TWI862564B

TWI862564B - 癌治療用醫藥

Info

Publication number: TWI862564B
Application number: TW109110983A
Authority: TW
Inventors: 中村康司; 高橋恒太; 坂口泉; 張霊
Original assignee: 日商凱依歐姆生物科學股份有限公司
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2024-11-21
Also published as: KR20210144767A; IL286680A; CN113660954B; CN113660954A; CA3135157A1; TW202104259A; WO2020204033A1; JP7549889B2; EP3949990A4; JPWO2020204033A1; US20220193064A1; EP3949990A1; AU2020255907A1

Abstract

本發明係提供可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果之肝細胞癌的治療藥、治療方法等。本發明為一種用於治療肝細胞癌之組合醫藥，其特徵為包含樂伐替尼(lenvatinib)或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內(in vivo)具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段。

Description

癌治療用醫藥

本發明係關於肝細胞癌的治療用醫藥及方法等。

肝癌為全世界中之癌相關死亡原因之第2位，在世界上，一年之間約75萬人因肝癌而亡故。一年之間新患者數約78萬人的約80%係集中於包含日本及中國在內之亞洲地區。肝細胞癌佔肝癌整體的85～90%，在日本國內，肝細胞癌的患者數經報告約4萬2千人，一年之間死亡數經報告約2萬6千人。無法切除之肝細胞癌係治療方法受限，其係預後極差，未被滿足的醫療需求(unmet medical needs)較高之疾患。

作為針對於無法切除之進行性肝細胞癌之治療藥，係使用針對於複數種受體酪胺酸激酶之多重激酶阻礙劑。具體而言，作為第1選擇藥，係使用索拉非尼(sorafenib)或樂伐替尼(lenvatinib)，作為第2選擇藥，係使用瑞格非尼(regorafenib)或卡博替尼(cabozantinib)。樂伐替尼為多重激酶阻礙劑之一，其係具有針對於屬於血管內皮增殖因子受體(VEGFR)之VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3或纖維母細胞增殖因子受體(FGFR)之FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4，除此以外，源自血小板之增殖因子受體(PDGFR)之PDGFRα，KIT、RET等與腫瘤血管新生或腫瘤惡性化相關之受體型酪胺酸激酶之選擇性阻礙活性，且能夠經口投予之酪胺酸激酶阻礙劑，2018年3月，在日本係領先於世界被承認為無法切除之進行性肝細胞癌的初級治療藥。於2018年8月，在美國、歐洲受到承認。另外，樂伐替尼在使用作為藥劑之情況，一般係以甲磺酸鹽的形態使用。

作為針對於無法切除之肝細胞癌之初級治療，將樂伐替尼及索拉非尼進行比較之開放標籤隨機化III期試驗(REFLECT試驗)之結果，樂伐替尼組的奏效率顯示為40.6%，高於索拉非尼的12.4%，此外，在REFLECT試驗中，被分配至樂伐替尼組之日本人集團(81人)的奏效率為46.9%(參照非專利文獻1)。如此，雖然樂伐替尼對無法切除之肝細胞癌顯示出高達40.6%的奏效率，但在剩餘的約60%的患者中並未看出效果。此外，藉由屬於另一種初級治療藥之索拉非尼之奏效率更低，為12.4%，藉由多重激酶阻礙劑的單獨療法之治療效果有限。

[非專利文獻1]Kudo M, et al., Lancet, vol. 391(10126), p. 1163-1173, 2018

[發明所欲解決之課題]

在此種狀況下，期望開發出可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果之肝細胞癌的治療藥、治療方法等。 [解決課題之手段]

本發明係考慮上述狀況而成者，其係提供以下所示之肝細胞癌治療用組合醫藥等。

(1)一種用於治療肝細胞癌之組合醫藥，前述組合醫藥包含樂伐替尼或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段。 (2)如上述(1)所記載之組合醫藥，其中，前述腫瘤為肝細胞癌。 (3)如上述(1)或(2)所記載之組合醫藥，其中，前述抗體為嵌合抗體或人類化抗體。

(4)如上述(1)～(3)中任一項所記載之組合醫藥，其中，前述抗體為選自由下列者所組成之群組之至少1種： (a)H鏈V區域(重鏈可變區)之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號3～5所示之胺基酸序列，且L鏈V區域(輕鏈可變區)之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號6～8所示之胺基酸序列之抗體， (b)H鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號9～11所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號12～14所示之胺基酸序列之抗體， (c)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號16所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號18所示之胺基酸序列之抗體， (d)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號20所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號22所示之胺基酸序列之抗體， (e)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號24或26所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號28所示之胺基酸序列之抗體， (f)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號30、32、34或36所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號46所示之胺基酸序列之抗體， (g)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號38、40、42或44所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號46所示之胺基酸序列之抗體， (h)由寄存編號為FERM BP-10899之融合瘤所產生之抗體， (i)由寄存編號為FERM BP-10707之融合瘤所產生之抗體， (j)由寄存編號為FERM BP-10900之融合瘤所產生之抗體，及 (k)由寄存編號為FERM BP-11337之融合瘤所產生之抗體。

(5)如上述(1)～(4)中任一項所記載之組合醫藥，其中，前述抗體或抗體片段呈與具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物之複合體的形態。 (6)如上述(1)～(5)中任一項所記載之組合醫藥，其中，即便在前述組合醫藥的投藥結束後，亦可抑制癌細胞的增殖或可使腫瘤縮小或消失。 (7)一種樂伐替尼或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段之用途，其係用於製造肝細胞癌的治療用藥劑。

(8)一種肝細胞癌的治療方法，其特徵為對被驗對象投予樂伐替尼或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段。 (9)一種用於治療肝細胞癌之套組，其包含樂伐替尼或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段。 [發明效果]

根據本發明，可提供關於肝細胞癌的治療，可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果之治療藥及治療方法等。本發明之治療藥及治療方法等在例如即便對迄今為止無法期待治療效果之患者亦可發揮效果之方面而言係極為有用。

以下，對本發明詳細地進行說明。本發明的範圍不拘於此等說明，針對以下例示以外者，亦可在無損本發明的意旨之範圍中適宜變更並實施。另外，本說明書含括成為本案優先權主張的基礎之日本專利特願2019-070120號說明書(日本平成31年(2019年)4月1日申請)整體。在本說明書中所引用之所有刊物，例如先前技術文獻及公開公報、專利公報以及其他專利文獻係作為參照而併入本說明書中。

1.本發明的概要如前述，樂伐替尼為具有針對於血管內皮增殖因子受體(VEGFR1～3)或纖維母細胞增殖因子受體(FGFR1～4)，除此以外，源自血小板之增殖因子受體(PDGFR)之PDGFRα，KIT、RET等與腫瘤血管新生或腫瘤惡性化相關之受體型酪胺酸激酶之選擇性阻礙活性，且能夠經口投予之多重激酶阻礙劑。2018年3月，在日本係領先於世界被承認為無法切除之進行性肝細胞癌的初級治療藥，在2018年8月，在美國及歐洲亦受到承認。在REFRECT試驗中，樂伐替尼顯示出高達40.6%的奏效率，但在剩餘的約60%的患者中並未見到效果，樂伐替尼單獨療法的治療效果有限。

本發明者為了開發出可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果之治療藥，而施行經由使用源自人類肝細胞癌之Hep3B細胞株或HepG2細胞株之異種移植治療模型之實驗及檢討。其結果，得知藉由組合投予樂伐替尼及抗人類DLK-1(delta-like 1 homolog(Drosophila)；以下，有時稱為「hDLK-1」)之抗體，與樂伐替尼或該抗體的單獨投予所引發之情況相比，係發揮持續且顯著較強的腫瘤增殖抑制及腫瘤縮小效果。

在此處，已知hDLK-1為含有383個殘基的胺基酸之1次膜貫穿型I型膜蛋白質，其係在肝細胞癌、小細胞肺癌、胰臟癌、乳癌等成人癌，神經母細胞瘤、肝母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、病毒瘤等小兒癌中表現。在另一方面，在正常的組織、臟器中，DLK-1的表現限於腎上腺、腦下垂體等，在大部分的臟器中並未表現，因而適合作為癌的治療標的分子。迄今為止，已創製顯示出包含優異的腫瘤縮小效果在內之腫瘤細胞增殖阻礙及腫瘤細胞死亡誘導作用之抗hDLK-1單株抗體，在使用複數種人類癌細胞株之異種移植治療模型中，顯示出抗體的單獨投予所引發之抗腫瘤活性。

根據本發明者所發現之將樂伐替尼及抗hDLK-1抗體進行組合而得之併用醫藥/併用療法，即便對迄今為止僅藉由多重激酶阻礙劑的單獨投予係無法期待充分的治療效果(不應答)之肝細胞癌的患者，亦可期待充分的治療效果。本發明係依此而完成。

2.癌治療用組合醫藥本發明之用於治療肝細胞癌之組合醫藥(以下，有時稱為「本發明之組合醫藥」。)係如前述，其特徵為包含下列者作為有效成分：・樂伐替尼或其前藥，或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物(以下，在本說明書中有時稱為「樂伐替尼等」。)，以及・在活體內具有抗腫瘤活性之抗hDLK-1抗體或源自於該抗體之抗體片段(以下，在本說明書中有時稱為「抗hDLK-1抗體等」。)。

另外，本發明亦包含(i)肝細胞癌的治療方法，其包含使用樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等，具體而言，例如將樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等的有效量投予至被驗對象(肝細胞癌的患者或有此疑慮(發病風險)之患者，或者該種非人類哺乳動物)，(ii)樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等之用途，其係用於製造肝細胞癌的治療用藥劑，(iii)樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等之用途，其係用於治療肝細胞癌，以及(iv)肝細胞癌的治療用之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等。在本發明中，作為肝細胞癌的治療，亦包含例如抑制肝細胞癌的進行、改善預後及/或防止復發等。

(1)樂伐替尼等屬於本發明之組合醫藥之有效成分之樂伐替尼等可使用公知的市售者，並無限定，亦可使用獨自地合成、萃取及精製等而得者。在獨自地合成等之情況，亦可參照美國專利第7,612,092號說明書所記載之合成方法。另外，樂伐替尼係正式名稱(IUPAC名)為4-[3-氯-4-(環丙基胺甲醯基胺基)苯氧基]-7-甲氧基-喹啉-6-羧醯胺(4-[3-chloro-4-(cyclopropylcarbamoylamino)phenoxy]-7-methoxy-quinoline-6-carboxamide)，其係以下述結構式表示。

[化1]

作為本發明之組合醫藥之有效成分，亦可與樂伐替尼共同地使用樂伐替尼衍生物，或者使用樂伐替尼衍生物來代替樂伐替尼。作為該衍生物，只要是具有源自樂伐替尼之化學結構等基於熟習該項技術者的技術常識被認為是樂伐替尼之衍生物者即可，並無限定，較佳為抗腫瘤活性係與樂伐替尼同程度者。在本發明中，在僅稱為樂伐替尼之情況，亦視為可包含樂伐替尼之衍生物之含意。

作為用於本發明之樂伐替尼，亦含括例如在生物體內經受氧化、還原、水解或抱合等代謝者，除此以外，亦包含在生物體內經受氧化、還原或水解等代謝而生成樂伐替尼之化合物(所謂的前藥)。在本發明中，所謂前藥，係指藥理學上可容許且以通常在前藥中所使用之基對母化合物進行修飾而得之化合物，例如，係指經賦予安定性或持續性的改善等特性，可期待在腸道內等轉換成母化合物而表現出效果之化合物。例如，樂伐替尼之前藥可藉由使用對應的鹵化物等前藥化試劑，依常法在從該化合物中之能夠進行前藥化之基(例如羥基、胺基、其他基)中所選出之1個以上任意的基中，依照常法適宜導入構成前藥之基後，視需要進行單離精製而予以製造。在此處，作為上述構成前藥之基，並無限定，較佳係可列舉例如低級烷基-CO-、低級烷基-O-低級伸烷基-CO-、低級烷基-OCO-低級伸烷基-CO-、低級烷基-OCO-及低級烷基-O-低級伸烷基-OCO-等。

作為本發明之組合醫藥之有效成分，亦可與樂伐替尼或其前藥共同地使用該等之藥理學上可容許的鹽，或者使用該等之藥理學上可容許的鹽來代替樂伐替尼或其前藥。作為該藥理學上可容許的鹽，並無限定，較佳係可列舉例如有機磺酸鹽(例如甲烷磺酸鹽(亦稱為甲磺酸鹽)、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽及樟腦磺酸鹽等)、有機羧酸鹽(例如醋酸鹽、三氟醋酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽及檸檬酸鹽等)、胺基酸鹽(例如天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽等)、四級胺鹽、鹼金屬鹽(例如鈉鹽及鉀鹽等)、無機酸鹽(例如硫酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽及重碳酸鹽等)、氫鹵酸鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽及氫碘酸鹽等)、鹼土族金屬鹽(例如鎂鹽及鈣鹽等)等。作為用於本發明之樂伐替尼之藥理學上可容許的鹽之一較佳態樣，可列舉樂伐替尼甲磺酸鹽。

用於本發明之樂伐替尼亦含括在化合物的結構上可產生之所有異構物(例如幾何異構物、基於不對稱碳之光學異構物、旋轉異構物、立體異構物及互變異構物等)及此等異構物中之2種以上之混合物，並不限定於便宜上之結構式的記載等。此外，樂伐替尼可為S-體、R-體或RS-體中之任何者，並無限定。再者，樂伐替尼視其種類亦有以水合物或溶劑合物的形式存在之情況，在本發明中，該水合物及溶劑合物亦視為包含在樂伐替尼中，可使用作為本發明之組合醫藥之有效成分。作為該溶劑合物，並無限定，可列舉例如與乙醇之溶劑合物等。

在本發明之組合醫藥中，作為有效成分之樂伐替尼等的含有比例並無限定，可適宜設定，例如，相對於組合醫藥整體而言，可設為0.01～99重量%的範圍內，亦可設為較佳係0.01～30重量%，更佳係0.05～20重量%，再佳係0.1～10重量%的範圍內。藉由使有效成分的含有比例為上述範圍內，本發明之組合醫藥可充分地發揮肝細胞癌的治療效果。本發明之組合醫藥係除了樂伐替尼等以外，在不會明顯損及本發明的效果之範圍中，亦可包含任意的其他多重激酶阻礙劑等。

(2)抗hDLK-1抗體等屬於本發明之組合醫藥之有效成分之抗hDLK-1抗體(在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體)可基於以下說明記載予以製作。

(i)抗原的調製 hDLK-1的胺基酸序列(序列編號2)的情報係以「Accession number：NP_003827」之形式公佈於例如NCBI(GenBank)的網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另外，編碼出hDLK-1的胺基酸序列之鹼基序列(序列編號1)的情報係以「Accession number：NM 003836」之形式公佈於同網站。作為抗原，可使用包含hDLK-1的胺基酸序列的至少一部分(全部或一部分)之多肽或胜肽(亦僅稱為胜肽)，較佳係可使用包含hDLK-1之細胞外區域(FA-1)的胺基酸序列的至少一部分(全部或一部分)之胜肽。hDLK-1之細胞外區域如前述般係指包含6個EGF樣模體(EGF-1～EGF-6)之區域，包含序列編號2所示之胺基酸序列中之第24個～第244個胺基酸之區域較佳係指含有序列編號2所示之胺基酸序列中之「第24個」至「第248～285個」胺基酸之區域(大約225～262個胺基酸殘基)。

在此處，針對用於抗原之胜肽，所謂上述「胺基酸序列的至少一部分」，長度並無特別限定，較佳為例如包含6個EGF樣模體中之1個或2個以上之區域。更佳為例如包含EGF-1及EGF-2之區域(即，含有序列編號2所示之胺基酸序列中之第24個～第91個胺基酸之區域)、包含EGF-3及EGF-4之區域(即，含有序列編號2所示之胺基酸序列中之第92個～第167個胺基酸之區域)以及包含EGF-4、EGF-5及EGF-6之區域(即，含有序列編號2所示之胺基酸序列中之第131個～第244個胺基酸之區域)。

作為抗原之胜肽的製作方法可為化學合成，亦可為經由使用大腸菌等之基因工學手法之合成，可使用熟習該項技術者所週知的方法。在施行胜肽的化學合成之情況，可藉由胜肽合成的週知方法進行合成。此外，該合成亦可應用固相合成法及液相合成法中之任何者。亦可使用市售的胜肽合成裝置(例如島津製作所製：PSSM-8等)。

在基因工學性地合成胜肽之情況，首先，設計編碼出該胜肽之DNA並加以合成。該設計及合成可例如以包含全長hDLK-1基因之載體等作為模板，使用以可合成所期望的DNA區域之方式所設計出之引子，藉由PCR法來施行。又，藉由將上述DNA連結至適當的載體而獲得蛋白質表現用重組載體，藉由將此重組載體以可表現出目標基因之方式導入至宿主中而獲得轉形體(Molecular cloning 4th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012))。

使用可在宿主微生物中自主性地增殖之噬菌體或質體當作載體。再者，亦可使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的製作只要以適當的限制酵素切斷經精製之DNA，插入至適當的載體DNA之限制酵素部位等中並連結至載體即可。作為使用於轉形之宿主，只要是可表現出目標基因者，即無特別限定。可列舉例如細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆蟲細胞或昆蟲。亦能夠使用山羊等哺乳動物作為宿主。將重組載體導入至宿主中之方法屬公知。

又，將前述轉形體進行培養，自該培養物中採取使用作為抗原之胜肽。所謂「培養物」，係意味培養上清液、培養細胞或培養菌體或者其破碎物中之任一者。培養後，在於菌體內或細胞內生產目標胜肽之情況，係藉由將菌體或細胞進行破碎而萃取出胜肽。此外，在於菌體外或細胞外生產目標胜肽之情況，係依原樣使用培養液，或者藉由離心分離等去除菌體或細胞。然後，可藉由單獨或適宜組合使用胜肽的單離精製中所使用之一般的生化學方法，例如硫酸銨沉澱、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等，而將目標胜肽進行單離精製。

在本發明中，亦可藉由使用無細胞合成系統之活體外(in vitro)轉譯而獲得作為抗原之胜肽。在此情況，可使用2種方法：將RNA當作模板之方法及將DNA當作模板之方法(轉錄/轉譯)。作為無細胞合成系統，可使用市售的系統，例如Expressway TM系統(Invitrogen公司)、PURESYSTEM(註冊商標；Post Genome研究所)、TNT系統(註冊商標；Promega公司)等。如上述所獲得之胜肽亦能夠結合至適當的攜載蛋白質，例如牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔帽貝血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、人類甲狀腺球蛋白、雞γ-球蛋白等。

此外，抗原亦可為含有在hDLK-1的胺基酸序列(序列編號2)或前述之其部分序列中，1或複數個胺基酸發生缺失、置換或附加而得之胺基酸序列之胜肽。例如，亦可使用含有hDLK-1的胺基酸序列或其部分序列中之1或複數個(較佳為1個或數個(例如1個～10個，更佳為1個～5個))胺基酸發生缺失，1或複數個(較佳為1個或數個(例如1個～10個，更佳為1個～5個))胺基酸被其他胺基酸所置換，或者1或複數個(較佳為1個或數個(例如1個～10個，更佳為1個～5個))其他胺基酸進行附加而得之胺基酸序列之胜肽。

在本發明中，作為用於導入至細胞等中之基因，可列舉編碼出hDLK-1蛋白質或其部分片段或者該等之變異型蛋白質或片段之基因。作為該種基因，可使用例如具有序列編號1所示之鹼基序列或其部分序列者。此外，作為用於導入至細胞等中之基因，亦能夠使用與互補於序列編號1所示之鹼基序列之序列在嚴苛的條件下進行雜合且編碼出具有hDLK-1活性之蛋白質之鹼基序列或其部分序列。

所謂「嚴苛的條件」，係指雜合後之洗淨時之條件，其係緩衝液的鹽(鈉)濃度為10～500mM，溫度為42℃～72℃，較佳係上述鹽濃度為50～300mM，溫度為55～68℃之條件。在將變異導入至基因中時，可藉由Kunkel法或Gapped duplex法等公知手法，使用例如利用部位特異性突變誘發法之變異導入用套組，例如GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司製)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Prime STAR(註冊商標)Mutagenesis Basal kit、Mutan(註冊商標)-Super Express Km等：Takara Bio公司製)來施行。

(ii)多株抗體的製作將所調製之抗原投予至用於免疫之哺乳動物。哺乳動物並無特別限定，可列舉例如大鼠、小鼠及兔等，其中，較佳為小鼠。每一隻動物之抗原投予量可依佐劑的有無而適宜設定。作為佐劑，可列舉弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant，FCA)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant，FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可藉由注入至靜脈內、足底、皮下、腹腔內等而施行。此外，針對免疫的間隔，並無特別限定，以數日至數週間隔，較佳為1週間隔，施行1～10次，較佳為2～3次免疫。又，可在最終的免疫日起3～7日後，以酵素免疫測定法(ELISA或EIA)或放射性免疫測定法(RIA)等測定抗體價，在顯示出所期望的抗體價之日進行採血，而獲得抗血清。在上述抗體的採取方法中，在需要進行抗體的精製之情況，可藉由適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等公知的方法，或者將此等進行組合而進行精製。然後，以ELISA法等測定抗血清中之多株抗體的反應性。

(iii)單株抗體的製作・產生抗體之細胞的採取本發明之抗hDLK-1抗體並無限定，較佳為單株抗體。將所調製之抗原投予至用於免疫之哺乳動物，例如大鼠、小鼠及兔等。每一隻動物之抗原投予量可依佐劑的有無而適宜設定。作為佐劑，係與上述相同。免疫手法亦與前述相同。又，在最終的免疫日起1～60日後，較佳為1～14日後，採取產生抗體之細胞。作為產生抗體之細胞，可列舉脾臟細胞、淋巴節細胞及末梢血細胞等，其中，較佳為淋巴節細胞及脾臟細胞。

・細胞融合為了獲得融合瘤(產生抗體之細胞株)，而施行產生抗體之細胞及骨髓瘤細胞之細胞融合。作為與產生抗體之細胞進行融合之骨髓瘤細胞，可使用小鼠等動物的一般能夠取得之株化細胞。作為所使用之細胞株，較佳為具有藥劑選擇性，且具有在未融合的狀態下在HAT選擇培養基(包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷)中無法生存，僅在與產生抗體之細胞進行融合之狀態下可生存之性質者。作為骨髓瘤細胞，可列舉例如P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1(NS1)及Sp2/0-Ag14(Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細胞株。骨髓瘤細胞的選擇可適宜考慮與產生抗體之細胞之適合性而施行。

接著，使骨髓瘤細胞及產生抗體之細胞進行細胞融合。細胞融合係在不含血清之DMEM及RPMI-1640培養基等動物細胞用培養基中，將1×10⁶ ～1×10⁷ 個/mL的產生抗體之細胞及2×10⁵ ～2×10⁶ 個/mL的骨髓瘤細胞進行混合。產生抗體之細胞與骨髓瘤細胞之細胞比(產生抗體之細胞：骨髓瘤細胞)並無限定，通常較佳係設為1：1～10：1，更佳為3：1。其次，在細胞融合促進劑的存在下施行融合反應。作為細胞融合促進劑，可使用例如平均分子量1,000～6,000道耳吞(D)的聚乙二醇等。此外，亦可使用利用電刺激(例如電穿孔)之市售的細胞融合裝置，使產生抗體之細胞及骨髓瘤細胞進行融合。

・融合瘤的挑選及選殖自細胞融合處理後之細胞中挑選出目標融合瘤。作為其方法，係將細胞懸浮液適當地稀釋於例如含有胎牛血清之RPMI-1640培養基等中後，接種於微量滴定盤上，在各孔中加入選擇培養基，以後適當地更換選擇培養基而施行培養。其結果，可獲得以選擇培養基開始進行培養後，14日前後起所生長出之細胞作為融合瘤。其次，在逐漸增殖之融合瘤之培養上清液中，篩選出是否存在對hDLK-1進行反應之抗體。融合瘤的篩選只要依照通常的方法即可，並無特別限定。例如，可採取已生長為融合瘤之孔中所包含之培養上清液的一部分，藉由ELISA、EIA及RIA等進行篩選。

融合細胞的選殖可藉由有限稀釋法等施行。藉由流式細胞儀等判定出對hDLK-1顯示出較強的反應性之抗體，選擇產生此抗體之融合瘤，建立為選殖株。

・單株抗體的採取作為將所建立之融合瘤進行培養並自所獲得之培養物中採取單株抗體之方法，可採用通常的細胞培養法或腹水形成法等。所謂「培養」，係意味使融合瘤在培養皿或培養瓶中生長，或者使融合瘤如下述般在動物的腹腔內增殖。在細胞培養法中，可將融合瘤在含有10%胎牛血清之RPMI-1640培養基、MEM培養基或無血清培養基等動物細胞培養培養基中，在通常的培養條件(例如37℃，5%CO₂ 濃度)下培養7～14日，自其培養上清液中取得抗體。

在腹水形成法之情況，係將約1×10⁷ 個融合瘤投予至與源自骨髓瘤細胞之哺乳動物同種系動物的腹腔內，使融合瘤大量地增殖。又，較佳係在2～3週後採取腹水。在上述抗體的採取方法中，在需要進行抗體的精製之情況，可藉由適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等公知的方法，或者將此等進行組合而進行精製。

・具有抗腫瘤活性之選殖株的挑選用於本發明之抗hDLK-1抗體為在活體內具有抗腫瘤活性之抗體。在此處，所謂「抗腫瘤活性」，係意味使腫瘤細胞(癌細胞)死滅之活性或阻礙腫瘤成長之活性。在本發明中，作為抗腫瘤活性，較佳係可列舉例如腫瘤血管新生阻礙活性。作為本發明之抗hDLK-1抗體可發揮抗腫瘤活性之人類腫瘤(腫瘤細胞)的種類，可列舉已確認hDLK-1的表現之公知的人類腫瘤。

在活體內之抗腫瘤活性的確認可藉由例如使用將所期望的腫瘤細胞移植至小鼠的皮下而得之荷癌小鼠，將如前述所獲得之抗體投予至此小鼠而施行。在此情況，抗體的投予可在腫瘤細胞的移植後立即施行(Prevention模型)，亦可在移植下確認腫瘤成為預定的體積之後施行(Treatment模型)。投予方法並無任何限定，例如，亦可設為每3日1次，20mg/kg體重，腹腔內投予。在Prevention模型之情況，可藉由腫瘤形成頻率及腫瘤體積來評估抗腫瘤活性的有無及水平。在Treatment模型之情況，可藉由腫瘤體積及腫瘤重量來評估抗腫瘤活性的有無及水平。

在本發明中，作為在活體內具有抗腫瘤活性之抗hDLK-1抗體，並無特別限定，可使用例如WO2008/056833、WO2009/116670、WO2014/054820各公報所揭示之抗hDLK-1。更具體而言，可列舉例如以下(a)～(k)之抗hDLK-1抗體，可使用該等中之至少1種。

(a)H鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號3～5所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號6～8所示之胺基酸序列之抗體。 (b)H鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號9～11所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1～3的胺基酸序列分別依序為序列編號12～14所示之胺基酸序列之抗體。

(c)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號16所示之胺基酸序列(對應的鹼基序列為序列編號15)，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號18(對應的鹼基序列為序列編號17)所示之胺基酸序列之抗體。另外，該抗體之H鏈V區域及L鏈V區域中之各CDR序列係與上述(a)之抗體相同。 (d)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號20所示之胺基酸序列(對應的鹼基序列為序列編號19)，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號22(對應的鹼基序列為序列編號21)所示之胺基酸序列之抗體。另外，該抗體之H鏈V區域及L鏈V區域中之各CDR序列係與上述(b)之抗體相同。

(e)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號24或26所示之胺基酸序列(對應的鹼基序列為序列編號23或25)，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號28(對應的鹼基序列為序列編號27)所示之胺基酸序列之抗體(人類化抗體)。另外，該抗體之H鏈V區域及L鏈V區域中之各CDR序列係與上述(a)之抗體相同。 (f)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號30、32、34或36所示之胺基酸序列(對應的鹼基序列為序列編號29、31、33或35)，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號46(對應的鹼基序列為序列編號45)所示之胺基酸序列之抗體(人類化抗體)。另外，該抗體之H鏈V區域及L鏈V區域中之各CDR序列係與上述(b)之抗體相同。

(g)H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號38、40、42或44所示之胺基酸序列(對應的鹼基序列為序列編號37、39、41或43)，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號46(對應的鹼基序列為序列編號45)所示之胺基酸序列之抗體(人類化抗體)。另外，該抗體之H鏈V區域及L鏈V區域中之各CDR序列係與上述(b)之抗體相同。

(h)由寄存編號為FERM BP-10899之融合瘤所產生之抗體。 (i)由寄存編號為FERM BP-10707之融合瘤所產生之抗體。 (j)由寄存編號為FERM BP-10900之融合瘤所產生之抗體。 (k)由寄存編號為FERM BP-11337之融合瘤所產生之抗體。

在此處，關於上述(f)之抗體，序列編號32所示之胺基酸序列為序列編號30所示之胺基酸序列之第24個丙胺酸(A)被置換成甘胺酸(G)而得者，序列編號34所示之胺基酸序列為序列編號30所示之胺基酸序列之第74個蘇胺酸(T)被置換成離胺酸(K)而得者，序列編號36所示之胺基酸序列為序列編號30所示之胺基酸序列之第24個丙胺酸(A)被置換成甘胺酸(G)，且第74個蘇胺酸(T)被置換成離胺酸(K)而得者。

同樣地，關於上述(g)之抗體，序列編號40所示之胺基酸序列為序列編號38所示之胺基酸序列之第24個丙胺酸(A)被置換成甘胺酸(G)而得者，序列編號42所示之胺基酸序列為序列編號38所示之胺基酸序列之第74個蘇胺酸(T)被置換成離胺酸(K)而得者，序列編號44所示之胺基酸序列為序列編號38所示之胺基酸序列之第24個丙胺酸(A)被置換成甘胺酸(G)，且第74個蘇胺酸(T)被置換成離胺酸(K)而得者。

此種上述(f)及(g)之抗體(人類化抗體)中之經胺基酸置換而得之改良抗體為結合性(Avidity；抗原結合活性)進一步更高的抗體，例如，其能夠保持與在細胞表面之抗原的表現量較少的癌細胞之結合活性。此外，該改良抗體在液劑配方中以及猴或人類的血中(血漿中)等可保持長期安定的抗原結合活性。

此外，關於上述(h)～(k)之抗體，寄存編號為FERM BP-11337之融合瘤係稱為「Mouse-Mouse hybridoma BA-1-3D」，於2011年2月1日寄存，寄存編號為FERM BP-10707之融合瘤係稱為「Mouse-Mouse hybridoma：M3-1」，於2006年10月18日寄存，寄存編號為FERM BP-10899之融合瘤係稱為「Mouse-Mouse hybridoma DI-2-14」，於2007年8月21寄存，寄存編號為FERM BP-10900之融合瘤係稱為「Mouse-Mouse hybridoma DI-6」，於2007年8月21日寄存，皆寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄託中心(International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(寄存證發行當時之國際寄存當局的名稱)。作為可用於本發明之抗hDLK-1抗體，較佳係亦可列舉例如結合至上述之多種抗hDLK-1抗體所結合(識別)之部位(例如抗原決定位)之抗hDLK-1抗體等可與上述之多種抗hDLK-1抗體進行競爭之抗體。

・抗hDLK-1抗體之抗原決定位抗hDLK-1抗體之抗原決定位(抗原決定基)只要是屬於抗原之hDLK-1的至少一部分即可，並無限定，較佳為例如序列編號2所示之hDLK-1的胺基酸序列中之含有第24個～第91個胺基酸之區域(hDLK-1之包含EGF-1～EGF-2之區域)、含有第92個～第167個胺基酸之區域(hDLK-1之包含EGF-3～EGF-4之區域)或含有第131個～第244個胺基酸之區域(hDLK-1之包含EGF-4～EGF-6之區域)的至少一部分。其中，更佳為hDLK-1之包含EGF-1～EGF-2之區域。識別該區域(與該區域進行結合)之抗hDLK-1抗體係例如向腫瘤細胞內之內化活性較高，在後述之免疫共軛物等用途上極為有用。

(iv)基因重組抗體及抗體片段・基因重組抗體作為抗hDLK-1抗體之較佳態樣之一，可列舉基因重組抗體。作為基因重組抗體，並無限定，可列舉例如嵌合抗體及人類化抗體等。嵌合抗體(即人類型嵌合抗體)為將源自小鼠之抗體之可變區連結(接合)至源自人類之恆定區而得之抗體(參照Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984)等)，在製作嵌合體之情況，可藉由基因重組技術輕易地構築，以便獲得如此連結之抗體。

在製作人類化抗體之情況，係自小鼠抗體之可變區將互補性決定區(CDR)移植至人類可變區，而製作框架區(FR)源自人類者且CDR源自小鼠者所組成之經再構成之可變區(所謂的CDR移植(CDR grafting))。其次，將此等經人類化之再構成人類可變區連結至人類恆定區。人類化抗體的製作法可參照例如Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；日本專利特表平4-502408號公報(專利第2828340號公報；Queen等人)等。再者，在本發明中，亦含括將上述人類化抗體之H鏈或L鏈之V區域的一部分(CDR序列除外)的胺基酸(較佳為1～數個，更佳為1～2個胺基酸)進行其他胺基酸置換而得之改良型胺基酸。作為改良人類化抗hDLK-1抗體，亦可當作結合性(Avidity；抗原結合活性)進一步更高的人類化抗體，例如，其能夠保持與在細胞表面之抗原的表現量較少的癌細胞之結合活性。此外，改良人類化抗hDLK-1抗體亦可視為在液劑配方中以及猴或人類的血中(血漿中)等可保持長期安定的抗原結合活性者。

上述嵌合抗體及人類化抗體較佳係例如抗體Fc區中之N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖並未鍵結至該糖鏈的還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺之糖鏈，詳細而言，可列舉在抗體分子之Fc區具有該岩藻糖的1位並未α鍵結至N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺的6位之糖鏈之基因重組抗體分子所組成之抗體。若為此種抗體，便可飛躍性地提升ADCC活性。另外，此方面(抗體Fc區中之N-糖苷鍵複合型糖鏈之特徵)針對前述之多株抗體及單株抗體而言亦同樣地較佳。

・抗體片段在本發明中，亦可與本發明之抗hDLK-1抗體共同地使用抗hDLK-1抗體之片段，或者使用抗hDLK-1抗體之片段來代替本發明之抗hDLK-1抗體。在此處，該抗體片段係與本發明之抗hDLK-1抗體(包含小鼠抗體以外之人類化抗體等)同樣地，較佳係具有對hDLK-1之結合活性，此外，較佳亦在活體內具有抗腫瘤活性，或者識別與本發明之抗hDLK-1抗體相同的抗原決定位，並無特別限制。作為該抗體片段，係意味抗hDLK-1多株抗體或抗hDLK-1單株抗體的一部分的區域(即，源自於本發明之抗hDLK-1抗體之抗體片段)，可列舉例如Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv(variable fragment of antibody)、單鏈抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區域及L鏈V區域等)、scFv、diabody(scFv二聚體)、dsFv(二硫化物安定化V區域)以及在至少一部分包含互補性決定區(complementarity determining region：CDR)之胜肽等。

Fab為將抗體分子以蛋白質分解酵素木瓜蛋白酶進行處理所獲得之片段中，H鏈的N末端側約一半及L鏈整體以二硫鍵進行鍵結而得之分子量約5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。此外，亦可藉由將編碼出抗體之Fab之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造Fab。 F(ab')₂ 為將抗體分子以蛋白質分解酵素胃蛋白酶進行處理所獲得之片段中，稍大於Fab經由鉸鏈區之二硫鍵進行鍵結而得者之分子量約10萬的具有抗原結合活性之抗體片段。此外，亦可使後述之Fab進行硫醚鍵結或二硫鍵結而予以製作。

Fab'為將上述F(ab')₂ 之鉸鏈區之二硫鍵加以切斷而得之分子量約5萬的具有抗原結合活性之抗體片段。此外，亦可藉由將編碼出抗體之Fab'片段之DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造Fab'。 scFv為將1條H鏈V區域(VH)及1條L鏈V區域(VL)使用適當的胜肽連結子(P)進行連結而得之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其係具有抗原結合活性之抗體片段。可藉由取得編碼出抗體之VH及VL之cDNA，構築編碼出scFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造scFv。

diabody為scFv進行二聚體化而得之抗體片段，其係具有二價的抗原結合活性之抗體片段。二價的抗原結合活性可相同，亦可將其中一者設為不同的抗原結合活性。可藉由取得編碼出抗體之VH及VL之cDNA，以P的胺基酸序列的長度成為8個殘基以下之方式構築編碼出scFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造diabody。

dsFv係指使將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換成半胱胺酸殘基而得之多肽經由該半胱胺酸殘基間之二硫鍵進行鍵結而得之物。置換成半胱胺酸殘基之胺基酸殘基可依照由Reiter等人所示之方法(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)，基於抗體的立體結構預測而進行選擇。可藉由取得編碼出抗體之VH及VL之cDNA，構築編碼出dsFv之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造dsFv。

包含CDR之胜肽係包含VH或VL之CDR (CDR1～3)中之至少1個區域以上而構成。複數個包含CDR之胜肽可直接地或經由適當的胜肽連結子進行結合。可藉由構築編碼出抗體之VH及VL之CDR之DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物中而使其進行表現，製造包含CDR之胜肽。此外，包含CDR之胜肽亦可藉由Fmoc法(茀基甲基氧基羰基法)及tBoc法(第三丁基氧基羰基法)等化學合成法予以製造。

作為用於本發明之抗體片段，可為以原有的形狀包含N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖並未鍵結至該糖鏈的還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺之糖鏈之抗體Fc區的一部分或全部之抗體片段，此外，亦可為上述之抗體片段與N-糖苷鍵複合型糖鏈為岩藻糖並未鍵結至該糖鏈的還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺之糖鏈之抗體Fc區的一部分或全部之融合蛋白質。若為此種抗體片段，便可飛躍性地提升ADCC活性，因而較佳。作為用於本發明之抗體片段之具體例，並無限定，可列舉例如前述之各種抗hDLK-1抗體中，包含H鏈V區域之CDR1～3及L鏈V區域之CDR1～3者，或包含H鏈V區域整體及L鏈V區域整體者等。

(v)抗體-藥劑複合體用於本發明之抗hDLK-1抗體及抗體片段亦可呈與具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物形成複合體之形態。另外，預先分別調製抗體分子或抗體片段分子以及具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物之後，使此等進行複合化所獲得之物一般係稱為免疫共軛物。此外，使用基因重組技術，使作為具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物之蛋白質毒素在基因上與抗體或抗體片段之基因進行連結，使其作為1個蛋白質(融合蛋白質)進行表現所獲得之物一般係稱為免疫毒素。

作為具有抗腫瘤活性之化合物，可列舉例如阿黴素(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、絲裂黴素(mitomycin C)、澳瑞他汀E(auristatin E)等。作為具有殺細胞活性之化合物，可列舉例如皂草素、蓖麻毒素、綠膿菌外毒素、白喉毒素等，其中，較佳係使用皂草素及綠膿菌外毒素。作為該複合體的製作方法，並無限定，可列舉例如藉由二硫鍵或腙鍵將抗體及藥劑進行偶合之方法等。

用於本發明之抗hDLK-1抗體在向表現hDLK-1之標的腫瘤細胞內之內化活性上係優異。因此，可藉由預先使具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物進行複合化，而使此等化合物直接且高選擇性地作用於腫瘤細胞。該複合體在向標的腫瘤細胞送達藥劑之能力上係極為優異。另外，向細胞內之內化活性可藉由將抗體以羅丹明(rhodamine)等進行螢光標識，針對移行至細胞內之行為及抗體的局部性使用螢光顯微鏡等進行觀察而予以評估。

(3)組合醫藥本發明之組合醫藥各包含樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等作為有效成分。本發明之組合醫藥可對作為被驗對象之人類或非人類哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、貓、犬、猴等)，以多種投予途徑，具體而言，經口或非經口(例如靜脈內注射(靜脈注射)、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、直腸投予、經皮投予)進行投予。從而，本發明之組合醫藥亦能夠單獨使用，可因應投予途徑，藉由慣用的方法，使用藥學上可容許的擔體而製劑化成適當的劑型來使用。

作為劑型，就經口劑而言，可列舉例如錠劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、被覆錠劑、膠囊劑、內用水劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑及口含錠劑等，就非經口劑而言，可列舉例如注射劑(包含點滴劑)、吸入劑、軟膏劑、點鼻劑及微脂體劑等。作為可用於此等製劑的製劑化之擔體，可列舉例如通常所使用之賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑及矯味矯臭劑，除此以外，視需要地，安定化劑、乳化劑、吸收促進劑、界面活性劑、pH調整劑、防腐劑、抗氧化劑、增量劑、濕潤化劑、表面活化劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、溶解輔助劑及無痛化劑等，能夠摻合可使用作為醫藥品製劑之原料之公知的成分並依常法進行製劑化。

作為能夠使用作為該成分之無毒性的物質，可列舉例如大豆油、牛脂及合成甘油酯等動植物油；流動石蠟、角鯊烷及固態石蠟等烴；肉豆蔻酸辛基十二烷酯及肉豆蔻酸異丙酯等酯油；鯨蠟硬脂醇及山萮醇等高級醇；矽樹脂；矽油；聚氧乙烯脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等界面活性劑；羥基乙基纖維素、聚丙烯酸、羧基乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯啶酮及甲基纖維素等水溶性高分子；乙醇及異丙醇等低級醇；甘油、丙二醇、二丙二醇、山梨糖醇及聚乙二醇等多元醇(多元醇)；葡萄糖及蔗糖等糖；矽酸酐、矽酸鋁鎂及矽酸鋁等無機粉體；氯化鈉、磷酸鈉等無機鹽；精製水等，皆亦可為其鹽或其水合物。

各自而言，作為賦形劑，較佳係可列舉例如乳糖、果糖、玉米澱粉、白糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、結晶纖維素及二氧化矽等，作為黏合劑，較佳係可列舉例如聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纖維素、乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、蟲膠、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、聚丙二醇/聚氧乙烯嵌段聚合物及葡甲胺等，作為崩解劑，較佳係可列舉例如澱粉、瓊脂、明膠末、結晶纖維素、碳酸鈣、碳酸氫鈉、檸檬酸鈣、糊精、果膠及羧基甲基纖維素/鈣等，作為潤滑劑，較佳係可列舉例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、氧化矽及硬化植物油等，作為著色劑，較佳係可列舉容許添加至醫藥品中者，作為矯味矯臭劑，較佳係可列舉例如可可末、薄荷腦、芳香散、薄荷油、龍腦及桂皮末等，皆亦可為其鹽或該等之水合物。

本發明之組合醫藥的投予量一般而言可在考慮到製劑中之有效成分的摻合比例之後，斟酌投予對象(患者)的年齡、體重、疾病的種類/進行狀況，或投予途徑、投予次數(/1日)、投予期等，適宜地在廣範圍中進行設定。此外，本發明之組合醫藥可實質上同時地投予屬於有效成分之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等，亦可依序先投予任一者，隨後投予另一者，並無限定。此外，此等投予可一次性地投予組合醫藥中所包含之量，亦可連續地進行投予，並無限定。針對將本發明之組合醫藥用作非經口劑或經口劑之情況，在以下進行說明。

在用作非經口劑之情況，一般而言，其形態並無限定，在各種注射劑之情況，可例如以單位投予量安瓿或多投予量容器的狀態，或使用時使其再溶解成溶解液之凍結乾燥粉末的狀態提供。在該非經口劑中，除了成為有效成分之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等以外，尚可因應各種形態，在無損上述有效成分的效果之範圍中含有公知的各種賦形材或添加劑。例如，在各種注射劑之情況，可列舉水、甘油、丙二醇或聚乙二醇等脂肪族多元醇等。非經口劑的投予量(每1日)並無限定，例如若為各種注射劑，一般而言，可設為應用對象(被驗者、患者等)的體重每1kg，可服用0.01～1000mg、0.05～500mg或0.1～50mg成為有效成分之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等之量，或者亦可設為可服用0.5～20mg之量或可服用1～10mg之量。

在用作經口劑之情況，一般而言，其形態並無限定，可為前述之劑型中之任何者，亦可為使用時使其進行再溶解之乾燥生成物。在該經口劑中，除了成為有效成分之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等以外，尚可因應各種形態，在無損上述有效成分的效果之範圍中含有公知的各種賦形材或添加劑。可列舉例如黏合劑(糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠、聚乙烯基吡咯啶酮等)、填充材(乳糖、糖、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、磷酸鈣、山梨糖醇、甘胺酸等)、潤滑劑(硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、氧化矽等)、崩解劑(各種澱粉等)及濕潤劑(月桂基硫酸鈉等)等。

經口劑的投予量(每1日)一般而言可設為應用對象(被驗者、患者等)的體重每1kg，可服用0.05～5000mg、0.1〜1000mg或0.1～100mg成為有效成分之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等之量，或者亦可設為可服用0.5～50mg之量或可服用1～10mg之量。此外，經口劑中之有效成分的摻合比例並無限定，可考慮到每1日之投予次數等而適宜設定。

本發明之組合醫藥係關於肝細胞癌的治療，可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果，例如，即便在該醫藥的投藥結束後，亦可抑制癌細胞的增殖，可使腫瘤縮小或消失。在即便對迄今為止無法期待治療效果之肝細胞癌患者亦可發揮效果之方面而言，本發明之組合醫藥係極為有用。

3.套組本發明亦可提供包含樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等作為構成要素之肝細胞癌的治療用套組的形態。該套組中之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等係考慮到安定性(保存性)及使用容易性等，亦可例如以經溶解之狀態準備。該套組係除了樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等以外，亦可適宜包含其他構成要素。可包含例如抗體之標識物質，或者將抗體或其標識物進行固定之固相化試劑等。所謂抗體之標識物質，係意味經酵素、放射性同位素、螢光化合物及化學發光化合物等所標識之物。此外，亦可包含各種緩衝液、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反應容器(Eppendorf管等)、阻斷劑(牛血清白蛋白(BSA)、脫脂乳、山羊血清等血清成分)、洗淨劑、界面活性劑、各種板件、疊氮化鈉等防腐劑及實驗操作手冊(說明書)等。

該套組只要是至少具備前述之樂伐替尼等及抗hDLK-1抗體等作為構成要素即可。從而，可在套組中共同地具備肝細胞癌的治療所需之所有構成要素，亦可個別分開地具備，並無限定。

以下，列舉實施例來更具體地說明本發明，但本發明並不限定於此等。 [實施例1]

使用Hep3B異種移植模型，檢討樂伐替尼甲磺酸鹽及抗hDLK-1抗體在腫瘤形成阻礙活性中之併用效果。在此處，樂伐替尼甲磺酸鹽係使用市售者(以下，在本實施例中，僅稱為「樂伐替尼」。)。本實施例中所使用之抗hDLK-1抗體為WO2014/054820公報所記載之「HuBA-1-3D-1-A24G/T73K抗體」(以下，在本實施例中，僅稱為「HuBA-1-3D抗體」。)，編碼出該抗體蛋白質之DNA的構築係依照同公報(說明書中之實施例)所記載之方法，然後，針對經由宿主細胞之該抗體蛋白質的產生/調製，係使用GlymaxX(註冊商標)技術(ProBioGen AG；參照https://www.probiogen.de/genetic-glyco-engineering-adcc-glymaxx.html)來施行。另外，本實施例中所使用之HuBA-1-3D-1-A24G/T73K抗體為H鏈V區域含有序列編號36所示之胺基酸，L鏈V區域含有序列編號46所示之胺基酸者。

將1×10⁶ 個Hep3B細胞移植至6～7週齡雌性NOD/ShiJic-scidJcl小鼠的右側腹皮下(Day 0)，在平均腫瘤體積達到100mm³ 左右之階段(Day 14)，施行分組成對照組(N＝8，103.5±18.1mm³ )、樂伐替尼(3mg/kg體重)投予組(N＝8，102.8±16.8mm³ )、HuBA-1-3D抗體(1mg/kg體重)投予組(N＝8，102.7±15.0mm³ )、樂伐替尼(3mg/kg體重)及HuBA-1-3D抗體(1mg/kg體重)之併用投予組(N＝8，102.5±12.5mm³ )(以下，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組)，自同日起12日，HuBA-1-3D抗體係以每週2次的進度(共計4次；Day 14、18、22、25)，樂伐替尼係以每週5次(投予5日，休藥2日)的進度(共計10次；Day 14、15、16、17、18、21、22、23、24、25)，施行投藥。以每週2次的頻率施行腫瘤體積的計測，達到1500mm³ 之個體係視為觀察結束。

其結果，在癌細胞移植起第25日(投藥結束日，Day 25)之腫瘤體積，對照組為557.5±240.5mm³ ，相對於此，樂伐替尼投予組成為268.1±175.7mm³ ，HuBA-1-3D抗體投予組成為144.6±111.2mm³ ，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組成為66.2±59.1mm³ ，所有投予組相比於對照組而言皆確認到較強的抗腫瘤活性。此外，對投藥結束後之藥效進行檢討，結果在癌細胞移植起第31日(投藥結束後6日，Day 31)，對照組為1282.8±448.3mm³ ，樂伐替尼投予組為572.2±456.0mm³ ，HuBA-1-3D抗體投予組為92.9±79.3mm³ ，相對於此，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組成為40.3±46.1mm³ 。再者，在癌細胞移植起第38日(投藥結束後13日，Day 38)，樂伐替尼投予組為1148.5±591.0mm³ ，HuBA-1-3D抗體投予組為402.3±364.4mm³ ，相對於此，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組成為52.8±63.9mm³ 。即，確認到樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組相比於樂伐替尼投予組或HuBA-1-3D抗體投予組而言，即便投藥結束後，亦持續較強的抗腫瘤活性(圖1A)。

將各個體的腫瘤體積的推移示於圖1B。投藥期間中，樂伐替尼投予組、HuBA-1-3D抗體投予組相比於對照組而言，腫瘤體積的增加受到抑制，但投予期結束後，在樂伐替尼投予組及HuBA-1-3D抗體投予組中，幾乎在所有個體中皆可看出腫瘤體積的增加。相對於此，在樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組中，即便投藥期結束後，幾乎在所有個體中，腫瘤體積的增加亦受到抑制。

將在觀察結束日(Day38)所採取之腫瘤的重量及照片示於圖1C。腫瘤重量係樂伐替尼投予組(N＝7)為841.1±515.8mg，HuBA-1-3D抗體投予組(N＝8)為392.3±412.9mg，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組(N＝8)成為22.9±40.5mg，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組相比於樂伐替尼投予組或HuBA-1-3D抗體投予組而言，腫瘤重量顯著地較小。此外，與樂伐替尼投予組或HuBA-1-3D抗體投予組相比，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組的腫瘤較小，在半數的個體中，確認到腫瘤的消失。 [實施例2]

使用HepG2異種移植模型，檢討樂伐替尼甲磺酸鹽及抗hDLK-1抗體在腫瘤形成阻礙活性中之併用效果。在此處，樂伐替尼甲磺酸鹽係使用市售者(以下，在本實施例中，僅稱為「樂伐替尼」。)。本實施例中所使用之抗hDLK-1抗體為WO2014/054820公報所記載之「HuBA-1-3D-1-A24G/T73K抗體」(以下，在本實施例中，僅稱為「HuBA-1-3D抗體」。)，編碼出該抗體蛋白質之DNA的構築係依照同公報(說明書中之實施例)所記載之方法，然後，針對經由宿主細胞之該抗體蛋白質的產生/調製，係使用GlymaxX(註冊商標)技術(ProBioGen AG；參照https://www.probiogen.de/genetic-glyco-engineering-adcc-glymaxx.html)來施行。另外，本實施例中所使用之HuBA-1-3D-1-A24G/T73K抗體為H鏈V區域含有序列編號36所示之胺基酸，且L鏈V區域含有序列編號46所示之胺基酸者。

將5×10⁶ 個HepG2細胞移植至7週齡雌性NOD/ShiJic-scidJcl小鼠的右側腹皮下(Day 0)，在平均腫瘤體積達到100mm³ 左右之階段(Day 10)，施行分組成對照組(N＝8，118.4±15.6mm³ )、樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組(N＝8，118.8±15.2mm³ )、HuBA-1-3D抗體(1mg/kg體重)投予組(N＝8，119.8±12.9mm³ )、樂伐替尼(10mg/kg體重)及HuBA-1-3D抗體(1mg/kg體重)之併用投予組(N＝8，119.7±13.4mm³ )(以下，樂伐替尼＋HuBA-1-3D抗體投予組)，自同日起12日，HuBA-1-3D抗體係以每週2次的進度(共計4次；Day 10、13、17、21)，樂伐替尼係以每週5次(投予5日，休藥2日)的進度(共計10次；Day 10、11、12、13、14、17、18、19、20、21)，施行投藥。以每週2次的頻率施行腫瘤體積的計測，達到1500mm³ 之個體係視為觀察結束。

其結果，在癌細胞移植起第21日(投藥結束日，Day 21)之腫瘤體積，對照組為596.1±201.6mm³ (N＝8)，相對於此，樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組成為326.2±188.7mm³ (N＝8)，HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組成為116.4±42.4mm³ (N＝8)，樂伐替尼(10mg/kg體重)＋HuBA-1-3D(1mg/kg)抗體投予組成為110.6±33.3mm³ (N＝8)，所有投予組相比於對照組而言皆確認到較強的抗腫瘤活性。再者，對投藥結束後之藥效進行檢討，結果在癌細胞移植起第31日(投藥結束後10日，Day 31)，對照組為1427.7±591.7mm³ (N＝8)，樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組為817.4±583.4mm³ (N＝8)，HuBA-1-3D(1mg/kg)抗體投予組為394.0±169.8mm³ (N＝8)，相對於此，在樂伐替尼(10mg/kg體重)＋HuBA-1-3D抗體(1mg/kg)投予組中則成為240.8±90.7mm³ (N＝8)。在樂伐替尼(10mg/kg體重)及HuBA-1-3D(1mg/kg)之併用投予組中，相比於HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組、樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組而言，腫瘤體積顯著地較小，確認到併用投予所引發之抗腫瘤效果的增強(圖2A)。在Day 31之時點，在對照組中，針對8個體中之腫瘤體積超過1500mm³ 之4個體進行犧牲，在樂伐替尼投予組中，針對8個體中之腫瘤體積超過1500mm³ 之1個體進行犧牲。在Day 31之時點，針對已觀察併用效果之樂伐替尼(10mg/kg體重)＋HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組，以及樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組、HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組，進行觀察至Day 34(投藥結束後13日)，結果樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組(N＝7)的腫瘤體積為796.2±461.7mm³ ，HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組(N＝8)為584.1±241.9mm³ ，相對於此，在樂伐替尼(10mg/kg體重)＋HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組(N＝8)中則為358.0±168.1mm³ ，在樂伐替尼(10mg/kg體重)及HuBA-1-3D(1mg/kg)之併用投予組中，相比於HuBA-1-3D(1mg/kg)投予組、樂伐替尼(10mg/kg體重)投予組而言，腫瘤體積顯著地較小，確認到併用投予所引發之抗腫瘤效果的增強(圖2B)。

[參考例1] 針對源自人類肝細胞癌之2種細胞株(Hep3B及HepG2)，以異種移植治療模型比較對樂伐替尼甲磺酸鹽(市售品；以下，在本實施例中，僅稱為「樂伐替尼」。)之感受性。在Hep3B異種移植模型中，將細胞移植至NOD/SCID小鼠皮下，在平均的腫瘤體積超過100mm³ 之時點(Day 14)，施行分組成1組8隻，自同日起開始進行投予。投予係以每小鼠體重10μL/g使用經口餵食管進行經口投予，以每週5次(投予5日，休藥2日)的進度(共計12次；Day 14、15、16、17、18、21、22、23、24、25、28、29)，實施至試驗最終日。在移植起第29日(Day 29；試驗最終日)之腫瘤體積(平均值±標準偏差)，媒劑(vehicle)(注射用水)投予組為1050.3±553.8mm³ (N＝8)，樂伐替尼(3mg/kg)投予組為400.9±160.9mm³ (N＝8)，樂伐替尼(10mg/kg)投予組為200.2±133.3mm³ (N＝8)，樂伐替尼(30mg/kg)投予組為136.2±33.8mm³ (N＝8)。以媒劑組作為基準，在Day 29之腫瘤體積的比率(T/C)，在樂伐替尼投予組(3、10、30mg/kg投予組)中分別依序為38.2%(P＜0.05)、19.1%(P＜0.05)、13.0%(P＜0.05)(圖3A)。

另一方面，已判明在HepG2異種移植模型中，對樂伐替尼之感受性相比於Hep3B模型而言係較低。將細胞移植至NOD/SCID小鼠皮下，在平均的腫瘤體積超過100mm³ 之時點(Day 10)，施行分組成1組8隻，自同日起開始進行投予。投予係以每小鼠體重10μL/g使用經口餵食管進行經口投予，以每週5次(投予5日，休藥2日)的進度(共計14次；Day 10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、24、25、26、27)，實施至試驗最終日之前日。在移植起第28日(Day 28；試驗最終日)之腫瘤體積(平均值±標準偏差)，媒劑(注射用水)投予組為1163.0±205.1mm³ (N＝8)，樂伐替尼(3mg/kg)投予組為892.5±220.7mm³ (N＝8)，樂伐替尼(10mg/kg)投予組為506.8±215.7mm³ (N＝8)，樂伐替尼(30mg/kg)投予組為380.0±146.8mm³ (N＝8)。以媒劑組作為基準，在Day 28之腫瘤體積的比率(T/C)，在樂伐替尼投予組(3、10、30mg/kg投予組)中分別依序為76.7%(P＜0.05)、43.6%(P＜0.05)、32.7%(P＜0.05)(圖3B)。 [產業上之可利用性]

本發明所涉及之治療藥及治療方法等係關於肝細胞癌的治療，可發揮相較於既存的多重激酶阻礙劑而言更強力且持續的抗腫瘤效果，在例如即便對迄今為止無法期待治療效果之患者亦可發揮效果之方面而言係極為有用。 [序列表自由正文]

序列編號23：重組DNA 序列編號24：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號25：重組DNA 序列編號26：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號27：重組DNA 序列編號28：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號29：重組DNA 序列編號30：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號31：重組DNA 序列編號32：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號33：重組DNA 序列編號34：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號35：重組DNA 序列編號36：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號37：重組DNA 序列編號38：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號39：重組DNA 序列編號40：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號41：重組DNA 序列編號42：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號43：重組DNA 序列編號44：合成構築體(重組蛋白質) 序列編號45：重組DNA 序列編號46：合成構築體(重組蛋白質)

[圖1A]示出本實施例中之使用Hep3B異種移植模型而得之樂伐替尼及抗hDLK-1抗體(HuBA-1-3D抗體)之併用效果測定試驗之結果之圖。 [圖1B]示出本實施例中之關於使用Hep3B異種移植模型而得之樂伐替尼及抗hDLK-1抗體(HuBA-1-3D抗體)之併用效果測定試驗，各個體的腫瘤體積的增減(移植後38日)之結果之圖。 [圖1C]示出本實施例中之關於使用Hep3B異種移植模型而得之樂伐替尼及抗hDLK-1抗體(HuBA-1-3D抗體)之併用效果測定試驗，在測定試驗結束後所摘出之腫瘤的重量及照片之圖。 [圖2A]示出本實施例中之使用HepG2異種移植模型而得之樂伐替尼及抗hDLK-1抗體(HuBA-1-3D抗體)之併用效果測定試驗之結果之圖。 [圖2B]示出本實施例中之關於使用HepG2異種移植模型而得之樂伐替尼及抗hDLK-1抗體(HuBA-1-3D抗體)之併用效果測定試驗，樂伐替尼投予組、抗hDLK-1抗體投予組、樂伐替尼及抗hDLK-1抗體投予組的腫瘤移植後第34日之腫瘤體積之圖。 [圖3]示出使用Hep3B異種移植模型及HepG2異種移植模型而得之Hep3B及HepG2對樂伐替尼之感受性之結果之圖。A表示使用Hep3B異種移植模型而得之結果，B表示使用HepG2異種移植模型而得之結果。

國外寄存資訊 1.日本; NITE-IPOD ; 2006/10/18 ; FERM BP-10707 2.日本; NITE-IPOD ; 2007/08/21 ; FERM BP-10899 3.日本; NITE-IPOD ; 2007/08/21 ; FERM BP-10900 4.日本; NITE-IPOD ; 2011/02/01 ; FERM BP-11337

Claims

一種用於治療肝細胞癌之組合醫藥，前述組合醫藥包含樂伐替尼(lenvatinib)或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內(in vivo)具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段，前述抗體為H鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號9~11所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體，前述抗體片段為包含序列編號9~11所示之胺基酸序列與序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體片段。
如請求項1之組合醫藥，其中，前述腫瘤為肝細胞癌。
如請求項1或2之組合醫藥，其中，前述抗體為嵌合抗體或人類化抗體。
如請求項1或2之組合醫藥，其中，前述抗體為H鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號36所示之胺基酸序列，且L鏈V區域的胺基酸序列含有序列編號46所示之胺基酸序列之抗體，前述抗體片段為包含序列編號36所示之胺基酸序列與序列編號46所示之胺基酸序列之抗體片段。
如請求項1或2之組合醫藥，其中，前述抗體或抗體片段呈與具有抗腫瘤活性及/或殺細胞活性之化合物之複合體的形態。
如請求項1或2之組合醫藥，其中，即便在前述組合醫藥的投藥結束後，亦可抑制癌細胞的增殖或可使腫瘤縮小或消失。
一種用於製造肝細胞癌的治療用藥劑之組合醫藥的用途，該組合醫藥包含：樂伐替尼或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段，前述抗體為H鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號9~11所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體，前述抗體片段為包含序列編號9~11所示之胺基酸序列與序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體片段。
一種用於治療肝細胞癌之套組，其包含樂伐替尼或該等之藥理學上可容許的鹽，或者該等之水合物或溶劑合物，以及在活體內具有抗腫瘤活性之抗人類DLK-1之抗體或源自於該抗體之抗體片段，前述抗體為H鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號9~11所示之胺基酸序列，且L鏈V區域之CDR1~3的胺基酸序列分別依序為序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體，前述抗體片段為包含序列編號9~11所示之胺基酸序列與序列編號12~14所示之胺基酸序列之抗體片段。