TWI857300B - 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於新穎性經結合莢膜醣抗原(醣結合物)、包含該等醣結合物之免疫原組合物及其用途。
Description
本發明係關於新的結合之莢膜醣抗原(醣結合物)、包含該等醣結合物之免疫原組合物及其用途。本發明之免疫原組合物通常將包含醣結合物，其中醣係源自肺炎鏈球菌(
Streptococcus pneumoniae)之血清型。本發明亦係關於使用該等醣結合物針對肺炎球菌感染對人類受試者、特定而言嬰兒及老年人接種疫苗。
藉由使免疫原性較差之分子結合至「載體」分子來增加該等分子之免疫原性之方式已成功地利用數十年(例如參見Goebel等人，(1939) J. Exp. Med. 69: 53)。舉例而言，闡述許多免疫原組合物，其中已使經純化莢膜聚合物結合至載體蛋白以藉由利用此「載體效應」來產生更有效之免疫原組合物。Schneerson等人，(1984) Infect. Immun. 45: 582-591)。亦已證實，結合可避免在使用游離多醣實施免疫時通常觀察於嬰兒中之較差抗體反應(Anderson等人，(1985) J. Pediatr. 107: 346；Insel等人，(1986) J. Exp. Med. 158: 294)。
已成功地使用各種交聯或偶合試劑(例如同雙官能、異雙官能或零長度交聯劑)來生成結合物。當前可利用許多方法來使免疫原分子(例如醣、蛋白質及肽)偶合至肽或蛋白質載體。大部分方法產生胺、醯胺、胺基甲酸酯、異硫脲或二硫鍵，或在一些情形下產生硫醚。使用將反應性位點引入載體及/或免疫原分子上之反應性胺基酸分子之側鏈中之交聯或偶合試劑的缺點在於，反應性位點在未經中和之情形下將與在活體外(由此可能不良地影響結合物之功能性或穩定性)或在活體內(由此在經該等製劑免疫化之人或動物引起不良事件之潛在風險)與任何不期望分子自由反應。可利用各種已知化學反應使該等過量反應性位點發生反應或「封端」以不活化該等位點，但該等反應可另外破壞結合物之功能性。
因此，仍需要適當封端之新醣結合物及製備該等結合物之方法，從而功能性得以保留且結合物保留誘發期望免疫反應之能力。
肺炎球菌多醣、尤其莢膜多醣係發現於細菌表面上之重要免疫原。此使得其成為肺炎球菌疫苗之設計中之重要組分。其已證實可用於誘發免疫反應，尤其在連接至載體蛋白時。
一些血清型、尤其肺炎鏈球菌血清型3會產生較大黏性多醣鏈(例如關於3型之2-3百萬道爾頓(Dalton)之葡萄糖/葡萄糖醛酸鏈)。其黏性使得其難以處理。
另外，難以獲得關於血清型3多醣之顯著免疫原性。舉例而言，在11價肺炎球菌蛋白D結合疫苗(11-Pn-PD)之免疫原性及安全性之研究中，在已接受三個劑量之疫苗且隨後接受加強劑量之相同疫苗或肺炎球菌多醣疫苗之嬰兒中未觀察到血清型3之引發效應(Nurkka等人，(2004) Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014)。在另一研究中，已接受11-Pn-PD劑量之嬰兒之調理吞噬分析(OPA)結果未展示與其他所測試血清型程度相當之針對血清型3的抗體反應(Gatchalian等人，17
thannual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis. (ESPID)，第4號海報，PIA海報展示1，Istanbul Turkey, Mar. 27, 2001)。在評價11-Pn-PD在預防急性中耳炎中之效能又一研究中，疫苗不能防止由血清型3引起之發作(Prymula等人，The Lancet，第367卷：740-748 (2006年3月4日))。
因此，需要能夠生成針對肺炎鏈球菌血清型3之較穩定免疫反應之抗原。
本發明尤其提供展示改良免疫原性之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物。本發明亦提供以改良之結合產率生成肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之製程(製備方法)。
在一態樣中，本發明係關於製備肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之方法，其包含以下步驟：
(a)使經分離肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接體在非質子溶劑中進行反應以產生經活化疊氮基多醣，
(b)使載體蛋白與具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，其中NHS部分與胺基進行反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白，
(c)藉由Cu
+1介導之疊氮化物-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化疊氮基多醣與步驟(b)之經活化炔烴-載體蛋白進行反應以形成醣結合物。
在一特大態樣中，在活化步驟(a)之前，經分離多醣之大小為重量平均分子量介於100 kDa與200 kDa之間。
在一態樣中，碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
在一態樣中，本發明係關於根據該等方法產生之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物。
在一態樣中，本發明係關於肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之肺炎鏈球菌血清型3醣且具有通式(VII)：
(VII)，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n’、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n’、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n’及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n’係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在又一態樣中，本發明係關於包含該肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之免疫原組合物。
1. 本發明之醣結合物本發明部分地係關於結合之莢膜醣抗原(亦稱為醣結合物)，其中醣係衍生自肺炎鏈球菌血清型、尤其衍生自血清型3。出於本發明目的，術語「醣結合物」指示共價連接至載體蛋白之莢膜醣。在一實施例中，莢膜醣直接連接至載體蛋白。在第二實施例中，細菌醣經由間隔體/連接體連接至蛋白質。
1.1 來自肺炎鏈球菌血清型 3 之肺炎球菌醣如圖1處所展示，血清型3之多醣重複單元由具有一個吡喃葡萄糖(Glc
p)及一個葡萄糖醛酸(Glc
pA)之線性二醣單元組成(例如參見Geno K等人，(2015) Clin Microbiol Rev，第28卷:3，p 871-899)。
在一實施例中，本發明中所使用之莢膜肺炎鏈球菌血清型3醣係合成碳水化合物。合成肺炎鏈球菌類型3莢膜醣之合成可(例如)如WO2017178664中所揭示來實施。
然而，在一較佳實施例中，本發明之細菌多醣之來源可為肺炎鏈球菌血清型3細菌細胞。可用作肺炎鏈球菌血清型3多醣之來源之細菌菌株可自既定培養物保藏所(例如自鏈球菌參考實驗室(Streptococcal Reference Laboratory) (疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，Atlanta, GA USA))或臨床樣品獲得。
血清型3多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如參見US2006/0228380、US2006/0228381、US2007/0184071、US2007/0184072、US2007/0231340及US2008/0102498以及WO2008/118752中所揭示之方法)自細菌直接獲得。其亦可使用熟習此項技術者已知之合成方案來產生。其亦可購得(例如來自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection) (ATCC, Manassas, VA USA) (例如參考號ATCC 172-X或ATCC 33-X))。
倘若血清型3多醣係自細菌直接獲得，則可在培養基中、較佳地在基於大豆之培養基中生長細菌細胞。在產生肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣之細菌細胞發酵後，可使細菌細胞溶解以產生細胞溶解物。然後可使用業內已知之純化技術自細胞溶解物來分離血清型3多醣，包括使用離心、深度過濾、沈澱、超濾、使用活性碳處理、滲濾及/或管柱層析(例如參見US2006/0228380、US2006/0228381及WO2008/118752)。然後可使用經純化血清型3莢膜多醣來製備免疫原結合物。
可藉由不同參數(包括例如重量平均分子量(Mw))來表徵藉由自肺炎鏈球菌溶解物純化血清型3多醣且視情況分篩純化多醣所獲得之經分離血清型3莢膜多醣。
可藉由粒徑篩析層析(SEC)以及多角度雷射光散射檢測器(MALLS)來量測多醣之分子量。
在一較佳實施例中，經分離血清型3莢膜多醣(亦即在進一步處理之前純化)具有介於5 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與300 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與200 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於5 kDa與100 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與300 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與200 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於50 kDa與100 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與300 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於100 kDa與200 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與300 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於150 kDa與200 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於200 kDa與300 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於300 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於400 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於500 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於750 kDa與1000 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1000 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1000 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1000 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1000 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1000 kDa與1500 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1500 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1500 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1500 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於1500 kDa與2000 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2000 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2000 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2000 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2500 kDa與5000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2500 kDa與4000 kDa之間之重量平均分子量。在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣具有介於2500 kDa與3000 kDa之間之重量平均分子量。
考慮任一上述範圍內之任一整數以作為本發明之一實施例。
較佳地，為產生具有有利之濾過特性、免疫原性及/或產率之血清型3結合物，在結合至載體蛋白之前將多醣分篩至目標分子量範圍。有利的是，減小經純化血清型3多醣之大小，而保留多醣結構之關鍵特徵。可採用機械或化學分篩。在一實施例中，藉由化學水解來減小經純化血清型3多醣之大小。可使用弱酸(例如乙酸、甲酸、丙酸)實施化學水解。在一實施例中，使用甲酸實施化學水解。在一實施例中，使用丙酸實施化學水解。在一較佳實施例中，使用乙酸實施化學水解。亦可使用稀強酸(例如稀鹽酸、稀硫酸、稀磷酸、稀硝酸或稀過氯酸)實施化學水解。在一實施例中，使用稀鹽酸實施化學水解。在一實施例中，使用稀硫酸實施化學水解。在一實施例中，使用稀磷酸實施化學水解。在一實施例中，使用稀硝酸實施化學水解。在一實施例中，使用稀過氯酸實施化學水解。亦可藉由機械均質化減小經純化血清型3多醣之大小。在實施例中，藉由高壓均質化減小經純化血清型3多醣之大小。高壓均質化藉由將製程流泵送通過具有足夠小尺寸之流動路徑來達成高剪切速率。藉由施加較大均質壓力來增加剪切速率，且可藉由使進料流再循環通過均質機來延長暴露時間。
高壓均質化製程可適於減小經純化血清型3多醣之大小，而保留多醣之結構特徵。
在一較佳實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與100 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於5 kDa與50 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於50 kDa與100 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與150 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於110 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於120 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於110 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於130 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於120 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於120 kDa與140 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於120 kDa與130 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於130 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於130 kDa與140 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與250 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於150 kDa與200 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於200 kDa與250 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與350 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於250 kDa與300 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於300 kDa與350 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與450 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於350 kDa與400 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於400 kDa與450 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於450 kDa與500 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與600 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於500 kDa與600 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於600 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於600 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於600 kDa與800 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於600 kDa與700 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於700 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於700 kDa與900 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於700 kDa與800 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於800 kDa與1000 kDa之間。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於800 kDa與900 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於900 kDa與1000 kDa之間。
在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約5 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約50 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約100 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約110 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約120 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約130 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約140 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約150 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約160 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約170 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約180 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約190 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約200 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約250 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約300 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約350 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約400 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約450 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約500 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約550 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約600 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約700 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約800 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約900 kDa。在一實施例中，將經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量為約1000 kDa。
在一實施例中，經分離血清型3莢膜多醣未經分篩。
可活化(例如以化學方式活化)上述經分離血清型3莢膜多醣以使其能夠發生反應(例如與連接體或直接與載體蛋白)且然後納入醣結合物中，如本文進一步所闡述。
出於本發明目的，術語「醣結合物」指示共價連接至載體蛋白之醣。在一實施例中，醣直接連接至載體蛋白。在第二實施例中，醣經由間隔體/連接體連接至載體蛋白。
一般而言，醣與載體之共價結合增強了醣之免疫原性，此乃因其將醣自T獨立性抗原轉化成T依賴性抗原，由此可引發免疫記憶。結合尤其可用於兒科疫苗。
1.2 本發明之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物在一些實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於10 kDa與2,000 kDa之間。
醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)係指在活化多醣(亦即在最終分篩步驟之後但在多醣與活化劑反應之前)之前的Mw。在本發明之上下文中，多醣之Mw並不由活化步驟實質上改變，且納入結合物中之多醣之Mw類似於在活化之前所量測多醣的Mw。在一實施例中，使用碳酸衍生物(例如CDI或CDT)與疊氮基連接體(參見下文之章節1.3)之組合來活化多醣。在一實施例中，使用CDI與疊氮基連接體(參見下文之章節1.3)之組合來活化多醣。在一實施例中，使用CDT與疊氮基連接體(參見下文之章節1.3)之組合來活化多醣。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與140 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與130 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與120 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與110 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與140 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與130 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與120 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與110 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與140 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與130 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與120 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與110 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與140 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與130 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與200 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與150 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於130 kDa與140 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於150 kDa與200 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與400 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於200 kDa與300 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與500 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於300 kDa與400 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於400 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於400 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於400 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於400 kDa與600 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於400 kDa與500 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於500 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於500 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於500 kDa與700 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於500 kDa與600 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於600 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於600 kDa與750 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於600 kDa與700 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於700 kDa與1,000 kDa之間。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)介於700 kDa與750 kDa之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於750 kDa與1,000 kDa之間。
考慮任一上述範圍內之任一整數以作為本發明之一實施例。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)為約1,000 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約750 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約700 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約600 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約500 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約400 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約300 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約200 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約150 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約140 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約130 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約120 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約110 kDa。在一實施例中，重量平均分子量(Mw)為約100 kDa。
在一些此類實施例中，使用點擊化學製備血清型3醣結合物(參見章節1.3)。
在一些實施例中，本發明之血清型3醣結合物具有介於250 kDa與20,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與15,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與3,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與2,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與1,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與1,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與750 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與600 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於250 kDa與400 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與3,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與2,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與1,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與1,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與750 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於500 kDa與600 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與3,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與2,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與1,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於750 kDa與1,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與3,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與2,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於1,000 kDa與1,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與3,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,000 kDa與3,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於2,250 kDa與3,500 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於3,000 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於4,000 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於5,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於5,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於5,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於5,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於5,000 kDa與6,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於6,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於6,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於6,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於6,000 kDa與7,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於7,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於7,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於7,000 kDa與8,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於8,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於8,000 kDa與9,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有介於9,000 kDa與10,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
考慮任一上述範圍內之任一整數以作為本發明之一實施例。
在其他實施例中，血清型3醣結合物具有約10,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有約9,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在其他實施例中，血清型3醣結合物具有約8,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約7,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約6,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約5,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約4,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約3,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約3,250 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約3,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約2,500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約2,250 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約2,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約1,000 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約750 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約600 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約500 kDa之重量平均分子量(Mw)。在再其他實施例中，血清型3醣結合物具有約400 kDa之重量平均分子量(Mw)。
可藉由粒徑篩析層析(SEC)以及多角度雷射光散射檢測器(MALLS)來量測多醣之分子量。
表徵本發明血清型3醣結合物之另一方式係藉助載體蛋白(例如CRM
197或SCP)中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。可使用熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白之離胺酸修飾之證據。結合使得與用於產生結合材料之載體蛋白起始材料相比，所回收之離胺酸殘基數有所減少。在一較佳實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與15之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與13之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與10之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與8之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與6之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與5之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於2與4之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與15之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與13之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與10之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與8之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與6之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與5之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於3與4之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於5與15之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於5與10之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於8與15之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於8與12之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於10與15之間。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於10與12之間。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約2。
在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約3。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約4。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約5。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約6。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約7。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約8。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約9。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約10、約11。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約12。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約13。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約14。在一實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度為約15。在一較佳實施例中，本發明之血清型3醣結合物之結合度介於4與7之間。在一些此類實施例中，載體蛋白係CRM
197。在其他此類實施例中，載體蛋白係SCP。
亦可藉由醣對載體蛋白之比率(重量/重量)來表徵本發明之血清型3醣結合物。在一些實施例中，醣結合物中血清型3多醣對載體蛋白之比率(w/w)介於0.5與3.0之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於0.5與2.0之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於0.5與1.5之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於0.8與1.2之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於0.5與1.0之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於1.0與1.5之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於1.0與2.0之間。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)介於0.8與1.2之間。在一較佳實施例中，結合物中血清型3莢膜多醣對載體蛋白之比率介於0.9與1.1之間。
在一實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約0.5。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約0.6。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約0.7。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約0.8。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約0.9。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.0。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.1。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.2。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.3。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.4。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.5。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.6。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.7。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.8。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約1.9。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約2.0。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約2.1。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約2.2。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約2.5。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約2.8。在其他實施例中，醣對載體蛋白比率(w/w)為約3.0。在一些此類實施例中，載體蛋白係CRM
197。在其他此類實施例中，載體蛋白係SCP。
亦可藉由載體蛋白與醣之間之共價鍵聯數來表徵本發明之血清型3醣結合物，該共價鍵聯數隨醣重複單元數而變化。在一實施例中，對於多醣之每4個醣重複單元，本發明之血清型3醣結合物在載體蛋白與多醣之間包含至少一個共價鍵聯。在另一實施例中，在多醣之每10個醣重複單元中，載體蛋白與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每15個醣重複單元中，載體蛋白與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每25個醣重複單元中，載體蛋白與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每50個醣重複單元中，載體蛋白與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。在又一實施例中，在多醣之每100個醣重複單元中，載體蛋白與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每5至10個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每2至7個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每6至11個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每9至14個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每10至20個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在其他實施例中，本發明之血清型3醣結合物之多醣之每4至25個醣重複單元包含至少一個載體蛋白與多醣之間的共價鍵聯。
在常見實施例中，載體蛋白係CRM
197。在常見實施例中，載體蛋白係SCP。
在一些實施例中，載體蛋白係CRM
197，且在多醣之每4個、10個、15個或25個醣重複單元中，CRM
197與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。在常見實施例中，載體蛋白係SCP，且在多醣之每4個、10個、15個或25個醣重複單元中，SCP與多醣之間之共價鍵聯出現至少一次。
本發明之血清型3醣結合物及免疫原組合物可含有並不共價結合至載體蛋白、但仍存在於醣結合物組合物中之游離醣。游離醣可與醣結合物非共價締合(亦即，非共價結合至該醣結合物中、吸附至該醣結合物中或包埋於該醣結合物中或與其一起包埋)。
在一較佳實施例中，與血清型3多醣之總量相比，血清型3醣結合物包括小於約50%之游離血清型3多醣。在一較佳實施例中，與血清型3多醣之總量相比，血清型3醣結合物包括小於約40%之游離血清型3多醣。在又一較佳實施例中，與血清型3多醣之總量相比，血清型3醣結合物包括小於約25%之游離血清型3多醣。在一更佳實施例中，與血清型3多醣之總量相比，血清型3醣結合物包括小於約20%之游離血清型3多醣。在又一較佳實施例中，與血清型3多醣之總量相比，血清型3醣結合物包括小於約15%之游離血清型3多醣。
血清型3醣結合物亦可藉由其分子大小分佈(K
d)來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑篩選層析培養基(CL-4B)來測定。將粒徑篩析層析(SEC)用於重力進料管柱中以剖析結合物之分子大小分佈。自培養基中之孔篩析之大分子比小分子洗脫更快速。使用級分收集器來收集管柱洗脫物。藉由醣分析以比色方式測試該等級分。為測定K
d，對管柱進行校準以確立分子被完全篩析時之分數(V
0) (K
d=0)及代表最大滯留之分數(V
i) (K
d=1)。達到指定試樣屬性時之分數(V
e)與K
d相關，且表示為K
d= (V
e- V
0)/ (V
i- V
0)。
在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%之血清型3醣結合物之K
d小於或等於0.3。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%之醣結合物之K
d小於或等於0.3。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之血清型3醣結合物之K
d小於或等於0.3。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之血清型3醣結合物之K
d小於或等於0.3。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與80%之間之血清型3醣結合物之K
d小於或等於0.3。在一較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型3醣結合物之K
d小於或等於0.3。
1.3 使用點擊化學製得之本發明之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物在一實施例中，使用點擊化學製備本發明之血清型3醣結合物。
本發明亦係關於製備如本文所揭示之血清型3醣結合物之方法。
根據本發明，點擊化學包含以下三個步驟：(a)使經分離血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接體在非質子溶劑中進行反應以產生經活化疊氮基多醣(多醣活化)；(b)使載體蛋白與具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，其中NHS部分與胺基進行反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白(載體蛋白活化)；(c)藉由Cu
+1介導之疊氮化物-炔烴環加成反應使步驟(a)之經活化疊氮基多醣與步驟(b)之經活化炔烴-載體蛋白進行反應以形成醣結合物。
在步驟(a)後，多醣可視為經活化且在本文中稱為「活化多醣」或「經活化疊氮基多醣」。
在步驟(b)後，載體可視為經活化且稱為「活化載體」。
如上文所提及，在活化(a)之前，可將多醣分篩至目標分子量(MW)範圍。
因此，在一實施例中，在使用碳酸衍生物及疊氮基連接體活化之前，分篩經分離多醣。
在一實施例中，將經分離多醣分篩至上文所定義之任一靶分子量(MW)範圍。
在一實施例中，該碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺基酯(DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯。
在一實施例中，該碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(CDI)。在一實施例中，該碳酸衍生物係1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。在另一實施例中，該碳酸衍生物係碳酸二琥珀醯亞胺基酯(DSC)。在又一實施例中，該碳酸衍生物係氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯。
在一實施例中，該碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(CDI)或1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。較佳地，該碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係CH
2(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又一實施例中，n為3。在又一實施例中，n為4。在又一實施例中，n為5。在又一實施例中，n為6。在又一實施例中，n為7。在又一實施例中，n為8。在又一實施例中，n為9。在又一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又一實施例中，m為3。在又一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係NHCO(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又一實施例中，n為3。在又一實施例中，n為4。在又一實施例中，n為5。在又一實施例中，n為6。在又一實施例中，n為7。在又一實施例中，n為8。在又一實施例中，n為9。在又一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又一實施例中，m為3。在又一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係OCH
2(CH
2)
n，且n係選自1至10。在一實施例中，n係選自1至5。在一實施例中，n係選自1至4。在一實施例中，n係選自1至3。在一實施例中，n係選自1至2。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又一實施例中，n為3。在又一實施例中，n為4。在又一實施例中，n為5。在又一實施例中，n為6。在又一實施例中，n為7。在又一實施例中，n為8。在又一實施例中，n為9。在又一實施例中，n為10。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(I)化合物，其中X係O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4。在一實施例中，m係選自1至3。在一實施例中，m係選自1至2。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又一實施例中，m為3。在又一實施例中，m為4。
在一實施例中，該疊氮基連接體係式(II)化合物，
。
在一實施例中，該疊氮基連接體係3-疊氮基-丙基胺。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(III)化合物，
(III)
其中X係選自由CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O及CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O組成之群，其中n係選自0至10且m係選自0至4。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(III)化合物，其中X係CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10。在一實施例中，n係選自0至5。在一實施例中，n係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2。在一特定實施例中，n為0。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又一實施例中，n為3。在又一實施例中，n為4。在又一實施例中，n為5。在又一實施例中，n為6。在又一實施例中，n為7。在又一實施例中，n為8。在又一實施例中，n為9。在又一實施例中，n為10。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(III)化合物，其中X係CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O，其中n係選自0至10且m係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至5。在一實施例中，n係選自0至4。在一實施例中，n係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2。在一特定實施例中，n為0。在一特定實施例中，n為1。在另一實施例中，n為2。在又一實施例中，n為3。在又一實施例中，n為4。在又一實施例中，n為5。在又一實施例中，n為6。在又一實施例中，n為7。在又一實施例中，n為8。在又一實施例中，n為9。在又一實施例中，n為10。在一實施例中，m係選自0至3。在一實施例中，m係選自0至2。在一特定實施例中，m為1。在一特定實施例中，m為1。在另一實施例中，m為2。在又一實施例中，m為3。在又一實施例中，m為4。
在一實施例中，n係選自0至5且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至5且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至4且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至4且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至3且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至3且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至2且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至2且m係選自0至2。
在一實施例中，n係選自0至1且m係選自0至3。在一實施例中，n係選自0至1且m係選自0至2。
在一實施例中，n為0且m為0。在一實施例中，n為1且m為0。在一實施例中，n為2且m為0。在一實施例中，n為3且m為0。在一實施例中，n為4且m為0。在一實施例中，n為5且m為0。在一實施例中，n為6且m為0。在一實施例中，n為7且m為0。在一實施例中，n為8且m為0。在一實施例中，n為9且m為0。在一實施例中，n為10且m為0。
在一實施例中，n為0且m為1。在一實施例中，n為1且m為1。在一實施例中，n為2且m為1。在一實施例中，n為3且m為1。在一實施例中，n為4且m為1。在一實施例中，n為5且m為1。在一實施例中，n為6且m為1。在一實施例中，n為7且m為1。在一實施例中，n為8且m為1。在一實施例中，n為9且m為1。在一實施例中，n為10且m為1。
在一實施例中，n為0且m為2。在一實施例中，n為1且m為2。在一實施例中，n為2且m為2。在一實施例中，n為3且m為2。在一實施例中，n為4且m為2。在一實施例中，n為5且m為2。在一實施例中，n為6且m為2。在一實施例中，n為7且m為2。在一實施例中，n為8且m為2。在一實施例中，n為9且m為2。在一實施例中，n為10且m為2。
在一實施例中，n為0且m為3。在一實施例中，n為1且m為3。在一實施例中，n為2且m為3。在一實施例中，n為3且m為3。在一實施例中，n為4且m為3。在一實施例中，n為5且m為3。在一實施例中，n為6且m為3。在一實施例中，n為7且m為3。在一實施例中，n為8且m為3。在一實施例中，n為9且m為3。在一實施例中，n為10且m為3。
在一實施例中，n為0且m為4。在一實施例中，n為1且m為4。在一實施例中，n為2且m為4。在一實施例中，n為3且m為4。在一實施例中，n為4且m為4。在一實施例中，n為5且m為4。在一實施例中，n為6且m為4。在一實施例中，n為7且m為4。在一實施例中，n為8且m為4。在一實施例中，n為9且m為4。在一實施例中，n為10且m為4。
在一實施例中，該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(IV)化合物：
。
在一實施例中，步驟a)包含在非質子溶劑中使多醣與碳酸衍生物進行反應且隨後使經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接體進行反應以產生經活化疊氮基多醣。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係於存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.8-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之2-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之3-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.5-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.8-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之2-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之3-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.5-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.8-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之2-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.5-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.8-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.5-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.8-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.4-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.3-0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.01-0.3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.05-0.3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.1-0.3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之0.2-0.3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.01莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.05莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.08莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)包含使多醣與一定量之碳酸衍生物進行反應，該量係存在於反應混合物中血清型3莢膜多醣量之約10莫耳當量。
在一實施例中，在步驟a)處，使經分離多醣與碳酸衍生物在非質子溶劑中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)組成之溶液中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基甲醯胺(DMF)組成之溶液中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)組成之溶液中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基乙醯胺組成之溶液中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由N-甲基-2-吡咯啶酮組成之溶液中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由六甲基磷醯胺(HMPA)組成之溶液中進行反應。
在一較佳實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)組成之溶液中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在二甲基亞碸(DMSO)或二甲基甲醯胺(DMF)中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在二甲基甲醯胺(DMF)中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在二甲基亞碸(DMSO)中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在二甲基乙醯胺中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在N-甲基-2-吡咯啶酮中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與碳酸衍生物在六甲基磷醯胺(HMPA)中進行反應。
在一較佳實施例中，使經分離多醣與CDI在二甲基亞碸(DMSO)中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在無水DMSO中進行反應。
已令人吃驚地發現，使經分離多醣與CDI在水分含量為約0.1%至1% (v/v)之環境中進行反應使得可避免副反應。因此，在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.8% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.5% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.4% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.3% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.2% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至1% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.8% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.5% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.4% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.3% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.8% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.5% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.4% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.1% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.2% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.3% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.4% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.5% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.6% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.7% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.8% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.9% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.8% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.5% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.4% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.3% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.1%至0.2% (v/v)水之DMSO中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至1% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.8% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.5% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.4% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.2%至0.3% (v/v)水之DMSO中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.8% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.5% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含0.3%至0.4% (v/v)水之DMSO中進行反應。
在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.1% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.2% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.3% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.4% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.5% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.6% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.7% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.8% (v/v)水之DMSO中進行反應。在一實施例中，使經分離多醣與CDI在包含約0.9% (v/v)水之DMSO中進行反應。
在一實施例中，然後藉由在添加疊氮基連接體之前添加水來淬滅游離碳酸衍生物。水可不活化游離CDI。
因此，在一實施例中，在碳酸衍生物活化後添加水。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量介於約1%至約10% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量介於約1.2%至約8% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量介於約1.5%至約5% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量介於約1.5%至約3% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量介於約1.5%至約2.5% (v/v)之間。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.2% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.4% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約1.5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約2% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約2.5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約3% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約5% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約7% (v/v)。在一實施例中，添加水以使混合物中之總水含量達到約10% (v/v)。
當多醣已與碳酸衍生物發生反應後，且接著在最後使用水淬滅碳酸衍生物後，使經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接體進行反應。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量(RU之莫耳當量) 之0.01-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.01-0.1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05-0.1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量活化多醣中多醣重複單元量係之0.5-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣多醣重複單元量之1-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之2-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之2-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之2-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之2-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之2-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之3-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之3-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之3-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之3-4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之4-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之4-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之4-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之5-8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之8-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.01莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.05莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約1莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約2莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約3莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約4莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約5莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約8莫耳當量。
在一實施例中，步驟a)進一步包含使經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約10莫耳當量。
在上述實施例中，該碳酸衍生物較佳係CDI。在另一實施例中，該碳酸衍生物係CDT。
在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於0.5%至50%之間。疊氮基多醣之活化度定義為連接至疊氮基連接體之重複單元之百分比。
在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於1%至30%之間。在另一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於2%至25%之間。在另一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於3%至20%之間。
在另一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於3%至15%之間。在另一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於4%至15%之間。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於1%至6%之間。
在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於3%至6%之間。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度介於10%至15%之間。
在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約1%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約2%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約3%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約4%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約5%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約6%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約7%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約8%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約9%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約10%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約11%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約12%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約13%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約14%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約15%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約16%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約17%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約18%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約19%。在一實施例中，在步驟a)後活化多醣之活化度為約20%。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之3-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之7.5-10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2.5-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之3-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之5-7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-5莫耳當量 。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2.5-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之3-5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上之胺酸之2.5-3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之2-2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1.5-2莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-1.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-1.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之1-1.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.5-1莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之0.1-0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約10莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約7.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約3莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約2.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約2莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約1.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約1莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約0.5莫耳當量。
在一實施例中，步驟b)包含使載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係載體上離胺酸之約0.1莫耳當量。
在一實施例中，在步驟b)後活化載體之活化度介於1與50之間。活化載體之活化度定義為載體蛋白中變得連接至具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑之離胺酸殘基數。
在一實施例中，載體蛋白係含有39個離胺酸殘基之CRM
197。在該實施例中，在步驟b)後活化載體之活化度可介於1至30之間。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度介於5至20之間。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度介於9至18之間。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度介於8至11之間。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度介於15至20之間。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約5。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約6。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約7。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約8。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約9。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約10。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約11。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約12。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約13。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約14。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約15。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約16。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約17。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約18。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約19。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約20。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約21。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約22。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約23。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約24。在另一實施例中，活化載體(CRM
197)在步驟b)後之活化度為約25。
在一實施例中，載體蛋白係SCP或其片段。在該實施例中，在步驟b)後活化載體之活化度可介於1至50之間。
在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於5至50之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於7至45之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於5至15之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於20至30之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於30至50之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於30至40之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度介於10至40之間。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約5。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約7。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約10。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約13。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約15。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約20。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約26。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約30。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約35。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約37。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約40。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約45。在另一實施例中，活化載體(SCP)在步驟b)後之活化度為約50。
在一實施例中，載體蛋白係TT或其片段。在該實施例中，在步驟b)後活化載體之活化度可介於1至30之間。
在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度介於5至25之間。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度介於7至25之間。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度介於10至20之間。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約5。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約7。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約10。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約12。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約15。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約20。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約25。在另一實施例中，活化載體(TT)在步驟b)後之活化度為約30。
在一實施例中，在水性緩衝液中實施結合反應c)。在一實施例中，於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)存在下來實施結合反應c)。在一實施例中，於水性緩衝液中在氧化劑及作為觸媒之銅(I)存在下來實施結合反應c)。在一較佳實施例中，於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下來實施結合反應c)。在一實施例中，可進一步添加THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍以保護蛋白質免於副反應。因此，在一較佳實施例中，於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下來實施結合反應c)，其中反應混合物進一步包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。
在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)介於0.1與3之間。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)介於0.5與2之間。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)介於0.6與1.5之間。在一較佳實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)介於0.8與1之間。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約0.5。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約0.6。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約0.7。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約0.8。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約0.9。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.1。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.2。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.3。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.4。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.5。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.6。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.7。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.8。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約1.9。在一實施例中，步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)為約2。
在點擊結合反應後，未反應疊氮基可保留於結合物中，可使用適宜疊氮基封端劑將該等基團封端。因此，在一實施例中，在步驟c)後，使用適宜疊氮基封端劑將結合物中之未反應疊氮基封端。在一實施例中，此疊氮基封端劑係具有炔基之試劑。在一實施例中，此疊氮基封端劑係具有末端炔烴之試劑。在一實施例中，此疊氮基封端劑係具有環炔烴之試劑。
在一實施例中，該疊氮基封端劑係式(V)化合物，
其中X係(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
在一實施例中，此疊氮基封端劑係炔丙醇。
因此，在一實施例中，在步驟(c)後，該製程進一步包含使用疊氮基封端劑將保留於結合物中之未反應疊氮基封端之步驟。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05莫耳至20莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1莫耳至15莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至10莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至2莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至1莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1莫耳至2莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.75莫耳至1.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約1莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約1.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應疊氮基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約2莫耳當量。
在點擊結合反應後，未反應炔基可仍存在於結合物中，可使用適宜炔基封端劑將該等基團封端。在一實施例中，此炔基封端劑係具有疊氮基之試劑。
在一實施例中，該炔基封端劑係式(VI)化合物，
其中X係(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
在一實施例中，此炔基封端劑係3-疊氮基-1-丙醇。
因此，在一實施例中，在步驟(c)後，該製程進一步包含使用炔基封端劑將保留於結合物中之未反應炔基封端之步驟。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.05莫耳至20莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.1莫耳至15莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至10莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至2莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之0.5莫耳至1莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1莫耳至5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之1莫耳至2莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣之多醣重複單元之量1.5莫耳至2.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約0.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約1莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約1.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約2莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約2.5莫耳當量。
在一實施例中，使用一定量之封端劑對未反應炔基實施封端，該量係活化多醣中多醣重複單元量之約5莫耳當量。
在結合至載體蛋白後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術來純化醣結合物(相對於醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括透析、濃縮/滲濾操作、切向流過濾沈澱/洗脫、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。因此，在一實施例中，產生本發明之醣結合物之製程包含在產生之後純化醣結合物之步驟。
在一態樣中，本發明提供根據本文所揭示之任一方法產生之血清型3醣結合物。
在一態樣中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣共價且具有通式(VII)：
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n’、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n’、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n’及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n’係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
式(VII)係本發明之血清型3醣結合物之示意圖示。不應理解，鍵聯存在於醣之每一重複單元處。而係，大部分肺炎鏈球菌血清型3醣重複單元保持未修飾且載體蛋白與醣之間之共價鍵聯僅涉及少數醣重複單元。另外，個別載體蛋白(CP)分子可連接至一個以上肺炎鏈球菌血清型3醣分子且個別肺炎鏈球菌血清型3醣分子可連接至一個以上個別載體蛋白(CP)分子。
在一較佳實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係CH
2(CH
2)
n’，其中n’為2且其中X'係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”為1。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係CH
2(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10且其中X'係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，n’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3且n”為0。在又一實施例中，n’為4且n”為0。在又一實施例中，n’為5且n”為0。在又一實施例中，n’為6且n”為0。在一特定實施例中，n’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3且n”為1。在又一實施例中，n’為4且n”為1。在又一實施例中，n’為5且n”為1。在又一實施例中，n’為6且n”為1。在一特定實施例中，n’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3且n”為2。在又一實施例中，n’為4且n”為2。在又一實施例中，n’為5且n”為2。在又一實施例中，n’為6且n”為2。在一特定實施例中，n’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3且n”為3。在又一實施例中，n’為4且n”為3。在又一實施例中，n’為5且n”為3。在又一實施例中，n’為6且n”為3。在一特定實施例中，n’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3且n”為4。在又一實施例中，n’為4且n”為4。在又一實施例中，n’為5且n”為4。在又一實施例中，n’為6且n”為4。在一特定實施例中，n’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3且n”為5。在又一實施例中，n’為4且n”為5。在又一實施例中，n’為5且n”為5。在又一實施例中，n’為6且n”為5。在一特定實施例中，n’為1且n”為6。在另一實施例中，n’為2且n”為6。在又一實施例中，n’為3且n”為6。在又一實施例中，n’為4且n”為6。在又一實施例中，n’為5且n”為6。在又一實施例中，n’為6且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係CH
2(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10，且其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為5。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4且其中X'係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，m為1且n”為0。在另一實施例中，m為2且n”為0。在又一實施例中，m為3且n”為0。在又一實施例中，m為4且n”為0。在一特定實施例中，m為1且n”為1。在另一實施例中，m為2且n”為1。在又一實施例中，m為3且n”為1。在又一實施例中，m為4且n”為1。在一特定實施例中，m為1且n”為2。在另一實施例中，m為2且n”為2。在又一實施例中，m為3且n”為2。在又一實施例中，m為4且n”為2。在一特定實施例中，m為1且n”為3。在另一實施例中，m為2且n”為3。在又一實施例中，m為3且n”為3。在又一實施例中，m為4且n”為3。在一特定實施例中，m為1且n”為4。在另一實施例中，m為2且n”為4。在又一實施例中，m為3且n”為4。在又一實施例中，m為4且n”為4。在一特定實施例中，m為1且n”為5。在另一實施例中，m為2且n”為5。在又一實施例中，m為3且n”為5。在又一實施例中，m為4且n”為5。在一特定實施例中，m為1且n”為6。在另一實施例中，m為2且n”為6。在又一實施例中，m為3且n”為6。在又一實施例中，m為4且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4；且其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為5。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係NHCO(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10；且其中X’係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，n’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3且n”為0。在又一實施例中，n’為4且n”為0。在又一實施例中，n’為5且n”為0。在又一實施例中，n’為6且n”為0。在一特定實施例中，n’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3且n”為1。在又一實施例中，n’為4且n”為1。在又一實施例中，n’為5且n”為1。在又一實施例中，n’為6且n”為1。在一特定實施例中，n’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3且n”為2。在又一實施例中，n’為4且n”為2。在又一實施例中，n’為5且n”為2。在又一實施例中，n’為6且n”為2。在一特定實施例中，n’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3且n”為3。在又一實施例中，n’為4且n”為3。在又一實施例中，n’為5且n”為3。在又一實施例中，n’為6且n”為3。在一特定實施例中，n’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3且n”為4。在又一實施例中，n’為4且n”為4。在又一實施例中，n’為5且n”為4。在又一實施例中，n’為6且n”為4。在一特定實施例中，n’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3且n”為5。在又一實施例中，n’為4且n”為5。在又一實施例中，n’為5且n”為5。在又一實施例中，n’為6且n”為5。在一特定實施例中，n’為1且n”為6。在另一實施例中，n’為2且n”為6。在又一實施例中，n’為3且n”為6。在又一實施例中，n’為4且n”為6。在又一實施例中，n’為5且n”為6。在又一實施例中，n’為6且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係NHCO(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10；且其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為5。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4；且其中X’係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，m為1且n”為0。在另一實施例中，m為2且n”為0。在又一實施例中，m為3且n”為0。在又一實施例中，m為4且n”為0。在一特定實施例中，m為1且n”為1。在另一實施例中，m為2且n”為1。在又一實施例中，m為3且n”為1。在又一實施例中，m為4且n”為1。在一特定實施例中，m為1且n”為2。在另一實施例中，m為2且n”為2。在又一實施例中，m為3且n”為2。在又一實施例中，m為4且n”為2。在一特定實施例中，m為1且n”為3。在另一實施例中，m為2且n”為3。在又一實施例中，m為3且n”為3。在又一實施例中，m為4且n”為3。在一特定實施例中，m為1且n”為4。在另一實施例中，m為2且n”為4。在又一實施例中，m為3且n”為4。在又一實施例中，m為4且n”為4。在一特定實施例中，m為1且n”為5。在另一實施例中，m為2且n”為5。在又一實施例中，m為3且n”為5。在又一實施例中，m為4且n”為5。在一特定實施例中，m為1且n”為6。在另一實施例中，m為2且n”為6。在又一實施例中，m為3且n”為6。在又一實施例中，m為4且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4；且其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為5。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係OCH
2(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10；且其中X’係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。
在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，n’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3且n”為0。在又一實施例中，n’為4且n”為0。在又一實施例中，n’為5且n”為0。在又一實施例中，n’為6且n”為0。在一特定實施例中，n’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3且n”為1。在又一實施例中，n’為4且n”為1。在又一實施例中，n’為5且n”為1。在又一實施例中，n’為6且n”為1。在一特定實施例中，n’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3且n”為2。在又一實施例中，n’為4且n”為2。在又一實施例中，n’為5且n”為2。在又一實施例中，n’為6且n”為2。在一特定實施例中，n’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3且n”為3。在又一實施例中，n’為4且n”為3。在又一實施例中，n’為5且n”為3。在又一實施例中，n’為6且n”為3。在一特定實施例中，n’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3且n”為4。在又一實施例中，n’為4且n”為4。在又一實施例中，n’為5且n”為4。在又一實施例中，n’為6且n”為4。在一特定實施例中，n’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3且n”為5。在又一實施例中，n’為4且n”為5。在又一實施例中，n’為5且n”為5。在又一實施例中，n’為6且n”為5。在一特定實施例中，n’為1且n”為6。在另一實施例中，n’為2且n”為6。在又一實施例中，n’為3且n”為6。在又一實施例中，n’為4且n”為6。在又一實施例中，n’為5且n”為6。在又一實施例中，n’為6且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係OCH
2(CH
2)
n’，其中n’係選自1至10；且其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，n’係選自1至5，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，n’係選自1至3，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，n’係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為0。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為1。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為2。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為3。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為4。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，n’為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，n’為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，n’為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，n’為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為4，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，n’為5，m’為0且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為1且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為2且n”為5。在又一實施例中，n’為5，m’為3且n”為5。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4及其中X’係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10。
在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至3且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2且n”係選自0至2。在一特定實施例中，m為1且n”為0。在另一實施例中，m為2且n”為0。在又一實施例中，m為3且n”為0。在又一實施例中，m為4且n”為0。在一特定實施例中，m為1且n”為1。在另一實施例中，m為2且n”為1。在又一實施例中，m為3且n”為1。在又一實施例中，m為4且n”為1。在一特定實施例中，m為1且n”為2。在另一實施例中，m為2且n”為2。在又一實施例中，m為3且n”為2。在又一實施例中，m為4且n”為2。在一特定實施例中，m為1且n”為3。在另一實施例中，m為2且n”為3。在又一實施例中，m為3且n”為3。在又一實施例中，m為4且n”為3。在一特定實施例中，m為1且n”為4。在另一實施例中，m為2且n”為4。在又一實施例中，m為3且n”為4。在又一實施例中，m為4且n”為4。在一特定實施例中，m為1且n”為5。在另一實施例中，m為2且n”為5。在又一實施例中，m為3且n”為5。在又一實施例中，m為4且n”為5。在一特定實施例中，m為1且n”為6。在另一實施例中，m為2且n”為6。在又一實施例中，m為3且n”為6。在又一實施例中，m為4且n”為6。
在一實施例中，本發明提供血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2，其中m係選自1至4及其中X’係CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
在一實施例中，m係選自1至3，m’係選自0至4且n”係選自0至10。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至4且n”係選自0至5。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至3。在一實施例中，m係選自1至2，m’係選自0至2且n”係選自0至1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為1，m’為3且n”為0。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為0。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為0。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為0。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為0。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為1。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為1。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為1。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為1。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為1。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為1。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為2。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為2。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為2。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為2。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為2。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為2。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為3。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為3。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為3。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為3。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為3。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為3。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為4。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為4。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為4。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為4。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為4。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為4。
在一特定實施例中，m為1，m’為0且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為1且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為2且n”為5。在一特定實施例中，m為1，m’為3且n”為5。
在另一實施例中，m為2，m’為0且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為1且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為2且n”為5。在另一實施例中，m為2，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為3，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為3，m’為3且n”為5。
在又一實施例中，m為4，m’為0且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為1且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為2且n”為5。在又一實施例中，m為4，m’為3且n”為5。
1.6 本發明之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物之載體蛋白醣結合物之一種組分係純化多醣所結合之載體蛋白。術語「蛋白質載體」或「載體蛋白」或「載體」在本文中可互換使用。載體蛋白應適用於標準結合程序。
在一較佳實施例中，血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係選自由以下組成之群：DT (白喉類毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、CRM
197(白喉毒素之無毒但在抗原性上相同之變體)、其他DT突變體(例如CRM
176、CRM
228、CRM
45(Uchida等人，(1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844)、CRM
9、CRM
102、CRM
103或CRM
107；及由Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins，編者：Frankel, Maecel Dekker Inc. (1992)中所闡述之其他突變；Glu-148之缺失或至Asp、Gln或Ser之突變及/或Ala 158之缺失或至GIy之突變及揭示於美國專利第4,709,017號及第4,950,740號中之其他突變；至少一種或多種殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及揭示於美國專利第5,917,017號及第6,455,673號中之其他突變；或揭示於美國專利第5,843,711號中之片段)、肺炎球菌溶血素(ply) (Kuo等人，(1995) Infect lmmun 63:2706-2713) (包括以某一方式去毒之ply，例如dPLY-GMBS (WO 2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-甲醛)、PhtX (包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列揭示於WO 00/37105及WO 00/39299中)及Pht蛋白融合體(例如PhtDE融合體、PhtBE融合體、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/054007、WO 2009/000826)))、OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白，其通常提取自腦膜炎雙球菌(
Neisseria meningitidis)血清群B (EP0372501))、PorB (來自腦膜炎雙球菌)、PD (流感嗜血桿菌
(Haemophilus influenzae)蛋白D；例如參見EP0594610 B) )或其免疫功能等效物、合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、細胞介素、淋巴因子、生長因子或激素(WO 91/01146)、包含多個來自各種病原體源抗原之人類CD4+ T細胞表位之人工蛋白(Falugi等人，(2001) Eur J Immunol 31:3816-3824) (例如N19蛋白(Baraldoi等人，(2004) Infect lmmun 72:4884-4887))、肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)、鐵攝取蛋白(WO 01/72337)、難養芽胞梭菌(
Clostridium difficile)之毒素A或B (WO 00/61761)、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌黏附蛋白(PsaA)、重組銅綠假單胞菌(
Pseudomonas aeruginosa)外毒素A (尤其其無毒突變體(例如在麩胺酸553處具有取代之外毒素A (Douglas等人，(1987) J. Bacteriol. 169(11):4967-4971))。亦可使用其他蛋白質(例如卵白蛋白、鑰孔帽貝血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之經純化蛋白質衍生物(PPD))作為載體蛋白。其他適宜載體蛋白包括不活化之細菌毒素，例如霍亂類毒素(例如如WO 2004/083251中所闡述)、大腸桿菌(
Escherichia coli) LT、大腸桿菌ST及來自銅綠假單胞菌之外毒素A。另一適宜載體蛋白係來自鏈球菌(
Streptococcus)之C5a肽酶(SCP)。
在一較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係選自由以下組成之群：TT、DT、DT突變體(例如CRM
197)及來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在一實施例中，血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係DT (白喉類毒素)。在另一實施例中，血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係TT (破傷風類毒素)。
在另一實施例中，血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係PD (流感嗜血桿菌蛋白D；例如參見EP0594610 B)。
在一較佳實施例中，血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係CRM
197或來自鏈球菌之C5a肽酶(SCP)。
在一較佳實施例中，血清型3莢膜多醣結合至CRM
197蛋白。CRM
197蛋白係白喉毒素之無毒形式，但在免疫上無異於白喉毒素。CRM
197係由感染不產毒素之噬菌體β197
tox-之白喉棒狀桿菌(
Corynebacterium diphtheriae)產生，該不產毒素之噬菌體β197
tox-係藉由亞硝基胍誘變產毒素之棒狀噬菌體β所產生(Uchida等人，(1971) Nature New Biology 233:8-11)。CRM
197蛋白具有與白喉毒素相同之分子量，但其不同之處在於結構基因中之單一鹼基變化(鳥嘌呤至腺嘌呤)。此單一鹼基變化引起成熟蛋白質中之胺基酸取代(麩胺酸取代甘胺酸)且消除白喉毒素之毒性性質。CRM
197蛋白係醣之安全且有效之T細胞依賴性載體。關於CRM
197及其產生之其他細節可參見(例如)美國專利第5,614,382號。
在一實施例中，血清型3莢膜多醣結合至CRM
197蛋白。在一實施例中，血清型3莢膜多醣結合至CRM
197蛋白或CRM
197之A鏈(參見CN103495161)。在一實施例中，血清型3莢膜多醣結合至經由藉由基因重組大腸桿菌之表現獲得之CRM
197A鏈(參見CN103495161)。
在其他較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP (鏈球菌C5a肽酶)。
β-溶血性鏈球菌之兩種重要物種釀膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes) (A型鏈球菌
， GAS)及無乳鏈球菌(
Streptococcus agalactiae) (B型鏈球菌
，GBS)會引起自輕度咽炎及膿皰病病例至嚴重侵襲性疾病(例如壞死性筋膜炎(GAS)及新生兒敗血症(GBS))之各種嚴重人類感染，且已形成擊敗此免疫反應之方式。β-溶血性鏈球菌(包括GAS及GBS)之所有人類分離物皆產生特異性不活化C5a之高度保守之細胞壁蛋白SCP (鏈球菌C5a肽酶)。來自GAS及GBS之
scp基因編碼含有1,134至1,181個胺基酸之多肽(Brown等人，PNAS, 2005，第102卷，第51期，第18391-18396頁)。前31個殘基係輸出信號前序列且在通過細胞質膜後去除。接下來中之68個殘基用作原序列且必須去除以產生活性SCP。可去除接下來之10個殘基而不損失蛋白酶活性。在另一端，自Lys-1034開始係4個連續17-殘基基序，隨後係細胞分選及細胞壁附接信號。此組合信號係由含有LPTTND序列之20-殘基親水性序列、17-殘基疏水性序列及短鹼性羧基末端構成。
SCP可分成多個結構域(參見Brown等人，PNAS, 2005，第102卷，第51期第18391-18396頁之圖1B)。該等結構域係Pre/Pro結構域(其包含輸出信號前序列(通常係前31個殘基)及原序列(通常係接下來之68個殘基))、蛋白酶結構域(其分成兩個部分(蛋白酶部分1(通常係殘基89-333/334)及蛋白酶結構域部分2 (通常係殘基467/468-583/584))、蛋白酶相關結構域(PA結構域) (通常係殘基333/334-467/468)、三個III型纖連蛋白(Fn)結構域(Fn1，通常係殘基583/584-712/713；Fn2，通常係殘基712/713-928/929/930；Fn3，通常係殘基929/930-1029/1030/1031)及細胞壁錨結構域(通常係C-末端之殘基1029/1030/1031)。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係來自GBS之SCP (SCPB)。SCPB之一實例提供於WO97/26008之SEQ.ID.NO: 3處。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 3。
在另一較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係來自GAS之SCP (SCPA)。
SCPA之實例可參見WO97/26008之SEQ.ID.No.1及SEQ.ID.No.2。亦參見WO00/34487之SEQ ID NO: 1、2及23。
在一較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCP。
在其他較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係來自GBS之酶促惰性SCP (SCPB)。
在另一較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係來自GAS之酶促惰性SCP (SCPA)。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之片段。在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之片段。較佳地，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之片段。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP片段。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP片段。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域中之兩者但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP酶促惰性片段。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段。在一實施例中，該SCP之酶促惰性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域，但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之酶促惰性片段。在一實施例中，SCPA之該酶促惰性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域，但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一較佳實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之酶促惰性片段。較佳地，SCPB之該酶促惰性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域，但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
在一實施例中，藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸來不活化SCP之酶促活性。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。數字指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號肽酶中之胺基酸殘基位置。
因此，在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCP，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPA，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPB，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成。較佳地，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該代替係D130A。在另一實施例中，該代替係H193A。在另一實施例中，該代替係N295A。在又一實施例中，該代替係S512A。
在一實施例中，藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸來不活化SCP之酶促活性。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCP，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPA，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPB，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一種胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成。較佳地，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少兩個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及H193A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係D130A及N295A。較佳地，該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及N295A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係H193A及S512A。在一實施例中，該至少兩個胺基酸代替係N295A及S512A。
在一實施例中，藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸來不活化SCP之酶促活性。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCP，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPA，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPB，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少三個胺基酸所達成。較佳地，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少三個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及N295A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、H193A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係D130A、N295A及S512A。在一實施例中，該至少三個胺基酸代替係H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸來不活化SCP之酶促活性。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
因此，在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCP，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPA，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係酶促惰性SCPB，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCP之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPA之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少一種胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係SCPB之酶促惰性片段，其包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少四個胺基酸所達成。較佳地，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分1中。在一實施例中，至少四個胺基酸之該代替位於蛋白酶結構域之部分2中。在一實施例中，該至少四個胺基酸代替係D130A、H193A、N295A及S512A。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由SEQ ID NO: 41組成之SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由SEQ ID NO: 42組成之SCP酶促惰性片段。
SEQ ID NO: 41 :
MAKTADTPATSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIAAGFDKNH
EAWRLTDKAKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKT
AVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLAD
YARNYAQAIRDAINLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGV
SIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQL
TETVTVKTADQQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVKGK
IALIERGDIDFKDKIAKAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAF
ISRKDGLLLKDNPQKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKP
DIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTAMSAPLVAGIMGLLQEQYETQYPDMT
PSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYV
TDKDNTSSKVHLNNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKH
FALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLE
GFVRFKQDPKKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEAN
SDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESS
EITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGT
FLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTR
WDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATS
ATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTF
TLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQ
SEQ ID NO: 41長950個胺基酸。
SEQ ID NO: 42 :
AKTADTPATSKATIRDLNDPSQVKTLQEKAGKGAGTVVAVIAAGFDKNH
EAWRLTDKAKARYQSKEDLEKAKKEHGITYGEWVNDKVAYYHDYSKDGKT
AVDQEHGTHVSGILSGNAPSETKEPYRLEGAMPEAQLLLMRVEIVNGLAD
YARNYAQAIRDAINLGAKVINMSFGNAALAYANLPDETKKAFDYAKSKGV
SIVTSAGNDSSFGGKTRLPLADHPDYGVVGTPAAADSTLTVASYSPDKQL
TETVTVKTADQQDKEMPVLSTNRFEPNKAYDYAYANRGTKEDDFKDVKGK
IALIERGDIDFKDKIAKAKKAGAVGVLIYDNQDKGFPIELPNVDQMPAAF
ISRKDGLLLKDNPQKTITFNATPKVLPTASGTKLSRFSSWGLTADGNIKP
DIAAPGQDILSSVANNKYAKLSGTAMSAPLVAGIMGLLQEQYETQYPDMT
PSERLDLAKKVLMSSATALYDEDEKAYFSPRQQGAGAVDAKKASAATMYV
TDKDNTSSKVHLNNVSDKFEVTVTVHNKSDKPQELYYQATVQTDKVDGKH
FALAPKALYETSWQKITIPANSSKQVTVPIDASRFSKDLLAQMKNGYFLE
GFVRFKQDPKKEELMSIPYIGFRGDFGNLSALEKPIYDSKDGSSYYHEAN
SDAKDQLDGDGLQFYALKNNFTALTTESNPWTIIKAVKEGVENIEDIESS
EITETIFAGTFAKQDDDSHYYIHRHANGKPYAAISPNGDGNRDYVQFQGT
FLRNAKNLVAEVLDKEGNVVWTSEVTEQVVKNYNNDLASTLGSTRFEKTR
WDGKDKDGKVVANGTYTYRVRYTPISSGAKEQHTDFDVIVDNTTPEVATS
ATFSTEDRRLTLASKPKTSQPVYRERIAYTYMDEDLPTTEYISPNEDGTF
TLPEEAETMEGATVPLKMSDFTYVVEDMAGNITYTPVTKLLEGHSNKPEQ
SEQ ID NO: 42長949個胺基酸。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少90%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少95%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少99%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少99.5%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少99.8%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少99.85%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少90%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少95%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少99%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少99.5%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少99.8%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
在一特定實施例中，本發明之血清型3莢膜多醣醣結合物之載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少99.85%一致性之多肽組成的SCP酶促惰性片段。
2 免疫原組合物 2.1 本發明醣結合物之組合在一實施例中，本發明係關於包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之免疫原組合物。
在一實施例中，本發明係關於包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且包含1至25種不同醣結合物之免疫原組合物。
在一實施例中，本發明係關於包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且包含1至25種來自不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物(1至25種肺炎球菌結合物)之免疫原組合物。在一實施例中，本發明係關於包含來自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25種不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物之免疫原組合物。在一實施例中，免疫原組合物包含來自16或20種不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係14、15、16、17、18或19價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係16價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係19價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係20價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，免疫原組合物係21、22、23、24或25價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。在一實施例中，免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物。
在一實施例中，該免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型22F及33F之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型8、10A、11A、12F及15B之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型2之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型9N之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型17F之醣結合物。
在一實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型20之醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係8價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係11價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係13價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係15價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係20價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F及33F之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含至少一種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含20種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係21價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含21種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係22價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含至少一種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含22種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含23種選自由以下組成之群之醣結合物：來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係24價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、9N、15A、17F、20、23A、23B、24F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係10價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、9N、15A、17F、19A、19F、20、23A、23B、24F及35B之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係12價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係23價肺炎球菌結合物組合物。
在一實施例中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包含本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物且進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物。在一實施例中，免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
在一較佳實施例中，醣各自個別地結合至蛋白質載體之不同分子(蛋白質載體之每一分子僅具有與其結合之一種類型之糖)。在該實施例中，認為莢膜醣個別地結合至載體蛋白。較佳地，上述免疫原組合物之所有醣結合物皆個別地結合至載體蛋白。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型15B之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之醣結合物結合至CRM197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型8之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之醣結合物結合至CRM
197。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之醣結合物結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，任一上述免疫原組合物之醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在一實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之醣結合物個別地結合至PD。
在一實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型18C之醣結合物結合至TT。
在一實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型19F之醣結合物結合至DT。
在一實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之醣結合物個別地結合至PD，來自肺炎鏈球菌血清型18C之醣結合物結合至TT，且來自肺炎鏈球菌血清型19F之醣結合物結合至DT。
在一實施例中，上述免疫原組合物包含8至20種不同肺炎鏈球菌血清型。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少一種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，一種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少兩種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，兩種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少三種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，三種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少4種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，4種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少5種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，5種其他醣結合物結合至TT且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少一種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，一種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少兩種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，兩種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少三種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，三種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少4種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，4種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，至少5種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之醣結合物結合至SCP，5種其他醣結合物結合至SCP且其他醣結合物皆個別地結合至CRM
197。
本發明組合物可包括少量游離載體。在既定載體蛋白以游離及結合形式存在於本發明組合物中時，未結合形式較佳地不超過整體組合物中之載體蛋白總量之5%，且更佳地以小於2重量%存在。
2.2 本發明之免疫原組合物之劑量各劑量中之醣結合物之量選擇成在典型接種疫苗者中誘導免疫保護性反應而無顯著不良副作用之量。該量將端視所採用之特異性免疫原及其呈遞方式而變化。
免疫原組合物中之具體醣結合物之量可基於用於該結合物之總多醣(結合及未結合)來計算。舉例而言，具有20%游離多醣之醣結合物將在100 µg多醣劑量中具有約80 µg結合多醣及約20 µg未結合多醣。醣結合物之量可端視肺炎球菌血清型而變化。醣濃度可藉由醣醛酸分析來確定。
免疫原組合物中之不同多醣組分之「免疫原量」可有所不同且各自可包含約0.5 µg、約0.75 µg、約1 µg、約2 µg、約3 µg、約4 µg、約5 µg、約6 µg、約7 µg、約8 µg、約9 µg、約10 µg、約15 µg、約20 µg、約30 µg、約40 µg、約50 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg或約100 µg之任何特定多醣抗原。
通常，每一劑量將包含0.1 µg至100 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含0.1 µg至100 µg血清型3多醣。在一較佳實施例中，每一劑量將包含0.5 µg至20 µg。在一較佳實施例中，每一劑量將包含1.0 µg至10 µg。在一更佳實施例中，每一劑量將包含2.0 µg至5.0 µg血清型3多醣。考慮任一上述範圍內之任一整數以作為本發明之一實施例。
在一實施例中，每一劑量將包含約0.5 µg血清型3多醣。
在一實施例中，每一劑量將包含約0.55 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約0.75 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約1.0 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約1.1 µg血清型3多醣。
在一實施例中，每一劑量將包含約1.5 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約2.0 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約2.2 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約2.5 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約3.0 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約3.5 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約4.0 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約4.4 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約5.0 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約5.5 µg血清型3多醣。在一實施例中，每一劑量將包含約6.0 µg血清型3多醣。
通常，既定血清型之每一劑量將包含0.1 µg至100 µg多醣。在一實施例中，既定血清型之每一劑量將包含0.1 µg至100 µg多醣。在一較佳實施例中，每一劑量將包含0.5 µg至20 µg。在一較佳實施例中，每一劑量將包含1.0 µg至10 µg。在更佳實施例中，既定血清型之每一劑量將包含2.0 µg至5.0 µg多醣。考慮任一上述範圍內之任一整數以作為本發明之一實施例。
在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約0.5 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約0.55 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約0.75 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約1.0 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約1.1 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約1.5 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約2.0 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約2.2 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約2.5 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約3.0 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約3.5 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約4.0 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約4.4 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約5.0 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約5.5 µg多醣。在一實施例中，每一特定醣結合物之每一劑量將包含約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之醣結合物而言，每一劑量將包含約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之醣結合物而言，每一劑量將包含約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg、約2.2 µg、約2.4 µg、約2.6 µg、約2.8 µg、約3.0 µg、約3.2 µg、約3.4 µg、約3.6 µg、約3.8 µg、約4.0 µg、約4.2 µg、約4.4 µg、約4.6 µg、約4.8 µg、約5.0、約5.2 µg、約5.4 µg、約5.6 µg、約5.8 µg或約6.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言，每一劑量將包含約1.0 µg、約1.1 µg、約2.0 µg、約2.2 µg、約2.4 µg、約2.6 µg、約2.8 µg、約3.0 µg、約3.2 µg、約3.4 µg、約3.6 µg、約3.8 µg、約4.0 µg、約4.2 µg、約4.4 µg、約4.6 µg、約4.8 µg、約5.0、約5.2 µg、約5.4 µg、約5.6 µg、約5.8 µg或約6.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約1.0 µg至約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約1.0 µg至約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3 µg至約6 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約1.0 µg至約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約1.0 µg至約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及/或35B之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及/或35B之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言，每一劑量將包含約1.0 µg、約1.1 µg、約2.0 µg、約2.2 µg、約2.4 µg、約2.6 µg、約2.8 µg、約3.0 µg、約3.2 µg、約3.4 µg、約3.6 µg、約3.8 µg、約4.0 µg、約4.2 µg、約4.4 µg、約4.6 µg、約4.8 µg、約5.0、約5.2 µg、約5.4 µg、約5.6 µg、約5.8 µg或約6.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約1.0 µg至約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之醣結合物而言將包含約4.4 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及/或38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg、約0.55 µg、約0.75 µg、約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg之多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約0.5 µg至約1.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.0 µg多醣。
在一實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型2、3、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之每一醣結合物而言，每一劑量將包含約2.2 µg多醣。
2.3 載體量通常，每一劑量將包含10 µg至150 µg載體蛋白、尤其15 µg至100 µg載體蛋白、更尤其地25 µg至75 µg載體蛋白及甚至更尤其地40 µg至60 µg載體蛋白。在一實施例中，該載體蛋白係CRM
197。在一實施例中，該載體蛋白係SCP。
在一實施例中，每一劑量將包含約10 µg、約15 µg、約20 µg、約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg或約75 µg之載體蛋白。
在一實施例中，每一劑量將包含約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg或約75 µg之載體蛋白。
在一實施例中，每一劑量將包含約30 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約31 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約32 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約33 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約34 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約45 µg載體蛋白。
在一實施例中，每一劑量將包含約40 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約41 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約42 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約43 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約44 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約45 µg載體蛋白。
在一實施例中，每一劑量將包含約48 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約49 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約50 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約51 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約52 µg載體蛋白。在一實施例中，每一劑量將包含約53 µg載體蛋白。
在一實施例中，該載體蛋白係CRM
197。
在一實施例中，該載體蛋白係SCP。
2.4 其他抗原本發明之免疫原組合物包含結合之肺炎鏈球菌醣抗原(醣結合物)。其亦可進一步包括來自其他病原體、尤其來自細菌及/或病毒之抗原。較佳之其他抗原係選自：白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、百日咳抗原(P) (其通常為非細胞的(Pa))、B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、A型肝炎病毒(HAV)抗原、結合之b型流感嗜血桿菌莢膜醣(Hib)、不活化之脊髓灰白質炎病毒疫苗(IPV)。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。
百日咳抗原：百日咳博德氏菌(
Bordetella pertussis)會引起哮咳。疫苗中之百日咳抗原係細胞(完整細胞，呈不活化之百日咳博德氏菌細胞形式)或非細胞的。細胞百日咳抗原之製備在文獻中有充分記載(舉例而言，其可藉由熱不活化百日咳博德氏菌之I期培養物來獲得)。然而，較佳地，本發明使用非細胞抗原。在使用非細胞抗原時，較佳使用以下抗原中之一者、兩者或(較佳)三者：(1)去毒百日咳毒素(百日咳類毒素或PT)；(2)絲狀血球凝集素(FHA)；(3)百日咳菌素(亦稱為69千道爾頓外膜蛋白)。FHA及百日咳菌素可在用於本發明之前使用甲醛進行處理。較佳地，藉由使用甲醛及/或戊二醛進行處理來將PT去毒。非細胞百日咳抗原較佳地吸附於一或多種鋁鹽佐劑上。或者，其可以未吸附狀態添加。在添加百日咳菌素時，則其較佳地已吸附至氫氧化鋁佐劑上。PT及FHA可吸附至氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁上。最佳使PT、FHA及百日咳菌素皆吸附至氫氧化鋁。
不活化之脊髓灰白質炎病毒疫苗：脊髓灰白質炎病毒會引起脊髓灰白質炎。本發明之較佳實施例使用IPV，而非使用口服脊髓灰白質炎病毒疫苗。在投與患者之前，必須不活化脊髓灰白質炎病毒，且此可藉由使用甲醛進行處理來達成。脊髓灰白質炎可由三類脊髓灰白質炎病毒中之一者引起。該三種類型類似且引起相同症狀，但其抗原不同，且感染一種類型不會針對其他類型之感染進行保護。因此，在本發明中較佳使用三種脊髓灰白質炎病毒抗原：1型脊髓灰白質炎病毒(例如Mahoney株)、2型脊髓灰白質炎病毒(例如MEF-1株)及3型脊髓灰白質炎病毒(例如Saukett株)。較佳使病毒個別地生長、純化及不活化，且然後組合以獲得與本發明一起使用之三價本體混合物。
白喉類毒素：白喉棒狀桿菌會引起白喉。可對白喉毒素進行處理(例如使用福爾馬林(formalin)或甲醛)以去除毒性，同時保留在注射後誘導特異性抗毒素抗體之能力。將該等白喉類毒素用於白喉疫苗中。較佳白喉類毒素係藉由甲醛處理製備之彼等。白喉類毒素可藉由使白喉棒狀桿菌於生長培養基中生長、然後藉由甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。然後可藉由包含無菌過濾及/或透析之製程處理類毒素化材料。白喉類毒素較佳地吸附於氫氧化鋁佐劑上。
破傷風類毒素：破傷風梭菌(
Clostridium tetani)會引起破傷風。可對破傷風毒素進行處理以獲得保護性類毒素。將該等類毒素用於破傷風疫苗中。較佳破傷風類毒素係藉由甲醛處理製備之彼等。破傷風類毒素可藉由使破傷風梭菌於生長培養基中生長、然後藉由甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。然後可藉由包含無菌過濾及/或透析之製程處理該材料。
A型肝炎病毒抗原：A型肝炎病毒(HAV)係導致病毒性肝炎之已知因素中之一者。較佳HAV組分係基於不活化病毒，且不活化可藉由福爾馬林處理來達成。
B型肝炎病毒(HBV)係導致病毒性肝炎之已知因素中之一者。衣殼之主要組分係稱為HBV表面抗原或更通常而言HBsAg之蛋白質，其通常係分子量為約24 kDa之226胺基酸多肽。所有現有B型肝炎疫苗皆含有HBsAg，且當將此抗原投與正常接種疫苗者時，其刺激針對HBV感染進行保護之抗HBsAg抗體之產生。
對於疫苗製造而言，已以兩種方式製得HBsAg：自慢性B型肝炎載體之血漿純化呈微粒形式之抗原或藉由重組DNA方法(例如酵母細胞中之重組表現)表現該蛋白質。與天然HBsAg (亦即作為血漿純化產物)不同，酵母表現之HBsAg通常未經醣基化，且此係與本發明一起使用之最佳HBsAg形式。
結合之b型流感嗜血桿菌抗原：b型流感嗜血桿菌(Hib)會引起細菌性腦膜炎。Hib疫苗通常係基於莢膜醣抗原，該莢膜醣抗原之製備已有充分記載。Hib醣可結合至載體蛋白以增強其免疫原性，尤其係在兒童中。典型載體蛋白係破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM
197、流感嗜血桿菌蛋白D及來自血清群B腦膜炎球菌之外膜蛋白複合物。結合物之醣部分可包含全長聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP) (如自Hib細菌製得)及/或全長PRP之片段。Hib結合物可或可不吸附至鋁鹽佐劑上。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群A莢膜醣(MenA)、結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。
2.5 佐劑在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含至少一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含一種佐劑。在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含兩種佐劑。術語「佐劑」係指增強針對抗原之免疫反應之化合物或混合物。抗原可主要用作遞送系統、主要用作免疫調節劑或具有二者之較強特徵。適宜佐劑包括適用於哺乳動物(包括人類)之彼等。
已知可用於人類中之適宜遞送系統型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油型乳液(例如MF59 (4.3% w/v鯊烯/0.5% w/v聚山梨醇酯80 (Tween 80)/0.5% w/v去水山梨醇三油酸酯(Span 85)))、油包水型乳液(例如Montanide)及聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLG)微粒或奈米粒子。
在一實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含鋁鹽(明礬)作為佐劑(例如磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含磷酸鋁或氫氧化鋁作為佐劑。在一較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含磷酸鋁作為佐劑。
增強如本文所揭示之免疫原組合物之有效性之其他實例性佐劑包括(但不限於)：(1)水包油型乳液調配物(具或不具其他特異性免疫刺激劑，例如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁組分)，例如(a) SAF，其含有10%角鯊烷、0.4% Tween 80、5%普羅尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，將其微流化成次微米乳液或渦旋以產生較大粒徑乳液，及(b) RIBI™佐劑系統(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)，其含有2%鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組分，例如單磷醯脂質A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳地MPL + CWS (DETOX™)；(2)可使用皂素佐劑，例如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)，或自其產生之粒子，例如ISCOMs (免疫刺激複合物)，該ISCOMS可不含其他清潔劑(例如WO 00/07621)；(3)完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant, CFA)及不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant, IFA)；(4)細胞介素，例如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如WO 99/44636))、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬球菌落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯基脂質A (MPL)或3-O-去醯基化MPL (3dMPL) (例如參見GB-2220221、EP0689454)，當與肺炎球菌醣一起使用時視情況實質上缺乏明礬(例如參見WO 00/56358)；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油型乳液之組合(例如參見EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如參見WO 99/52549)；(8)聚氧乙烯去水山梨醇酯表面活性劑與辛苯昔醇之組合(例如WO 01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其他非離子型表面活性劑(例如辛苯昔醇(octoxynol))之組合(例如WO 01/21152)；(9)皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸) (例如WO 00/62800)；(10)免疫刺激劑及金屬鹽粒子(例如參見WO 00/23105)；(11)皂素及水包油型乳液(例如WO 99/11241)；(12)皂素(例如QS21) + 3dMPL + IM2 (視情況+固醇) (例如WO 98/57659)；(13)作為免疫刺激劑起增強組合物效能作用之其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含CpG寡核苷酸作為佐劑。除非另外指明，否則本文所用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且因此該等術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG基序，其視情況在某些較佳鹼基背景內為未甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸。CpG免疫刺激性基序之甲基化狀態通常係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸係含有藉由磷酸酯鍵連接至3'鳥嘌呤之5'未甲基化胞嘧啶且經由結合至類鐸受體9 (TLR-9)活化免疫系統之寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，其將經由TLR9活化免疫系統，但不如CpG基序未甲基化時強。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個進而可涵蓋CpG二核苷酸之回文結構。CpG寡核苷酸已闡述於多個已頒佈專利、公開專利申請案及其他公開案中，包括美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號；第及6,339,068號。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行所闡述之任一CpG寡核苷酸。
業內已鑑別出CpG免疫刺激性寡核苷酸之不同種類。該等種類稱為A類、B類、C類及P類，且更詳細闡述於WO 2010/125480之第3頁第22行至第12頁第36行中。本發明方法涵蓋該等不同種類之CpG免疫刺激性寡核苷酸之應用。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含A類CpG寡核苷酸。較佳地，本發明之「A類」 CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’ GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’ (SEQ ID NO: 1)。A類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5’ G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’ (SEQ ID NO: 2)；其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含B類CpG寡核苷酸。在一實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸係由至少下式表示之B類CpG寡核苷酸：
5' X
1X
2CGX
3X
43’，其中X1、X2、X3及X4為核苷酸。在一實施例中，X
2係腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。在另一實施例中，X
3係胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。
本發明之B類CpG寡核苷酸序列係上文所廣泛闡述以及揭示於WO 96/02555、WO 98/18810及美國專利第6,194,388號、第6,207,646號、第6,214,806號、第6,218,371號、第6,239,116號及第6,339,068號中之彼等。實例性序列包括(但不限於)揭示於該等後續申請案及專利中之彼等。
在一實施例中，本發明之「B類」 CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’ (SEQ ID NO: 3)，或
5’ TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’ (SEQ ID NO: 4)，或
5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 5)，或
5’ TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 6)，或
5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’ (SEQ ID NO: 7)。
在該等序列中之任一者中，所有鍵聯皆可為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在該等序列中之任一者中，一或多個鍵聯可為較佳地介於CpG基序之「C」與「G」之間之磷酸二酯，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
B類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 8)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 9)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 10)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 11)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’ (SEQ ID NO: 12)
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含C類CpG寡核苷酸。在一實施例中，本發明之「C類」 CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：
5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 13)，或
5’ TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 14)，或
5’ TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 15)，或
5’ TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 16)，或
5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 17)，或
5’ TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 18)，或
5’ TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 19)，或
5’ TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 20)，或
5’ TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 21)，或
5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 22)，或
5’ TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 23)，或
5’ TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’ (SEQ ID NO: 24)，或
5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’ (SEQ ID NO: 25)。
在該等序列中之任一者中，所有鍵聯皆可為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在該等序列中之任一者中，一或多個鍵聯可為較佳地介於CpG基序之「C」與「G」之間之磷酸二酯，從而產生半軟CpG寡核苷酸。
C類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：
5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 26)，或
5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 27)，或
5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 28)，或
5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 29)，或
5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 30)，或
5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 31)，或
5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 32)，或
5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 33)，或
5’ T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 34)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 35)，或
5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 36)，或
5’ T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 37)，或
5’ T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’ (SEQ ID NO: 38)
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
在本發明之一實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含P類CpG寡核苷酸。在一實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸係含有5' TLR活化結構域及至少兩個回文區域之P類CpG寡核苷酸，一個回文區域係長度為至少6個核苷酸之5'回文區域且直接或經由間隔體連結至長度為至少8個核苷酸之3'回文區域，其中寡核苷酸包含至少一個YpR二核苷酸。在一實施例中，該寡核苷酸不為T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27)。在一實施例中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未甲基化CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化結構域係TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一實施例中，TLR活化結構域位於5'回文區域內。在另一實施例中，TLR活化結構域緊鄰5'回文區域之5'端。
在一實施例中，本發明之「P類」 CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’ TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 39)。
在該等序列中，所有鍵聯皆可為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，一或多個鍵聯可為較佳地介於CpG基序之「C」與「G」之間之磷酸二酯，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。
P類寡核苷酸之非限制性實例包括：
5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 40)
其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。
在一實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵聯。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵聯皆為硫代磷酸酯鍵聯。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵聯。在另一實施例中，磷酸二酯樣鍵聯係磷酸二酯鍵聯。在另一實施例中，親脂性基團結合至寡核苷酸。在一實施例中，親脂性基團係膽固醇。
在一實施例中，本文所揭示CpG寡核苷酸之所有核苷酸間鍵聯皆係磷酸二酯鍵(「軟」寡核苷酸，如WO 2007/026190中所闡述)。在另一實施例中，使本發明之CpG寡核苷酸抵抗降解(例如經穩定化)。「穩定化寡核苷酸」係指相對抵抗活體內降解(例如經由外切酶或內切酶)之寡核苷酸。核酸穩定化可經由主鏈修飾來達成。具有硫代磷酸酯鍵聯之寡核苷酸提供最大活性且保護寡核苷酸免於細胞內外切酶及內切酶之降解。
免疫刺激性寡核苷酸可具有具磷酸二酯及硫代磷酸酯鍵聯之組合之嵌合主鏈。出於本發明目的，嵌合主鏈係指部分穩定化之主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵聯係磷酸二酯鍵或磷酸二酯樣鍵聯，且其中至少一個其他核苷酸間鍵聯係穩定化核苷酸間鍵聯，其中至少一個磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵聯與至少一個穩定化鍵聯不同。在磷酸二酯鍵聯優先位於CpG基序內時，該等分子稱為「半軟」分子，如WO 2007/026190中所闡述。
其他經修飾之寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或對乙氧基鍵聯之組合。
混合主鏈經修飾ODN可如WO 2007/026190中所闡述來合成。
CpG寡核苷酸之大小(亦即沿寡核苷酸長度之核苷酸殘基數)亦可有助於寡核苷酸之刺激活性。為促進吸收至細胞中，本發明之CpG寡核苷酸較佳具有6核苷酸殘基之最小長度。若存在足夠的免疫刺激性基序，則大於6個核苷酸(甚至許多kb長)之任一大小之寡核苷酸皆能夠誘導免疫反應，此乃因較大寡核苷酸在細胞內部被降解。在某些實施例中，CpG寡核苷酸長6至100個核苷酸，優先地長8至30個核苷酸。在重要實施例中，本發明之核酸及寡核苷酸並非質體或表現載體。
在一實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸包含(例如)鹼基及/或糖中之取代或修飾，如WO 2007/026190之第134段至第147段中所闡述。
在一實施例中，本發明之CpG寡核苷酸經化學修飾。化學修飾之實例為熟習此項技術者所已知且闡述於(例如)以下文獻中：Uhlmann等人，(1990) Chem. Rev. 90:543；S. Agrawal編輯，Humana Press, Totowa, USA 1993；Crooke等人，(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker等人，(1995) Mod. Synth. Methods 7:331-417。與由天然DNA或RNA構成之相同序列之寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸可具有一或多個修飾，其中每一修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋及/或特定β-D-核糖單元及/或特定天然核苷鹼位置處。
在本發明之一些實施例中，可根據熟習此項技術者已知之方法簡單地混合含有CpG之核酸與免疫原載體(例如參見WO 03/024480)。
在本發明之一特定實施例中，本文所揭示之任一免疫原組合物包含2 μg至100 mg CpG寡核苷酸。在本發明之一特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含0.1 mg至50 mg CpG寡核苷酸、較佳地0.2 mg至10 mg CpG寡核苷酸、更佳地0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸。在本發明之一特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸。甚至較佳地，本發明之免疫原組合物可包含0.5 mg至2 mg CpG寡核苷酸。最佳地，本發明之免疫原組合物可包含0.75 mg至1.5 mg CpG寡核苷酸。在一較佳實施例中，本文所揭示之任一免疫原組合物可包含約1 mg CpG寡核苷酸。
3 調配物本發明之免疫原組合物可調配成液體形式(亦即溶液或懸浮液)或凍乾形式。在一實施例中，本發明之免疫原組合物調配成液體形式。在一實施例中，本發明之免疫原組合物調配成凍乾形式。液體調配物可有利地直接自其封裝形式投與，且因此理想地用於注射而無需在水性培養基中重構為本發明凍乾組合物所需之其他形式。
本發明之免疫原組合物之調配可使用業內公認之方法來達成。舉例而言，可使用生理上可接受之媒劑調配個別多醣及/或結合物以製備組合物。該等媒劑之實例包括(但不限於)水、緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。
本發明提供一種免疫原組合物，其包含本文所揭示之醣結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載體或稀釋劑之任一組合。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物係呈液體形式，較佳呈水性液體形式。
本發明之免疫原組合物可包含以下各項中之一或多者：緩衝液、鹽、二價陽離子、非離子型清潔劑、低溫保護劑(例如糖)及抗氧化劑(例如自由基清除劑或螯合劑)或其任何多個組合。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含緩衝液。在一實施例中，該緩衝液之pKa為約3.5至約7.5。在一些實施例中，緩衝液係磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸或檸檬酸鹽。在一些實施例中，緩衝液係琥珀酸鹽。在一些實施例中，緩衝液係組胺酸。在某些實施例中，緩衝液係最終濃度為1 mM至10 mM之琥珀酸鹽。在一特定實施例中，琥珀酸鹽緩衝液之最終濃度為約5 mM。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含鹽。在一些實施例中，鹽係選自由以下組成之群：氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合。在一特定實施例中，鹽係氯化鈉。在一特定實施例中，本發明之免疫原組合物包含150 mM之氯化鈉。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物包含表面活性劑。在一實施例中，表面活性劑係選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20 (TWEEN
TM20)、聚山梨醇酯40 (TWEEN
TM40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™ 60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™ 65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™ 80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™ 85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯醇醚40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯80。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯80 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯80 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯80 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.02%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.01%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.03%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.04%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.05%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係1%聚山梨醇酯80 (w/w)。
在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯20。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯20 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯20 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯20 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係0.02%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係0.01%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係0.03%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.04%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係0.05%聚山梨醇酯20 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯20之最終濃度係1%聚山梨醇酯20 (w/w)。
在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯40。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯40之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯40 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯40之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯40 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯40之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯40 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯40之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯40 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯40之最終濃度係1%聚山梨醇酯40 (w/w)。
在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯60。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯60之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯60 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯60之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯60 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯60之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯60 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯60之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯60 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯60之最終濃度係1%聚山梨醇酯60 (w/w)。
在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯65。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯65之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯65 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯65之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯65 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯65之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯65 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯65之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯65 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯65之最終濃度係1%聚山梨醇酯65 (w/w)。
在一特定實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯85。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯85之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯85 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯85之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯85 (重量/重量，w/w)。在一些此類實施例中，調配物中聚山梨醇酯85之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯85 (重量/重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯85之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯85 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯85之最終濃度係1%聚山梨醇酯85 (w/w)。
在某些實施例中，本發明之免疫原組合物具有5.5至7.5之pH，更佳5.6至7.0之pH，甚至更佳5.8至6.0之pH。
在一實施例中，本發明提供填充有本文所揭示之任一免疫原組合物之容器。在一實施例中，容器係選自由以下組成之群：小瓶、注射器、燒瓶、發酵罐、生物反應器、袋、罐、安瓿、柱及可棄式筆。在某些實施例中，容器經矽化。
在一實施例中，本發明容器係由玻璃、金屬(例如鋼、不銹鋼、鋁等)及/或聚合物(例如熱塑性體、彈性體、熱塑性彈性體)製得。在一實施例中，本發明容器係由玻璃製得。
在一實施例中，本發明提供填充有本文所揭示之任一免疫原組合物之注射器。在某些實施例中，注射器經矽化及/或由玻璃製得。
本發明之免疫原組合物用於注射之典型劑量具有0.1 mL至2 mL之體積。在一實施例中，用於注射之本發明之免疫原組合物具有0.2 mL至1 mL之體積、甚至更佳地約0.5 mL之體積。
4 本發明之醣結合物及免疫原組合物之用途本文所揭示之醣結合物可用作抗原。舉例而言，其可為疫苗之一部分。
因此，在一實施例中，本發明之免疫原組合物用作藥劑。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物用作疫苗。
因此，在一實施例中，本文所闡述之免疫原組合物用於在受試者生成免疫反應。在一態樣中，受試者係哺乳動物，例如人類、非人類靈長類動物、貓、綿羊、豬、馬、牛或狗。在一態樣中，受試者係人類。
本文所闡述之免疫原組合物可於治療性或預防性方法中用於預防、治療或改善受試者之細菌感染、疾病或病狀。特定而言，本文所闡述之免疫原組合物可用於預防、治療或改善受試者之肺炎鏈球菌血清型3感染、疾病或病狀。
因此，在一態樣中，本發明提供預防、治療或改善受試者之與肺炎鏈球菌血清型3有關之感染、疾病或病狀的方法，其包含向受試者投與免疫有效量之本發明之免疫原組合物。
在一些此類實施例中，感染、疾病或病狀係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。
在一實施例中，本發明提供誘導受試者之針對肺炎鏈球菌血清型3之免疫反應的方法，其包含向受試者投與免疫有效量之本發明之免疫原組合物。在一態樣中，受試者係哺乳動物，例如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛或狗。在一態樣中，受試者係人類。
在一實施例中，本文所揭示之免疫原組合物用作疫苗。在該等實施例中，本文所闡述之免疫原組合物可用於預防受試者之肺炎鏈球菌血清型3感染。因此，在一態樣中，本發明提供預防受試者之肺炎鏈球菌血清型3感染之方法，其包含向受試者投與免疫有效量之本發明之免疫原組合物。在一些此類實施例中，感染係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。在一態樣中，受試者係哺乳動物，例如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛或狗。在一態樣中，受試者係人類。
本發明之免疫原組合物可用於藉助經由全身或黏膜途徑投與該等免疫原組合物來保護易受肺炎鏈球菌血清型3感染之人類或治療肺炎鏈球菌血清型3感染。在一實施例中，本發明之免疫原組合物係藉由肌內、腹膜腔內、皮內或皮下途徑來投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物係藉由肌內、腹膜腔內、皮內或皮下注射來投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物係藉由肌內或皮下注射來投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物係藉由肌內注射來投與。在一實施例中，本發明之免疫原組合物係藉由皮下注射來投與。
5 擬使用本發明之免疫原組合物治療之受試者如本文所揭示，本文所闡述之免疫原組合物可於多種治療或預防性方法中用於預防、治療或改善受試者之細菌感染、疾病或病狀。
在一較佳實施例中，該受試者係人類。在一最佳實施例中，該受試者係新生兒(亦即，年齡在三個月以下)、嬰兒(亦即，年齡為3個月至一歲)或幼兒(亦即，年齡為一歲至四歲)。
在一實施例中，本文所揭示之免疫原組合物用作疫苗。
在此類實施例中，擬接種疫苗之受試者之年齡可小於1歲。舉例而言，擬接種疫苗之受試者之年齡可為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12個月。在一實施例中，擬接種疫苗之受試者之年齡為約2個月、約4個月或約6個月。在另一實施例中，擬接種疫苗之受試者之年齡小於2歲。舉例而言，擬接種疫苗之受試者之年齡可為約12個月至約15個月。在一些情形下，需要少至一個劑量之本發明之免疫原組合物，但在一些情況下，可給出第二、第三或第四劑量(參見下文之章節8)。
在本發明之一實施例中，擬接種疫苗之受試者係年齡為50歲或以上之成年人類，更佳年齡為55歲或以上之成年人類。在一實施例中，擬接種疫苗之受試者係年齡為65歲或以上、年齡為70歲或以上、年齡為75歲或以上或年齡為80歲或以上之成年人類。
在一實施例中，擬接種疫苗之受試者係免疫受損之個體、尤其人類。免疫受損之個體通常定義為展現減弱或降低的引起針對感染物之攻擊之正常體液或細胞防禦之能力的人。
在本發明之一實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者患有損害免疫系統且引起不足以防止或治療肺炎球菌性疾病之抗體反應的疾病或病狀。
在一實施例中，該疾病係原發性免疫缺陷病症。較佳地，該原發性免疫缺陷病症係選自由以下組成之群：組合的T細胞及B細胞免疫缺陷、抗體缺陷、經明確定義之症候群、免疫失調疾病、吞噬細胞病症、固有免疫缺陷、自體發炎性病症及補體缺陷。在一實施例中，該原發性免疫缺陷病症係選自WO 2010/125480之第24頁第11行至第25頁第19行中所揭示者。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者患有選自由以下組成之群之疾病：HIV感染、獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)、癌症、慢性心臟或肺病症、鬱血性心臟衰竭、糖尿病、慢性肝病、酒精中毒、硬化、脊髓液洩露、心肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障礙(例如鐮形血球疾病)、脾功能缺乏(無脾)、惡性血液病、白血病、多發性骨髓瘤、何傑金氏病(Hodgkin’s disease)、淋巴瘤、腎衰竭、腎病症候群及氣喘。
在本發明之一實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者患有營養失調。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者正服用降低身體對感染之抗性之藥物或治療劑。在一實施例中，該藥物係選自WO 2010/125480之第26頁第33行至第26頁第4行中所揭示者。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者係吸煙者。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者之白血細胞計數(白血球計數)小於5 × 10
9個細胞/公升或小於4 × 10
9個細胞/公升或小於3 × 10
9個細胞/公升或小於2 × 10
9個細胞/公升或小於1 × 10
9個細胞/公升或小於0.5 × 10
9個細胞/公升或小於0.3 × 10
9個細胞/公升或小於0.1 × 10
9個細胞/公升。
白血細胞計數(白血球計數)：血液中之白血細胞(WBC)數量。WBC通常係作為CBC (全血計數)之部分來量測。白血細胞係血液中之抗感染細胞且不同於紅(攜載氧)血細胞(稱為紅血球)。存在不同類型之白血細胞，包括嗜中性球(多形核白血球；PMN)、桿狀核細胞(稍不成熟之嗜中性球)、T型淋巴球(T細胞)、B型淋巴球(B細胞)、單核球、嗜伊紅血球及嗜鹼性球。白血細胞之所有類型係以白血細胞計數來反映。白血細胞計數之正常範圍通常介於4,300與10,800個細胞/立方毫米血液之間。此亦可提及為白血球計數且可以國際單位表示為4.3 - 10.8 × 10
9個細胞/公升。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者患有嗜中性球減少症。在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者之嗜中性球計數小於2 × 10
9個細胞/公升或小於1 × 10
9個細胞/公升或小於0.5 × 10
9個細胞/公升或小於0.1 × 10
9個細胞/公升或小於0.05 × 10
9個細胞/公升。
低白血細胞計數或「嗜中性球減少症」係特徵在於循環血液中之嗜中性球量異常低的病狀。嗜中性球係有助於預防及抵抗感染之特定類型之白血細胞。癌症患者經歷嗜中性球減少症之最常見原因在於化學療法之副作用。化學療法引起之嗜中性球減少症增加患者感染之風險且破壞癌症治療。
在本發明之一特定實施例中，擬接種疫苗之免疫受損受試者具有小於500/mm
3之CD4+細胞計數或小於300/mm
3之CD4+細胞計數或小於200/mm
3之CD4+細胞計數、小於100/mm
3之CD4+細胞計數、小於75/mm
3之CD4+細胞計數或小於50/mm
3之CD4+細胞計數。
CD4細胞測試通常報告為mm
3中之細胞數。正常CD4計數介於500與1,600之間，且CD8計數介於375與1,100之間。CD4計數在患有HIV之個人中顯著降低。
在本發明之一實施例中，本文所揭示之任一免疫受損受試者係男性或女性。
6 方案在一些情形下，需要少至一個劑量之本發明之免疫原組合物，但在一些情況(例如較大免疫缺陷之病狀)下，可給出第二、第三或第四劑量。在初始接種疫苗後，受試者可接受一個或若干個適當間隔之加強免疫。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物之接種疫苗時間表係單劑量時間表。在一特定實施例中，該單劑量時間表係用於至少2歲之健康人。
在一實施例中，本發明之免疫原組合物之接種疫苗時間表係多劑量時間表。在一特定實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之2個劑量組成。在一特定實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月間隔之2個劑量或一系列相隔約2個月間隔之2個劑量組成。
在另一實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之3個劑量組成。在另一實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月間隔之3個劑量或一系列相隔約2個月間隔之3個劑量組成。
在另一實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量組成。在另一實施例中，該多劑量時間表係由一系列相隔約1個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量或一系列相隔約2個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量組成。
在一實施例中，多劑量時間表係由生命第一年中之至少一個劑量(例如1個、2個或3個劑量)、隨後至少一個幼兒劑量組成。
在一實施例中，多劑量時間表係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約1個月至約2個月(例如劑量之間為28-56天)間隔之2個或3個劑量及隨後在年齡為12-18個月時之幼兒劑量組成。在一實施例中，該多劑量時間表係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約1個月至約2個月(例如劑量之間為28-56天)間隔之3個劑量及隨後在年齡為12-15個月時之幼兒劑量組成。在另一實施例中，該多劑量時間表係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約2個月間隔之2個劑量及隨後在年齡為12-18個月時之幼兒劑量組成。
在一實施例中，多劑量時間表係由在年齡為2個月、4個月、6個月及12-15個月時疫苗之4劑量系列組成。
在一實施例中，在第0天給予初次劑量，且以介於約2週至約24週範圍內之間隔、較佳使用4-8週之投藥間隔給予一或多個加強。
在一實施例中，在第0天給予初次劑量，且在約3個月後給予加強。
7. 本發明亦提供如下列編號段落 1 至 84 中所定義之下列實施例 ：1. 一種製備肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之方法，其包含以下步驟：
(a)使經分離肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接體在非質子溶劑中進行反應以產生經活化疊氮基多醣，
(b)使載體蛋白與具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，其中該NHS部分與胺基進行反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白，
(c)藉由Cu
+1介導之疊氮化物-炔烴環加成反應使步驟(a)之該經活化疊氮基多醣與步驟(b)之該經活化炔烴-載體蛋白進行反應以形成醣結合物。
2. 如段落1之方法，其中在該活化步驟(a)之前分篩該經分離多醣。
3. 如段落2之方法，其中將該經分離血清型3莢膜多醣分篩至重量平均分子量介於100 kDa與200 kDa之間。
4. 如段落1至3中任一項之方法，其中該碳酸衍生物係選自由以下組成之群：1,1’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺基酯(DSC)及氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯。
5. 如段落1至3中任一項之方法，其中該碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(CDI)。
6. 如段落1至3中任一項之方法，其中該碳酸衍生物係1,1'-羰基-二-(1,2,4-三唑) (CDT)。
7. 如段落1至6中任一項之方法，其中該疊氮基連接體係式(I)化合物，
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n係選自1至10且m係選自1至4。
8. 如段落1至6中任一項之方法，其中該疊氮基連接體係式(II)化合物，
。
9. 如段落1至8中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
10. 如段落1至8中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
11. 如段落1至8中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(III)化合物，
(III)
其中X係選自由CH
2O(CH
2)
nCH
2C=O及CH
2O(CH
2CH
2O)
m(CH
2)
nCH
2C=O組成之群，其中n係選自0至10且m係選自0至4。
12. 如段落1至8中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(IV)化合物：
。
13. 如段落1至12中任一項之方法，其中步驟a)包含在非質子溶劑中使該多醣與碳酸衍生物進行反應且隨後使經碳酸衍生物活化之多醣與疊氮基連接體進行反應以產生經活化疊氮基多醣。
14. 如段落1至13中任一項之方法，其中在步驟a)處，使該經分離多醣與該碳酸衍生物在非質子溶劑中進行反應。
15. 如段落1至13中任一項之方法，其中在步驟a)處，使該經分離多醣與碳酸衍生物在基本上由二甲基亞碸(DMSO)組成之溶液中進行反應。
16. 如段落1至14中任一項之方法，其中在步驟a)處，使該經分離多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之非質子溶劑中進行反應。
17. 如段落1至14中任一項之方法，其中在步驟a)處，使該分離多醣與CDI在包含0.1%至1% (v/v)水之DMSO中進行反應。
18. 如段落1至17中任一項之方法，其中在步驟a)處，碳酸衍生物活化係在添加水後進行。
19. 如段落18之方法，其中添加水以使混合物中之總水含量介於約1%至約10% (v/v)之間。
20. 如段落1至19中任一項之方法，其中步驟a)進一步包含使該經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係該活化多醣中多醣重複單元量之0.01至10莫耳當量。
21. 如段落1至20中任一項之方法，其中在步驟a)後該活化多醣之活化度介於0.5%至50%之間。
22. 如段落1至21中任一項之方法，其中步驟b)包含使該載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係該載體上離胺酸之0.1至10莫耳當量。
23. 如段落1至22中任一項之方法，其中在步驟b)後該活化載體之活化度介於1與50之間。
24. 如段落1至23中任一項之方法，其中結合反應c)係於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)存在下來實施。
25. 如段落1至23中任一項之方法，其中結合反應c)係於水性緩衝液中在氧化劑及作為觸媒之銅(I)存在下來實施。
26. 如段落1至23中任一項之方法，其中結合反應c)係於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)及作為氧化劑之抗壞血酸鹽存在下來實施，其中反應混合物進一步包含THPTA (參(3-羥丙基三唑基甲基)胺)及胺基胍。
27. 如段落1至26中任一項之方法，其中步驟c)處經活化疊氮基多醣對經活化炔烴-載體之初始輸入比(重量/重量)介於0.1與3之間。
28. 如段落1至27中任一項之方法，其中在步驟c)後，該方法進一步包含使用疊氮基封端劑將保留於該結合物中之未反應疊氮基封端之步驟。
29. 如段落28之方法，其中該疊氮基封端劑係式(V)化合物，
其中X係(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
30. 如段落28之方法，其中該疊氮基封端劑係炔丙醇。
31. 如段落28至30中任一項之方法，其中使用一定量之封端劑來實施該等未反應疊氮基之該封端，該量係該活化多醣中多醣重複單元量之0.05至20莫耳當量。
32. 如段落1至31中任一項之方法，其中在步驟c)後，該方法進一步包含使用炔基封端劑將保留於該結合物中之未反應炔基封端之步驟。
33. 如段落32之方法，其中該炔基封端劑係具有疊氮基之試劑。
34. 如段落33之方法，其中該炔基封端劑係式(VI)化合物，
其中X係(CH
2)
n，其中n係選自1至15。
35. 如段落32之方法，其中該炔基封端劑係3-疊氮基-1-丙醇。
36. 如段落32至35中任一項之方法，其中使用一定量之封端劑來實施該等未反應炔基之該封端，該量係該活化多醣中多醣重複單元量之0.05至20莫耳當量。
37. 如段落1至36中任一項之方法，其中該方法進一步包含在產生之後純化該醣結合物之步驟。
38. 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其係根據如段落1至37中任一項之方法所產生。
39. 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之肺炎鏈球菌血清型3醣且具有通式(VII)：
其中X係選自由以下組成之群：CH
2(CH
2)
n’、(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、NHCO(CH
2)
n’、NHCO(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2、OCH
2(CH
2)
n’及O(CH
2CH
2O)
mCH
2CH
2；其中n’係選自1至10且m係選自1至4，
且其中X'係選自由以下組成之群：CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O、CH
2O(CH
2CH
2O)
m’(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”係選自0至10且m’係選自0至4。
40. 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之肺炎鏈球菌血清型3醣且具有通式(VII)，其中X係CH
2(CH
2)
n’，其中n’為2；且其中X’係CH
2O(CH
2)
n”CH
2C=O，其中n”為1。
41. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於10 kDa與2,000 kDa之間。
42. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於50 kDa與300 kDa之間。
43. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於75 kDa與200 kDa之間。
44. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於100 kDa與200 kDa之間。
45. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於125 kDa與200 kDa之間。
46. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)為約200 kDa。
47. 如段落38至40中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)為約150 kDa。
48. 如段落38至47中任一項之血清型3醣結合物，其具有介於250 kDa與20,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
49. 如段落38至47中任一項之血清型3醣結合物，其具有介於500 kDa與5,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
50. 如段落38至47中任一項之血清型3醣結合物，其具有介於750 kDa與2,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
51. 如段落38至47中任一項之血清型3醣結合物，其具有介於1,000 kDa與4,000 kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
52. 如段落38至51中任一項之血清型3醣結合物，其中該血清型3醣結合物之結合度介於2與15之間。
53. 如段落38至52中任一項之血清型3醣結合物，其中該醣結合物(w/w)中血清型3多醣對載體蛋白之比率介於0.5與3.0之間。
54. 如段落38至52中任一項之血清型3醣結合物，其中對於該多醣之每4個醣重複單元，該血清型3醣結合物在該載體蛋白與該多醣之間包含至少一個共價鍵聯。
55. 如段落38至52中任一項之血清型3醣結合物，其中對於該多醣之每25個醣重複單元，該血清型3醣結合物在該載體蛋白與該多醣之間包含至少一個共價鍵聯。
56. 如段落38至52中任一項之血清型3醣結合物，其中對於該多醣之每5至10個醣重複單元，該血清型3醣結合物在該載體蛋白與該多醣之間包含至少一個共價鍵聯。
57. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係CRM
197。
58. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係SCP。
59. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係酶促惰性SCP。
60. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係來自GBS之酶促惰性SCP (SCPB)。
61. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係SCPB之片段。
62. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP片段。
63. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係SCP之酶促惰性片段。在一實施例中，該SCP之酶促惰性片段包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域，但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域。
64. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少一個胺基酸所達成且其中該代替係選自由以下組成之群：D130A、H193A、N295A及S512A，其中數字指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號肽酶中之胺基酸殘基位置。
65. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係包含蛋白酶結構域、蛋白酶相關結構域(PA結構域)及三個III型纖連蛋白(Fn)結構域但不包含輸出信號前序列、原序列及細胞壁錨結構域之SCP酶促惰性片段，其中該不活化係藉由代替野生型序列之至少兩個胺基酸所達成，其中該至少兩個胺基酸代替係D130A及S512A，其中數字指示根據WO00/34487之SEQ ID NO: 1之編號肽酶中之胺基酸殘基位置。
66. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係由與SEQ ID NO: 41具有至少95%一致性之多肽組成之SCP酶促惰性片段。
67. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係由與SEQ ID NO: 42具有至少95%一致性之多肽組成之SCP酶促惰性片段。
68. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係由SEQ ID NO: 41組成之SCP酶促惰性片段。
69. 如段落38至56中任一項之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係由SEQ ID NO: 42組成之SCP酶促惰性片段。
70. 一種免疫原組合物，其包含如段落38至69中任一項之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物。
71. 如段落70之免疫原組合物，其包含1至25種來自不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。
72. 如段落70之免疫原組合物，其包含來自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25種不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。
73. 如段落70之免疫原組合物，其係15價肺炎球菌結合物組合物。
74. 如段落70之免疫原組合物，其係20價肺炎球菌結合物組合物。
75. 如段落70至74中任一項之免疫原組合物，其包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之醣結合物。
76. 如段落75之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之醣結合物。
77. 如段落76之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之醣結合物。
78. 如段落77之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型22F及33F之醣結合物。
79. 如段落78之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型8、10A、11A、12F及15B之醣結合物。
80. 如段落70之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之醣結合物，其中該免疫原組合物係13價肺炎球菌結合物組合物。
81. 如段落70之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物，其中該免疫原組合物係15價肺炎球菌結合物組合物。
82. 如段落70之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物，其中該免疫原組合物係20價肺炎球菌結合物組合物。
83. 如段落70之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物，其中該免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
84. 如段落70之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、7C、9N、10B、15A、16F、17F、19A、19F、20、21、22A、23A、23B、24B、24F、27、29、31、33B、34、35B、35F及38之醣結合物，其中該免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
如本文中所使用，術語「約」意指在值之統計學上有意義之範圍內，例如所述濃度範圍、時段、分子量、溫度或pH。此一範圍可在一定數量級內，通常在既定值或範圍之20%內、更通常10%內及甚至更通常5%內或1%內。有時，此一範圍可在用於量測及/或確定既定值或範圍之標準方法之典型實驗誤差內。術語「約」所涵蓋之允許變化形式將端視研究下之特定系統而定，且可容易地為熟習此項技術者所瞭解。每當在本申請案內陳述範圍時，亦考慮在該範圍內之每個數值以作為本發明之一實施例。
發明者在本文中所用術語「包含(comprising、comprise及comprises)」意欲可在每一情況下視情況分別經術語「基本上由……組成(consisting essentially of、consist essentially of)」、「由……組成(consisting of、consist of及consists of)」代替。
「免疫原量」、「免疫有效量」、「治療有效量」、「防治有效量」或「劑量」 (其中之每一者可在本文中互換使用)通常係指抗原或免疫原組合物足以誘發免疫反應之量，該免疫反應係細胞(T細胞)或體液(B細胞或抗體)反應或二者，如藉由熟習此項技術者已知之標準分析所量測。
考慮在本文件之任一範圍內之任何整數以作為本發明之一實施例。
本專利說明書中所引用之所有參考文獻或專利申請案皆以引用方式併入本文中。
在隨附實例中闡釋本發明。除非另有詳細闡述，否則以下實例係使用標準技術來實施，該等技術為熟習此項技術者所熟知且係常規技術。該等實例具有闡釋性，但並不限制本發明。
實例 實例 1. 使用水性緩衝液中還原胺化 (RAC/Aq.) 來製備血清型 3 醣結合物1. 水解
在活化之前水解天然多醣以減小分子量。將計算體積之2M乙酸添加至多醣溶液中以達成2.0 ± 0.2 g/L之最終多醣濃度及0.2M之最終乙酸濃度。將經稀釋多醣溶液加熱至85 ± 5℃。端視靶多醣Mw，維持水解反應某一時間。在反應結束時，將混合物冷卻至23 ± 2℃。
2. 氧化
對於氧化反應而言，將1M氯化鎂添加至反應溶液中直至最終濃度為0.10M。然後將過碘酸添加至多醣溶液中以引發氧化反應(以於WFI中之50 mg/mL溶液形式添加)。基於靶氧化度(DO)來選擇過碘酸之所需莫耳當量。DO之靶範圍為5.0 ± 3.0。氧化反應時間為20 ± 4小時，且在23 ± 2℃下進行。
3. 活化多醣之純化
藉由針對WFI之切向流過濾來純化活化多醣。使用截止分子量(MWCO)為100kDa之聚醚碸(PES)平板膜實施滲濾。在完成滲濾後，表徵活化多醣之以下各項：(i)醣濃度-藉由比色分析；(ii)醛濃度-藉由比色分析；(iii)氧化度；及(iv)分子量-藉由SEC-MALLS。將純化醣之pH調節至6.3 ± 0.3。然後以預定比率添加蛋白質(CRM
197、TT或SCP)。然後殼式冷凍混合物並凍乾至乾燥。
4. 結合反應
在0.1M磷酸鈉緩衝液中重構經凍乾之活化多醣及蛋白質。在重構完成之後，使用1N鹽酸或1N氫氧化鈉將pH調節至最終pH為6.5 ± 0.2。為引發結合反應，將預定莫耳當量之氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中。在30 ± 2℃下使結合進行40 ± 4小時之時段，同時在100 ± 10 rpm下連續混合。
5. 稀釋及封端反應
在結合反應時間完成之後，將反應溶液冷卻至23 ± 2℃並使用0.9% NaCl緩衝液將反應體積稀釋0.5 - 1.0倍，然後將1莫耳當量之硼氫化鈉添加至混合物中。在23 ± 2℃下使封端反應進行3-6小時之時段，同時在100 ± 10 rpm下連續混合。
6. 結合物之純化
使經稀釋之結合物溶液通過5 µm過濾器，且使用5 mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6.0)作為培養基實施滲濾。在完成滲濾之後，經由0.45um/0.22 μm過濾器過濾結合物滲餘物。
實例 2. 使用二甲基亞碸中還原胺化 (RAC/DMSO) 來製備血清型 3 醣結合物1. 水解及氧化
以與針對上述水性基結合所闡述相同之方式來實施多醣水解、活化及滲濾。基於靶DO來選擇過碘酸鈉之所需莫耳當量。DO之靶範圍為15.0 ± 4.0。氧化反應時間為20 ± 4小時，且在23 ± 2℃下進行。
2. 複合及凍乾
將活化多醣與蔗糖以25-100克蔗糖/克活化多醣之比率、較佳地以40-60克蔗糖/克活化多醣之比率複合。然後凍乾經複合混合物。將計算量之載體蛋白(CRM
197、TT或SCP)殼式冷凍並單獨凍乾。
3. 結合及封端
在無水二甲基亞碸(DMSO)中重構經凍乾之活化多醣，使用等量無水DMSO重構載體蛋白。
在反應容器中合併重構之活化多醣與重構之載體蛋白，隨後充分混合以獲得澄清溶液，隨後使用氰基硼氫化鈉引發結合。反應溶液中之最終多醣濃度為約1 g/L。藉由將0.5 - 2.0 MEq之氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中來引發結合並在23 ± 2℃下培育20-48 hr。藉由添加2 MEq硼氫化鈉(NaBH
4)來終止結合反應以將未反應醛封端。在23 ± 2℃下持續此封端反應3 ± 1 hr。
4. 純化
在製備中使用經冷卻之5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)以1:10稀釋結合物溶液，使用100-300K MWCO膜藉由切向流過濾來純化。然後使用5 mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6.0)作為培養基來實施滲濾。在完成滲濾之後，經由0.22 μm過濾器轉移結合物滲餘物。使用5 mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6)將結合物進一步稀釋至約0.5 mg/mL之目標糖濃度。或者，使用20 mM組胺酸-0.9%鹽水(pH 6.5)藉由切向流過濾使用100-300K MWCO膜來純化結合物。完成最終0.22 μm過濾步驟以獲得免疫原結合物。
表 1 匯總使用兩種結合 (DMSO 或水性緩衝液中之還原胺化 ) 獲得之一些結合物之結果
| RAC/DMSO 蛋白質: CRM | RAC/DMSO 蛋白質: TT | RAC/DMSO 蛋白質: SCP | RAC/水性 蛋白質: CRM | |
| Poly MW (kDa) | 166 | 199 | 199 | 140 |
| 氧化度(DO) | 14 | 14 | 14 | 5 |
| 醣/蛋白質比率 | 0.9 | 0.9 | 1.0 | 1.0 |
| 游離醣% | ＜5% | ＜5% | ＜5% | 8.5% |
| 藉由SEC-MALLS測得之結合物MW，kDa | 2670 | 3962 | 4760 | 1530 |
實例 3. 多醣大小對血清型 3 醣結合物之效應在標準條件下測定小鼠中包含不同大小之多醣之血清型3-CRM
197結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。
使用利用RAC/水性(參見實例1)或RAC/DMSO (參見實例2)結合至CRM
197來結合至CRM
197之經分篩血清型3多醣(約25、150或250 kDa)在佐劑存在下對動物接種疫苗(參見表2處之測試結合物之屬性)。
表 2. 用於評估多醣大小效應之 Pn3 結合物之屬性
| RAC/ Aq. 高MW | RAC/ Aq. 中等MW | RAC/ Aq. 低MW | RAC/ DMSO 高MW | RAC/ DMSO 中等MW | RAC/ DMSO 低MW | |
| 活化多醣MW，kDa | 250 | 150 | 25 | 250 | 150 | 25 |
| 結合物MW (kDa) | 2467 | 1278 | 1972 | 3123 | 2670 | 1790 |
| 活化度 | 3.9 | 10 | 7 | 14 | 14 | 13 |
| SPR比率 | 0.9 | 0.8 | 1.1 | 1 | 0.94 | 0.9 |
| 游離醣，% | ＜5 | 9 | ＜5 | 4.5 | 7 | 13 |
| MW：分子量；SPR：醣對蛋白質比率 |
在第0週使用0.01 µg/ml、0.1 µg/ml或1 µg/ml測試結合物經由皮下途徑對25隻6-8週齡雌性瑞士韋伯斯特小鼠(Swiss Webster mice)之各組實施免疫(250 µL)。在第3週使用相同劑量之結合物對小鼠加強免疫且然後在第5週抽血。使用100 µg/劑量之AlPO
4作為佐劑來調配所接種之每一疫苗。所有臨床前免疫原性研究皆能夠使用25隻小鼠/組來檢測OPA效價之4至5倍差異。在第二接種疫苗之後兩週(第5週，PD 2)自小鼠收集全血並使用血清進行分析。對第5週血清試樣實施血清型特異性OPA分析。
使用調理吞噬活性(OPA)分析來量測鼠類血清中對肺炎鏈球菌血清型3具有特異性之功能抗體。將測試血清置於分析反應中，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積以由此促進吞噬作用並藉由吞噬細胞殺死細菌之能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%之倒數稀釋度。OPA效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。
OPA程序係基於Hu等人，(2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2):287-295中所闡述之方法且進行下列修改。將測試血清連續稀釋2.5倍且添加至微量滴定分析板中。將活血清型3靶細菌菌株添加至孔中，且在25℃下將板振盪30分鐘。將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®，12%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下將板振盪45分鐘。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等分試樣轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO
2下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)固定。然後使用考馬斯藍(Coomassie Blue)對板進行染色且去色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。使用生菌落計數來繪製殺死曲線並計算OPA效價。
在5週時不同劑量下之OPA效價(具有95%置信區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表3中。結果呈現於圖3中。
| 表 3 - 使用結合至 CRM 197 之經分篩血清型 3 多醣接種疫苗後之 OPA 效價。使用 Rac/ 水性或 RAC/DMSO 結合至 CRM 197 之經分篩 ( 約 25 、 150 或 250 kDa) 血清型 3 在佐劑存在下對動物接種疫苗。雌性瑞士韋伯斯特小鼠， 6-8 週齡；劑量： 0.01 、 0.1 及 1 μg/ml + AlPO 4 ；接種疫苗： 0 及 3 wk. ；放血第 5 週讀出： OPA | ||||
| 0.01 | 0.1 | 1 | ||
| 250 kDa (RAC/Aq.) | 平均 | 49 | 663 | 1909 |
| 小鼠總數 | 47 | 49 | 49 | |
| 無反應者數量 | 19 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 40 | 2 | 0 | |
| 150 kDa (RAC/Aq.) | 平均 | 117 | 1286 | 3679 |
| 小鼠總數 | 44 | 49 | 49 | |
| 無反應者數量 | 6 | 0 | 0 | |
| 無反應者% | 14 | 0 | 0 | |
| 25 kDa (RAC/Aq.) | 平均 | 158 | 1677 | 5644 |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | |
| 無反應者數量 | 4 | 0 | 0 | |
| 無反應者% | 16 | 0 | 0 | |
| 250 kDa (RAC/DMSO) | 平均 | 46 | 360 | 3271 |
| 小鼠總數 | 40 | 39 | 40 | |
| 無反應者數量 | 16 | 3 | 0 | |
| 無反應者% | 40 | 8 | 0 | |
| 150 kDa (RAC/DMSO) | 平均 | 19 | 626 | 1285 |
| 小鼠總數 | 47 | 40 | 47 | |
| 無反應者數量 | 29 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 62 | 3 | 0 | |
| 25 kDa (RAC/DMSO) | 平均 | 93 | 319 | 3560 |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | |
| 無反應者數量 | 6 | 3 | 0 | |
| 無反應者% | 24 | 12 | 0 |
表3及圖3之數據指示，血清型3結合物在鼠類免疫原性模型中誘發劑量依賴性OPA效價。如表3中所展示，隨著多醣大小降低，使用RAC/水性化學之血清型3結合物在所有劑量下皆誘導較高OPA GMT。對於RAC/DMSO化學而言，在0.01µg劑量及較小多醣大小下，無反應者較少。
實例 4. 多醣之氧化度 (DO)/ 活化度 (DoA) 對血清型 3 醣結合物之效應在標準條件下測定小鼠中使用不同氧化度生成之血清型3-CRM
197結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。
使用利用RAC/水性(參見實例1)或RAC/DMSO (參見實例4)結合至CRM
197來結合至CRM
197之經分篩血清型3多醣(約120-170 kDa)在佐劑存在下對動物接種疫苗(參見表2處之測試結合物之屬性)。
表 4. 用於評估氧化度之 Pn3 結合物之屬性
| RAC/DMSO 低DO | RAC/DMSO 高DO | RAC/水性 低DO | RAC/水性 高DO | |
| 活化多醣MW，kDa | 156 | 166 | 140 | 123 |
| 結合物MW (kDa) | 1580 | 2670 | 1530 | 1278 |
| 活化度(DoA) | 7 | 14 | 5 | 10 |
| SPR比率 | 1 | 0.94 | 1 | 0.8 |
| 游離醣，% | ＜5 | 7 | 8.5 | 9 |
| MW：分子量；SPR：醣對蛋白質比率 |
在第0週時，使用0.01 µg/ml、0.1 µg/ml或1 µg/ml測試結合物經由皮下途徑對25隻6-8週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之各組實施免疫(250 µL)。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫，且然後在第5週時采血。對第5週血清樣品實施血清型特異性OPA分析。
如實例3處所闡述來實施OPA。結果呈現於表5及圖4處。
| 表 5 - 使用以可變氧化度 (DO) 結合至 CRM 之血清型 3 抗原接種疫苗後之 OPA 效價。使用結合至 CRM 之血清型 3 在佐劑存在下對動物接種疫苗。雌性瑞士韋伯斯特小鼠， 6-8 週齡；劑量： 0.01 、 0.1 及 1 μg/ml + AlPO 4 ；接種疫苗： 0 及 3 wk. ；放血第 5 週讀出： OPA | ||||
| 0.01 | 0.1 | 1 | ||
| DO 7 (RAC/DMSO) | 平均 | 14 | 113 | 963 |
| 小鼠總數 | 19 | 17 | 25 | |
| 無反應者數量 | 12 | 4 | 0 | |
| 無反應者% | 63 | 24 | 0 | |
| DO 14 (RAC/DMSO) | 平均 | 19 | 626 | 1301 |
| 小鼠總數 | 47 | 40 | 48 | |
| 無反應者數量 | 29 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 62 | 3 | 0 | |
| DO 5 (RAC/Aq.) | 平均 | 38 | 383 | 1478 |
| 小鼠總數 | 22 | 21 | 24 | |
| 無反應者數量 | 10 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 45 | 5 | 0 | |
| DO 10 (RAC/Aq.) | 平均 | 117 | 1286 | 3679 |
| 小鼠總數 | 44 | 49 | 49 | |
| 無反應者數量 | 6 | 0 | 0 | |
| 無反應者% | 14 | 0 | 0 |
表5及圖4之數據指示，血清型3結合物在鼠類免疫原性模型中誘發劑量依賴性OPA效價。如表5中所展示，使用RAC/水性或RAC/DMSO化學之血清型3結合物在所有劑量及較高DO下皆誘導較高OPA GMT。
實例 5 ：使用點擊化學結合血清型 3 莢膜多醣 ( 參見圖 2)1. 使用疊氮基連接體活化血清型3莢膜多醣
將血清型3莢膜多醣與咪唑(3x, w/w)混合且使用1M-HCl將pH調節至3.5，然後冷凍並凍乾。
在凍乾3天之後，使用無水DMSO (4 mg/mL)重構經凍乾多醣。然後將反應混合物升溫至35℃，且添加CDI (0.2 MEq)。將反應混合物在35℃下攪拌3 hr。在將反應混合物冷卻至23℃之後，添加WFI (2% v/v)以淬滅游離CDI且然後在23℃下進一步攪拌30 min。向反應混合物中添加3-疊氮基-丙基胺(2 MEq)。在23℃下反應20 hr之後，將反應混合物稀釋至冷凍(在5℃下) 10 mM NaH2PO4緩衝液(5X, v/v)中。然後藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜針對WFI (30X, v/v)來純化經稀釋反應混合物。
2. 使用炔烴NHS酯將CRM
197活化成炔烴-CRM
197向CRM
197溶液(1000 mg)中添加57 mL WFI及50 mL 0.5 M磷酸鈉緩衝液(pH 8.3)。在冷卻至8℃之後，將18 mL 3-炔丙基氧基-丙酸NHS酯(POPS) (20 mg/mL於DMSO中) (相對於CRM
197上之離胺酸，2.4 MEq)逐滴添加至反應混合物中且將反應溫度維持於8 ± 3℃。在將反應混合物在8℃下攪拌2 hr之後，藉由UF/DF使用10K MWCO PES膜(Millipore Pellicon 2 Mini)針對100 mM磷酸鈉緩衝液/鹽水(pH 7.0) (30X透析體積)進行純化。在UF/DF之後，添加蔗糖23 g (15% v/v)。
3. 點擊結合：藉由Cu+1介導之疊氮化物-炔烴環加成反應(稱為「點擊反應」)使經活化疊氮基poly及炔烴CRM結合。
在23℃下，將5 mM硫酸銅(CuSO
4)(1 mL)及25 mM參(3-羥丙基三唑基甲基)胺(THPTA) (1 mL)之混合物添加至經疊氮基連接體活化之血清型3莢膜多醣(參見上述步驟1)及炔烴-CRM
197(參見上述步驟2) (於100 mM磷酸鈉緩衝液(SPB)/鹽水中，pH 7.0)之混合物中，且隨後添加100 mM胺基胍(2 mL)及100 mM抗壞血酸鈉(2 mL)。在將反應混合物在23℃下攪拌2小時之後，在23℃下藉由炔丙醇(1 MEq)將未反應疊氮基封端2小時，且在第一封端之後，隨後在23℃下藉由3-疊氮基-1-丙醇(2 MEq)將未反應炔基封端2小時。然後，藉由UF/DF使用100K MWCO PES膜針對(10 mM EDTA + 10 mM SPB)/鹽水(pH 7.0) (30X透析體積)且隨後針對5 mM琥珀酸鹽/鹽水(pH 6.0) (30X透析體積)來純化反應混合物。
實例 6. 載體蛋白對血清型 3 醣結合物之免疫原性之效應在標準條件下測定小鼠中血清型3 - CRM
197、SCP或破傷風類毒素結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。使用DMSO中還原胺化(RAC/DMSO) (參見實例2)。
使用結合至不同蛋白質載體之經分篩血清型3多醣(約160-250 kDa)在佐劑存在下對動物接種疫苗(參見表6處之測試結合物之屬性)。
表 6. 用於化學評估 (RAC/DMSO) 之 Pn3 結合物之屬性
MW：分子量；SPR：醣對蛋白質比率
| CRM 197 | TT | SCP | |
| 活化多醣MW，kDa | 166 | 199 | 199 |
| 結合物MW (kDa) | 2670 | 3962 | 4760 |
| 活化度 | 14 | 14 | 14 |
| SPR比率 | 0.94 | 0.92 | 1 |
| 游離醣，% | 7 | ＜5 | ＜5 |
在第0週時，使用0.01 µg/ml、0.1 µg/ml或1 µg/ml測試結合物經由皮下途徑對25隻6-8週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之各組實施免疫(250 µL)。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫，且然後在第5週時采血。對第5週血清樣品實施血清型特異性OPA分析。
結果呈現於表7及圖5處。
| 表 7 -- 使用血清型 3 抗原 -CRM 197 、 SCP 或破傷風類毒素結合物接種疫苗後之 OPA 效價。使用結合之血清型 3 在佐劑存在下對動物接種疫苗。雌性瑞士韋伯斯特小鼠， 6-8 週齡；劑量： 0.01 、 0.1 及 1 μg/ml + AlPO 4 ；接種疫苗： 0 及 3 wk. ；放血第 5 週讀出： OPA | ||||
| 0.01 | 0.1 | 1 | ||
| 破傷風類毒素(RAC/DMSO) | 平均 | 51 | 383 | 2119 |
| 小鼠總數 | 40 | 35 | 37 | |
| 無反應者數量 | 9 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 23 | 3 | 0 | |
| SCP (RAC/DMSO) | 平均 | 251 | 1110 | 2106 |
| 小鼠總數 | 40 | 38 | 40 | |
| 無反應者數量 | 0 | 0 | 0 | |
| 無反應者% | 0 | 0 | 0 | |
| CRM 197(RAC/DMSO) | 平均 | 19 | 626 | 1301 |
| 小鼠總數 | 47 | 40 | 48 | |
| 無反應者數量 | 28 | 1 | 0 | |
| 無反應者% | 60 | 3 | 0 |
表7及圖5之數據指示，血清型3結合物在鼠類免疫原性模型中誘發劑量依賴性OPA效價。如表7中所展示，結合至SCP之血清型3誘導較高OPA GMT，且所有小鼠皆具有反應並獲得可量測OPA效價(0%無反應者)，即使在低劑量下。
如本文所述，僅SCP真正增加了對0.01 ug/ ml劑量下之接種疫苗具有反應之小鼠之百分比。TT所誘發之反應通常低於CRM
197。
實例 7. 化學對血清型 3 醣結合物之免疫原性之效應在標準條件下測定小鼠中血清型3-CRM
197結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。使用不同化學(水性還原胺化(RAC/Aq.)，參見實例1；DMSO中還原胺化(RAC/DMSO)，參見實例2；eTEC連接之醣結合物(eTEC)，參見WO2014/027302；或點擊化學(點擊)，參見實例5)評估小鼠中之OPA反應變化。
使用利用不同化學結合至CRM
197之經分篩血清型3多醣(約160-1100 kDa)在佐劑存在下對動物接種疫苗(參見表8處之測試結合物之屬性)。
表 8. 用於評估結合化學之 Pn3 結合物之屬性
| RAC/Aq. | RAC/DMSO | eTEC | 點擊 | |
| 活化多醣MW，kDa | 250 | 234 | 1131 | 470 |
| 結合物MW (kDa) | 2467 | 3123 | 2278 | 598 |
| 活化度 | 3.9 | 14 | 19 | 12 |
| SPR比率 | 0.9 | 1 | 1.1 | 0.4 |
| 游離醣，% | ＜5 | 4.5 | 3 | 9 |
| MW：分子量；SPR：醣對蛋白質比率 |
在第0週時，使用0.01 µg/ml、0.1 µg/ml或1 µg/ml測試結合物經由皮下途徑對25隻6-8週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之各組實施免疫(250 µL)。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫，且然後在第5週時采血。對第5週血清樣品實施血清型特異性OPA分析。
結果呈現於表9及圖6處。
| 表 9 -- 使用利用不同化學 ： RAC/Aq. 、 RAC/DMSO 、 eTEC 或點擊結合至 CRM 197 之血清型 3 抗原接種疫苗後之 OPA 效價。使用結合之血清型 3 在佐劑存在下對動物接種疫苗。雌性瑞士韋伯斯特小鼠， 6-8 週齡；劑量： 0.01 、 0.1 及 1 μg/ml + AlPO 4 ；接種疫苗： 0 及 3 wk. ；放血第 5 週讀出： OPA | |||||
| 0.01 | 0.1 | 1 | |||
| CRM 197(RAC/Aq.) | 平均 | 38 | 1165 | 2049 | |
| 小鼠總數 | 22 | 24 | 25 | ||
| 無反應者數量 | 10 | 0 | 0 | ||
| 無反應者% | 45 | 0 | 0 | ||
| CRM 197(RAC/DMSO) | 平均 | 60 | 486 | 3766 | |
| 小鼠總數 | 25 | 25 | 25 | ||
| 無反應者數量 | 10 | 1 | 0 | ||
| 無反應者% | 40 | 4 | 0 | ||
| CRM 197(eTEC) | 平均 | 16 | 565 | 2371 | |
| 小鼠總數 | 24 | 25 | 24 | ||
| 無反應者數量 | 15 | 2 | 0 | ||
| 無反應者% | 63 | 8 | 0 | ||
| CRM 197(點擊) | 平均 | 91 | 1308 | 5578 | |
| 小鼠總數 | 20 | 24 | 25 | ||
| 無反應者數量 | 7 | 0 | 0 | ||
| 無反應者% | 35 | 0 | 0 |
表9及圖6之數據指示，所有血清型3結合物皆在鼠類免疫原性模型中誘發劑量依賴性OPA效價。如表9及圖6中所展示，與其他化學相比，使用點擊化學之血清型3在所有小鼠中皆誘導指示可量測OPA反應之較高OPA GMT。
實例 8 ： 利用 CRM
197 作為載體蛋白使用點擊化學之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物使用類似於實例5中者之製程(點擊化學)且使用CRM
197作為載體來生成具有不同屬性之結合物(參見表10)。藉由Pn3與疊氮基poly (活化度(DoA) 12%)及炔烴CRM
197(DoA 18)之點擊結合生成之1號及2號結合物獲得低產率、低MW及低醣蛋白質比率(SPR)。已藉由降低疊氮基多醣及炔烴CRM
197之DoA來最佳化製程以增加結合產率及靶結合物SPR (約1)。使用疊氮基多醣(DoA 5%)及炔烴CRM
197(DoA 11)產生具有SPR 1.1及較高產率之3號結合物。
然後使用此製程，且產率增至76%。大部分該等參數生成游離醣小於20%之結合物。
表 10.
| Pn3-CRM 197 點擊結合物 | |||||
| 結合物編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Poly Mw (kDa) | 130 | 250 | 134 | 124 | 116 |
| 疊氮基 Poly DoA (%)/Poly RU | 12 | 12 | 5 | 6 | 4 |
| 疊氮基 Poly Mw (kDa) | 150 | 470 | 224 | 207 | 226 |
| 炔烴 -CRM197 Mw (kDa) | 63 | 63 | 59 | 59 | 58 |
| 炔烴 -CRM197 DoA (AAA) ，炔烴 /CRM197 | 18 | 18 | 11 | 9 | 10 |
| 結合 | |||||
| 結合物產率 (%) | 18 | 20 | 41 | 76 | 70 |
| 結合物輸出 SPR | 0.4 | 0.4 | 1.1 | 1 | 1.1 |
| 游離醣 (%) | 8 | 9 | 20 | 6 | 7 |
| 游離蛋白 (%) | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜1 | ＜1 |
| 結合物 Mw (kDa) | 702 | 598 | 1477 | 1757 | 1089 |
實例 9 ： 利用 SCP 作為載體蛋白使用點擊化學之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物使用類似於實例5中者之製程(點擊化學)且使用SCP作為載體來生成具有不同屬性之結合物。疊氮基poly (DOA 5%)及炔烴SCP (DOA 26)之點擊結合生成具有中等產率及SPR之1號結合物。然而，在最佳化期間，使用具有4%及13% DOA之疊氮基poly及具有DOA 13、26及37之炔烴SCP生成2號至7號結合物。如自下表(表11)所展示，具有DOA 26之炔烴SCP生成具有高產率、SPR ~1及較高MW之2號及3號結合物。與2號及3號結合物相比，使用具有DOA 13及37之炔烴SCP製得之結合物係具有較低產率、MW及SPR之4號至6號結合物。
表 11.
| Pn3-SCP 點擊結合物 | |||||||
| 結合物編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Poly Mw (kDa) | 134 | 116 | 116 | 116 | 116 | 116 | 116 |
| 疊氮基 Poly DoA (%) | 5 | 4 | 13 | 4 | 13 | 4 | 13 |
| 疊氮基 Poly Mw (kDa) | 224 | 226 | 249 | 226 | 249 | 226 | 249 |
| 炔烴 -SCP Mw (kDa) | 103 | 103 | 103 | 101 | 101 | 105 | 105 |
| 炔烴 -SCP DOA (AAA) | 26 | 26 | 26 | 13 | 13 | 37 | 37 |
| 結合 | |||||||
| 結合物產率 (%) | 51 | 72 | 79 | 29 | 36 | 41 | 63 |
| 結合物輸出 SPR | 0.7 | 0.91 | 0.9 | 0.57 | 0.52 | 0.64 | 0.72 |
| 游離醣 (%) | 9 | ＜ 5 | ＜ 5 | ＜ 5 | ＜ 5 | ＜ 5 | ＜ 5 |
| 游離蛋白 (%) | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 |
| 結合物 Mw (kDa) | 1075 | 1696 | 3128 | 746 | 877 | 711 | 1778 |
實例 10 ： 利用 TT 作為載體蛋白使用點擊化學之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物使用類似於實例5中者之製程(點擊化學)且使用TT作為載體來生成具有不同屬性之結合物。
疊氮基poly (DOA ~5%)及炔烴TT (DOA ~10、15及20)之點擊結合生成具有較高游離醣含量之1 - 4號結合物。然而，在製程最佳化期間，具有DOA ~10%之疊氮基poly及具有DOA ~20之炔烴TT生成具有低游離醣之5號結合物(參見表12)。
表 12 。
| Pn3-TT 結合物 | |||||
| 結合物編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Poly Mw (kDa) | 134 | 182 | 182 | 182 | 182 |
| 疊氮基 Poly DoA (%) | ~5 | ~5 | ~5 | ~10 | ~10 |
| 疊氮基 Poly Mw (kDa) | |||||
| 炔烴 -TT Mw (kDa) | 230 | 287 | 259 | 287 | 259 |
| 炔烴 -TT DOA (AAA) | ~15 | ~10 | ~20 | ~10 | ~20 |
| 結合 | |||||
| 結合物產率 (%) | 30 | 33 | 36 | 37 | 47 |
| 結合物 SPR | 0.59 | 0.56 | 0.51 | 0.53 | 0.54 |
| 游離醣 (%) | 36 | 35 | 25 | 18 | 12 |
| 游離蛋白 (%) | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜ 1 | ＜1 |
| 結合物 Mw (kDa) | 1119 | 1773 | 1126 | 1483 | 1186 |
實例 11 ： 使用不同化學及不同載體之肺炎鏈球菌血清型 3 醣結合物之免疫原性之評估使用利用RAC/Aq.或點擊化學結合至2種載體蛋白(CRM
197或SCP)中之任一者之肺炎鏈球菌血清型3對幼小恆河猴接種疫苗。
1. 幼小恆河猴研究
將年齡及性別匹配之幼小恆河猴(IRM) (3-6個月齡)隨機分成3組(參見研究設計表13)。
經肌內使用點擊多醣化學(點擊-SCP、點擊-CRM；poly大小皆為約130 kDa)或使用ST3 RAC-水性CRM結合物(poly大小為約250kDa)對幼猴接種疫苗。在初次接種疫苗(D0)之前1週(wk= -1)預采血以評價基線ST3特異性血清效價。在初次接種疫苗後第8週及第16週重複接種疫苗兩次。
在劑量1後(PD1) 4-及8週、PD2 1、4及8週及PD3 1、4、16及36週收集全血以獲得血清。
2. 調理吞噬分析
實施微菌落調理吞噬分析(mcOPA)。
在Pn3 mcOPA中，將由靶細菌細胞及熱滅活測試血清構成之反應混合物在25℃下於環境振盪器中培育30分鐘。然後將經分化HL-60組織培養細胞(效應細胞)及仔兔補體添加至反應混合物中，並在37℃下於環境振盪器中培育45分鐘。藉由量測含有測試血清之mcOPA反應液中之細菌存活率來測定功能性抗肺炎鏈球菌抗體效價。平鋪分析混合物並生長過夜。
在第2天，測定未吞噬活細菌之數量。mcOPA抗體效價係使得與不含血清之細菌-效應細胞-補體對照孔相比細菌群落數減小50%之血清稀釋度之倒數。
表 13.
| Pn3 結合物類型 | 化學 | 載體 | Poly 大小 (kDa) | 活化度 | 抗原劑量 (µg) | 佐劑 | IRM 數量 | 雄性 / 雌性 |
| CRM/RAC Aq. | RAC/Aq. | CRM | 250 | 3.9 | 2.2 | AlPO 4 | 13 | 5/8 |
| CRM-點擊 | 點擊 | CRM | 130 | 11 | 2.2 | AlPO 4 | 9 | 4/5 |
| SCP-點擊 | 點擊 | SCP | 130 | 11 | 2.2 | AlPO 4 | 11 | 7/4 |
3. 結果
3.1.
點擊 -SCP 化學顯著改良了幼小恆河猴在劑量 1 後之血清型 3 特異性 OPA 效價：
評估與RAC/Aq-CRM化學相比使用肺炎球菌血清型3點擊化學(點擊-SCP、點擊-CRM) 在幼小恆河猴之初次接種疫苗之後之OPA反應。所有構築體皆經AlPO
4佐劑化(表13)。有趣的是，與RAC/Aq-CRM相比，點擊-SCP化學/載體組合顯著改良了血清型3特異性OPA (＞8倍) (圖7；表14)。
表 14. 幼小恆河猴中之劑量 1 後第 4 週 OPA 效價
*單向ANOVA與杜克多重對比測試
| Pn3 結合物類型 | 幾何平均 OPA - | 下 95% CI | 上 95% CI | N | 較 CRM RAC/Aq 之倍數增加 | 與 CRM RAC/Aq 相比之 p 值 * |
| CRM/RAC Aq. | 33.78 | 13.9 | 81.6 | 13 | ||
| CRM-點擊 | 48.78 | 13.0 | 181.9 | 9 | 1.4 | 0.65 |
| SCP-點擊 | 283.9 | 190.3 | 423.6 | 11 | 8.4 | 0.0001 |
3.2 點擊 -SCP 化學誘導幼小恆河猴在劑量 2 後 (PD2) 之最高 OPA 效價進一步測試第2個月時之第二劑量是否誘導幼小恆河猴中之OPA效價增加。與相應PD1效價相比，使用所有不同化學之結合物接種疫苗皆誘導較高PD2 OPA效價(圖8)。點擊-SCP接種疫苗誘導約4.5倍於RAC/Aq-CRM化學之最高幾何平均效價(表15)。此外，點擊-SCP誘導之效價具有窄置信區間，此指示在該組之所有猴中生成均勻免疫反應(圖8)。與RAC/Aq-CRM相比，點擊-CRM接種疫苗改良了各別劑量下之PD2 OPA效價，但具有較寬置信區間(圖8)。
表 15. 幼小恆河猴中之劑量 2 後第 4 週 OPA 效價
*單向ANOVA與杜克多重對比測試
| Pn3 結合物類型 | 幾何平均 OPA | 下 95% CI | 上 95% CI | N | 較 CRM RAC/Aq 之倍數增加 | 與 CRM RAC/Aq 相比之 p 值 * |
| CRM/RAC Aq. | 76.04 | 26.38 | 219.2 | 13 | ||
| CRM-點擊 | 134.5 | 35.11 | 514.9 | 9 | 1.7 | 0.65 |
| SCP-點擊 | 349 | 229.2 | 531.4 | 11 | 4.5 | 0.06 |
與使用單一劑量之RAC/Aq-CRM結合物相比，使用點擊-SCP結合物接種疫苗在幼小恆河猴中誘導顯著更高之血清型3特異性OPA/IgG效價且維持較高PD2反應。點擊-CRM接種疫苗所誘導之幼小恆河猴平均效價高於RAC/Aq-CRM結合物。
本說明書中所提及之所有出版物及專利申請案皆指示熟習本發明所屬領域技術者之技術水準。所有出版物及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其程度如同指示每一個別出版物或專利申請案係特定地且個別地以引用方式併入本文中一般。
儘管出於清晰理解之目的已藉助說明及實例相當詳細地闡述了上述發明，但可在隨附申請專利範圍之範圍內實踐某些變化及修改。
圖 1展示肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣之重複多醣結構。
圖 2展示使用點擊化學製備本發明之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物之一般反應圖。Pn3 poly =肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣；CP =載體蛋白，CDI = 1,1’-羰基二咪唑。
圖 3展示包含不同大小之多醣之血清型3-CRM
197結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。將使用RAC/水性或RAC/DMSO結合結合至CRM
197之特定大小之血清型3多醣(約25、150或250 kDa)用於對小鼠接種疫苗。
圖 4展示具有不同活化程度(DoA)之血清型3-CRM
197結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。利用RAC/水性或RAC/DMSO結合作用與CRM
197結合之特定大小之血清型3多醣用於對小鼠接種疫苗。
圖 5展示與-CRM
197、SCP或破傷風類毒素(TT)之血清型3結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價。使用DMSO中還原胺化(RAC/DMSO)。
圖 6展示血清型3-CRM
197結合物在小鼠中之調理吞噬活性(OPA)效價
。已使用不同化學(水性還原胺化(RAC/Aq.)、DMSO中還原胺化(RAC/DMSO)、eTEC連接之醣結合物(eTEC)或點擊化學(點擊)。
圖 7展示使用血清型3化學物/載體結合物接種疫苗之幼小恆河猴中之劑量1後OPA效價
。已使用不同化學(水性還原胺化(RAC/Aq.)或點擊化學(點擊)。自在劑量1後4週時間點時收集之血清來量測不同結合化學之調理吞噬效價。每一點代表個別動物且數據表示為具有95%置信區間之幾何平均效價。基於單因子ANOVA來測定統計學顯著性。報告經杜克多重性(Tukey’s multiplicity)調節之p值。****=p≤0.0001 LLOQ -量化下限。
圖 8展示使用血清型3化學物/載體結合物接種疫苗之幼小恆河猴中之劑量2後OPA反應。自在劑量2後4週時收集之血清來量測不同結合化學之調理吞噬效價。每一點代表個別動物且數據表示為具有95%置信區間之幾何平均效價。基於單因子ANOVA來測定統計學顯著性。報告經杜克多重性調節之p值。LLOQ -量化下限。
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1 5 10 15
Asp Leu Asn Asp Pro Ser Gln Val Lys Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gly
20 25 30
Lys Gly Ala Gly Thr Val Val Ala Val Ile Ala Ala Gly Phe Asp Lys
35 40 45
Asn His Glu Ala Trp Arg Leu Thr Asp Lys Ala Lys Ala Arg Tyr Gln
50 55 60
Ser Lys Glu Asp Leu Glu Lys Ala Lys Lys Glu His Gly Ile Thr Tyr
65 70 75 80
Gly Glu Trp Val Asn Asp Lys Val Ala Tyr Tyr His Asp Tyr Ser Lys
85 90 95
Asp Gly Lys Thr Ala Val Asp Gln Glu His Gly Thr His Val Ser Gly
100 105 110
Ile Leu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Glu Thr Lys Glu Pro Tyr Arg Leu
115 120 125
Glu Gly Ala Met Pro Glu Ala Gln Leu Leu Leu Met Arg Val Glu Ile
130 135 140
Val Asn Gly Leu Ala Asp Tyr Ala Arg Asn Tyr Ala Gln Ala Ile Arg
145 150 155 160
Asp Ala Ile Asn Leu Gly Ala Lys Val Ile Asn Met Ser Phe Gly Asn
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Tyr Ala Asn Leu Pro Asp Glu Thr Lys Lys Ala Phe
180 185 190
Asp Tyr Ala Lys Ser Lys Gly Val Ser Ile Val Thr Ser Ala Gly Asn
195 200 205
Asp Ser Ser Phe Gly Gly Lys Thr Arg Leu Pro Leu Ala Asp His Pro
210 215 220
Asp Tyr Gly Val Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Asp Ser Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Lys Gln Leu Thr Glu Thr Val Thr Val
245 250 255
Lys Thr Ala Asp Gln Gln Asp Lys Glu Met Pro Val Leu Ser Thr Asn
260 265 270
Arg Phe Glu Pro Asn Lys Ala Tyr Asp Tyr Ala Tyr Ala Asn Arg Gly
275 280 285
Thr Lys Glu Asp Asp Phe Lys Asp Val Lys Gly Lys Ile Ala Leu Ile
290 295 300
Glu Arg Gly Asp Ile Asp Phe Lys Asp Lys Ile Ala Lys Ala Lys Lys
305 310 315 320
Ala Gly Ala Val Gly Val Leu Ile Tyr Asp Asn Gln Asp Lys Gly Phe
325 330 335
Pro Ile Glu Leu Pro Asn Val Asp Gln Met Pro Ala Ala Phe Ile Ser
340 345 350
Arg Lys Asp Gly Leu Leu Leu Lys Asp Asn Pro Gln Lys Thr Ile Thr
355 360 365
Phe Asn Ala Thr Pro Lys Val Leu Pro Thr Ala Ser Gly Thr Lys Leu
370 375 380
Ser Arg Phe Ser Ser Trp Gly Leu Thr Ala Asp Gly Asn Ile Lys Pro
385 390 395 400
Asp Ile Ala Ala Pro Gly Gln Asp Ile Leu Ser Ser Val Ala Asn Asn
405 410 415
Lys Tyr Ala Lys Leu Ser Gly Thr Ala Met Ser Ala Pro Leu Val Ala
420 425 430
Gly Ile Met Gly Leu Leu Gln Glu Gln Tyr Glu Thr Gln Tyr Pro Asp
435 440 445
Met Thr Pro Ser Glu Arg Leu Asp Leu Ala Lys Lys Val Leu Met Ser
450 455 460
Ser Ala Thr Ala Leu Tyr Asp Glu Asp Glu Lys Ala Tyr Phe Ser Pro
465 470 475 480
Arg Gln Gln Gly Ala Gly Ala Val Asp Ala Lys Lys Ala Ser Ala Ala
485 490 495
Thr Met Tyr Val Thr Asp Lys Asp Asn Thr Ser Ser Lys Val His Leu
500 505 510
Asn Asn Val Ser Asp Lys Phe Glu Val Thr Val Thr Val His Asn Lys
515 520 525
Ser Asp Lys Pro Gln Glu Leu Tyr Tyr Gln Ala Thr Val Gln Thr Asp
530 535 540
Lys Val Asp Gly Lys His Phe Ala Leu Ala Pro Lys Ala Leu Tyr Glu
545 550 555 560
Thr Ser Trp Gln Lys Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ser Ser Lys Gln Val
565 570 575
Thr Val Pro Ile Asp Ala Ser Arg Phe Ser Lys Asp Leu Leu Ala Gln
580 585 590
Met Lys Asn Gly Tyr Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Phe Lys Gln Asp
595 600 605
Pro Lys Lys Glu Glu Leu Met Ser Ile Pro Tyr Ile Gly Phe Arg Gly
610 615 620
Asp Phe Gly Asn Leu Ser Ala Leu Glu Lys Pro Ile Tyr Asp Ser Lys
625 630 635 640
Asp Gly Ser Ser Tyr Tyr His Glu Ala Asn Ser Asp Ala Lys Asp Gln
645 650 655
Leu Asp Gly Asp Gly Leu Gln Phe Tyr Ala Leu Lys Asn Asn Phe Thr
660 665 670
Ala Leu Thr Thr Glu Ser Asn Pro Trp Thr Ile Ile Lys Ala Val Lys
675 680 685
Glu Gly Val Glu Asn Ile Glu Asp Ile Glu Ser Ser Glu Ile Thr Glu
690 695 700
Thr Ile Phe Ala Gly Thr Phe Ala Lys Gln Asp Asp Asp Ser His Tyr
705 710 715 720
Tyr Ile His Arg His Ala Asn Gly Lys Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Pro
725 730 735
Asn Gly Asp Gly Asn Arg Asp Tyr Val Gln Phe Gln Gly Thr Phe Leu
740 745 750
Arg Asn Ala Lys Asn Leu Val Ala Glu Val Leu Asp Lys Glu Gly Asn
755 760 765
Val Val Trp Thr Ser Glu Val Thr Glu Gln Val Val Lys Asn Tyr Asn
770 775 780
Asn Asp Leu Ala Ser Thr Leu Gly Ser Thr Arg Phe Glu Lys Thr Arg
785 790 795 800
Trp Asp Gly Lys Asp Lys Asp Gly Lys Val Val Ala Asn Gly Thr Tyr
805 810 815
Thr Tyr Arg Val Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ser Gly Ala Lys Glu Gln
820 825 830
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Thr Ser Ala Thr Phe Ser Thr Glu Asp Arg Arg Leu Thr Leu Ala Ser
850 855 860
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Tyr Met Asp Glu Asp Leu Pro Thr Thr Glu Tyr Ile Ser Pro Asn Glu
885 890 895
Asp Gly Thr Phe Thr Leu Pro Glu Glu Ala Glu Thr Met Glu Gly Ala
900 905 910
Thr Val Pro Leu Lys Met Ser Asp Phe Thr Tyr Val Val Glu Asp Met
915 920 925
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Gly Ala Gly Thr Val Val Ala Val Ile Ala Ala Gly Phe Asp Lys Asn
35 40 45
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50 55 60
Lys Glu Asp Leu Glu Lys Ala Lys Lys Glu His Gly Ile Thr Tyr Gly
65 70 75 80
Glu Trp Val Asn Asp Lys Val Ala Tyr Tyr His Asp Tyr Ser Lys Asp
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100 105 110
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Gly Ala Met Pro Glu Ala Gln Leu Leu Leu Met Arg Val Glu Ile Val
130 135 140
Asn Gly Leu Ala Asp Tyr Ala Arg Asn Tyr Ala Gln Ala Ile Arg Asp
145 150 155 160
Ala Ile Asn Leu Gly Ala Lys Val Ile Asn Met Ser Phe Gly Asn Ala
165 170 175
Ala Leu Ala Tyr Ala Asn Leu Pro Asp Glu Thr Lys Lys Ala Phe Asp
180 185 190
Tyr Ala Lys Ser Lys Gly Val Ser Ile Val Thr Ser Ala Gly Asn Asp
195 200 205
Ser Ser Phe Gly Gly Lys Thr Arg Leu Pro Leu Ala Asp His Pro Asp
210 215 220
Tyr Gly Val Val Gly Thr Pro Ala Ala Ala Asp Ser Thr Leu Thr Val
225 230 235 240
Ala Ser Tyr Ser Pro Asp Lys Gln Leu Thr Glu Thr Val Thr Val Lys
245 250 255
Thr Ala Asp Gln Gln Asp Lys Glu Met Pro Val Leu Ser Thr Asn Arg
260 265 270
Phe Glu Pro Asn Lys Ala Tyr Asp Tyr Ala Tyr Ala Asn Arg Gly Thr
275 280 285
Lys Glu Asp Asp Phe Lys Asp Val Lys Gly Lys Ile Ala Leu Ile Glu
290 295 300
Arg Gly Asp Ile Asp Phe Lys Asp Lys Ile Ala Lys Ala Lys Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Val Gly Val Leu Ile Tyr Asp Asn Gln Asp Lys Gly Phe Pro
325 330 335
Ile Glu Leu Pro Asn Val Asp Gln Met Pro Ala Ala Phe Ile Ser Arg
340 345 350
Lys Asp Gly Leu Leu Leu Lys Asp Asn Pro Gln Lys Thr Ile Thr Phe
355 360 365
Asn Ala Thr Pro Lys Val Leu Pro Thr Ala Ser Gly Thr Lys Leu Ser
370 375 380
Arg Phe Ser Ser Trp Gly Leu Thr Ala Asp Gly Asn Ile Lys Pro Asp
385 390 395 400
Ile Ala Ala Pro Gly Gln Asp Ile Leu Ser Ser Val Ala Asn Asn Lys
405 410 415
Tyr Ala Lys Leu Ser Gly Thr Ala Met Ser Ala Pro Leu Val Ala Gly
420 425 430
Ile Met Gly Leu Leu Gln Glu Gln Tyr Glu Thr Gln Tyr Pro Asp Met
435 440 445
Thr Pro Ser Glu Arg Leu Asp Leu Ala Lys Lys Val Leu Met Ser Ser
450 455 460
Ala Thr Ala Leu Tyr Asp Glu Asp Glu Lys Ala Tyr Phe Ser Pro Arg
465 470 475 480
Gln Gln Gly Ala Gly Ala Val Asp Ala Lys Lys Ala Ser Ala Ala Thr
485 490 495
Met Tyr Val Thr Asp Lys Asp Asn Thr Ser Ser Lys Val His Leu Asn
500 505 510
Asn Val Ser Asp Lys Phe Glu Val Thr Val Thr Val His Asn Lys Ser
515 520 525
Asp Lys Pro Gln Glu Leu Tyr Tyr Gln Ala Thr Val Gln Thr Asp Lys
530 535 540
Val Asp Gly Lys His Phe Ala Leu Ala Pro Lys Ala Leu Tyr Glu Thr
545 550 555 560
Ser Trp Gln Lys Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ser Ser Lys Gln Val Thr
565 570 575
Val Pro Ile Asp Ala Ser Arg Phe Ser Lys Asp Leu Leu Ala Gln Met
580 585 590
Lys Asn Gly Tyr Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Phe Lys Gln Asp Pro
595 600 605
Lys Lys Glu Glu Leu Met Ser Ile Pro Tyr Ile Gly Phe Arg Gly Asp
610 615 620
Phe Gly Asn Leu Ser Ala Leu Glu Lys Pro Ile Tyr Asp Ser Lys Asp
625 630 635 640
Gly Ser Ser Tyr Tyr His Glu Ala Asn Ser Asp Ala Lys Asp Gln Leu
645 650 655
Asp Gly Asp Gly Leu Gln Phe Tyr Ala Leu Lys Asn Asn Phe Thr Ala
660 665 670
Leu Thr Thr Glu Ser Asn Pro Trp Thr Ile Ile Lys Ala Val Lys Glu
675 680 685
Gly Val Glu Asn Ile Glu Asp Ile Glu Ser Ser Glu Ile Thr Glu Thr
690 695 700
Ile Phe Ala Gly Thr Phe Ala Lys Gln Asp Asp Asp Ser His Tyr Tyr
705 710 715 720
Ile His Arg His Ala Asn Gly Lys Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Pro Asn
725 730 735
Gly Asp Gly Asn Arg Asp Tyr Val Gln Phe Gln Gly Thr Phe Leu Arg
740 745 750
Asn Ala Lys Asn Leu Val Ala Glu Val Leu Asp Lys Glu Gly Asn Val
755 760 765
Val Trp Thr Ser Glu Val Thr Glu Gln Val Val Lys Asn Tyr Asn Asn
770 775 780
Asp Leu Ala Ser Thr Leu Gly Ser Thr Arg Phe Glu Lys Thr Arg Trp
785 790 795 800
Asp Gly Lys Asp Lys Asp Gly Lys Val Val Ala Asn Gly Thr Tyr Thr
805 810 815
Tyr Arg Val Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ser Gly Ala Lys Glu Gln His
820 825 830
Thr Asp Phe Asp Val Ile Val Asp Asn Thr Thr Pro Glu Val Ala Thr
835 840 845
Ser Ala Thr Phe Ser Thr Glu Asp Arg Arg Leu Thr Leu Ala Ser Lys
850 855 860
Pro Lys Thr Ser Gln Pro Val Tyr Arg Glu Arg Ile Ala Tyr Thr Tyr
865 870 875 880
Met Asp Glu Asp Leu Pro Thr Thr Glu Tyr Ile Ser Pro Asn Glu Asp
885 890 895
Gly Thr Phe Thr Leu Pro Glu Glu Ala Glu Thr Met Glu Gly Ala Thr
900 905 910
Val Pro Leu Lys Met Ser Asp Phe Thr Tyr Val Val Glu Asp Met Ala
915 920 925
Gly Asn Ile Thr Tyr Thr Pro Val Thr Lys Leu Leu Glu Gly His Ser
930 935 940
Asn Lys Pro Glu Gln
945
Claims (27)
- 一種製備肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型3醣結合物之方法，其包含以下步驟：(a)使經分離肺炎鏈球菌血清型3莢膜多醣與碳酸衍生物及疊氮基連接體在非質子溶劑中進行反應以產生經活化疊氮基多醣，(b)使載體蛋白與具有N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)部分及炔基之試劑進行反應，其中該NHS部分與胺基進行反應以形成醯胺鍵聯，由此獲得經炔烴官能化之載體蛋白，(c)藉由Cu+1介導之疊氮化物-炔烴環加成反應使步驟(a)之該經活化疊氮基多醣與步驟(b)之該經活化炔烴-載體蛋白進行反應以形成醣結合物。
- 如請求項1之方法，其中該經分離多醣在該活化步驟(a)之前係經分篩。
- 如請求項2之方法，其中該經分離血清型3莢膜多醣係經分篩至重量平均分子量介於100kDa與200kDa之間。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該碳酸衍生物係1,1’-羰基二咪唑(1,1’-carbonyldiimidazole；CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(1,1’-carbonyl-di-(1,2,4-triazole)；CDT)、碳酸二琥珀醯亞胺基酯(disuccinimidyl carbonate；DSC)或氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該疊氮基連接體係式(I)化合物，H2N-X-N3 (I)其中X係選自由以下組成之群：CH2(CH2)n、(CH2CH2O)mCH2CH2、NHCO(CH2)n、NHCO(CH2CH2O)mCH2CH2、OCH2(CH2)n及O(CH2CH2O)mCH2CH2；其中n係選自1至10，且m係選自1至4。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該疊氮基連接體係式(II)化合物，
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及末端炔烴之試劑。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及環炔烴之試劑。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(III)化合物，
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑係式(IV)化合物：
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中步驟a)進一步包含使該經碳酸衍生物活化之多醣與一定量之疊氮基連接體進行反應，該量係該活化多醣中多醣重複單元之量的0.01至10莫耳當量。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中步驟b)包含使該載體蛋白與一定量之具有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分及炔基之試劑進行反應，該量係該載體上離胺酸的0.1至10莫耳當量。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中結合反應c)係於水性緩衝液中在作為觸媒之銅(I)存在下來實施。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中在步驟c)後，該方法進一步包含使用疊氮基封端劑(azido group capping agent)將保留於該結合物中之未反應疊氮基封端之步驟。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中在步驟c)後，該方法進一步包含使用炔基封端劑(alkyne group capping agent)將保留於該結合物中之未反應炔基封端之步驟。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法進一步包含在該醣結合物產生後，純化該醣結合物之步驟。
- 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其係根據如請求項1至16中任一項之方法所產生。
- 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(carrier protein；CP)之肺炎鏈球菌血清型3醣，且具有通式(VII)：
- 一種肺炎鏈球菌血清型3醣結合物，其包含經由間隔體共價結合至載體蛋白(CP)之肺炎鏈球菌血清型3醣，且具有通式(VII)，其中X係CH2(CH2)n’，其中n’為2；且其中X’係CH2O(CH2)n”CH2C=O，其中n”為1，且其中該血清型3醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於50kDa與1,000kDa之間。
- 如請求項17至19中任一項之血清型3醣結合物，其包含血清型3莢膜多醣，其中該多醣在結合之前之重量平均分子量(Mw)介於75kDa與200kDa之間。
- 如請求項20之血清型3醣結合物，其具有介於1,000kDa與4,000kDa之間之重量平均分子量(Mw)。
- 如請求項21之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係CRM197。
- 如請求項21之血清型3醣結合物，其中該載體蛋白係SCP。
- 一種免疫原組合物，其包含如請求項17至23中任一項之肺炎鏈球菌血清型3醣結合物。
- 如請求項24之免疫原組合物，其包含1至25種來自不同肺炎鏈球菌血清型之醣結合物。
- 如請求項24之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之醣結合物，其中該免疫原組合物係20價肺炎球菌結合物組合物。
- 如請求項24之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15A、15B、18C、19A、19F、22F、23A、23B、23F、24F、33F及35B之醣結合物，其中該免疫原組合物係25價肺炎球菌結合物組合物。
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