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TW201813671A - 抗ｃ－Ｍｅｔ抗體－細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途 - Google Patents

抗ｃ－Ｍｅｔ抗體－細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途 Download PDF

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TW201813671A
TW201813671A TW106135073A TW106135073A TW201813671A TW 201813671 A TW201813671 A TW 201813671A TW 106135073 A TW106135073 A TW 106135073A TW 106135073 A TW106135073 A TW 106135073A TW 201813671 A TW201813671 A TW 201813671A
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TW
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antibody
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TW106135073A
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孫星
曹國慶
唐蜜
蔣家驊
楊昌永
張連山
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蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司
江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
上海恆瑞醫藥有限公司
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Abstract

本發明涉及抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途。具體地，本發明涉及一種抗c-Met抗體，c-Met的抗原結合片段，包含該抗c-Met抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，及其抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物，以及包含人源化抗c-Met抗體和抗原結合片段及其抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物的醫藥組成物作為抗肝癌藥物的用途。

Description

抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途
本發明涉及一種抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物在製備治療肝癌的藥物中的用途。
近年來分子生物學和腫瘤藥理學研究表明，酪胺酸激酶(Protein Tyrosine Kinases,PTKs)相關的細胞信號轉導通路在腫瘤的形成和發展中發揮了極其重要的作用，超過50%的原癌基因和癌基因產物都具有酪胺酸激酶活性。c-Met原癌基因屬於PTKs家族中Ron亞族，其編碼的c-Met蛋白是肝細胞生長因子/離散因子(Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor,HGF/SF)的高親和性受體。HGF/c-Met信號通路與血管新生和腫瘤生長過程密切相關，其持續啟動是組織細胞癌變或癌細胞增殖亢進的重要原因，抑制該通路已成為腫瘤靶向治療的新手段。
c-Met原癌基因位於人類第7號染色體長臂(7q31)，大小超過120kb，編碼分子量約150kD的c-Met蛋白前體，經局部糖基化生成一個170kD的糖蛋白，該糖蛋白進一步剪 切為亞基(50kDa)和亞基(140kDa)，以二硫鍵相連，形成成熟的c-Met蛋白受體。該異二聚體包含兩條鏈，鏈有胞外區、跨膜區(也稱膜伸展片段)和胞內區(包含細胞內酪胺酸激酶結合位點)。鏈只有胞外部分，但它是高度糖基化，藉由二硫鍵附著於鏈上。兩個亞基的胞外區域是相應配體的識別部位，胞內區域具有酪胺酸激酶活性。
c-Met啟動的機制分為三種：一是依賴HGF的啟動機制，二是不依賴HGF啟動機制，三是經過其他膜途徑，例如藉由透明質酸膜表面受體的CD44、粘附素以及RON信號傳導途徑等等。其中最常見的是依賴HGF的啟動機制。HGF的N末端與c-Met結合，促進鏈上Tyr1234和Tyr1235二聚化和自磷酸化，C-末端附近的Tyr1349和Tyr1356磷酸化產生多個接頭蛋白的結合位點，這些接頭蛋白誘導了P13K/Akt、Ras/Mapk、c-Src和STAT3/5介導的下游信號的啟動，引發不同細胞反應，如細胞生存和活動(與P13K/Akt通路密切相關)，腫瘤轉移和細胞增殖(主要由Ras/Mapk介導)。此外，c-Met與其它膜受體存在交聯(cross-talk)，現已確知這種交聯可促進腫瘤形成及轉移，由於c-Met是導致腫瘤形成及轉移的許多通路的交叉點，以c-Met為靶標可相對較容易地實現對許多通路的同時干擾，c-Met成為抗腫瘤生成和轉移治療的一個有希望的靶點。
抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對腫瘤細胞特異或 高表達抗原結合的特異性和細胞毒素的高效性，避免對正常細胞的毒副作用。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體藥物偶聯物能精准地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。
ADC藥物由抗體(靶向)、接頭和毒素三部分組成。其中，好的靶點(抗體部分)決定了ADC藥物的特異性，這不僅包括特異靶向結合，還包括有效的內吞。
目前針對c-Met激酶靶點抑制劑主要有三類：HGF和c-Met生物拮抗劑、HGF和c-Met抗體，以及小分子c-Met抑制劑。現有的臨床結果表明，直接針對HGF和c-Met的抗體，或c-Met小分子抑制療效不甚理想。針對c-Met的ADC藥物可能是該靶點最有效的方法治療腫瘤。目前，尚沒有c-Met ADC藥物臨床研究。
本申請人的PCT/CN2016/078699記載了一類c-Met ADC藥物，並預期其可能用於癌症的治療，但未提到其能否用於肝癌。
本發明要解決的技術問題是一種抗體-細胞毒性藥物偶聯物(ADC)或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物在製備治療肝癌藥物中的用途，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物(ADC)作為單一組分具有顯著的抗腫瘤活性、有效抑制肝癌細胞的增殖作用，可更好地應用於臨床。
本發明的技術方案如下：本發明提供一種抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其藥學 上可接受的鹽或溶劑化合物在製備治療肝癌藥物中的用途，其中，所述抗體-細胞毒性藥物偶聯物具有式(I)所示結構：Ab-[(L2)t-L1-D)]y (I)
其中：D為細胞毒性藥物；L1，L2是接頭單員；t為0或1，較佳為1；y為1-8，較佳為2至5；Ab為特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含至少1個選自以下的CDR區序列或其突變序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
較佳的，其中該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如下的HCDR區序列或其突變序列：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
較佳的，其中該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如下的LCDR區序列或其突變序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或其突變序列，和輕鏈可變區序列SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10 和SEQ ID NO：11或其突變序列。
所述的突變序列為CDR區發生1至3個優化抗體活性的胺基酸突變，其中HCDR2區突變序列較佳為SEQ ID NO：12。
該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
該鼠源抗體重鏈可變區序列為：SEQ ID NO：4。
該鼠源抗體輕鏈可變區序列為：SEQ ID NO：5。
在本發明較佳的實施方案中，該鼠源抗體的重鏈可變區為：SEQ ID NO：4，輕鏈可變區為：SEQ ID NO：5。
在本發明較佳的實施方案中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體或人源化抗體或其片段。
所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈序列，較佳為人種系重鏈IGHV 3-33*01；其中該重鏈FR區序列包含人種系重鏈IGHV 3-33*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列或其突變序列，較佳該突變序列為0-10個胺基酸的回復突變。
該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：13-15所示的重鏈可變區序列或其變體。
該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，選自人種系輕鏈序列，較佳為人種系輕鏈IGKV085或IGKV 4-1*01，其中該輕鏈FR區序列包含人種系輕鏈IGKV085和IGKV 4-1*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列 或其突變序列，較佳為突變序列為0-10個胺基酸的回復突變。
在本發明較佳的實施方案中，該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：16-18所示的輕鏈可變區序列或其變體。
在本發明較佳的實施方案中，該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：13-15的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：16-18的輕鏈可變區序列。
在本發明較佳的實施方案中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自a)至c)任一的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的組合：a)SEQ ID NO：13的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：16的輕鏈可變區序列；b)SEQ ID NO：14的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區序列；或c)SEQ ID NO：15的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：18的輕鏈可變區序列。
在本發明較佳的實施方案中，該人源化抗體的重鏈恒定區包含源自人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區，較佳包含人源IgG1或其變體或人源IgG2或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區，更佳為人源IgG2或其變體的恒定區。
在本發明較佳的實施方案中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：23-25或與其具有至少90%同源性的全長重鏈序列。
在本發明較佳的實施方案中，該人源化抗體的輕鏈恒定區包含選自人源κ或λ鏈或其變體的恒定區。
該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：26-28或與其具有至少90%序列同源性的全長輕鏈序列。
該人源化抗體包含選自以下全長輕鏈序列和全長重鏈序列的組合：Ab-9：SEQ ID NO：23的重鏈序列和SEQ ID NO：26的輕鏈序列；Ab-10：SEQ ID NO：24的重鏈序列和SEQ ID NO：27的輕鏈序列；或Ab-11：SEQ ID NO：25的重鏈序列和SEQ ID NO：28的輕鏈序列。
本發明進一步提供一種醫藥組成物在製備治療肝癌藥物中的用途，其包含含有如上所述的c-Met抗體或其抗原結合片段，和一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
在本發明較佳的實施方案中，其中，該-L2-為以下通式(-L2-)所示的化合物： 其中X1選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、C1-6烷基、C1-6 烷氧基或3-8員環烷基；X2選自C1-6烷基、3-8員環烷基或3-8員雜環基；m為0-5，較佳為1-3；S為硫原子。
較佳的，該藥物模組D選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素或核溶酶的細胞毒劑。
在本發明較佳的實施方案中，該D為以下通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或3-8員環烷基；R8、R9、R10、R11選自氫原子、鹵素、C2-6烯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或3-8員環烷基，較佳為至少其中一個基團選自鹵素、C2-6烯基、C1-6烷基或3-8員環烷基，其餘為氫原子；或者R8、R9、R10、R11之中的任意兩個形成3-8員環烷基，餘下的兩個基團選自氫原子、C1-6烷基或3-8員環烷基；R12、R13選自氫原子、C1-6烷基或鹵素；R14選自視需要被取代基取代的6-14員芳基或5-15員雜芳基，該取代基選自氫原子、鹵素、羥基、C1-6烷基、 C1-6烷氧基或3-8員環烷基；R15視需要選自鹵素、C2-6烯基、C1-6烷基、3-8員環烷基、羧基、C1-6烷基羰基或C1-6烷氧基羰基；R16選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、C1-6烷氧基或3-8員環烷基。
較佳的，該L2包含選自Val-Cit，MC，PAB和MC-PAB的接頭，較佳為MC。
特別佳的，該D是美登木素生物鹼；較佳為DM1、DM3和DM4，更佳為DM1。
較佳的，該L2選自N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯(SMCC)或N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)；較佳為N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯或N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯。
進一步較佳的，該D是喜樹鹼類生物鹼，該喜樹鹼類生物鹼選自CPT、10-羥基-CPT、伊立替康、SN-38或托泊替康，更佳為SN-38。
特別較佳的，該接頭L2選自Val-Cit，MC，PAB或MC-PAB，較佳為MC或MC-vc-PAB。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(II)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中：R2-R16如通式(D)中所定義；Ab，t，y，L1，L2如通式(I)中所定義。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(III)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中：R2-R16如通式(D)中所定義；Ab，y，如通式(I)中所定義；n為3至6，較佳為5。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(IV)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中：R2-R16如通式(D)中所定義；Ab，y如通式(I)中所定義；n如通式(III)中所定義；X1，X2，m如通式L2中所定義。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(V)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物：
其中：Ab，D，y如通式(I)中所定義；n如通式(III)中所定義；X1，X2，m如通式L2中所定義。
在本發明較佳的實施方案中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物選自：
Ab-9，Ab-10，Ab-11為如上所述的c-Met抗體，y為1至8，較佳為2至5。
其中，y的範圍為1至8；較佳為1至4。
在本發明較佳的實施方案中，該肝癌的癌細胞對c-Met表達量為陽性或高表達，較佳為20%的肝癌細胞呈陽性/弱陽性，進一步較佳為25%的肝癌細胞呈陽性，更佳為為50%的肝癌細胞呈強陽性。
發明詳述
一、術語
在本申請的說明書和申請專利範圍中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。然而，為了更好地理解本發明，下面提供了部分相關術語的定義和解釋。另外，當本申請所提供的術語的定義和解釋與本領域技術人員所通常理解的含義不一致時，以本申請所提供的術語的定義和解釋為准。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol. chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“c-Met”或“c-Met多肽”或“c-Met受體”是指結合肝細胞生長因子(HGF)的受體酪胺酸激酶。本發明中如非特指，比如鼠c-Met(m-c-Met)或猴c-Met(cyno-c-Met)，均指人的c-Met(h-c-Met)。本發明中所用的人、鼠、食蟹猴c-Met均藉由GenBank提供的核苷酸序列或多肽序列進行編碼，例如GenBank登錄號NM_000245中提供的核苷酸序列編碼的人多肽，或由GenBank登錄號NP_000236中提供的多肽序列編碼的人蛋白質或其細胞外結構域。原始的單鏈前體蛋白質在翻譯後被剪切以產生α和β亞基，其藉由二硫鍵連接以形成成熟受體。受體酪胺酸激酶c-Met參與細胞過程包括，例如伴隨胚胎發生的組織再生的遷移、侵入和形態發生的過程。
術語“c-Met相關病症或狀況”指任何源自c-Met的不利表達或缺乏表達，不利調控或缺乏調控，或有害活性或缺乏活性，或可以藉由調節c-Met表達或活性來進行調節、治療或治癒的疾病、病症或狀況。例如在大部分癌症患者中，或在其疾病確實由與c-Met途徑相關的變化驅動的患者中，可以預期HGF/c-Met途徑的啟動。例如上調歸因於不同的機制，像HGF和/或c-Met的過表達，或藉由c-Met突變的組成型啟動。c-Met相關病症或狀況包括但不限於，例如增生性疾病和紊亂和炎性疾病和紊亂。增生性疾病包括但不限於，例如癌症，其包括例如，胃癌、食道癌、乳腺癌、腎癌包括乳突狀腎細胞癌、肺癌、神經膠質 瘤、頭頸癌、上皮癌、皮膚癌、白血病、淋巴癌，骨髓瘤、腦癌、胰腺癌，結直腸癌、胃腸癌、腸癌、生殖器癌症、泌尿器癌症、黑色素瘤、前列腺癌以及本領域技術人員已知的其他腫瘤。炎性疾病包括但不限於，例如細菌感染，包括李斯特菌屬細菌引起的感染。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈，δ鏈，γ鏈，α鏈，ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和 HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能用小鼠製備的抗人c-Met的單株抗體。製備時用c-Met抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源c-Met抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，或進一步包含鼠源IgG1,IgG2,IgG3或IgG4或其變體的重鏈恒定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再選殖到人抗體的恒定區基因，進行重組表達。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)人源化，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變 區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列資料庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本發明一個較佳的實施方案中，該c-Met人源化抗體小鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：6，7，8，9，10，11(please check the #s,in case just copy from sost draft)。人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中所述抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，選自人種系輕鏈序列，較佳為人種系輕鏈IGKV085或IGKV 4-1*01，包含人種系輕鏈IGKV085和IGKV 4-1*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區；其中所述抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈序列，較佳為人種系重鏈IGHV 3-33*01；包含人種系重鏈IGHV 3-33*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
本領域中有可獲得的多種方法來產生人源化抗體。例如，可藉由獲得抗c-Met特異抗體(例如，鼠類抗體或由融合瘤產生的抗體)HCVR和LCVR序列，將其移植到所選的人抗體框架編碼序列上來產生人源化抗體。視需要地，可藉由隨機誘變或在特定位置誘變來優化CDR區，以在將CDR區移植到框架區中之前用不同的胺基酸置換CDR中的一個或更多個胺基酸。或者，可使用本領域技術人員可獲得的方法在將CDR區插入人框架區後對其進行優化。較佳地，“人源化抗體”具有起源於或來自親本抗體(即非人抗 體，較佳為小鼠單株抗體)的CDR，而在其存在的程度上框架區和恒定區(或其主要部分或基本部分，即至少約90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同人類種系免疫球蛋白區(參見，例如the，International，ImMunoGeneTics，Database)或其重組或突變形式中，無論該抗體是否在人類細胞中產生。較佳地，從人源化抗體來源的非人親本抗體的CDR優化人源化抗體的至少2、3、4、5或6個CDR，以產生期望的性質，例如改善的特異性、親和力或中和作用，其可以藉由篩選測定，例如ELISA測定來進行鑒定。較佳為地，本發明抗體中優化的CDR當與親本抗體中存在的CDR相比時，包含至少一個胺基酸置換。與親本抗體的CDRs相比，本發明人源化抗體的CDR中某些胺基酸置換(參見本文的實施例6)降低了抗體不穩定性的可能性(例如除去CDR中Asn殘基)或當對人受試者施用時降低了抗體的免疫原性(例如，由IMMUNOFILTERTM，Technology預測的)。
在CDR編碼序列移植到所選人框架編碼序列上之後，然後表達編碼人源化可變重鏈和可變輕鏈序列的所得DNA序列，以產生結合c-Met的人源化抗體。可將人源化HCVR和LCVR表達為整個抗硬骨素抗體分子的部分，即表達為與人恒定域序列的融合蛋白。然而，HCVR和LCVR序列也可在不存在恒定序列的情況下進行表達，以產生人源化抗c-Met scFv。
進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文 獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。
本發明中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及與人c-Met結合的Fv片段scFv片段；包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：8中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恒定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(scFv)。scFv還可以和其他抗體，例如抗EGFR抗體構建雙特異抗體(bispecific antibody)本發明的術語“與c-Met結合”，指能與人c-Met相互作用。本發明的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恒定區進行突變，如選自IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4chimera，IgG4的 F235E，或L234A/E235A突變。
本發明中所述的融合蛋白是一種藉由DNA重組，得到的兩個基因共表達的蛋白產物。重組c-Met胞外區Fc融合蛋白藉由DNA重組，把c-Met胞外區和人抗體Fc片段共表達的融合蛋白。該c-Met胞外區，是指c-Met蛋白表達在細胞膜以外的部分。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈(SEQ ID NO：4)和輕鏈(SEQ ID NO：5)的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體pEE6.4((Lonza Biologics)。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人c-Met特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行過管柱。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體或mAb，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗 原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其他現有技術進行重組得到。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其他專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、 依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其他胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由……組成”或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且視需要包括與該元件類似或不同性質的其他元件，所述其他元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。作為非限制性例子，基本上由所提及的胺基酸序列組成的結合化合物還可以包括一種或多種胺基酸，其不顯著影響結合化合物的性質。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副 作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源懷百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本發明的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。
術語“可藥用鹽”是指本發明配體-細胞毒性藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本發明抗體-抗體藥物偶聯化合物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，包括與無機酸或有機酸(例如羧酸等)形成的鹽。。
術語“溶劑化合物”指本發明的配體-藥物偶聯化合物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑化合物。
術語“配體”是能識別和結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。配體的作用是將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，這些配體包括但不限於蛋白類激 素、凝集素、生長因子、抗體或其他能與細胞結合的分子。
治療劑是與結合部分如抗體或抗體片段、或其亞片段分別、同時或相繼地給藥的分子或原子，並且可用於疾病的治療。治療劑的實例包括但不限於抗體、抗體片段、共軛物、藥物、細胞毒性劑、促細胞凋亡劑、毒素、核酸酶(包括DNA酶和RNA酶)、激素、免疫調節劑、螯合劑、硼化合物、光敏劑或染料、放射性同位素或放射性核素、寡核苷酸、干擾RNA、肽、抗血管發生劑、化療劑、細胞因子、趨化因子、前藥、酶、結合蛋白或肽、或其組合。
偶聯物是與如上該治療劑偶聯的抗體組分或其他靶向部分。本文所用的術語“偶聯物”和“免疫偶聯物”可交換地使用。
術語“細胞毒劑”在用於本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“毒素”指能夠對細胞的生長或增殖產生有害效果的任何物質。
“化療劑”指可用於治療癌症的化學化合物。該定義還包括起調節、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的抗激素劑，且常常是系統或全身治療的形式。它們自身可以是激素。
澳瑞他汀是全合成藥物，化學結構式相對容易改造，以便優化其物理性質和成藥特性。用於和抗體偶聯的澳瑞他汀衍生物主要包括單甲基澳瑞他汀E(MMAE)和單甲基澳瑞他汀F(MMAF)，前者是由天然微管蛋白聚合酶抑制劑 尾海兔素-10(dolastatin-10)衍生出的合成五肽，在C-端加上一個2-胺基-1-苯基丙基-1-醇而合成。MMAE對多種人類腫瘤細胞株的抑制活性小於一奈莫耳。為了降低MMAE自身細胞毒活性，MMAF在尾海兔素-10的C-端加上一個苯丙胺酸，因為在結構上引入一個羧基，MMAF的細胞膜通過性較差，因此對細胞的生物活性顯著降低，但是和抗體偶聯後對細胞的抑制活性大幅度提高(US7750116)。
術語“微管蛋白抑制劑”是指藉由抑制微管蛋白的聚合或促進微管蛋白的聚合而幹擾細胞的有絲分裂過程，從而發揮抗腫瘤作用的一類化合物。其非限制性實例包括：美登素類、卡利奇黴素、紫杉烷類、長春新鹼、秋水仙鹼、尾海兔素/澳瑞他汀，較佳為選自自美登素類或尾海兔素/澳瑞他汀；更佳選自通式D1或DM所示的化合物。
CPT是喜樹鹼的縮寫，並且在本申請中CPT用於表示喜樹鹼本身或喜樹鹼的類似物或衍生物。具有所示的編號和用字母A-E標記的環的喜樹鹼和一些其類似物的結構在以下式提供。
CPT：R1=R2=R3=H
10-羥基-CPT：R1=OH；R2=R3=H
伊立替康：；R2=乙基；R3=H
SN-38：R1=OH；R2=乙基；R3=H
托泊替康：R1=OH；R2=H；R3=CH-N(CH3)2
術語“胞內代謝物”指由細胞內對抗體-藥物偶聯物(ADC)的代謝過程或反應產生的化合物。該代謝過程或反應可以是酶促過程，諸如ADC的肽接頭的蛋白水解切割、或官能團諸如腙、酯或醯胺的水解。胞內代謝物包括但不限於在進入、擴散、攝取或轉運進入細胞後經歷胞內切割的抗體和遊離藥物。
術語“胞內切割的”和“胞內切割”指細胞內對抗體-藥物偶聯物(ADC)的代謝過程或反應，由此藥物模組(D)與抗體(Ab)之間的共價附著，即接頭被打斷，導致細胞內遊離藥物與抗體解離。ADC被切割的模組因而是胞內代謝物。
術語“生物利用度”指施用於患者的給定量的藥物的系統利用度(即血液/血漿水準)。生物利用度是表明藥物從所施用的劑量形式到達大循環的時間(速率)和總量(程度)二者度量的絕對項。
術語“細胞毒活性”指抗體-藥物偶聯物或抗體-藥物偶聯物的胞內代謝物的細胞殺傷、細胞抑制、或生長抑制效果。細胞毒活性可以表述為IC50值，即半數細胞存活時每單位體積的濃度(莫耳或品質)。
本發明所述“C1-6烷基”表示直鏈或支鏈的含有1-6 個碳原子的烷基，包括例如“C1-4烷基”、“C1-3烷基”等，具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、異己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。
本發明所述的“C2-6烯基”是指含有至少一個雙鍵且碳原子數為2-6的直鏈、支鏈或環狀的烯基，包括例如“C2-4烯基”等。其實例包括但不限於：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基、環戊烯基、1,3-環戊二烯基、環己烯基、1,4-環己二烯基等。
本發明所述的“3-8員環烷基”是指含有3-8個碳原子的飽和的環狀烷基，包括例如“3-6員環烷基”、“5-6員環烷基”等。具體實例包括但不限於：環丙烷基、環丁烷基、環戊烷基、環己烷基、環庚烷基、環辛烷基等。“5-6員環烷基”是指含有5-6個碳原子的飽和的環狀烷基。
本發明所述的“C1-6烷氧基”是指以C1-6烷基-O-方式連接的基團，其中“C1-6烷基”如前文所定義。
術語“鍵”指用“-”表示的共價鍵。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘等。
術語“胺基”指-NH2。
術語“氰基”指-CN。
術語“硝基”指-NO2。
術語“側氧基”指=O。
本發明所述的“3-8員雜環基”是指含有3-8個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環狀基團。視需要地，環狀結構中的環原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧化。較佳為“5-6員雜環基”。具體實例包括但不僅限於：氮雜環丙烷基、2H-氮雜環丙烷基、二氮雜環丙烷基、3H-二氮雜環丙烯基、氮雜環丁烷基、1,4-二氧雜環己烷基、1,3-二氧雜環己烷基、1,3-二氧雜環戊烷基、1,4-二氧雜環己二烯基、四氫呋喃基、二氫吡咯基、吡咯烷基、吡咯烷-2,5-二酮、咪唑烷基、4,5-二氫咪唑基、吡唑烷基、4,5-二氫吡唑基、2,5-二氫噻吩基、四氫噻吩基、4,5-二氫噻唑基、噻唑烷基、哌啶基、四氫吡啶基、哌啶酮基、四氫吡啶酮基、二氫哌啶酮基、哌嗪基、嗎啉基、4,5-二氫噁唑基、4,5-二氫異噁唑基、2,3-二氫異噁唑基、噁唑烷基、2H-1,2-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、4H-1,3-噻嗪基、6H-1,3-噻嗪基、2H-吡喃基、2H-吡喃-2-酮基、3,4-二氫-2H-吡喃基等。該“5-6員雜環基”是指3-8員雜環基中含有5-6個環原子的具體實例。
本發明所述的“6-8員芳基”是指含有6-8個環碳原子的單環芳基，其實例包括但不限於：苯基、環辛四烯基等。
本發明所述的“6-15員稠芳基”是指由兩個或兩個以上環狀結構彼此共用兩個相鄰的原子所形成的、含有6-15個環碳原子的、不飽和的、具有芳香性的環狀基團。具體實例包括但不僅限於：萘基、蒽基、菲基等。該“6-10員稠芳基”是指6-14員稠芳基中環原子個數為6-10個的具體實例。
本發明所述的“5-8員雜芳基”是指含有5-8個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的具有芳香性的環狀基團。視需要地，環狀結構中的環原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧化。較佳為“5-6員雜芳基”。具體實例包括但不僅限於呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、噠嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮雜環庚三烯基、1,3-二氮雜環庚三烯基、氮雜環辛四烯基等。該“5-6員雜芳基”是指5-8員雜芳基中含有5-6個環原子的具體實例。
本發明所述的“碳原子、氮原子或硫原子被側氧基取代”是指形成C=O、N=O、S=O或SO2的結構。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環基團” 意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1至3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由試驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有遊離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
“接頭或接頭單元”指包含使抗體共價附著於藥物模組的共價鍵或原子鏈的化學模組。在各個實施方案中，接頭包括：二價基，諸如亞烴基(alkyldiyl)、亞芳基、亞雜芳基，諸如-(CR2)nO(CR2)n-、烴氧基重複單元(例如聚亞乙基氧基(polyethyleneoxy)、PEG、聚亞甲基氧基(polymethyleneoxy)和烴胺基(例如聚乙烯胺基，JeffamineTM)等模組；及二酸酯和醯胺類，包括琥珀酸酯、琥珀醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己醯胺。
縮寫
接頭組件
MC=6-馬來醯亞胺基己醯基
Val-Cit或“vc”=纈胺酸-瓜胺酸(蛋白酶可切割接頭中的例示二肽)
瓜胺酸=2-胺基-5-脲基戊酸
PAB=對胺基苄氧羰基(“自我犧牲”接頭組件的例示)
Me-Val-Cit=N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(其中接頭肽鍵已經修飾以防止其受到組織蛋白酶B的切割)
MC(PEG)6-OH=馬來醯亞胺基己醯基-聚乙二醇(可附著於抗體半胱胺酸)
SPP=N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯
SPDP=N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯
SMCC=琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯
IT=亞胺基硫烷
細胞毒性藥物：
MMAE=單甲基澳瑞他汀E(MW 718)
MMAF=澳瑞他汀E(MMAE)的變體，其在藥物的C-末端處有苯丙胺酸(MW731.5)
MMAF-DMAEA=有DMAEA(二甲基胺基乙胺)以醯胺連接至C-末端苯丙胺酸的MMAF(MW 801.5)
MMAF-TEG=有四乙二醇酯化至苯丙胺酸的MMAF
MMAF-NtBu=N-第三丁基作為醯胺附著於MMAF的C-末端
DM1=N(2’)-脫乙醯基-N(2′)-(3-巰基-1-氧丙基)-美登素
DM3=N(2’)-脫乙醯基-N2-(4-巰基-1-氧戊基)-美登素
DM4=N(2’)-脫乙醯基-N2-(4-巰基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素
本發明還提供了包含偶聯有一種或多種細胞毒劑的 本發明任何抗c-Met抗體或其他具有內吞活性的c-Met抗體(如，LY-2875358)的抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物(可互換的稱為“抗體-藥物偶聯物”或“ADC”)，所述細胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯物)。
在某些實施方案中，抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物包含抗c-Met抗體和化療劑或其他毒素。本文中(上文))描述了可用於生成抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物的化療劑。也可使用酶活性毒素及其片段，這些酶活性毒素及其片段已在說明書中描述。
在某些實施方案中，抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物包含抗c-Met抗體和一種或多種小分子毒素，包括但不限於小分子藥物，諸如喜樹鹼衍生物、加利車黴素(calicheamicin)、美登木素生物鹼(maytansinoids)、朵拉司他汀(dolastatin)、澳瑞他汀、單端孢黴素(trichothecene)和CC1065及這些藥物具有細胞毒活性的片段。
例示性的接頭L2包括6-馬來醯亞胺基己醯基(“MC”)、馬來醯亞胺基丙醯基(“MP”)、纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”)、丙胺酸-苯丙胺酸(“ala-phe”)、對胺基苄氧羰基(“PAB””)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(“SMCC”)、和N-琥珀醯亞胺基(4- 碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(“SIAB”)。本領域知道多種接頭，下文也描述了一些。
接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
在有些實施方案中，接頭構件可以是將抗體連接至另一接頭構件或藥物模組的“延伸物單元”(stretcher unit)。例示性的延伸物單元顯示於下文(其中波形線指示共價附著至抗體的位點)：
在有些實施方案中，接頭單元可以是胺基酸單元。在一個這樣的實施方案中，胺基酸單元容許蛋白酶切割接頭，由此便於在暴露於胞內蛋白酶(諸如溶酶體酶)後從抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物釋放 藥物。參見例如Doronina等(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784。例示性的胺基酸單元包括但不限於二肽、三肽、四肽、和五肽。例示性的二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(VC或val-cit)；丙胺酸-苯丙胺酸(AF或ala-phe)；苯丙胺酸-賴胺酸(FK或phe-lys)；或N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。例示性的三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可以包含天然存在的胺基酸殘基，以及次要胺基酸和非天然存在胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可以在它們對特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D，或血漿蛋白酶)的酶促切割的選擇性方面進行設計和優化。
在有些實施方案中，接頭構件可以是將抗體連接(或是直接的或是藉由延伸物單元和/或胺基酸單元)至藥物模組的“間隔物”單元。間隔物單元可以是“自我犧牲的”(self-immolative)或“非自我犧牲的”。“非自我犧牲的”間隔物單元指間隔物單元的部分或整體在ADC的酶促(蛋白水解)切割後保持結合於藥物模組的間隔物單元。非自我犧牲的間隔物單元的例子包括但不限於甘胺酸間隔物單元和甘胺酸-甘胺酸間隔物單元。還涵蓋對序列特異性酶促切割易感的肽間隔物的其他組合。例如，腫瘤細胞相關蛋白酶對含甘胺酸-甘胺酸間隔物單元的ADC的酶促切割將導致甘胺酸-甘胺酸-藥物模組從ADC的剩餘部分釋放。在一個這樣的實施方案中，甘胺酸-甘胺酸-藥物模組然後在腫瘤細胞中進行分開的水解步驟，如此從藥物模組切割甘胺 酸-甘胺酸間隔物單元。
“自我犧牲的”間隔物單元容許釋放藥物模組而沒有分開的水解步驟。在某些實施方案中，接頭的間隔物單元包含對胺基苄基單元。在一個這樣的實施方案中，將對胺基苯甲醇經醯胺鍵附著至胺基酸單元，並且在苯甲醇與細胞毒劑之間生成胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯、或碳酸酯。參見例如Hamann等(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103。在一個實施方案中，間隔物單元是對胺基苄氧羰基(PAB)。
本發明中的示例性接頭如下：
接頭，包括延伸物、間隔物、和胺基酸單元，可以藉 由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。
例示性的藥物模組：
美登素和美登木素生物鹼。
在有些實施方案中，抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物包含偶聯有一個或多個美登木素生物鹼分子的本發明抗體。美登木素生物鹼是藉由抑制微管蛋白多聚化來發揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國專利No.3,896,111)。隨後發現某些微生物也生成美登木素生物鹼，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利No.4,151,042)。
美登木素生物鹼藥物模組在抗體-藥物偶聯物中是有吸引力的藥物模組，因為它們：(i)相對易於藉由發酵或發酵產物的化學修飾或衍生化來製備；(ii)易於用適於藉由非二硫化物接頭偶聯至抗體的官能團衍生化；(iii)在血漿中穩定；且(iv)有效針對多種腫瘤細胞系。
適於用作美登木素生物鹼藥物模組的美登素化合物是本領域公知的，而且可以依照已知方法從天然來源分離，或是使用遺傳工程技術生產(參見Yu等(2002)PNAS 99：7968-7973)。美登醇和美登醇類似物也可以依照已知方法合成製備。
美登木素生物鹼藥物模組的例示性實施方案包括：DM1；DM3；和DM4，正如本文中所公開的。
在有些實施方案中，抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可 藥用鹽或溶劑化合物包含與朵拉司他汀(dolastatin)或朵拉司他汀肽類似物或衍生物(例如澳瑞他汀)(美國專利No.5,635,483；5,780,588)偶聯的本發明抗體。朵拉司他汀和澳瑞他汀已經顯示出幹擾微管動力學、GTP水解、及核和細胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(美國專利No.5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。朵拉司他汀或澳瑞他汀藥物模組可經由肽藥物模組的N(胺基)末端或C(羧基)末端附著於抗體(WO02/088172)。
例示性的澳瑞他汀實施方案包括N-末端連接的單甲基澳瑞他汀藥物模組DE和DF，披露於Senter等，Proceedings of the American Association for CancerResearch，卷45，摘要號623,2004年3月28日，明確將其公開內容完整收入本文作為參考。肽藥物模組可以選自下文通式DE和DF：
其中DE和DF的波形線指示抗體或抗體-接頭的共價附著位點，且每個位置是獨立的；R2選自H和C1-C8烴基； R3選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環和C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；R4選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環和C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；R5選自H和甲基；或者R4與R5一起形成碳環且具有通式-(CRaRb)n-，其中Ra和Rb獨立地選自H、C1-C8烴基和C3-C8碳環，而n選自2、3、4、5和6；R6選自H和C1-C8烴基；R7選自H、C1-C8烴基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烴基-芳基、C1-C8烴基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環和C1-C8烴基-(C3-C8雜環)；每個R8獨立地選自H、OH、C1-C8烴基、C3-C8碳環和O-(C1-C8烴基)；R9選自H和Cl-C8烴基；R10選自芳基或C3-C8雜環；Z為O、S、NH或NR12，其中R12為C1-C8烴基；R11選自H、C1-C20烴基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14和-(R13O)m-CH(R15)2；m是選自1-1000的整數；R13為C2-C8烴基；R14為H或C1-C8烴基； R15每次出現獨立為H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烴基；R16每次出現獨立為H、C1-C8烴基或-(CH2)n-COOH；R18選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)和-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環)；且n是為選自0到6的整數。
通式DE的一種例示性澳瑞他汀，實施方案是MMAE，其中波形線指示共價附著至抗體-藥物偶聯物的接頭(L)：
通式DF的一種例示性澳瑞他汀，實施方案是MMAF，其中波形線指示共價附著至抗體-藥物偶聯物的接頭(L)(參見US2005/0238649及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)：
其他藥物模組包括選自以下的MMAF衍生物，其中波形線指示共價附著至抗體-藥物偶聯物的接頭(L)：
一方面，可以將親水性基團在R11處附著於藥物模組，該親水性基團包括但不限於三乙二醇酯(triethylene glycol ester,TEG)，如上所述。不限於任何特定理論，該親水性基團有助於藥物模組的內在化和不聚集(non-agglomeration)。包含澳瑞他汀/朵拉司他汀或其衍生物的通式I ADC的例示性實施方案記載於US2005-0238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124，明確收入本文作為參考。包含MMAE或MMAF及各種接頭的通式I ADC的例示性實施方案具有如下結構和縮寫(其中“Ab”是抗體；p是1到約8；“Val-Cit”是纈胺酸-瓜胺酸二肽；而“S”是硫原子)： Ab-接頭1-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-接頭1-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-接頭1-MC-MMAE
Ab-接頭1-MC-MMAF
典型的是，基於肽的藥物模組可藉由在兩個或更多胺基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此類肽鍵可依照例如肽化學領域眾所周知的液相合成法來製備(參見E.Schroder和K.Lübke,“The Peptides”，卷1,pp 76-136,1965,Academic Press)。澳瑞他汀/朵拉司他汀藥物模組可依照以下文獻中的方法來製備)US20050238649A1；美國專利No.5635483；美國專利No.5780588；Pettit等(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等，Synthesis,1996,719-725；Pettit等，(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863，及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
具體而言，通式DF的澳瑞他汀/朵拉司他汀藥物模組 諸如MMAF及其衍生物可以使用US20050238649A1及Doronina等(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124中記載的方法來製備。通式DE的澳瑞他汀/朵拉司他汀藥物模組諸如MMAE及其衍生物可以使用Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784中記載的方法來製備。可以藉由常規方法方便地合成藥物-接頭模組MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF和MC-vc-PAB-MMAE，例如Doronina等(2003)Nat.Biotech.21：778-784及美國專利申請公開號US20050238649A1中所記載的，然後將它們偶聯至感興趣的抗體。
本發明所述的免疫組化IHC(Immunohistochemistry)用於檢測c-Met蛋白過表達中c-Met陽性的腫瘤細胞，表達量體現在癌細胞的染色情況，參照percep test評分或者利用軟體進行灰密度分析。
c-Met表達分為高表達和低表達兩類，3+(50%的腫瘤細胞呈強陽性)，2+(50%腫瘤細胞呈陽性/弱陽性且<50%腫瘤細胞呈強陽性)，1+(50%的腫瘤細胞呈弱陽性且陽性細胞數<50%)，0(無染色或任何強度的腫瘤細胞數均<50%)，2+或3+被定義為高表達。
c-Met陽性標記評分標準如下：(1)依照細胞陽性著色程度(抗原含量)分為弱陽性(+)、計1分，中等陽性(++)、計2分，強陽性(+++)、計3分；(2)依照陽性細胞數量分為弱陽性(+，指陽性細胞總數 在25%以下)，中等陽性(++，指陽性細胞總數在25%-49%)，強陽性(+++，指陽性細胞總數在50%以上)；目前多採用積分綜合計量，計算公式為：(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3，得分值在0-0.3為弱陽性，0.3-1.5為中等陽性，1.5-3為強陽性。
本發明所述的c-Met陽性或高表達為20%的肝癌細胞呈陽性/弱陽性，較佳為25%的肝癌細胞呈陽性，更佳為50%的肝癌細胞呈強陽性。
藥物載荷
藥物載荷(loading)由y表示，即通式I的分子中每個抗體的平均藥物模組數。藥物載荷的範圍可以為每個抗體1-20個藥物模組(D)。通式I的ADC包括偶聯有一定範圍(1-20個)藥物模組的抗體的集合。來自偶聯反應的ADC製備物中每個抗體的平均藥物模組數可以藉由常規手段來表徵，諸如質譜、ELISA測定法、和HPLC。還可以測定ADC在y方面的定量分佈。在有些情況中，將p為某數值的同質ADC從具有其他藥物載荷的ADC中分離、純化、和表徵可以藉由諸如反相HPLC或電泳的手段來實現。
對於有些抗體-藥物偶聯物，y可能受到抗體上附著位元點數目的限制。例如，若附著是半胱胺酸硫醇，正如上文例示性實施方案中的那樣，則抗體可能只有一個或數個半胱胺酸硫醇基，或者可能只有一個或數個有足夠反應性的硫醇基，可附著接頭。在某些實施方案中，較高的藥物載荷，例如y>5，可引起某些抗體-藥物偶聯物的聚集、不 溶性、毒性、或喪失細胞通透性。在某些實施方案中，本發明ADC的藥物載荷的範圍為1到約8；約2到約6；約3到約5；約3到約4；約3.1到約3.9；約3.2到約3.8；約3.2到約3.7；約3.2到約3.6；約3.3到約3.8；或約3.3到約3.7。事實上，對於某些ADC已經顯示了每個抗體藥物模組的最佳比率可以為小於8，可以為約2到約5。參見US20050238649A1(完整收入本文作為參考)。
在某些實施方案中，在偶聯反應中將少於理論最大值的藥物模組偶聯至抗體。抗體可包含例如賴胺酸殘基，其不與藥物-接頭中間物或接頭試劑起反應，如下文所討論的。只有最具反應性的賴胺酸基團可以與胺反應性接頭試劑起反應。一般而言，抗體不包含許多遊離的和反應性的半胱胺酸硫醇基，其可連接藥物模組；事實上，抗體中的大多數半胱胺酸硫醇基以二硫橋形式存在。在某些實施方案中，可以在部分或完全還原性條件下用還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)還原抗體以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施方案中，將抗體置於變性條件以暴露反應性親核基團，諸如賴胺酸或半胱胺酸。
ADC的載荷(藥物/抗體比率DAR)可以以不同方式來控制，例如藉由：(i)限制藥物-接頭中間物或接頭試劑相對於抗體的莫耳過量，(ii)限制偶聯反應的時間或溫度，(iii)半胱胺酸硫醇修飾的部分或限制還原性條件，(iv)藉由重組技術對抗體的胺基酸序列進行工程改造，使得半胱胺酸殘基的數目和位置為了控制接頭-藥物附著的數目和/或位 置而進行改變(諸如如本文中和WO2006/034488(完整收入本文作為參考)中所述而製備的thioMab或thioFab)。
應當理解，若超過一個親核基團與藥物-接頭中間物或者與接頭試劑和接下來的藥物模組試劑起反應，則所得產物是具有一個或多個藥物模組附著於抗體之分佈的ADC化合物混合物。可以藉由對抗體特異性的和對藥物特異性的雙重ELISA抗體測定法自混合物計算每個抗體的平均藥物數。混合物中的各種ADC分子可以藉由質譜來鑒定，並藉由HPLC來分離，例如疏水相互作用層析。在某些實施方案中，可以藉由電泳或層析從偶聯混合物中分離具有單一載荷值的同質ADC。
製備抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物的某些方法
可以採用本領域技術人員知道的有機化學反應、條件和試劑藉由數種路徑來製備通式I的ADC，包括：(1)抗體的親核基團經共價鍵與二價接頭試劑反應形成Ab-L，接著與藥物模組D反應；和(2)藥物模組的親核基團經共價鍵與二價接頭試劑反應形成D-L，接著與抗體的親核基團反應。經後一種路徑製備通式I的ADC的例示性方法記載於US20050238649A1，明確收入本文作為參考。
抗體的親核基團包括但不限於：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如賴胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或胺基。胺、硫醇、和羥基是親核的，能夠與接頭模組上的親電子基團反應而形成共 價鍵，而接頭試劑包括：(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烴基和苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團。某些抗體具有可還原的鏈間二硫化物，即半胱胺酸橋。可藉由還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)處理使抗體完全或部分還原，從而具有與接頭試劑偶聯的反應性。每個半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。或者，可經由賴胺酸殘基的修飾將硫氫基引入抗體，例如藉由使賴胺酸殘基與2-亞胺基硫烷(Traut氏試劑)起反應，導致胺轉變為硫醇。
還可藉由抗體上的親電子基團(諸如醛或酮羰基)與接頭試劑或藥物上的親核基團之間的反應來生成本發明的抗體-藥物偶聯物。接頭試劑上的有用親核基團包括但不限於醯肼(hydrazide)、肟(oxime)、胺基(amino)、肼(hydrazine)、縮胺基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯(hydrazine carboxylate)、和芳基醯肼(arylhydrazide)。在一個實施方案中，可以用例如高碘酸鹽氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物模組的胺基團反應的醛或酮基團。所得亞胺Schiff鹼基可形成穩定的連接，或者可以用例如硼氫化物試劑還原而形成穩定的胺連接。在一個實施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應可以在抗體中生成羰基(醛基和酮基)，它可與藥物上的適宜基團反應(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一個實施方案中，包含N-末端絲胺酸或 蘇胺酸殘基的抗體可以與偏高碘酸鈉反應，導致在第一個胺基酸處生成醛(Geoghegan和Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US5362852)。這樣的醛可與藥物模組或接頭親核體反應。
藥物模組上的親核基團包括但不限於：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、肼羧酸酯、和芳基醯肼基團，它們能夠與接頭模組上的親電子基團反應而形成共價鍵，而接頭試劑包括：(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯、和酸性鹵化物；(ii)烴基和苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基、和馬來醯亞胺基團。
本發明的化合物明確涵蓋但不限於用如下交聯試劑製備的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)它們可藉由商業途徑獲得(例如Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A參見2003-2004年度應用手冊和產品目錄(2003-2004 Applications Handbook and Catalog)第467-498頁)。
還可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來製備包含抗體和細胞毒劑的抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物，諸如N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亞胺基硫烷(IT)，亞胺酸酯(諸如鹽酸 己二醯亞胺酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述製備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苄基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於將放射性核苷酸與抗體偶聯的例示性螯合劑。參見WO94/11026。
或者，可藉由例如重組技術或肽合成來製備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。重組DNA分子可以包含各自編碼偶聯物的抗體和細胞毒部分的區域，彼此或是毗鄰或是由編碼接頭肽的區域分開，該接頭肽不破壞偶聯物的期望特性。
在又一個實施方案中，可以將抗體與“受體”(諸如鏈黴親合素)偶聯從而用於腫瘤預先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯物，接著使用清除劑由迴圈中清除未結合的偶聯物，然後施用與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯的“配體”(例如親合素)。提供以下實施例僅為說明性目的，並不旨在限制本發明的範圍。
與現有技術相比，本發明的技術方案具有以下優點：
(1)本發明抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物(ADC)作 為單一組分對肝癌細胞具有顯著的抑制作用、有效抑制其增殖作用、並且能夠長時間抑制肝癌細胞生長體積大小，而單獨抗體對肝癌細胞的抑制作用較差，二者差異顯著，因而本發明的ADC藥物可以較好地作為醫藥活性成分使用。
(2)經研究表明，本發明抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物(ADC)在動物體內有較好的耐受性，本發明技術方案得到的抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物(ADC)能夠適應於工業化生產。
第1圖為本發明ADC分子在LI-03-0022 HCC PDX腫瘤模型中抑制肝癌細胞的腫瘤體積跟蹤曲線圖，結果表明ADC分子藉由帶入的毒素能達到對腫瘤的完全抑制作用，而抗體單獨無法達到；本發明ADC藥物在荷瘤動物體內有較好的耐受性；數據點代表組平均值、誤差棒代表平均值的標準誤差(SEM)；第2圖為LI-03-0022 HCC PDX腫瘤模型中LI-03-0010(陰性對照)的IHC(免疫組化染色)評分圖；第3圖為LI-03-0022 HCC PDX腫瘤模型中LI-03-0022組織的IHC(免疫組化染色)評分圖；第4圖為本發明ADC分子在LI-03-0240 HCC PDX腫瘤模型中抑制肝癌細胞的腫瘤體積跟蹤曲線圖；第5圖為LI-03-0240 HCC PDX腫瘤模型中LI-03-0010(陰性對照)組織的IHC(免疫組化染色)評分圖； 第6圖為LI-03-0240 HCC PDX腫瘤模型中LI-03-0240組織的IHC(免疫組化染色)評分圖。
以下將結合實施例更詳細地解釋本發明，本發明的實施例僅用於說明本發明的技術方案，並非限定本發明的實質和範圍。
本發明實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例 實施例1、抗原抗體選殖表達
本發明所用抗體(輕、重鏈)，抗原用領域周知的重疊延伸PCR方法構建，將重疊延伸PCR得到的DNA片段用HindIII/BstBI這兩個酶切位點插入到表達載體pEE6.4((Lonza Biologics)，在293F細胞(Invitrogen,Cat# R790-07)中表達得到。所得重組蛋白用於免疫或篩選。c-Met基因模板來源於origene公司(貨號RC217003)。所選殖表達的DNA序列如下：
人c-Met細胞外區域(ECD)和鼠Fc區域融合蛋白(human c-Met ECD-mFc)DNA序列：
(SEQ ID NO：1)
人c-Met細胞外Sema區域和Flag-His標籤(Human c-Met Sema-Flis)DNA序列：
(SEQ ID NO：2)
人c-Met ECD his標籤(Human c-Met ECD-His)重組蛋白DNA序列：
(SEQ ID NO：3)
實施例2、抗原抗體結合實驗(ELISA)
本實驗是利用酶聯免疫吸附的方法檢驗抗c-Met抗體(包括融合瘤上清或重組表達的單株抗體等)在體外對c-Met抗原的親和力。
實驗步驟為：用包被液(PBS)(Hyclone,Cat No.：SH30256.01B)稀釋抗原(human c-Met-His，實施例1)至2μg/mL，加入100μL/孔於96孔酶標板(Costar 9018,Cat No.：03113024)，4℃孵育過夜。次日將包被有抗原的96孔酶標板恢復至室溫，洗滌液(PBS+0.05%Tween 20(Sigma,Cat No.：P1379)洗滌三次。隨後加入200μL/孔封閉液(PBS+1%BSA(Roche,Cat No.：738328)，37℃孵育1小時。洗滌液洗滌三次。加入待測抗c-Met抗體於96孔酶標板，室溫孵育1小時。洗滌液洗滌三次。加入封閉液10000倍稀釋二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)(HRP)(Thermo，貨 號：31432)100μL/孔至96孔酶標板，室溫孵育1小時。洗滌液洗滌三次。加入100μL/孔顯色液TMB(eBioscience REF：00-4201-56)至96孔酶標板。加入100μL/孔終止液(2N H2SO4)至96孔酶標板。使用讀板儀450nm讀板。
實施例3、抗人c-Met的小鼠單株抗體細胞株產生
本發明藉由免疫小鼠，脾細胞融合、融合瘤篩選方法得到小鼠來源抗人c-Met單株細胞株。該方法為本領域熟知。即將重組表達抗原(human c-Met ECD-mFc,human c-Met Sema-flis，見實施例1)用PBS(Hyclone,Cat No.：SH30256.01B)稀釋至1mg/mL，與弗氏佐劑(首次免疫用完全弗氏佐劑，加強免疫用不完全弗氏佐劑)乳化後，皮下注射接種Balb/C小鼠(每組5隻)，每隻小鼠接種100μg抗原，間隔兩周加強免疫。從第一次加強免疫開始，每次加強免疫後的7至10天內採集小鼠血清用ELISA測定(方法見實施例2)效價。
選擇免疫後血清效價高於1：105的小鼠進行細胞融合。分別無菌製備小鼠B細胞和骨髓瘤細胞(SP2/0，ATCC number：CRL-1581TM)並計數，將兩種細胞按照B細胞：SP2/0=1：4的比例進行混合後離心(1500r/min，7min)，棄上清加入1mL 50%聚乙二醇(Supplier：SIGMA,Catalogue# RNBB306)，之後用1mL無血清RPMI1640(Supplier：GIBCO,Catalogue#C22400)終止，離心10min，棄上清，用含融合瘤細胞生長因子(Supplier：Roche,Catalogue# 1363735001)，血清(Supplier：GIBCO,Catalogue#C20270)和HAT(Supplier： Invitrogen,Catalogue# 21060-017)的RPMI1640再懸沉澱，按照每孔105個B細胞的標準鋪板，每孔100μL，置37℃細胞培養箱中培養，3天後加入每孔100μL含融合瘤細胞生長因子，血清和HT(Supplier：Invitrogen,Catalogue# 11067-030)的RPMI1640，2至4天後全換液每孔加入150μL含融合瘤細胞生長因子，血清和HT的RPMI1640，次日ELISA(方法見實施例2)檢測陽性純株。
實驗結果：
實施例4、抗c-Met抗體序列選殖
將單細胞株Ab-5進行cDNA序列選殖，然後重組表達出單株抗體並進行各項活性檢測。本發明用逆轉錄PCR擴增抗體基因的重鏈和輕鏈可變區，連接到載體測序得到單 株抗體輕重鏈序列。首先採用RNA純化試劑盒(Qiagen公司，貨號74134，步驟見此說明書)提取實施例3中活性好的單細胞株的細胞總RNA。然後使用Invitrogen公司的貨號為18080-051 cDNA合成試劑盒製備cDNA單鏈，即Oligo-dT primers cDNA反轉錄。以此為模版，採用PCR方法合成抗體輕重鏈可變區序列，PCR產物選殖到TA載體pMD-18T，然後送去測序。將得到的抗體輕重鏈序列分別選殖到表達載體(見實施例1)，表達重組單株抗體，驗證活性(見實施例2，3)後，進行人源化工作。
本發明小鼠融合瘤細胞單株抗體Ab-5的序列：
重鏈可變區：
(SEQ ID NO：4)
輕鏈可變區：
(SEQ ID NO：5)
抗人c-Met抗體的VH/VL CDR的胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。
本發明中鼠源的CDR序列如下表所述：
實施例5、抗c-Met抗體人源化
將實施例4得到鼠源抗c-Met單株抗體輕重鏈序列在抗體資料庫裏進行同源性比較後，建立人源化抗體模型，根據模型選擇回復突變篩選最優的人源化抗c-Met單株抗體為本發明較佳分子。該方法從已經發表的小鼠Fab晶體結構模型資料庫(比如PDB資料庫)中查找與所得鼠源候選分子同源性相似的晶體結構開始，挑取高解析度(比如<2.5Å)的Fab晶體結構，建立小鼠Fab模型。將本發明鼠源抗體輕重鏈序列和模型中的序列比對，保留和模型中和鼠源抗體序列一致的序列，得到本發明鼠抗體的結構模型，其中不一致胺基酸為可能的回復突變位點。用Swiss-pdb viewer軟體運行鼠抗體結構模型，優化能量(最小化)。將模型中除CDR外的不同胺基酸位點進行回復突變，將所得的突變抗體(人源化)和人源化之前抗體對比進行活性檢測。保留活性好的人源化抗體。之後，對CDR區 域優化，包括避免糖基化，脫醯胺化，氧化位點等。優化後的人源化抗c-Met抗體的CDR區如下表所示：
人源化以後的輕重鏈可變區如以下所示：
1、重鏈可變區：
Ab-9
(SEQ ID NO： 13)
Ab-10
(SEQ ID NO： 14)
Ab-11
(SEQ ID NO：15)
2、輕鏈可變區：
Ab-9
(SEQ ID NO：16)
Ab-10
(SEQ ID NO：17)
Ab-11
(SEQ ID NO：18)
人源化以後的輕重鏈和IgG Fc區段重組，得到本發明人源化抗c-Met單株抗體。所用的Fc序列視需要選自以下序列：
重鏈恒定區：
(SEQ ID NO：19)
(SEQ ID NO： 20)
(SEQ ID NO：21)
輕鏈恒定區：
(SEQ ID NO：22)
用基因選殖、重組表達的方法分別選殖、表達、純化上述抗體，經ELISA(實施例2)和體外結合活性檢測(實施例6)，最終選出活性保持最好的人源化抗體Ab-9，Ab-10，Ab-11，序列如下：
Ab-9人源化抗體：
重鏈：
(SEQ ID NO：23)
輕鏈：
(SEQ ID NO：26)
Ab-10人源化抗體：
重鏈：
(SEQ ID NO：24)
輕鏈：
(SEQ ID NO：27)
Ab-11人源化抗體：
重鏈：
(SEQ ID NO：25)
輕鏈：
(SEQ ID NO：28)
實施例6、抗c-Met人源化抗體體結合外活性檢測
本發明人源化抗體體外活性除了用ELISA(實施例2)檢測之外，還檢測了其與c-Met高表達細胞株MKN45的結 合，及其與c-Met抗原的親和力(BIACore測定)。
用FACS方法檢測本發明抗c-Met人源化體同c-Met高表達細胞株MKN45的結合活性。
在具有10%(v/v)胎牛血清(FBS)(GIBCO，Cat No.：10099-141)和青黴素/鏈黴素(GIBCO，Cat No.：15070-063)的RPMI 1640培養基(GIBCO，Cat No.：11835-030)中再懸浮MKN45細胞(JCRB，Cat No.：JCRB0254)至10000,000細胞/mL。將2mL再懸的MKN45細胞以150,000細胞/孔加入96孔微滴定板(Corning，Cat No.：3799)中，加入8個濃度(20μg/mL起5倍濃度梯度稀釋)的c-Met抗體至對應的孔中，最終體積為100μL，在4度孵育1小時。加入FACS緩衝液(具有2.5%(v/v)胎牛血清(FBS)的磷酸鹽緩衝液(PBS)(Hyclone，Cat：SH30256.01B)，4℃，1300rpm，4分鐘，離心棄上清，重複三次。每孔加入100μL二抗溶液(螢光標記羊抗鼠二抗：1：200稀釋，Biolegend，Cat#405307；螢光標記抗人二抗：1：30稀釋，Biolegend，Cat#409304)，在4度孵育1小時。加入FACS緩衝液，4℃，1300rpm，4分鐘，離心棄上清，重複三次。加入200μL FACS緩衝液，再懸細胞，準備好樣品，使用流式細胞儀(BD FACS Array)檢測。
本發明採用表面等離子共振技術(surface plasmon resonance,SPR)檢測c-Met抗體與c-Met抗原Sema-His之間的親和力。
Anti-mouse IgG(GE Life Sciences catalog # BR-1008-38) 或anti-human IgG(GE Life Sciences catalog # BR-1008-39)抗體用pH5.0乙酸鈉溶液(GE Healthcare，Cat#BR-1003-51)分別稀釋至30μg/mL和50μg/mL，用胺基偶聯試劑盒(GE Life Sciences，Cat#BR100050)固定化至CM5晶片(GE Life Sciences catalog # BR-1000-12)的試驗及對比通道，偶聯水準設定在15000RU。運行緩衝液PBS(Hyclone,Cat#SH30256.01B)+0.05% P20(GE Life Sciences,Cat#BR-1000-54))稀釋c-Met抗體至1.5μg/mL，運行緩衝液稀釋抗原sema-his至200nM，之後用同樣緩衝液1：2倍稀釋直至0.78nM。將稀釋好的抗體在30μL/min的流速下流過實驗通道一分鐘，抗原在同樣的流速下流經實驗通道和對比通道3分鐘，解離10分鐘後將流速調至10μL/min，在實驗通道和對比通道流過再生緩衝液3分鐘。數據經雙重扣減後用BiaEvaluation 4.1擬合，擬合模型用1：1(Langmuir)模型。
試驗結果：
試驗結論：上述試驗結果表明，本發明人源化抗體和抗原的結合活性在0.13-8nM，因檢測方法的不同，檢測結果有所不同。結果表明了人源化後的抗c-Met抗體保留了人源化之前抗體的結合活性。
實施例7、抗c-Met抗體的內吞作用
本發明抗體結合人c-Met，具有非常好的體外活性，體內抑制腫瘤活性。此外，該抗體沒有或有很弱的激動劑活性。為了檢測本發明抗體結合人c-Met後，是否能夠和人c-Met一起內吞到細胞內，用表達c-Met的人胃癌細胞MKN45(JCRB，Cat No.：JCRB0254)進行了評估。
在具有10%(v/v)胎牛血清(FBS)(GIBCO，Cat No.：10099-141)和青黴素/鏈黴素(GIBCO，Cat No.：15070-063)的RPMI 1640培養基(GIBCO，Cat No.：11835-030)中再懸浮MKN45細胞至10000,000細胞/mL。將2mL再懸的MKN45細胞以250,000細胞/孔加入96孔微滴定板中，加入10μg/mL的c-Met抗體至對應的孔中，最終體積為100μL，在4℃孵育1小時。加入FACS緩衝液(具有2.5%胎牛血清的 磷酸鹽緩衝液(Hyclone，Cat：SH30256.01B)，4℃，1300rpm，4分鐘，離心棄上清，重複三次。每孔加入100μL二抗溶液(螢光標記羊抗鼠二抗：1：200稀釋，Biolegend，Cat#405307；螢光標記抗人二抗：1：30稀釋，Biolegend，Cat#409304)，在4℃孵育1小時。加入FACS緩衝液，4℃，1300rpm，4分鐘，離心棄上清，重複三次。加入細胞完全培養基(具有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基)，在37℃，5% CO2下孵育0小時，0.5小時，1小時，2小時，4小時。每孔加入5μL 7-AAD(Biolegend,Cat：420403)至100μL FACS緩衝液中，在4℃孵育30分鐘，加入FACS緩衝液，4℃，1300rpm，4分鐘，離心棄上清，重複三次。加入200μL Stripping buffer(0.05M甘胺酸，pH 3.0；0.1M氯化鈉，按照1：1(v/v)混勻)至每孔細胞中，再懸細胞，室溫孵育7分鐘。室溫，1300rpm，4分鐘，離心棄上清。加入200μL中和洗液(0.15M三羥甲基胺基甲烷，pH 7.4)至每孔細胞中，再懸細胞，室溫，1300rpm，4分鐘，離心棄上清。加入200μL FACS緩衝液，再懸細胞，準備好樣品，使用流式細胞儀(BD FACS Calibur)檢測。結果見下表。
c-Met抗體內吞百分比=(各個時間點螢光強度值-零點時的平均螢光強度值)/零點時的平均螢光強度值。
試驗結果：
*：對照組-4.9%、-3.6%均為實驗誤差(背景值)，均視為沒有內吞作用。
試驗結論：上表試驗結果表明，本發明抗體除了沒有激動劑活性外，還有很好的內吞作用。結合靶細胞後，抗體和受體一起迅速內吞到靶細胞內，2-4小時內吞達到最大值。
實施例8、抗c-Met抗體生物物理穩定性特性分析
為了評估本發明抗體的生物物理穩定性，比如糖基化，脫胺基化位點是否存在，以及其穩定性等，用質譜(LC-MS)分析方法對本發明抗c-Met抗體進行了綜合評價。
樣品直接LC-MS檢測輕重鏈分子量分析糖基化。在4℃長時間(3個月以上)，或40℃，21天加速條件下，LC-MS分析脫胺基化。不同條件處理樣品後，取出樣品，用pH7.2 Tris-HCl稀釋樣品至2mg/mL，加入終濃度為10mM TCEP和6M尿素(AMRESCO,Cat# 0378)，37℃孵育20min，加入終濃度為20mM IAA(Sigma-Aldrich,Cat#I1149)室溫避光孵育15min保護巰基，用pH 7.2 Tris-HCl稀釋樣品以調節 pH，按照蛋白：酶=10：1(重量比)的比例添加蛋白酶(Sigma-Aldrich,Cat# T6567)，37℃孵育25min後添加終濃度為0.1%的甲酸(Fluca,Cat#94318)終止反應，離心上LC-MS分析。
用BiopharmaLynx來分析有無脫醯胺基作用。所得到的質譜數據藉由找到包含脫醯胺化位點的原生肽(native peptide)和修飾產物，提取母離子得到EIC(Extracted Ion Chromatogram)圖，積分得到峰面積並計算脫醯胺化和氧化產物所占比例。
試驗結果：
*：重鏈均有糖基化，分子量均和預期一致。#：脫胺基分子比例(%)。0.66-1.0%在檢測背景範圍內；-：為未進行該試驗。
試驗結論：上述結果表明，本發明的抗體穩定，物理性能好。
實施例9、抗c-Met抗體Ab-10偶聯毒素MC-MMAF(編號1)
本發明抗c-Met抗體具有受體結合阻止活性、無激動劑活性、具有靶細胞內吞活性和物理穩定性等特性，這些特性使得本發明抗體特別適合和毒素偶聯成ADC藥物用於c-Met表達癌症治療。偶聯過程見下方案：
第一步將硫乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.7mg，5.3μmol)溶解於乙腈溶液(0.9mL)，備用。向Ab-10單抗pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.35mg/mL，9.0mL，0.97mmol)加入上述預製的硫乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加氰基硼氫化鈉(14.1mg,224μmol,1.0mL)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後，用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後，得產物1b溶液，濃縮到約10mg/mL後直接進行下一 步反應。
第二步，向1b溶液(11.0mL)中加入鹽酸羥胺溶液(2.0M，0.35mL)，於25℃下振盪反應30分鐘後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後，得標題產物Ab-10單抗-丙硫醇1c溶液(濃度6.17mg/mL，14.7mL)。
第三步，將化合物MC-MMAF(1.1mg，1.2μmol，採用PCT專利WO2005081711公開的方法製備而得)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-10單抗-丙硫醇溶液1c(6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-1的PBS緩衝液(3.7mg/mL，4.7mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148119.2(MAb+0D)、149278.1(MAb+1D)、150308.1(MAb+2D)、151314.1(MAb+3D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.7。
實施例10、抗c-Met抗體Ab-10偶聯毒素MC-VC-PAB-MMAE(編號2)
將化合物MC-VC-PAB-MMAE(1.6mg，1.2μmol，採用PCT專利WO2004010957公開的方法製備而得)溶解於乙腈 (0.3mL)中，加入Ab-10單抗-丙硫醇溶液1c(6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-2的PBS緩衝液(3.6mg/mL，4.8mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148118.4(MAb+0D)、149509.2(MAb+1D)、150903.1(MAb+2D)、152290.4(MAb+3D)、153680.7(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.8。
實施例11、抗c-Met抗體Ab-10偶聯毒素MC-VC-PAB-MMAF(編號3)
將化合物MC-VC-PAB-MMAF(1.6mg，1.2μmol，採用PCT專利WO2005081711公開的方法製備而得)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-10單抗-丙硫醇溶液1c(6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-3的PBS緩衝液(3.5mg/mL，4.9mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148119.1(MAb+0D)、149525.3 (MAb+1D)、150930.7(MAb+2D)、152335.2(MAb+3D)、153739.8(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.6。
實施例12、抗c-Met抗體Ab-10偶聯毒素MC-MMAE(編號4)
化合物MC-MMAE(1.2mg，1.2μmol，採用專利申請”US7/750/116 B1”公開的方法製備而得)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-10單抗-丙硫醇溶液1c(6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-4的PBS緩衝液(3.4mg/mL，5.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148118.6(MAb+0D)、149104.3(MAb+1D)、150090.1(MAb+2D)、151075.8(MAb+3D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.6。
實施例13、抗c-Met抗體Ab-9偶聯毒素MC-MMAE(編號5)
第一步，將硫乙酸S-(3-羰基丙基)酯(0.7mg，5.3μmol)，溶解於0.9mL乙腈溶液，備用；向Ab-9單抗pH=4.3的乙酸/乙酸鈉緩衝液(10.85mg/mL，9.0mL，0.976mmol)加入上述預製的硫乙酸S-(3-羰基丙基)酯的乙腈溶液，然後滴加的氰基硼氫化鈉(14.1mg,224μmol,1.0mL)的水溶液，於25℃下振盪反應2小時。反應結束後，用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後，得標題產物5b溶液，濃縮到約10mg/mL後直接進行下一步反應。
第二步，向5b溶液(11.0mL)中加入鹽酸羥胺溶液(2.0M，0.35mL)，於25℃下振盪反應30分鐘後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS溶液)後，得標題產物Ab-9單抗-丙硫醇5c溶液(濃度6.2mg/mL，15.0mL)。
第三步，將化合物MC-MMAE(1.1mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-9單抗-丙硫醇溶液5c(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器 過濾後得標題產物ADC-5的PBS緩衝液(3.8mg/mL，4.6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150530.9(MAb+0D)、151915.7(MAb+1D)、153333.6(MAb+2D)、154763.4(MAb+3D)、156271.9(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.5。
實施例14、抗c-Met抗體Ab-9偶聯毒素MC-MMAF(編號6)
將化合物MC-MMAF(1.1mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-9單抗-丙硫醇溶液5c(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-6的PBS緩衝液(3.8mg/mL，4.6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150537.8(MAb+0D)、152087.9(MAb+1D)、153486.5(MAb+2D)、154911.7(MAb+3D)、156499.9(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.7。
實施例15、抗c-Met抗體Ab-9偶聯毒素MC-VC-PAB-MMAF(編號7)
將化合物MC-VC-PAB-MMAF(1.6mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-9單抗-丙硫醇溶液5c(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-7的PBS緩衝液(3.8mg/mL，4.6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150537.8(MAb+0D)、152087.9(MAb+1D)、153486.5(MAb+2D)、154911.7(MAb+3D)、156499.9(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.8。
實施例16、抗c-Met抗體Ab-9偶聯毒素MC-VC-PAB-MMAE(編號8)
將化合物MC-VC-PAB-MMAE(1.6mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-9單抗-丙硫醇溶液5c(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器 過濾後，得標題產物ADC-8的PBS緩衝液(3.8mg/mL，4.6mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150508.6(MAb+0D)、151903.6(MAb+1D)、153314.5(MAb+2D)、154747.8(MAb+3D)、156039.5(MAb+4D)。分析得每個抗體分子連接毒素量(DAR)平均值：y=1.6。
實施例17、抗c-Met抗體Ab-9偶聯毒素-SN-38(編號9)
將化合物MC-VC-PAB-SN-38(1.3mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中，加入Ab-9單抗-丙硫醇溶液5c(6.2mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後，將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後，得標題產物ADC-11的PBS緩衝液(3.7mg/mL，4.5 mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：150537.1(MAb+0D)、151786.6(MAb+1D)、152948.6(MAb+2D)、154161.7(MAb+3D)、155365.9(MAb+4D)、156477.8(MAb+5D)。
平均值：y=2.6。
實施例18、抗c-Met抗體Ab-10偶聯毒素(編號10)
1、毒素的製備
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
第一步
(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸的製備
將原料((S)-2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸12a(400mg，2.18mmol，採用公知的方法“Advanced Synthesis & Catalysis,2012,354(17),3327-3332”製備而得)溶於乙酸第三丁酯(10mL)，加入高氯酸(300mg(70%)，3.3mmol)，於室溫下攪拌16小時。反應完畢後加入水(6mL)，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)洗滌。水相用飽和碳酸氫鈉溶液調節至Ph=8，二氯甲烷(5mL×3)萃取，合併有機相，依次用水(3mL)，飽和氯化鈉溶液(5mL)洗滌，無水硫酸鈉乾 燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品標題產物化合物12b(390mg，黃色油狀物)，產品不經純化直接進行下一步反應。
第二步
(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸的製備
將原料(2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(第三丁氧羰基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸12e(100mg，0.334mmol)溶於二氯甲烷(6mL)和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入反應物粗品(S)-第三丁酯2-胺基-3-(2-氟苯基)丙酸12b(80mg，0.334mmol)。再加入N,N-二異丙基乙基胺(0.29mL，1.67mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(152.3mg，0.40mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌1小時。反應結束後，加水(10mL)攪拌，分層，二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物化合物12c(173mg，無色液體，收率99.5%)。
MS m/z(ESI)：521.2[M+1]
第三步
(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸的製備
將原料(1S,3S,5S)-第三丁酯3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(第 三丁氧基)-3-(2-氟苯基)-1-羰基丙基-2-基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-羰基丙基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-2-羧酸12c(173mg，0.33mmol)溶於二噁烷(2mL)中，加入氯化氫二噁烷溶液(5.6M，0.21mL，1.16mmol)，氬氣氛下，於室溫攪拌1小時，置於0℃冰箱內12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，加入二氯甲烷(5mL)稀釋，加入飽和碳酸氫鈉溶液(10mL)，攪拌10分鐘。體系分層，水層用二氯甲烷萃取(5mL×3)。合併二氯甲烷層，用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮，得到粗品標題產品化合物12d(77mg，黃色液體)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：421.2[M+1]
第四步
(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸的製備
將粗品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12d(77mg，0.183mmol)，(5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷-14-羧酸 12i(116.8mg，0.183mmol，採用專利申請“WO 2013072813”公開的方法製備而得)溶於二氯甲烷(6mL)和二甲基甲醯胺(V/V=5：1)混合溶劑中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.16mL，0.915mmol)和2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(84mg，0.22mmol)。反應體系在氬氣氛下，於室溫下攪拌1小時。反應結束後，加入水(10mL)攪拌，分層。二氯甲烷層用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥。過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠管柱色譜法以洗脫劑體系B純化殘留物，得到標題產品化合物12e(190.5mg，黃色粘稠物，收率100%)。
MS m/z(ESI)：1040.6[M+1]
第五步
(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸的製備
將原料(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-第二丁基)-1-(9H-芴-9-基)-5,8-二異丙基-12-甲氧基-4,10-二甲基-3,6,9-三羰基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十四烷基-14-醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12e(190.5mg，0.183mmol)溶於二氯甲烷(1.5mL)中，加入二乙胺(2mL)。反應體系在氬氣氛下，於室溫攪拌3小時。反應 結束後，將反應液減壓濃縮，得到粗品標題產品化合物12f(150mg，黃色粘稠物)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：818.5[M+1]
第六步
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸的製備
將粗品(S)-第三丁酯2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12f(150mg，0.183mmol)溶於二噁烷(1mL)中，加入的氯化氫二噁烷溶液(5.6M，3mL)，氬氣氛下，於室溫攪拌12小時。反應結束後，將反應液減壓濃縮，用乙醚帶旋溶劑。所得殘餘物用高效液相色譜法純化得標題產品化合物12g(28mg，白色粉末固體，收率20%)。
MS m/z(ESI)：762.7[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.38-7.18(m,2H),7.13-7.01(m,2H),4.80-4.67(m,2H),4.30-4.15(m,1H),4.13-4.01(m,1H),3.96-3.83(m,2H),3.75-3.60(m,2H),3.42-3.11(m,9H),3.06-2.95(m,1H),2.70-2.58(m,4H),2.28-2.01(m,4H),1.88-1.70(m,3H),1.57-1.25(m,4H),1.22-0.95(m,18H),0.92-0.80 (m,4H),0.78-0.65(m,1H).
2、毒素中間體的製備
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-甲基己醯胺)-3-甲基丁醯胺)-N,3-二甲基丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸
將原料(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基胺基)丁醯胺)丁醯胺)-3-甲氧基-5-甲基庚醯基)-2-氮雜雙環[3.1.0]己烷-3-基)-3-甲氧基-2-甲基丙醯胺)-3-(2-氟苯基)丙酸12g(25mg，0.033mmol)溶於二氯甲烷(3mL)中，加入N,N-二異丙基乙基胺(0.029mL，0.164mmol)，反應體系在氬氣氛下，冰浴下滴加預製的6-(2,5-二羰基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯4b(11.3mg，0.049mmol)的二氯甲烷溶液，於室溫反應3小時。反應結束後，加入水(5mL)，攪拌20分鐘，分液，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，殘留物用高效液相色譜法純化得標題產物化合物12h(7 mg，黃色粘稠物，收率22.4%)。
MS m/z(ESI)：955.4[M+1]
1H NMR(400MHz,CD3OD)：δ 7.36-7.30(m,1H),7.29-7.21(m,1H),7.17-7.02(m,2H),6.83-6.79(m,2H),4.81-4.71(m,2H),4.69-4.55(m,2H),4.25-4.15(m,1H),4.13-4.04(m,1H),3.96-3.85(m,2H),3.70-3.61(m,1H),3.55-3.46(m,3H),3.40-3.21(m,4H),3.18-3.10(m,2H),3.07-2.96(m,4H),2.67-2.56(m,2H),2.54-2.34(m,3H),2.29-2.17(m,2H),2.10-1.99(m,1H),1.89-1.57(m,7H),1.52-1.28(m,6H),1.21-1.11(m,4H),1.07-0.96(m,6H),0.95-0.81(m,12H),0.80-0.69(m,1H).
3、抗體毒素偶聯物的製備
將化合物12h(1.2mg，1.2μmol)溶解於乙腈(0.3mL)中， 加入Ab-10單抗-丙硫醇1c溶液(6.17mg/mL，3.0mL)中，於25℃下振盪反應4小時後將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的含0.05M的PBS溶液)，在無菌條件下藉由0.2μm濾器過濾後得標題產物ADC-12的PBS緩衝液(3.3mg/mL，5.0mL)，於4℃冷凍儲存。
Q-TOF LC/MS：特徵峰：148119.6(MAb+0D)、149150.5(MAb+1D)、150221.1(MAb+2D)、151265.1(MAb+3D)、152314.3(MAb+4D)。
平均值：y=1.6。
參照實施例9-18，製備編號11-12的ADC化合物。
實施例19、抗c-Met抗體毒素偶聯(ADC)分子對肝癌細胞的增殖抑制作用
供試品：本發明部分抗體化合物，其化學名稱和製備方法見各化合物的製備實施例。
採用CCK法測試本發明分子對細胞增殖的抑制作 用，根據IC50大小評價本發明ADC分子體外細胞活性。
用Cell Counting Kit(東仁化學科技有限公司，Cat#CK04)檢測細胞增殖(按說明書進行操作)，所用細胞及相應的培養基見下表：
實驗方法：
實驗時加入2-3mL胰蛋白酶消化2-3min，待細胞消化完全，加入10-15mL完全培養基將經過消化的細胞洗脫下來，1000rpm離心3min，棄上清。接著加入10-20mL培養基將細胞再懸，製成單細胞懸液，調整細胞密度為4×104cells/mL。在96孔細胞培養板各孔中加0.1mL上述細胞懸液，37℃ 5% CO2的培養箱中培養，24小時後去掉培養基，每孔加入90μL含2%FBS的培養基，將待測樣品用PBS稀釋成不同濃度梯度，每孔加入10μL，37℃ 5% CO2的培養箱中孵育72小時。每孔加入10μL CCK8，培養箱中繼續孵育2小時，酶標儀(VICTOR 3，PerkinElmer公司)檢測OD450，採用GraphPad Prism(version 5.0)軟體進行數據分 析。
實驗結果：
實驗結論：
由上表實驗結果顯示本發明的ADC-1藥物分子對肝癌細胞系的抑制作用優於本發明抗c-Met抗體，說明本發明的ADC藥物具有較好的抑制肝癌細胞的增殖作用。
實施例20、本發明ADC藥物對人肝癌HCCLM3裸小鼠皮下移植瘤的療效
供試品：本發明部分抗體、ADC化合物，其化學名稱和製備方法見各化合物的製備實施例。
實驗動物：BALB/cA-nude裸小鼠，21-28天，雄性，購自中國科學院上海藥物研究所。生產許可證號：SCXK(滬)2013-0017，No311613700000089。飼養環境：SPF 級。
供試品溶液配製：
ADC-12用注射用水溶解成20mg/mL溶液，分裝保存-80℃冰箱，臨用時用0.1% BSA生理鹽水稀釋成相應濃度；Ab-10抗體原液，抗體濃度16.3mg/mL，用0.1% BSA生理鹽水稀釋後，分裝保存於-80℃冰箱。
實驗方法：
裸小鼠皮下接種人肝癌HCCLM3細胞，待腫瘤生長至100-150mm3後，將動物隨機分組(D0)，每組10隻。每週測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數據。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬； T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C為試驗結束時的腫瘤體積；T0、C0為試驗開始時的腫瘤體積。
實驗結果：
D0：第一次給藥時間；P值指與溶劑相比；**P<0.01；均採用student’s t檢驗；試驗開始時小鼠數目：n=10；短線-表示數據為空白。
實驗結論：
由上表數據可判斷，ADC-12(1、3、10mg/kg，iv，D0)劑量依賴性地抑制高表達c-Met人肝癌HCCLM3裸小鼠皮下移植瘤的生長，抑瘤率分別為36%、87%、178%(D21)，3mg/kg劑量組有1/10腫瘤部分消退，10mg/kg劑量組有3/10腫瘤部分消退和6/10腫瘤完全消退(D21)；至首次給藥後第43天(D42)，10mg/kg劑量組仍有7/10腫瘤完全消退。Ab-10抗體原液(10mg/kg，IV，每週2次，共6次)，對HCCLM3的抑瘤率為36%；荷瘤小鼠對以上藥物均能很好耐受，沒有體重減輕等症狀發生。相比較，ADC-12對HCCLM3的療效明顯強於Ab-10抗體原液。
因此，ADC-12對c-Met人肝癌HCCLM3裸小鼠皮下移 植瘤的抑制作用顯著，有效抑制腫瘤生長，引起腫瘤部分或完全消退，並且隨著劑量的升高，抑瘤率提高、抑制效果更加顯著；Ab-10抗體原液對HCCLM3有顯著抑制作用、有效抑制腫瘤生長；在相同劑量條件下，ADC-12對HCCLM3的療效明顯強於Ab-10抗體原液。
實施例21、本發明ADC藥物在BALB/c裸小鼠的LI-03-0022 HCC患者來源的腫瘤移植(PDX)模型上的抗腫瘤療效
供試品：本發明部分抗體、ADC化合物，其化學名稱和製備方法見各化合物的製備實施例。
試驗動物：BALB/cA-nude裸小鼠，6-8週，18隻，雌性，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016，動物合格證號：2008001658891，飼養環境：SPF級。
供試品溶液配製：
ADC-12藥物用注射用水溶解成20mg/mL溶液，分裝保存-80℃冰箱，臨用時用5%葡萄糖溶液稀釋成相應濃度；Ab-10抗體原液濃度16.3mg/mL用5%葡萄糖溶液稀釋後，分裝保存於-80℃冰箱，臨用時用5%葡萄糖溶液稀釋成相應濃度。
具體配置方法如下表所示：
LI-03-0022 HCC PDX腫瘤模型的建立：
LI-03-0022 HCC(hepatic celluler cancer，肝細胞癌)PDX腫瘤模型(人體腫瘤移植(patient-derived tumor xenograft model，PDX)最初是從肝癌病人手術切除組織的臨床樣品(來源於上海東方肝膽醫院)上建立的，植入裸小鼠中，將其定義為0代(P0)，植入0代(P0)腫瘤後定義為1代(P1)，在裸小鼠中持續植入以此順序定義，FP3腫瘤從P2T的人中恢復，從FP5產生的下一代定義為FP6，以此類推，FP5 腫瘤組織用於此研究。
實驗方法：
(1)腫瘤植入：每隻小鼠在右側皮下植入LI-03-0022 FP5腫瘤切片(~30mm3)以發展腫瘤，當腫瘤植入32天後、並且腫瘤大小平均接近183.20mm3後開始治療、每組6隻荷瘤小鼠，對小鼠的實驗方法按照下表實驗設計中的預定方案進行：
備註：a、N為每組動物數量；b、給藥體積為基於體重10μL/g調整給藥體積；c、BIW為每週2次；iv為靜脈注射；在2小時後最後一次給藥從所有老鼠未經抗凝收集血液樣品，收集約50μL血清用於PK分析；在研究結束時，收集腫瘤樣品，將來自溶媒組的2隻動物和樣品組的2隻動物，分為兩組：一個用於FFPE(Formalin-Fixedand Parrffin-Embedded，福馬林固定後石蠟包埋的組織簡稱為FFPE樣品)和IHC(Immunohistochemistry，免疫組織化學染 色)、一個用於在液氮中冷凍。
(2)觀察與記錄：每週測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數據。
(3)腫瘤測量與終點
主要終點是看腫瘤生長是否可能會推遲或小鼠可能被治癒，腫瘤體積用卡尺每週測量兩次、測量兩個維度，單位為mm3；腫瘤體積(V)計算公式為：V=0.5×a×b2其中a和b分別是腫瘤的長徑和短徑；腫瘤體積用於計算T-C值、T/C值，T-C值藉由T(為治療組腫瘤達到1000mm3所需的平均時間，單位為天)和C(為對照組腫瘤達到相同大小所需的平均時間，單位為天)來計算；T/C值(百分比)作為抗腫瘤效力的指示，尤其是，T=Ti/T0，C=Ci/C0，Ti為治療組在某一天的平均腫瘤體積，T0為治療組開始治療的平均腫瘤體積，Ci為與Ti相同時間的溶媒對照組的平均腫瘤體積，V0為開始治療的溶媒組的平均腫瘤體積。
(4)數據分析：匯總統計，包括平均值和平均值的標準誤差(SEM)，在不同組間的腫瘤體積差異的體積分析和在最後一次給藥(分組後的第14天)後在最佳治療時間點獲得數據進行的藥物相互作用的體積分析，單向方差分析以比較組間腫瘤體積和腫瘤重量，當得到非顯著F-統計量(p值=0.061，治療方差比上誤差方差)，進行Dunnett的T(雙面)組間比較，採用SPSS17.0對所有數據進行分析，P<0.05 被認為是統計學上有意義。
實驗結果：
a為平均值±標準誤差；b為治療開始後的天數；c為n=5；短線-為相應組別的動物在該時間已經處死，未獲取數據。
a為平均值±標準誤差；b為腫瘤生長抑制是藉由將治療組的組平均腫瘤體積除以對照組的組平均腫瘤體積，T/C必須小於或等於50%；c為p值在腫瘤大小的基礎上計算得到；d為腫瘤動物每組3-5隻。
具體染色面積見說明書圖式第2圖和第3圖。
備註：0表示未染色，+表示淺染色，++表示中等染色，+++表示深染色；在顯微鏡下讀取整個切片，細胞不同染色強度的百分比藉由視覺評估來確定，H得分計算公式為 1×(+的細胞%)+2×(++的細胞%)+3×(+++的細胞%)；然後我們用得分標準來評價圖片：得分值在0-0.3為弱陽性，0.3-1.5為中等陽性，1.5-3為強陽性。
實驗結論：
由上表結果說明本發明的ADC藥物對抑制肝癌細胞的增殖作用顯著強於抗體；用ADC-12注射液治療產生顯著的抗腫瘤活性，平均腫瘤體積為52.3mm3(T/C value =3.25%,p=0.001)，與溶媒組比較，腫瘤生長體積大小控制在1000mm3延遲了32天；但是，用Ab-10抗體溶液治療僅產生微小的抗腫瘤活性、平均腫瘤大小控制在1,067mm3(T/C value=74.47%)延遲了3天，與溶媒組比較沒有統計學上的顯著不同(p=0.252)；LI-03-0022 HCC PDX模型對c-Met蛋白表達的印象得分為2+，說明該模型對c-Met蛋白表達量為強陽性，可以用於體內做進一步研究。因此，本發明ADC藥物在LI-03-0022 HCC患者來源的腫瘤移植(PDX)模型研究中有顯著的抗腫瘤活性，並且在荷瘤動物上有較好的耐受性。
實施例22、本發明ADC藥物在BALB/c裸小鼠的LI-03-0240 HCC患者來源的腫瘤移植(PDX)模型上的抗腫瘤療效
供試品：本發明部分抗體、ADC化合物，其化學名稱和製備方法見各化合物的製備實施例。
實驗動物：BALB/cA-nude裸小鼠，6-8週，30隻，雌性，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016，動物合格證號2008001658004， 飼養環境：SPF級。
供試品溶液配製：
ADC-12藥物的凍乾粉用注射用水溶解成20mg/mL溶液，分裝保存-80℃冰箱，臨用時用5%葡萄糖溶液稀釋成相應濃度；Ab-10抗體原液濃度16.3mg/mL用5%葡萄糖溶液稀釋後，分裝保存於-80℃冰箱，臨用時用5%葡萄糖溶液稀釋成相應濃度。
具體配置方法如下表所示：
LI-03-0240 HCC PDX腫瘤模型的建立：
LI-03-0240 HCC(hepatic celluler cancer，肝細胞癌)PDX腫瘤模型(人體腫瘤移植(patient-derived tumor xenograft model，PDX)最初是從肝癌病人手術切除組織的臨床樣品(來源於上海東方肝膽醫院)上建立的，植入裸小鼠中，將其定義為0代(P0)，植入0代(P0)腫瘤後定義為1代(P1)，在裸小鼠中持續植入以此順序定義，FP3腫瘤從P2T的人中恢復，從FP5產生的下一代定義為FP6，以此類推，FP5腫瘤組織用於此研究。
實驗方法：
(1)腫瘤植入：每隻小鼠在右側皮下植入LI-03-0240 FP5腫瘤切片(~30mm3)以發展腫瘤，當腫瘤植入15天後、並且腫瘤大小平均接近151.79mm3後開始治療、每組6隻荷瘤小鼠，對小鼠的實驗方法按照下表實驗設計中的預定方案進行：
a、N為每組動物數量；b、給藥體積為基於體重10μL/g調整給藥體積；c、BIW為每週2次；iv為靜脈注射；在2小時後最後一次給藥從所有老鼠未經抗凝收集血液樣品，收集約50μL血清用於PK分析；在研究結束時，收.集腫瘤樣品，將來自溶媒組的2隻動物和樣品組的2隻動物，分為兩組：一個用於FFPE(Formalin-Fixedahd Parrffin-Embedded，福馬林固定後石蠟包埋的組織簡稱為FFPE樣品)和IHC(Immunohistochemistry，免疫組織化學染色)、一個用於在液氮中冷凍。
(2)觀察與記錄：每週測2-3次瘤體積，稱鼠重，記錄數據。
(3)腫瘤測量與終點
主要終點是看腫瘤生長是否可能會推遲或小鼠可能被治癒，腫瘤體積用卡尺每週測量兩次、測量兩個維度，單位為mm3；腫瘤體積(V)計算公式為：V=0.5×a×b2其中a、b分別表示長、寬；腫瘤體積用於計算T-C值、T/C值，T-C值藉由T(為治療組腫瘤達到1000mm3所需的平均時間，單位為天)和C(為對照組腫瘤達到相同大小所需的平均時間，單位為天)來計算；T/C值(百分比)作為抗腫瘤效力的指示，尤其是，T=Ti/T0，C=Ci/C0，Ti為治療組在某一天的平均腫瘤體積，T0為治療組開始治療的平均腫瘤體積，Ci為與Ti相同時間的溶媒對照組的平均腫瘤體積，V0為開始治療的溶媒 組的平均腫瘤體積。
(4)數據分析：匯總統計，包括平均值和平均值的標準誤差(SEM)，組間腫瘤體積的差異統計分析和在最後一次給藥(分組後的第17天)後在最佳治療時間點進行的藥物相互作用所獲得的數據分析。比較組間腫瘤體積和腫瘤重量用單向方差分析，當得到非顯著F-統計量(p<0.001，治療方差比上誤差方差)，進行組間Games-Howell比較，對所有數據採用SPSS17.0進行分析，P<0.05被認為是統計學上有意義。
實驗結果：
a為平均值±標準誤差；b為治療開始後的天數；c為n=5；短線-為相應組別的動物在該時間已經處死，未獲取數據。
a為平均值±標準誤差；b為腫瘤生長抑制是藉由將治療組的組平均腫瘤體積除以對照組的組平均腫瘤體積，T/C必須小於或等於50%；c為p值在腫瘤大小的基礎上計算得到；d為腫瘤動物每組3-5隻。
具體染色面積見說明書圖式第5圖和第6圖。
備註：0表示未染色，+表示淺染色，++表示中等染色， +++表示深染色；在顯微鏡下讀取整個切片，細胞不同染色強度的百分比藉由視覺評估來確定，H得分計算公式為1×(+的細胞%)+2×(++的細胞%)+3×(+++的細胞%)；然後我們用得分標準來評價圖片：得分值在0-0.3為弱陽性，0.3-1.5為中等陽性，1.5-3為強陽性。
實驗結論：
由上表結果說明本發明的ADC藥物對抑制肝癌細胞的增殖作用顯著強於抗體；用ADC-12注射液治療產生顯著的抗腫瘤活性，平均腫瘤體積為52.3mm3(T/C value =3.25%,p=0.001)，與溶媒組比較，腫瘤生長體積大小控制在1000mm3延遲了32天；但是，用Ab-10抗體溶液治療僅產生微小的抗腫瘤活性、平均腫瘤大小控制在1,067mm3(T/C value=74.47%)延遲了3天，與溶媒組比較沒有統計學上的顯著不同(p=0.252)；LI-03-0240 PDX模型對c-Met蛋白表達的印象得分為3+，說明該模型對c-Met蛋白表達量為強陽性，可以用於體內做進一步研究。因此，本發明ADC藥物在LI-03-0240 HCC患者來源的腫瘤移植(PDX)模型研究中有顯著的抗腫瘤活性，並且在荷瘤動物上有較好的耐受性。
<110> 蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司、江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 抗c-Met抗體-細胞毒性藥物偶聯物的醫藥用途
<130> 770066CPCT
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2796
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人cMet細胞外區域(ECD)和鼠Fc區域融合蛋白(human cMet ECD-mFc)DNA序列
<400> 1
<210> 2
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人cMet細胞外Sema區域和Flag-His標籤(Human cMet Sema-Flis)DNA序列
<400> 2
<210> 3
<211> 2823
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人c-Met ECD his標籤(Human cMet ECD-His)重組蛋白DNA序列
<400> 3
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 4
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 6
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 7
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 8
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 9
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 鼠源
<400> 11
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 優化的輕鏈CDR1
<400> 12
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-9重鏈可變區
<400> 13
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-10重鏈可變區
<400> 14
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-11重鏈可變區
<400> 15
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-9輕鏈可變區
<400> 16
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-10輕鏈可變區
<400> 17
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-11輕鏈可變區
<400> 18
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人源
<400> 19
<210> 20
<211> 326
<212> PRT
<213> 人源
<400> 20
<210> 21
<211> 327
<212> PRT
<213> 人源
<400> 21
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人源
<400> 22
<210> 23
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-9重鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-10重鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-11重鏈
<400> 25
<210> 26
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-9輕鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-10輕鏈
<400> 27
<210> 28
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ab-11輕鏈
<400> 28

Claims (54)

  1. 一種抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物在製備治療肝癌藥物中的用途，其中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物具有式(I)所示結構：Ab-[(L 2)t-L 1-D)]y (I)其中：D為細胞毒性藥物；L 1，L 2是接頭單元；t為0或1；y為1至8；Ab為特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含至少1個選自以下的CDR區序列或其突變序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，t為1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，y為2-5。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如下的HCDR區序列或其突變序列：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如下的LCDR區序列或其突變 序列：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的用途，其中，該抗體包含重鏈可變區序列SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或其突變序列，和輕鏈可變區序列SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11或其突變序列。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的用途，其中，該突變序列為CDR區發生1-3個優化抗體活性的胺基酸突變，其中HCDR2區突變序列優選為SEQ ID NO：12。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的用途，其中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中，該鼠源抗體重鏈可變區序列為：SEQ ID NO：4。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中，該鼠源抗體輕鏈可變區序列為：SEQ ID NO：5。
  11. 如申請專利範圍第8至10項中任一項所述的用途，其中，該鼠源抗體的重鏈可變區為：SEQ ID NO：4，輕鏈可變區為：SEQ ID NO：5。
  12. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的用途，其中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體或人源化抗體或其片段。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的用途，其中，該人源化 抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈序列；其中該重鏈FR區序列包含人種系重鏈IGHV 3-33*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列或其突變序列。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其中，該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列為人種系重鏈IGHV 3-33*01。
  15. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其中，該突變序列為0至10個胺基酸的回復突變。
  16. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其中，該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：13-15所示的重鏈可變區序列或其變體。
  17. 如申請專利範圍第12項所述的用途，其中，該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，選自人種系輕鏈序列，其中該輕鏈FR區序列包含人種系輕鏈IGKV085和IGKV 4-1*01的FR1，FR2，FR3區和FR4區的框架序列或其突變序列。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的用途，其中，該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列為人種系輕鏈IGKV085或IGKV 4-1*01。
  19. 如申請專利範圍第17項所述的用途，其中，該突變序列為0至10個胺基酸的回復突變。
  20. 如申請專利範圍第17項所述的用途，其中，該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：16-18所示的輕鏈可變區序列 或其變體。
  21. 如申請專利範圍第12至20項中任一項所述的用途，其中，該人源化抗體包含選自SEQ ID NO：13-15的重鏈可變區序列和選自SEQ ID NO：16-18的輕鏈可變區序列。
  22. 如申請專利範圍第1至7或12至21項中任一項所述的用途，其中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自a)至c)任一的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列的組合：a)SEQ ID NO)：13的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：16的輕鏈可變區序列；b)SEQ ID NO：14的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：17的輕鏈可變區序列；或c)SEQ ID NO：15的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：18的輕鏈可變區序列。
  23. 如申請專利範圍第12至22項中任一項所述的用途，其中，該人源化抗體的重鏈恒定區包含源自人源IgG1或其變體、人源IgG2或其變體、人源IgG3或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區。
  24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該人源化抗體的重鏈恒定區包含人源IgG1或其變體或人源IgG2或其變體或人源IgG4或其變體的恒定區。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的用途，其中，該人源化抗體的重鏈恒定區包含人源IgG2或其變體的恒定區。
  26. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：23-25或與其具有至少90%同源性的全長重鏈序列。
  27. 如申請專利範圍第12至22項中任一項所述的用途，其中，該人源化抗體的輕鏈恒定區包含選自人源 κ或 λ鏈或其變體的恒定區。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的用途，其中，該特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段，其包含選自SEQ ID NO：26-28或與其具有至少90%序列同源性的全長輕鏈序列。
  29. 如申請專利範圍第12至28項中任一項所述的用途，其中，該人源化抗體包含選自以下全長輕鏈序列和全長重鏈序列的組合：Ab-9：SEQ ID NO：23的重鏈序列和SEQ ID NO：26的輕鏈序列；Ab-10：SEQ ID NO：24的重鏈序列和SEQ ID NO：27的輕鏈序列；或Ab-11：SEQ ID NO：25的重鏈序列和SEQ ID NO：28的輕鏈序列。
  30. 如申請專利範圍第1至29項中任一項所述的特異性結合c-Met受體的抗體或其抗原結合片段在製備治療肝癌藥物中的用途，其中，該藥物包含一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  31. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該-L 2-為以下通式(-L 2-)所示的化合物： 其中，X 1選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或3-8員環烷基；X 2選自C 1-6烷基、3-8員環烷基或3-8員雜環基；m為0至5；S為硫原子。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的用途，其中，m為1至3。
  33. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該細胞毒性藥物D選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素或核溶酶的細胞毒劑。
  34. 如申請專利範圍第33項所述的用途，其中，該D為以下通式(D)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽： 其中， R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、R 6、R 7選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或3-8員環烷基；R 8、R 9、R 10、R 11選自氫原子、鹵素、C 2-6烯基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或3-8員環烷基；或者R 8、R 9、R 10、R 11之中的任意兩個形成3-8員環烷基，餘下的兩個基團選自氫原子、C 1-6烷基或3-8員環烷基；R 12、R 13選自氫原子、C 1-6烷基或鹵素；R 14選自視需要被取代基取代的6-8員芳基或5-8員雜芳基，該取代基選自氫原子、鹵素、羥基、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基或3-8員環烷基；R 15視需要自鹵素、C 2-6烯基、C 1-6烷基、3-8員環烷基、羧基、C 1-6烷基羰基或C 1-6烷氧基羰基；R 16選自氫原子、鹵素、羥基、氰基、烷基、C 1-6烷氧基或3-8員環烷基。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的用途，其中，該L 2包含選自Val-Cit，MC，PAB和MC-PAB的接頭。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的用途，其中，該L 2為MC。
  37. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該D是美登木素生物鹼。
  38. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中，該D是DM1、DM3和DM4。
  39. 如申請專利範圍第38項所述的用途，其中，該D是 DM1。
  40. 如申請專利範圍第37項所述的用途，其中，該L 2選自N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯或N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯。
  41. 如申請專利範圍第40項所述的用途，其中，該L 2選自N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯或-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸酯。
  42. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該D是喜樹鹼類生物鹼。
  43. 如申請專利範圍第42項所述的用途，其中，該喜樹鹼類生物鹼選自CPT、10-羥基-CPT、伊立替康、SN-38或托泊替康。
  44. 如申請專利範圍第43項所述的用途，其中，該喜樹鹼類生物鹼為SN-38。
  45. 如申請專利範圍第42項所述的用途，其中，該接頭L 2選自Val-Cit，MC，PAB或MC-PAB。
  46. 如申請專利範圍第45項所述的用途，其中，該接頭L 2選自MC或MC-vc-PAB。
  47. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(II)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物： 其中：R 2-R 16如申請專利範圍第34項中所定義；Ab，t，y，L 1，L 2如申請專利範圍第1項中所定義。
  48. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(III)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物： 其中：R 2-R 16如申請專利範圍第34項中所定義；Ab，y如申請專利範圍第1項中所定義；n為3至6。
  49. 如專利範圍第48項所述的用途，其中，n為5。
  50. 如專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(IV)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物： 其中，R 2-R 16如申請專利範圍第34項中所定義；Ab，y如申請專利範圍第1項中所定義；n如申請專利範圍第48項中所定義；X 1，X 2，m如申請專利範圍第31項中所定義。
  51. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該抗體-細胞毒性藥物偶聯物為通式(V)所示的偶聯藥物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化合物： 其中，Ab，D，y如申請專利範圍第1項中所定義；n如申請專利範圍第48項中所定義；X 1，X 2，m如申請專利範圍第31項中所定義。
  52. 申請專利範圍第1至51項中任一項所述的用途，其中該抗體-細胞毒性藥物偶聯物或其可藥用鹽或溶劑化合物選自： Ab-9，Ab-10，Ab-11如申請專利範圍第29項中所定義，其中，y的範圍為1至8。
  53. 如申請專利範圍第52項所述的用途，其中，y為2至5。
  54. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，該肝癌為c-Met陽性或過表達的肝癌。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI709904B (zh) * 2019-11-26 2020-11-11 國立中央大學 訓練類神經網路以預測個體基因表現特徵的方法及系統

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
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CN115297889A (zh) * 2020-09-01 2022-11-04 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 抗c-Met抗体药物偶联物及其应用
CN117659203B (zh) * 2023-12-06 2024-08-13 科弈(浙江)药业科技有限公司 一种抗met/egfr双特异性抗体及其药物偶联物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101865223B1 (ko) * 2011-10-05 2018-06-08 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 인간화 항체 및 그의 용도
KR20130037153A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
EP2992019B1 (en) * 2013-04-30 2019-03-06 Agency For Science, Technology And Research Mab 2 anti-met antibody
KR102150616B1 (ko) * 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
WO2016165580A1 (zh) * 2015-04-17 2016-10-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗c-Met抗体和抗c-Met抗体-细胞毒性药物偶联物及其医药用途

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI709904B (zh) * 2019-11-26 2020-11-11 國立中央大學 訓練類神經網路以預測個體基因表現特徵的方法及系統

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