TWI528972B

TWI528972B - 疫苗

Info

Publication number: TWI528972B
Application number: TW099104980A
Authority: TW
Inventors: 班諾特巴拉斯; 德克吉森; 伊莎貝爾諾特; 珍皮爾斯; 珍托森特
Original assignee: 葛蘭素史密斯克萊生物股份有限公司
Priority date: 2009-02-17
Filing date: 2010-02-22
Publication date: 2016-04-11
Also published as: PE20151588A1; CL2011001993A1; AU2010215595A1; JP6058266B2; TW201517915A; CA2752809A1; US20110318407A1; CO6551750A2; KR20110132379A; PE20110992A1; ZA201105656B; AR075437A1; IL214385A0; CN102395600A; PH12015501637A1; SG173194A1; MX2011008649A; WO2010094663A1; EP2398821B1; JP2015221803A

Description

疫苗

相關申請案的交互參照

本申請案主張在2009年02月17日所提申之美國專利暫時申請案第61/153,060號的較早申請日，該件申請案的完整內容係被納入於此以供參照。

本案揭露內容提供數種用於預防及/或治療由登革熱病毒所引起之疾病的免疫原組成物。

背景

登革熱是一種由蚊子所傳播的人類急性病毒疾病。它在熱帶、亞熱帶和世界上盛行，每年估計有100,000,000個病例發生。儘管相對罕見，但出血性登革熱(DHF)和登革休克症候群(DSS)對兒童造成重大的死亡病例。目前沒有對抗登革熱的疫苗，而藉由防治蚊蟲病媒來預防疾病已被證明是大致上無效的。因此，仍然需要一種安全且有效的疫苗，以對抗由登革熱病毒所造成的疾病。

概要

本案揭露內容關於數種會引發一免疫反應以對抗登革熱病毒的組成物。特定言之，本案揭露內容係關於含有一佐劑之失活登革熱病毒疫苗。本案所揭組成物包括一不含鋁的佐劑，該佐劑可促進一個Th1免疫反應。本案亦述及將彼等應用於諸如醫藥調配物中以預防或治療由登革熱病毒所造成之疾病的方法。

發明詳細說明 導言

本發明關於一種疫苗，其可滿足對於安全且有效的疫苗之需求。相對於減毒活登革熱病毒，純化型失活登革熱病毒疫苗具有的主要優點在於，失活的病毒不具傳染性，因而不會回復致病性或導致疾病。純化型失活登革熱病毒疫苗相較於減毒活病毒的一個潛在性缺點在於，誘發高效價登革熱專一性中和抗體的能力較低，以及保護性免疫反應的持續期間較短。這些缺點係藉由將純化型失活登革熱抗原與一適當佐劑共同調配來克服。如本說明書中所揭露者，該佐劑是一種不含鋁(alum-free)的佐劑(或佐劑系統)，其有效於誘發高效價的登革熱專一性中和抗體。在一具體例中，該佐劑引發一個以Th1為主的反應，或是一個以產生干擾素-γ(INF-γ)為特徵的均衡型Th1/Th2反應。

本案說明書中所揭露的免疫原組成物包括至少一種(亦即，一種或超過一種)失活登革病毒熱抗原，與一不含鋁之佐劑共同組合。該失活登革熱病毒抗原可選自於登革熱-1型病毒抗原、登革熱-2型病毒抗原、登革熱-3型病毒抗原和登革熱-4型病毒抗原。因此，該免疫原組成物可為一種單價組成物，其包括單一種源自於單一病毒株的失活登革熱病毒抗原，該病毒株係選自於登革熱-1型、登革熱-2型、登革熱-3型和登革熱-4型，抑或是該組成物可為一種多價(諸如二價、三價、四價)組成物，其含有這些登革熱病毒株中超過一者的失活抗原。在一例示性具體例中，該免疫原組成物包括一登革熱-2型病毒抗原。例如，該免疫原組成物可為一種含有一失活登革熱-2型抗原的單價組成物。任擇地，該免疫原組成物可為一種二價、三價或四價組成物，其含有一失活登革熱-2型病毒抗原，與另一、二或三種額外的失活登革熱病毒抗原相組合。例如，在一具體例中，該組成物為一種四價組成物，其包括失活登革熱-1型病毒抗原、失活登革熱-2型病毒抗原、失活登革熱-3型病毒抗原和失活登革熱-4型病毒抗原。

該一或多種失活登革熱病毒抗原係與一佐劑共同調配，該佐劑不含鋁或鋁鹽，亦即，一不含鋁的佐劑或佐劑系統。在一具體例中，該佐劑包括一水包油乳液。舉例而言，該水包油乳液可包括一併有一可代謝性油的油相，且任擇地包括一額外油相成份，諸如母育酚(tocol)。該水包油乳液亦含有一水性成份，諸如一緩衝化生理食鹽水溶液(例如磷酸鹽緩衝化生理食鹽水)。此外，該水包油乳液通常含有一乳化劑。在一具體例中，該可代謝性油為鯊烯(squalene)。在一具體例中，該母育酚為α-生育酚(α-tocopherol)。在一具體例中，該乳化劑為一非離子性界面活性劑乳化劑(諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯，)。在一例示性具體例中，該水包油乳液含有呈一為等於或低於1(w/w)之比例的鯊烯和α-生育酚。

在一特定實例中，該免疫原組成物包括一種被調配成具有一劑量的水包油乳液佐劑系統，該劑量包含：約2%至約10%之鯊烯；約2%至約10%之α-生育酚；以及約0.3%至約3%之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。舉例而言，該免疫原組成物可包括一種被調配成具有一劑量的水包油乳液佐劑系統，該劑量包含：約10毫克至約12毫克之鯊烯；約10毫克至約12毫克之α-生育酚；以及約4毫克至約6毫克之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。在一特定實例中，該佐劑在單一(完整)劑量中包括：10.68毫克之鯊烯；11.86毫克之α-生育酚；4.85毫克之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。在其他具體例中，該免疫原組成物係與前述成份用量之一個分劑量(fractional dose；亦即，一個呈前述單一劑量調配物之一分量的劑量，諸如前述成份用量的一半、前述成份用量的，抑或是諸如1/3、1/6等其他分劑量)共同調配。

在某些具體例中，該失活登革熱病毒抗原係與一不含鋁的佐劑系統共同調配，該佐劑系統包括3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)及/或QS21。在一具體例中，該佐劑系統包括3D-MPL及QS21。舉例而言，在一具體例中，該佐劑含有配於一微脂體調配物內的3D-MPL及QS21。任擇地，該佐劑系統亦含有膽固醇。在一特定具體例中，該佐劑包括QS21和膽固醇。任擇地，該佐劑系統含有1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)。例如，在一種即將與失活登革熱病毒抗原共同調配的特定佐劑系統中含有膽固醇、DOPC、3D-MPL及QS21。

在一特定具體例中，該免疫原組成物包括一種被調配成具有一劑量的佐劑，該劑量包括：約0.1至約0.5毫克之膽固醇；約0.25至約2毫克之DOPC；約10微克至約100微克之3D-MPL；以及約10微克至約100微克之QS21。在一具體例中，膽固醇在佐劑中相對於QS21的比例為5：1(w/w)。舉例而言，膽固醇在佐劑中相對於QS21的比例可約為或恰為1：1(w/w)。在一特定具體例中，該佐劑被調配成單一劑量，該劑量含有：約0.25毫克之膽固醇；約1.0毫克之DOPC；約50微克之3D-MPL；以及約50微克之QS21。在其他具體例中，該免疫原組成物係與前述成份用量之一個分劑量共同調配(亦即，一個呈前述單一劑量調配物之一分量的劑量，諸如前述成份(膽固醇、DOPC、3D-MPL以及QS21)用量的一半、前述成份用量的，抑或是諸如1/3、1/6等其他分劑量)。

在另一態樣中，本案揭露內容係關於一種用於製造一登革熱疫苗的方法，其包含下列步驟：提供至少一種經純化之失活登革熱病毒抗原；以及將該至少一種經純化之失活登革熱病毒抗原與一不含鋁的佐劑共同調配。舉例而言，該免疫原組成物可與一完整病毒抗原共同調配，該完整病毒抗原係從一經失活化或已被殺死的致病株或減毒株製得。例如，可利用諸如甲醛、β-丙內酯(BPL)或過氧化氫等化學藥劑，或是利用紫外線輻射，或是藉由利用由二或更多個失活化步驟所構成之組合(這些步驟可相同或相異，例如甲醛和BPL、甲醛和UV輻射、BPL和UV輻射、過氧化氫和BPL、過氧化氫和UV輻射等，呈任何組合)，將(具致病性或經減毒的)活病毒予以殺死或令其失活化，而使其無法複製。任擇地，令失活登革熱病毒接受額外的加工程序，例如進行切割或是進一步純化抗原性單元。

在另一態樣中，本案揭露內容係關於一種用於在一個體中預防、改善或治療由登革熱病毒所引起之疾病的方法，其包含：給予一免疫原組成物(例如疫苗)，該免疫原組成物含有至少一種失活登革熱病毒抗原以及一不含鋁的佐劑(如本案說明書中所述)。在一具體例中，該方法涉及將該免疫原組成物給予一位兒童，諸如一位小於5歲或是小於1歲的兒童。在一具體例中，該免疫原組成物係給予一小於1歲的初始個體(nave subject)。在其他具體例中，該免疫原組成物係給予一成年個體，例如一成人個體，諸如一超過約60或65歲的年長個體。這些個體可於事前已暴露於登革熱病毒。通常，該疫苗係非經腸道給予，例如經肌肉內給予。在另一態樣中，本案揭露內容係關於將一免疫原組成物應用於醫學上，以諸如預防、改善或治療登革熱病毒感染及/或諸如出血性登革熱(DHF)和登革休克症候群(DSS)等由登革熱病毒所引起之疾病，該疫原組成物含有至少一種經純化之失活登革熱病毒抗原以及一不含鋁的佐劑。

用語

為便利檢視本案揭露內容的許多具體例，就用語提供下列解釋。本案揭露內容中可提供其他的用語和解釋。

除非另行解釋，否則本說明書中所使用的所有技術和科學用語均和本案所屬技術領域中具有通常知識的人士所普遍明暸的意義相同。分子生物學上共通用語的定義可見於Benjamin Lewin所著Genes V，於1994年由Oxford University Press出版(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(編者)，The Encyclopedia of Molecular Biology，於1994年由Blackwell Science Ltd.出版(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A. Meyers(編者)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference，於1995年由VCH Publishers,Inc.出版(ISBN 1-56081-569-8)。

除非前後文意指明另有其他意義，否則單數形用語“a”、“an”和“the”包括複數形用語。類似地，除非前後文意指明另有其他意義，「或(or)」此用語係意欲包括「以及(and)」。「複數」此用語意指二或更多個。另需理解的是，所有鹼基的大小或胺基酸的大小，以及給予核酸或多肽的所有分子量或分子質量數值皆為近似值，且供敘述之用。此外，針對物質之濃度或位準所給予的數值限定亦意欲為近似值。因此，當一濃度被指定為至少(舉例而言)200 pg時，則其意指該濃度應被理解為至少概略為(或是「約」或「~」)200 pg。

雖然類似於或相當於本說明書中所述者的方法和材料可供實際應用或供用於測試本案揭露內容，但適當的方法和材料係述明於下文。「包含(comprises)」此用語意指「包括(includes)」。因此，除非前後文意另有所指，否則「包含(comprises)」此用語以及諸如「comprise」、「comprising」等詞性變化應被理解成意味著涵蓋有所指化合物或組成(例如核酸、多肽、抗原)或步驟，或是一組化合物或步驟，但不排除任何其他的化合物、組成、步驟或彼等之群組。「e.g.」此縮寫源自於拉丁文exempli gratia，且在本說明書用於指稱一非限制性實例。因此，「e.g.」此縮寫與「例如(for example)」此用語同義。

一「免疫原組成物」是一種適合給予一人類或動物個體的組成物(諸如在一實驗設定中)，其可引發專一性免疫反應，以諸如對抗一病原，諸如登革熱病毒。因此，一免疫原組成物包括一或多種抗原(例如完整的純化病毒或是其抗原性單元，諸如多肽)或抗原決定基。一免疫原組成物亦可包括一或多種可引發或增進一免疫反應的其他成份，諸如賦形劑、載劑及/或佐劑。在某些情形下，免疫原組成物係經給予以引發一免疫反應，以保護個體免於由一病原所引起的症狀或病況。在一些例子中，由一病原所引起的症狀或疾病係在個體暴露於病原之前藉由抑制該病原的複製來進行預防(或是治療，諸如降低或改善)。就本案揭露內容而言，免疫原組成物此用語將被理解成涵蓋到欲供給予一個體或一群個體以達到引發一對抗登革熱的保護性或緩解性免疫反應之目的之組成物(亦即，疫苗組成物或疫苗)。

「純化」此用語(例如，針對一病原或一含病原組成物)係指從組成物中移除不希望存在之成份的程序。純化乃是一相對性的用語，且不要求所有微量的非所欲成份均必須從組成物中移除。就疫苗的製造而言，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析以及尺寸篩選性層析、親和性純化或沈澱等程序。因此，「純化」此用語並非要求絕對純質，反而意欲使用作為一相對性的用語。因此，舉例而言，相較病毒在諸如一細胞或一群細胞內的自然複製生成環境中或是在一人工環境中，病毒在一經純化之病毒製劑中更為富化。一實質純質病毒製劑可被純化成使得所欲病毒或病毒成份相當於製劑蛋白質總含量的至少50%。在某些具體例中，一實質純質病毒相當於製劑蛋白質總含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更高。

一「被單離」的生物成份(例如病毒、核酸分子、蛋白質或胞器)已從該成份所存在或被製造的細胞及/或生物體中之其他生物成份中實質分離或純化出來。被單離的病毒以及諸如蛋白質等病毒成份包括藉由標準純化方法所純化出來的病毒和蛋白質。該用語亦涵蓋藉由在一宿主細胞內進行重組型表現所製得的病毒和病毒成份(諸如病毒蛋白)。

一「抗原」乃是一種可在一動物體內刺激抗體生成及/或T細胞反應的化合物、組成物或物質，包括被注入、被吸收或以其他方式導入於一動物體內的組成物。「抗原」此用語包括所有相關的抗原決定基。「決定基」或「抗原決定基」此用語係指抗原上B及/或T細胞所反應的位址。「主要抗原決定基」或「主要決定基」為造成一功能明顯之宿主免疫反應的決定基，該功能明顯之宿主免疫反應為諸如一抗體反應或T-細胞反應。因此，至於對抗一病原的保護性免疫反應，主要抗原決定基為被宿主免疫系統所辨識時會導致保護作用以免於該病原所造成之疾病的抗原部分。「T-細胞決定基」此用語係指當與一適當的HMC分子相結合時會被T細胞所專一性地結合(經由T細胞受體)的決定基。一個「B-細胞決定基」為被一抗體(或是B細胞受體分子)所專一性地結合的決定基。

就本案揭露內容而言，一登革熱病毒抗原通常為一被殺死或失活的完整病毒。就登革熱病毒疫苗而言，「失活」此用語意指抗原成份(例如病毒)無法於活體內或活體外進行複製。舉例而言，失活此用語涵蓋一已於諸如活體外進行複製且隨後運用化學或物理手段被殺死因而無法再進行複製的病毒。該用語亦可包括藉由進一步的加工程序(例如切割、部分分離等)所製得的抗原，以及藉由重組手段在諸如細胞培養物內所製得的成份。

一「佐劑」是一種試劑，相較於在沒有該試劑下給予抗原，其能夠促進抗原專一性免疫反應的產生。常用的佐劑包括含鋁佐劑，其包括吸收有抗原的礦物質(或是諸如氧氧化鋁、磷酸鋁、羥基磷酸鋁等礦物質鹽)之懸浮液。就本案揭露內容而言，該等佐劑為不含鋁之佐劑，其係在不存在有任何鋁鹽下調配而成。不含鋁之佐劑包括油和水的乳液，諸如油包水、水包油(以及彼等之變異形式，包括雙重乳液、可逆型乳液)、脂醣、脂多醣、免疫刺激核酸(諸如CpG寡核苷酸)、微脂體、類鐸受體促效劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9促效劑)，以及這些成份的各種組合。

一「免疫反應」是諸如等B細胞、T細胞或單核細胞等免疫系統細胞對於刺激的反應。一免疫反應可以是一個B細胞反應，其致使諸如抗原專一性中和抗體等專一性抗體的產生。一免疫反應也可以是一個T細胞反應，諸如CD4+反應或CD8+反應。在一些例子中，該反應對於一特定抗原具有專一性(亦即，一「抗原專一性反應」)。若抗原來自於一病原，則抗原專一性反應即為一種「病原專一性反應」。一「保護性免疫反應」是一種用於抑制病原之有害功能或活性、降低被病原所感染或是減少由於病原感染所造成之症狀(包括死亡)的免疫反應。一保護性免疫反應可諸如藉由在蝕斑降低分析法或ELISA-中和分析法中抑制病毒複製或蝕斑形成，抑或是藉由於活體內測量對於病原攻毒的抗性進行測量。

一個「Th1」偏向型免疫反應之特徵在於存在有會製造出IL-2和IFN-γ的CD4+輔助細胞，因而分泌或存在有IL-2和IFN-γ。相對地，一個「Th2」偏向型的免疫反應之特徵在於製造出IL-4、IL-5和IL-13的CD4+輔助細胞在數量上佔優勢。

一「個體」是一個活的多細胞脊椎動物生物體。就本案揭露內容而言，該個體可為一實驗個體，例如一非人類動物，諸如小鼠、棉鼠或非人類靈長類動物。任擇地，該個體可為一人類個體。

本案所揭露的免疫原組成物適供用於預防、改善及/或治療由登革熱病毒感染所造成的疾病。

本案所揭露的免疫原組成物包括一或多種經純化之失活登革熱病毒抗原。舉例而言，免疫原組成物可包括單一株登革熱病毒(亦即，單價組成物)或是它們可含有超過一株登革熱病毒(亦即，多價組成物)。通常來說，一個多價組成物含有數個選自於不同血清型的病毒株。因為有四個血清型的登革熱病毒會致病，亦即登革熱第1型(DEN-1)、登革熱第2型(DEN-2)、登革熱第3型(DEN-3)和登革熱第4型(DEN-4)，而且因為交叉反應性非中和抗體偏好較為嚴重的登革熱疾病形式，所以可以選出各血清型的一個代表物納入最終疫苗中，以確保可提供保護免於四個血清型中任一者所造成的疾病。因此，在一具體例中，免疫原組成物是種四價組成物，包括選自於四個登革熱病毒血清型的病毒株。

供用作為抗原的病毒可選自於基本上任何的登革熱病毒株。舉例而言，病毒株可根據其與某一血清型在界定用序列(例如一致性序列)上的相似度而從各血清型選出。此一病毒可為天然或人造。任擇地，病毒株可被選定為與意欲施予疫苗的地區或族群中所流行的病毒株相關聯。另一個選擇是依據可用性和先前經驗而從便利性的角度選定各血清型的病毒株。舉例而言，例示性的病毒株係敘述於美國專利第6,254,873號，該件專利案的內容係納入於此以供參照。其他適用病毒株被揭露於諸如美國專利第7,226,602號。其他病毒株見於諸如VBRC病毒基因體資料庫(http://athena.bioc.uvic.ca/organisms/Flaviviridae/Dengue/Curated_genes)，以及登革熱病毒資料庫(http://www.broad.mit.edu/annotation/viral/Dengue/ProjectInfo.html)。

就經純化之失活登革熱病毒疫苗而言，無論具致病性或被減毒的病毒株均可供使用。致病株通常在宿主細胞內會增殖至較高的效價，而促進商業規模的生產。但是，致病株需要特別小心操作，以避免感染製作過程中所涉及的人員。減毒株，例如經由適應在培養細胞內生產並篩選致病性降低及/或登革熱病媒蚊內複製減少所發展出的減毒株，所需要的操作謹慎程度較低，但啊能不易製造。適用於一含有失活登革熱病毒和不含鋁佐劑的例示性減毒株係敘述於WO 00/57907和美國專利第6,638,514號以及WO 00/58444和美國專利第6,613,556號，這些專利案的內容係納入於此以供參照。因此，所選定的病毒株通常是從數個可在適合生產供人類使用之材料的細胞(例如，經確認不含病原的細胞)內進行複製的病毒株當中選出。舉例而言，病毒株可經篩選以鑑定出病毒在選定的細胞株內生長至最高效價者，例如至少約5×10⁶ pfu/ml，較佳為至少約1×10⁷ pfu/ml或更高；(ii)選擇在選定的細胞株內生長至最高效價的登革熱病毒株；以及(iii)藉由在選定的細胞株內進行一至數次的額外繼代，以進一步使選出的病毒株適應於大量生長。經選定的病毒(例如，從四種登革熱病毒血清型中選出者)係藉由額外的細胞培養繼代或是藉由基因操作程序而進一步調適成可生長至高效價，從而製得高效價化的主要和生產種批料。

適合於增殖登革熱病毒的細胞株包括哺乳動物細胞，諸如Vero細胞、AGMK細胞、BHK-21細胞、COS-1或COS-7細胞、MDCK細胞、CV-1細胞、LLC-MK2細胞、諸如胎恆河猴肺臟(FRhL-2)細胞、BSC-1細胞和MRC-5細胞等初級細胞株，或是人類二倍體纖維原細胞，以及鳥類細胞、雞或鴨胚源細胞株，諸如AGE1細胞、初級雞胚纖維原細胞，以及諸如C6/36等蚊細胞株。較佳地，所選定的細胞係經調適成可在不存有血清或血清源蛋白質下生長，且可在不含血清(及/或不含蛋白質)的生長條件下維持登革熱病毒的高效價複製。

所選定的登革熱病毒株係供用於感染宿主細胞(例如，從上述適當細胞類型當中所選出者)，使病毒在細胞培養物中增殖。在病毒吸附以後，將能夠支持細胞生長的培養基饋入於培養物中。較佳地，該培養基不含有血清或血清源蛋白質或其他動物源蛋白質，抑或是可在生產過程中使用不含血清的培養基來取代含有血清的培養基。從商業上可購得多種不含血清的培養基調配物。有關在維持於無血清條件下的細胞內生產病毒之方法的詳細敘述可見於諸如美國專利公開案第20060183224號，該件專利案的內容被納入於此以供參照。

將宿主細胞持續培養數日，直到達成所欲的病毒效價為止。任擇地，細胞係維持在一連續灌注系統中，以在數日或更長的期間內間歇地或持續地從該系統獲取病毒。在非連續性培養條件下，在感染後3-7日獲得一為至少約10⁶至10⁷ PFU/ml的病毒效價是所希望的。在一些宿主細胞中，該效價會於數日內仍維持高位準，而可於數個時間點回收病毒，使產率最佳化。舉例而言，從感染後約3日至約13日，可藉由收集上澄液並再餵養細胞而每日由這些培養物獲取病毒。任擇地，可將這些上澄液予以集中，再進行其他加工程序。在其他的宿主細胞中，可令病毒在較短的期間內生長至一較高效價。在此例中，病毒可如實驗所測定者於最高效價處獲取。

舉例來說，可利用無花果蛋白酶(Ficin)在VPSFM培養基中將Vero細胞予以擴增，達141個繼代。可於豬胰蛋白酶的存在下進行另一次繼代。可以約0.7×10⁶個細胞/ml的濃度將細胞種入生物反應器內(4升)，並在VPSFM+Pluronic 0.1%中以及灌注條件下(例如，D0→：每日為0體積；D1→D2：每日為1體積；接著在後續3日為每日1.5體積)，將細胞培植於微型載體(cytodex-1)上。隨後，當細胞位於約3×10⁶個細胞/ml的濃度時以登革熱病毒感染之，例如，在37℃以及降低的培養基體積(2升)下於DMEM+麩醯胺酸4mM++FBS 2%中，以MOI 0.01的條件進行2小時。隨後，將生物反應器內的培養基體積調整至4升。經過3日以後，移離大部分的培養基(大約3升)，並以DMEM培養基+麩醯胺酸4 mM取代之。感染7日後可獲取病毒。

為了回收病毒，藉由包括低速離心(例如在1500×g下離心10分鐘)在內的習知通用方法，或是藉由濾經一具有0.45 μm之孔徑的濾器，而獲取病毒。用於濃縮所述病毒的方法係落在本項技術中具有一般知識者的範圍內，且包括諸如超過濾(例如利用一具有不超過300 kDa之孔徑的薄膜)，或是利用聚乙二醇(PEG) 8000進行沈澱。用於純化病毒的方法為習於此藝者所熟知，且包括連續式或多步驟式蔗糖梯度、運用藉由尺寸篩選、離子交換、吸附或親和管柱以管柱層析法進行純化、或是藉由分配於聚合物兩相或多相系統中來進行純化、或是彼等的任何組合。用於分析病毒陽性分液的方法包括蝕斑分析法、紅血球凝集素(HA)分析法及/或諸如免疫分析法等抗原分析法。

舉例而言，登革熱病毒可藉由聚乙二醇(PEG)沈澱法而從培養物上澄液中濃縮出來。源自於受感染細胞的上澄液流體係藉由離心10分鐘(1500×g)而澄清化。經澄清化的上澄液被調整成具有6% PEG 8000(Sigma)和0.5 M NaCl，置於4℃下，並施以溫和攪拌，歷時45分鐘。沈澱物係藉由在5000×g下離心50分鐘來收集，且再懸浮於STE緩衝液中(0.1 M NaCl、10 mM tris、1 mM EDTA，pH 7.6)。接著可藉由離心(於4℃下，以12,000×g之速率離心10分鐘)將病毒懸浮液予以澄清化。拋棄澱積丸粒，隨後將上澄液予以離心(170,000×g，80分鐘，4℃)使病毒沈降。令此一病毒澱積丸粒再懸浮於STE緩衝液中，而呈現所希望的濃度。

任擇地或額外地，登革熱病毒可藉由切向流超過濾法從細胞上澄液中濃縮出來。源自於受感染細胞的上澄液流體係藉由前述低速離心予以澄清化，隨後濾經一個0.45 μm的CN濾器(Nalgene)。經過濾的上澄液係利用一低蛋白結合性100 kDa截留膜(例如omega 100K篩選通道，Filtron,Inc.)並藉由切向流超過濾法而濃縮出。濃縮程序係利用每分鐘400 ml的流速、每分鐘約100 ml的過濾速率以及20-30 psi的壓力下，而於4℃下進行。

進一步的純化可利用蔗糖梯度超離心法來達成。登革熱病毒基本上可依據先前技術所述(Srivastava et al. Arch. Virol. 96: 97-107,1987)再略加變化，而以蔗糖梯度進行純化。15毫升的蔗糖梯度可藉由逐步添加下列以w/w所表示的比例配於磷酸鹽緩衝化生理食鹽水，pH 7.4內(PBS，不含Caq和Mg，Whittaker MA Bioproducts)的蔗糖溶液，而在1”×3.5”(40毫升)的超離心管中(Ultra-clear.TM.,Beckman,Inc.)製成：2毫升60%、2毫升55%、2毫升50%、2毫升45%、2毫升40%、2毫升35%、2毫升30%和1毫升15%。藉由在室溫下令管體靜置2-4小時而形成平順的梯度。將至高為25毫升的濃縮病毒施加至各管。隨後於4℃下，在一具諸如SW 28離心機轉子內(Beckman)以17,000 rpm之速率進行超離心，歷時18小時。經離心後，從管體底部收集1至2毫升的分液。可視需要分析這些分液的總體蛋白質、病毒HA和病毒抗原。通常將呈陽性的梯度分液予以集中，並以培養基199(M199,Gibco-BRL)或PBS稀釋成具有10%或更低的蔗糖濃度。任擇地，在進行失活化之前，可令病毒集中液濾經一個0.22 μm低蛋白結合性濾器(GV型，Millipore)。

經純化後，藉由一可保留病毒抗原性和免疫原性且同時破壞其感染性的選定手段，令回收的病毒失活。在一實例中，將一有效量之諸如福馬林或β-丙內酯的試劑加入病毒，並利用失活劑來培育混合物，直到失去活性為止。舉例而言，將福馬林(37%甲醛)以1:40之比例稀釋於PBS中，並以1 N NaCl將pH調整至約7.4。隨後，令溶液通過一個0.22 μm的CN濾器(Nalgene)而使溶液無菌化。將此一福馬林溶液加入經純化之病毒中(1:50)，達到一為0.05%的最終福馬林濃度。失活程序係在15至25℃之間進行，歷時48小時至14日(通常為10日或更少)。任擇地，令病毒濾經一個0.22 μm的GV型濾器，並轉移至一新容器。失活程序完成時，位於大量培養基內的游離福馬林可藉由諸如添加等當量的無菌10% w/v亞硫酸氫鈉予以中和。

任擇地，失活可藉由以一放射源來照射病毒直到病毒失去活性為止來達成。放射源的一個較佳實例為鈷-60，其劑量為足可使得病毒失去感染性但保留基本上完整的抗原性。適用劑量的實例為落在5.5至7.0 Mrads的範圍內者。例如，將位於1.5毫升無菌聚丙烯管內的50微升病毒分量予以冷凍，置入設有⁶⁰Co源的輻照儀內並置放於乾冰上，經歷一段足以傳輸所欲輻射的期間。

任擇地，紫外光輻射可供用於使病毒失活。適用於以紫外光照射病毒的裝置屬於習知的商用裝置，且可在商業上購自於諸如Bayer等廠商，其將上澄液(或其他含病毒流體)暴露於一設定於約254 nm的UV-C光源，經歷一段足以使病毒失活但保留免疫原性的時間。

任擇地，可依據諸如美國專利公開案第20070031451號中所述方式，利用過氧化氫使登革熱病毒失活，該件專利案的內容被納入於此以供參照。

若有需要，可以運用二或更多個失活步驟。當運用二或更多個失活步驟時，這些步驟可為相同或相異。舉例而言，在純化並失活化登革熱病毒以配製成一可供給予人類個體的免疫原組成物之期間，可以使用一由任何適合的失活程序所構成的組合，例如使用由前述失活程序中之任一者所構成者。

病毒製劑的品質可藉由多種習知方法來監測。舉例來說，病毒可於失活程序前在一蝕斑效價測定分析中進行監測。令病毒在與生產過程中所使用之宿主細胞相同或相異的宿主細胞內進行擴增，並用以感染一諸如單層LLC-MK2細胞或Vero細胞的適當細胞株，且可計算病毒蝕斑的數目以測定被回收之病毒的感染性(請參見諸如Sukhavachana et al. WHO Bull. 35: 65-6,1966)。另一種用於評價被回收抗原之數量和品質的方法乃是藉由病毒紅血球凝集(HA)和紅血球凝集抑制(HI)分析法。病毒HA和HI分析法可依據先前技術所述方式來進行(Clarke ＆ Casals,Am. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-73,1958)。總體蛋白質主要是利用一商業上可購得的套組(BioRad,Hercules,Calif.)並利用牛血清蛋白(BSA)或γ-免疫球蛋白作為基準體，而依據Bradford所述方式來測定(Anal. Biochem. 72: 248,1976)。

任擇地，於失活程序之後，抗原可諸如在一抗原墨點分析法中進行檢測及/或定量。為了將位於失活病毒製劑內的抗原予以檢測和定量，將病毒樣品予以系列稀釋，通常為二倍數系列稀釋，並點加於硝基纖維素濾紙上。將這些濾紙予以風乾，以配於PBS內的5%酪蛋白進行封阻，並與專一性抗體或抗血清共同培育，再與連綴有酵素的二級抗體共同培育。病毒亦可藉由西方墨點法進行檢測。簡言之，在22℃下，令抗原製劑溶解於含有1% SDS、66 mM Tris-HCl,pH 6.8、1%甘油和0.7%溴粉草藍的SDS-PAGE樣品緩衝液內，歷時10分鐘，並在12.5%的聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳(例如，依據Feighny et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50(3): 322-8,1994中所述方式)。將經離析之蛋白質電泳轉移至耐綸或硝基纖維素薄膜。隨後可藉由膠體金染色測得蛋白質，而病毒抗原可利用一個非同位素變化型西方墨點過程而以免疫學方式進行鑑定。

免疫原組成物和方法

令失活登革熱病毒與一適當的不含鋁佐劑相混合，以製得一適於使人類個體免疫化以引發高效價的病毒中和抗體並保護被免疫化之個人免於由登革熱病毒所造成之疾病的免疫原組成物。通常，失活登革熱病毒係被調配於一藥學上可接受之載劑或賦形劑中。

藥學上可接受之載劑和賦形劑係屬習知，且可為熟習本項技術人士所選定。舉例來說，載劑或賦形劑較佳為可包括有一緩衝液。任擇地，載劑或賦形劑亦含有至少一種安定化溶解性及/或安定性的成份。助溶/安定劑的實例包括清潔劑，例如月桂基肌胺酸及/或聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。替代性的助溶/安定劑包括精胺酸和玻璃形成用多元醇(諸如蔗糖、海藻糖等)。許多藥學上可接受之載劑及/或藥學上可接受之賦形劑均屬習知，且敘述於諸如由E. W. Martin所著Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.,Easton,PA，第5版(975)。

因此，熟習本項技術人士可選擇適合的賦形劑和載劑，以製成一適於經由所選定的給予途徑而傳輸至一個體的調配物。

適用的賦形劑包括但不限於甘油、乙二醇(PEG)、山梨糖醇、海藻糖(trehalose)、N-月桂醯肌胺酸鈉鹽、L-脯胺酸、非清潔劑型硫代甜菜鹼(sulfobetaine)、鹽酸胍、尿素、三甲胺氧化物、KCl、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺和其他二價陽離子相關鹽類、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇和β-巰乙醇。其他的賦形劑可為清潔劑(包括：聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯、Triton X-00、NP-40、Empigen BB、辛基糖苷、月桂醯麥芽糖苷、兩性清潔劑3-08(Zwittergen 3-08)、兩性清潔劑3-0、兩性清潔劑3-2、兩性清潔劑3-4、兩性清潔劑3-6、CHAPS、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化鯨蠟基三甲基銨)。

本案所揭露的免疫原組成物亦包括一佐劑。就一適合給予個體以引發一對抗登革熱之保護性免疫反應的免疫原組成物而言，該佐劑是一種不含鋁的佐劑，其被選定成可引發一性中和抗體。在一具體例中，該佐劑引發一個均衡型Th1/Th2反應或是一個Th1偏向型免疫反應。此一免疫反應以產生γ-IFN為特徵。

該佐劑通常被選定成可在被給予該組成物的個體或一群個體體內促進一個均衡型Th1/Th2反應或是一個Th1偏向型免疫反應。例如，當免疫原組成物被給予一容易被登革熱所感染(或是受感染的風險升高)的特定年齡族群之個體時，該佐劑被選定成在個體或一群個體體內是安全且有效的。因此，當調配一含有失活登革熱病毒抗原的免疫原組成物以供給予新生兒或嬰兒個體(諸如介於初生至一週歲間的個體)或幼童(諸如介於初生至五週歲間的個體)時，該佐劑被選定成在新生兒和嬰兒及/或幼童體內是安全且有效的。

此外，該佐劑通常被選定成，當其經由一用以給予免疫原組成物的給予途徑進行給予時，可增進一個Th1免疫反應。例如，當免疫原組成物被調配成可供肌肉內給予時，佐劑係較佳為選定成包括有3D-MPL、鯊烯(例如QS21)、微脂體及/或油性和水性乳液。

一適於與失活登革熱抗原組合運用的佐劑為一無毒性細菌脂多醣衍生物。脂質A之適當無毒性衍生物的一個實例為單磷醯脂質A，特別是3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)。3D-MPL係由GlaxoSmithKline Biologocals N.A. 以MPL為商品名販售，且在本文件中皆稱為MPL或是3D-MPL。請參見諸如美國專利第4,436,727號；第4,877,611號；第4,866,034號以及第4,912,094號。3D-MPL主要是促進CD4+ T細胞反應，且具有IFN-γ(Th1)表現型。3D-MPL可依據GB2220211 A中所揭露的方法來製造。在化學上，它乃是一種由具有3、4、5或6個醯鏈的3-去醯基化單磷醯脂質A所構成之混合物。在本發明的組成物中，可使用小顆粒的3D-MPL。小顆粒的3D-MPL具有一個能夠無菌濾經0.22 μm濾器的顆粒尺寸。這些製劑係敘述於WO 94/21292。

可以在每劑免疫原組成物之人用劑量中為介於1和100微克間的用量來運用一諸如3D-MPL的脂多醣。這種3D-MPL可在一為約50微克的位準下進行使用，例如介於40-60微克之間，較佳為介於45-55微克之間或介於46-54微克之間，或是介於47-53微克之間或介於48-52微克之間，或是介於49-51微克之間，或是位於50微克。在另一具體例中，舉例來說，為供給予嬰兒或幼童，免疫原組成物的劑量包含在每劑免疫原組成物之人用劑量中為位於約25微克之位準的3D-MPL分劑量。這種3D-MPL可在一為約25微克的位準下進行使用，例如介於20-30微克之間，較佳為介於21-29微克之間或介於22-28微克之間，或是介於23-27微克之間或介於24-26微克之間，或是25微克。在另一具體例中(例如，適合給予極為幼小的嬰兒)，免疫原組成物之人用劑量中包含一含有更低用量之3D-MPL的分劑量，其位於一為約10微克之位準，例如介於5-15微克之間，較佳為介於6-14微克之間，例如介於7-13微克之間或是介於8-12微克之間或是介於9-11微克之間，或是10微克。在另一具體例中，免疫原組成物之人用劑量包含一位於約5微克之位準的3D-MPL，例如介於1-9微克之間，或是介於2-8微克之間或是較佳為介於3-7微克之間或介於4-6微克之間，或是5微克。

在其他具體例中，如美國專利第6,005,099號和歐洲專利第0 729 473 B1號中所述，脂多醣可為β(1-6)葡萄糖胺聚二醣。依據這些參考文獻的教示內容，習於此藝者將能夠容易地製造出各種脂多醣，諸如3D-MPL。然而，這些參考文獻的內容各被納入於此以供參照。除了前述免疫刺激劑以外(在結構上類似於LPS或MPL或3D-MPL)，呈前述MPL結構之次部分的醯基化單醣和雙醣衍生物亦為適合的佐劑。在其他具體例中，該佐劑是脂質A的合成衍生物，其中某些被稱為TLR-4促效劑，且包括但不限於：OM174(2-去氧-6-o-[2-去氧-2-[(R)-3-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-o-膦酸基-β-D-葡萄呋喃糖基]-2-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]-a-D-葡萄呋喃糖基二氫磷酸鹽)，(WO 95/14026)；OM 294 DP(3S,9R)-3-[(R)-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-側氧基-5-氮-9(R)-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]癸-1,10-二醇,1,10-雙(二氫磷酸鹽)，(WO 99/64301和WO 00/0462)；以及OM 197 MP-Ac DP(3S-,9R)-3-[(R)-十二醯氧基十四醯基胺基]-4-側氧基-5-氮-9-[(R)-3-羥基十四醯基胺基]癸-1,10-二醇,1-二氫磷酸鹽10-(6-胺基己酸鹽)(WO 01/46127)。

其他可供運用的TLR4配體為胺基葡萄糖苷磷酸烷酯(AGPs)，諸如在WO 98/50399或美國專利第6,303,347號中所揭露者(亦揭露用以製備AGPs的方法)，較佳為RC527或RC529或是AGPs在藥學上可接受之鹽，如美國專利第6,764,840號中所揭露者。有些AGPs為TLR4促效劑，而有些為TLR4拮抗劑。兩者皆被認為是可供用作為佐劑。

其他能夠經由TLR-4而導致一訊息傳導反應的適當TLR4配體(Sabroe et al. JI 2003 p1630-5)為諸如源自於格蘭氏陰性細菌的脂多醣及其衍生物，或是其片段，特別是LPS的無毒性衍生物(諸如3D-MPL)。其他適用的TLR促效劑為：熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；界面活性劑蛋白質A、透明質酸寡醣、硫酸乙醯肝素片段、纖維黏連蛋白片段、纖維蛋白原肽和b-防禦素-2，以及胞壁醯二肽(muramyl dipeptide；MDP)。在一具體例中，TLR促效劑為HSP 60、70或90。其他的適用TLR-4配體敘述於WO 2003/011223和WO 2003/099195中，諸如WO 2003/011223第4-5頁或WO 2003/099195第3-4頁中所述化合物I、化合物II和化合物III，特別是WO 2003/011223中所揭露的ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764等化合物。例如，一種適用的TLR-4配體為ER804057。

其他可供用於含失活登革熱病毒抗原之免疫原組成物中而諸如與3D-MPL或本案所述其他佐劑相組合的佐劑為皂苷，諸如QS21。

皂苷被教示於：Lacaille-Dubios,M and Wagner H.(1996,A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)。皂苷是廣泛分佈於植物和海洋動物中的甾類或三萜糖苷。皂苷以在水中會形成振盪後起泡的膠體溶液且會使膽固醇沈澱著稱。當皂苷接近細胞膜時，它們會於膜內產生通孔類結構，而使膜綻開。紅血球的溶血是此一現象是一個例子，此乃是某些但非所有皂苷的性質。

皂苷已知可在系統性給予的疫苗中作為佐劑。個別皂苷的佐劑和溶血活性已於本項技術中進行廣泛的研究(Lacaille-Dubiosand Wagner，同前)。例如，Quil A(來自於南美皂皮樹Quillaja saponaria Molina的樹皮)及其部分分離部分係敘述於美國專利第5,057,540號以及“Saponins as vaccine adjuvants”,Kensil,C.R.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst,1996,12(1-2): 1-55；以及歐洲專利第0 362 279 B1號中。包含有Quil A的部分分離部分並被稱為免疫刺激複合物(ISCOMS)的微粒結構具有溶血性，且已供用於製造疫苗(Morein,B.，歐洲專利第0 109 942 B1號；WO 96/11711；WO 96/33739)。溶血性皂苷QS21和QS17(經HPLC純化之Quil A部分分離部分)已被敘述為強效的系統性佐劑，且彼等之製造方法敘述於美國專利第5,057,540號和歐洲專利第0 362 279 B1號中，這些專利案的內容被納入於此以供參照。其他已供用於系統性疫苗施打研究的皂苷包括來自於諸如滿天星(Gypsophila)和皂草(Saponaria)等其他植物物種者(Bomford et al.,Vaccine,10(9): 572-577,1992)。

QS21是一個經HPLC純化之無毒性部分分離部分，來自於南美皂皮樹的樹皮。美國專利第5,057,540號述及一種用以製造QS21的方法。WO 96/33739中述及含有QS21的非致反應性佐劑調配物。前述參考文獻的內容被納入於此以供參照。諸如QS21等具免疫活性皂苷可以在每劑免疫原組成物之人用劑量中為介於1和50微克間的用量來運用。較佳地，QS21係在每劑免疫原組成物之人用劑量中為介於約1和100微克之間的位準下進行使用。舉例而言，QS21可在一為約50微克的位準下進行使用，例如介於40-60微克之間，較佳為介於45-55微克之間或介於46-54微克之間，或是介於47-53微克之間或介於48-52微克之間，或是介於49-51微克之間，或是位於50微克。在另一具體例中，舉例來說，為供給予嬰兒或幼童，免疫原組成物的劑量包含一為25微克的分劑量，例如介於20-30微克之間，較佳為介於21-29微克之間或介於22-28微克之間，或是介於23-27微克之間或介於24-26微克之間，或是25微克。在另一具體例中，免疫原組成物之人用劑量中包含位於約10微克之位準的QS21，例如介於5-15微克之間，較佳為介於6-14微克之間，例如介於7-13微克之間或是介於8-12微克之間或是介於9-11微克之間，或是10微克。在另一具體例中，免疫原組成物之人用劑量包含一位於約5微克之位準的QS21，例如介於1-9微克之間，或是介於2-8微克之間或是較佳為介於3-7微克之間或介於4-6微克之間，或是5微克。經顯示，這些包含QS21且更包含有膽固醇的調配物(較佳為配製成微脂體調配物)，當與一抗原共同調配時，可為成功的Th1刺激型佐劑。因此，舉例來說，失活登革熱病毒抗原可較佳為與一佐劑共同運用於免疫原組成物中，而該佐劑包含有一由QS21和膽固醇所構成的組合。

由不同佐劑所構成的組合，例如前文所述諸佐劑所構成者，亦可與失活登革熱病毒抗原共同運用於組成物中。例如，如前所述，QS21可與3D-MPL共同調配。QS21：3D-MPL的比例通常位於1:10至10:1的等級；諸如1:5至5:1，且經常實質為1:1。通常來說，3D-MPL：QS21的比例係位於2.5:1至1:1的範圍內。有關於這些組合的調配物和劑量之進一步細節，特別是適合給予嬰兒和幼童的劑量(分劑量)，可見於WO 2007068907和US 2008-0279926中，這些專利案的內容被納入於此以供參照。當組合調配時，此一組合可促進抗原專一性Th1免疫反應。

在一些情形中，佐劑組成物包括一水包油乳液。

水包油乳液的一個實例包含一諸如鯊烯的可代謝性油、一諸如生育酚的母育酚(例如α-生育酚)，以及一諸如聚山梨醇酯80或Tween 80的界面活性劑，配於一水性載劑內，且不含有任何其他的免疫刺激劑，特別是它不含有無毒性脂質A衍生物(例如3D-MPL)或皂苷(例如QS21)。這些水性載劑可為諸如經磷酸鹽緩衝化的生理食鹽水。此種水包油乳液的一個較佳實例在此指名為AS03。此外，水包油乳液可含有脫水山梨醇三油酸酯(SPAN 85^TM)及/或卵磷脂及/或三辛醯甘油酯(tricaprylin)。水包油乳液的另一個實例為MF59，其為一種以鯊烯為主的乳液系統，由Novartis Vaccine and Diagnostics所販售。

在本發明的另一具體例中係提供一種疫苗組成物，其包含一抗原或抗原組成物，以及一含水包油乳液的佐劑組成物，且任擇地包含一或多種其他免疫刺激劑，其中該水包油乳液包含0.25-10毫克之可代謝性油(較佳為鯊烯)、0.25-11毫克之母育酚(較佳為生育酚，例如α-生育酚)以及0.125-4毫克之乳化劑。在一些情形下，例如供用於給予兒童時，水包油乳液係呈標準成人劑量之1/2、1/4或1/8的分劑量。有關於適合與失活登革熱病毒疫苗組合運用的水包油乳液之分劑量可見於WO 2008043774、USSN 12/445,090中，這些專利案的內容被納入於此以供參照。

在一特定具體例中，佐劑調配物包括3D-MPL，其被備成諸如水包油乳液的乳液形式。在一些例子中，如WO 94/21292所揭露者，乳液具有一低於0.2 μm直徑的小顆粒尺寸。例如，3D-MPL的顆粒可微小至足以無菌濾經一個0.22微米的薄膜(如歐洲專利第0 689 454號中所述)。任擇地，3D-MPL可被製備成一微脂體調配物。任擇地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐劑亦包括另一免疫刺激性成份。

舉例而言，當一含有失活登革熱病毒抗原的免疫原組成物被調配成供給予一嬰兒時，佐劑的劑量係被釐定成在一嬰兒個體體內有效且相對不具致反應性。一般來說，佐劑在一嬰兒用調配物內的劑量相較於供給予成人(例如65歲或更年長的成人)之調配物中所使用者為低。例如，3D-MPL的用量通常位於每劑為1微克-200微克的範圍內，諸如每劑為10-100微克或是10微克-50微克。嬰兒劑量通常位於此範圍的下限，例如由約1微克至約50微克，諸如由約2微克或約5微克或約10微克至約25微克或約50微克。通常，當調配物中使用QS21時，該範圍可類推(依據前文所述比例)。就成人和年長者族群而言，調配物通常包括相較於嬰兒用調配物中所常見的佐劑成份更多的佐劑成份。在運用水包油乳液的特定調配物中，此一乳液可包括其他的成份，例如膽固醇、鯊烯、α-生育酚及/或一諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯()或脫水山梨醇三油酸酯的清潔劑。在例示性的調配物中，這些成份可呈下列用量：約1-50毫克之膽固醇、2至10%之鯊烯、2至10%之α-生育酚以及0.3至3%之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(均以體積/體積比來表示)。通常，鯊烯：α-生育酚之比例等於或低於1，因為此一比例會提供更安定的乳液。在一些例子中，調配物亦可含有一安定劑。

一免疫原組成物通常含有一免疫保護量(或其分劑量)的抗原，且可藉由習用技術製得。免疫原組成物的製備，包括供給予人類個體之免疫原組成物的製備，係一般性地敘述於由Powell和Newman所編著的Pharmaceutical Biotechnology,Vol. 61 Vaccine Design- the subunit and adjuvant approach，Plenurn Press，1995。由Voller等人所編著的New Trends and Developments in Vaccines，University Park Press,Baltimore,Maryland,U.S.A. 1978。微脂體囊封技術敘述於諸如Fullerton的美國專利第4,235,877號中。將蛋白質綴連至巨分子上的技術係揭露於諸如Likhite的美國專利第4,372,945號以及Armor等人的美國專利第4,474,757號中。

通常來說，各劑免疫原組成物內的抗原含量被選定成一可在典型個體中引發免疫保護性反應而不會產生明顯不良副作用的含量。從此一角度來說，免疫保護性不必然意味著提供完全保護免於感染；其意指提供保護免於症狀或疾病，特別是與病毒相關的嚴重疾病。抗原含量可依據所使用的專一性免疫原而變化。一般預期，各個人用劑量包含有0.05-100微克之失活病毒，例如約0.1微克(諸如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5微克)至約50微克，例如約0.5微克至約30微克，例如約1微克、約2微克、約3微克、約4微克、約5微克、約10微克、約15微克、約20微克或是約25微克之各個失活登革熱病毒株。免疫原組成物中所使用的含量係依據個體族群(例如嬰兒)進行選定。用於一特定組成物中的最佳含量可藉由涉及觀察個體內之抗體效價和其他反應的標準研究來確定。初次施打疫苗後，個體可於適當時間間隔後(例如約4週)再接受一追加劑。

應注意的是，無論所選定的佐劑為何，其在最終調配物內的濃度必定要計算成為對於標的族群具有安定性和有效性。舉例而言，用於在人體內引發一免疫反應以對抗登革熱病毒的免疫原組成物係較佳為可給予嬰兒(例如介於初生至1週歲間的嬰兒，諸如介於0至6個月間者，位於初次施打的年齡)。用於引發一免疫反應以對抗登革熱的免疫原組成物亦較佳為可給予成人(例如，單獨給予，抑或在「旅行者」疫苗的情形下與其他病原之抗原組合給予)。咸明瞭，在這些不同的應用中，佐劑的選擇可能相異，而各個情況下的最佳佐劑和濃度可為習於此藝者經實驗測定。

用於在一個體內引發一免疫反應以對抗登革熱的方法亦為本案的一個技術特徵。這些方法包括將一免疫有效量之組成物給予一個體，諸如一人類個體，該組成物包含一失活登革熱病毒抗原，以及一不含鋁之佐劑。例如，該組成物包括一能夠引發一個Th1偏向型免疫反應的佐劑。該組成物被調配成可引發一對於登革熱具有專一性的免疫反應，亦即，該組成物被調配成獲致一個Th1偏向型免疫反應，該免疫反應可降低或預防被登革熱病毒所感染及/或降低或預防被登革熱病毒感染後的病理反應。

通常來說，疫苗被製備成呈液體溶液或懸浮液的注射劑；亦可製備成適合在注射前溶解於或懸浮於液體中的固體形式。雖然組成物可經由許多途徑進行給予，但最普遍者為令免疫原組成物經由肌肉內、皮下或皮內給予途徑來傳輸。一般而言，疫苗可呈一有效於產生中和抗體並提供保護的劑量而經由皮下、皮內或肌肉內給予。疫苗係以可與劑型調配物相容的方式且呈在預防上及/或治療上有效的用量來給予。給予量係大致上位於每劑中含有0.05-100微克的各個失活病毒株，依據所欲治療的個體、個體之免疫系統在合成抗體上的能力以及所希望的保護程度而定。所給予以疫苗的精確用量可依據實施者的研判而定，且可以是個別個體所特有的。

疫苗可以單劑施打進程給予，抑或較佳為以多劑施打進程給予，在多劑施打進程中，主要施打疫苗過程可具有1-10劑，隨後在後續時間間隔給予所需要的其他劑，以維持及/或強化免疫反應，例如，在1-4個月給予第二劑，且若有需要，在數月或數年後給予後續各劑。該施打程序亦至少部分地由個人的需求來決定，且依據實施者的研究而定。適當免疫化進程的實例包括：第一劑，隨後於7日至6個月之間施打第二劑，並於初次免疫化後1個月至2年之間任擇施打第三劑，抑或是足以引發預期可提供保護性免疫力的病毒中和用抗體之效價的其他進程，諸如被選定成對應於確立的小兒用疫苗進程。經過由1至3次接種所構成的主要免疫化過程後，可合理地預期到失活病毒疫苗會產生資以對抗登革熱的保護性免疫力。經過某時間間隔(例如每隔兩年)，可補充被設計來將保護性免疫力維持在滿意位準的追加劑。

實例 實例I─含有經純化之失活登革熱病毒(1微克和10微克)及不含鋁佐劑的例示性免疫原組成物的免疫原性

以兩劑例示性疫苗候選物經肌肉內施打數個由15隻成年雌性C57B1/6小鼠所組成的群組，該例示性疫苗候選物含有登革熱-2型病毒株的純化型失活病毒(PIV)。疫苗是以50微升的總體積給予。以僅含有登革熱PIV的調配物，抑或是含有以Alum(氫氧化鋁)為佐劑之登革熱PIV疫苗的調配物、含有被吸附於氫氧化鋁上的3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)的調配物(AS04D)、含有水包油乳液的調配物(AS03A)，以及配於微脂體調配物內的3D-MPL和QS21的調配物(AS01B)，將小鼠予以免疫化(請參見下表1中所列各群組)。AS03A和AS01B是不含鋁之佐劑的兩個非限制性實例。調配用的登革熱PIV抗原係如本說明書所述主要是從野生型登革熱-2型(Den-2)病毒培養物於22℃下以0.185%福馬林予以失活7日所獲得的大量純化體。

本案所述實例均是針對施打疫苗後的CD4+頻率及中和效價藉由UNISTAT來進行統計學分析。進行變數分析所使用的流程可概述如下：令數據進行對數變換；對於各族群(群組)進行Shapiro-Wilk測驗，以驗證群組分佈常態；進行Cochran測驗，以驗證不同族群(群組)間的變數均一性；就選定數據進行變數分析；就單因子變異數分析(one-way ANOVA)的交互作用進行測驗；進行Tukey-HSD測驗，以進行多重比較。

在第一次免疫化(設定為第0日)和第二次免疫化(第21日)後21日，亦即，在免疫化後的第21和42日，測量體液免疫反應。利用抗登革熱中和分析法來測試血清樣品。簡言之，為了測量小鼠血清對於登革熱病毒的中和效價，將經過濾和熱失活的系列稀釋血清與定量單一專一性登革熱病毒(登革熱-2型)共同培育。隨後，將血清和病毒的混合物加入單層Vero細胞中(來自於WHO細胞庫)，並培育4日。運用ELISA檢測黏附於一個96-井孔微皿之Vero細胞上的細胞結合性病毒抗原，來測量血清樣品的病毒感染抑制力。所得到的光學密度讀數會被自動處理成為一個Excel試算表，其運用對數中點線性迴歸程式模型，而演算出感染病毒降低百分率(稱為微量中和50%降低率，或MN50)。病毒中和效價(MN50)被定義為稀釋血清在分析中之吸光值讀數上相較於不含血清的病毒劑量對照組(TV)達到50%降低率的數值倒數。

對於各群組在第21日所得到的集中血清以及在第42日所得到的個別血清，測定中和抗體效價。結果顯示於第1圖。在所測試的兩個劑量(1和10微克的總體蛋白質)上均觀察到相同的免疫學樣態。經過給予兩次1微克或10微克的登革熱PIV疫苗以後，相較於給予單劑組成物後所得到的反應，中和抗體的效價更為增進。對於受測試的兩種登革熱PIV疫苗劑量而言，觀察到未佐劑化之疫苗相較於佐劑化之登革熱PIV疫苗具有顯著更低的中和抗體反應(p<0.00001)。在10微克的總體蛋白質下，相較於僅以alum(AS22A)為佐劑的登革熱PIV疫苗所引發的反應，以AS04D為佐劑的登革熱PIV疫苗會引發出顯著更高的中和抗體反應(p=0.0027)。在1微克的總體蛋白質劑量下，此二種佐劑之間未觀察到差異(p>0.05)。如第1圖所示，相較於含有AS04D或AS22A的組成物，以任一不含鋁之佐劑為佐劑的組成物會顯著引發更高的中和抗體反應(AS03A(p<0.0173)或AS01B(p<0.0001))。以AS03A和AS01B為佐劑的登革熱PIV疫苗引發相似位準的中和抗體效價(P>0.05)。

這些結果顯示，在1或10微克的登革熱PIV總體蛋白質劑量下，相較於相同抗原與一含鋁佐劑相組合所引發的反應(例如AS22A或AS04D)，運用一包含不含鋁之佐劑系統(以此處中所示AS03A或AS01B為例)的組成物所免疫化的小鼠中會觀察到較高的中和抗體效價。

實例II─含有經純化之失活登革熱病毒(1微克和10微克) 及不含鋁之佐劑的例示性免疫原組成物在佐劑之不同稀釋物下的免疫原性

以兩劑例示性登革熱PIV疫苗以50微升的總體積經肌肉內施打數個由15隻成年雌性C57B1/6小鼠所組成的群組。以僅含有登革熱PIV的調配物，或是以含有以Alum(AS22A，氫氧化鋁)為佐劑之登革熱PIV抗原的調配物，抑或是以例如AS04D標準劑量的(AS04D/2)、AS03B(含有5.93毫克生育酚之以水包油乳液為主的佐劑系統)以及AS01E(AS01B的一半劑量)等不同佐劑系統的稀釋物為佐劑者，將小鼠予以免疫化(詳見下表2)。調配用的PIV係如本說明書所述主要是從野生型登革熱-2型(Den-2)病毒培養物於22℃下以0.185%福馬林予以失活7日所獲得的大量純化體。

在進行第一次和第二次免疫化後21日(分別在第21和42日)，測量15隻小鼠/群組對於免疫化的體液免疫反應。藉由前述中和分析法來檢驗血清樣品。

各群組在第21日所得到之集中血清以及各群組在第42日所得到之個別血清的中和抗體效價顯示於第2圖。在所測試的兩個劑量(1和10微克的總體蛋白質)上觀察到相同的免疫學樣態。相較於僅單次給予1微克或10微克的登革熱PIV抗原後所得到的反應，經過給予兩次免疫原組成物以後可觀察到更高的中和抗體效價。對於受測試的兩種登革熱PIV疫苗劑量而言，觀察到未佐劑化之疫苗相較於佐劑化之登革熱PIV調配物具有顯著更低的中和抗體反應(p<0.00001)。在1微克的總體蛋白質下，相較於僅以alum為佐劑的登革熱PIV疫苗所引發的反應，以AS04D/2為佐劑的登革熱PIV疫苗會引發出相似的中和抗體反應(p>0.05)。對於相同的受測疫苗劑量而言，以AS03B或AS01E為佐劑的登革熱PIV疫苗，相較於以AS04D為佐劑的疫苗(相對於AS03B為p≦0.029，而相對於AS01E為p≦0.00001)或以alum為佐劑的疫苗(相對於AS03B為p≦0.0035，而相對於AS01E為p≦0.00001)，會引發顯著更高的中和抗體效價。

綜言之，在1或10微克的登革熱PIV抗原總體蛋白質劑量下，相較於以一含鋁佐劑(AS22A或AS04D/2)為佐劑的相同抗原所引發的反應，運用一包含不含鋁之佐劑系統的稀釋物(AS03B或AS01E)的組成物所免疫化的小鼠中會觀察到較高的中和抗體效價。

實例III─含有經純化之失活登革熱病毒(2 μg和200 ng)及不含鋁之佐劑的例示性免疫原組成物在佐劑之不同稀釋物下的免疫原性

以兩劑例示性登革熱PIV疫苗以50微升的總體積經肌肉內施打數個由25隻成年雌性C57B1/6小鼠所組成的群組。以僅含有登革熱PIV抗原的調配物，或是以含有以Alum為佐劑(AS22A，氫氧化鋁)之登革熱PIV抗原的調配物，抑或是以例如AS04D(AS04D/2)、AS03B(含有5.93毫克生育酚之以水包油乳液為主的佐劑系統)以及AS01E(AS01B的一半劑量)等不同佐劑系統的稀釋物為佐劑者，將小鼠予以免疫化(這些群組詳見於下表3)。調配用的PIV抗原係如本說明書所述主要是從野生型登革熱-2型(Den-2)病毒培養物於22℃下以0.185%福馬林予以失活7日所獲得的大量純化體。

在進行第一次和第二次免疫化後14日(分別在第14和28日)，測量15隻小鼠/群組對於給予免疫組成物的體液免疫反應。藉由前述中和分析法來評價血清樣品。

各群組在免疫化後第7日時犧牲10隻小鼠，以藉由ICS並利用5組(各具有2脾臟)來評價細胞免疫反應。僅針對被以AS04D/2、AS03B、AS01E為佐劑的2μg登革熱PIV疫苗所免疫化的小鼠群組，以及被200ng之不含佐劑疫苗或以AS22A為佐劑之疫苗所免疫化的小鼠(群組1至5)，以及接受PBS的小鼠(群組9)，進行CMI的評價。在第一次免疫化(第14日)和第二次免疫化(第28日)後14日，收集其他15隻小鼠的血清。

針對各群組在第14日所得到之集中血清以及各群組在第28日所得到之個別血清，測得中和抗體效價。結果顯示於第3圖。相較於單次給予後所得到的效價，經過兩次給予2μg或200ng的登革熱PIV疫苗以後可觀察到更高的中和抗體效價。觀察到佐劑化之登革熱PIV調配物相較於未佐劑化之調配物具有顯著更高的中和抗體反應(p<0.0089)。在200ng劑量的登革熱PIV下，相較於調配有AS22A或AS04D/2的相同抗原所引發的反應，以AS03B和AS01E為佐劑的調配物會引發一實質更高的中和抗體反應。在較低的抗原劑量下，以AS22A和AS04D/2為佐劑的登革熱PIV在200ng劑量的總體蛋白質下會引發類似的中和抗體反應(p>0.05)。在2μg總體蛋白質的較高抗原劑量下，相較於AS03B為佐劑的疫苗，含有AS04D/2的調配物會引發類似的中和抗體反應(p>0.05)。但是，在較低的抗原劑量下(200ng)，含有AS03B的調配物相較於AS04D/2會引發顯著更高的中和抗體效價(p=0.0012)。有趣的是，以AS01E為佐劑的登革熱PIV相較於所有其他的群組會引發顯著更高的中和抗體效價(p≦0.0028)。

細胞免疫反應亦在給予兩次組合有前述佐劑稀釋物的登革熱PIV之後進行評價。CD4+ T細胞的細胞激素反應係在第二次免疫化(第21日)之後7日藉由ICS進行評價(第4圖)。

未佐劑化之登革熱PIV疫苗相較所有其他的群組會引發較低度的CD4+ T細胞反應(p≦0.001)。相較所有其他群組中的小鼠，被以AS01E為佐劑的登革熱PIV疫苗所免疫化的小鼠體內引發了最高的CD4+ T細胞反應(p≦0.00001)。以AS22A、AS04D/2和AS03B為佐劑的登革熱PIV疫苗所獲得的CD4+ T細胞反應在統計學上無差異(p>0.05)。

綜言之，在以一包含不含鋁之佐劑系統(AS03B或AS01E)為佐劑的登革熱PIV疫苗所免疫化的小鼠中，相較於以氫氧化鋁(AS22A)為佐劑的此一疫苗所引發的反應，會觀察到較高的中和抗體效價。

簡言之，相較於被調配有含鋁佐劑(AS22A、AS04D或AS04D/2)的登革熱PIV所免疫化的小鼠，被調配有不含鋁之佐劑系統(諸如AS03B或AS01E，其不含alum)會引發實質更高的中和抗體反應和CD4+T細胞反應。這些結果顯示，有利的免疫原特性係歸因於調配有不含鋁之佐劑的登革熱PIV疫苗。

第1圖為一柱狀圖，顯示在初始CB57B1/6小鼠中的抗登革熱-2型中和抗體效價。

第2圖為一柱狀圖，顯示在初始CB57B1/6小鼠中的抗登革熱-2型中和抗體效價。

第3圖為一柱狀圖，顯示在初始CB57B1/6小鼠中的抗登革熱-2型中和抗體效價。

第4圖為一柱狀圖，顯示藉由在週邊血液細胞中進行胞內細胞激素染色來鑑定出細胞免疫反應。

Claims

一種免疫原組成物，其包含至少一種失活登革熱病毒抗原，以及一不含鋁且適用於投與至人類個體的佐劑，其中該佐劑包含水包油乳液及/或包含3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)及QS21的組合。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該至少一種失活登革熱病毒抗原係選自於由登革熱-1型病毒抗原、登革熱-2型病毒抗原、登革熱-3型病毒抗原和登革熱-4型病毒抗原所構成的群組中。
如申請專利範圍第1或2項之免疫原組成物，其中該登革熱病毒抗原為登革熱-2型病毒抗原。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該該至少一種失活登革熱病毒抗原為被殺死的完整病毒。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該佐劑包含一水包油乳液載劑，該水包油乳液載劑包含一可代謝性油、一母育酚(tocol)以及一乳化劑。
如申請專利範圍第5項之免疫原組成物，其中該可代謝性油為鯊烯(squalene)。
如申請專利範圍第5項之免疫原組成物，其中該母育酚為α-生育酚(α-tocopherol)。
如申請專利範圍第5項之免疫原組成物，其中該乳化劑包含一非離子性界面活性劑乳化劑。
如申請專利範圍第8項之免疫原組成物，其中該非離子性界面活性劑為聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其包含呈一為等於或低於1之比例的鯊烯和α-生育酚。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該佐劑被調配成一包含下列成份的劑量：2%至10%之鯊烯；2%至10%之α-生育酚；0.3%至3%之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
如申請專利範圍第11項之免疫原組成物，其中該佐劑被調配成一包含下列成份的劑量：10毫克至12毫克之鯊烯；10毫克至12毫克之α-生育酚；4毫克至6毫克之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
如申請專利範圍第11或12項之免疫原組成物，其中該佐劑被調配成一包含下列成份的劑量：10.68毫克之鯊烯；11.86毫克之α-生育酚；4.85毫克之聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該佐劑包含3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)及QS21的組合。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其中該佐劑包含配於一微脂體調配物內的3D-MPL及QS21。
如申請專利範圍第14項之免疫原組成物，其中該佐劑更包含膽固醇。
如申請專利範圍第14項之免疫原組成物，其中該佐劑更包含1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)。
如申請專利範圍第14項之免疫原組成物，其中該佐劑包含膽固醇、DOPC、3D-MPL及QS21。
如申請專利範圍第18項之免疫原組成物，其中該佐劑被調配成一包含下列成份的劑量：0.1至0.5毫克之膽固醇；0.25至2毫克之DOPC；10微克至100微克之3D-MPL；以及10微克至100微克之QS21。
如申請專利範圍第16項之免疫原組成物，其中膽固醇相對於QS21的比例為5：1(w/w)。
如申請專利範圍第16項之免疫原組成物，其中膽固醇相對於QS21的比例為1：1(w/w)。
如申請專利範圍第19項之免疫原組成物，其中該佐劑被調配成一包含下列成份的劑量：0.25毫克之膽固醇；1.0毫克之DOPC；50微克之3D-MPL；以及50微克之QS21。
如申請專利範圍第1項之免疫原組成物，其係供用於醫藥。
一種用於製造一登革熱疫苗的方法，其包含：提供至少一種經純化之失活登革熱病毒抗原；以及將該至少一種經純化之失活登革熱病毒抗原與一不含鋁且適用於投與至人類個體的佐劑共同調配，其中該佐劑包含水包油乳液及/或包含3-去醯基化單磷醯脂質A(3D-MPL)及QS21的組合。
一種如申請專利範圍第1至23項中任一項之免疫原組成物於製備藥物的用途，該藥物係在一個體中預防、改善或治療由登革熱病毒所造成之疾病。
如申請專利範圍第25項之用途，其中該個體小於5歲。
如申請專利範圍第26項之用途，其中該個體小於1歲。
如申請專利範圍第25或26項之用途，其中該疫苗係非經腸胃給予。