевтических препаратов.
Величина рН в ходе приготовления водного раствора составляет примерно 5,5 и не более чем 6,3. Более предпочтительно она составляет от 5,7 до не более чем 6,3. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,6 до примерно 6,2. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,8 до примерно 6,2. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,9 до примерно 6,1. Наиболее предпочтительной является величина рН примерно 6,0. Буферными системами, пригодными для эффективного поддержания величины рН, являются системы с Трисацетатом, цитратом натрия, цитратом калия, цитрат-глицином и фосфатом натрия. Более предпочтительными являются буферные системы на основе цитрата натрия и фосфата натрия. Наиболее предпочтительная буферная система основана на цитрате натрия. Предпочтительная молярность буферной системы находится в пределах 10-50 мМ. Наиболее предпочтительная молярность составляет 20-40 мМ. Для специалиста в данной области техники понятно, что многие другие буферные системы пригодны с точки зрения того, что они могут быть использованы для поддержания рН в заявляемом диапазоне.
Ионная сила приготавливаемых растворов является вторым критическим компонентом настоящего изобретения. Ионная сила в целом определяется добавлением фармацевтически приемлемых солей
- предпочтительно хлорида натрия или хлорида калия. Ионная сила предпочтительно превышает или равна 150 мМ, что обеспечивается концентрацией соли свыше 150 мМ в забуференном растворе. Предпочтительно концентрация соли не превышает примерно 1000 мМ, что должно облегчить дальнейшие этапы приготовления. Более предпочтительно концентрация соли находится в диапазоне от примерно 200 мМ до примерно 1000 мМ. Ранее считалось, что концентрации, превышающие 50 мМ и уступающие 400 мМ, являются неприемлемыми.
Дополнительным критерием обеспечения минимизированной деструкции является температура. Предпочтительно температура при приготовлении раствора находится в пределах 0002149
10°С, более предпочтительно в пределах 2-8°С, а при выходе за пределы этого температурного интервала имеет место существенное саморасщепление активированного белка С. Однако, кратковременный выход за пределы 10°С может оказаться безопасным с точки зрения сохранения структурной целостности активированного белка С.
Концентрация активированного белка С не является критической по настоящему изобретению. Существенно то, что описываемые здесь условия повышают возможность приготовления данного белка при его высоких концентрациях. Предпочтительная концентрация белка составляет от примерно 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл, более предпочтительно 1-30 мг/мл, еще более предпочтительно 1-20 мг/мл и наиболее предпочтительно 1-10 мг/мл, хотя и с более высокими, и с более низкими концентрациями также можно работать.
Активированный белок С, полученный в соответствии с описанным здесь, пригоден для лечения широкого круга ненаследственных заболеваний, включая внутрисосудистое свертывание крови, включая тромботический шок, тромбофлебит, эмболию легочных сосудов, тромбоз периферических артерий, эмболию, начинающуюся с коронарных сосудов или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, рассеивающееся внутрисосудистое свертывание крови и острые пре- и посткапиллярные закупорки, включая трансплантации и тромбоз сетчатки.
Активированный белок С в лиофилизованном виде идеально пригоден для включения в состав препаратов с компонентомнаполнителем. В идеале наполнитель выбирают таким образом, чтобы он улучшал стабильность данной молекулы в твердой фазе. Примерами таких наполнителей являются сахароза, трегалоза и раффиноза. Для специалиста в данной области техники должно быть ясно, что и другие наполнители пригодны для использования вместе с активированным белком С. Концентрация наполнителя в фармацевтическом препарате является критической переменной для процесса замораживания-высушивания. Предпочтительным наполнителем является сахароза, концентрация которой в предназначенном для лиофилизации растворе составляет 15-30 мг/мл. Наиболее предпочтительной в предназначенном для лиофилизации растворе является концентрация сахарозы 15 мг/мл при том, что в этом препарате содержится 2,5 мг/мл активированного белка С. Наиболее предпочтительной концентрацией сахарозы в предназначенном для лиофилизации растворе является 30 мг/мл при том, что содержание абС в этом препарате составляет 5,0 мг/мл.
Следующие примеры представлены с целью проиллюстрировать и пояснить настоящее изобретение. Масштаб настоящего изобретения не должен рассматриваться как в какой-нибудь степени ограничиваемый этими примерами.
Если специально не оговаривается, то все указания частей и процентов являются весовыми, а все значения температуры даны в градусах Цельсия.
Подготовительный этап 1 Подготовка белка С человека
Рекомбинантный белок С человека (зимоген) был получен в клетках линии 293 почек человека с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области техники, изложенных Уаи в патенте США № 4981952, полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Ген, кодирующий белок С человека, представлен и защищен патентом США № 4775624 (Вайд е! а1.). Плазмидой, использовавшейся для экспрессии белка С человека в клетках линии 293, являлась плазмида рЬРС, которая была описана в патенте США № 4992373 (Вапд е! а1.), полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Конструирование плазмиды рЬРС также описано в патентной публикации № 0445939 и у Оттпе11 е! а1., 1987, Вю/Тесйпо1оду, 5,1189-1192, содержание которых также включено в данный текст в виде библиографических ссылок. Вкратце, плазмидой трансфицировали клетки линии 293, затем идентифицировали стабильные трансформанты, субкультивировали их и выращивали в среде, лишенной сыворотки. После ферментации бессывороточную культуральную среду получали с помощью микрофильтрования.
Зимоген белка С человека отделяли от культуральной жидкости с применением адаптированной методики, описанной в патенте США № 4981952 (Уаи), полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Осветвленную культуральную среду включали в концентрации 4 мМ в ΕΌΤΑ с последующей адсорбцией на анионобменной смоле (Еак!-Е1оте О. Рйаттааа). После промывки четырьмя объемами колонки 20 мМ Трис, 200 мМ ЫаС1(рН=7,4) и двумя объемами колонки 20 мМ Трис, 150 мМ №101 (рН=7,4) связанный рекомбинантный зимоген белка С человека элюировали раствором 20 мМ Трис, 150 мМ ЫаС1, 10 мМ СаС12 (рН=7,4). Элюированный белок характеризовался более чем 95%-ной чистотой, что подтверждается проверкой с помощью электрофореза в δΌδ-полиакриламидном геле.
Дальнейшую очистку данного белка осуществляли путем приготовления белка 3М ЫаС1 с последующей адсорбцией на гидрофобную смолу (Тоуореаг1 Рйепу1 650 М, ТокоНаак), уравновешенную 20 мМ Трис, 3 М ЫаС1, 10 мМ СаС12 (рН=7,4). Элюированный белок приготавливали для активации путем удаления остаточного кальция. Зимоген пропускали через металлаффинную колонку (Сйе1ех-100, ВюЯаб) с целью удаления кальция и снова связывали с ани онным обменником (Еа§!-Е1оте О. Рйатшас1а). Обе эти колонки выстраивали в серию и уравновешивали 20 мМ Трис, 150 мМ ЫаС1. 5 мМ ΕΌΤΑ (рН= 7.4). После загрузки данного белка колонку С11с1сх-100 промывали одним объемом колонки того же буфера перед тем, как выключить ее из сформированной серии. Анионобменную колонку промывали тремя объемами уравновешивающего буфера перед элюированием данного белка с помощью 0.4М №1С1. 29 мМ Трис-ацетата (рН=6,5). Концентрации рекомбинантного белка С человека измеряли по экстинкции при УФ 280 нм - Ε0'1'1 = 1.81.
Подготовительный этап 2 Активация рекомбинантного белка С человека Бычий тромбин соединяли с активированной-СН-сефарозой 4В (Рйатшааа) в присутствии 50 мМ ΗΕΡΕ8. рН=7,5, при 4°С. Реакцию связывания осуществляли на смоле, уже упакованной в колонку с использованием смолы, содержащей примерно 5000 ед. тромбина на 1 мл. Для раствора тромбина обеспечивали циркуляцию по колонке в течение приблизительно 3 ч с последующим добавлением 2-аминоэтанола до концентрации 0.6 мл/л по отношению к циркулирующему раствору. Содержащий 2аминоэтанол раствор включали в циркуляцию на протяжении еще 10-12 ч для обеспечения полной блокировки непрореагировавших аминов в смоле. После такой блокировки связанную с тромбином смолу промывали 10 объемами колонки 1М ЫаС1. 20 мМ Трис (рН=6,5) с целью удаления всего неспецифически связанного белка и использовали для реакции активации после уравновешивания активационным буфером.
Очищенный рекомбинантный белок С человека готовили в концентрации 5 мМ в ΕΌΤΑ (с целью хелатирования оставшегося кальция) и разводили до концентрации 2 мг/мл в 20 мМ Трис (рН=7,4) или 20 мМ Трис-ацетате (рН=6,5). Полученный материал пропускали через тромбинсодержащую колонку, уравновешенную при 37°С 50 мМ ЫаС1 и либо 20 мМ Трис (рН=7,4), либо 20 мМ Трис-ацетата (рН=6,5). Скорость потока была доведена таким образом, чтобы полное время контакта рекомбинантного белка С человека и тромбинсодержащей смолы составило 20 мин. Эффлюент собирали и немедленно подвергали тестированию на амидолитическую активность. Если полученный материал не обладал специфической (амидолитической) активностью по сравнению с установленным стандартом активированного белка С, то этот материал подвергали новому циклу обработки на тромбинсодержащей колонке с целью более полной активации рекомбинантного белка С человека. После этого осуществляли разведение в соотношении 1:1 вышеназванным 20 мМ буфером.
Антикоагулянтную активность активированного белка С определяют путем измерения увеличения времени свертывания в тесте на оп ределение времени АРТТ (время частичной активации тромбопластина) при свертывании крови. Калибровочную кривую формируют при варьировании концентрации белка С в пределах 125-1000 нг/мл в дилюционном буфере (1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина чистоты для радиоимунного анализа, 20 мМ Трис, рН= 7.4. 150 мМ ЫаС1. 0.02% ЫаХ3.). в то время как образцы готовят в нескольких разведениях в пределах этого диапазона концентраций. В каждую емкость с образцом добавляют 50 мкл холодной лошадиной плазмы и 50 мкл реагента (АРТТ Кеадеп!. 81дша) и инкубируют при 37°С в течение 5 мин. После инкубации в каждую емкость добавляют по 50 мкл соответствующих образцов или стандартов. Для определения исходного времени свертывания используют чистый дилю-ционный буфер вместо образца или стандарта. Таймер фиброметра (СоА 8стеепет Нешо51а515 Апа1ухег. Ашепсап ЬаЬот) запускают сразу после добавления в каждый образец или стандарт 50 мкл нагретого до 37°С 30 мМ СаС12. Концентрацию активированного белка С в образцах определяют по линейному уравнению регрессии для калибровочной кривой. Время свертывания определяют как среднее по крайней мере по трем повторностям, включая образцы для калибровочной кривой. Концентрации рекомбинантного активированного белка С определяли по параметрам экстинкции в УФ 280 нм Е0'1'1 = 1.85.
Пример 1. Хроматографическое отделение абС Раствор абС, характеризующийся проводимостью на уровне приблизительно 14 мМо (14· 10-3 см) и величиной рН=5,7, был помещен на колонку 9,5х9 см (соотношение высоты и диаметра) быстротечной 8-сефарозы с катионобменной смолой, последовательно соединенной с колонкой размером 25х14 см (соотношение высоты и толщины) быстротечной рсефарозы с анион-обменной смолой. Обе колонки предварительно уравновешивали 20 мМ цитрата натрия (рН=6,0). 150 мМ ЫаС1. Колонку загружали 10 г абС в расчете на 1 л анионобменной смолы. Колонку промывали более чем двумя объемами колонки уравновешивающим буфером и постепенно выполняли элюцию 20 мМ цитрат натрия (рН=6,0), 400 мМ ЫаС1. Все операции были осуществлены при 2-8°С и линейной скорости потока 60 см/ч.
Хотя абС проявлял высокий уровень активности (539 ед./мг в тесте на АРТТ) и оказался весьма концентрированным в процессе хроматографии (более 20 г/л в точке пика) и в условиях агрегированного потока (10 г/л). полученный продукт оставался стабильным. Эти данные были подтверждены путем масс-спектроскопии с восстановлением или невосстановлением протеазного расщепления легкой цепи, которые показали отсутствие выявляемых изоформ (<2%). которые бы включали эндопротеолитическое расщепление по положению 308/309. как и отсутствие вариантов де(1-9)-абС и де(1-10)абС (< 5%).
Пример 2. Вирусная фильтрация
Активированный белок С (4 мг/мл) в буфере с 20 мМ Трис, 150 мМ Ναοί и 20 мМ ΕΌΤΑ фильтруют с использованием проточной тангенциальной фильтрации (мембрана М1Шроте У1ти8о1уе™ 180). Пропускание абС через этот фильтр облегчается использованием диафильтрационного буфера. Диафильтрационный буфер включает 20 мМ цитрата натрия и 150 мМ ЫаС1. Раствор (10 л), 4 мг/мл абС в буфере с 20 мМ Трис, 150 мМ №1С1 и 20 мМ ΕΌΤΑ отфильтровывали. Буфер с цитратом натрия и хлоридом натрия использовали в качестве диафильтрационного буфера с целью получения конечного объема раствора абС в количестве 21,5 л.
Пример 3. Лиофилизация
Раствор приготавливали в ампуле путем добавления соответствующего количества сахарозы, хлорида натрия и цитрата натрия к заранее определенному количеству рекомбинантного активированного белка С с выходом 2,5 мг/мл абС, 15 мг/мл сахарозы, 325 мМ хлорида натрия и 20 мМ цитрата натрия при рН=6,0. Раствор лиофилизуют с использованием стандартной лиофильной сушки с получением ампул, содержащих лиофилизованный абС, пригодный для последующего восстановления и введения пациенту. Лиофилизованные препараты содержат менее 10% де(1-9)-абС и де(1-10)абС.
Пример 4. Лиофилизация
Раствор приготавливали в ампуле путем добавления соответствующего количества сахарозы, хлорида натрия и цитрата натрия к заранее определенному количеству рекомбинантного активированного белка С с выходом 5 мг/мл абС, 30 мг/мл сахарозы, 650 мМ хлорида натрия и 40 мМ цитрата натрия при рН=6,0. Раствор лиофилизуют с использованием стандартной лиофильной сушки с получением ампул, содержащих лиофилизованный абС, пригодный для последующего восстановления и введения пациенту. Лиофилизованные препараты содержат менее 10% де(1-9)-абС и де(1-10)-абС.
Принципы, предпочтительные варианты и пути применения настоящего изобретения были представлены в предшествующих конкретных описаниях. Однако настоящее изобретение, представленное здесь к патентной защите, не должно рассматриваться как ограниченное конкретными описанными вариантами, поскольку они являются более иллюстративными, нежели ограничивающими. Изменения и модификации могут быть произведены специалистом в данной области техники без отхода от духа настоящего изобретения.

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Улучшенный способ лиофилизации водного раствора рекомбинантного активированного белка С, включающий осуществление такой лиофилизации при ионной силе выше чем 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3.
  2. 2. Способ по п. 1, где белок С является активированным белком С человека.
  3. 3. Способ по п. 2, где величина рН находится в пределах от 5,6 до 6,2.
  4. 4. Способ по п.3, где указанный раствор включает хлорид натрия.
  5. 5. Способ по п.4, где концентрация хлорида натрия составляет от 200 до 1000 мМ.
  6. 6. Способ по п. 1, где величину рН поддерживают буфером на основе цитрата натрия.
  7. 7. Препарат активированного белка С, полученного лиофилизацией раствора активированного белка С, имеющего ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3, в отсутствии денатурирующего агента, гиситидина, гидрохлорида лизина или альбумина.
  8. 8. Водный раствор рекомбинантного активированного белка С, включающий рекомбинантный активированный белок С, где указанный раствор имеет ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3 и содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1 -1 0)-активированного белка С от общего веса белка.
  9. 9. Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный активированный белок С, где указанный препарат содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)активированного белка С от общего веса белка.
  10. 10. Фармацевтический препарат по п.9, где указанный препарат содержит менее 5% де(1-9)активированного белка С и де(1 -1 0)активированного белка С от общего веса белка.
EA199900980A 1997-04-28 1998-04-24 Улучшенные способы приготовления активированного белка с EA002149B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4525597P 1997-04-28 1997-04-28
PCT/US1998/008384 WO1998048822A1 (en) 1997-04-28 1998-04-24 Improved methods for processing activated protein c

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900980A1 EA199900980A1 (ru) 2000-04-24
EA002149B1 true EA002149B1 (ru) 2001-12-24

Family

ID=21936854

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900980A EA002149B1 (ru) 1997-04-28 1998-04-24 Улучшенные способы приготовления активированного белка с
EA199900979A EA004881B1 (ru) 1997-04-28 1998-04-24 Лиофилизированные композиции на основе рекомбинантного человеческого активированного протеина с и их применение

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900979A EA004881B1 (ru) 1997-04-28 1998-04-24 Лиофилизированные композиции на основе рекомбинантного человеческого активированного протеина с и их применение

Country Status (35)

Country Link
US (4) US6162629A (ru)
EP (2) EP0875563A3 (ru)
JP (2) JP4383547B2 (ru)
KR (2) KR100450856B1 (ru)
CN (2) CN1227025C (ru)
AR (2) AR012010A1 (ru)
AT (1) ATE285788T1 (ru)
AU (2) AU740753C (ru)
BR (2) BR9809292A (ru)
CA (2) CA2288143C (ru)
CO (2) CO4940438A1 (ru)
CZ (1) CZ298429B6 (ru)
DE (1) DE69828330T2 (ru)
DK (1) DK0875252T3 (ru)
EA (2) EA002149B1 (ru)
EG (1) EG23685A (ru)
ES (1) ES2234072T3 (ru)
HK (1) HK1016472A1 (ru)
HU (2) HUP0003401A3 (ru)
ID (2) ID23172A (ru)
IL (2) IL132502A0 (ru)
IN (2) IN187157B (ru)
MY (2) MY118591A (ru)
NO (2) NO995134L (ru)
NZ (2) NZ337828A (ru)
PE (2) PE86299A1 (ru)
PL (2) PL195090B1 (ru)
PT (1) PT875252E (ru)
SI (1) SI0875252T1 (ru)
SV (2) SV1998000050A (ru)
TR (2) TR199902529T2 (ru)
TW (2) TWI242443B (ru)
UA (2) UA55448C2 (ru)
WO (2) WO1998048818A1 (ru)
ZA (2) ZA983497B (ru)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998048818A1 (en) * 1997-04-28 1998-11-05 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
US6630137B1 (en) * 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
HUP0001237A3 (en) * 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
US6815533B1 (en) 1998-07-31 2004-11-09 Eli Lilly And Company Cryogranulation of activated protein C
JP2002529515A (ja) * 1998-11-13 2002-09-10 イーライ・リリー・アンド・カンパニー ヘパリンにより誘発される血小板減少症の処置法
IL142220A0 (en) * 1998-11-20 2002-03-10 Lilly Co Eli Method of treating viral hemorrhagic fever
EP1133314B1 (en) * 1998-11-23 2003-02-19 Eli Lilly And Company Protein c for the treatment of sickle cell disease and thalassemia
BR9915984A (pt) * 1998-12-10 2001-09-04 Lilly Co Eli Método de tratar púrpura trombocitopênica e sìndrome urêmica hemolìtica
US6758938B1 (en) * 1999-08-31 2004-07-06 Micron Technology, Inc. Delivery of dissolved ozone
US7204981B2 (en) * 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
JP2004511428A (ja) * 2000-05-24 2004-04-15 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 凝固亢進状態を処置するための製剤および方法
MXPA03007316A (es) 2001-02-19 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Metodo para la identificacion de epitopes de celulas t y el uso para la preparacion de moleculas con inmunogenicidad reducida.
US7101982B2 (en) * 2001-03-30 2006-09-05 Immunex Corporation Control of ph transitions during chromatography
US20030055003A1 (en) * 2001-07-19 2003-03-20 David Bar-Or Use of copper chelators to inhibit the inactivation of protein C
EP1453529A4 (en) 2001-09-19 2007-09-26 Oklahoma Med Res Found TREATMENT OF SEPSIS WITH TAFI
US20030073636A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-17 Oklahoma Medical Research Foundation Method of treating diabetes
DE10149030A1 (de) * 2001-10-05 2003-04-10 Viscum Ag Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin
JP2005506345A (ja) 2001-10-15 2005-03-03 カイロン コーポレイション 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）の投与による重症な肺炎の処置
WO2003055512A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
WO2003075834A2 (en) * 2002-03-08 2003-09-18 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
CA2490342C (en) 2002-06-21 2015-06-16 Novo Nordisk A/S Stabilised solid compositions of factor vii polypeptides
MXPA05004593A (es) * 2002-10-29 2005-07-26 Alza Corp Particulas de polipeptido estabilizado en estado solido.
US20070142272A1 (en) * 2003-01-24 2007-06-21 Zlokovic Berislav V Neuroprotective activity of activated protein c independent of its anticoagulant activity
US7897734B2 (en) 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
JP4658041B2 (ja) * 2003-06-25 2011-03-23 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｖｉｉ因子ポリペプチドの液体組成物
WO2005110059A2 (en) * 2004-03-17 2005-11-24 Chiron Corporation Treatment of severe community-acquired pneumonia by admistration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
EP1773371A4 (en) * 2004-07-23 2009-12-30 Univ Rochester ACTIVATED PROTEIN C INHIBITS SIDE EFFECTS OF PLASMINOGEN ACTIVATOR IN THE BRAIN
CA2612859A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 The University Of British Columbia Coagulation factor iii polymorphisms associated with prediction of subject outcome and response to therapy
ES2386972T3 (es) * 2006-05-31 2012-09-10 Genzyme Corporation Uso de polisacáridos para la estimulación de la actividad enzimática
US20100041600A1 (en) * 2006-06-09 2010-02-18 Russel James A Interferon gamma polymorphisms as indicators of subject outcome in critically ill subjects
EA019345B1 (ru) * 2007-03-05 2014-03-31 Кадила Хелзкэр Лимитед Композиции, содержащие конъюгаты пэг-интерферон-альфа и рафинозу в качестве криопротектора
NZ598881A (en) 2007-03-29 2013-11-29 Abbvie Inc Crystalline anti-human il-12 antibodies
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
AU2008334099B2 (en) * 2007-11-30 2014-07-24 Abbvie Biotechnology Ltd. Protein formulations and methods of making same
US20110171200A1 (en) * 2008-01-15 2011-07-14 Walley Keith R Protein c rs2069915 as a response predictor to survival and administration of activated protein c or protein c-like compound
BRPI0921320A2 (pt) * 2008-11-28 2018-05-22 Abbott Laboratories composições de anticorpo estáveis e métodos para estabilizar os mesmos
WO2012068519A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Sirius Genomics Inc. Markers associated with response to activated protein c administration, and uses thereof
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
EP2834635A4 (en) 2012-04-03 2015-09-02 Smiths Medical Asd Inc COMPOSITIONS WITH A HEPARINE ACCUMULATIVE AND METHOD THEREFOR
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9249182B2 (en) 2012-05-24 2016-02-02 Abbvie, Inc. Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
AU2013286812B2 (en) 2012-07-04 2017-04-20 Zz Biotech Llc Treatment of inflammatory skin disorders
BR112015004467A2 (pt) 2012-09-02 2017-03-21 Abbvie Inc método para controlar a heterogeneidade de proteínas
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014159579A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Abbvie Inc. MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US8946395B1 (en) 2013-10-18 2015-02-03 Abbvie Inc. Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US20170035862A1 (en) 2014-04-16 2017-02-09 Zz Biotech Llc Use of APC analogue for wound healing
DK3137102T3 (da) 2014-04-16 2021-10-11 Zz Biotech Llc Apc til anvendelse til behandling af unormal kutan ardannelse
US11058750B2 (en) 2015-12-03 2021-07-13 Mor Research Applications Ltd. Compositions and methods for treatment of ocular diseases
SMT202200049T1 (it) * 2016-06-01 2022-03-21 Servier Ip Uk Ltd Formulazioni di ossido di polialchilene-asparaginasi e metodi di produzione e uso delle stesse
CN108159399B (zh) * 2017-12-29 2020-07-24 华中科技大学同济医学院附属同济医院 一种凝血蛋白酶aPC在防治糖尿病心肌病药物中的应用
WO2023119230A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 L'oreal Coagulation pathway and nicotinamide-adenine dinucleotide pathway modulating compositions and methods of their use

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775624A (en) * 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US4849403A (en) * 1985-05-29 1989-07-18 Pentapharm Ag Protein C activator, methods of preparation and use thereof
US5516650A (en) 1985-06-27 1996-05-14 Zymogenetics, Inc. Production of activated protein C
AT399095B (de) * 1986-03-27 1995-03-27 Vukovich Thomas Dr Verfahren zur auftrennung von proteinen mittels gradientenelution und vorrichtung zur durchführung des verfahrens
US5175087A (en) * 1987-07-06 1992-12-29 Biopool International, Inc. Method of performing tissue plasminogen activator assay
CA1329760C (en) * 1987-10-29 1994-05-24 Ted C. K. Lee Plasma and recombinant protein formulations in high ionic strength media
US4877608A (en) * 1987-11-09 1989-10-31 Rorer Pharmaceutical Corporation Pharmaceutical plasma protein formulations in low ionic strength media
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
JP2739050B2 (ja) * 1988-01-28 1998-04-08 ヘキスト薬品工業株式会社 抗血液凝固剤
JPH01226900A (ja) * 1988-03-08 1989-09-11 Green Cross Corp:The プロテインｃの精製方法
DE3823519A1 (de) * 1988-07-12 1990-01-18 Basf Ag Verfahren zur reinigung von aktiviertem protein c
US4981952A (en) * 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
US5093117A (en) * 1989-01-24 1992-03-03 Baxter International Inc. Compositions and method for the treatment or prophylaxis of sepsis or septic shock
JPH05506354A (ja) * 1990-02-09 1993-09-22 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 端が切り取られた軽鎖を有する活性プロテインｃ
IL97312A (en) * 1990-02-23 1999-01-26 Lilly Co Eli A method of generating a polypeptide in an eukaryotic vector AND recombinant surrogate cell containing an enhanced transcriptional control unit based on the primary late adenovirus coefficient
US5040862A (en) 1990-05-07 1991-08-20 Corning Incorporated Method of trimming optical power
AT402262B (de) * 1991-06-20 1997-03-25 Immuno Ag Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c
US5413732A (en) * 1991-08-19 1995-05-09 Abaxis, Inc. Reagent compositions for analytical testing
MY110664A (en) 1992-05-21 1999-01-30 Lilly Co Eli Protein c derivatives
DE4234295A1 (de) * 1992-10-12 1994-04-14 Thomae Gmbh Dr K Carbonsäurederivate, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US5395923A (en) * 1993-02-23 1995-03-07 Haemacure-Biotech, Inc. Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by "salting-out"
JP2886061B2 (ja) * 1993-10-29 1999-04-26 財団法人化学及血清療法研究所 プロテインｃもしくは活性化プロテインｃの安定化方法及び安定化組成物
JP3043558B2 (ja) * 1993-10-29 2000-05-22 財団法人化学及血清療法研究所 ヒト活性化プロテインｃ調製物及びその製法
JPH07165605A (ja) * 1993-12-16 1995-06-27 Teijin Ltd 活性化プロテインｃバイアル
NZ270271A (en) * 1994-01-05 1996-07-26 Lilly Co Eli Minimizing protein c degradation
JPH08301786A (ja) * 1995-05-11 1996-11-19 Mochida Pharmaceut Co Ltd 吸収性骨疾患予防・治療剤
WO1997020043A1 (en) 1995-11-30 1997-06-05 Zymogenetics, Inc. Protein c production in transgenic animals
WO1998048818A1 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
HUP0001237A3 (en) 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders

Also Published As

Publication number Publication date
CZ381099A3 (cs) 2000-03-15
EG23685A (en) 2007-05-09
PL336889A1 (en) 2000-07-17
PT875252E (pt) 2005-03-31
AU743531B2 (en) 2002-01-31
ZA983496B (en) 1999-10-25
TWI242443B (en) 2005-11-01
SV1998000051A (es) 1998-12-11
BR9809304A (pt) 2000-10-17
JP2001524111A (ja) 2001-11-27
ZA983497B (en) 1999-10-25
CN1227025C (zh) 2005-11-16
WO1998048822A1 (en) 1998-11-05
AU740753C (en) 2002-10-10
AU7161898A (en) 1998-11-24
US6162629A (en) 2000-12-19
AU740753B2 (en) 2001-11-15
IN187157B (ru) 2002-02-16
NZ500346A (en) 2001-08-31
UA55448C2 (ru) 2003-04-15
PE84799A1 (es) 1999-09-16
IL132502A0 (en) 2001-03-19
CN1261280A (zh) 2000-07-26
HUP0003401A2 (hu) 2001-02-28
PL195090B1 (pl) 2007-08-31
KR100564189B1 (ko) 2006-03-27
PE86299A1 (es) 1999-09-17
CZ298429B6 (cs) 2007-10-03
SI0875252T1 (en) 2005-06-30
AR015598A1 (es) 2001-05-16
CA2288143C (en) 2012-08-21
HUP0100284A3 (en) 2003-08-28
ID23172A (id) 2000-03-23
WO1998048818A1 (en) 1998-11-05
KR100450856B1 (ko) 2004-10-02
EP0875563A3 (en) 2000-08-02
ID22933A (id) 1999-12-16
CA2288143A1 (en) 1998-11-05
US6436397B1 (en) 2002-08-20
EP0875252A3 (en) 2000-07-26
CO4950523A1 (es) 2000-09-01
PL195642B1 (pl) 2007-10-31
JP2001527543A (ja) 2001-12-25
IL132325A0 (en) 2001-03-19
DE69828330T2 (de) 2005-10-13
EP0875252A2 (en) 1998-11-04
TR199902631T2 (xx) 2000-01-21
SV1998000050A (es) 1999-01-13
DK0875252T3 (da) 2005-04-25
TR199902529T2 (xx) 2000-02-21
AR012010A1 (es) 2000-09-13
CA2287267A1 (en) 1998-11-05
NO995134L (no) 1999-12-21
UA73071C2 (en) 2005-06-15
TW585871B (en) 2004-05-01
EP0875563A2 (en) 1998-11-04
EA199900980A1 (ru) 2000-04-24
NO995198L (no) 1999-10-25
US6159468A (en) 2000-12-12
AU7258998A (en) 1998-11-24
KR20010020325A (ko) 2001-03-15
HUP0003401A3 (en) 2003-01-28
CN1235638C (zh) 2006-01-11
PL336420A1 (en) 2000-06-19
BR9809304B1 (pt) 2011-02-08
JP4383546B2 (ja) 2009-12-16
BR9809292A (pt) 2000-07-04
US6395270B1 (en) 2002-05-28
KR20010020242A (ko) 2001-03-15
CA2287267C (en) 2006-08-15
NO995134D0 (no) 1999-10-21
IN183798B (ru) 2000-04-15
CN1254284A (zh) 2000-05-24
NZ337828A (en) 2001-06-29
HK1016472A1 (en) 1999-11-05
EA004881B1 (ru) 2004-08-26
CO4940438A1 (es) 2000-07-24
EP0875252B1 (en) 2004-12-29
IL132325A (en) 2005-07-25
MY118591A (en) 2004-12-31
HUP0100284A2 (hu) 2001-06-28
DE69828330D1 (de) 2005-02-03
ES2234072T3 (es) 2005-06-16
MY120984A (en) 2005-12-30
EA199900979A1 (ru) 2000-06-26
NO995198D0 (no) 1999-10-25
ATE285788T1 (de) 2005-01-15
JP4383547B2 (ja) 2009-12-16
HU224826B1 (en) 2006-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA002149B1 (ru) Улучшенные способы приготовления активированного белка с
KR930007434B1 (ko) 혈액응고 억제 단백질 제조방법
US20130164815A1 (en) Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition
US4470969A (en) Process for producing a concentrate of coagulation factors VII and VIIa
EP0326014A1 (en) Composition of anticoagulants
US8476054B2 (en) Thrombin-like enzyme of Agkistrodon acutus
NL8601354A (nl) Nieuwe samenstelling.
CZ253395A3 (en) Method of controlled activation and degradation of factor vii during purification process
AU2003244850B2 (en) Processes for the preparation of fibrinogen
CN110167575B (zh) 因子xa衍生物的制备
EP0573605B1 (en) Preparation of factor ix
KR100296395B1 (ko) 단백질 c 또는 활성화 단백질 c 를 안정화시키는방법및안정화된조성물
CA2475738A1 (en) Activated protein c formulations
JP2007068497A (ja) プラスミンの精製法
CZ373799A3 (cs) Zlepšené způsoby zpracování aktivovaného proteinu C
CN109952374A (zh) 用于从人类血浆开始的纤溶酶原纯化的工艺
AU769144B2 (en) Improved methods for processing activated protein C
EP1557463A1 (en) Improved methods for processing activated protein C
KR20240017824A (ko) 혈장 분획물로부터 플라스미노겐을 분리하기 위한 공정
KR20010043941A (ko) 인간 단백질 ｃ 폴리펩티드
JPS6336781A (ja) 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法
WO2004050700A1 (en) Process for preparating concentrated thrombin solutions and use in fibrin glue

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU