TWI714566B

TWI714566B - 軸手性異構體及其製備方法和製藥用途

Info

Publication number: TWI714566B
Application number: TW105110608A
Authority: TW
Inventors: 王建非; 張靜; 張龍; 張楊; 健黎; 曙輝陳
Original assignee: 大陸商南京明德新藥研發股份有限公司
Priority date: 2015-04-03
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2021-01-01
Also published as: CN105622531A; US10183915B2; US20180079731A1; EP3279188A1; JP6725530B2; TW201639823A; ES2835924T3; WO2016155653A1; EP3279188A4; JP2018515439A; EP3279188B1

Abstract

本發明公開了兩種軸手性異構體及其可用藥鹽，其製備方法，以及這兩種軸手性異構體或其藥物組合物的製藥用途。

Description

軸手性異構體及其製備方法和製藥用途

本發明涉及兩種軸手性異構體及其可用藥鹽，其製備方法，以及這兩種軸手性異構體或其藥物組合物的製藥用途。

Lesinurad(CAS：878672-00-5,RDEA594)作為一種降血尿酸試劑，是由Ardea Biosciences Inc公司在專利(WO2009070740)裡首次報導的，其合成路線如下。

合成路線1：

在隨後的多篇專利中(WO2011085009、WO2011126852、WO201159732、WO2012050589、WO2012092395、WO2014008295)，Ardea Biosciences Inc公司對Lesinurad及其鈉鹽的合成生產，與秋水仙鹼(colchicines)，非布索坦(Febuxostat)和別嘌呤醇(Allopurinol)等藥物的聯合用藥都做了詳盡的報導。

中國專利CN103524440A也報導了另外一種合成Lesinurad及其中間體的方法，如下。

合成路線2：

已經報導的這些專利都沒有明確提及Lesinurad是具有軸手性的一對手性旋光異構體的混合物，都沒有具體報導詳細的分離技術和詳細的手性合成技術，以及這一對手性旋光異構體的具體參數。

本發明提供了左旋或右旋的式(Ⅰ)化合物或其藥學上可接受的鹽，其以單一軸手性異構體形式或富含一種軸手性異構體形式存在。

本發明的一個方案中，其中一種軸手性異構體的含量

60%，優選

70%，更優選

80%，更優選

90%，最優選

95%。

本發明還提供了式(Ⅱ)化合物：

本發明的一個方案中，式(Ⅱ)軸手性異構體過量

95%。

本發明還提供了式(Ⅲ)化合物：

本發明的一個方案中，式(Ⅲ)軸手性異構體過量

95%。

本發明還提供了製備上述化合物的方法，其包括式(Ⅳ)所示路線：

其中，Y選自O、NH或N(W)；W選自烷基，其任選地被鹵素、OH、CN或NH₂中的1、2或3個所取代；優選地，上述手性分離是指SFC分離；優選地，上述W選自C_1-6烷基，其任選地被鹵素、OH、CN或NH₂中的1、2或3個所取代。優選地，上述W選自甲基、乙基、丙基、三氟甲基、三氟乙基。

本發明還提供了製備上述化合物的方法，其包括式(Ⅴ)所示路線：

(Ⅴ)

其中L選自O、NH或N(R)；R代表手性基團，其選自手性的烷基、雜烷基、芳烷基、雜芳烷基、芳基；所述手性基團任選地被鹵素、OH、CN或NH₂中的1、2或3個所取代；優選地，所述非手性分離是指重結晶、薄層色譜分離、柱層析分離、快速過柱機分離、使用非手性填料的製備色譜柱分離。

本發明還提供了製備上述化合物的方法，其包括式(Ⅵ)所示路線：

其中，X選自F、Cl、Br、I、磺酸酯；R’選自F、Cl、Br、I或OH。

本發明製備方法的一個方案中，所述水解是在強鹼條件下進行。

本發明製備方法的一個方案中，所述強鹼優選自LiOH、NaOH、或者KOH。

本發明製備方法的一個方案中，所述R選自苯烷基或

，所述苯烷基中烷基上的C任選地被N、O、S、C(=O)、C(=O)O、S(=O)、S(=O)₂、C(=O)NH、S(=O)NH、S(=O)₂NH或NHBoc中的一個或多個所替代。

本發明製備方法的一個方案中，R優選自

、

、

本發明製備方法的一個方案中，所述溴化試劑為Br₂/鹼。

本發明製備方法的一個方案中，所述溴化試劑中的鹼優選自吡啶、三乙胺、或DIPEA。

本發明製備方法的一個方案中，所述磺酸酯選自甲磺酸酯、對甲基苯磺酸酯、對硝基苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。

本發明還提供了一種藥物組合物，包括治療有效量的上述化合物或其藥學上可接受的鹽作為活性成分以及藥學上可接受的載體。

本發明還提供了上述化合物或其藥學上可接受的鹽或上述組合物在製備治療血尿酸水準異常相關病症的藥物上的應用。

本發明還提供了一種治療血尿酸水準異常相關病症的方法，包括給予治療物件治療有效量的上述化合物或其藥學上可接受的鹽或上述組合物。

本發明還提供了上述化合物或其藥學上可接受的鹽或上述組合物作為治療血尿酸水準異常相關病症的藥物的應用。

術語定義。

本發明中，除非另有規定，“Lesinurad”特指式(Ⅰ)化合物。

“左旋或右旋的式(Ⅰ)化合物”可以是式(Ⅰ)化合物的單一軸手性異構體，也可以是富含一種軸手性異構體的混合物。

“富含一種軸手性異構體”指其中一種軸手性異構體的含量<100%，且

60%，優選

70%，更優選

80%，更優選

90%，最優選

95%。

軸手性異構體的過量指兩種軸手性異構體相對百分數之間的差值。例如，其中一種軸手性異構體的含量為90%，另一種軸手性異構體的含量為10%，則軸手性異構體過量為80%。

式(Ⅱ)和(Ⅲ)化合物分別是式(Ⅰ)化合物的兩種絕對構型，

和

分別是

的兩種絕對構型，

和

分別是

的兩種絕對構型，

和

分別是

的兩種絕對構型，

和

分別是

的兩種絕對構型，其結構可經單晶X射線衍射確證。

但是，為了便於表述，製備路線或者實施例中所述

、

所指代的內容不限於結構式所限定的單一軸手性異構體，也包括富含該單一軸手性異構體的情況。

(+)表示右旋，(-)表示左旋，(±)表示外消旋。

除非另有規定，術語“芳基”表示多不飽和的芳族烴取代基，可以是單取代、二取代或多取代的，可以是一價、二價或者多價，它可以是單環或多環(比如1至3個環；其中至少一個環是芳族的)，它們稠合在一起或共價連接。術語“雜芳基”是指含有一至四個雜原子的芳基(或環)。在一個示範性實例中，雜原子選自B、N、O和S，其中氮和硫原子任選地被氧化，氮原子任選地被四級銨化。雜芳基可通過雜原子連接到分子的其餘部分。芳基或雜芳基的非限制性實施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-惡唑基、4-惡唑基、2-苯基-4-惡唑基、5-惡唑基、3-異惡唑基、4-異惡唑基、5-異惡唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。

術語“芳烷基”意在包括芳基附著於烷基的那些原子團(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(如亞甲基)已經被例如氧原子代替的那些烷基，例如苯氧基甲基、2-吡啶氧甲基3-(1-萘氧基)丙基等。

DIPEA代表二異丙基乙胺；OTos代表對甲苯磺酸酯；OMs代表甲磺酸酯。

本發明所採用的術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。

術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機氨或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物的中性形式接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括氨基酸(如精氨酸等)的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽(參見Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19(1977))。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。

優選地，以常規方式使鹽與鹼或酸接觸，再分離母體化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母體形式與其各種鹽的形式的不同之處在於某些物理性質，例如在極性溶劑中的溶解度不同。

本文所用的“藥學上可接受的鹽”屬於本發明化合物的衍生物，其中，通過與酸成鹽或與鹼成鹽的方式修飾所述母體化合物。藥學上可接受的鹽的實例包括但不限於：鹼基比如胺的無機酸或有機酸鹽、酸根比如羧酸的鹼金屬或有機鹽等等。藥學上可接受的鹽包括常規的無毒性的鹽或母體化合物的四級銨鹽，例如無毒的無機酸或有機酸所形成的鹽。常規的無毒性的鹽包括但不限於那些衍生自無機酸和有機酸的鹽，所述的無機酸或有機酸選自2-乙醯氧基苯甲酸、2-羥基乙磺酸、乙酸、抗壞血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氫根、碳酸、檸檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富馬酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸鹽、羥萘、羥乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、雙羥萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水楊酸、硬脂酸、亞乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、對氨基苯磺酸、硫酸、單寧、酒石酸和對甲苯磺酸。

本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由遊離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。一般地，優選醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈等非水介質。

本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚(³H)，碘-125(¹²⁵I)或C-14(¹⁴C)。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。

術語“藥學上可接受的載體”是指能夠遞送本發明有效量活性物質、不干擾活性物質的生物活性並且對宿主或者患者無毒副作用的任何製劑或載體介質代表性的載體包括水、油、蔬菜和礦物質、膏基、洗劑基質、軟膏基質等。這些基質包括懸浮劑、增黏劑、透皮促進劑等。它們的製劑為化妝品領域或局部藥物領域的技術人員所周知。關於載體的其他資訊，可以參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams & Wilkins(2005)，該文獻的內容通過引用的方式併入本文。

針對藥物或藥理學活性劑而言，術語“有效量”或“治療有效量”是指無毒的但能達到預期效果的藥物或藥劑的足夠用量。對於本發明中的口服劑型，組合物中一種活性物質的“有效量”是指與該組合物中另一種活性物質聯用時為了達到預期效果所需要的用量。有效量的確定因人而異，取決於受體的年齡和一般情況，也取決於具體的活性物質，個案中合適的有效量可以由本領域技術人員根據常規試驗確定。

術語“活性成分”是指一種化學實體，它可以有效地治療目標紊亂、疾病或病症。

術語“任選”或“任選地”是指隨後描述的事件或情況可能發生或可能不發生，該描述包括發生所述事件或情況和不發生所述事件或情況。例如，乙基“任選”被鹵素取代，指乙基可以是未被取代的(CH₂CH₃)、單取代的(如CH₂CH₂F)、多取代的(如CHFCH₂F、CH₂CHF₂等)或完全被取代的(CF₂CF₃)。

術語“被取代的”是指特定原子上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為酮基(即=O)時，意味著兩個氫原子被取代。酮取代不會發生在芳香基上。術語“任選被取代的”是指可以被取代，也可以不被取代，除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。

當任何變數(例如R)在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被0-2個R所取代，則所述基團可以任選地至多被兩個R所取代，並且每種情況下的R都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。

本發明的進步。

我們發現Lesinurad具有手性軸引起的光學異構現象，並進一步發現(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在常溫下和血漿中都非常穩定，因此我們有理由開發出Lesinurad的單一軸手性異構體。

本發明詳細報導了本發明的兩個軸手性異構體(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在固體粉末中、常規有機溶液中和血漿溶液中的穩定性資料，穩定轉染URAT1基因的HEK293細胞系對標記尿酸的轉運被化合物抑制程度的評價，以及(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在大鼠體內的藥代動力學參數。從這些資料可以得出結論：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad固體在常規保存條件下和在溶液中是穩定的；在穩定轉染URAT1基因的HEK293細胞系對標記尿酸的轉運被化合物抑制程度的評價實驗中，(+)-Lesinurad的體外活性明顯優於(-)-Lesinurad，是體外活性較高的軸手性異構體，也優於消旋的(±)-Lesinurad；在SD-大鼠體內藥代動力學實驗中，未觀察到(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在體內的相互轉化，在體內(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad保持為穩定的單一軸手性異構體。

本發明的製備方法中，路線式(Ⅴ)或式(Ⅵ)不採用手性分離，從而降低了成本。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉數個較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：圖1：化合物12A單分子的立體結構橢球圖；圖2：化合物12A雙分子的立體結構橢球圖；圖3：化合物12A沿a軸方向的晶胞堆積圖；圖4：化合物12B單分子的立體結構橢球圖；圖5：化合物12B雙分子的立體結構橢球圖；以及圖6：化合物12B沿a軸方向的晶胞堆積圖。

下面通過實施例和測試例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對本領域的技術人員而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

實施例1：(-)-Lesinurad和(+)-Lesinurad的製備。

合成路線：

步驟1：化合物12A和12B的合成。

化合物12參照專利CN103524440A或者專利W2009070740報導方法合成。化合物12(330.00mg，763.31umol)經超臨界流體色譜SFC(手性柱：Chiralpak AS(250mm×30mm,5um)；流動相：超臨界CO₂/乙醇(0.05% DEA)=70/30；流速：60mL/min；檢測波長：220nm)分離得到化合物12A(150.00mg，346.96umol)和化合物12B(152.00mg，351.58umol)。

化合物12A：¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ：8.57(d,J=8.4Hz,1H),7.78-7.76(m,1H),7.69-7.58(m,2H),7.43(d,J=7.6Hz,1H),7.13(d,J=8.0Hz,1H),4.10-4.00(m,4H),2.59-2.51(m,1H),1.17-1.11(m,5H),0.89-0.83(m,2H)。SFC(手性柱：Chiralpak AS-H(250mm×4.6mm,5um)；流動相：乙醇(0.05% DEA)/超臨界CO₂=5~40%；流速：2.5mL/min；檢測波長：254nm)R_t=4.842min。軸手性異構體過量100%。[α]²⁵D=-11.036(c=9.455mg/mL乙醇溶液)。化合物12A的SXRD圖譜資料參見圖1~3，具體資料如下。

化合物12A晶體結構精修資訊。

化合物12A原子座標參數及等價溫度因數值。

化合物12A成鍵原子的鍵長和鍵角值。

化合物12A各向異性溫度因數值。

化合物12B：¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ：8.57(d,J=8.4Hz,1H),7.78-7.76(m,1H),7.68-7.60(m,2H),7.43(d,J=8.0Hz,1H),7.13(d,J=8.0Hz,1H),4.10-4.02(m,4H),2.60-2.51(m,1H),1.20-1.10(m,5H),0.89-0.83(m,2H).SFC(手性柱：Chiralpak AS-H(250mm×4.6mm,5um)；流動相：乙醇(0.05% DEA)/超臨界CO₂=5~40%；流速：2.5mL/min；檢測波長：254nm)R_t=5.113min..軸手性異構體過量95.7%。[α]²⁵D=9.053(c=8.645mg/mL乙醇溶液).化合物12B的SXRD圖譜資料參見圖4~6，具體資料如下。

化合物12B晶體結構精修資訊。

化合物12B原子座標參數及等價溫度因數值

化合物12B成鍵原子的鍵長和鍵角值。

化合物12B各向異性溫度因數值。

步驟2：化合物(-)-Lesinurad的合成。

將化合物12A(106.00mg,245.18umol，1.00eq)溶於四氫呋喃/水/乙醇(3mL，1：1：1)混合溶劑中。在降溫到0℃後，加入一水合氫氧化鋰(12.35mg，294.22umol，1.20eq)，並在0℃反應一小時。反應完畢後，用稀鹽酸(1mol/L)調到pH=4，在室溫下用氮氣吹乾除去四氫呋喃和乙醇。在殘餘物中加入水(1mL)，用二氯甲烷(2mL×6)萃取。合併有機相，在室溫下用氮氣吹乾除去二氯甲烷。在殘餘物中加入乙醇(1mL)溶解殘留物，再加入水(10mL)，混勻後冷凍乾燥得到白色固體化合物(-)-Lesinurad(94.40mg，233.50umol)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)=8.59(d,J=8.4Hz,1H),7.79-7.71(t,J=7.6Hz,1H),7.70-7.61(m,2H),7.45(d,J=8.0Hz,1H),7.16(d,J=8.4Hz,1H),3.97(s,2H),2.60-2.55(m,1H),1.18-1.14(d,J=6.4Hz,2H),0.91-0.86(m,2H)。LC/MS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.801min；MS m/z：404[M+H]⁺,406[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralpak AS-H(250mm× 4.6mm,5μm)；流動相：A：超臨界CO₂，B：甲醇(0.05% DEA)；梯度：5~40% B(5min),40% B(3min),5% B(1.5min)；流速：2.5mL/min；柱溫：33℃)R_t=5.197min。軸手性異構體過量96.5%。[α]²²D=-3.693(c=3.030mg/mL乙醇溶液)。

步驟3：化合物(+)-Lesinurad的合成。

將化合物12B(45.00mg,104.09umol,1.00eq)溶於四氫呋喃/水/乙醇(3mL,1：1：1)混合溶劑中。在降溫到0℃後，加入一水合氫氧化鋰(5.24mg,124.9umol,1.20eq)，並在0℃反應一小時。反應完畢後，用稀鹽酸(1mol/L)調到pH=4，在室溫下用氮氣吹乾除去四氫呋喃和乙醇。在殘餘物中加入水(1mL)，用二氯甲烷(2mL×6)萃取。合併有機相，在室溫下用氮氣吹乾除去二氯甲烷。在殘餘物中加入乙醇(1mL)溶解殘留物，再加入水(10mL)，混勻後冷凍乾燥得到白色固體化合物(+)-Lesinurad(38.40mg,82.59umol)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d ₆)=8.59(d,J=8.4Hz,1H),7.80-7.72(t,J=7.2Hz,1H),7.71-7.61(m,2H),7.45(d,J=7.2Hz,1H),7.16(d,J=8.0Hz,1H),3.99(s,2H),2.60-2.55(m,1H),1.20-1.12(dd,J=8.4Hz,J=1.6Hz,2H),0.91-0.83(m,2H)。LC/MS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.796min；MS m/z：404[M+H]⁺,406[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralpak AS-H(250mm×4.6mm,5μm)；流動相：A：超臨界CO₂，B：甲醇(0.05% DEA)；梯度：5~40% B(5min),40% B(3min),5% B(1.5min)；流速：2.5mL/min；柱溫：35℃)R_t=5.570min。軸手性異構體過量95.9%。[α]²⁵D=4.432(c=3.35mg/mL乙醇溶液)。

實施例2：(-)-Lesinurad和(+)-Lesinurad的製備。

合成路線：

步驟1：化合物14的合成。

將化合物13(2.00g,16.37mmol,1.00eq)與吡啶(2.59g,32.74mmol,2.00eq)溶於甲苯(30.00mL)中，混合液在冰水浴下冷卻至0℃，加入2-溴乙醯氯(3.09g,19.64mmol,1.20eq)，反應液在0℃下攪拌1小時後析出大量白色固體。反應完全後，過濾，濾餅用二氯甲烷(3mL)洗滌，所得濾液旋乾得到黃色油狀粗品。粗品經柱層析純化(洗脫劑：0~15%乙酸乙酯/石油醚)得到無色油狀化合物14(3.20g,13.16mmol，收率80.41%)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：7.45-7.22(m,6H),6.00-5.92(m,1H),4.07(s,1H),3.85(s,1H),1.63-1.55(d,J=4Hz,3H)。

步驟2：化合物15的合成。

化合物10參照專利CN10352440A報導方法合成。將化合物10(50.00mg,187.02umol,1.00eq)，化合物14(54.56mg,224.42umol,1.20eq)和碳酸鉀(31.02mg,224.42umol,1.20eq)溶於N,N-二甲基甲醯胺(10.00mL)中，反應液在15℃下攪拌2.5小時。反應完全後，將反應液旋乾得到黃色固體粗品。粗品經薄層色譜PTLC純化(展開劑：50%乙酸乙酯/石油醚)得到無色油狀化合物15。LCMS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.888min,MS：m/z 431[M+H]⁺。SFC(手性柱：Chiralpak AD-3 150×4.6mm I.D.,3um；流動相：A：超臨界CO₂，B：異丙醇(0.05% DEA)；梯度：5~40% B(5.5min),40% B(2min),5% B(2.5min)；流速：2.5mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：254nm)R_t=5.766min。

步驟3：化合物16A和16B的合成。

將化合物15(1.30g,3.03mmol,1.00eq)和吡啶(287.61mg,3.64mmol,1.20eq)溶於乙腈(500.00mL)中，混合液在冰水浴下冷卻至0℃，加入液溴(1.45g,9.09mmol,3.00eq)，反應逐漸升至15℃攪拌4小時。反應液用飽和亞硫酸氫鈉溶液(20mL)淬滅後，低溫旋乾得到黃色固體粗品16。粗品16經快速柱層析儀Combi Flash純化(洗脫劑：0~20%乙酸乙酯/石油醚)，得到化合物16A和16B。

化合物16A：LCMS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.951min,MS：m/z 508[M+H]⁺,510[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralcel OJ-H 250×4.6mm I.D.,5um；流動相：異丙醇(0.05% DEA)/超臨界CO₂(5%~40%)；流速：2.4mL/min；檢測波長：220nm)R_t=8.41min。

化合物16B：LCMS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.946min,MS：m/z 508[M+H]⁺,510[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralcel OJ-H 250×4.6mm I.D.,5um；流動相：異丙醇(0.05% DEA)/超臨界CO₂(5%~40%)；流速：2.4mL/min；檢測波長：220nm)R_t=7.54min。

步驟4：化合物(-)-Lesinurad的合成。

將化合物16A(10.00mg,19.67umol,1.00eq)和一水合氫氧化鋰(1.65mg,39.34umol,2.00eq)溶於四氫呋喃(1.50mL)和水(1.50mL)中，反應在15℃下攪拌16小時。反應完全後，反應液用稀鹽酸(1M)調節至體系pH=2-3，將反應液旋乾得到黃色油狀粗品。粗品經製備色譜HPLC分離(製備柱：Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um；流動相：A：水(含0.05%HCl)，B：乙腈；梯度38%~68% B(12min)；100% B(2min)；流速：25mL/min)後旋乾得到化合物(-)-Lesinurad(白色固體)。LCMS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相；乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.786min,MS：m/z 404[M+H]⁺,406[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralpak AS-H 250×4.6mm I.D.,5μm；流動相： A：超臨界CO₂,，B：甲醇(0.05% DEA)；梯度：5%~40%B(5min),40%B(3min),5%(1.5min)；流速：2.5mL/min；柱溫：35℃)R_t=5.279min。

步驟5：化合物(+)-Lesinurad的合成。

將化合物16B(10.00mg,19.67umol,1.00eq)和一水合氫氧化鋰(1.65mg,39.34umol,2.00eq)溶於四氫呋喃(1.50mL)和水(1.50mL)中，反應在15℃下攪拌16小時。反應完全後，反應液用稀鹽酸(1M)調節至體系pH=2-3，將反應液旋乾得到黃色油狀粗品。粗品經製備色譜HPLC分離(製備柱：Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um；流動相：A：乙腈，B：水(含0.05%HCl)；梯度38%~68% A(12min)；100% A(2min)；流速：25mL/min)後旋乾得到到化合物(+)-Lesinurad(白色固體)。LCMS(色譜柱：Ultimate XB-C18,3um,30×2.1mm；流動相：乙腈(0.02%三氟醋酸)的水(0.04%三氟醋酸)溶液；梯度：5%~95%(1.5min)；流速：1.2mL/min；檢測波長：220nm &254nm)R_t=0.787min,MS：m/z 404[M+H]⁺,406[M+H+2]⁺。SFC(手性柱：Chiralpak AS-H 250×4.6mm I.D.,5μm；流動相：A：超臨界CO₂，B：甲醇(0.05% DEA)；梯度：5%~40%B(5min),40%B(3min),5%(1.5min)；流速：2.5mL/min；柱溫：35℃)R_t=5.666min。

測試例1：穩定轉染URAT1基因的HEK293細胞系對標記尿酸的轉運被化合物抑制程度的評價。

實驗目的：採用穩定轉染URAT-1(尿酸轉運蛋白)基因的HEK293細胞系測定化合物抑制尿酸重吸收的IC₅₀值。

實驗材料：

URAT-1(HEK293)細胞系：穩定轉染URAT-1基因的HEK293細胞(細胞系由上海藥明康得新藥開發有限公司構建)；細胞培養液：DMEM培養液(Invitrogen 11965118),加10%胎牛血清(FBS,Corning 35076105)、1%丙酮酸鈉(Invitrogen 113600070)和300ug/mL G418(Gibco 10131)；HBSS緩衝液：(Invitrogen,14025126)；0.1M NaOH溶液：由NaOH乾粉(江蘇強盛化工有限公司20090206)配製；¹⁴C標記-尿酸溶液(ARC 0513A)；CO₂培養箱：(Thermo)；以及液體閃爍發光計數儀Tricarb：(Backman)。

實驗步驟和方法。

細胞接種：

1)吸掉細胞培養的培養上清，用10mL PBS洗細胞。

2)加入預熱過的胰酶到洗過的細胞培養瓶中，旋轉培養瓶使胰酶均勻覆蓋培養瓶底部。室溫消化。

3)每個T150培養瓶用10-15mL培養液懸浮細胞，吸取0.1mL用台盼藍溶液稀釋2倍計數細胞。

4)用培養液稀釋細胞到2.5×10⁵/mL，將稀釋好的細胞加入鼠尾膠原包被過的24孔板(800μL/孔，2×10⁵細胞/孔)。置於37度，5% CO₂培養箱培養過夜。

細胞準備：

1)細胞接種於24孔板16-18小時後，棄去上清。每孔加入600μl的HBSS緩衝液，清洗兩遍。

2)吸掉HBSS緩衝液後，再向每孔加入180μl的HBSS緩衝液。

化合物溶液製備、稀釋和加樣：

1)將化合物粉劑溶解於100% DMSO。然後對化合物以3倍稀釋6個點，或10倍稀釋2個點，最高起始濃度為50mM。

2)將步驟1)的5uL DMSO溶液轉入120μl HBSS緩衝液，稀釋25倍。

3)將步驟2)的10μL稀釋液加入24孔細胞板，置於37度，5% CO₂培養箱孵育15分鐘。DMSO終濃度為0.2%。細胞對照孔：不加化合物，只含0.2% DMSO。

檢測：將14C標記-尿酸溶液稀釋加入細胞板，終濃度為50μM。置於37度，5% CO₂培養箱孵育10分鐘。棄去上清液後，用HBSS緩衝液清洗細胞兩遍。向細胞加入0.1M NaOH溶液進行裂解。將細胞裂解液收集於液閃管，加入液閃液後，使用液閃計數儀Tri-Carb讀取信號值。

資料處理和分析：根據發光資料分析化合物對URAT-1抑制效果，計算抑制百分比資料。採用GraphPad Prism軟體對抑制百分比(inh%)資料進行非線性擬合分析得到IC₅₀值。

實驗結果見表1。

實驗結果表明：在多次平行測試中，(+)-Lesinurad的體外活性明顯優於(-)-Lesinurad，是體外活性較高的軸手性異構體，也優於消旋的(±)-Lesinurad。

測試例2：化合物固體在常溫下的穩定性評價。

實驗步驟和方法：取20mg測試化合物，置於5mL棕色透明具塞試劑瓶中，於氮氣櫃中(15℃)避光保存。在預先設定的保存時間後，準確稱取2mg左右測試化合物，加入乙醇，製備成1mg/mL的乙醇溶液，用高效液相色譜(HPLC)或者液質聯用色譜(LCMS)和超臨界流體色譜(SFC)檢測化合物的純度和手性純度。

實驗結果見表2。

實驗結果表明：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad固體粉末在15℃保存超過80天后，SFC純度未見變化，仍保持穩定。

測試例3：化合物在乙醇溶液中的穩定性評價。

實驗步驟和方法：準確稱取一定量測試化合物，加入乙醇，製備成乙醇溶液。將化合物的乙醇溶液置於加熱的油浴中攪拌。在檢測終點，用高效液相色譜(HPLC)或者液質聯用色譜(LCMS)和超臨界流體色譜(SFC)檢測化合物的純度和手性純度。

實驗結果見表3。

實驗結果表明：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad固體在乙醇溶液中加熱至37℃和70℃後，SFC純度未見變化，仍保持穩定。

測試例4：化合物在DMSO溶液中的穩定性評價。

實驗步驟和方法：準確稱取一定量測試化合物，加入DMSO，製備成DMSO溶液。將化合物的DMSO溶液置於加熱的油浴中攪拌。在檢測終點，取一定量DMSO溶液用乙醇稀釋後，用高效液相色譜(HPLC)或者液質聯用色譜(LCMS)和超臨界流體色譜(SFC)檢測化合物的純度和手性純度。

實驗結果見表4。

實驗結果表明：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad固體在DMSO溶液中加熱至80℃,120℃和160℃後，SFC純度未見變化，仍保持穩定。

測試例5：化合物在大鼠和人血漿中的穩定性評價。

1.實驗材料：

1.1 測試化合物儲存液：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad。

1.2 測試基質如下表。

2.實驗步驟與方法。

2.1 實驗之前，將凍存在-40℃冰箱內的血漿放在室溫下解凍，然後在37℃水浴鍋內孵育5-10min；4,000rpm離心5分鐘，去除血漿內的雜質和脂類。測試血漿pH，有必要的情況下，將pH調節到7.4±0.1。

2.2 10mM儲存液用DMSO稀釋至中間濃度400μM，稀釋步驟為：4μL的10mM儲存液加入96μL DMSO。

2.3 孵育樣品的製備：3μL的中間濃度溶液(400μM)加入到597μL的空白血漿中，形成終濃度為2μM的孵育樣品。將所有時間點(0,10,30,60,120min)的孵育樣品在37℃水浴鍋中孵育，每個樣品做兩個重複。

2.4 每到一個時間點從孵育板中取出100μL的孵育樣品，加入400μL的終止液(終止液為含有內標200ng/mL tolbutamaide和20ng/mL buspirone 50% ACN/MeOH溶液)沉澱蛋白。將已處理過的所有時間點的樣品在搖板機上充分混合。

2.5 離心20min,4,000rpm；取上清100μL，加入200μL超純水。搖板機上800rpm 10min，然後樣品進行LC-MS/MS分析。

3.實驗資料分析：以化合物峰面積與內標峰面積的比值來評估待測化合物的減少。血漿孵育之後，計算每個時間點的保留率，公式如下：%剩餘率=100*(特定時間點的峰面積比值/T0時間點的峰面積比值)

特定時間點：0,10,30,60,120min；T0：孵育之前的樣品

4.化合物在大鼠和人血漿中的穩定性結果

實驗結果見表5。

實驗結果表明：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在與人血漿或者SD-大鼠血漿共孵育2小時後仍保持穩定。

測試例6：化合物在大鼠體內的藥代動力學測試。

實驗目的：以SD大鼠為受試動物，應用LC/MS/MS法測定大鼠IV(靜注)，PO(灌胃)給予(±)-Lesinurad，(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad後，不同時刻測定血漿中(±)-Lesinurad，(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad的藥物濃度，研究本發明的化合物在大鼠體內的藥代動力學行為，評價其藥動學特徵。

實驗方案。

試驗藥品：(±)-Lesinurad，(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad。

試驗動物：健康成年雄性SD大鼠18只，分成6組(每個化合物各有IV,PO組)，每組3只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016。

藥物配製：稱取適量樣品，加入一定量的純水中，調節pH 7~8，分別製成1mg/mL(過濾後澄清)和2mg/mL(有少許混懸顆粒)用於IV和PO給藥。

給藥：SD大鼠18只，分成6組，每組3只，雄性，禁食一夜後分別IV，PO給藥。IV劑量為2mg/kg，給藥體積為2mL/kg；PO劑量為10mg/kg，給藥體積為5mL/kg。

實驗操作：IV組於給藥前及給藥後0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,24小時采血250μL，置於K2-EDTA的抗凝管中，3000rpm離心15分鐘，分離血漿，於-80℃保存。PO組於給藥前及給藥後0.25,0.5,1,2,4,8,24小時采血，其他操作同IV組。用LC/MS/MS法測定IV，PO給藥後大鼠血漿中的待測化合物含量。分析方法的線性範圍為6.00-18000nM，定量下限均為6.00nM；血漿樣品經沉澱蛋白預處理後進行分析。

藥代動力學參數結果：實驗結果見表6。

實驗結果表明：(+)-Lesinurad和(-)-Lesinurad在SD-大鼠體內藥代動力學表現相近，與(±)-Lesinurad相似。在體內未觀察到兩個軸手性異構體的相互轉化，在循環體系內保持為穩定的單一軸手性異構體。

Claims

一種式(II)化合物或其藥學上可接受的鹽。
一種如申請專利範圍第1項所述的化合物的製備方法，其包括式(IV)所示路線，
其中，Y選自O、NH或N(W)；W選自C_1-6烷基，其任選地被鹵素、OH、CN或NH₂中的1、2或3個所取代。
如申請專利範圍第2項所述的製備方法，其中，所述手性分離是指SFC分離。
如申請專利範圍第2項所述的製備方法，其中，W選自甲基、乙基、丙基、三氟甲基或三氟乙基。
一種如申請專利範圍第1項所述的化合物的製備方法，其包括式(V)所示路線，
其中L選自O、NH或N(R)； R選自苯烷基或
，所述苯烷基中烷基上的C任選地被N、O、S、C(=O)、C(=O)O、S(=O)、S(=O)₂、C(=O)NH、S(=O)NH、S(=O)₂NH或NHBoc中的一個或多個所替代。
如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中，所述非手性分離是指重結晶、薄層色譜分離、柱層析分離、快速過柱機分離、使用非手性填料的製備色譜柱分離。
如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其包括式(VI)所示路線，(VI)
其中，X選自F、Cl、Br、I、磺酸酯；R’選自F、Cl、Br、I或OH。
如申請專利範圍第2至7中任一項所述的製備方法，其中所述水解是在強鹼條件下進行。
如申請專利範圍第8項所述的製備方法，其中，所述強鹼選自LiOH、NaOH、或者KOH。
如申請專利範圍第5項所述的製備方法，其中，所述R選自
、
如申請專利範圍第7項所述的製備方法，其中所述溴化試劑為Br₂/鹼。
如申請專利範圍第11項所述的製備方法，其中，所述鹼選自吡啶、三乙胺、或DIPEA。
如申請專利範圍第7項所述的製備方法，其中所述磺酸酯選自甲磺酸酯、對甲基苯磺酸酯、對硝基苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。
一種藥物組合物，包括治療有效量的如申請專利範圍第1項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽作為活性成分以及藥學上可接受的載體。
一種如申請專利範圍第1項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或如請求項14所述的組合物在製備治療血尿酸水準異常相關病症的藥物上的應用。