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TWI618715B - 流感病毒疫苗及其用途 - Google Patents

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TWI618715B
TWI618715B TW101144619A TW101144619A TWI618715B TW I618715 B TWI618715 B TW I618715B TW 101144619 A TW101144619 A TW 101144619A TW 101144619 A TW101144619 A TW 101144619A TW I618715 B TWI618715 B TW I618715B
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安東聶塔 茵帕葛列佐
菲利普 艾拉
洛諾 佛格斯
史蒂芬 洛佛瑞斯
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傑森疫苗防護公司
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Abstract

本發明提供流感血球凝集素主幹域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中之一或多個胺基酸已突變。亦提供編碼該等多肽之核酸，包含該等多肽及/或核酸分子之組合物，以及其使用方法，尤其在偵測、預防及/或治療流感方面。

Description

流感病毒疫苗及其用途
本發明係關於醫藥領域。本文提供流感血球凝集素主幹域多肽，提供血球凝集素主幹域多肽之方法，包含其之組合物，包含其之疫苗，及其使用方法，尤其在偵測、預防及/或治療流感方面。
流感病毒為主要的人類病原體，其引起呼吸道疾病(通常稱為「流感」或「流行性感冒」)，嚴重度可在無症狀性感染(sub-clinical infection)至可引起死亡之原發性病毒性肺炎範圍內。感染之臨床作用隨流感病毒株之毒性及宿主之暴露量、病史、年齡及免疫狀態而變化。據估計在世界範圍內每年約有10億人經歷流感病毒之感染，在3至5百萬個病例中引起嚴重疾病，及引起估計300,000至500,000起流感相關死亡。大部分此等感染可歸因於攜帶H1或H3血球凝集素亞型之A型流感病毒，小部分歸因於B型流感病毒，且因此所有三者之代表株均包括於季節性疫苗中。當前免疫接種實踐依賴於早期鑑別傳播性流感病毒以允許及時製造有效的季節性流感疫苗。除在預測將在下一個季節期間占主導地位之病毒株方面存在固有的困難以外，抗病毒耐藥性及免疫逃避亦在當前疫苗無法預防發病及死亡中起一定作用。除此以外，大流行病之可能性對全球健康造成重大及現實的威脅，該大流行病由來源於動物儲存宿主之高毒性病毒株引起且經過再分類以增強人與人之間傳 播。
A型流感病毒在自然界中分佈廣泛且可感染多種禽類及哺乳動物。流感病毒為包膜RNA病毒，其屬於正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)家族。其基因組由8個單股RNA區段組成，該等單股RNA區段編碼以下11種不同的蛋白質：一種核蛋白(NP)、三種聚合酶蛋白(PA、PB1及PB2)、兩種基質蛋白(M1及M2)、三種非結構蛋白(NS1、NS2及PB1-F2)及兩種外部醣蛋白：血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA)。基於HA及NA蛋白之抗原結構之差異對病毒進行分類，且其不同組合表示獨特的病毒亞型，該等病毒亞型進一步分類為特定流感病毒株。儘管所有已知亞型均可見於禽類中，但目前傳播的人類A型流感亞型為H1N1及H3N2。系統發育分析已展示血球凝集素再分成兩個主要類群：尤其系統發育第1類群中之H1、H2、H5及H9亞型，及尤其系統發育第2類群中之H3、H4及H7亞型。
B型流感病毒株嚴格針對人類。B型流感病毒株內HA之抗原變異少於在A型病毒株內觀察到之抗原變異。B型流感病毒之兩種遺傳上及抗原上不同之譜系在人類中傳播，如由B/Yamagata/16/88(亦稱為B/Yamagata)及B/Victoria/2/87(B/Victoria)譜系所表示(Ferguson等人，2003)。儘管由B型流感病毒引起之疾病譜與由A型流感病毒引起之疾病譜相比一般較溫和，但在B型流感感染之情況下仍頻繁地觀察到需要住院治療之嚴重疾病。
已知中和流感病毒之抗體主要係針對血球凝集素(HA)。 血球凝集素或HA為三聚醣蛋白，其錨定至病毒外殼且具有雙重功能：其負責結合至細胞表面受體唾液酸，及在吸收之後，其介導病毒與內體膜之融合，引起病毒RNA在細胞之胞溶質中之釋放。HA包含較大頭部域及較小主幹域。對病毒膜之附著係由與主幹域連接之C端錨定序列所介導。蛋白以指定環形式轉譯後裂解，得到兩種多肽HA1及HA2(完整序列稱為HA0)。膜遠端頭部區主要來源於HA1，且膜近端幹區主要來自HA2(圖1)。
季節性流感疫苗必須每年更新之原因在於病毒之變異性較大。在血球凝集素分子中，此變異尤其表現於頭部域中，其中抗原漂移(drift)及轉移(shift)已產生大量不同的變異體。由於此頭部域亦為免疫顯性區，故大多數中和抗體係針對此域且藉由干擾受體結合來起作用。頭部域之免疫顯性與較大變異之組合亦解釋經特定病毒株感染不引起對其他病毒株之免疫性的原因：由首次感染誘生之抗體僅識別與初次感染之病毒密切相關之有限數目的病毒株。
近來，已經描述了缺乏全部或實質上全部流感血球凝集素球狀頭部域之流感血球凝集素主幹域多肽，且其用於對主幹域多肽之一或多個保守抗原決定基產生免疫反應。感信主幹域多肽之抗原決定基與球狀頭部域之高度免疫原性區相比免疫原性較低，因此，主幹域多肽中不存在球狀頭部域可能允許針對主幹域多肽之一或多個抗原決定基產生免疫反應(Steel等人，2010)。因此，Steel等人已藉由以下方式建立一種新的分子：使A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)及 A/Hong Kong/1968(H3N2)病毒株之HA1之胺基酸殘基53至276自HA一級序列中缺失，且用較短可撓性連接序列GGGG置換此缺失。用H3 HK68構築體對小鼠進行疫苗接種不會誘生可與第1類群HA交叉反應之抗血清。此外，如以下實例中所示，該等主幹域多肽高度不穩定且未採取正確構形，如由展示結合至幹區中之保守抗原決定基之抗體不發生結合所證實。
此外，Bommakanti等人(2010)描述一種基於HA2之多肽，其包含HA2之胺基酸殘基1至172、7胺基酸連接子(GSAGSAG)、HA1之胺基酸殘基7至46、6胺基酸連接子GSAGSA，後接HA1之殘基290至321，其中在HA1中有突變V297T、I300E、Y302T及C305T。該設計係基於H3 HA之序列(A/Hong Kong/1968)。該多肽僅針對H3亞型內另一流感病毒株(A/Phil/2/82)而非針對H1亞型(A/PR/8/34)提供交叉保護。
因此，仍存在對安全及有效之通用疫苗之需求，該通用疫苗刺激產生穩固的廣泛中和抗體反應，且針對一組廣泛的當前及未來流感病毒株(季節性及大流行性)提供保護，尤其針對系統發育第1類群及/或第2類群內之一或多種A型流感病毒亞型提供保護，以用於有效預防及治療流感。
本文提供流感血球凝集素主幹域多肽，提供主幹域多肽之方法，包含其之組合物，包含其之疫苗及其使用方法。
在第一態樣中，本發明提供新穎免疫原性多肽，其包含 流感血球凝集素主幹域且缺乏球狀頭部，稱為流感血球凝集素(HA)主幹域多肽。多肽能夠在投與個體(尤其為人類個體)時誘導免疫反應。本發明之多肽在膜遠端頭部域中存在之顯性抗原決定基不存在之情況下，向免疫系統呈現膜近端主幹域HA分子之保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域之HA0蛋白之一級序列的一部分，且將剩餘胺基酸序列直接再連接或在一些實施例中藉由引入較短可撓性連接序列(『連接子』)而再連接，以恢復胺基酸鏈之連續性。所得序列藉由引入特定突變來進一步修飾，該等特定突變使HA0分子之剩餘部分之天然3維結構穩定。免疫原性多肽不包含流感病毒之全長HA1及/或HA2。
流感血球凝集素主幹域多肽係基於一般用於人類流感疫苗製造之流感病毒株之HA。具體而言，多肽係基於H1、H5及/或H3亞型之A型流感病毒之HA。
在某些實施例中，本發明提供流感血球凝集素主幹域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中該血球凝集素主幹域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解，且其中連接HA2之A螺旋與螺旋CD之胺基酸序列中之一或多個胺基酸與野生型流感HA2域相比已突變。HA1及HA2域較佳來源於選自由H1、H5及H3亞型組成之群的A型流感病毒。
如圖1中所指示，本發明之多肽在使螺旋A之C端殘基連 接至螺旋CD之N端殘基的HA2胺基酸序列中包含一或多個突變。在某些實施例中，該HA2胺基酸序列中之一或多個疏水性胺基酸已經親水性胺基酸(諸如極性及/或帶電荷的胺基酸)或可撓性胺基酸甘胺酸(G)取代。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸1至x，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸y至末端(亦即HA1之C端胺基酸)。因此，在某些實施例中，HA1區段中之缺失包含位置x+1處之胺基酸至且包括位置y-1處之胺基酸的胺基酸序列。在某些實施例中，多肽不包含信號序列。因此，在某些實施例中，HA1 N端區段包含HA1之胺基酸p至x，其中p為成熟HA分子之第一個胺基酸(例如在SEQ ID NO：1之情況下，p=18)。熟習此項技術者將能在無信號肽(例如SEQ ID NO：1之胺基酸1至17)之情況下製備本文中所述之多肽。在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，本發明之多肽不包含HA之細胞內序列及跨膜域。在某些實施例中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域之位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域之C端的胺基酸序列。
本發明之多肽不包含全長HA1。
在某些實施例中，多肽經糖基化。
在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小於HA0，較佳缺乏HA之全部或實質上全部球狀頭部。免疫原性多肽長度較佳不大於360個、較佳不大於350、340、330、320、 310、305、300、295、290、285、280、275或270個胺基酸。在某些實施例中，免疫原性多肽長度為約250至約350個、較佳約260至約340個、較佳約270至約330個、較佳約270至約330個胺基酸。
在某些實施例中，與HA1及HA2域所基於之HA之胺基酸序列相比，多肽在HA1及/或HA2域中另外包含一或多個其他突變。
本發明亦提供提供流感血球凝集素幹多肽之方法，該方法包含以下一般步驟：(a)提供流感HA0胺基酸序列；(b)移除HA1與HA2之間的裂解位點；(c)自HA0序列中移除球狀頭部域之胺基酸序列，尤其自位置x+1開始至y-1之胺基酸序列；(d)在使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列中引入一或多個突變；及(e)在HA主幹域多肽中引入一或多個二硫橋連基。
可藉由該等方法獲得之多肽亦為本發明之一部分。
在某些實施例中，多肽包含第1類群交叉中和抗體CR6261(如WO 2008/028946中所揭示)及/或抗體CR9114(如下文及同在申請中之申請案EP 11173953.8中所述；一種能夠結合及中和第1類群及第2類群A型流感病毒以及B型流感病毒之抗體)之保守主幹域抗原決定基。因此，本發明之另一態樣提供HA主幹域多肽，其中該等多肽結合至抗體CR6261及/或抗體CR9114。在一實施例中，多肽不結合 至CR8057(描述於WO 2010/130636中；一種僅結合至H3流感病毒之單株抗體)。在某些實施例中，多肽結合至抗體CR8020、CR8043及/或CR9114。本文提供之流感血球凝集素主幹域多肽適用於免疫原性組合物(例如疫苗)，該免疫原性組合物能夠針對複數種A型及/或B型流感病毒株產生免疫反應。在一實施例中，流感血球凝集素主幹域多肽能夠針對系統發育第1類群及/或第2類群之A型流感病毒株、尤其針對系統發育第1類群及第2類群兩者之流感病毒株產生免疫反應。在一實施例中，多肽能夠針對同源流感病毒株產生免疫反應。在一實施例中，多肽能夠針對屬於相同及/或不同亞型之異源流感病毒株產生免疫反應。在另一實施例中，多肽能夠對系統發育第1類群及第2類群兩者之流感病毒株及B型流感病毒株產生免疫反應。
本發明之多肽可用於例如獨立治療及/或預防及/或診斷由流感病毒、尤其系統發育第1類群或第2類群A型流感病毒及/或B型流感病毒引起之疾病或病狀，或與其他預防性及/或治療性治療(諸如(現有或未來的)疫苗、抗病毒劑及/或單株抗體)組合。
在另一態樣中，本發明提供編碼流感HA主幹域多肽之核酸分子。在另一態樣中，本發明提供包含編碼免疫原性多肽之核酸的載體。
在另一態樣中，本發明提供在個體中誘導免疫反應之方法，該方法包含向個體投與本發明之多肽及/或核酸分子。
在另一態樣中，本發明提供免疫原性組合物，其包含本發明之多肽及/或核酸分子。本文提供之免疫原性組合物可呈允許組合物投與個體(例如小鼠、雪貂或人類)之任何形式。在一特定實施例中，免疫原性組合物適於人類投與。多肽、核酸分子及組合物可用於預防及/或治療流感病毒疾病之方法及/或用於診斷目的。組合物可另外包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在某些實施例中，本文中所述之組合物包含佐劑或與佐劑組合投與。
在另一態樣中，本發明提供多肽、核酸及/或免疫原性組合物，其用作疫苗。本發明尤其係關於免疫原性多肽、核酸及/或免疫原性組合物，其在預防及/或治療由系統發育第1類群及/或第2類群之A型流感病毒亞型及/或B型流感病毒引起之疾病或病狀中用作疫苗。
由以下本發明之[實施方式]，將清楚本發明之多肽之各種實施例及用途。
定義
下文給出如本發明中所用之術語的定義。
本發明之胺基酸可為20種天然產生之胺基酸(或『標準』胺基酸)中之任一者或其變異體(諸如D-脯胺酸(脯胺酸之D-對映異構體))、或並非天然可見於蛋白質中之任何變異體(諸如正白胺酸)。標準胺基酸可基於其性質劃分為數個群組。重要因素為電荷、親水性或疏水性、尺寸及官能基。此等性質對於蛋白質結構及蛋白質間相互作用很重 要。一些胺基酸具有特殊性質，諸如半胱胺酸，其可對其他半胱胺酸殘基形成共價二硫鍵(或二硫橋連基)；脯胺酸，其對多肽主鏈形成環；及甘胺酸，其與其他胺基酸相比可撓性較大。表5展示標準胺基酸之縮寫及性質。
術語「胺基酸序列一致性」係指一對經比對之胺基酸序列之間的一致性或相似性程度，通常以百分比形式表示。一致性百分比為在比對序列及引入空隙(如有必要)以獲得最大序列同源性百分比之後，候選序列中與肽中相應胺基酸殘基一致(亦即，在比對中在給定位置處之胺基酸殘基為相同殘基)或相似(亦即，如下文論述，在比對中在給定位置處之胺基酸取代為保守性取代)之胺基酸殘基的百分比。序列同源性(包括序列一致性及相似性百分比)使用此項技術中熟知之序列比對技術(諸如藉由目視檢查及數學計算)來測定，或更佳地，比較藉由使用電腦程式比較序列資訊來進行。一種例示性較佳電腦程式為Genetics Computer Group(GCG；Madison,Wis.)Wisconsin套裝10.0版程式『GAP』(Devereux等人(1984))。
「保守性取代」係指一個類別之胺基酸經相同類別之另一胺基酸置換。在特定實施例中，保守性取代不改變多肽之結構或功能或結構及功能兩者。出於保守性取代之目的，胺基酸之類別包括疏水性(例如Met、Ala、Val、Leu)、中性親水性(例如Cys、Ser、Thr)、酸性(例如Asp、Glu)、鹼性(例如Asn、Gln、His、Lys、Arg)、構形破壞者(例如Gly、Pro)及芳族(例如Trp、Tyr、Phe)。
如本文所用，術語「疾病」及「病症」可互換使用以指代個體中之病狀。在一些實施例中，病狀為病毒性感染，尤其為流感病毒感染。在特定實施例中，術語「疾病」係指由細胞或個體中存在病毒引起、或藉由病毒對細胞或個體之侵襲引起之病理狀態。在某些實施例中，病狀為個體中之疾病，其嚴重度藉由經由投與免疫原性組合物在個體中誘導免疫反應來降低。
如本文所用，術語「有效量」在向個體投與療法之情形下係指具有預防性及/或治療性作用之療法的量。在某些實施例中，「有效量」在向個體投與療法之情形下係指足以獲得以下效果之療法的量：降低或改善流感病毒感染、與其相關之疾病或症狀之嚴重度，諸如(但不限於)減少流感病毒感染、與其相關之疾病或症狀之持續時間；預防流感病毒感染、與其相關之疾病或症狀之發展；預防流感病毒感染、與其相關之疾病或症狀之發生或發作或復發；預防或減少流感病毒由一個個體傳播至另一個體；減少個體之住院治療及/或住院治療持續時間；提高患有流感病毒感染或與其相關之疾病之個體的存活率；消除流感病毒感染或與其相關之疾病；抑制或減少流感病毒複製；降低流感病毒效價；及/或增強及/或改良另一療法之預防性或治療性作用。在某些實施例中，有效量不引起全面保護免於流感病毒疾病，但與未經治療之個體相比引起流感病毒效價降低或數目減少。流感病毒之效價、數目或總負載降低之益處包括(但不限於)感染之症狀嚴重度較低、感染之症 狀較少及與感染有關之疾病的持續時間減少。
如本文所用之術語「宿主」意欲指代已引入載體(諸如選殖載體或表現載體)之生物體或細胞。生物體或細胞可為原核或真核的。宿主較佳包含經分離之宿主細胞，例如培養中之宿主細胞。術語「宿主細胞」僅意味經修飾以用於本發明之多肽之(過度)表現的細胞。應理解術語宿主意欲不僅指代特定個體生物體或細胞，而且指代該生物體或細胞之子代。由於某些修飾可能因突變或環境影響而發生於繼代中，故該子代可能實際上並非與親本生物體或細胞一致，但仍包括於如本文中所用之術語「宿主」之範疇內。
如本文所用之術語「包括(included或including)」視為後接措詞「(但不限於)」。
如本文所用，術語「感染」意謂藉由病毒在細胞或個體中倍增及/或存在而侵襲。在一個實施例中，感染為「活性」感染，亦即，病毒在細胞或個體中複製之感染。該感染特徵在於病毒自經病毒最初感染之細胞、組織及/或器官傳播至其他細胞、組織及/或器官中。感染亦可為潛伏性感染，亦即，病毒不複製之感染。在某些實施例中，感染係指由細胞或個體中存在病毒引起、或藉由病毒對細胞或個體之侵襲引起之病理狀態。
流感病毒分類成流感病毒類型：A屬、B屬及C屬。如本文所用之術語「流感病毒亞型」係指A型流感病毒變異體，其特徵在於血球凝集素(H)及神經胺酸酶(N)病毒表面 蛋白質之組合。根據本發明，流感病毒亞型可利用其H號數稱為諸如「包含H3亞型之HA之流感病毒」、「H3亞型之流感病毒」或「H3流感」，或利用H號數與N號數之組合稱為諸如「流感病毒亞型H3N2」或「H3N2」。術語「亞型」特定言之包括各亞型內之所有個別「病毒株」，該等病毒株通常由突變產生且展示不同病原性概況，包括天然分離株以及人造突變株或重配株及其類似物。該等病毒株亦可稱為病毒亞型之各種「分離株」。因此，如本文所用，術語「病毒株」及「分離株」可互換使用。人類流感病毒株或分離株之現行命名法包括病毒類型(屬)(亦即A、B或C)、首次分離之地理位置、病毒株號數及分離年份，通常在括號中給出HA及NA之抗原描述，例如A/Moscow/10/00(H3N2)。非人類病毒株亦在命名中包括起源宿主。A型流感病毒亞型可另外藉由參考其系統發育類群分類。系統發育分析已展示血球凝集素再分成兩個主要類群：尤其系統發育第1類群(「第1類群」流感病毒)中之H1、H2、H5、H9亞型，及尤其系統發育第2類群(「第2類群」流感病毒)中之H3、H4、H7及H10亞型。
如本文所用，術語「流感病毒疾病」係指由細胞或個體中存在流感病毒(例如A型或B型流感病毒)或者流感病毒侵襲細胞或個體而產生之病理狀態。在特定實施例中，術語係指由流感病毒引起之呼吸道疾病。
如本文所用，術語「核酸」意欲包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)及RNA分子(例如mRNA)及使用核苷 酸類似物產生之DNA或RNA之類似物。核酸可為單股或雙股的。如熟習此項技術者將輕易地瞭解，核酸分子可以化學方式或以生物化學方式修飾，或可含有非天然或經衍生之核苷酸鹼基。該等修飾包括例如：標記；甲基化；用類似物取代一或多個天然產生之核苷酸；核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)、帶電荷的鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；側接部分(例如多肽)；嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)；螯合劑；烷基化劑；及經修飾之鍵聯(例如α變旋異構核酸等)。除非另有說明，否則提及核酸序列涵蓋其互補序列。因此，提及具有特定序列之核酸分子應理解為涵蓋其互補股以及其互補序列。互補股亦適用於例如反義療法、雜交探針及PCR引子。
如本文所用，在某些實施例中，HA中胺基酸之編號係基於野生型流感病毒之HA0中胺基酸之編號，例如H1N1流感病毒株A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)之胺基酸的編號。因此，如本發明中所用，措詞「HA中位置「x」處之胺基酸」意謂對應於特定野生型流感病毒(例如A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1；其中HA2域之胺基酸已以斜體形式指示))之HA0中位置x處之胺基酸的胺基酸。熟習此項技術者將理解在其他流感病毒株及/或亞型中之等效胺基酸可藉由多重序列比對來測定(參見例如表9)。應注意，在貫穿本申請案所用之編號系統中，1係指不成熟HA0蛋白(SEQ ID NO：1)之N端胺基酸。成熟序列起始於例 如SEQ ID NO：1之位置18。在某些實施例中，等效胺基酸之編號係基於H3 HA0中胺基酸之編號，尤其基於H3N2流感病毒株A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)之胺基酸之編號。其他H3 HA序列中之等效胺基酸可藉由比對來測定。熟習此項技術者將理解在製造期間引導蛋白質轉運之前導序列(或信號序列；例如對應於SEQ ID NO：89之胺基酸1至17)一般不存在於例如用於疫苗之最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明之多肽包含不具有前導序列之胺基酸序列，亦即胺基酸序列係基於不具有信號序列之HA0的胺基酸序列。
如熟習此項技術者已知，「多肽」係指利用醯胺鍵鍵聯之胺基酸的聚合物。如本文所用，該術語可指代利用共價醯胺鍵鍵聯之單條多肽鏈。該術語亦可指代利用非共價相互作用(諸如離子接觸、氫鍵、凡得瓦爾力(Van der Waals)接觸及疏水性接觸)締合之多條多肽鏈。熟習此項技術者將認識到該術語包括例如藉由轉譯後處理而經修飾之多肽，該轉譯後處理諸如為信號肽裂解、二硫鍵形成、糖基化(例如N連接型糖基化)、蛋白酶裂解及脂質修飾(例如S-棕櫚醯化)。
「主幹域多肽」係指多肽，其包含構成天然產生之(或野生型)血球凝集素(HA)之主幹域的一或多條多肽鏈。主幹域多肽通常為單條多肽鏈(亦即對應於血球凝集素HA0多肽之主幹域)或兩條多肽鏈(亦即對應於與血球凝集素HA2多肽締合之血球凝集素HA1多肽之主幹域)。根據本發明， 與野生型HA分子相比，主幹域多肽包含一或多個突變，特定言之野生型HA之一或多個胺基酸殘基可能經其他胺基酸取代，該等其他胺基酸並非天然產生於特定野生型HA中之相應位置上。如下文所述，本發明之主幹域多肽可另外包含一或多個連接序列。
術語「載體」表示核酸分子，其中可插入第二核酸分子以用於引入其將複製且在一些情況下表現之宿主中。換言之，載體能夠轉運其已連接之核酸分子。如本文所用，術語「載體」涵蓋選殖載體以及表現載體。載體包括(但不限於)質體、黏質體、細菌人工染色體(BAC)及酵母人工染色體(YAC)及來源於噬菌體或植物或動物(包括人類)病毒之載體。載體包含由所提出之宿主識別之複製起點，且在表現載體之情況下，包含由宿主識別之啟動子及其他調節區。某些載體能夠在引入其之宿主中自主複製(例如具有細菌複製起點之載體可在細菌中複製)。其他載體一旦引入宿主中後即可整合於宿主之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。
如本文所用，術語「野生型」在病毒之情形下係指流行、自然傳播且產生典型疾病爆發之流感病毒。
流感病毒對全球公眾健康具有重大影響，每年引起數百萬例嚴重疾病、數以千計的死亡及可觀的經濟損失。當前三價流感疫苗對疫苗病毒株及密切相關之分離株誘發強力中和抗體反應，但極少擴展至亞型內分歧較大之病毒株或其他亞型。此外，選擇適當疫苗病毒株存在許多挑戰且經 常引起欠佳的保護。另外，預測下一次大流行病毒之亞型(包括其將出現之時間及地點)在當前是不可能的。
血球凝集素(HA)為來自A型流感病毒之主要包膜醣蛋白，其為中和抗體之主要標靶。血球凝集素在進入過程期間具有兩個主要功能。第一，血球凝集素經由與唾液酸受體相互作用來介導病毒對靶細胞表面之附著。第二，在病毒內飲之後，血球凝集素隨後觸發病毒與內體膜之融合以將其基因組釋放至靶細胞之細胞質中。HA包含具有約500個胺基酸之較大胞外域，該胞外域由宿主來源之酶裂解，產生仍然利用二硫鍵鍵聯之2條多肽。大部分N端片段(HA1，320至330個胺基酸)形成膜遠端球狀域，該膜遠端球狀域含有由病毒中和抗體識別之受體結合位點及大多數決定基。較小C端部分(HA2，約180個胺基酸)形成幹樣結構，該幹樣結構使球狀域錨定至細胞或病毒膜。HA1多肽中亞型之間的序列同源性程度(亞型之間34%至59%同源性)與HA2多肽中(51%至80%同源性)相比較小。最保守的區域為裂解位點周圍之序列，尤其為HA2N端23個胺基酸，其在所有A型流感病毒亞型中均為保守的(Lorieau等人，2010)。此區域之一部分以HA前驅體分子(HA0)中之表面環形式暴露，但在HA0裂解成HA1及HA2時變得不可及。
大多數中和抗體結合至圍繞受體結合位點之環且干擾受體結合及附著。由於此等環高度易變，故大多數靶向此等區之抗體為病毒株特異性的，解釋當前疫苗誘發如此有限 的病毒株特異性免疫之原因。然而，近來產生具有廣泛交叉中和效能之針對流感病毒血球凝集素之完全人類單株抗體。功能及結構分析已揭示此等抗體干擾膜融合過程且針對流感HA蛋白之主幹域中的高度保守抗原決定基(Throsby等人，2008；Ekiert等人2009；WO 2008/028946；WO 2010/130636)。
根據本發明，已設計含有此等抗原決定基之新穎HA主幹域多肽，以便建立基於通用抗原決定基之疫苗，該疫苗針對廣泛範圍流感病毒株誘發保護。基本上，首先自全長HA分子中移除高度易變且免疫顯性之部分(亦即頭部域)，產生主幹域多肽(亦稱為微型HA)。以此方式，免疫反應將對定位有針對廣泛中和抗體之抗原決定基的主幹域重定向。上述廣泛中和抗體用於探查新建分子之正確摺疊，並用於證實存在中和抗原決定基。
本發明之主幹域多肽能夠在膜遠端頭部域中存在之顯性抗原決定基不存在之情況下，向免疫系統呈現膜近端主幹域HA分子之保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域之HA0蛋白之一級序列的一部分，且直接再連接或在一些實施例中藉由引入較短可撓性連接序列(『連接子』)來再連接，以恢復多肽鏈之連續性。所得多肽序列藉由引入特定突變來進一步修飾，該等突變使HA0分子之剩餘部分之天然3維結構穩定。
因此，本發明提供多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基 酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中HA2域中之一或多個胺基酸已突變。因此，在本發明之多肽中，HA2域與HA主幹域多肽所基於之野生型流感血球凝集素之HA2域相比包含一或多個突變。
流感血球凝集素主幹域多肽係基於一般用於人類流感病毒疫苗之A型流感病毒亞型之HA。在較佳實施例中，主幹域多肽係基於包含H1、H5及/或H3亞型之HA之流感病毒的HA。
本發明特定言之提供流感血球凝集素主幹域多肽，其包含(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中血球凝集素主幹域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解，且其中連接HA2之A螺旋與螺旋CD之胺基酸序列中之一或多個胺基酸與野生型流感HA2域相比已突變。HA1及HA2域較佳來源於選自由H1、H5及H3組成之群的A型流感病毒亞型。
因此，如圖1中所指示，本發明之多肽在使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基的HA2胺基酸序列中包含一或多個突變。在某些實施例中，該HA2胺基酸序列中之一或多個疏水性胺基酸已經親水性胺基酸(諸如極性及/或帶電荷的胺基酸)或可撓性胺基酸甘胺酸(G)取代。
本發明之多肽不包含全長HA1。
在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小於HA0，較佳缺乏HA之全部或實質上全部球狀頭部。免疫原性多肽長度較佳不大於360個、較佳不大於350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275或270個胺基酸。在某些實施例中，免疫原性多肽長度為約250至約350個、較佳約260至約340個、較佳約270至約330個、較佳約270至約330個胺基酸。
在某些實施例中，與獲得HA 1及HA2域之HA之胺基酸序列相比，多肽在HA1及/或HA2域中另外包含一或多個其他突變。由此，進一步增強幹多肽之穩定性。
根據本發明，「HA1 N端區段」係指對應於流感血球凝集素(HA)分子之HA1域之胺基端部分的多肽區段。在某些實施例中，HA1 N端多肽區段包含HA1域之位置1至位置x之胺基酸，其中位置x上之胺基酸為HA1內之胺基酸殘基。術語「HA1 C端區段」係指對應於流感血球凝集素HA1域之羧基端部分之多肽區段。在某些實施例中，HA1 C端多肽區段包含HA1域之位置y至且包括C端胺基酸之胺基酸，其中位置y上之胺基酸為HA1內之胺基酸殘基。根據本發明，y大於x，因此，HA1 N端區段與HA1 C端區段之間(亦即HA1的位置x上之胺基酸與位置y上之胺基酸之間)的HA1域之區段已缺失，且在一些實施例中，經連接序列置換。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸1至x，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸y至末端。因 此，在某些實施例中，HA1區段中之缺失包含位置x+1處之胺基酸至且包括位置y-1處之胺基酸的胺基酸序列。
在某些實施例中，多肽不包含信號序列。因此，在某些實施例中，HA1 N端區段包含HA1之胺基酸p至x，其中p為成熟HA分子之第一個胺基酸(例如在SEQ ID NO：1之情況下，p=18)。熟習此項技術者將能在無信號肽(例如SEQ ID NO：1之胺基酸1至17)之情況下製備本文中所述之多肽。在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，本發明之多肽不包含HA之細胞內序列及跨膜域。在某些實施例中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域之位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域之C端的胺基酸序列。
根據本發明，血球凝集素主幹域多肽在HA1與HA2之間的接合點處可抵抗蛋白酶裂解。熟習此項技術者已知跨越HA1及HA2之Arg(R)-Gly(G)序列為胰蛋白酶及胰蛋白酶樣蛋白酶之識別位點且通常裂解以達成血球凝集素活化。由於本文中所述之HA主幹域多肽不應活化，故本發明之流感血球凝集素主幹域多肽耐蛋白酶裂解。因此，根據本發明，移除蛋白酶裂解位點，或使跨越HA1及HA2之蛋白酶位點突變成耐蛋白酶裂解之序列。
在某些實施例中，HA1 C端主幹區段之C端胺基酸殘基為除精胺酸(R)或離胺酸(K)以外之任何胺基酸。在某些實施例中，HA1 C端胺基酸為麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)、蘇 胺酸(T)、天冬醯胺(N)、天冬胺酸(D)或麩胺酸(E)。在某些實施例中，HA1 C端主幹區段之C端胺基酸殘基為麩醯胺酸(Q)。
在某些實施例中，多肽經糖基化。
流感血球凝集素主幹域多肽可基於任何天然產生之A型流感血球凝集素病毒之HA，該A型流感血球凝集素病毒屬於用於人類流感疫苗之亞型。一般用於流感疫苗之A型流感病毒亞型為H1、H3或H5亞型之A型流感病毒。「基於」意謂HA1域及/或HA2域的N端區段及/或C端區段與H1、H3及/或H5亞型之任何天然產生之流感血球凝集素之HA1及/或HA2域的相應N端及/或C端區段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性，該H1、H3及/或H5亞型為熟習此項技術者已知或後來發現的。在某些實施例中，流感血球凝集素主幹域多肽係基於第1類群A型流感病毒之流感血球凝集素。在某些實施例中，流感血球凝集素主幹域多肽係基於第2類群A型流感病毒之流感血球凝集素。在一些實施例中，流感血球凝集素主幹域多肽為雜交或嵌合多肽，其包含以下或由以下組成：來自複數種流感病毒株或亞型之區段及/或域。舉例而言，流感血球凝集素主幹域多肽可包含來自不同A型流感病毒HA亞型之HA1 N端及HA1 C端主幹區段及/或HA2域。
在某些實施例中，多肽係基於H1 HA。如下文所述，在一特定實施例中，多肽包含來自以下或基於以下之血球凝 集素主幹域：包含H1亞型之HA之A型流感病毒之HA，諸如來自流感病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO：1)。熟習此項技術者將理解，亦可根據本發明使用包含H1亞型之HA之其他A型流感病毒。在某些實施例中，多肽包含基於選自表7之A型H1流感病毒之HA的血球凝集素主幹域。
在某些實施例中，多肽包含HA1 N端多肽區段，該HA1 N端多肽區段包含H1 HA1域之位置1至位置x之胺基酸，其中x為位置46上之胺基酸與位置60上之胺基酸之間的任何胺基酸，諸如為位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59上之胺基酸，較佳其中x為52、53、55或59。多肽較佳包含不具有信號序列之HA1 N端區段，亦即包含HA1域之位置18(例如對於H1 HA而言，諸如SEQ ID NO：1；或其他H1流感病毒株中之等效位置)至位置x之胺基酸的HA1 N端區段。因此，在某些實施例中，HA1 N端區段包含HA1域之位置p(其中對於H1 HA而言，在SEQ ID NO：1中，p=18；或其他H1 HA上之等效位置)至位置x之胺基酸。
在某些實施例中，HA1 C端多肽區段包含H1 HA1域之位置y至且包括C端胺基酸之胺基酸，其中y為H1 HA1之位置290上之胺基酸與位置325上之胺基酸之間的任何胺基酸，較佳其中y為291、303、318或321。根據本發明，HA2域在使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基的HA2胺基酸序列中包含一或多個突變(圖1)。在某些實施例中，該 HA2胺基酸序列中之一或多個疏水性胺基酸已經親水性胺基酸(諸如極性及/或帶電荷的胺基酸)取代。在某些實施例中(例如對於H1 HA而言，諸如SEQ ID NO：1)，連接螺旋A之C端殘基與螺旋CD之N端殘基的HA2胺基酸序列包含流感HA2之殘基402至418之間的胺基酸序列。在某些實施例中，連接螺旋A之C端殘基與螺旋CD之N端殘基之HA2胺基酸序列包含胺基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO：17)。
在某些實施例中，x為59且y為291。
在某些實施例中，x為52且y為321。
在某些實施例中，x為53且y為303。
在某些實施例中，x為55且y為318。
在一實施例中，使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列對應於：SEQ ID NO：1之HA2的位置402上之胺基酸與位置418上之胺基酸之間的胺基酸序列，其中多肽在跨越SEQ ID NO：1之胺基酸402至418之胺基酸序列中包含一或多個突變。血清型H1之流感HA之殘基402至418之間的胺基酸序列包含胺基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO：17)。在某些實施例中，血清型H1之流感HA之殘基402至418之間的胺基酸序列包含胺基酸序列MNTQX1TAX2GKEX3N(H/K)X4E(K/R)。
因此，在某些實施例中，如表6中所指示，多肽在H1 HA2域中包含一或多個突變。在某些實施例中，位置406、400、413及416上之胺基酸中之一或多者(亦即胺基 酸X1、X2、X3及X4中之一或多者)已突變(編號參考SEQ ID NO：1)。在某些實施例中，位置406上之胺基酸(亦即X1)已轉變成選自由以下組成之群的胺基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E及G，較佳為S。在某些實施例中，位置409上之胺基酸(亦即X2)已轉變成選自由以下組成之群的胺基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E及G，較佳為T、Q或G。在某些實施例中，位置413上之胺基酸(亦即X3)已轉變成選自由以下組成之群的胺基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E、G，較佳為S。在某些實施例中，位置416上之胺基酸(亦即X4)已轉變成選自由以下組成之群的胺基酸：S、T、N、Q、R、H、K、D、E、G，較佳為S。亦可能為此等突變之組合。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基1至59，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基291至343，其中位置343上之胺基酸(亦即R343)已突變且為除R以外之胺基酸，較佳為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，HA1 N端區段由HA1之胺基酸殘基1至59組成，且HA1 C端區段由HA1之胺基酸殘基291至343組成。應注意胺基酸之編號係基於H1 HA0中胺基酸之編號，特定言之係基於H1N1流感病毒株A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)之胺基酸之編號。應注意由於不同流感亞型/病毒株之HA序列與彼此相比可能在頭部區中具有插入或缺失，故編號未必總是相同。熟習此項技術者將能藉由序列比對來測定不同流感病毒株及/或亞型之HA序列中之等效胺基酸位置。
在某些實施例中，HA1 N端多肽區段不包含信號序列。在較佳實施例中，HA1 N端區段包含HA1域之位置18至位置59之胺基酸。在某些實施例中，HA1 N端區段由HA1域之胺基酸18至59組成。
在一些實施例中，本發明之多肽在HA1域及/或HA2域中包含一或多個其他突變(亦即胺基酸取代)。因此，在某些實施例中，HA1域另外包含以下突變中之一或多者：L58T、V314T及I316T。再次應注意胺基酸之編號係基於H1 HA0中胺基酸之編號，特定言之係基於H1N1流感病毒株A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)之胺基酸之編號。熟習此項技術者將能測定其他H1流感病毒之HA中之等效胺基酸，且因此將能測定等效突變。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突變中之一或多者：F406S、V409T及L416S。
在某些實施例中，HA1域另外包含突變K321C且/或HA2域另外包含以下突變中之一或多者：Q405C、F413C、E421C及Y502S。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突變：Q405C、F406S、V409T及L416S。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突變：F406S、V409T、F413C、L416S及E421C。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含突變：F406S、V409T、L416S及Y502S。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突變：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S及E421C。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及K321C，且HA2域包含突變：Q405C、F406S、V409T、F413C、L416S、E421C及Y502S。
在其他實施例中，HA2域另外包含突變M420I及V421I中之一或多者或等效突變。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T及I316T，且HA2域包含以下突變中之一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基1至52，較佳為HA1之胺基酸殘基18至52，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基321至343，其中位置343上之胺基酸(亦即R343)已突變且為除R以外之胺基酸，較佳為麩醯胺酸(Q)，其中HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在某些實施例中，HA1 N端主幹區段由HA1之胺基酸殘基1至52、較佳HA1之胺基酸殘基18至52組成，且HA1 C端主幹區段由HA1之胺基酸殘基321至343組成。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸 殘基1至53，較佳為HA1之胺基酸殘基18至53，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基303至343，其中位置343上之胺基酸(亦即R343)已突變且為除R以外之胺基酸，較佳為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，HA1 N端主幹區段由HA1之胺基酸殘基1至53、較佳HA1之胺基酸殘基18至53組成，且HA1 C端主幹區段由HA1之胺基酸殘基303至343組成。在一特定實施例中，HA1域包含突變V314T及I316T，且HA2域包含以下突變中之一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。在一較佳實施例中，多肽包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基1至55，較佳為HA1之胺基酸殘基18至55，且HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸殘基318至343，其中位置343上之胺基酸(亦即R343)已突變且為除R以外之胺基酸，較佳為麩醯胺酸(Q)。在某些實施例中，HA1 N端主幹區段由HA1之胺基酸殘基1至55、較佳HA1之胺基酸殘基18至55組成，且HA1 C端主幹區段由HA1之胺基酸殘基318至343組成。在一實施例中，HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、M420I及V421I。
在某些實施例中，多肽另外包含以下突變：HA1域中之R324C及HA2域中之T436C。
在一特定實施例中，HA1域包含突變L58T、V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突變中之一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在一實施例中，HA1域包含突變R324C，且HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在另一實施例中，HA1域包含突變V314T、I316T及R324C，且HA2域包含以下突變中之一或多者：F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在一實施例中，HA1域包含突變R324C，且HA2域包含突變F406S、V409T、L416S、M420I、V421I及T436C。
在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域之位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域之C端(編號根據SEQ ID NO：1)的胺基酸序列。在某些實施例中，藉由引入已知形成三聚體結構之序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143)(『摺疊子』序列)，視情況經由連接子連接，使多肽進一步穩定。連接子視情況可含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記(HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下添加連接子及his標記序列。
在某些實施例中，已移除HA2域之位置530(或等效位置)至HA2域之C端(編號根據SEQ ID NO：1)的胺基酸序列。在某些實施例中，細胞內及跨膜序列已經胺基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID NO：81)或SGRSLVPRGSPGSGYI PEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO：82)置換。
在某些實施例中，多肽選擇性結合至抗體CR6261及/或CR9114。在一實施例中，多肽不結合至抗體CR8057。在一實施例中，CR6261包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；CR9114包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在一實施例中，CR8057包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
如上所述，多肽包含流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段。連接序列不以天然產生之(或野生型)HA形式出現。在某些實施例中，連接子為包含以下之肽：1個胺基酸殘基、2個或2個以下胺基酸殘基、3個或3個以下胺基酸殘基、4個或4個以下胺基酸殘基、5個或5個以下胺基酸殘基、10個或10個以下胺基酸殘基、15個或15個以下胺基酸殘基、或20個或20個以下胺基酸殘基、或30個或30個以下胺基酸殘基、或40個或40個以下胺基酸殘基、或50個或50個以下胺基酸殘基。在一特定實施例中，連接序列為選自由以下組成之群的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、 GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG及GSGSGSG。
本發明亦提供提供本發明之多肽、特定言之提供本發明之H1 HA主幹域多肽之方法，以及利用此等方法可獲得或獲得之多肽。在某些實施例中，該方法包含以下步驟：
(a)提供流感HA0胺基酸序列，特定言之血清型H1之流感HA0胺基酸序列；
(b)移除HA1與HA2之間的裂解位點，較佳藉由使HA1之C端胺基酸突變成除精胺酸(R)或離胺酸(K)以外之胺基酸；
(c)自HA0序列中移除球狀頭部域之胺基酸序列；此舉藉由以下方式進行：使位置x上之胺基酸與位置y上之胺基酸之間的HA1域之區段缺失，且視情況經由具有0至50個胺基酸之連接序列將由此獲得之HA1之N端區段(跨越HA1之位置1上之胺基酸至且包括位置x上之胺基酸)與C端區段(跨越HA1之胺基酸y至C端胺基酸)再連接。在某些實施例中，x為位置46與60之間的任何位置上之胺基酸，較佳為HA1之位置52、53、55或59上之胺基酸，且其中y為位置290與325之間的任何位置上之胺基酸，較佳為HA1之位置291、303、318或321上之胺基酸。再次，所用編號參考SEQ ID NO：1。熟習此項技術者將理解在製造期間引導蛋白質轉運之前導序列(或信號序列；例如對應於SEQ ID NO：1之胺基酸1至17)一般將不存在於例如用於疫苗之最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明之多肽包含不具 有前導序列之HA1 N端區段。
(d)使經修飾之HA之融合前構形之穩定性增強且使融合後構形不穩定，較佳藉由在以下中引入一或多個突變：使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列、較佳為跨越SEQ ID NO：1之胺基酸402至418之胺基酸序列(尤其包含MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO：17)之胺基酸序列)。突變較佳包含將疏水性胺基酸殘基取代成親水性胺基酸殘基。
(e)在HA主幹域多肽中引入一或多個二硫橋連基。
根據本發明，移除HA1與HA2之間的裂解位點可藉由在P1位置處使R(在少數情況下為K)突變成Q來達成(參見例如Sun等人，2010對於裂解位點(SEQ ID NO：1中之位置343)之命名的解釋)。較佳突變成Q，但S、T、N、D或E為替代方案。
移除頭部域可例如藉由使來自SEQ ID NO：1之胺基酸53至320、或來自其他流感病毒之HA中之等效位置處的胺基酸缺失來達成。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置(x)(等效位置)處、例如在位置54、55、56、57或58處開始缺失；或藉由在位置 47、48、49、50、51或52處切割以增加缺失長度。類似地，最後一個欲缺失之胺基酸可在位置(y)、諸如315、316、317、318或319(等效位置)處，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)處以增加缺失長度。重要的是認識到，缺失長度之變化可藉由匹配連接子序列之長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。本發明亦涵蓋此等多肽。
根據本發明，增強A螺旋與CD螺旋之間的環之溶解度。此環由H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)中之殘基402至418(等效殘基)形成。因此，使經修飾之HA之融合前構形之穩定性增強且使融合後構形不穩定。如可在以下表6中看出，此環在H1序列中高度保守。此舉可例如藉由用親水性對應物置換該環中之胺基酸I、L、F或V來達成。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。突變成甘胺酸使融合後構形不穩定，因為此胺基酸之高度可撓性引起欲利用HA序列之此部分形成之融合後螺旋的穩定性降低。描述血清型H1之流感HA之殘基402至418之間的環之共同序列為(SEQ ID NO：17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本發明之多肽中，位置406、409、413及/或416(或其等效位置，如由序列比對測定)處之胺基酸為極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)或可撓性(G)胺基酸。亦可能為此等位點處之突變之組合，例如F406S、V409T、L416S。在一些情況下，較佳為恢復共同胺基酸 之突變，例如其中V或M在位置404處(突變成T)，V在408(突變成A)或410(突變成G)處，或I在414處(突變成N)；具有此等特定胺基酸之序列之發生率極低。表徵本發明之多肽之上述突變之概述在表6中給出。
根據本發明，將一或多個二硫橋連基引入主幹域多肽中，較佳在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置324與436(或等效位置)之胺基酸之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。根據本發明，可在位置418至433(等效位置)處將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列(例如IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO：83))引入本發明之多肽中。在某些實施例中，在位置419至433(等效位置)處引入來源於GCN4且亦已知三聚之序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)。在某些實施例中，藉由將M420、L423、V427、G430修飾成異白胺酸來使三聚體界面穩 定。
在某些實施例中，本發明之多肽含有H1 HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，已移除細胞內及跨膜序列，例如HA2域之位置523、524、525、526、527、526、528、529或530(或等效位置)至HA2域之C端(編號根據SEQ ID NO：1)的胺基酸序列，以在表現於細胞中之後產生可溶性多肽。在某些實施例中，藉由引入已知形成三聚體結構之序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：80)，視情況經由連接子連接，使多肽進一步穩定。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記(HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下添加連接子及his標記序列。在某些實施例中，細胞內及跨膜序列已經胺基酸序列AGRHHHHHHH(SEQ ID NO：97)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO：82)置換。
申請人先前已鑑別由來自經接種疫苗之個體之原代人類B細胞分離的廣泛中和抗體，其中一些對第1類群具有特異性(例如CR6261，如WO 2008/028946中所述)，且其中一些對第2類群流感病毒具有特異性(例如CR8020，如WO 2010/130636中所述)。此等單株抗體之抗原決定基之詳細分析已揭露此等特異性抗體缺乏交叉反應性之原因。在兩種情況下，聚糖存在於第1類群或第2類群HA分子中之不 同位置上至少部分解釋抗體具有類群特異性之事實。如下文所述，在鑑別與許多第1類群及第2類群HA分子交叉反應之CR9114樣抗體之情況下，已清楚人類免疫系統有可能針對流感病毒誘生極廣泛中和抗體。然而，鑒於對每年疫苗接種流程之需求，在經(季節性)H1及/或H3亞型之流感病毒感染或疫苗接種之後顯然不誘生或僅在極低程度上誘生此等抗體。因此，在某些實施例中，本發明提供以構形正確方式呈現HA之幹區之多肽，以便在不存在免疫顯性可變區之情況下向免疫系統呈現誘生廣泛中和抗體之抗原決定基。由於已知聚糖模式在H1與H3 HA之間不同，且此差異可引起較多類群限制性抗體反應，故在不同實施例中，本發明之多肽係基於第2類群HA分子(例如H3之HA)。如以下實例3中所示，與H3亞型相比，CR9114對H1亞型之活體外中和能力較高。因此，猜測與H3 HA分子(其可歸因於HA1中N38上為許多第2類群HA亞型所共有之聚糖)相比，CR9114之抗原決定基對H1較可及。在不希望受此理論束縛下，可推斷若本發明之多肽係基於H1，則所得抗體很可能受第2類群HA分子上N38上之聚糖阻礙，且因此對第2類群流感病毒之活性稍低。因此，為了能夠誘生以良好活性對第1類群及第2類群兩者流感病毒起作用之廣泛中和抗體，在某些實施例中，本發明之主幹域多肽係基於H3 HA亞型。
人類經常受包含H1或H3亞型之HA之季節性流感病毒感染。顯然儘管暴露於此等流感病毒，但在自然情況下通常 不產生廣泛中和抗體。除HA中存在易變頭部區以外，此現象的原因之一可能為暴露於與先前所見亞型密切相關之新亞型不知何故使反應較不廣泛。因此，較佳可使個體暴露於較無關之亞型序列。因此，在另一實施例中，本發明之主幹域多肽係基於第2類群亞型之HA，該第2類群亞型在HA1中之位置38上含有天冬醯胺(N)(N38)且不為H3亞型。
在某些實施例中，多肽係基於A型流感病毒亞型。在某些實施例中，多肽不基於H7 HA。
如上所述，本發明之多肽不僅經設計基於來自第1類群之流感疫苗病毒亞型(諸如H1及H5)之親本HA序列，而且亦可基於來自第2類群之流感亞型之HA序列，尤其用於流感疫苗之第2類群之流感病毒亞型(諸如H3)。根據本發明，多肽經構築保守CR8020及CR8043之抗原決定基，因為此等抗體能夠中和多種第2類群病毒株(WO 2010/130636)。在此等多肽中，幹區底部處之β片及其周圍應儘可能的保守，因為此β片為CR8020及CR8043結合至H3 HA之區域。
在某些實施例中，HA域屬於H3亞型，較佳屬於A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)或A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)。熟習此項技術者將理解，亦可根據本發明使用包含H3亞型之HA之其他A型流感病毒。
在某些實施例中，多肽包含HA1 N端多肽區段或由HA1 N端多肽區段組成，該HA1 N端多肽區段包含H3 HA1域之 位置1至位置x之胺基酸，較佳包含HA1域之位置p至位置x之胺基酸，其中x為H3 HA1之位置56與69之間的任何胺基酸，諸如為57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68，較佳其中x為61、62、63或68。在某些實施例中，HA1 C端多肽區段包含H3 HA1域之位置y至且包括C端胺基酸之胺基酸，其中y為H3 HA1之位置292與325之間(且包括位置292及325)的任何胺基酸，較佳其中y為293、306、318或323。
在某些實施例中，HA域屬於H3亞型，較佳屬於A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)或A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)。
根據本發明，頭部域已藉由以下方式移除：使HA1序列之較大部分缺失，且經由較短連接子使N端及C端序列再連接。缺失長度可變化，但較佳HA1之N端序列之最後一個殘基與C端序列之第一個殘基在空間上緊靠在一起以避免經由連接序列引入病毒株。在H3序列中，可在S62至P322、S63至P305及T64至T317(等效位置)處引入缺失。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置63、64、65、66、67(等效位置)處開 始來減少缺失中之殘基數目，或藉由在位置57、58、59、60或61處切割來增加缺失長度。類似地，最後一個欲缺失之胺基酸可在位置317、318、319、320或321(等效位置)處，或在位置323、324、325、326或327(等效位置)處以增加缺失長度。重要的是認識到，缺失長度之變化可藉由匹配連接子序列之長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括於本發明中。
在某些實施例中，x為61且y為323。
在某些實施例中，x為62且y為306。
在某些實施例中，x為63且y為318。
在某些實施例中，x為位置62、63、64、65、66或位置56、57、58、59或60(等效位置)。
在某些實施例中，y為位置306、318、319、320、321或322(等效位置)，或位置324、325、326、327或328(等效位置)。
在一實施例中，使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列對應於：SEQ ID NO：89之HA2的位置400上之胺基酸與位置420上之胺基酸之間的胺基酸序列，或其他H3病毒株中等效位置上之胺基酸殘基，其中多肽在以下中包含一或多個突變：使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列，亦即跨越SEQ ID NO：89之胺基酸400至420之胺基酸序列，或其他H3流感病毒株中之等效胺基酸殘基。
在某些實施例中，使血清型H3之流感HA的螺旋A之C端 殘基連接至螺旋CD之N端殘基的胺基酸序列包含SEQ ID NO：104的胺基酸序列。
根據本發明，多肽在使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列中包含一或多個突變。在某些實施例中，多肽包含表9之一或多個突變、或H3亞型之其他流感病毒株中之等效突變。
根據本發明，已移除HA1與HA2之間的裂解位點。在某些實施例中，位置345(編號參考SEQ ID NO：89)處之裂解位點移除已突變(R345Q)，以防止自HA0形成HA1及HA2。視情況可再缺失殘基347至351(IFGAI，融合肽之一部分)，以使疏水性殘基對水性溶劑之暴露降至最低。裂解處之正電荷在H3中100%保守，且此突變可因此應用於所有序列中。
頭部域之缺失留下現暴露於水性溶劑之殘基400至420之間的B環。在H3 HA中，此環高度保守(參見表9)。共同序列為：401 I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO：104；編號參考SEQ ID NO：89)。為了增加此環之溶解度以用於呈融合前構形之本發明之多肽且使融合後構形不穩定，一些疏水性殘基必需修飾成極性(S、T、N、Q)、帶電荷的胺基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突變成G來增加可撓性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(編號參考SEQ ID NO：89)處之突變將有助於本發明之多肽之穩定性。
為了使本發明之多肽之融合前構形穩定，在於一級序列 中遠離但在摺疊之融合前構形中接近之兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋連基可在本發明之多肽中經工程化，較佳在H3 A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)中之位置326與438(等效位置)之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。藉由使此等殘基突變成半胱胺酸，可在H3 A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)中之位置334與393(等效位置)之間建立替代性半胱胺酸橋連基。在一些情況下，將位置321(等效位置)處之半胱胺酸修飾成甘胺酸以避免形成不當二硫橋連基。
在某些實施例中，多肽包含以下突變中之一或多者：F408S、I411T、F415S、V418G、I401R、K326C、S438C、T334C、I393C、C321G。
天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。在位置421至441(等效位置)處引入用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK。為了避免妨礙在位置326與 438之間形成二硫橋連基，亦使用在位置421至435(等效位置)處之替代性較短序列IEAIEKKIEAIEKKI。一種替代方案為在位置421至441處引入來源於GCN4且已知三聚之序列RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN或在位置421至435處引入較短序列RMKQIEDKIEEIESK。
本發明之多肽可含有HA之細胞內序列及跨膜域，以便所得多肽在表現於細胞中時呈現於細胞表面上。在其他實施例中，移除位置522至C端(等效位置)之細胞質序列及跨膜序列，以便在表現於細胞中之後產生分泌型(可溶性)多肽。一些其他殘基視情況可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置)缺失序列而包括於可溶性蛋白質中。藉由引入已知形成三聚體結構之序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143)(『摺疊子』序列)，視情況經由連接子連接，可使可溶性多肽進一步穩定。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記(HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下添加連接子及his標記序列。
根據本發明，HA2域之位置530(編號根據SEQ ID NO：1)至C端胺基酸之胺基酸序列可經移除並置換為以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ ID NO：81)或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO：82)。
在某些實施例中，HA1 N端主幹區段不包含信號序列。熟習此項技術者將理解在製造期間引導蛋白質轉運之前導序列(或信號序列；例如對應於SEQ ID NO：89之胺基酸1至17)一般將不存在於例如用於疫苗之最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明之多肽包含不具有前導序列之胺基酸序列。
根據本發明，多肽不基於B型流感之HA分子。B型流感病毒株嚴格地針對人類。B型流感病毒株內HA之抗原變異少於在A型病毒株內觀察到之抗原變異。B型流感病毒之兩種遺傳上及抗原上不同之譜系在人類中傳播，如由B/Yamagata/16/88(亦稱為B/Yamagata)及B/Victoria/2/87(B/Victoria)譜系所表示(Ferguson等人，2003)。儘管由B型流感病毒引起之疾病譜與由A型流感病毒引起之疾病譜相比一般較溫和，但在B型流感感染之情況下仍頻繁地觀察到需要住院治療之嚴重疾病。
根據本發明，提供模擬CR6261及CR9114之特異性抗原決定基之多肽，且其可用作免疫原性多肽以例如在單獨或與其他預防性及/或治療性治療組合活體內投與時誘生交叉中和抗體。在「交叉中和抗體」之情況下，抗體意謂能夠中和：系統發育第1類群之A型流感病毒之至少兩種、較佳至少三種、四種或五種不同亞型；及/或系統發育第2類群之A型流感病毒之至少兩種、較佳至少三種、四種或五種不同亞型；及/或B型流感病毒之至少兩種不同亞型，尤其由CR6261及CR9114中和的至少所有病毒株。
本發明之多肽不包含全長HA1。在某些實施例中，免疫原性多肽實質上小於HA0，較佳缺乏HA之全部或實質上全部球狀頭部。免疫原性多肽長度較佳不大於360個、較佳不大於350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275或270個胺基酸。在一實施例中，免疫原性多肽長度為約250至約350個、較佳約260至約340個、較佳約270至約330個、較佳約270至約330個胺基酸。
在某些實施例中，多肽選擇性結合至抗體CR6261及/或CR9114。在一實施例中，多肽不結合至抗體CR8057。在一實施例中，CR6261包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；CR9114包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列。在一實施例中，CR8057包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
如上所述，多肽包含流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至50個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段。連接序列不以天然產生之(或野生型)HA形式出現。在某些實施例中，連接子為包含以下之肽：1個胺基酸殘基、2個或2個以下胺基酸殘基、3個或3個以下胺基酸殘基、4個或4個以下胺基酸殘基、5個或5個以下胺基酸殘基、10個或 10個以下胺基酸殘基、15個或15個以下胺基酸殘基、或20個或20個以下胺基酸殘基、或30個或30個以下胺基酸殘基、或40個或40個以下胺基酸殘基、或50個或50個以下胺基酸殘基。在一特定實施例中，連接序列為選自由以下組成之群的序列：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG及GSGSGSG。
本發明亦提供提供本發明之多肽、特定言之提供本發明之HA主幹域多肽之胺基酸序列的方法，以及利用此等方法可獲得或獲得之多肽。在某些實施例中，該方法包含以下步驟：
-提供流感HA0胺基酸序列，例如血清型H1、H5或H3之流感HA0序列；
-移除HA1與HA2之間的裂解位點，較佳藉由使HA1之C端胺基酸突變成除精胺酸(R)或離胺酸(K)以外之胺基酸；
-自HA0序列中移除球狀頭部域之胺基酸序列；此舉藉由以下方式進行：使位置x上之胺基酸與位置y上之胺基酸之間的HA1域之區段缺失，且視情況經由具有0至50個胺基酸之連接序列將由此獲得之HA1之N端區段(跨越HA1之位置1上之胺基酸至且包括位置x上之胺基酸)與C端區段(跨越HA1之胺基酸y至C端胺基酸)再連接。
-使經修飾之HA之融合前構形之穩定性增強且使融合後構形不穩定，較佳藉由在以下中引入一或多個突變；使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列、 較佳為跨越H1 HA之胺基酸402至418之胺基酸序列(尤其包含MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO：17)或對於H3 HA之I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO：104)之胺基酸序列)。突變較佳包含將疏水性胺基酸殘基取代成親水性胺基酸殘基。
-在HA主幹域多肽中引入一或多個二硫橋連基。
根據本發明，移除HA1與HA2之間的裂解位點可藉由在P1位置處使R(在少數情況下為K)突變成Q來達成(參見例如Sun等人，2010對於裂解位點(SEQ ID NO：1中之位置343)之命名的解釋)。較佳突變成Q，但S、T、N、D或E為替代方案。
移除頭部域可例如藉由使來自SEQ ID NO：1之胺基酸53至320缺失來達成。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置(x)(等效位置)處、例如在位置54、55、56、57或58處開始缺失；或藉由在位置47、48、49、50、51或52處切割以增加缺失長度。類似地，最後一個欲缺失之胺基酸可在位置(y)、諸如315、316、317、318或319(等效位置)處，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)處以增加缺失長度。重要 的是認識到，缺失長度之變化可藉由匹配連接子序列之長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。本發明亦涵蓋此等多肽。
根據本發明，增強A螺旋與CD螺旋之間的環之溶解度。此環由H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)中之殘基402至418(等效位置)形成。因此，使經修飾之HA之融合前構形之穩定性增強且使融合後構形不穩定。如可在以下表6中看出，此環在H1序列中高度保守。此舉可例如藉由用親水性對應物置換該環中之胺基酸I、L、F或V來達成。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。突變成甘胺酸使融合後構形不穩定，因為此胺基酸之高度可撓性引起欲利用HA序列之此部分形成之融合後螺旋的穩定性降低。描述血清型H1之流感HA之殘基402至418之間的環之共同序列為(SEQ ID NO：17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本發明之某些多肽中，位置406、409、413及/或416(或其等效位置，如由序列比對測定)處之胺基酸為極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)或可撓性(G)胺基酸。亦可能為此等位點處之突變之組合，例如SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：14中之F406S、V409T、L416S。在一些情況下，較佳為恢復共同胺基酸之突變，例如其中V或M在位置404處(突變成T)，V在408(突變成A)或410(突變成G)處，或I在414處(突變成N)；具有此等特定胺基酸之序列之發生率極低。表徵本發明之多肽之上述突變之概述在 表6中給出。
根據本發明，將一或多個二硫橋連基引入主幹域多肽中，較佳在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置324與436(或等效位置)之胺基酸之間：SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：16。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
利用該方法可獲得之多肽亦為本發明之一部分。
天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。根據本發明，可在位置418至433(等效位置)處將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO：83)引入本發明之多肽中。在某些實施例中，在位置419至433(等效位置)處引入來源於GCN4且亦已知三聚之序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)。在某些實施例中，藉由將M420、L423、V427、G430修飾成異白胺酸來使三聚體界面穩定。
在某些實施例中，多肽包含選自由以下組成之群的胺基 酸序列：SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：111至SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：119至SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：144至SEQ ID NO：175及SEQ ID NO：177至SEQ ID NO：187。
在某些實施例中，多肽係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：113及SEQ ID NO：130。
熟習此項技術者將理解在製造期間引導蛋白質轉運之前導序列(或信號序列；例如對應於SEQ ID NO：1之胺基酸1至17)不存在於例如用於疫苗之最終多肽中。因此，在某些實施例中，本發明之多肽包含不具有前導序列之胺基酸序列。
可根據視為適於熟習技術者之任何技術(包括下文描述之技術)製備流感血球凝集素主幹域多肽。
因此，本發明之免疫原性多肽可藉由此項技術中已知之標準方法以DNA序列形式合成並選殖，且隨後使用此項技術中已知之適合之限制酶及方法活體外或活體內表現。因此，本發明亦關於編碼上述多肽之核酸分子。本發明另外關於包含編碼本發明之多肽之核酸的載體。在某些實施例中，本發明之核酸分子為載體(例如質體)之一部分。該等載體可利用熟習此項技術者所熟知之方法來輕易地操作，且可例如經設計以能夠在原核及/或真核細胞中複製。此外，許多載體可直接或以來自其之經分離之所需片段形式用於真核細胞轉型，且將全部或部分整合至該等細胞之基 因組中，產生在基因組中包含所需核酸之穩定宿主細胞。所用載體可為適於選殖DNA且可用於相關核酸轉錄之任何載體。當使用宿主細胞時，載體較佳為整合載體。或者，載體可為游離型複製載體。
熟習此項技術者能夠選擇適合之表現載體，且以功能方式插入本發明之核酸序列。為了獲得編碼多肽之核酸序列之表現，熟習此項技術者熟知能夠驅動表現之序列可功能性連接至編碼多肽之核酸序列，產生編碼呈可表現形式之蛋白質或多肽之重組核酸分子。通常，將啟動子序列置放於應表現之序列之上游。此項技術中可利用許多表現載體，例如Invitrogen之pcDNA及pEF載體系列、來自BD Sciences之pMSCV及pTK-Hyg、來自Stratagene之pCMV-Script等，該等表現載體可用於獲得適合之啟動子及/或轉錄終止子序列、polyA序列及其類似序列。當參考控制所編碼之多肽之轉錄及轉譯的序列適當插入編碼相關多肽之序列時，所得表現卡匣適用於製造相關多肽，稱為表現。驅動表現之序列可包括啟動子、強化子及其類似物及其組合。此等序列應能夠在宿主細胞中起作用，藉此驅動與其功能性連接之核酸序列之表現。熟習此項技術者意識到各種啟動子可用於獲得基因在宿主細胞中之表現。啟動子可為組成性的或經調節的，且可自各種來源(包括病毒、原核或真核來源)獲得或經人工設計。相關核酸可自天然啟動子或其衍生物或自完全異源之啟動子表現(Kaufman，2000)。一些用於在真核細胞中表現之熟知且較常用之啟 動子包含：來源於病毒(諸如腺病毒)之啟動子，例如E1A啟動子；來源於細胞巨大病毒(CMV)之啟動子，諸如CMV即時早期(IE)啟動子(本文中稱為CMV啟動子)(可例如自pcDNA,Invitrogen獲得)；來源於猴病毒40(SV40)之啟動子(Das等人，1985)；及其類似啟動子。適合之啟動子亦可來源於真核細胞，諸如金屬硫蛋白(MT)啟動子、延長因子1α(EF-1α)啟動子(Gill等人，2001)、泛素C或UB6啟動子(Gill等人，2001)、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子及其類似啟動子。測試啟動子功能及啟動子強度為熟習此項技術者之常規事項，且通常可例如涵蓋選殖在啟動子序列後面之測試基因(諸如lacZ、螢光素酶、GFP等)，及針對測試基因之表現測試。當然，啟動子可藉由其中序列之缺失、添加、突變來改變且針對功能性測試，以發現新型減弱或改良之啟動子序列。根據本發明，較佳為在所選真核細胞中產生較高轉錄水準之較強啟動子。
構築體可使用熟習此項技術者所熟知之方法轉染至真核細胞(例如植物、真菌、酵母或動物細胞)或適合之原核表現系統(如大腸桿菌(E.coli))中。在一些情況下，可將適合之『標記』序列(諸如(但不限於)his標記、myc標記、strep標記或flag標記)或完全蛋白質(諸如(但不限於)麥芽糖結合蛋白或谷胱甘肽S轉移酶)添加至本發明之序列中，以允許自細胞或上清液中純化及/或鑑別多肽。視情況可包括含有特異性蛋白水解位點之序列以在之後藉由蛋白水解消化 移除標記。
可藉由此項技術中已知之光譜學方法(例如圓二色性光譜學、傅里葉變換紅外光譜學(Fourier Transform Infrared spectroscopy)及NMR光譜學或X射線晶體學)分析經純化之多肽，以研究所需結構(如螺旋及β片)之存在。ELISA、Octet及FACS及其類似方法可用於研究本發明之多肽對前述廣泛中和抗體(CR6261、CR9114、CR8057)之結合。因此，可選擇具有正確構形之本發明之多肽。
本發明另外關於免疫原性組合物，其包含治療有效量之本發明之多肽及/或核酸中之至少一者。在某些實施例中，組合物包含多肽，該多肽包含血球凝集素主幹域，該血球凝集素主幹域來自(或基於)一種流感亞型之HA，例如基於包含例如H1或H7亞型之HA之流感病毒的HA。在某些實施例中，組合物包含多肽，該多肽包含血球凝集素主幹域，該血球凝集素主幹域基於兩種或兩種以上不同流感亞型之HA，例如包含以下之組合物：包含基於H1亞型之HA之血球凝集素主幹域之多肽、及包含基於H7亞型之HA之血球凝集素主幹域之多肽兩者。
免疫原性組合物較佳另外包含醫藥學上可接受之載劑。在本發明情形中，術語「醫藥學上可接受」意謂載劑在所用劑量及濃度下將不在其所投與之個體中引起不當或有害作用。該等醫藥學上可接受之載劑及賦形劑為此項技術中所熟知(參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company[1990]； Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer及L.Hovgaard編，Taylor及Francis[2000]；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe編，Pharmaceutical Press[2000])。術語「載劑」係指與組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。可例如採用鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。確切配方應適應投藥模式。多肽及/或核酸分子較佳以無菌溶液形式調配並投與。無菌溶液藉由無菌過濾或藉由此項技術中本身已知之其他方法來製備。溶液可隨後凍乾或填充至藥物劑量容器中。溶液之pH值一般在pH 3.0至pH 9.5(例如pH 5.0至pH 7.5)之範圍內。
本發明亦關於在個體中誘導免疫反應之方法，該方法包含投與個體如上所述之多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物。本發明之個體較佳為哺乳動物，其能夠受感染性致病試劑(特定言之為流感病毒)感染或可得益於免疫反應之誘導，該個體例如為齧齒動物(例如小鼠、雪貂或家畜或農畜)、或非人類靈長類動物或人類。個體較佳為人類個體。因此，本發明提供在利用本文中所述之多肽、核酸及/或免疫原性組合物之個體中誘導對流感病毒血球凝集素(HA)之免疫反應的方法，該流感病毒血球凝集素(HA)尤其屬於第1類群及/或第2類群A型流感病毒(諸如包含H1、H2、H3、H4、H5、H7及/或H10亞型之HA之流感病毒)及/或B型流感病毒。在一些實施例中，所誘導之免疫反應有 效預防及/或治療第1類群及/或第2類群A型流感病毒亞型及/或B型流感病毒引起之流感病毒感染。在一些實施例中，由本文中所述之多肽、核酸及/或免疫原性組合物誘導之免疫反應有效預防及/或治療由A型流感病毒之兩種、三種、四種、五種或六種亞型及/或B型流感病毒引起的A型及/或B型流感病毒感染。
由於已熟知較小蛋白質及/或核酸分子並不總是有效誘導強力免疫反應，故可能有必要藉由添加佐劑來增加多肽及/或核酸分子之免疫原性。在某些實施例中，本文中所述之免疫原性組合物包含佐劑或與佐劑組合投與。用於與本文中所述之組合物組合投與之佐劑可在該組合物投與之前、同時或之後投與。適合之佐劑之實例包括：鋁鹽，諸如氫氧化鋁及/或磷酸鋁；油-乳液組合物(或水包油組合物)，包括角鯊烯-水乳液，諸如MF59(參見例如WO 90/14837)；皂素調配物，諸如QS21及免疫刺激複合物(ISCOMS)(參見例如US 5,057,540；WO 90/03184；WO 96/11711；WO 2004/004762；WO 2005/002620)；細菌或微生物衍生物，其實例為單磷醯基脂質A(MPL)、3-O-脫醯MPL(3dMPL)、含有CpG基元之寡核苷酸、ADP核糖基化細菌毒素或其突變體(諸如大腸桿菌不耐熱腸毒素LT、霍亂菌毒素CT、百日咳毒素PT或破傷風類毒素TT)、基質M(Isconova)。此外，可使用已知免疫增強技術，諸如將本發明之多肽融合至此項技術中已知之蛋白質以增強免疫反應(例如破傷風類毒素、CRM197、rCTB、細菌鞭毛蛋白或 其他)、或在病毒體中包括多肽或其組合。可使用之其他非限制性實例例如由Coffman等人(2010)揭示。
在一實施例中，將本發明之流感血球凝集素主幹域多肽併入病毒樣粒子(VLP)載體中。VLP一般包含通常來源於病毒之結構蛋白質之病毒多肽。VLP較佳不能夠複製。在某些實施例中，VLP可能缺乏病毒之完整基因組或包含病毒之基因組的一部分。在一些實施例中，VLP不能夠感染細胞。在一些實施例中，VLP在其表面上表現熟習此項技術者已知之病毒(例如病毒表面醣蛋白)或非病毒(例如抗體或蛋白質)靶向部分中之一或多者。
在一特定實施例中，本發明之多肽併入病毒體中。含有本發明之多肽之病毒體可使用熟習此項技術者已知之技術製造。舉例而言，病毒體可藉由以下方式製造：破壞經純化之病毒，提取基因組，及將粒子與病毒蛋白質(例如流感血球凝集素主幹域多肽)及脂質一起重新裝配以形成含有病毒蛋白質之脂質粒子。
本發明亦關於上述多肽、核酸及/或免疫原性組合物，其用於在個體中針對流感HA誘導免疫反應，尤其用作疫苗。因此，本文中所述之流感血球凝集素主幹域多肽、編碼該等多肽之核酸或包含該等核酸或多肽之載體可用於針對流感病毒、例如針對流感病毒血球凝集素之幹區誘生中和抗體。本發明尤其關於如上所述之多肽、核酸及/或免疫原性組合物，其在預防及/或治療由系統發育第1類群及/或第2類群之A型流感病毒及/或B型流感病毒引起之疾病或 病狀中用作疫苗。在一實施例中，疫苗可用於預防及/或治療由系統發育第1類群及/或第2類群之兩種、三種、四種、五種、六種或六種以上不同亞型及/或B型流感病毒引起之疾病。本發明之多肽可在活體外或在適合之細胞表現系統(包括細菌及真核細胞)中合成之後使用，或者可藉由表現針對免疫原性多肽編碼之核酸而在有需要之個體中活體內表現。該等核酸疫苗可採用任何形式，包括裸DNA、質體或病毒載體(包括腺病毒載體)。
可使用標準投藥途徑進行本發明之多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物之投與。非限制性實例包括非經腸投與，諸如靜脈內、皮內、經皮、肌肉內、皮下等；或經黏膜投與，例如鼻內、經口及其類似方式。熟習此項技術者應能夠確定投與本發明之多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物之各種可能性，以便誘導免疫反應。在某些實施例中，多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物(或疫苗)投與一次以上，亦即呈所謂同源初免-加強(prime-boost)方案形式。在某些實施例中，當不止一次投與多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物時，第二劑量之投與可在以下時間間隔之後進行：例如第一劑量投與之後1週或1週以上、第一劑量投與之後2週或2週以上、第一劑量投與之後3週或3週以上、第一劑量投與之後1個月或1個月以上、第一劑量投與之後6週或6週以上、第一劑量投與之後2個月或2個月以上、第一劑量投與之後3個月或3個月以上、第一劑量投與之後4個月或4個月以上等，直至多肽、核酸分子及/或免 疫原性組合物之第一劑量投與之後數年。亦可能投與疫苗大於兩次，例如三次、四次等，以便第一次初免投與繼之以一次以上加強投與。在其他實施例中，僅投與一次本發明之多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物。
多肽、核酸分子及/或免疫原性組合物亦可在異源初免-加強方案中以初免或加強形式投與。
本發明另外提供在利用本文中所述之多肽、核酸及/或組合物之個體中預防及/或治療流感病毒疾病的方法。如上所述，在一特定實施例中，一種在個體中預防及/或治療流感病毒疾病之方法包含投與有需要之個體有效量之多肽、核酸及/或免疫原性組合物。治療有效量係指如本文所定義之多肽、核酸及/或組合物之量，該量有效預防、改善及/或治療由第1類群或第2類群A型流感病毒及/或B型流感病毒感染引起之疾病或病狀。預防涵蓋抑制或減少流感病毒之傳播、或抑制或減少與流感病毒感染有關之一或多種症狀之發作、發生或發展。如本文中所用之改善可指代減少可見或可察覺之疾病症狀、病毒血症或任何其他可量測之流感感染表現。
需要治療者包括已遭受由經第1類群或第2類群A型流感病毒或B型流感病毒感染引起之病狀者、以及欲預防流感病毒感染者。因此，本發明之多肽、核酸及/或組合物可投與未處理個體(亦即不患有由流感病毒感染引起之疾病或尚未及當前未經流感病毒感染感染之個體)或投與早已及/或已經受流感病毒感染之個體。
在一實施例中，預防及/或治療可以容易受到流感病毒感染之患者群體為目標。該等患者群體包括(但不限於)例如老年人(例如50歲、60歲且較佳65歲)、年輕人(例如5歲、1歲)、住院治療之患者及已用抗病毒化合物治療但顯示抗病毒反應不夠之患者。
在另一實施例中，多肽、核酸及/或免疫原性組合物可與一或多種其他活性藥劑組合投與個體，該等其他活性藥劑諸如為現有或未來的流感疫苗、單株抗體及/或抗病毒劑、及/或抗細菌劑及/或免疫調節劑。一或多種其他活性藥劑可有益於治療及/或預防流感病毒疾病，或可改善與流感病毒疾病有關之症狀或病狀。在一些實施例中，一或多種其他活性藥劑為疼痛舒解劑、抗發熱藥物、或緩和或輔助呼吸之療法。
本發明之多肽及/或核酸分子之給藥方案可經調整以提供最佳所需反應(例如治療反應)。適合之劑量範圍可例如為0.1毫克/公斤體重至100毫克/公斤體重，較佳為1毫克/公斤體重至50毫克/公斤體重，較佳為0.5毫克/公斤體重至15毫克/公斤體重。欲使用之多肽及/或核酸分子之精確劑量將例如視投藥途徑及由其引起之感染或疾病之嚴重度而定，且應根據醫師之判斷及各個體之情況來決定。舉例而言，有效劑量視以下而改變：靶部位、患者之生理狀態(包括年齡、體重、健康狀態)以及治療為預防性的抑或治療性的。患者通常為人類，但亦可治療非人類哺乳動物，包括轉殖基因哺乳動物。治療劑量經最佳滴定以使安全性 及功效最佳化。
本發明之多肽亦可用於驗證鑑別為潛在治療候選物之單株抗體的結合。此外，本發明之多肽可用作診斷工具，例如藉由在個體之血清中確定是否存在能夠結合至本發明之多肽之抗體來測試該個體之免疫狀態。因此，本發明亦關於用於偵測患者中存在流感感染之活體外診斷方法，該方法包含以下步驟：a)使自該患者獲得之生物樣本與本發明之多肽接觸；及b)偵測抗體-抗原複合物之存在。
本發明之多肽亦可用於鑑別新的結合分子或改良現有結合分子，諸如單株抗體及抗病毒劑。
本發明另外說明於以下實例及圖式中。實例不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
實例 實例1：鑑別新穎第1類群及第2類群交叉中和抗體：CR9114
藉由靜脈穿刺在EDTA抗凝血試樣管中收集來自正常健康供體之周邊血液。scFv噬菌體呈現文庫基本上如WO 2008/028946中所述獲得，該專利以引用之方式併入本文中。針對以下A型流感亞型之重組血球凝集素(HA)進行選擇：H1(A/New Caledonia/20/99)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H4(A/鴨/Hong Kong/24/1976)、H5(A/雞/Vietnam/28/2003)、H7(A/Netherlands/219/2003)及H9(A/HongKong/1073/99)。進行連續兩輪選擇，隨後分離個別單鏈噬菌體抗體。在第二輪選擇之後，使用個別大腸桿菌群落來製備單株噬菌體 抗體。在ELISA中驗證在上述篩檢中獲得之含有單鏈噬菌體抗體之所選上清液的特異性，亦即對不同HA抗原之結合。為此目的，將以下塗佈至MaxisorpTM ELISA盤：桿狀病毒表現之重組H1(A/New Caledonia/20/99)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/04)、H7(A/Netherlands/219/2003)及B(B/Ohio/01/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)。在所獲得之單鏈噬菌體抗體中，單鏈噬菌體抗體SC09-114展示特異性結合重組A型流感H1、H3、H5、H7及B型流感HA。藉由FACS分析驗證SC09-114之結合及特異性。為此目的，使全長重組A型流感亞型H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及H7(A/Netherlands/219/2003)HA表現於PER.C6細胞之表面上。SC09-114展示特異性結合至A型流感亞型H1、H3及H7HA。如先前所述選殖scFv之重鏈及輕鏈可變區(WO 2008/028946)。編碼人類IgG1重鏈及輕鏈之所得表現構築體短暫組合表現於293T細胞中，且使用標準純化程序獲得及製造含有人類IgG1抗體CR9114之上清液。CR9114之重鏈及輕鏈之CDR之胺基酸序列在表1中給出。以下給出重鏈及輕鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列。
實例2：CR9114之交叉結合反應性
在ELISA中驗證CR9114之結合特異性，亦即對不同HA抗原之結合。為此目的，將以下塗佈至MaxisorpTM ELISA盤：桿狀病毒表現之重組H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/04)、 H7(A/Netherlands/219/2003)及H9(A/HongKong/1073/99)HA(Protein Sciences,CT,USA)。使用無關IgG CR4098作為對照。CR9114展示對所測試之所有重組HA均具有異源亞型交叉結合活性。參見表2。
另外，藉由FACS分析來測試抗體之異源亞型結合。為此目的，使全長重組A型流感亞型H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及H7(A/Netherlands/219/2003)HA表現於PER.C6細胞之表面上。將細胞與CR9114一起培育1小時，隨後用PBS+0.1%BSA進行三個洗滌步驟。使用PE結合之抗人抗體偵測所結合之抗體。使用未經轉染之PER.C6細胞作為對照。CR9114展示對A型流感亞型H1、H3及H7 HA而非野生型PER.C6細胞之交叉結合活性。參見表2。
實例3：CR9114之交叉中和活性
為了測定CR9114是否能夠阻斷多種A型流感病毒株，進行額外的活體外病毒中和分析(VNA)。在MDCK細胞(ATCC CCL-34)上進行VNA。將MDCK細胞培養於MDCK細胞培養基(補充以抗生素、20mM Hepes及0.15%(w/v)碳酸氫鈉之MEM培養基(完全MEM培養基)，補充以10%(v/v)胎牛血清)中。將以下用於分析之病毒株均稀釋至5.7×103 TCID50/ml(每毫升50%組織培養感染劑量)之效價，其中效價根據Spearman及Karber之方法計算：H1(A/WSN/33、A/New Caledonia/20/1999、A/Solomon Islands/IVR-145(A/Solomon Islands/3/2006之高生長性重配株)、 A/Brisbane/59/2007、A/NYMC/X-181(A/California/07/2009之高生長性重配株))、H2(A/Env/MPU3156/05)、H3(A/Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2000/1999、A/Hiroshima/52/2005、A/Wisconsin/67/2005及A/Brisbane/10/2007)、H4(A/WF/HK/MPA892/06)、H5(PR8-H5N1-HK97(A/Hong Kong/156/97及A/PR/8/34之6：2重配株)及A/赤頸鴨/MPF461/07)、H6(A/赤頸鴨/MPD411/07)、H7(NIBRG-60(A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000之6：2重配株)及PR8-H7N7-NY(A/New York/107/2003(H7N7)及A/PR/8/34之7：1重配株))、H8(A/赤頸鴨/MPH571/08)、H9(A/Hong Kong/1073/99及A/雞/HK/SSP176/09)、H10(A/雞/Germany/N/49)及H14(PR8-H14N5(A/綠頭鴨/Astrakhan/263/1982(H14N5)及A/PR/8/34之6：2重配株))。在一式四份孔中在完全MEM培養基中連續2倍稀釋(1：2至1：512)IgG製備物(200μg/ml)。將25μl各別IgG稀釋液與25μl病毒懸浮液(100 TCID50/25μl)混合，且在37℃下培育1小時。隨後將懸浮液一式四份地轉移至含有匯合MDCK培養物於50μl完全MEM培養基中之96孔盤上。使用前，MDCK細胞以3×104個細胞/孔接種於MDCK細胞培養基中，生長直至細胞已達至匯合為止，用300μl至350μl PBS(pH 7.4)洗滌，且最後向各孔中添加50μl完全MEM培養基。在37℃下將所接種之細胞培養3至4天，且每日觀察細胞病變作用(CPE)之發展。將CPE與陽性對照比較。
CR9114展示對所有測試之A型流感亞型H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9及H10病毒之代表病毒株均具有異源亞型交叉中和活性。參見表3。
實例4：基於H1 HA設計包合CR6261及CR9114之保守主幹域抗原決定基之主幹域多肽
先前已鑑別針對流感病毒血球凝集素之具有廣泛交叉中和效能之完全人類單株抗體。CR6261(如WO 2008/028946中所述)展示具有針對系統發育第1類群之A型流感病毒之廣泛交叉中和活性。此外，上述CR9114已顯示能夠結合及中和系統發育第1類群及第2類群兩者之A型流感病毒以及B型流感病毒。功能及結構分析已揭示此等抗體干擾膜融合過程且針對流感HA蛋白之主幹域中的高度保守抗原決定基(Throsby等人(2008)；Ekiert等人(2009)；WO 2008/028946；及同在申請中之申請案第EP11173953.8號)。
在引向本發明之研究中，設計了包含含有此等抗原決定基之HA之主幹域的新穎分子，以便建立基於通用抗原決定基之免疫原性多肽，該等多肽可例如用作針對廣泛範圍流感病毒株誘發保護的疫苗。基本上，首先自全長HA分子中移除高度易變且免疫顯性之部分(亦即頭部域)，以產生HA主幹域多肽(亦稱為「微型HA」)。以此方式，免疫反應將對定位有針對廣泛中和抗體之抗原決定基的主幹域重定向。抗體CR6261及CR9114用於探查新建分子之正確摺疊，並用於證實存在中和抗原決定基。
因此，本發明之多肽在膜遠端頭部域中存在之顯性抗原 決定基不存在之情況下，向免疫系統呈現膜近端主幹域HA分子之保守抗原決定基。為此，移除構成頭部域之HA0蛋白之一級序列的一部分，且直接再連接或藉由引入較短可撓性連接序列(『連接子』)來再連接，以恢復多肽鏈之連續性。所得序列藉由引入特定突變來進一步修飾，該等突變使HA0分子之剩餘部分之天然3維結構穩定。
病毒中HA分子之功能為結合至細胞表面受體唾液酸，及在吸收於內體中之後，介導病毒與內體膜之融合，引起病毒RNA釋放至細胞中。融合過程中之基本步驟為HA分子之較大構形變化，該構形變化使分子之二級結構元件重排以使融合肽暴露。因此，HA分子存在之兩種構形(融合前及融合後)在其三級結構方面極其不同。由於病毒HA蛋白質主要以融合前狀態暴露於免疫系統，故重要的是確保本發明之多肽採用此構形。此要求可藉由使融合前構形穩定且同時使融合後構形不穩定來滿足。由於融合前構形為介穩態且採用融合後構形可產生穩定構形(亦即能量最低)(Chen等人，1995)，故需要此穩定/去穩定作用。
在此實例中，採用來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之HA(SEQ ID NO：1)作為一級(或野生型)序列來建立本發明之多肽。
在第一步驟中，本發明之多肽之構築法係移除在位置59與291之間的HA1序列(編號參考HA0序列中之位置，如SEQ ID NO：1中所示。在某些實施例中，HA1部分包含胺基酸18至343，且HA2部分包含胺基酸殘基344至565；由 於SEQ ID NO：1包含信號肽，故HA1部分起始於位置18)。此結果為移除HA0之殘基60至290。此等殘基被GGGG連接序列置換。接著，藉助於Brugel計算融合前及融合後構形中各殘基之可利用表面積(Delhaise等人，1984)。如Samantha等人(2002)中所述，測定各殘基之暴露及隱藏程度，其中著重於在融合前構形中暴露且在融合後構形中隱藏之殘基。此等殘基之進一步分析指示一些此等胺基酸殘基可依一定方式突變，該方式使得突變不會影響融合前構形，但會使融合後構形不穩定。此等殘基通常具有疏水性側鏈且參與形成融合後構形中之捲曲螺旋。使此等胺基酸殘基突變成親水性胺基酸將擾亂捲曲螺旋性質(捲曲螺旋中螺旋之間的接觸通常為疏水性)，且因此使融合後構形不穩定。
依據此推斷，在序列之HA2部分中引入一些突變：Phe 406突變成Ser(F406S)、Val 409突變成Thr(V409T)、Leu 416突變成Ser(L416S)及Tyr 502突變成Ser(Y502S)。此等突變為自HA表面移除疏水性殘基之突變。應注意到L416突變成S或T時亦引入共同N-糖基化位點(共同序列為NX(S/T))。此位置處之糖基化將進一步增強此區域之溶解度。此外，Leu 58突變成Thr(L58T)、Val 314突變成Thr(V314T)且Ile 316突變成Thr(I316T)；此等突變均在HA1域中，亦即對應於在天然HA0鏈裂解後之HA1之序列部分。後兩個突變維持側鏈之β分支，但自表面移除疏水性殘基。如以下將展示，將一些此等突變引入所有變異體 中，在各別多肽中測試其他此等突變，以研究該等突變是否以不合需要之方式彼此影響。
為了增強多肽之穩定性，研究兩個二硫橋連基以將HA鎖定為融合前構形。二硫橋連基形成於在空間上彼此相隔適當距離(在全長HA分子中)之殘基之間，且該等殘基使其已在正確位置處之C-β原子形成二硫橋連基。所提出之第一二硫橋連基係在位置321(HA1域)與位置405(HA2域)之間。在HA2域內，二硫橋連基產生於位置413與421之間。
由於在位置R343處裂解HA為構形變化能夠進行之基本步驟，故在本發明之多肽中，藉由引入Arg(R)至Gln(Q)之突變來移除裂解位點。本發明之另一解決方案為將Arg變為Gln且使殘基345至350(HA2之融合肽之一小部分)缺失。此等(疏水性)序列之移除將使多肽進一步穩定。
在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，移除HA2之位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2之C端(編號根據SEQ ID NO：1)之細胞質序列及跨膜序列，以便在表現於細胞中之後製造可用於例如疫苗之分泌型(可溶性)多肽。藉由引入已知形成三聚體結構之序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143)，視情況經由連接子連接，使可溶性多肽進一步穩定。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記 (HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下添加連接子及his標記序列。根據本發明，HA2域之位置530(編號根據SEQ ID NO：1)至C端胺基酸之胺基酸序列可經移除並置換為以下序列：EGRHHHHHHH(SEQ ID NO：81)，包含較短連接子及his標記；或SGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(SEQ ID NO：82)，包含凝血酶裂解位點、三聚域及his標記。
將上述突變根據其功能及在HA幹多肽之3維結構中之位置集合成群集。所有多肽均含有H1 HA序列1至59及291至565及R343Q突變，具有以下其他突變：L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S(SEQ ID NO：3；命名為群集1)。此外，製得具有其他突變之變異體：
群集2：K321C、Q405C(SEQ ID NO：4)
群集3：F413C、E421C(SEQ ID NO：5)
群集4：HA2 Y502S(SEQ ID NO：6)
另外，製得含有群集1序列且此外含有群集2及3(SEQ ID NO：7)或群集2、3及4(SEQ ID NO：8)之突變的兩種變異體。
合成編碼上述蛋白質序列之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。出於比較之原因，將全長序列(SEQ ID NO：1)以及由Steel等人(2010)描述之序列(H1-PR8-dH1；SEQ ID NO：24，其係基於H1N1 A/Puerto Rico/8/1934序列)包括於實驗中。
使用40μl 293transfectin作為轉染試劑用表現載體(1 μg/ml)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞，等分試樣(0.3ml，約3×105個細胞)，且將等分試樣以針對H1 HA產生之多株血清處理以探查表現或以HA特異性單株抗體(5微克/毫升)及用於染色之二級抗體處理。隨後，使用針對H1 HA產生之多株血清，針對膜連接之本發明之HA主幹域多肽之表現，藉由螢光結合細胞分選(FACS)分析細胞以探查表現。將具有結合全長蛋白質之已知特異性之單株抗體小組(例如CR6261及CR9114)用於探查保守抗原決定基之存在，且根據推理探查全長HA及本發明之微型HA多肽之正確摺疊。結果表示為陽性細胞百分比及平均螢光強度，且展示於圖2中。
結果展示所有構築體均表現於細胞表面上，因為與對於未經轉染之細胞之約4%相比，與多株血清(抗H1多株)之反應引起所分析之全部細胞之75%或75%以上為陽性。此結果由平均螢光強度(MFI)之值證實，該等值對於以多株血清處理之後的所有構築體而言為類似的。不存在IgG、僅使用經標記之抗人IgG或不相關單抗之對照實驗均為陰性的。A/Brisbane/59/2007及A/Puerto Rico/8/1934全長HA蛋白質均由單株抗體CR6261、CR6254、CR6328(均已知結合並中和H1 HA；Throsby等人(2008)；WO 2008/028946)、CR9114(上述)、CR8001(結合至H1 HA，但不中和H1；描述於WO 2010/130636中)而非CR8057(僅結合至某些H3病毒株，亦描述於WO 2010/130636中)及CR6307(Throsby等 人(2008)；WO 2008/028946)識別。
考慮CR6261抗原決定基之不連續性及構形特徵(Ekiert等人2009)，推斷出兩種全長蛋白質均以其天然3維構形形式存在。對於在此實驗中測試之新設計之本發明多肽而言，觀察到由單株抗體小組識別之相同模式：由CR6261、CR6254、CR6328、CR9114及CR8001而非CR6307及CR8057結合。此現象在陽性細胞百分比之資料中最明顯，但亦在平均螢光強度資料中觀察到。就細胞陽性%以及平均螢光強度而言，均在微型HA-群集1之情況下獲得最佳結果。
添加其他修飾，諸如上述二硫橋連基(群集2及3)及群集4之Y502S突變或此等突變之組合，引起陽性細胞百分比降低及平均強度降低。此實驗中所用之任何抗體均未在背景水準以上識別含有頭部域缺失但缺乏其他修飾之由Steel等人(2010)描述之構築體(SEQ ID NO：24)。因此，推斷出在DNA轉染之後，此蛋白未以其在HA中具有之天然3維構形形式展示。
上述結果預示群集1突變之重要性，該等群集1突變增強環之親水性特徵，該環由HA分子之連接A螺旋及較長骨架螺旋(CD)之殘基402至418及周圍區域形成。為了進一步確定群集1突變對本發明之多肽之穩定性及摺疊的有益作用，在另一實驗中比較微型HA(SEQ ID NO：2；根據Steel之多肽，但基於A/Brisbane)及微型HA_群集1(本發明之多肽；SEQ ID NO：3)(圖3)。
儘管約60%經微型HA-群集1轉染之細胞在結合CR6261、CR6254、CR6328及CR9114之後為陽性，但用微型HA(根據Steel之多肽，但基於A/Brisbane；SEQ ID NO：2)轉染引起極接近於背景水準之值(1%至3%)。吾人推斷出群集1之突變與缺乏此等突變之未經修飾之微型HA蛋白(SEQ ID NO：2)相比，有利地促進本發明之多肽之正確摺疊及穩定性。
Steel等人藉由以下方式建立一種新的分子：使H1 A/Puerto Rico/8/1934及H3 HK68病毒株之HA1之胺基酸殘基53至276自一級序列中缺失，且用較短可撓性連接子置換此缺失。如此實例中所示，此舉產生高度不穩定之分子，該分子並未調整正確構形，如由先前展示結合至幹區中之保守抗原決定基之抗體不發生結合所證實。不正確摺疊由較大區域之溶劑暴露引起，該較大區域通常由全長HA分子中之球狀頭部遮蔽。由於此區域本質為疏水性的，故分子不再穩定且因此必需改適。
如已在本發明多肽中進行之疏水性殘基調換為親水性殘基抵消此作用且使HA主幹域多肽穩定。藉由以下方式來達成主幹域之天然3維摺疊之進一步穩定：在適當位置處引入二硫橋連基，以使在天然三級結構中空間上接近但在一級結構中分離之殘基緊密連接。
實例5：實例4之HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載體對小鼠進行免疫接種：來自A/Brisbane/59/2007之全長 H1(SEQ ID NO：1)、微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型HA-群集1+2(SEQ ID NO：4)及微型HA-群集1+4(SEQ ID NO：6)。出於比較之原因，亦將由Steel等人(2010)設計之微型HA(微型PR8；SEQ ID NO：24)及來自A/Puerto Rico/8/1934之相應全長蛋白質HA包括於實驗中。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用50μg構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。藉由FACS分析來分析血清。使用40微升293transfectin作為轉染試劑用表現載體(1微克/毫升)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞，等分試樣(0.3ml，約3×105個細胞)，且將等分試樣以構築體特異性血清處理，用二級抗體染色且藉由螢光結合細胞分選進行分析。結果展示於圖4中。
正如所料，如由陽性細胞%及MFI表明，cM2特異性血清(陰性對照)識別cM2，但全長HA或主幹域多肽中沒有一者識別cM2。相比之下，全長HA特異性血清染色表現相應全長HA(SEQ ID NO：1)之細胞，而且染色表現微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型HA-群集1+2(SEQ ID NO：4)及微型HA-群集1+4(SEQ ID NO：6)之細胞，但在較低水準下(約40%陽性細胞相對於針對全長之約80%，MFI約1000相對於針對全長之約7000)。反過來亦是正確的：對微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型HA-群集1+2(SEQ ID NO：4)及微 型HA-群集1+4(SEQ ID NO：6)具有特異性之血清識別表現相應構築體以及全長HA(SEQ ID NO：1)之細胞。結果概述於下表4中。
與上述針對微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型HA-群集1+2(SEQ ID NO：4)及微型HA-群集1+4(SEQ ID NO：6)之結果對比，自經全長PR8免疫接種之小鼠獲得之血清並未很好地結合至經H1-PR8-dH1(SEQ ID NO：24)轉染之細胞。與針對微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)及微型HA-群集1+2(SEQ ID NO：4)之40%至50%相比，細胞陽性百分比為約20%。在所觀察之幾乎不在背景水準以上之平均螢光強度中亦反映該結果。
總之，資料展示本發明之多肽能夠誘導針對全長HA之免疫反應。特定言之，在殘基402與418(編號根據SEQ ID NO：1)之間的區域中之修飾對建立穩定分子很重要。
實例6：製備第二代主幹域多肽
實例4中所述之主幹域多肽之平均螢光強度在所有情況下均低於針對相應全長蛋白質所觀察到之平均螢光強度；實際上，最佳設計微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)在與單株抗體結合之後具有全長構築體之約10%平均強度之強度。由此指示細胞表面上主幹域多肽之表現及/或摺疊低於針對全長蛋白質所觀察到之表現及/或摺疊，且可進一步改良設計。自第一代獲得之結果展示改良第一代構築體為可能的且因此啟動第二輪設計。
實例4中所述之多肽係基於HA0鏈之相同缺失，亦即殘 基L60至K290(微型1；編號參考來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA0中之位置；SEQ ID NO：1)。此方法產生現不再連接於頭部域之較長非結構化環。推斷此環並不有助於整體蛋白穩定性，且可在不影響多肽之其他部分摺疊之情況下大大縮短。設計三種其他缺失，且用如前所述之GGGG連接子序列置換且與上述群集1之突變組合。缺失為S53至P320(微型2)、H54至I302(微型3)、G56至G317(微型4)。引入與上述群集1一致之其他修飾(L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S)。屬於此群集之一些殘基為所缺失之序列之一部分，且因此可不再經修飾(參見下文)。此外，在於融合前狀態中形成三聚捲曲螺旋之較長螺旋C中建立兩種其他突變。此項技術中熟知三聚捲曲螺旋利用在七價重複序列之位置420 a及d處之Ile穩定，該七價重複序列為此結構基元之標誌(Suzuki等人，(2005)；Woolfson等人(2005))。藉由在位置420(M4201)及427(V427I)處引入Ile來應用此知識。此兩種突變與群集1之突變之組合指定為群集11；為了闡明，以下列出組合：
微型1：缺失L60至K290群集11：M420I、V427I、L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S
微型2：缺失S53至P320群集11：M420I、V427I、F406S、V409T、L416S
微型3：缺失H54至I302群集11：M420I、V427I、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S
微型4：缺失G56至G317群集11：M420I、V427I、F406S、V409T、L416S
為了使主幹域多肽之融合前狀態進一步穩定，在位置324與436(群集5：R324C、T436C)之間引入另一二硫橋連基且與不同缺失突變體組合。合成以下組合且如上所述在FACS分析中測試結合：
微型1-群集11(SEQ ID NO：9)
微型2-群集11(SEQ ID NO：10)
微型3-群集11(SEQ ID NO：11)
微型4-群集11(SEQ ID NO：12)
微型1-群集11+5(SEQ ID NO：13)
微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)
微型3-群集11+5(SEQ ID NO：15)
微型4-群集11+5(SEQ ID NO：16)
出於比較之原因，實驗中亦包括微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)。結果展示於圖5中。
如由用多株抗H1血清處理之後的陽性細胞百分比表明(90%或90%以上)，在所有情況下，主幹域多肽在表現載體轉染至HEK293F細胞中之後均呈現於細胞表面上。
此實驗中之所有HA主幹域多肽均由CR6261、CR6254、CR6328及CR9114而非CR8057識別；後者正如所料，因為此單抗對H3 HA具有特異性。然而，不同抗體在細胞陽性百分比及MFI方面存在明顯差異。最佳表徵之抗體為CR6261，其抗原決定基詳細已知。該抗原決定基為不連 續及構形的，且此抗體之結合因此可視為HA主幹域多肽之正確摺疊之嚴格測試。CR9114廣泛中和，涵蓋來自第1類群及第2類群兩者之病毒株(表3)。在CR6328及CR6254之抗原決定基中，已知詳情較少，但基於針對陽性細胞%及MFI發現之較高值，以及資料中之較小展開，此等抗體之結合與CR6261相比似乎為正確摺疊之較低敏感性探查。
比較陽性細胞百分比(考慮所有抗體之資料)，可將微型1至微型4構築體排序(最高%至最低%)。
對於與群集11之組合，微型2>微型1>微型4>微型3；及對於與群集11+5之組合，微型2>微型1=微型4>微型3
此排序亦反映在MFI上之資料中，且得出結論微型2構築體之缺失S53至P320引起來自此組之最高水準蛋白質以正確構形形式展示於細胞表面上。
比較微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)與微型1-群集11(SEQ ID NO：9)，其他突變M420I、V427I似乎並未引起構築體之額外穩定；若有，則其引起較低陽性細胞百分比及MFI值，但差異較小。
引入二硫橋連基R324C、T436C(群集5)引起細胞表面上正確摺疊之蛋白質對於微型2-群集11(SEQ ID NO：10)及微型4-群集11(SEQ ID NO：12)而言增多，但對於微型1-群集11(SEQ ID NO：9)及微型3-群集11(SEQ ID NO：11)而言極少或無改良。總體而言，在微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)之情況下獲得更佳結果。此結果自MFI值來看尤其明顯， 此構築體之MFI值為全長構築體之值的約50%。
在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，移除HA2之位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2之C端(編號根據SEQ ID NO：1)之細胞質序列及跨膜序列，且視情況藉由引入已知形成三聚體結構之序列(亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143))置換，視情況經由連接子連接。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記HHHHHHH。根據本發明，HA2域之位置530(編號根據SEQ ID NO：1)至C端胺基酸之胺基酸序列可經移除並置換為SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：82。
實例7：第二代HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估實例6之主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載體對小鼠進行免疫接種：來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)、微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型2-群集11(SEQ ID NO：10)、微型1-群集11+5(SEQ ID NO：13)、微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用50μg構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。亦使用約10μg構築體+約2μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫 接種流程，藉由基因槍投與不同組小鼠全長HA0(SEQ ID NO：1)、陰性對照cM2及微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)。使用來自A/Brisbane/59/2007病毒株之全長HA之重組胞外域(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA獲得)作為抗原，藉由Elisa分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之20倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗體。效價與使用單抗3AH1 InA134(Hytest,Turku,Finland)之標準曲線相比，得出Elisa單位/毫升(EU/ml)。
28天及49天後之Elisa結果分別展示於圖6A及圖6B中。在使用基因槍免疫接種後28天及49天後以及在肌肉內免疫接種49天後，自以編碼微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)之DNA免疫接種之小鼠獲得的血清展現明確結合至胞外域全長HA。對於微型2-群集11(SEQ ID NO：10)及微型1-群集11+5(SEQ ID NO：13)，在4隻小鼠中之1隻中偵測到反應，而對於微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)，未偵測到結合。
總之，資料展示本發明之多肽能夠誘導針對全長HA之免疫反應。特定言之，在殘基402與418(編號根據SEQ ID NO：1)之間的區域中之修飾、缺失S53至P320與二硫橋連基R324C、T436C組合對建立穩定分子很重要。
實例8：第三代主幹域多肽之製備
為了進一步改良主幹域多肽之設計，實施第三輪設計。在位置413處引入增強隱藏於全長HA中之表面而非主幹域多肽之親水性的另一突變F413G(編號根據SEQ ID NO：1)，且命名為群集6。此群集與微型2之缺失(S53至P320)、群集5之二硫橋連基(R324C、T436C)及群集1(亦即F406S、V409T、L416S；SEQ ID NO：46)或群集11(M420I、V427I、F406S、V409T、L416S；SEQ ID NO：47)之突變組合。微型2缺失(S53至P320)與群集1(F406S、V409T、L416S)及群集5(R324C、T436C)之組合亦包括於此實驗中以用於參考(SEQ ID NO：48)。
天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。根據本發明，可在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置418至433(等效位置)處(編號根據SEQ ID NO：1)將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO：83)引入本發明多肽中(SEQ ID NO：44)。一種替代方案為將來源於GCN4且已知三聚之序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)引入位置419至433處(SEQ ID NO：45)。
如由用多株抗H1血清處理之後的陽性細胞百分比(90%或90%以上)表明，在由SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：48描 述之主幹域多肽之情況下，所有蛋白質在表現載體轉染至HEK293F細胞中之後均呈現於細胞表面上。結果展示於圖7中。
此實驗中之所有HA主幹域多肽(其中例外為微型HA(SEQ ID NO：2))均由CR6261、CR6328及CR9114而非CR8020識別；後者正如所料，因為此單抗對H3 HA具有特異性。對於使用CR6261、CR6328及CR9114用於染色之主幹域多肽，陽性細胞百分比為約80%，其中例外為微型HA，其僅由多株抗H1血清識別。再次，此結果指示此特定構築體不發生正確摺疊。然而，不同抗體在MFI方面存在明顯差異。最佳表徵之抗體為CR6261，其抗原決定基詳細已知。該抗原決定基為不連續及構形的，且此抗體之結合可因此視為HA主幹域多肽之正確摺疊之嚴格測試。CR9114廣泛中和，涵蓋來自第1類群及第2類群兩者之病毒株(表3)。在CR6328之抗原決定基中，已知詳情較少，但在對全長HA之結合實驗中，觀察到與CR6261之競爭。
H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO：14)、H1-微型2-cl1+5(SEQ ID NO：48)、H1-微型2-cl1+5+6(SEQ ID NO：46)及H1-微型2-cl11+5+6(SEQ ID NO：47)之MFI極類似，與實驗中所用單株抗體無關。與不具有三聚域之等效序列(亦即H1-微型2-群集1+5+6；SEQ ID 46)相比，共同三聚域(SEQ ID NO：44)之納入使MFI降低3至4倍，但結果仍明顯優於在頭部域缺失之後幹多肽不存在修飾之情況(參照微型HA結果)。GCN4三聚序列(SEQ ID NO：45)之添加使MFI提高至 可與全長蛋白質相當的水準。
實例9：設計包含CR6261及CR9114之保守主幹域抗原決定基之其他主幹域多肽
根據上述程序設計之本發明之多肽可經進一步修飾以增強穩定性。可引入該等修飾以在單聚及/或二聚物內增強本發明多肽之三聚形式的形成。如上所述，天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。
根據本發明，可在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置418至433(等效位置)處(編號根據SEQ ID NO：1)將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO：83)引入本發明多肽中(SEQ ID NO：44)。或者，可將IEAIEKKIEAIEKKI(SEQ ID NO：85)引入419至433處(SEQ ID NO：49)，或將IEAIEKKIEAIEKK(SEQ ID NO：86)引入420至433處(SEQ ID NO：50)。一種替代方案為將來源於GCN4且已知三聚之序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)引入位置419至433處(SEQ ID NO：45)。或者，可將MKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO：87)引入位置420至433處(SEQ ID NO：51)，或將RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO：88)引入位置417至433處(SEQ ID NO：52)。類似地，三 聚體界面藉由將M420、L423、V427、G430修飾成異白胺酸來強化(SEQ ID NO：53)。
所有肽均展示結合CR9114及CR6261。
如先前所述，在某些實施例中，本發明之多肽不含有HA之信號序列及/或細胞內序列及跨膜域。
實例10：基於H7 HA設計包含CR6261及CR9114之保守主幹域抗原決定基之主幹域多肽
亦將設計本發明多肽之上述程序應用於H7。在此實例中，描述基於血清型H7設計本發明之多肽。將H7流感病毒A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000之HA(SEQ ID NO：31)用作親本序列，但熟習此項技術者將理解使用其他H7序列將同樣可能，因為該等序列充分保守，尤其在幹區中。
序列中之第一個修飾為藉由使R突變成Q(R339Q)來移除位置339(編號參考SEQ ID NO：31)處之裂解位點，以防止自HA0形成HA1及HA2。視情況可再缺失殘基341至345(LFGAI，融合肽之一部分)，以使疏水性殘基對水性溶劑之暴露降至最低。裂解處之正電荷在H7中100%保守，且此突變可因此應用於所有序列中。
第二個修飾為藉由以下方式移除頭部域：使HA1序列之較大部分缺失，且經由較短連接子使N端及C端序列再連接。缺失長度可變化，但較佳HA1之N端序列之最後一個殘基與C端序列之第一個殘基在空間上緊靠在一起以避免經由連接序列引入病毒株。在H7序列中，可在H7 A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000(SEQ ID NO：31)之R53至P315(等效 位置)處引入缺失(微型2；SEQ ID NO：33)。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。
SEQ ID NO：40描述含有缺失T54至C314之本發明之該多肽(微型5；SEQ ID NO：40)。上述缺失確保由殘基280至310形成之非結構化區域亦得以移除；此舉有益於本發明之多肽之總體穩定性。對來源於H1序列之本發明之多肽(參見上文)觀察到類似作用。
頭部域之缺失留下現暴露於水性溶劑之殘基394至414之間的環。在H7 HA中，此環高度保守(參見表7)。共同序列為：LI(E/D/G)KTNQQFELIDNEF(N/T/S)E(I/V)E(Q/K)(SEQ ID NO：32)。
為了增加此環在融合前構形中之溶解度且使融合後構形不穩定，將一些疏水性殘基修飾成極性(S、T、N、Q)、帶電荷的胺基酸(R、H、K、D、E)，或藉由突變成G來增加可撓性。特定言之，在位置402、404、405、409、412(編號參考SEQ ID NO：31)處之突變將有助於本發明之多肽之穩定性。
對於位置F402及F409，較佳突變成S，但其他極性(T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸 (G)將具有相同作用。對於位置404(96% L)，較佳突變成N或S；後一個胺基酸亦自然出現，但頻率較低，且此位置之突變在該等情況下不必要。其他極性(T、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置405(99% I)，較佳突變成T或D。D亦自然出現，且此位置之突變因而不必要。其他極性(S、N、Q)、帶電荷的(R、H、K)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置412(I或V)，較佳突變成N，但亦可能為其他極性(S、T、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)或可撓性(G)殘基。因此，多肽含有上述突變中之至少一者。亦已應用一個以上突變之組合，如例如SEQ ID NO：34至SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：43中所示。
為了使本發明之多肽之融合前構形穩定，在於一級序列中遠離但在摺疊之融合前構形中接近之兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋連基可在本發明之多肽中經工程化，較佳在H7 A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000(SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43)中之位置319與432(等效位置)之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
如上所述，天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面 上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。此項技術中熟知三聚捲曲螺旋利用在七價重複序列之位置a及d處之Ile穩定，該七價重複序列為此結構基元之標誌。此處，藉由在位置419、423、426及430(等效位置)(SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：43)處引入Ile來應用此知識。或者，將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列EAIEKKIEAI引入位置417至426(等效位置)處(SEQ ID NO：39)。
對此等序列(SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：43)進行上述螢光結合細胞分選分析。然而，未可偵測到單株抗體CR8020、CR8043、CR9114或CR8957之結合。吾人推斷此等序列不呈現此等抗體之抗原決定基，且因此如呈現於細胞膜上之蛋白質並不摺疊成其天然3維結構。
實例11：基於H3 HA設計包含CR8020、CR8043及CR9114之保守主幹域抗原決定基的主幹域多肽
在第一步驟中，使用來自H3 A/Wisconsin/67/2005之HA作為親本序列(SEQ ID NO：89)，以與由Steel及同事(Steel等人2010)所述類似之方式構築表示本發明多肽之序列。藉由自胺基酸D69至胺基酸K292缺失一部分HA1來移除HA之頭部。
此等殘基可經3或4個Gly置換。4 Gly連接子由Steel及同 事測試，且得到良好表現結果，且被此處採用以建立微型H3(SEQ ID NO：90)。為了防止多肽鏈裂解(全長HA蛋白質之正常轉譯後處理步驟)，將位置345處之裂解位點(精胺酸)突變成麩醯胺酸(R345Q)。
接著，藉助於Brugel計算經構築之微型HA及融合後構形中各殘基之可及表面積。測定各殘基之暴露及隱藏程度，如Samantha及同事(Samantha等人，2002)中所述。測定集中於在融合前構形中暴露且在融合後構形中隱藏之殘基。此等殘基之進一步分析指示一些此等殘基可以一定方式修飾，該方式使得突變對融合前構形不具有作用，但使融合後構形不穩定。此等殘基通常具有疏水性側鏈且參與形成融合後構形中之捲曲螺旋。使此等殘基突變成包含親水性側鏈將擾亂捲曲螺旋性質(捲曲螺旋中螺旋之間的接觸通常為疏水性)，且因此使融合後構形不穩定。自在融合構形前中暴露至在融合後構形中隱藏且預期突變後對後者構形具有去穩定作用之殘基為L397、I401及L425(編號根據SEQ ID NO：89)。此處包括L397K及I401T。
使螺旋A(殘基383至400)與中心螺旋CD(殘基421至470)連接之環(B環，殘基401至420)一旦採用融合後狀態即改變構形；其變為螺旋且成為擴大之三聚捲曲螺旋之一部分。為了使此連接子之融合前環構形穩定及/或使融合後構形不穩定，推斷使參與捲曲螺旋核心形成之所有殘基突變應足夠。對於位置N405，設計數種突變，尤其攜帶負電荷(Asp及Glu，N405D、N405E)之殘基，因為此額外電荷 將增強在融合前構形中觀察到之離子網絡。此研究中亦包括突變成中性Ala(N405A)。吾人亦使Phe 408突變成Thr、His 409突變成Ser及Val 418突變成Ser(編號根據SEQ ID NO：89；F408T、H409S、V418S)，以在移除頭部域之後進一步增強新暴露表面之溶解度。
設計五個二硫橋連基以將HA鎖定為融合前構形。此等橋連基形成於在空間上彼此相隔適當距離之殘基之間，且該等殘基使其已在正確位置處之Cβ原子形成二硫橋連基。其在位置320與406(A320C、E406C；編號根據SEQ ID NO：89)之間、326與438(K326C、S438C)之間及在415與423(F415C、Q423C)之間引入。前兩者在鏈之HA1與HA2部分之間交聯，而最後一者以共價方式將B環頂部連接在一起。K326C、S438C二硫橋連基伴隨有Asp 435突變成Ala(D435A)。二硫橋連基F347C/N461C及S385C/L463C獲自Bommakanti等人(2010)之論文且亦用於此研究中。
為了自溶劑移出新暴露之疏水性殘基，設計數種其他突變。將位置67(編號根據SEQ ID NO：89)處之Ile突變成Thr(I67T)。此突變維持側鏈之β分支，但自表面移除疏水性殘基。同樣適用於Ile 298突變成Thr(I298T)。在位置316處(天然序列中之異白胺酸)引入另一突變。直觀地，吾人將提出使此殘基突變成Thr維持β分支但自表面移除疏水性。然而，此突變將引起額外N-糖基化位點(位置314為Asn)之引入，且因此引入成為Gln之突變(I316Q)。
Gly 495亦突變成Glu(G495E)。此突變經設計以引入離 子橋連基，因為在環境中存在正電荷。自然已在此位置處提供某些H3病毒株以Glu。
HA之重要殘基為位置345(Arg)，因為此位置為發生蛋白酶裂解使得能夠蛋白融合之位置。此Arg突變成Gln(R345Q)防止裂解發生，藉此將蛋白鎖定為融合前狀態。
如下文所述將上述突變分群：
群集1：I67T、I98T、I316Q、F408T、H409S、V418S
群集2：A320C、E406C
群集3：K326C、D435A、S438C
群集4：L397K、I401T
群集5：N405D或N405E或N405A
群集6：F415C、Q423C
群集7：G495E
群集8：F347C、S385C、N461C、L463C
為了得到本發明之多肽，根據下文所述流程，使群集與缺失D69至K292及R345Q突變組合。
H3微型HA群集1(SEQ ID NO：91)
H3微型HA群集1+2(SEQ ID NO：92)
H3微型HA群集1+3(SEQ ID NO：93)
H3微型HA群集1+4(SEQ ID NO：94)
H3微型HA群集1+5 N405A(SEQ ID NO：95)
H3微型HA群集1+5 N405D(SEQ ID NO：96)
H3微型HA群集1+5 N405E(SEQ ID NO：97)
H3微型HA群集1+6(SEQ ID NO：98)
H3微型HA群集1+7(SEQ ID NO：99)
H3微型HA群集1+2+3+4+5+6+7-N405E(SEQ ID NO：100)
H3微型HA群集1+2+3+4+5+6+7-N405A(SEQ ID NO：101)
H3微型HA群集1+2+3+4+5+6+7-N405D(SEQ ID NO：102)
H3微型HA群集1+8(SEQ ID NO：103)。
合成編碼上述蛋白質序列之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。出於比較原因，將H3 A/Wisconsin/67/2005之全長HA序列以及含有裂解位點突變R343Q之H1 A/Brisbane/59/2007之全長HA序列包括於實驗中。
使用40μl 293transfectin作為轉染試劑用表現載體(1μg/ml)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞，等分試樣(0.3mi，約3×105個細胞)，且將等分試樣以針對H3 HA產生之多株血清(Protein Sciences Corp,Meriden,CT,USA)處理以探查表現或以HA特異性單株抗體(5微克/毫升)及用於染色之二級抗體處理。隨後，使用針對H3 HA或H1 HA產生之多株血清，針對膜連接之本發明之HA主幹域多肽之表現，藉由螢光結合細胞分選(FACS)分析細胞以探查表現。將具有結合全長蛋白質之已知特異性之單株抗體小組(CR8020、CR8043及CR9114)用於探查保守抗原決定基之存在，且根據推理探查全長HA及本發明之微型HA多肽之正確摺疊。單株抗體CR6261(已知不結合至H3 HA)及 CR8057(結合至來自A/Wisconsin/67/2005之HA之頭部域)亦包括於實驗中。結果表示為陽性細胞百分比，且展示於圖8中。
結果展示所有構築體均表現於細胞表面上，因為與對於未經轉染之細胞之4%以下相比，與H3多株血清之反應引起所分析之全部細胞對於基於H3之序列80%至90%及對於全長H1序列50%以上為陽性。使用抗H1多株，除接近100%之全長H1序列以外，全部細胞之60%至70%為陽性。不存在IgG、僅使用經標記之抗人或抗兔IgG之對照實驗均為陰性的。A/Wisconsin/67/2005及A/Brisbane/59/2007全長HA蛋白均由已知能夠中和兩種病毒株之單株抗體CR9114識別。A/Wisconsin/67/2005全長HA另外結合CR8020、CR8043及CR8057(僅結合至某些H3病毒株，描述於WO 2010/130636中)而非CR6261(Throsby等人(2008)；WO 2008/028946)。對於來自A/Brisbane/59/2007之全長HA而言，事實恰恰相反：其結合至CR6261而非CR8020、CR8043及CR8057。
如由圖8中缺乏背景以上之信號表明，如SEQ ID NO：91至SEQ ID NO：103中所述之多肽在任何該等情況下均不能夠結合至CR8020、CR8043及CR9114。因此推斷出此等序列不呈現此等抗體之抗原決定基，且因此如呈現於細胞膜上之蛋白不摺疊成其天然3維結構。
實例12：基於H3 HA設計包含CR8020、CR8043及CR9124之保守主幹域抗原決定基的其他主幹域多肽
在此實例中，描述基於血清型H3設計本發明之其他多肽。將H3流感病毒A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)及A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)之HA用作親本序列。
序列中之第一個修飾為藉由使R突變成Q(R345Q)來移除位置345(編號參考SEQ ID NO：89)處之裂解位點，以防止自HA0形成HA1及HA2。視情況可再缺失殘基347至351(IFGAI，融合肽之一部分)，以使疏水性殘基對水性溶劑之暴露降至最低。裂解處之正電荷在H3中100%保守，且此突變可因此應用於所有序列中。
第二個修飾為藉由以下方式移除頭部域：使HA1序列之較大部分缺失，且經由較短連接子使N端及C端序列再連接。缺失長度可變化，但較佳HA1之N端序列之最後一個殘基與C端序列之第一個殘基在空間上緊靠在一起以避免經由連接序列引入病毒株。在H3序列中，可在S62至P322(微型2；SEQ ID NO：105)、S63至P305(微型3；SEQ ID NO：119)及T64至T317(微型4；SEQ ID NO：120)(等效位置)處引入缺失。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置63、64、65、66、 67(等效位置)處開始來減少缺失中之殘基數目，或藉由在位置57、58、59、60或61處切割來增加缺失長度。類似地，最後一個欲缺失之胺基酸可在位置317、318、319、320或321(等效位置)處，或在位置323、324、325、326或327(等效位置)處以增加缺失長度。重要的是認識到，缺失長度之變化可藉由匹配連接子序列之長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。此等多肽亦包括於本發明中。
頭部域之缺失留下現暴露於水性溶劑之殘基400至420之間的B環。在H3 HA中，此環高度保守(參見表9)。共同序列為：401 I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421(SEQ ID NO：104；編號參考SEQ ID NO：89)。為了增加此環之溶解度以用於呈融合前構形之本發明之多肽且使融合後構形不穩定，一些疏水性殘基必需修飾成極性(S、T、N、Q)、帶電荷的胺基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突變成G來增加可撓性。特定言之，在位置401、408、411、415、418(編號參考SEQ ID NO：89)處之突變將有助於本發明之多肽之穩定性。
對於位置F408及F415，較佳突變成S，但其他極性(T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置411(I)，較佳突變成T；其他極性(S、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用且因此亦包括於本發明中。對於位置418(V)，較佳突變成G。其他極性(S、T、 N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)將具有相同作用且因此亦包括於本發明中。對於位置401(I)，較佳突變成R，但其他極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(H、K、D、E)或可撓性(G)殘基亦為可能的。因此，本發明之多肽含有上述突變中之至少一者。亦可能為一個以上突變之組合，如例如SEQ ID NO：123至SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：129至SEQ ID NO：131中所示。
為了使本發明之多肽之融合前構形穩定，在於一級序列中遠離但在摺疊之融合前構形中接近之兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋連基在本發明之多肽中經工程化，較佳在H3 A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)中之位置326與438(等效位置)之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。藉由使此等殘基突變成半胱胺酸，可在H3 A/Wisconsin/67/2005(SEQ ID NO：89)中之位置334與393(等效位置)之間建立替代性半胱胺酸橋連基。在一些情況下，將在位置321(等效位置)處之半胱胺酸修飾成甘胺酸以避免形成不當二硫橋連基。
天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截 斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。在位置421至441(等效位置)處引入用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE。為了避免妨礙在位置326與438之間形成二硫橋連基，亦使用在位置421至435(等效位置)處之替代性較短序列IEAIEKKIEAIEKKI。一種替代方案為在位置421至441處引入來源於GCN4且已知三聚之序列RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN或在位置421至435處引入較短序列RMKQIEDKIEEIESK。
本發明之多肽可含有HA之細胞內序列及跨膜域，以便所得多肽在表現於細胞中時呈現於細胞表面上。在其他實施例中，移除位置522至C端(等效位置)之細胞質序列及跨膜序列，以便在表現於細胞中之後產生分泌型(可溶性)多肽。一些其他殘基視情況可藉由自523、524、525、526、527、528或529(等效位置)缺失序列而包括於可溶性蛋白質中。藉由引入已知形成三聚體結構之序列，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143)(『摺疊子』序列)，視情況經由連接子連接，可使可溶性多肽進一步穩定。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記(HHHHHHH)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下添加連接子及his標記序列。
HA之重要殘基為位置345(Arg)，因為此位置為發生蛋白酶裂解使得能夠蛋白融合之位置。此Arg突變成Gln(R345Q)防止裂解發生，藉此將蛋白鎖定為融合前狀態。
如下文所述將上述突變分群：
群集9 F408S、I411T、F415S
群集10 V418G
群集11 I401R
群集12 K326C、S438C
群集13 T334C、I393C
群集14 C321G
GCN4在位置421至441處之RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN
或在位置421至435處之RMKQIEDKIEEIESK
三聚體在位置421至441處之IEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK
或在位置421至435處之IEAIEKKIEAIEKKI
使用來自H3N2 A/Wisconsin/67/2005之全長HA之序列作為起點，將上述群集與S62至P322缺失組合(微型2；SEQ ID NO：105)以得到本發明之多肽。
SEQ ID NO：105：H3-微型2
SEQ ID NO：106：H3-微型2-cl9+10
SEQ ID NO：107：H3-微型2-cl9+11
SEQ ID NO：108：H3-微型2-cl9+10+11
SEQ ID NO：109：H3-微型2-cl9+10+11-三聚體(在位置421至441處之三聚體序列)
SEQ ID NO：110：H3-微型2-cl9+10+11-GCN4(在位置421至441處之GCN4序列)
SEQ ID NO：111：H3-微型2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO：112：H3-微型2-cl9+10+12
SEQ ID NO：113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(在位置421至435處之較短GCN4序列)
SEQ ID NO：114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚體(在位置421至435處之較短三聚體序列)
SEQ ID NO：115：H3-微型2-cl9+13
SEQ ID NO：116：H3-微型2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO：117：H3-微型2-cl9+10+11+13-GCN4(在位置421至441處之GCN4序列)
SEQ ID NO：118：H3-微型2-cl9+10+11+13-三聚體(在位置421至441處之三聚體序列)
此外，缺失S63至P305(微型3)及T64至T317(微型4)與群集9、10、11及14組合以建立本發明之多肽。
SEQ ID NO：119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO：120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14
使用來自H3N2 A/Hong Kong/1/1968之全長HA之序列作為起點，將上述群集與S62至P322缺失組合以得到本發明之多肽
SEQ ID NO：121：H3全長A/Hong Kong/1/1968
SEQ ID NO：122：HK68 H3m2-cl9
SEQ ID NO：123：HK68 H3m2-cl9+10
SEQ ID NO：124：HK68 H3m2-cl9+10+11
SEQ ID NO：125：HK68 H3m2-cl9+10+12
SEQ ID NO：126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO：127：HK68 H3m2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO：128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚體(在位置421至435處之較短三聚體序列)
SEQ ID NO：129：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-三聚體(在位置421至441處之三聚體序列)
SEQ ID NO：130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(在位置421至435處之較短GCN4序列)
SEQ ID NO：131：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-GCN4(在位置421至441處之GCN4序列)。
合成編碼上述蛋白質序列之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。出於比較原因，將H3 A/Wisconsin/67/2005及/或H3 A/Hong Kong/4/1968之全長HA序列包括於實驗中。
使用40μl 293transfectin作為轉染試劑用表現載體(1μg/ml)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞，等分試樣(0.3ml，約3×105個細胞)，且將等分試樣以針對H3 HA產生之多株血清(Protein Sciences Corp,Meriden,CT,USA)處理以探查表現或以HA特異性單株抗體(5微克/毫升)及用於染色之二級抗體處理。隨後，使用針對H3 HA或H1 HA產生之多株血清，針對膜連接之本發明之HA主幹域多肽之表 現，藉由螢光結合細胞分選(FACS)分析細胞以探查表現。將具有結合全長蛋白質之已知特異性之單株抗體小組(CR8020、CR8043及CR9114)用於探查保守抗原決定基之存在，且根據推理探查全長HA及本發明之微型HA多肽之正確摺疊。單株抗體CR6261(已知不結合至H3 HA)及CR8057(結合至來自A/Wisconsin/67/2005之HA之頭部域)亦包括於實驗中。結果表示為陽性細胞百分比，且針對基於A/Wisconsin/67/2005之H3 HA之序列展示於圖9中，及針對基於A/Hong Kong/1/1968之H3 HA之序列展示於圖10中。
結果展示所有基於A/Wisconsin/67/2005之構築體(圖9)均表現於細胞表面上，因為與對於未經轉染之細胞之5%以下相比，與H3多株血清之反應引起所分析之全部細胞之80%或80%以上為陽性。不存在IgG、僅使用經標記之抗人或抗兔IgG之對照實驗均為陰性的。A/Wisconsin/67/2005全長HA由已知能夠結合至此蛋白之單株抗體CR8020、CR8043、CR8057(僅結合至某些H3病毒株，描述於WO 2010/130636中)及CR9114識別，而不由單抗CR6261識別。相比之下，大部分主幹域多肽不由CR8020、CR8043或CR9114識別，其中有一些值得注意的例外。包含群集12突變之多肽由CR8020及/或CR8043識別。H3-微型2-cl9+10+11+12(SEQ ID NO：111)、H3-微型2-cl9+10+12(SEQ ID NO：112)、H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：113)及H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚體(SEQ ID NO：114)展示由CR8020(陽性細胞百分比%在約10至60範圍 內)及CR8043(40%至70%)識別(由箭頭指示)。在4種陽性構築體中，H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：113)在此分析中展現最大反應。自平均螢光強度獲得之相同結果展示於圖B(圖9)中。H3-微型2-cl9+10+11+12(SEQ ID NO：111)、H3-微型2-cl9+10+12(SEQ ID NO：112)、H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：113)及H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚體(SEQ ID NO：114)在暴露於CR8020及CR8043並染色之後展現遠在背景以上之平均螢光強度，其中H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：113)之反應最高。基於來自A/Wisconsin/67/2005之HA之多肽中沒有一者能夠識別CR9114。
圖10展示所有基於A/Hong Kong/1/1968之構築體(圖10)均表現於細胞表面上，因為與對於未經轉染之細胞之5%以下相比，對於大多數構築體與H3多株血清之反應引起所分析之全部細胞之約40%至60%為陽性。不存在IgG、僅使用經標記之抗人或抗兔IgG之對照實驗均為陰性的。在用多株血清處理之後來自A/Hong Kong/1/1968之全長蛋白之陽性細胞百分比較低(約10%)，但自CR8020、CR8043及CR9114之結合獲得之較強信號指示蛋白呈現於細胞表面上。CR8057並不識別基於A/Hong Kong/1/1968之序列，僅識別來自A/Wisconsin/67/2005之全長蛋白。如由陽性細胞%(15%或15%以上)及明顯在背景以上之MFI所指示，CR8020及CR8043識別四種構築體(含有群集12突變)，亦即HK68 H3m2-cl9+10+12(SEQ ID NO：125)、HK68 H3m2- cl9+10+11+12(SEQ ID NO：126)、HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚體(SEQ ID NO：128，在位置421至435處含有縮短之三聚體序列)及HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：130，在位置421至435處含有較短GCN4序列)。針對HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4(SEQ ID NO：130)獲得最強信號(MFI)；此主幹域多肽構築體亦展示對CR9114之可偵測結合。
總之，吾人已展示根據上述方法，可針對第2類群之血清型、尤其H3亞型之A型流感病毒獲得本發明之主幹域多肽。
實例13：包含保守主幹域抗原決定基之可溶性主幹域多肽之設計、表現及部分純化
在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域，以便所得多肽在表現於細胞中時呈現於細胞表面上。在其他實施例中，移除HA2之位置523、524、525、526、527、528、529或530(或等效位置)至C端(編號根據SEQ ID NO：1)之細胞質序列及跨膜序列，以便表現於細胞中產生可用於例如疫苗之分泌型(可溶性)多肽。藉由引入已知形成三聚體結構之序列(亦稱為『摺疊子』)，亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143)，視情況經由連接子(例如GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)連接，可使可溶性多肽進一步穩定。連接子可視情況含有裂解位點以用於在根據熟習此項技術者所熟知之方案純化後處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如 經由較短連接子(例如EGR)連接之組胺酸標記(6或7個連續的組胺酸)。在一些實施例中，在不存在摺疊子序列之情況下，添加連接子及組胺酸標記。
根據本發明，來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA之位置530(編號根據SEQ ID NO：1)至HA2域之C端胺基酸的胺基酸序列經移除且由以下序列置換：包含較短連接子及組胺酸標記之EGRHHHHHHH(SEQ ID NO：81)。將此調換應用至：SEQ ID NO：44：H1-微型2-群集1+5+6-三聚體(產生SEQ ID NO 144：s-H1-微型2-群集1+5+6-三聚體)；SEQ ID NO：45：H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(產生SEQ ID NO：145：s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4)；SEQ ID NO：46：微型2-群集1+5+6(A/Brisbane/59/2007)(產生SEQ ID NO：146：s-H1-微型2-群集1+5+6)；SEQ ID NO：47：微型2-群集11+5+6(A/Brisbane/59/2007)(產生SEQ ID NO：147：s-H1-微型2-群集11+5+6)；SEQ ID NO：48：微型2-群集1+5(A/Brisbane/59/2007)(產生SEQ ID NO：148：s-H1-微型2-群集1+5)。
類似地，出於比較原因，將調換應用至SEQ ID NO1：H1全長(A/Brisbane/59/2007)，且此外藉由將精胺酸343修飾成麩醯胺酸(R343Q突變)來使HA裂解位點受損，得到SEQ ID NO：149：s-H1全長(R343Q)。此外，在HA1之N端與C端部分之間用不同連接子建立兩種本發明之多肽：s-H1-微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：150)及s-H1-微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：151)。
合成編碼上述蛋白質序列之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004neo中。根據此項技術中熟知之方案，使用293transfectin作為轉染試劑，用表現載體轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞，且允許再增殖7天。藉由離心使細胞與培養基分離並丟棄，同時收集含有本發明之可溶性多肽之上清液以用於進一步處理。上清液藉由固定化金屬親和層析法在Ni-NTA管柱上純化，以使本發明之經His標記之多肽結合至樹脂並收集穿流液。用以下洗滌管柱：3至10管柱體積之20mM磷酸鈉(pH 7.4)、500mM NaCl、10mM咪唑(『洗液』)；5至15管柱體積之20mM磷酸鈉(pH 7.4)、500mM NaCl、100mM咪唑(『嚴格洗液』)，並用20mM磷酸鈉(pH 7.4)、500mM NaCl、500mM咪唑溶離。在個別情況下，調適緩衝液組成或所用體積以提高純度或產率，或使用線性梯度代替分段梯度。全程收集溶離份並在SDS-PAGE及西方墨點(Western blot)上分析，使用多株抗H1 HA血清用於偵測(參見圖11A至11H)。結果指示與起始物質相比，本發明之多肽在溶離液中明顯富集。
為了證實本發明之經純化之多肽之正確摺疊及功能性，針對單株抗體CR9114之結合測試製備物。為此，藉由向各孔中施加100微升之1μg/ml抗體溶液並在4℃下培育隔夜，將能夠結合蛋白C端處之His標記(6或7個連續的組胺酸)之單株抗體塗佈於標準96孔盤上。在移除過量溶液並洗滌之後，在室溫下用150微升2%脫脂牛奶溶液將盤阻斷1小 時。移除阻斷劑並洗滌之後，添加100微升之1μg/ml本發明之多肽溶液以及相應全長蛋白之胞外域(SEQ ID NO：149)，且在室溫下培育2小時。移除過量的本發明多肽之後，以在2μg/ml與20μg/ml範圍內變化之濃度添加單抗CR9114、單抗CR8020(陰性對照)或在兔中針對H1 HA產生之多株血清(陽性對照)，且在室溫下培育2小時。使用此項技術中熟知之方案，經由HRP結合之抗人抗體偵測結合。
結果(圖12)展示單株抗體CR9114結合至本發明之經純化之可溶性多肽以及全長胞外域(圖12a)，而單株抗體CR8020不結合(圖12b)。多株抗H1血清亦以極類似方式結合至本發明之多肽及全長胞外域(圖12c)。因此，推斷CR9114之廣泛中和抗原決定基保留於本發明之多肽中，且考慮此抗原決定基之不連續性及構形本質，主幹域已適當摺疊且採用與天然全長HA中之構形等同或極相似之三維構形。
如由SDS-PAGE及西方墨點結果確定，本發明之多肽之製備物的尺寸不均一。吾人猜測該變化歸因於個別蛋白質分子之間的蛋白糖基化模式中之變化。為了證實此猜測，在37℃下用3個單位之N-糖苷酶F(自天冬醯胺殘基移除N連接之碳水化合物部分之酶)處理蛋白製備物之較小等分試樣持續18小時且藉由SDS-PAGE及西方墨點分析。結果(圖13a及圖13b)展示用N-糖苷酶處理使本發明多肽之擴散條帶集中至在由胺基酸序列計算之預期分子量下的單一條帶。由此明顯表明所觀察到之尺寸不均一性實際上產生於 糖基化模式中之變化。
利用HP-SEC進一步表徵本發明之多肽之製備物。為此，將體積在43與63μl之間的約40μg本發明之多肽(多肽濃度在0.64mg/ml與0.93mg/ml之間)施加至與多角度光散射偵測器連接之Tosoh TSK-凝膠G2000 SWx1管柱中。結果展示於圖14中。主峰由本發明之多肽產生(滯留時間約8分鐘)，且與較大物種較好地分離，指示可達成進一步純化。基於多角度光散射偵測器之資料，視所研究之本發明多肽而定，主峰對應於分子量在50千道爾頓與80千道爾頓之間的分子物種(參見圖9)。根據上述尺寸不均一性及多肽糖基化中之變化，以及結果對分子流體動力學形狀之依賴性，此等數字應僅視為指示。
實例14：包含單株抗體CR9114、CR6261及FI6v3之保守主幹域抗原決定基之可溶性主幹域多肽之表現及部分純化
為了獲得本發明之多肽之高度純的製備物，用含有編碼s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)之基因之表現載體pcDNA2004轉染HEK293F細胞。熟習此項技術者將理解在製造期間引導蛋白質轉運之前導序列(或信號序列；例如對應於SEQ ID NO：145之胺基酸1至17)將不存在於分泌型最終多肽中。為此，藉由將HEK293F細胞(Invitrogen)在300g下旋降5分鐘，且經由SF1000再懸浮於300mL預溫熱之FreestyleTM培養基來接種1.0×106個活細胞/毫升。在multitron培育箱中將此培養物在37℃、10% CO2下在110rpm下培育1小時。1小時後，將質體DNA移液於 9.9mL Optimem培養基中，達至300mL培養物體積中1.0μg/ml之濃度。平行地，將440μL 293fectin®移液於9.9mL Optimem培養基中且在室溫下培育5分鐘。5分鐘後，將質體DNA/Optimem混合物添加至293fectin®/Optimem混合物中，且在室溫下培育20分鐘。培育後，向細胞懸浮液中逐滴添加質體DNA/293fectin®混合物。在multitron培育箱中將經轉染之培養物在37℃、10% CO2及110rpm下培育。在第7天，藉由離心(在3000g下30分鐘)使細胞與培養基分離，同時在0.2μm瓶頂過濾器上過濾含有本發明之可溶性多肽之上清液以用於進一步處理。
為了驗證存在本發明之多肽，使用針對用於偵測之His標記之單株抗體，藉由西方墨點分析上清液之較小等分試樣(圖15a)。在37kDa與50kDa之間的表觀分子量下觀察到數個條帶，該表觀分子量接近或高於基於蛋白之胺基酸組成計算之分子量。尺寸不均一性由糖基化模式中之變化引起，因為先前實驗已展示用N-糖苷酶F處理此蛋白以自蛋白中移除所連接之N連接之聚糖，引起條帶集中於預期分子量下。
使用廣泛中和抗體CR6261、CR9114及FI6v3作為探針，藉由ELISA證實本發明之多肽上存在廣泛中和抗原決定基。出於比較原因，在實驗中亦包括單株抗體CR8020作為陰性對照；此抗體能夠結合至來自第2類群(例如H3及H7 HA)而非來自第1類群(例如H1及H5 HA)病毒之HA分子。為此，藉由向各孔中施加100微升之1μg/ml抗體溶液並在 4℃下培育隔夜，將能夠結合蛋白C端處之His標記(6或7個連續的組胺酸)之單株抗體塗佈於標準96孔盤上。在移除過量溶液並洗滌之後，在室溫下用150微升2%脫脂牛奶溶液將盤阻斷1小時。移除阻斷劑並洗滌之後，添加100微升上清液並在室溫下培育2小時。移除過量的本發明多肽之後，添加起始於5μg/ml濃度呈1：2稀釋系列之單抗CR9114，並在室溫下培育2小時。使用此項技術中熟知之方案，經由HRP結合之抗人抗體偵測結合。觀察到CR9114、FI6v3及在較低程度上CR6261明顯結合至本發明之多肽，而對於CR8020未觀察到反應，指示所觀察到之結合對所測試之單株抗體具有特異性(圖15b)。
出於純化目的，向5ml His-截留管柱中施加250ml培養物上清液，用75ml洗滌緩衝液(20mM TRIS、500mM NaCl，pH 7.8)洗滌，且用分段梯度之咪唑(10mM、50mM、100mM、200mM、300mM及500mM於洗滌緩衝液中)溶離。層析圖(16)展示多個峰，其中本發明之多肽在100mM咪唑(A峰)及200mM咪唑(B峰)下溶離。收集兩個峰，濃縮，並施加至尺寸排阻管柱以用於進一步純化(Superdex 200)。溶離概況展示於圖17a及圖17b中。收集溶離份並於SDS-PAGE上分析(圖17c及圖17d)。自A峰及B峰獲得之溶離份3含有高度純的本發明多肽。最終得到約10μg/ml之培養物上清液。經純化之批次不含內毒素(以5mg/kg投藥；<1EU/mg；Chromogenic LAL)且生物負載低於1CFU/50μg。
實例15：基於B型流感HA設計包含CR9114之保守主幹域抗原決定基之主幹域多肽
設計本發明多肽之上述程序亦應用於B型流感。在此實例中，描述基於自兩種已知譜系之病毒株(亦即B/Florida/4/2006(B/Yamagata lineage)及B/Malaysia/2506/2004(B/Victoria lineage))採集之HA序列的本發明之多肽。熟習此項技術者將理解亦可能使用其他B型流感HA序列，因為該等序列較好地保守，尤其在幹區中。因此，本發明亦涵蓋根據以下描述自其他B型流感HA序列獲得之多肽。
B/Florida/4/2006之HA序列中之第一個修飾為藉由使R(或在有限數目情況下為K)突變成Q(R361Q)來移除位置361(編號參考SEQ ID NO：132)處之裂解位點，以防止自HA0形成HA1及HA2。視情況可再缺失殘基363至367(GFGAI，融合肽之一部分)，以使疏水性殘基對水性溶劑之暴露降至最低。裂解處之正電荷在來自B型流感之HA中100%保守，且此突變可因此應用於所有序列中。
第二個修飾為藉由以下方式移除頭部域：使HA1序列之較大部分缺失，且經由較短連接子使N端及C端序列再連接。缺失長度可變化，但較佳HA1之N端序列之最後一個殘基與C端序列之第一個殘基在空間上緊靠在一起以避免經由連接序列引入病毒株。在B序列中，可在B/Florida/4/2006(SEQ ID NO：132)之P51至I336(等效位置)處引入缺失(m2；SEQ ID NO：133)。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比 對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。
SEQ ID NO：133描述含有缺失P51至I332之該本發明多肽(m2；SEQ ID NO：133)。上述缺失確保由P51與N58之間及E306與I337之間的殘基形成之非結構化區域亦得以移除；此舉有益於本發明之多肽之總體穩定性。對來源於H1序列之本發明之多肽觀察到類似作用(參見上文)。
頭部域之缺失留下現暴露於水性溶劑之殘基416至436之間的環。在B HA中，此環高度保守(參見表10)。共同序列為：LSELEVKNLQRLSGAMDELHN。
為了增加此環在融合前構形中之溶解度且使融合後構形不穩定，將一些疏水性殘基修飾成極性(S、T、N、Q)、帶電荷的胺基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突變成G來增加可撓性。特定言之，在位置421、424、427、434(編號參考SEQ ID NO：132)處之突變將有助於本發明之多肽之穩定性。
對於位置V421及L427，較佳突變成T，但其他極性(S、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置424，較佳突變成S。其他極性(N、T、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置L434，較佳突變 成G。其他極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)將具有相同作用。製得含有上述突變中之至少一者之多肽。亦可能為一個以上突變之組合，如例如SEQ ID NO：134至SEQ ID NO：136中所示。
為了使本發明之多肽之融合前構形穩定，在於一級序列中遠離但在摺疊之融合前構形中接近之兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋連基在多肽中經工程化，較佳在來自B/Florida/4/2006(SEQ ID NO：134至SEQ ID NO：136)之HA中之位置K340與S454(等效位置)之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。自GCN4獲得之支持三聚捲曲螺旋形成之序列在位置436至452(等效位置)處引入(RRMKQIEDKIEEILSKI(SEQ ID NO：135))或者在位置436至451處引入(RMKQIEDKIEEILSKI(SEQ ID NO：136))。
對於來自B/Malaysia/2506/2004(SEQ ID NO：137)之HA遵循相同程序以提供多肽。與來自B/Florida/4/2006之HA相比，如可在兩種序列之比對中輕易看出，此HA具有插入 於位置178處之另一天冬醯胺殘基。因此，裂解位點在位置362處，且防止裂解之相應突變為R362Q。在此情況下移除頭部區之缺失例如為P51至I337(m2；SEQ ID NO：138)。再次，序列之剩餘部分可直接連接，或者可引入可撓性連接子。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。
SEQ ID NO：138描述含有缺失P51至I332之該多肽(m2；SEQ ID NO：138)。上述缺失確保由P51與N58之間及E307與I338之間的殘基形成之非結構化區域亦得以移除；此舉有益於本發明之多肽之總體穩定性。對來源於H1序列之本發明之多肽觀察到類似作用(參見上文)。
頭部域之缺失留下現暴露於水性溶劑之殘基L420至H436之間的環。在B HA中，此環高度保守(參見表x)。共同序列為：LSELEVKNLQRLSGAMDELHN。
為了增加此環在融合前構形中之溶解度且使融合後構形不穩定，將一些疏水性殘基修飾成極性(S、T、N、Q)、帶電荷的胺基酸(R、H、K、D、E)，或必需藉由突變成G來增加可撓性。特定言之，測試在位置422、425、428、435(編號參考SEQ ID NO：137)處之突變。
對於位置V422及L428，較佳突變成T，但其他極性(S、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置425，較佳突變成S。其他 極性(N、T、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)及高度可撓性胺基酸(G)將具有相同作用。對於位置L435，較佳突變成G。其他極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)將具有相同作用。製得含有上述突變中之至少一者之多肽。亦可能為一個以上突變之組合，如例如SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：141中所示。
為了使本發明之多肽之融合前構形穩定，在於一級序列中遠離但在摺疊之融合前構形中接近之兩個部分之間引入共價鍵。為此，二硫橋連基在本發明之多肽中經工程化，較佳在來自B/Malaysia/2506/2004(SEQ ID NO：139至SEQ ID NO：141)之HA中之位置K341與S455(等效位置)之間。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
如上所述，天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的大部分相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強穩定性。在主幹域中，三聚藉由形成三聚捲曲螺旋基元來介導。藉由強化此基元，可產生較穩定三聚體。自GCN4獲得之支持三聚捲曲螺旋形成之序列在位置437至453(等效 位置)處引入(RRMKQIEDKIEEILSKI(SEQ ID NO：135))或者在位置437至452處引入(RMKQIEDKIEEILSKI(SEQ ID NO：136))。
藉由如上所述螢光結合細胞分選，針對CR9114之抗原決定基之存在，測試基於B型流感血球凝集素之多肽SEQ ID NO：133至SEQ ID NO：136及SEQ ID NO：138至SEQ ID NO：141。然而，針對此等構築體未觀察到單抗CR9114之結合。
實例16：第三代HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載體對小鼠進行免疫接種：來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)、微型3-群集11(SEQ ID NO：11)、微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5(SEQ ID NO：48)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)及微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用50μg構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。使用來自A/Brisbane/59/2007及A/California/07/2009病毒株之全長HA之重組胞外域(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA獲得)作為抗原，藉由Elisa分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。 用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之20倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗體。效價與使用單抗3AH1 InA134(Hytest,Turku,Finland)之標準曲線相比，得出Elisa單位/毫升(EU/ml)。
由上述免疫接種程序誘導之對同源全長蛋白胞外域之IgG反應的時程展示於圖18中。4週後，對用編碼全長蛋白(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種之小鼠，已可觀察到較高反應。如自在7週時增加之效價展示，反應藉由加強注射增強。用編碼以下之DNA免疫接種引起中等效價：本發明之多肽微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5(SEQ ID NO：48)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)及微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)，如由第7週時之效價表明，該等中等效價在加強免疫接種後進一步增強。用編碼微型3-群集11(SEQ ID NO：11)及陰性對照cM2之DNA免疫接種在此分析中不引起可偵測反應。
圖19展示在針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(圖A)及異源病毒株H1N1 A/California/07/2009之全長血球凝集素之胞外域對個別小鼠進行首次免疫接種之後，在第7週時之IgG反應。由編碼以下之DNA誘導之抗體同樣較好地結合至自同源及異源病毒株獲得之血球凝集素的胞外域：本發明之多肽微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5(SEQ ID NO：48)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)及微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)。相比之下，用編碼全長蛋白(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種引起針對同源血球凝集素之較高效價(比對用編碼本發明多肽之DNA免疫接種觀察到之效價高一個數量級以上)，但引起針對異源血球凝集素之胞外域的較低效價。用編碼微型3-群集11(SEQ ID NO：11)及陰性對照cM2之DNA免疫接種在此分析中不引起針對任一血球凝集素胞外域之可偵測反應。
總之，針對以下產生之抗體能夠識別全長血球凝集素：本發明之多肽微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5(SEQ ID NO：48)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)及微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)。其抗原決定基必定位於血球凝集素主幹域上且在來自H1N1 A/Brisbane/59/2007與H1N1 A/California/07/2009之全長血球凝集素之間保守。
實例17：第三代HA主幹域多肽微型2-群集1+5+6-GCN4之免疫原性
為了進一步評估本發明之主幹域多肽之免疫原性，用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之表現載體對小鼠進行小鼠一次免疫接種(初免)，且在三週時間間隔下用經純化之蛋白s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ IDNO：145)加強兩次。出於比較原因，在三週時間間隔下對 不同組進行三次免疫接種，用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)以及來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)之表現載體免疫接種。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天時用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之1000μg構築體+100μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)，及在第21天及第42天時用佐以10μg Matrix-M之s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145；100μg經純化之蛋白)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內(i.m.)免疫接種。一組接受第2次及第3次皮下免疫接種，而另一組接受第2次及第3次肌肉內免疫接種。此外，第三組如上在第1天時用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之100μg構築體+100μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)初免，且在第21天及第41天時接受佐以Montanide ISA-720(1：1 v/v)之s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ IDNO：145；100μg經純化之蛋白)的加強免疫接種。為了比較，在第1天、第21天及第42天時用佐以100μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)之編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)或cM2的100μg構築體對4隻小鼠(BALB\c)的群組進行肌肉內免疫接種。
在第49天，進行最終取血且收集血清。使用來自H1N1 A/Brisbane/59/2007、H1N1 A/California/07/2009、H5N1 A/Vietnam/1203/2004及H3N2 A/Hong Kong//1968病毒株之重組全長HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT, USA獲得)作為抗原，藉由ELISA分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之20倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗體。將效價與由結合至HA抗原之小鼠單株抗體之連續稀釋液組成之標準曲線比較，且表示為ELISA單位/毫升(EU/ml)。圖20展示在針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(圖A)、異源病毒株H1N1 A/California/07/2009(圖B)、異源亞型病毒株H5N1 A/Vietnam/1203/2004(圖C)及異源亞型病毒株H3N2 A/Hong Kong/1/1968(圖D)之全長血球凝集素之胞外域對個別小鼠進行首次免疫接種之後，在第7週時之IgG反應。藉由用編碼本發明之多肽微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之DNA免疫接種而誘生之抗體能夠識別H1N1 A/Brisbane/59/2007、H1N1 A/California/07/2009及在較低程度上H5N1 A/Vietnam/1203/2004之HA。藉由用編碼來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種而誘生之抗體極好地識別同源蛋白，但識別來自H1N1 A/California/07/2009之異源HA及來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之異源亞型HA較差，如由圖17B及圖17C中之較低效價表明。小鼠群組用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45；初免)之DNA免疫接種，隨後用s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)蛋白加強免疫接種，展示針對自同源H1N1 A/Brisbane/59/2007、異源H1N1 A/California/07/2009及異源亞型H5N1 A/Vietnam/1203/2004獲得之HA之胞外域的較高效價。
圖20D展示在第7週時針對來自H3N2 A/Hong Kong/1/1968之HA之胞外域的IgG反應。不同於自H1N1 A/Brisbane/59/2007(屬於流感第1類群之病毒株)之HA獲得之微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)及s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)，H3N2 A/Hong Kong/1/1968屬於流感第2類群，且因此在系統發育學上遠離用於設計此實驗中所用之本發明多肽的親本序列。用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)或來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種三次並不引起針對此抗原之可由ELISA偵測的IgG水準。相比之下，用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之DNA免疫接種繼而用經純化之蛋白s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)加強免疫接種兩次，引起針對來自H3N2 A/Hong Kong/1/1968之HA之較高效價。此結果獨立於所用免疫接種途徑(亦即肌肉內相對於皮下)或添加至蛋白加強免疫接種中之佐劑(Matrix-M或Montanide ISA-720)獲得。
總之，用本發明之多肽免疫接種可誘生能夠識別來自廣泛範圍流感病毒株之HA的IgG，該等流感病毒株包括來自流感第1類群之同源、異源及異源亞型病毒株以及來自流 感第2類群之病毒株。相比之下，用全長HA免疫接種引起針對同源病毒株之HA的較高效價、針對異源及異源亞型病毒株之較低效價、及在針對來自流感第2類群之病毒株之在偵測限以下的IgG水準。
實例18：設計包含CR6261及CR9114之保守主幹域抗原決定基之其他主幹域多肽
根據上述程序設計之本發明之多肽可經進一步修飾以增強穩定性。可引入該等修飾以在單聚及/或二聚物內增強本發明多肽之三聚形式的形成。如所述，天然HA以三聚體之形式存在於細胞表面上。使三聚體保持在一起之個別單體之間的許多相互作用位於頭部域。移除頭部之後，三級結構由此去穩定，且因此增強截斷之分子中之單體之間的相互作用將增強三聚體形式之穩定性。三聚藉由形成三聚體來介導。藉由強化主幹域中之捲曲螺旋基元，可獲得較穩定三聚體形式。
根據本發明，可在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置418至433(等效位置)處(編號根據SEQ ID NO：1)將用於形成三聚捲曲螺旋之共同序列IEAIEKKIEAIEKKIE(SEQ ID NO：83)引入本發明多肽中(SEQ ID NO：44)。或者，可將IEAIEKKIEAIEKKI(SEQ ID NO：85)引入419至433處(SEQ ID NO：49)，或將IEAIEKKIEAIEKK(SEQ ID NO：86)引入420至433處(SEQ ID NO：50)。一種替代方案為將來源於GCN4且已知三聚之序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)引入位置419至433處(SEQ ID NO：45)。或者，可將 MKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO：87)引入位置420至433處(SEQ ID NO：51)，或將RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO：88)引入位置417至433處(SEQ ID NO：52)。類似地，三聚體界面可藉由將M420、L423、V427、G430修飾成異白胺酸來強化(SEQ ID NO：53)。
在某些實施例中，本發明之多肽含有H1 HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，移除HA2之位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2之C端(編號根據SEQ ID NO：1)之細胞質序列及跨膜序列，以便製造分泌型(可溶性)多肽。可如上所述使可溶性多肽進一步穩定。
描述連接子變異體
合成編碼上述蛋白質序列(SEQ ID NO：44至SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：152至SEQ ID NO：157)之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。出於比較原因，將編碼全長序列(SEQ ID NO：1)以及cM2之表現載體包括於實驗中。
使用40μl 293-transfectin作為轉染試劑用表現載體(1μg/ml)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞；等分試樣(0.3ml，約3×105個細胞)，且將等分試樣以針對H1 HA產生之多株血清處理以探查表現或以HA特異性單株抗體(5微克/毫升)及用於染色之二級抗體處理。隨後，使用針對H1 HA 產生之多株血清，針對膜連接之本發明之HA主幹域多肽之表現，藉由螢光結合細胞分選(FACS)分析細胞以探查表現。將具有結合全長蛋白質之已知特異性之單株抗體小組(CR6261、CR9114、CR9020及CR8020)用於探查保守抗原決定基之存在，且根據推理探查全長HA及本發明之微型HA多肽之正確摺疊。結果表示為陽性細胞百分比及平均螢光強度，且展示於圖21中。
結果展示所有測試之變異體均表現於細胞表面上，如由來自多株抗H1血清之陽性反應證明。H3 HA特異性抗體CR8020並不識別實驗中所包括之任何構築體，而CR9020(其結合至H1 HA之頭部域)明顯僅識別全長蛋白。本發明之所有多肽以及全長蛋白由CR6261及CR9114識別，指示相應抗原決定基以與野生型蛋白中相同的構形存在於本發明之多肽中。在螺旋CD(參見圖1)中包括另一三聚基元之本發明多肽中，與含有SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86之共同三聚序列之SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：50相比，含有GCN4來源之序列SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88之SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：52分別引起相等或較高反應(MFI)。
本發明之多肽中連接胺基酸52與321(編號參考SEQ ID NO：1)之連接子之組成變化並不在單株抗體CR6261及CR9114識別方面引起重大變化。當SEQ ID NO：46中之GGGG經HNGK置換，產生SEQ ID NO：152時，觀察到最大 變化，其引起對CR6261之反應稍微降低，但並不影響對CR9114之反應。移除連接子並引入SEQ ID NO：1之胺基酸53至56(SHNG)，亦即在無連接子之情況下在SEQ ID NO：46(產生SEQ ID NO：153)、SEQ ID NO：45(產生SEQ ID NO：154)或SEQ ID NO：50(產生SEQ ID NO：155)中建立本發明之多肽並未影響FACS分析中之反應，指示連接子序列並非至關重要。
SEQ ID NO：156藉由引入突變I337N、I340N及F352Y而自SEQ ID NO：46獲得，而SEQ ID NO：157在位置353處含有另一突變，亦即I353N。此等突變並不在圖21中所示之FACS分析中引起對CR6261及CR9114之反應的改良。
在某些實施例中，本發明之多肽含有HA之細胞內序列及跨膜域。在其他實施例中，移除HA2之位置523、524、525、526、526、527、528、529或530(或其等效位置)至HA2之C端(編號根據SEQ ID NO：1)之細胞質序列及跨膜序列，且視情況藉由引入已知形成三聚體結構之序列(亦即AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO：143))置換，視情況經由連接子連接。連接子可視情況含有裂解位點以用於之後根據熟習此項技術者所熟知之方案處理。為了促進可溶性形式之純化，可添加標記序列，例如經由較短連接子(例如EGR)連接之his標記HHHHHHH。根據本發明，HA2域之位置530(編號根據SEQ ID NO：1)至C端胺基酸之胺基酸序列可經移除並置換為SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：82。
實例19：第三代HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載體對小鼠進行免疫接種：來自A/Brisbane/59/2007之全長H1(SEQ ID NO：1)、微型3-群集11(SEQ ID NO：11)、微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)、微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：153)、微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)、微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)、微型2-群集1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO：52)、微型2-群集1+5+6+12(SEQ ID NO：156)及微型2-群集1+5+6+12+13(SEQ ID NO：157)。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用100μg構築體+100μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。使用來自H1N1 A/Brisbane/59/2007、H1N1 A/California/07/2009及H5N1 A/Vietnam/1203/2004病毒株之重組全長HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA獲得)作為抗原，藉由ELISA分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之50倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗 體。將效價與由結合至HA抗原之小鼠單株抗體之連續稀釋液組成之標準曲線比較，且表示為ELISA單位/毫升(EU/ml)。
圖22展示在針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(圖A)、異源病毒株H1N1 A/California/07/2009(圖B)及異源亞型病毒株H5N1 A/Vietnam/1203/2004(圖C)之全長血球凝集素對個別小鼠進行首次免疫接種之後，在第7週時之IgG反應。藉由用編碼以下之DNA免疫接種誘生之抗體同樣較好地結合至自同源H1N1 A/Brisbane/59/2007及異源H1N1 A/California/07/2009病毒株獲得之血球凝集素的胞外域(圖22A及圖22B)：本發明之多肽微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)、微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：153)、微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)、微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)、微型2-群集1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO：52)、微型2-群集1+5+6+12(SEQ ID NO：156)及微型2-群集1+5+6+12+13(SEQ ID NO：157)。對微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)及微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)觀察到最高效價。相比之下，用編碼全長蛋白(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種引起針對同源血球凝集素之較高效價(比對用編碼本發明多肽之DNA免疫接種觀察到之效價高一個數量級以上)，但 引起針對異源血球凝集素之胞外域的較低效價(一個數量級以上)。用編碼微型3-群集11(SEQ ID NO：11)及陰性對照cM2之DNA免疫接種在此分析中不引起針對任一血球凝集素胞外域之可偵測反應。
針對來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之異源亞型血球凝集素之胞外域之效價(圖22C)指示對微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)的明顯反應。在用編碼微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)之DNA免疫接種之後，在4隻小鼠中之2隻中；及針對微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)、微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：153)、微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)，在4隻小鼠中之1隻中，亦獲得可觀察之效價。令人驚訝的是，吾人亦在用編碼微型3-群集11(SEQ ID NO 11)及微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)之DNA免疫接種之後發現可偵測效價。前一個構築體並不誘導針對同源及異源H1 HA之任何可偵測的抗體效價，而後者僅誘導中度反應(圖22A及圖22B)。此實驗中所有構築體與H5 HA之序列之比較預示推定線性抗原決定基定位於較長CD螺旋之膜遠端處(參見圖1)。SEQ ID NO：11中位置175處及SEQ ID NO：14中位置156處之蛋氨酸突變成異白胺酸產生線性序列ERRIENLNKK(SEQ ID NO：11中之位置172至181；SEQ ID NO：14中之位置153至162)。此序列亦存在於來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之HA中，但不存在於來自H1N1 A/Brisbane/59/2007及H1N1 A/California/07/2009之HA中(其中相應序列分別為 ERRMENLNKK及EKRIENLNKK)。
總之，針對以下產生之抗體能夠識別全長血球凝集素：本發明之多肽微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5+6(SEQ ID NO：46)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)、微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：153)、微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)、微型2-群集1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO：52)、微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)、微型2-群集1+5+6+12(SEQ ID NO：156)及微型2-群集1+5+6+12+13(SEQ ID NO：157)。此等抗體之抗原決定基必定位於血球凝集素主幹域且在來自H1N1 A/Brisbane/59/2007與H1N1 A/California/07/2009之全長血球凝集素之間保守。經由用編碼以下之DNA免疫接種而誘生之抗體亦能夠識別來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之HA的胞外域：微型2-群集1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO：51)、及在較低程度上微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)、微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)、微型2-群集1+5+6-nl(SEQ ID NO：152)、微型2-群集1+5+6-nl2(SEQ ID NO：153)、微型2-群集1+5+6-nl2s-GCN4(SEQ ID NO：154)及微型2-群集1+5+6+12(SEQ ID NO：156)。本發明之多肽微型3-群集11(SEQ ID NO：11)能夠誘生識別來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之HA的胞外域之抗體。
實例20：設計包含CR6261及CR9114之保守主幹域抗原決定基之主幹域多肽的一般方法
基於上述結果，定義一般方法以自流感病毒HA0序列、尤其自血清型H1之流感HA0序列建立本發明之多肽。該方法包含以下步驟：
1.移除HA1與HA2之間的裂解位點。此舉可藉由在P1位置處使R(在少數情況下為K)突變成Q來達成(參見例如Sun等人，2010對於裂解位點(SEQ ID NO：1中之位置343)之命名的解釋)。較佳突變成Q，但S、T、N、D或E為替代方案。
2.藉由使來自SEQ ID NO：1之胺基酸53至320、或來自其他流感病毒之HA中之等效位置處的胺基酸缺失來移除頭部域。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。序列之剩餘部分可直接連接或者藉由引入可撓性連接子來連接。連接子序列長度可為1至50個胺基酸。較佳為有限長度之可撓性連接子(小於或等於10個胺基酸)，例如GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAG或類似物。缺失長度亦可變化，例如藉由在位置54、55、56、57或58(等效位置)處開始缺失，或藉由在位置47、48、49、50、51或52處切割以增加缺失長度。類似地，最後一個欲缺失之胺基酸可在位置315、316、317、318或319(等效位置)處，或在位置321、322、323、324或325(等效位置)處以增加缺失長度。重要的是認識到，缺失長度之變化可藉由匹配連接子序列之長度來部分補償，亦即較大缺失可與較長連接子匹配且反之亦然。本發明亦涵蓋此等多肽。
3.增強由H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)中之殘基402至418(等效位置)形成之環(在A螺旋與CD螺旋之間)的溶解度，以使經修飾之HA之融合前構形之穩定性增強且使融合後構形不穩定。此環在H1序列中高度保守，如可在以下表6中看出。此舉可例如藉由用親水性對應物置換該環中之I、L、F或V殘基來達成。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal或Muscle)比對序列來輕易地測定。突變成甘胺酸使融合後構形不穩定，因為此胺基酸之高度可撓性引起欲利用HA序列之此部分形成之融合後螺旋的穩定性降低。描述血清型H1之流感HA之殘基402至418之間的環之共同序列為(SEQ ID NO：17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)。在本發明之多肽中，位置406、409、413及/或416(或其等效位置，如由序列比對測定)處之胺基酸為極性(S、T、N、Q)、帶電荷的(R、H、K、D、E)或可撓性(G)胺基酸。應注意到L416突變成S或T亦引入共同N-糖基化位點(共同序列為NX(S/T))。此位置天冬醯胺之糖基化將進一步增強此區域之溶解度。亦可能為此等位點處之突變之組合，例如SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：14中之F406S、V409T、L416S。在一些情況下，較佳為恢復共同胺基酸之突變，例如其中V或M在位置404處(突變成T)，V在408(突變成A)或410(突變成G)處，或I在414處(突變成N)；具有此等特定胺基酸之序列之發生率極低。表徵本發明之多肽之上述突變之概述在表6中給出。
4.在本發明之多肽中引入二硫橋連基，較佳在H1 A/Brisbane/59/2007中之位置324與436(等效位置)之胺基酸之間；SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：16。等效位置可由熟習此項技術者藉由使用適合之演算法(諸如Clustal、Muscle等)比對序列來輕易地測定。藉由以下方式產生經工程化之二硫橋連基：使空間上接近之至少一個(若另一者已為半胱胺酸)、但通常兩個殘基突變成半胱胺酸，其將自發地或藉由活性氧化在此等殘基之硫原子之間形成共價鍵。
使用上述本發明之一般方法，建立基於以下之HA0序列之本發明之多肽：H1N1 A/California/04/2009(SEQ ID NO：159)、H1N1 A/California/07/2009(SEQ ID NO：56)、H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID NO：78)及H1N1 A/Texas/36/1991(SEQ ID NO：64)。此外，使用來自H5N1 A/Vietnam/1203/2004之HA(SEQ ID NO：158)，將該方法應用於來自另一亞型(其為第1類群之一部分，亦即H5)之HA。
H1微型HA A/California/07/2009(SEQ ID NO：160)藉由以下方式自H1 FL HA A/California/07/2009(SEQ ID NO：56)建立：1.移除裂解位點：突變R344Q(編號參考SEQ ID NO：56)；2.使殘基K53至P321缺失，且在D52與K322(編號參考SEQ ID NO：56)之間引入GGGG連接子； 3.在A螺旋與CD螺旋之間的環(SEQ ID：NO：56中之殘基403至419)中，在位置407、417處引入絲胺酸殘基(F407S、L417S；編號參考SEQ ID NO：2)，在位置410處引入蘇胺酸(V410T；編號參考SEQ ID NO：56)，及在位置414處引入甘胺酸殘基(F414G；編號參考SEQ ID NO：2)；4.藉由使殘基離胺酸325及蘇胺酸437突變成半胱胺酸(K325C、T437C；編號參考SEQ ID NO：56)來引入二硫橋連基；5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置換419KRIENLNKKVDDGFLD434(編號參考SEQ ID NO：56)來引入另一穩定化元素。
基於來自A/California/04/2009(SEQ ID NO：159)之全長HA之微型HA序列可以相同方式建立，且與H1微型HA A/California/07/2009(SEQ ID NO：160)之序列一致。
類似地，H1微型HA A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID：NO：161)藉由以下方式自H1 FL HA A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID NO：78)建立：1.移除裂解位點：突變R343Q(編號參考SEQ ID NO：78)；2.使殘基S53至P320缺失，且在D52與K321(編號參考SEQ ID NO：78)之間引入GGGG連接子；3.在A螺旋與CD螺旋之間的環(SEQ ID NO：78中之殘基402至418)中，在位置406、416處引入絲胺酸殘基(F406S、L416S；編號參考SEQ ID NO：78)，在位置409處 引入蘇胺酸(V409T；編號參考SEQ ID NO：78)，及在位置413處引入甘胺酸殘基(F413G；編號參考SEQ ID NO：78)；4.藉由使殘基精胺酸324及蘇胺酸436突變成半胱胺酸(R324C、T436C；編號參考SEQ ID NO：78)來引入二硫橋連基；5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置換418KRMENLNNKVDDGFLD433(編號參考SEQ ID NO：78)來引入另一穩定化元素。
H1微型HA A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID：NO：161)與H1 FL HA A/Puerto Rico/8/1934(SEQ ID NO：78)之間的另一差異在位置397處，該位置397在全長蛋白(SEQ ID：NO：78)中為絲胺酸，但在SEQ ID：NO：161之本發明多肽中為蘇胺酸(S397T突變)。此突變為A/Puerto Rico/8/1934序列中天然產生之變化，且因此含有此突變之序列亦包括於本發明中。
H1微型HA A/Texas/36/1991(SEQ ID NO：162)藉由以下方式自H1 FL HA A/Texas/36/1991(SEQ ID NO：64)建立：1.移除裂解位點：突變R344Q(編號參考SEQ ID NO：64)；2.使殘基S53至P321缺失，且在D52與K322(編號參考SEQ ID NO：64)之間引入GGGG連接子；3.在A螺旋與CD螺旋之間的環(SEQ ID：NO：64中之殘基403至419)中，在位置407、417處引入絲胺酸殘基(F407S、L417S；編號參考SEQ ID NO：64)，在位置410處 引入蘇胺酸(V410T；編號參考SEQ ID NO：64)，及在位置414處引入甘胺酸殘基(F414G；編號參考SEQ ID NO：64)；4.藉由使殘基精胺酸325及蘇胺酸437突變成半胱胺酸(R325C、T437C；編號參考SEQ ID NO：64)來引入二硫橋連基；5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQ置換419RRMENLNKKVDDGFLD434(編號參考SEQ ID NO：64)來引入另一穩定化元素。
H5微型HA A/Vietnam/1203/2004(SEQ ID NO：163)藉由以下方式自H5 FL HA A/Vietnam/1203/2004(SEQ ID NO：158)建立：
1.移除裂解位點。由於H5 FL HA A/Vietnam/1203/2004(SEQ ID NO：158)含有多元裂解位點(341RRRKKR346)，故單一位點突變不足以防止蛋白質裂解。代之以，使341RRRKK345缺失且引入R346Q突變。
2.使殘基K52至P319缺失，且在K51與K320(編號參考SEQ ID NO：158)之間引入GGGG連接子；
3.在A螺旋與CD螺旋之間的環(SEQ ID：NO：158中之殘基405至421)中，在位置409、419處引入絲胺酸殘基(F409S、L419S；編號參考SEQ ID NO：158)，在位置412處引入蘇胺酸(V412T；編號參考SEQ ID NO：158)，及在位置416處引入甘胺酸殘基(F416G；編號參考SEQ ID NO：158)；
4.藉由使殘基離胺酸323及蘇胺酸439突變成半胱胺酸 (K323C、T439C；編號參考SEQ ID NO：158)來引入二硫橋連基；
5.藉由用序列RMKQIEDKIEEIESKQI置換421RRIENLNKKMEDGFLDV437(編號參考SEQ ID NO：158)來引入另一穩定化元素。
合成編碼以下之蛋白質序列之基因：SEQ ID：NO：56、SEQ ID：NO：160、SEQ ID：NO：78、SEQ ID：NO：161、SEQ ID：NO：162、SEQ ID：NO：158及SEQ ID：NO：163，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。出於比較原因，將H3 A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)之全長HA序列以及具有另一裂解位點突變R343Q之H1 A/Brisbane/59/2007之全長HA序列(SEQ ID NO：1)包括於實驗中。
使用40μl 293transfectin作為轉染試劑用表現載體(1μg/ml)轉染HEK293F(Invitrogen)懸浮細胞(106個細胞/毫升，30ml)，且允許再增殖2天。收集細胞，等分試樣(0.3ml，約3×105個細胞)，且將等分試樣以針對H1 HA產生之多株血清(Sino Biological Inc.Beijing,China)處理以探查表現或以HA特異性單株抗體(5微克/毫升)及用於染色之二級抗體處理。隨後，針對細胞表面上膜連接之本發明之HA主幹域多肽之表現，藉由螢光結合細胞分選(FACS)分析細胞。將具有結合全長蛋白質中之主幹域之已知特異性之單株抗體小組(CR6261、CR9114)用於探查保守抗原決定基之存在，且根據推理探查全長HA及本發明之微型HA多 肽之正確摺疊。單株抗體CR8020(已知不結合至H1及H5 HA)及CR9020(結合至來自H1 A/Brisbane/59/2007之HA之頭部域)亦包括於實驗中。結果表示為陽性細胞百分比及平均螢光強度(MFI)，且展示於圖23中。
用多株抗H1血清處理經轉染之細胞產生針對全長HA(實心條)之20%至80%陽性細胞及針對微型HA之40%至50%陽性細胞。陰性對照FL H3 A/Hong Kong/1/1968及cM2僅展示極低數目之陽性細胞。平均螢光強度(下圖)對映此結果，該平均螢光強度對於所有H1全長HA蛋白均展示明顯可偵測信號。對於全長H5 HA之信號仍然較低；然而，此現象可由經轉染之細胞數目較低以及多株H1血清之識別較低來解釋。陰性對照FL A/Hong Kong/1/1968及cM2展示在背景水準下之強度。
如由較高數目之陽性細胞(約50%至約95%)及較高MFI所指示，已知為較強第1類群幹結合物之CR6261及CR9114識別所有第1類群全長HA及微型HA蛋白。由此較有力地表明此等抗體之中和抗原決定基存在於微型HA蛋白中，指示強烈類似全長HA中HA主幹域之天然結構的三維結構。正如所料，陰性對照CR8020(對第2類群HA具有特異性)並不結合至H1及H5全長HA或H1及H5微型HA，指示所觀測之CR6261/CR9114中和抗體對微型HA蛋白之結合並不因特異性蛋白間相互作用而產生。自陽性細胞百分比及MFI明顯觀察到來自A/Hong Kong/1/1968之全長H3 HA與CR9114或CR8020之間的結合，與先前觀察一致，且證實此等單株 抗體之功能性。類似地，陰性對照抗體CR9020(A/Brisbane/59/2007之HA頭部結合物)並不識別微型HA或全長HA蛋白(其中例外為來自A/Brisbane/59/2007之HA)，進一步強調所觀察之CR6261與CR9114之間的結合特異性。
總之，已建立四種新穎HA來源之本發明之多肽，該等多肽已展示含有在HA頭部域不存在之情況下由中和CR6261及CR9114抗體識別之抗原決定基。
實例21 ：本發明之多肽對抗小鼠中致命流感攻擊之保護
為了測定本發明之多肽是否能夠誘導保護小鼠在暴露於將致命之流感病毒後免於死亡之免疫反應，進行流感攻擊實驗。用編碼以下之表現載體肌肉內對小鼠進行免疫接種：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：6以及含有另一R343Q突變以移除裂解位點之來自A/Brisbane/59/2007的全長HA(SEQ ID NO：1)。包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。根據以下研究方案，使用50μg表現構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)進行免疫接種：
研究方案
第-1天 取血。
第0天 投與疫苗(肌肉內)。
第21天 投與疫苗(肌肉內)。
第28天 取血。
第42天 投與疫苗(肌肉內)。
第47天 取血。
第48天 量測體重、體溫、臨床分數及死亡率。
第49天 用致死劑量之流感病毒感染攻擊(經鼻)。
第49天 將剩餘接種物用於反滴定病毒。
第49天至第70天 每日量測體重、體溫、臨床分數及致死率。
臨床分數3之動物每日監測兩次。
臨床分數4或體溫為32℃之動物，無論何者在先，均立即自研究中移除。
第70天 處死所有小鼠。
第1組至第6組：用PR8(A/Puerto Rico8/34，H1N1)攻擊
第1組：SEQ ID NO：78
第2組：SEQ ID NO：161
第3組：SEQ ID NO：1 R343Q
第4組：SEQ ID NO：45
第5組：SEQ ID NO：6
第6組：空載體
每組10隻小鼠。總共60隻小鼠。BALB/c。
材料及方法： 病毒株及來源：
流感病毒株PR8(A/Puerto Rico8/34,H1N1)係源自Virapur(San Diego)。儲備溶液1×108空斑形成單位/毫升(pfu/ml)批號E2004B。
儲存條件：-75℃±10℃。冷凍器：-86℃ UCT冷凍器。Thermo Form.Fisher Scientific。
動物：
小鼠，BALB/c(無特定病原體；SPF)，雌性。在研究第O天6至8週大，約17公克至19公克。來源於Charles River Laboratories，且利用『耳朵識別法』來識別。使所有動物適應新環境，且在實驗開始之前維持11天。
DNA投與 接種物復原之方法
製備如上列之適當DNA調配物，等分試樣，且儲存在-20℃下。在注射即將開始之前，每構築體解凍一份等分試樣至室溫，抽取至注射器中且注射。在完成各輪免疫接種之所有注射之後，丟棄各等分試樣之剩餘部分。
劑量水準及投與方法
小鼠藉由腹膜內注射以每公斤體重9.75mg Xylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目錄號：763.02)及48.75mg Ketasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目錄號：668.51)麻醉。使用0.5ml注射器以G29針在各後腿之四頭肌中肌肉內(i.m.)注射50μl DNA溶液，得到每小鼠注射100μl總體積。在完成各輪免疫接種之所有注射之後，丟棄各等分試樣之剩餘部分。
病毒投與： 接種物復原之方法
將病毒材料儲存在-75℃±10℃下，且在投與之前除霜。一旦除霜，即針對A/PR/8/34攻擊，對應於5LD50/50μl在冷PBS(4℃)中稀釋材料。將經稀釋之病毒保存在冰上，直 至投與小鼠。
劑量水準及投與方法
動物藉由腹膜內注射以每公斤體重9.75mg Xylasol及48.75mg Ketasol麻醉，且使各動物藉由鼻內接受50μl病毒溶液。將未使用之材料送回實驗室以用於反滴定。
抽血及血清製備
在以上研究方案中指定之天數下，採集血液樣本(經由眼球後套管插入法中間取血：100μl至150μl，經由心臟穿刺末端取血：約300μl至500μl)。藉由在14000g下離心5分鐘自此血液中分離血清，且儲存在-20℃下直至在乾冰上裝運為止。
臨床評分
用評分系統在病毒攻擊之後對臨床體徵評分(1分為健康小鼠；2分為小鼠展示不適之體徵，包括輕微豎毛、步態略有改變及走動增多；3分為小鼠展示強烈豎毛、腹部收縮、步態改變、不活動階段、呼吸速率增加及時有囉音(râles)(吱吱(clicking)/沙沙(crackling)聲)之體徵；4分為小鼠之前一組特徵增強，但展示幾乎不活動且變得垂死；5分為死亡小鼠)。只要動物得到3分，即對其每日觀察兩次。由單個研究者進行評分，且具有部分由兩個分數表示之症狀的小鼠+/- 0.5分。
稱重
每日稱重所有動物，在第48天開始(授權號2216)。在研究結束之前在死亡之情況下(亦即自研究移除時)亦稱重動 物。體重以公克(g)形式記錄。
病毒反滴定
所投與之病毒劑量藉由滴定來自完成動物接種之後剩餘之接種物之8份複製樣品來測定。在病毒反滴定中，根據『Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease 19.11.7』中概述之方案使用TCID50量度。
結果：
研究在無技術難度之情況下進行且與所定義之研究方案一致。流感病毒株PR8(A/Puerto Rico8/34，H1N1)之接種物之反滴定產生以下TCID50：PR8(A/Puerto Rico8/34，H1N1)：3.2×104TCID50/ml。
圖24A展示此實驗之卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活曲線。用編碼本發明之多肽SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：161之DNA免疫接種分別引起經流感致死劑量感染之小鼠50%、40%及40%的存活率，指示用本發明之多肽免疫接種可實際上誘導保護性免疫反應。相比之下，用空載體對照免疫接種之動物均在病毒攻擊8天後死於感染。用編碼與攻擊病毒株同源之全長HA(SEQ ID NO：78)之DNA免疫接種充分保護所有動物(亦即100%存活率)免於致命攻擊，而用編碼自含有另一裂解位點突變(R343Q；編號參考SEQ ID NO：1)之異源病毒株A/Brisbane/59/2007獲得之全長HA(SEQ ID NO：1)的DNA免疫接種引起經感染之動物90%的存活率。
自存活曲線獲得之結果亦反映於展示於圖24B及圖24C中之各組的平均體重變化及臨床分數中值中。用本發明之多肽SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：161免疫接種之動物展示至多25%至30%之體重損失，但在感染後第9天後存活之動物展示體重增加。對於用SEQ ID NO：45免疫接種之動物，亦觀察到臨床分數自4下降至3。用編碼與攻擊病毒株同源之全長HA(SEQ ID NO：78)之DNA免疫接種的動物並不展示體重損失，而用編碼自含有另一裂解位點突變(R343Q；編號參考SEQ ID NO：1)之異源病毒株A/Brisbane/59/2007獲得之全長HA(SEQ ID NO：1)之DNA免疫接種的動物經歷體重損失及臨床症狀，但倖存者完全恢復。對於用空載體免疫接種之對照組，觀察到最高體重損失及臨床症狀，與此等動物無存活一致。
總之，本發明之多肽SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：78能夠在小鼠中誘導對抗用H1N1 A/Puerto Rico/8/1934致命攻擊之保護性反應。應注意本發明之多肽SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：45係自與攻擊病毒株異源之HA分子獲得，而SEQ ID NO：78係自同源流感病毒株獲得。因此，本發明之多肽可對抗同源及異源流感感染誘導保護。
實例22：選擇代表性H1N1 HA序列小組並基於此等序列設計本發明之多肽。
為了展示實例20中所述設計方法之廣泛可適用性，將該方法應用至選定HA0序列小組，該等HA0序列涵蓋H1N1病毒中可見之多數百分比天然序列變異。此實例中自已知人 類H1N1 HA序列池選擇代表性HA序列小組之目的為選擇具有最大代表性之最小數目病毒株。為了達成此目的，已定量流感病毒序列資料庫中存在之人類H1N1流感病毒之HA序列之間的所有差異，此等差異中之結構已經研究且已鑑別同源子群。已自其中每一組選擇最有代表性之序列來構成該小組。
程序中之第一步驟為定量所考慮之序列資料庫中每一對序列之間的差異。採用反向PAM250(rPAM250)矩陣(Xu，2004)定量各胺基酸位置處之差異。採用歐幾里德加成法(Euclidian addition)定量該成對序列之總差異。採用所有成對差異形成差異之對稱的n×n矩陣，其中n等於所考慮之病毒株數目。
採用主座標分析(PCA)建構該差異之矩陣(Higgins，1992)。PCA係依據維度降低。輸入矩陣視為n維空間中之分佈(其中n等於所考慮之病毒株數目)。隨後分析並建構變異性，以便利用最小維度來涵蓋最多(或所有)變異性。結果為m維座標系(其中m為涵蓋最多或所有變異性之維度數目)，其中最大變異在第一軸上且隨後遞減。所有考慮之序列均位於座標系內。在僅需要2維或3維之情況下，結果可分別完整繪製成2D或3D圖式，其中可觀測到病毒株之間的差異。在需要較多維度之情況下，3D圖亦可由前3個軸建構，但該圖式並不涵蓋所有變異性，因為一部分變異在第四維及較高維度中。
隨後，使用分級及k均值分群法，使m維空間中之序列 分群。組內平均聯繫用於獲得具有類似內部變異性之組，且避免較大比例之單個病毒株形成群集。在所有層面下進行分群，起始於1(所有病毒株在一個群集中)直至n(各病毒株自身即形成群集)。自各群集選擇最中心之病毒株作為最具代表性之病毒株。最中心病毒株組隨後形成該層面群集之代表性病毒株小組。對於各群集層面，藉由與各病毒株至座標系中心之平方距離之總和相比，計算各病毒株至其中心病毒株之平方距離之總和，來估算覆蓋率(或所解釋之變異之百分比)。隨後將達成之最低層面覆蓋率設置為代表小組之最小所需尺寸。
除Xu rPAM250矩陣以外，在兩個序列之一在特定位置上具有空隙(歸因於插入或缺失)時，針對差異分配較小值。權重因子亦包括於程序中，以顧及經過多年之分離株之數目上的較大差異。此變異視為部分發生真正的變異，部分受不同監督/知曉程度驅動。因此，權重因子設置為1除以特定年份中觀察數目之平方根。在構築m維空間時、在群集分析及選擇中心點期間及在估算所涵蓋之變異程度時顧及此權重因子。
在此實例中，使用經構築之序列，其由針對本發明之多肽編碼之HA之一部分組成。建立兩組不同的經構築之序列。在第一組中，顧及除以下以外之天然序列：信號序列(例如胺基酸1至18)、胺基酸53至320(HA頭部域)、跨膜序列(胺基酸530至C端胺基酸)(編號參考SEQ ID NO：1)或其他序列中此等位置之等效位置。在第二組中，亦不考慮位置 406、409、416、324、436、413(或等效位置)處之胺基酸，因為此等胺基酸根據實例20中所述之一般方法經修飾。此外，亦不在第二組中考慮位置419至433(等效位置)，反映基於GCN4之穩定化序列在如實例9中所述之本發明之多肽中的添加。
使用上述方法，自涵蓋75%序列變異之所選經構築之序列第1組選擇7個HA序列，且自涵蓋74%序列變異之經構築之序列第2組選擇8個HA序列。病毒株列於表10中。三種所選序列出現於兩個組中，因此剩餘13種唯一的HA序列。此等序列用於根據實例20中所述方法設計本發明之多肽。此外，如實例9中所述，在位置419至433(編號參考SEQ ID NO：1)之等效位置處引入穩定化GCN4序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO：84)。基於H1N1 A/Memphis/20/1978及H1N1 A/USSR/92/1977之HA序列設計的本發明多肽與基於A/Wisconsin/629-D01415/2009及H1N1 A/Sydney/DD3-55/2010之HA序列設計的本發明多肽一致。因此，設計總共10個唯一的本發明之多肽，且此等序列之比對展示於圖25中。
將含有編碼以下之DNA之表現載體用於轉染HEK293F細胞：本發明之多肽SEQ ID NO：164至SEQ ID NO：173、以及基於A/Brisbane/59/2007之HA序列之本發明多肽SEQ ID NO：45、及在表現載體pcDNA2004中具有另一裂解位點突變R343Q之相應全長HA SEQ ID NO：1，且如前所述藉由FACS分析細胞。除人類單株抗體CR6261、CR9114及 CR8020以外，實驗中亦包括已知中和A型流感H1及H2病毒株之小鼠單株抗體C179(Okuna等人，1993)。結果展示於圖26中。
本發明之所有多肽以及A/Brisbane/59/2007之全長序列均表現於細胞表面上，且由廣泛中和抗體CR6261、CR9114及C179而非CR8020識別。後者已知僅結合來自A型流感第2類群之HA。抗體CR6261、CR9114及C179之結合指示廣泛中和抗原決定基在本發明之多肽中較好地保留。考慮到涵蓋於此等序列中之序列變異，此結果明顯表明吾人設計方法之一般可適用性，該設計方法用於產生含有廣泛中和抗原決定基之本發明多肽。
實例23：本發明之多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)之表徵
如實例13中所述獲得本發明之經純化之多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)。為了證實CR6261及CR9114之構形抗原決定基之存在，藉由生物層干涉術(Octet Red384,Forte Bio)研究此等抗體與經純化之蛋白之結合。為此，在經抗生蛋白鏈菌素塗佈之感測器上固定經生物素標記之CR6261、CR9114及CR8020，首先使感測器暴露於本發明之經純化之多肽的溶液(250nM)以量測結合速率，且隨後暴露於洗液以量測解離速率。出於比較原因，用呈三聚體及單體形式之全長蛋白(SEQ ID NO 149)重複實驗。結果展示於圖27中。
在暴露於呈溶解狀態之此等蛋白之後，如由明確反應表 明，經固定之CR6261識別來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA之胞外域的單體及三聚體形式(圖27A)。由較小尺寸單體引起(至少部分)之作用與三聚體相比，針對三聚體蛋白觀察到之反應大於以相同序列針對單體觀察到之反應(約1.3nm相對於0.9nm)。CR6261對s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)之結合引起約0.25nm之最大反應。在暴露於洗液後，觀察到所有三種分析物之複合物的解離，其中對本發明之多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)觀察到之釋放最快，且對於來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA(SEQ ID NO 149)之胞外域的三聚體形式最慢。
與CR6261相似，經固定之CR9114亦識別來自H1N1 A/Brisbane/59/2007之全長HA之胞外域的三聚體及單體形式以及本發明之多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)。與CR6261相比，所有三種分析物之反應均較強(對於三聚體、單體全長HA(SEQ ID NO：149)及主幹域多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)分別為1.5nm、1.4nm及0.8nm)，且在使複合物暴露於洗滌緩衝液後，在所有三種情況下抗原釋放極少或不可偵測。對於CR8020，對任何分析物均未觀察到反應，與此抗體之流感第2類群主幹域特異性一致。
為了進一步表徵CR6261及CR9114對經純化之主幹域多肽之結合，進行滴定。為此，使含有經固定之CR6261之感測器暴露於濃度分別為500nM、250nM、125nM、63 nM、31nM、16nM及8nM之s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)溶液，且14000秒後記錄最終反應。繪製隨主幹域多肽濃度而變之反應，且進行對穩態1：1結合模型之擬合，得到對於CR6261/主幹域多肽複合物約190nM之解離常數Kd(圖28A)。類似地，使經固定之CR9114修飾之感測器暴露於濃度分別為80nM、40nM、20nM、10nM、5nM、2.5nM及1.3nM之s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)，且在10800秒之後記錄最終反應。擬合隨主幹域多肽濃度而變之最終反應，得到對於CR9114/主幹域多肽複合物5.4nM之Kd值(圖28B)。
總之，本發明之多肽s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)能夠結合廣泛中和單株抗體CR6261及CR9114，證實此主幹域多肽中存在相應中和抗原決定基。
實例24：本發明之多肽對抗小鼠中致命流感攻擊之保護
為了測定本發明之多肽是否能夠誘導保護小鼠在暴露於將致命之流感病毒後免於死亡之免疫反應，進行流感攻擊實驗。用編碼以下之表現載體肌肉內對小鼠進行免疫接種：H3全長A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)、HK68 H3m2-cl9+10+11(SEQ ID NO：124)及HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4 SEQ ID NO：130。根據以下研究方案，使用50μg表現構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)進行免疫接種：
研究方案
第-1天 取血。
第0天 投與疫苗(肌肉內)。
第21天 投與疫苗(肌肉內)。
第28天 取血。
第42天 投與疫苗(肌肉內)。
第47天 取血。
第48天 量測體重、體溫、臨床分數及死亡率。
第49天 用致死劑量之流感病毒感染攻擊(經鼻)。
第49天 將剩餘接種物用於反滴定病毒。
第49天至第70天 每日量測體重、體溫、臨床分數及致死率。
臨床分數3之動物每日監測兩次。
臨床分數4或體溫為32℃之動物，無論何者在先，均立即自研究中移除。
第70天 處死所有小鼠。
第7組至第10組：用HK68(A/Hong Kong/1/68，H3N2)攻擊
第7組：SEQ ID NO：121
第8組：SEQ ID NO：130
第9組：SEQ ID NO：124
第10組：空載體
每組10隻小鼠。總共40隻小鼠。BALB/c。
材料及方法： 病毒株及來源：
流感病毒株HK68(A/Hong Kong/1/68)由J.Katz教授(Center for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA,USA)提供，繼而由Virapur(San Diego)增殖。病毒已在小 鼠肺中繼代多次以增強在小鼠中之毒性。適用於此病毒之參考文獻為：Frace等人，Vaccine 1999；17：2237。儲備溶液3×108pfu/ml。批號F1109A。
儲存條件：-75℃±10℃。冷凍器：-86℃ UCT冷凍器。Thermo Form.Fisher Scientific。
動物：
小鼠，BALB/c(無特定病原體；SPF)，雌性。在研究第0天6至8週大，約17公克至19公克。來源於Charles River Laboratories，且利用『耳朵識別法』來識別。使所有動物適應新環境，且在實驗開始之前維持11天。
DNA投與 接種物復原之方法
製備如上列之適當DNA調配物，等分試樣，且儲存在-20℃下。在注射即將開始之前，每構築體解凍一份等分試樣至室溫，抽取至注射器中且注射。在完成各輪免疫接種之所有注射之後，丟棄各等分試樣之剩餘部分。
劑量水準及投與方法
小鼠藉由腹膜內注射以每公斤體重9.75mg Xylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目錄號：763.02)及48.75mg Ketasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com)；目錄號：668.51)麻醉。使用0.5ml注射器以G29針在各後腿之四頭肌中肌肉內(i.m.)注射50μl DNA溶液，得到每小鼠注射100μl總體積。在完成各輪免疫接種之所有注射之後，丟棄各等分試樣之剩餘部分。
病毒投與： 接種物復原之方法
將病毒材料儲存在-75℃±10℃下，且在投與之前除霜。一旦除霜，即針對A/HK/1/68攻擊，對應於10LD50/50μl在冷PBS(4℃)中稀釋材料。將經稀釋之病毒保存在冰上，直至投與小鼠。
劑量水準及投與方法
動物藉由腹膜內注射以每公斤體重9.75mg Xylasol及48.75mg Ketasol麻醉，且使各動物藉由鼻內接受50μl病毒溶液。將未使用之材料送回實驗室以用於反滴定。
抽血及血清製備
在以上研究方案中指定之天數下，採集血液樣本(經由眼球後套管插入法中間取血：100μl至150μl，經由心臟穿刺末端取血：約300μl至500μl)。藉由在14000g下離心5分鐘自此血液中分離血清，且儲存在-20℃下直至在乾冰上裝運為止。
臨床評分
用評分系統在病毒攻擊之後對臨床體徵評分(1分為健康小鼠；2分為小鼠展示不適之體徵，包括輕微豎毛、步態略有改變及走動增多；3分為小鼠展示強烈豎毛、腹部收縮、步態改變、不活動階段、呼吸速率增加及時有囉音(吱吱/沙沙聲)之體徵；4分為小鼠之前一組特徵增強，但展示幾乎不活動且變得垂死；5分為死亡小鼠)。只要動物得到3分，即對其每日觀察兩次。由單個研究者進行評 分，且具有部分由兩個分數表示之症狀的小鼠+/- 0.5分。
稱重
每日稱重所有動物，在第48天開始(授權號2216)。在研究結束之前在死亡之情況下(亦即自研究移除時)亦稱重動物。體重以公克(g)形式記錄。
病毒反滴定
所投與之病毒劑量藉由滴定來自完成動物接種之後剩餘之接種物之8份複製樣品來測定。在病毒反滴定中，根據『Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease 19.11.7』中概述之方案使用TCID50量度。
結果：
研究在無技術難度之情況下進行且與所定義之研究方案一致。流感病毒株HK68(A/Hong Kong/1/68，H3N2)之接種物之反滴定產生以下TCID50：HK68(A/Hong Kong/1/68)：1×103TCID50/ml。
圖29展示如由ELISA測定之在第49天時針對來自A/Hong Kong/1/1968之HA之胞外域的IgG反應。用編碼本發明之多肽SEQ ID NO：124及SEQ ID NO：130之DNA免疫接種誘導針對H3 HA HK68胞外域之明顯可偵測反應，而對於空載體陰性對照未偵測到反應。正如所料，對用H3全長A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO：121)免疫接種觀察到最高反應。
圖30A展示此實驗之卡本-麥爾存活曲線。用編碼本發明 之多肽SEQ ID NO：124及SEQ ID NO：130之DNA免疫接種分別引起經流感致死劑量感染之小鼠40%及20%的存活率，指示用本發明之多肽免疫接種可實際上誘導保護性免疫反應。相比之下，用空載體對照免疫接種之動物均在病毒攻擊10天後死於感染。用編碼全長HA(SEQ ID NO：121)之DNA免疫接種充分保護所有動物(亦即100%存活率)免於致命攻擊。
自存活曲線獲得之結果亦反映於展示於圖30B及圖30C中之各組的平均體重變化及臨床分數中值中。用編碼本發明之多肽SEQ ID NO：124及SEQ ID NO：130之DNA免疫接種之動物展示至多20%的體重損失，但在感染後第9天後存活之動物展示體重增加。用編碼全長HA(SEQ ID NO：121)之DNA免疫接種之動物並不展示體重損失。對於用空載體免疫接種之對照組，觀察到最高體重損失及臨床症狀，與此等動物無存活一致。
總之，本發明之多肽SEQ ID NO：124及SEQ ID NO：130為免疫原性的且能夠在小鼠中誘導對抗用H3N2 A/Hong Kong/1/1968致命攻擊之保護性反應。
實例25：基於H3 HA之主幹域多肽之設計及表徵
為了進一步改良實例12中所述之主幹域多肽，設計另一組構築體。設計將允許在位置53及334(T53C、G334C；群集16)及位置39及51(G39C、E51C；群集17)(編號參考SEQ ID NO：121)處形成穩定化二硫橋連基之另外兩組半胱胺酸突變。此外，將兩個序列插入於位置420至421之間(亦即 在較長CD螺旋之N端側處)(參見圖1)。插入序列已經設計使得其將促進三聚體分子中個別單體之間的單體間二硫橋連基之形成。已設計兩種不同序列，亦即NATGGCCGG(群集18)及GSGKCCGG(群集19)。群集18之序列亦包含在主幹域多肽中引入糖基化位點之序列(亦即NAT)。在一些情況下，糖基化位點亦藉由突變成NAT在位置417至419處引入。
使用來自A/Hong Kong/1/1968之全長HA之序列作為起點，使上述修飾與S62至P322缺失組合以得到以下主幹域多肽：
SEQ ID NO：174：H3 HK微型2a-連接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1
SEQ ID NO：175：HK68 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+18+GCN4T
SEQ ID NO：176：HK68 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+16+CG7-GCN4T
SEQ ID NO：177：HK68 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+19+GCN4T
SEQ ID NO：178：HK68 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T
SEQ ID NO：179：H3 HK68微型2a-連接子2+cl9_+10+12+GCN4T
合成編碼上述蛋白質序列之基因，且使用熟習此項技術者一般已知之方法選殖至表現載體pcDNA2004中。藉由如 上所述之螢光結合細胞分選分析細胞表面上之表現及單株抗體之結合。出於比較原因，實驗中亦包括另外在裂解位點中含有R345Q突變之H3N2 A/Hong Kong/1/1968之全長HA(SEQ ID NO：121)、及SEQ ID NO：130(HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4)以及陰性對照cM2。
圖31展示此實驗之結果。如由對多株抗H3血清觀察到之反應(MFI，圖A；陽性細胞百分比，圖B)表明，所有構築體均表現於細胞表面上。觀察到CR8043及CR8020對SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：121及SEQ ID NO：130之結合，指示群集16之突變並不有助於使此等抗體之構形抗原決定基穩定。針對單抗CR9114，僅可觀察到對SEQ ID NO：174：H3 HK微型2a-連接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-1及在較小程度上SEQ ID NO：177：HK68 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T之在背景以上之結合。兩種序列均在B環中含有另一糖基化位點，指示此修飾對CR9114之構形中和抗原決定基之穩定作用。
總之，吾人已展示根據上述方法，可針對第2類群之血清型、尤其H3亞型獲得本發明之主幹域多肽。藉由在B環中引入糖基化位點，可達成此等主幹域多肽之進一步穩定。本發明亦涵蓋此等序列。
實例26：基於H3 HA之HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載 體對小鼠進行免疫接種：來自A/Wisconsin/67/2005之全長H3(SEQ ID NO：89)；SEQ ID NO：105：H3-微型2；SEQ ID NO：108：H3-微型2-cl9+10+11；SEQ ID NO：112：H3-微型2-cl9+10+12；SEQ ID NO：111：H3-微型2-cl9+10+11+12；SEQ ID NO：114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚體；SEQ ID NO：113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4；SEQ ID NO：119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14；SEQ ID NO：120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用50μg構築體+50μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。使用約10μg構築體+約2μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫接種流程，藉由基因槍投與陰性對照質體cM2。使用來自A/Wisconsin/67/2005及A/Hong Kong/1/1968之重組全長HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA獲得)作為抗原，藉由ELISA分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之50倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗體。將效價與由結合至HA抗原之小鼠單株抗體之連續稀釋液組成之標準曲線比較，且表示為ELISA單位/ 毫升(EU/ml)。49天後使用來自A/Wisconsin/67/2005、A/Hong Kong/1/1968及A/Perth/16/2009之HA之ELISA結果分別展示於圖32A、圖32B及圖32C中。自用包括於此實驗中之編碼主幹域多肽之DNA免疫接種之小鼠獲得的血清能夠識別來自A/Wisconsin/67/2005之同源全長HA，且其程度與來自A/Hong Kong/1/1968之異源全長HA程度類似。相比之下，與來自A/Hong Kong/1/1968及A/Perth/16/2009之異源HA相比，自用來自A/Wisconsin/67/2005之全長HA(SEQ ID NO：89)免疫接種之小鼠獲得的血清展示對同源HA之較高反應。
總之，資料展示自H3 HA獲得之本發明之多肽能夠誘導針對全長HA之免疫反應。
實例27：基於A/Hong Kong/1/1968之H3 HA之HA主幹域多肽之免疫原性
為了評估主幹域多肽之免疫原性，用編碼以下之表現載體對小鼠進行免疫接種：來自A/Hong Kong/1/1968之全長H3(SEQ ID NO：121)；SEQ ID NO：124：HK68 H3m2-cl9+10+11；SEQ ID NO：125：HK68 H3m2-cl9+10+12；SEQ ID NO：126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12；SEQ ID NO：128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚體；SEQ ID NO：130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4。亦包括編碼cM2之表現載體作為陰性對照。
在第1天、第21天及第42天用100μg構築體+100μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)對4隻小鼠(BALB\c)之群組進行肌肉內 免疫接種。在第49天，進行最終取血且收集血清。使用約10μg構築體+約2μg佐劑(pUMCV1-GM-CSF)及相同免疫接種流程，藉由基因槍投與陰性對照質體cM2。使用來自A/Hong Kong/1/1968之重組全長HA(自Protein Sciences Corporation,Meriden,CT,USA獲得)作為抗原，藉由ELISA分析血清。簡言之，在4℃下用50ng HA塗佈96孔盤隔夜，隨後在室溫下與阻斷緩衝液(100μl PBS(pH 7.4)+2%脫脂牛奶)一起培育1小時。用PBS+0.05% Tween-20洗滌盤，且自血清之50倍稀釋液開始添加100μl在阻斷緩衝液中之2倍稀釋系列。使用HRP結合之山羊抗小鼠IgG，使用此項技術中公認之標準方案偵測結合之抗體。將效價與由結合至HA抗原之小鼠單株抗體之連續稀釋液組成之標準曲線比較，且表示為ELISA單位/毫升(EU/ml)。
49天後使用來自A/Hong Kong/1/1968之HA之ELISA之結果展示於圖33中。用包括於此實驗中之編碼主幹域多肽之DNA免疫接種之小鼠獲得的血清能夠識別來自A/Hong Kong/1/1968之同源全長HA。正如所料，用編碼全長HA之DNA免疫接種對同源HA蛋白引起較高抗體效價，而用編碼cM2之陰性對照表現載體免疫接種並不誘導識別A/Hong Kong/1/1968之全長HA的抗體。
總之，資料展示自H3 HA獲得之本發明之多肽能夠誘導針對全長H3 HA之免疫反應。
實例28 ：基於能夠誘生中和第1類群及第2類群流感病毒之 抗體之H1 HA設計另一主幹域多肽
實例4及6揭示基於H1序列之多肽，其穩定暴露廣泛中和CR6261抗體之抗原決定基。鑒於CR6261專門中和來自系統發育第1類群之流感病毒，為此抗原決定基設計之多肽可能不誘生對系統發育第2類群流感病毒之強烈反應。設計誘生該等廣泛交叉中和抗體之本發明多肽之另一方式為：使用在抗原決定基中重要胺基酸之結構及生物化學特徵方面較緊密類似於H3 HA序列之H1 HA序列變異體。基於類群特異性抗體及分子(CR6261、F10及HB36)與結晶之泛流感抗體FI6之結構之間的比較(Corti等人，2011)，吾人發現第1類群-第2類群T49N(HA2)突變僅可在不引入空間碰撞之情況下由FI6提供。HA2之位置49處之天冬醯胺存在於NCBI流感資料庫中之兩種第1類群病毒中：A/豬/Hubei/S1/2009(ACY06623)及A/豬/Haseluenne/IDT2617/2003(ABV60697)。因此，在一個實施例中，構成如實例4、6及9中揭示之本發明之基礎的H1序列為此等含有N49之HA序列之一。或者，如實例4、6及9中所述之本發明之序列在HA2中之位置49處具有另一突變以使T變成N胺基酸。表7展示可用作本發明之多肽之起始序列之例示性H1HA序列的序列比對。
SEQ ID NO：180藉由突變T392N(編號參考SEQ ID NO：1)自SEQ ID NO：45獲得，SEQ ID NO：1中之T392對應於如上所述HA2中位置49處之蘇胺酸。合成編碼本發明之此多肽之基因，且使用熟習此項技術者所熟知之方法選殖至表現 載體pcDNA2004中。CR9114及CR6261之中和抗原決定基之存在由如上所述之螢光結合細胞分選證實。結果展示於圖34中。SEQ ID NO：180之MFI與針對CR6261及CR9114結合對SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：1觀察到之MFI相當，而CR9020(已知結合至全長HA分子之頭部區)僅識別SEQ ID NO：1，且CR8020(對A型流感第2類群HA具有特異性)並不識別SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：45。陰性對照cM2不由此實驗中所用之任何單株抗體識別。
總之，含有突變T392N之SEQ ID NO：180包含CR6261及CR9114之中和抗原決定基。
實例29：設計缺乏跨膜序列之本發明之另一多肽
呈天然形式之流感HA以三聚體形式存在於細胞或病毒膜上。在某些實施例中，移除細胞內及跨膜序列以便在表現於細胞中之後製造分泌型(可溶性)多肽。表現及純化HA之分泌型胞外域之方法已經描述(參見例如Dopheide等人2009；Ekiert等人2009；Ekiert等人2011；Stevens等人2004；Stevens等人2006；Wilson等人1981)。熟習此項技術者將理解此等方法亦可直接應用於本發明之主幹域多肽以便達成分泌型(可溶性)多肽之表現。因此，此等多肽亦涵蓋於本發明中。
舉例而言，在自第1類群流感病毒之HA序列獲得之本發明多肽之情況下，本發明之可溶性多肽可藉由使殘基514至C端(等效位置)(編號根據SEQ ID NO：1)之多肽序列缺失來建立。或者，可使其他殘基包括於本發明之多肽中，例 如藉由使自殘基515、516、517、518、519、520、521或522之序列缺失。出於純化目的，視情況可添加his標記序列(HHHHHH或HHHHHHH)，視情況經由連接子連接。連接子視情況可含有蛋白水解裂解位點以在純化後移除his標記。可藉由引入已知形成三聚體結構之序列(諸如摺疊子序列)來使可溶性多肽進一步穩定。如上所述獲得之多肽亦涵蓋於本發明中。
SEQ ID NO：181至SEQ ID NO：185展示自H1N1 A/Brisbane/59/2007之HA序列獲得之本發明之可溶性多肽之序列。類似地，SEQ ID NO：186至SEQ ID NO：187展示H3N2 A/Hong Kong/1/1968之HA序列之本發明可溶性多肽的序列。熟習此項技術者將理解可設計自例如H1、H3、H5亞型之其他A型流感疫苗病毒株之其他HA序列獲得之本發明多肽的等效序列。熟習此項技術者亦將清楚C端6個組胺酸出於純化目的連接。由於存在不使用此標記之其他純化方法，故視情況選用6組胺酸序列，本發明中亦涵蓋缺乏此純化標記之序列。
參考文獻
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序列
SEQ ID NO 1：H1全長(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 2：微型HA(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 3：微型HA群集1(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 4：微型HA群集1+2(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 5：微型HA群集1+3(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 6：微型HA群集1+4(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 7：微型HA群集1+2+3(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 8：微型HA群集1+2+3+4(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 9：微型1群集11(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 10：微型2群集11(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 11：微型3群集11(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 12：微型4群集11(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 13：微型1群集11+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 14：微型2群集11+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 15：微型3群集11+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 16：微型4群集11+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 17：H1共同序列殘基402至418(編號根據SEQ ID NO：1)402 MNTQFTAVG KEFN(H/K)LE(K/R) 418
>SC09-114 VH蛋白(SEQ ID NO：18)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>SC09-114 VL蛋白(SEQ ID NO：19)SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
>CR6261 VH蛋白(SEQ ID NO：20)
>CR6261 VL蛋白(SEQ ID NO：21)
>SC08-057 VH蛋白(SEQ ID NO：22)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYADSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV
>SC08-057 VL蛋白(SEQ ID NO：23)QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGVSDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI
SEQ ID NO：24(STEEL)
SEQ ID NO：31：H7全長(A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000)
SEQ ID NO：32：H7共同序列殘基394至414(編號根據SEQ ID NO：31) 394 LI(E/D/G)KTNQQFELIDNEF(N/T/S)E(I/V)E(Q/K)414
SEQ ID NO：33：H7-微型2(A/綠頭鴨/Netherlands/12/2000)
SEQ ID NO：34：H7-微型2-群集15
SEQ ID NO：35：H7-微型2-群集15+16
SEQ ID NO：36：H7-微型2-群集17
SEQ ID NO：37：H7-微型2-群集15+16+17
SEQ ID NO：38：H7-微型2-群集15+16+17+18
SEQ ID NO：39：H7-微型2-群集15+16+17+三聚體
SEQ ID NO：40：H7-微型5
SEQ ID NO：41：H7-微型5-群集15+16
SEQ ID NO：42：H7-微型5-群集17
SEQ ID NO：43：H7-微型5-群集15+16+17+18
SEQ ID NO：44：H1-微型2-群集1+5+6-三聚體
SEQ ID NO：45：H1-微型2-群集1+5+6-GCN4
SEQ ID NO：46：微型2-群集1+5+6(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：47：微型2-群集11+5+6(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：48：微型2-群集1+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：49：H1-微型2-群集1+5+6-三聚體2
SEQ ID NO：50：H1-微型2-群集1+5+6-三聚體3
SEQ ID NO：51：H1-微型2-群集1+5+6-GCN4t2
SEQ ID NO：52：H1-微型2-群集1+5+6-GCN4t3
SEQ ID NO：53：H1-微型2-群集1+5+6-Ile三聚體
SEQ ID NO：89：H3全長A/Wisconsin/67/2005
SEQ ID NO：90：微型H3
SEQ ID NO：91：微型H3群集1
SEQ ID NO：92：微型H3群集1+2
SEQ ID NO：93：微型H3群集1+3
SEQ ID NO：94：微型H3群集1+4
SEQ ID NO：95：微型H3群集1+5 N60A
SEQ ID NO：96：微型H3群集1+5 N60D
SEQ ID NO：97：微型H3群集1+5 N60E
SEQ ID NO：98：微型H3群集1+6
SEQ ID NO：99：微型H3群集1+7
SEQ ID NO：100：微型H3群集1+2+3+4+5+6+7-N405E
SEQ ID NO：101：微型H3群集1+2+3+4+5+6+7-N405A
SEQ ID NO：102：微型H3群集1+2+3+4+5+6+7-N405D
SEQ ID NO：103：微型H3群集1+8
SEQ ID NO：104：H3共同序列殘基401至421(編號根據SEQ ID No：1) 401 I(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR 421
SEQ ID NO：105：H3-微型2
SEQ ID NO：106：H3-微型2-cl9+10
SEQ ID NO：107：H3-微型2-cl9+11
SEQ ID NO：108：H3-微型2-cl9+10+11
SEQ ID NO：109：H3-微型2-cl9+10+11-三聚體
SEQ ID NO：110：H3-微型2-cl9+10+11-GCN4
SEQ ID NO：111：H3-微型2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO：112：H3-微型2-cl9+10+12
SEQ ID NO：113：H3-微型2-cl9+10+11+12-GCN4
SEQ ID NO：114：H3-微型2-cl9+10+11+12-三聚體
SEQ ID NO：115：H3-微型2-cl9+13
SEQ ID NO：116：H3-微型2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO：117：H3-微型2-cl9+10+11+13-GCN4
SEQ ID NO：118：H3-微型2-cl9+10+11+13-三聚體
SEQ ID NO：119：H3-微型3-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO：120：H3-微型4-cl9+10+11+12+14
SEQ ID NO：121：H3全長A/Hong Kong/1/1968
SEQ ID NO：122：HK68 H3m2-cl9
SEQ ID NO：123：HK68 H3m2-cl9+10
SEQ ID NO：124：HK68 H3m2-cl9+10+11
SEQ ID NO：125：HK68 H3m2-cl9+10+12
SEQ ID NO：126：HK68 H3m2-cl9+10+11+12
SEQ ID NO：127：HK68 H3m2-cl9+10+11+13
SEQ ID NO：128：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-三聚體
SEQ ID NO：129：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-三聚體
SEQ ID NO：130：HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4
SEQ ID NO：131：HK68 H3m2-cl9+10+11+13-GCN4
SEQ ID NO：132：B/Florida/4/2006全長HA
SEQ ID NO：133：FL4-06 B-m2
SEQ ID NO：134：FL4-06 B-m2-CL1+5
SEQ ID NO：135：FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4a
SEQ ID NO：136：FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4b
SEQ ID NO：137：B/Malaysia/2506/2004全長HA
SEQ ID NO：138：Mal2506-04 B-m2
SEQ ID NO：139：Mal2506-04 B-m2-CL1+5
SEQ ID NO：140：Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4a
SEQ ID NO：141：Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4b
SEQ ID NO：142：B型流感HA共同序列殘基416至436 416 LSELEVKNLQRLSGAMDELHN 436
SEQ ID NO：144：s-H1-微型2-群集1+5+6-三聚體(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：145：s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：146：s-H1-微型2-群集1+5+6(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：147：s-H1-微型2-群集11+5+6(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：148：s-H1-微型2-群集1+5(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO 149：s-H1全長R343Q(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：150：s-H1-微型2-群集1+5+6-nl(A/Brisbane/59/2007
SEQ ID NO：151：s-H1-微型2-群集1+5+6-nl2(A/Brisbane/59/2007)
SEQ ID NO：152 H1微型2a-cl1+5+6_無_連接子(HNGK)
SEQ ID NO：153 H1微型2a-cl1+5+6_無_連接子2s
SEQ ID NO：154 H1-微型2-cl1+5+6-無_連接子2s-GCN4
SEQ ID NO：155 H1微型2a-cl1+5+6_無_連接子2s-三聚體3
SEQ ID NO：156 H1微型2a-cl1+5+6-12
SEQ ID NO：157 H1微型2a-cl1+5+6-12+13
SEQ ID NO：158：H5 FL HA A/Vietnam/1203/2004(使341 RRRKK 345缺失且引入R346Q突變)
SEQ ID NO：159：H1 FL HA A/California/04/2009 R343Q
SEQ ID NO：160：H1微型HAA/California/07/2009
SEQ ID NO：161：H1微型HAA/PuertoRico/8/1934
SEQ ID NO：162：H1微型HAA/Texas/36/1991
SEQ ID NO：163：H5微型HAA/Vietnam/1203/2004
SEQ ID NO：164：mHA_H1N1_A_Maryland_12_1991
SEQ ID NO：165：mHA_H1N1_A_Henry_1936
SEQ ID NO：166：mHA_H1N1 A/AA/Marton/1943
SEQ_ID_NO：_167：_mHA_H1N1_A_New_York_607_1995
SEQ_ID_NO：_168：mHA_H1N1_A_New_Jersey_11_2007
SEQ_ID_NO：_169：mHA_H1N1_A_USSR_92_1977
SEQ_ID_NO：_170：mHA_H1N1_A_New_York_629_1995
SEQ_ID_NO：_171：mHA_H1N1_A_Virginia_UR06-0549_2007
SEQ_ID_NO：_172：_mHA_H1N1_A_Texas_UR0-0526_2007
SEQ_ID_NO：_173：_mHA_H1N1_A_Sydney_DD3-55_2010
SEQ_ID_NO：_174 H3微型2a-連接子+cl9_+10+11+12+GCN4T_CG7-1(A/HongKong/1/1968(H3N2)
SEQ_ID_NO：_175 H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+18+GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))
SEQ_ID_NO：_176H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+16+CG7-GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO：_177H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+19+GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO：_178H3微型2a-連接子+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))]
SEQ_ID_NO：_179 H3_HK68_微型2a-連接子2+cl9_+10+12+GCN4T
SEQ_ID_NO：_180 H1-微型2-群集1+5+6+GCN4-T49N
SEQ ID NO：181 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4-鳳梨酵素
SEQ ID NO：182 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4-鳳梨酵素-摺疊子
SEQ ID NO：183 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2
SEQ ID NO：184 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2-鳳梨酵素
SEQ ID NO：185 sH1-微型2-cl1+5+6-GCN4t2-鳳梨酵素-摺疊子
SEQ ID NO：186 sH3 HK微型2a-連接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-His
SEQ ID NO：187 sH3 HK微型2a-連接子+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-摺疊子-His
圖1：展示如存在於天然三聚體中之呈融合前狀態之HA單體的模型。HA 1以淺灰色展示，HA2以深灰色展示。如同連接此等二級結構元件之環一般，指示螺旋A(CR6261 之抗原決定基之重要部分)及螺旋CD(三聚體界面之一部分)。
圖2：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及本發明之HA主幹域多肽之結合。A：染色後陽性之細胞百分比。B：平均螢光強度。H1-全長(SEQ ID NO：1)、微型HA-cl1(SEQ ID NO：3)、微型HA-cl1+2(SEQ ID NO：4)、微型HA-cl1+3(SEQ ID NO：5)、微型HA-cl1+4(SEQ ID NO：6)、微型HA-cl1+2+3(SEQ ID NO：7)、微型HA-cl1+2+3+4(SEQ ID NO：8)。
圖3：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及HA主幹域多肽之結合。A：染色後陽性之細胞百分比。B：平均螢光強度。H1-全長(SEQ ID NO：1)、微型HA(SEQ ID NO：2)、微型HA-cl1(SEQ ID NO：3)。
圖4：血清抗體對HEK293F表現之全長HA及本發明之多肽的結合。A：平均螢光強度。B：染色後陽性之細胞百分比。H1-FL(SEQ ID NO：1)、CL1(SEQ ID NO：3)、CL1+2(SEQ ID NO：4)及CL1+4(SEQ ID NO：6)。cM2為陰性對照。
圖5：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及HA主幹域多肽之結合。上圖染色後陽性之細胞百分比。下圖：平均螢光強度。H1-全長(SEQ ID NO：1)、微型HA-cl1(SEQ ID NO：3)、H1-微型1-cl11(SEQ ID NO：9)、H1-微型2-cl11(SEQ ID NO：10)、H1-微型3-cl11(SEQ ID NO：11)、H1-微型4-cl11(SEQ ID NO：12)、H1-微型1-cl11+5(SEQ ID NO：13)、H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO：14)、H1微型3-cl11+5(SEQ ID NO：15)及H1-微型4-cl11+5(SEQ ID NO：16)。
圖6：在經編碼HA A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)、微型HA-群集1(SEQ ID NO：3)、微型2-群集11(SEQ ID NO：10)、微型1-群集11+5(SEQ ID NO：13)、微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)及cM2(共同M2序列)之DNA肌肉內免疫接種或編碼HA A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)、微型2-群集11+5(SEQ ID NO：14)及cM2(共同M2序列)之DNA的基因槍免疫接種之後，血清抗體對來自A/Brisbane 59/2007之全長HA之胞外域的結合。圖A：首次免疫接種後28天。圖B：免疫接種49天後。
圖7：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及HA主幹域多肽之結合。上圖染色後陽性之細胞百分比。下圖：平均螢光強度。H1-全長(SEQ ID NO：1)、微型HA(SEQ ID NO：2)、H1-微型2-cl11+5(SEQ ID NO：14)、H1-微型2-cl1+5(SEQ ID NO：48)、H1-微型2-cl1+5+6(SEQ ID NO：46)、H1-微型2-cl11+5+6(SEQ ID NO：47)、H1-微型2-cl1+5+6-三聚體(SEQ ID NO：44)、H1-微型2-cl1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：45)。
圖8：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及HA主幹域多肽之結合。A：染色後陽性之細胞百分比。B：平均螢光強度。
圖9：如由FACS分析之單株抗體對全長HA及HA主幹域 多肽之結合。A：染色後陽性之細胞百分比。B：平均螢光強度。
圖10 A及B：基於Hong Kong/1/1968之構築體在細胞表面上之表現。
圖11：本發明之若干多肽之純化的SDS-PAGE(A至D)及西方墨點(E至F)分析。在西方墨點中，將針對his標記之抗體用於偵測。
圖12：如由Elisa偵測之單株抗體CR9114(A)、CR8020(B)及多株抗H1 HA血清(C)對本發明之若干多肽之結合。
圖13：本發明之多肽之糖基化的SDS-PAGE(A)及西方墨點(B)分析。在去糖基化之後，擴散條帶集中在預期分子量下。在西方墨點中，將針對H1 HA之多株血清用於偵測。
圖14：本發明之多肽之SEC-MALS分析。跡線以SEQ ID NO標記。
圖15：a：表現SEQ ID NO：145之細胞之上清液的西方墨點分析。在西方墨點中，將針對his標記之抗體用於偵測。b：如由Elisa偵測之單株抗體CR9114(正方形)、CR6261(圓圈)、CR8020(向上三角形)及FI6v3(向下三角形)對SEQ ID NO：145之結合。
圖16：來自培養物上清液之SEQ ID NO：145在His截留管柱上之純化的溶離概況。本發明之多肽分別在100mM(A峰)及200mM(B峰)咪唑下溶離。
圖17：A至B：SEQ ID NO：145藉由尺寸排阻層析 (Superdex 200)純化之溶離概況。A峰及B峰均含有本發明之多肽。C：來自尺寸排阻層析之溶離份之非變性PAGE分析。大部分經純化之蛋白在與該蛋白之單體形式一致之分子量下運作。D：來自尺寸排阻層析之溶離份之SDS PAGE分析。
圖18：作為本申請案中所述之DNA免疫接種程序結果之對同源全長蛋白胞外域之IgG反應的時程。
圖19：針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(A)及異源病毒株H1N1 A/California/07/2009(B)之全長血球凝集素之胞外域，對個別小鼠進行首次免疫接種後第7週時的IgG反應。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖20：針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(A)、異源病毒株H1N1 A/California/07/2009(B)、異源亞型病毒株H5N1 A/Vietnam/1203/2004(C)及異源亞型病毒株H3N2 A/Hong Kong/1/1968(D)之全長血球凝集素之胞外域，對個別小鼠進行首次免疫接種後第7週時的IgG反應。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖21：基於H3 HA之主幹域多肽之FACS分析。展示平均螢光強度(A)及陽性細胞%(B)。
圖22：針對來自同源病毒株H1N1 A/Brisbane/59/2007(圖A)、異源病毒株H1N1 A/California/07/2009(圖B)及異源亞型病毒株H5N1 A/Vietnam/1203/2004(圖C)之全長血球凝集素，對個別小鼠進行首次免疫接種後第7週時的 IgG反應。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖23：單抗CR6261、CR9114、CR8020及CR9020以及多株抗H1血清對全長HA及本發明之相應多肽之FACS分析。上圖平均螢光強度。實心條表示全長蛋白，條紋條表示本發明之多肽。全長HA及來源於該序列之本發明之相應多肽具有相同的背景色。
圖24：實例21中所述之流感攻擊實驗之卡本-麥爾存活曲線(A)、體重變化(B)及臨床分數中值(C)。
圖25：根據實例22選擇之H1N1序列之比對。
圖26：根據實例22選擇之基於H1 HA之主幹域多肽之FACS分析。展示平均螢光強度。
圖27：如由生物層干涉術測定，呈三聚體及單體形式之全長H1 HA(SEQ ID NO 149)及s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)對經固定之單株抗體CR6261(A)、CR9114(B)及CR8020(C)之結合的動力學。
圖28：穩態滴定s-H1-微型2-群集1+5+6-GCN4(SEQ ID NO：145)對經固定之CR6261(A)及CR9114(B)之結合，繼而進行生物層干涉術。
圖29：如由ELISA測定，在第49天時針對來自A/Hong Kong/1/1968之HA之胞外域的IgG反應。實驗詳情描述於實例24中。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖30：實例24中描述之流感攻擊實驗之卡本-麥爾存活曲線(A)、體重變化(B)及臨床分數中值(C)。
圖31：根據實例25選擇之基於H1 HA之主幹域多肽之 FACS分析。展示平均螢光強度。
圖32：如由來自A/Wisconsin/67/2005(A)、A/Hong Kong/1/1968(B)及A/Perth/16/2009(C)之HA測定，49天後針對HA之胞外域之IgG反應。實驗詳情描述於實例26中。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖33：如由ELISA測定，在49天後針對來自A/Hong Kong/1/1968之HA之胞外域的IgG反應。實驗詳情描述於實例27中。空心符號對應於在分析偵測限以下的值。
圖34：根據實例28選擇之基於H1 HA之主幹域多肽之FACS分析。展示平均螢光強度。
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<223> CR6261 VL region
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<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+2
<400> 92
<210> 93
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+3
<400> 93
<210> 94
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+4
<400> 94
<210> 95
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+5 N60A
<400> 95
<210> 96
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+5 N60D
<400> 96
<210> 97
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+5 N60E
<400> 97
<210> 98
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+6
<400> 98
<210> 99
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+7
<400> 99
<210> 100
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+2+3+4+5+6+7-N405E
<400> 100
<210> 101
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+2+3+4+5+6+7-N405A
<400> 101
<210> 102
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+2+3+4+5+6+7-N405D
<400> 102
<210> 103
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mini-H3 clusterl+8
<400> 103
<210> 104
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3 consensus sequence residue 401-421
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 104
<210> 105
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2
<400> 105
<210> 106
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10
<400> 106
<210> 107
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+11
<400> 107
<210> 108
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11
<400> 108
<210> 109
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11-tri
<400> 109
<210> 110
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11-GCN4
<400> 110
<210> 111
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+12
<400> 111
<210> 112
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+12
<400> 112
<210> 113
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+12-GCN4
<400> 113
<210> 114
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+12-tri
<400> 114
<210> 115
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+13
<400> 115
<210> 116
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+13
<400> 116
<210> 117
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+13-GCN4
<400> 117
<210> 118
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini2-cl9+10+11+13-tri
<400> 118
<210> 119
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini3-cl9+10+11+12+14
<400> 119
<210> 120
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3-mini4-cl9+10+11+12+14
<400> 120
<210> 121
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3 Full length A/Hong Kong/1/1968
<400> 121
<210> 122
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9
<400> 122
<210> 123
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10
<400> 123
<210> 124
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11
<400> 124
<210> 125
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+12
<400> 125
<210> 126
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+12
<400> 126
<210> 127
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+13
<400> 127
<210> 128
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+12-tri
<400> 128
<210> 129
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+13-tri
<400> 129
<210> 130
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+12-GCN4
<400> 130
<210> 131
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> HK68 H3m2-cl9+10+11+13-GCN4
<400> 131
<210> 132
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> B/Florida/4/2006 Full length HA
<400> 132
<210> 133
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> FL4-06 B-m2
<400> 133
<210> 134
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> FL4-06 B-m2-CL1+5
<400> 134
<210> 135
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4a
<400> 135
<210> 136
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> FL4-06 B-m2-CL1+5-GCN4b
<400> 136
<210> 137
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> B/Malaysia/2506/2004 Full length HA
<400> 137
<210> 138
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> Mal2506-04 B-m2
<400> 138
<210> 139
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> Mal2506-04 B-m2-CL1+5
<400> 139
<210> 140
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4a
<400> 140
<210> 141
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> Mal2506-04 B-m2-CL1+5-GCN4b
<400> 141
<210> 142
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> Influenza B HA consensus sequence residue 416-436
<400> 142
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> foldon sequence
<400> 143
<210> 144
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5+6-trim(A/Brisbane/59/2007)
<400> 144
<210> 145
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4(A/Brisbane/59/2007)
<400> 145
<210> 146
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5+6(A/Brisbane/59/2007)
<400> 146
<210> 147
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster11+5+6(A/Brisbane/59/2007)
<400> 147
<210> 148
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5(A/Brisbane/59/2007)
<400> 148
<210> 149
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1 Full length R343Q(A/Brisbane/59/2007)
<400> 149
<210> 150
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5+6-nl(A/Brisbane/59/2007
<400> 150
<210> 151
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> s-H1-mini2-cluster1+5+6-nl2(A/Brisbane/59/2007)
<400> 151
<210> 152
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini2a-cl1+5+6_no_linker(HNGK)
<400> 152
<210> 153
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini2a-cl1+5+6_no_linker2s
<400> 153
<210> 154
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1-mini2-cl1+5+6-no_linker2s-GCN4
<400> 154
<210> 155
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini2a-cl1+5+6no_linker2s-trim3
<400> 155
<210> 156
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini2a-cl1+5+6-12
<400> 156
<210> 157
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini2a-cl1+5+6-12+13
<400> 157
<210> 158
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H5 FL HA A/Vietnam/1203/2004
<400> 158
<210> 159
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1 FL HA A/California/04/2009 R343Q
<400> 159
<210> 160
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini-HAA/California/07/2009
<400> 160
<210> 161
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini-HAA/PuertoRico/8/1934
<400> 161
<210> 162
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1mini-HAA/Texas/36/1991
<400> 162
<210> 163
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H5mini-HAA/Vietnam/1203/2004
<400> 163
<210> 164
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_Maryland_12_1991
<400> 164
<210> 165
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_Henry_1936
<400> 165
<210> 166
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1 A/AA/Marton/1943
<400> 166
<210> 167
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_New_York_607_1995
<400> 167
<210> 168
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_New_Jersey_11_2007
<400> 168
<210> 169
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_USSR_92_1977
<400> 169
<210> 170
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_New_York_629_1995
<400> 170
<210> 171
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_Virginia_UR06-0549_2007
<400> 171
<210> 172
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_Texas_UR0-0526_2007
<400> 172
<210> 173
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> mHA_H1N1_A_Sydney_DD3-55_2010
<400> 173
<210> 174
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3mini2a-linker+cl9_+10+11+12+GCN4T_CG7-1(A/HongKong/1/1968(H3N2))
<400> 174
<210> 175
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3mini2a-linker+cl9_+10+12+18+GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))
<400> 175
<210> 176
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3mini2a-linker+cl9_+10+12+16+CG7-GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))
<400> 176
<210> 177
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> 177H3mini2a-linker+cl9_+10+12+19+GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))
<400> 177
<210> 178
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> 178H3mini2a-linker+cl9_+10+12+17+CG7-GCN4T(A/HongKong/1/1968(H3N2))
<400> 178
<210> 179
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H3_HK68_mini2a-linker2+cl9_+10+12+GCN4T
<400> 179
<210> 180
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> H1-mini2-cluster1+5+6+GCN4-T49N
<400> 180
<210> 181
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH1-mini2-cl1+5+6-GCN4-Bromelain
<400> 181
<210> 182
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH1-mini2-cl1+5+6-GCN4-Bromelain-Foldon
<400> 182
<210> 183
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH1-mini2-cl1+5+6-GCN4t2
<400> 183
<210> 184
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH1-mini2-cl1+5+6-GCN4t2-Bromelain
<400> 184
<210> 185
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH1-mini2-cl1+5+6-GCN4t2-Bromelain-Foldon
<400> 185
<210> 186
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH3 HK mini2a-linker+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-His
<400> 186
<210> 187
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工Sequence
<220>
<223> sH3 HK mini2a-linker+cl9+10+11+12+GCN4T-CG7-Foldon-His
<400> 187

Claims (13)

  1. 一種多肽，其包含：(a)流感血球凝集素HA1域，該流感血球凝集素HA1域包含利用具有0至10個胺基酸殘基之連接序列共價鍵聯至HA1 C端主幹區段之HA1 N端主幹區段，該HA1 N端主幹區段包含HA1之胺基酸1至52，該HA1 C端主幹區段包含HA1之胺基酸321至末端，其中胺基酸53至320經移除；及(b)流感血球凝集素HA2域，其中該HA1 C端區段之C端胺基酸殘基為除精胺酸(R)或離胺酸(K)以外之任何胺基酸，其中位置406、409、413及416上之胺基酸中之一或多者已突變成選自由以下組成之群的胺基酸：S、T及G，且其中該多肽包含在位置324與436之胺基酸之間的二硫橋，其中該HA1域及該HA2域係源自A型流感病毒H1亞型，且其中編號係基於H1N1流感病毒株A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)之胺基酸編號。
  2. 如請求項1之多肽，其中該多肽經糖基化。
  3. 如請求項1之多肽，其中該HA1 C端主幹區段之C端胺基酸殘基為麩醯胺酸(Q)。
  4. 如請求項1之多肽，其中該多肽包含來自或基於流感病毒A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO：1)之HA的血球凝集素主幹域。
  5. 如請求項1之多肽，其中該多肽包含在位置419至433之SEQ ID NO：84。
  6. 如請求項1之多肽，其中該多肽選擇性結合至抗體CR6261及/或CR9114，其中CR9114包含SEQ ID NO：25之重鏈CDR1、SEQ ID NO：26之重鏈CDR2、SEQ ID NO：27之重鏈CDR3、SEQ ID NO：28之輕鏈CDR1、SEQ ID NO：29之輕鏈CDR2及SEQ ID NO：30之輕鏈CDR3，且不結合至抗體CR8057。
  7. 如請求項1之多肽，其中該多肽在該HA1域及/或該HA2域中包含一或多個其他突變。
  8. 如請求項1之多肽，其中該多肽不包含信號序列。
  9. 如請求項1之多肽，其中該多肽不包含HA之細胞內及跨膜序列。
  10. 如請求項9之多肽，其中該多肽不包含流感H1 HA2域之C端部分，該C端部分跨越H1 HA2之胺基酸殘基520、521、522、523、524、525、526、527、528、529或530至C端胺基酸。
  11. 一種多肽，其係由包含以下步驟之方法所獲得：提供流感HA0胺基酸序列；藉由將該HA1之C端胺基酸突變成除精胺酸(R)或離胺酸(K)以外之胺基酸，以移除HA1與HA2之間的裂解位點；移除胺基酸序列，該胺基酸序列包含來自位置53至320之胺基酸殘基且包含來自該HA0序列之球狀頭部域位 置320之胺基酸殘基，並將序列之剩餘部分直接連接或藉由引入1至10個胺基酸長度之連接序列而連接；在使螺旋A之C端殘基連接至螺旋CD之N端殘基之胺基酸序列中引入一或多個突變；及在該HA主幹域多肽中之胺基酸324與436之間(根據SEQ ID NO：1的編號)引入至少一個二硫橋連基。
  12. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至11中任一項之多肽。
  13. 一種免疫原性組合物，其包含足以誘導個體中之免疫反應之量的如請求項1至11中任一項之多肽。
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