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TWI513474B - 衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物、其供處置皮膚老化、發炎與療癒之用途、以及獲得其等之方法 - Google Patents

衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物、其供處置皮膚老化、發炎與療癒之用途、以及獲得其等之方法 Download PDF

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TWI513474B
TWI513474B TW100111022A TW100111022A TWI513474B TW I513474 B TWI513474 B TW I513474B TW 100111022 A TW100111022 A TW 100111022A TW 100111022 A TW100111022 A TW 100111022A TW I513474 B TWI513474 B TW I513474B
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biomass
cells
cell
dedifferentiated
culture
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Inventor
Nicolas Steward
Anne Mandeau
Nathalie Castex-Rizzi
Original Assignee
Fabre Pierre Dermo Cosmetique
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Publication date
Application filed by Fabre Pierre Dermo Cosmetique filed Critical Fabre Pierre Dermo Cosmetique
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Description

衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物、其供處置皮膚老化、發炎與療癒之用途、以及獲得其等之方法
本發明之目的係一種衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物；包含該製備物之美容或皮膚組成物；以及其供處置皮膚老化、發炎與療癒之用途。
摩洛哥堅果樹(Argan)係一種屬於植物山欖科之喬木，其學名為Argania spinosa (L.) Scelles。
其習性與橄欖樹相似；其具有短且扭曲之樹幹。木頭非常堅硬以及緻密。樹枝非常多刺，且它們具有小型、矛尖形的、交替、短的(約2公分長)以及窄的葉子，其時常集結成簇。葉子係長綠的，但當嚴重乾旱的時候，它們會變枯並掉落。花係雌雄同株以及五個花瓣的。它們聚集成團繖花，在五六月開花。它們係綠黃色的。
摩洛哥堅果樹從5歲開始可產生果實。果實呈黃色、橢圓形無柄漿果，約4至5公分長。其之組成為果肉圍繞著含有2至3個黏在一起之平坦狀種子之堅果，每一個圍住富含油脂之杏仁狀的東西。
摩洛哥堅果樹係摩洛哥特有的，主要位於摩洛哥西南，Essaouira與Agadir之間。摩洛哥堅果樹森林涵蓋約830000公頃。
摩洛哥人最先開採摩洛哥堅果樹，係因為其特別堅硬的木頭可作為燃料供應。其它主要的傳統用途係最初用手萃取出來之油，但現在用壓榨機。此油第一用途係供食用；另一重要的應用係美容用品。果肉以及從此油生產衍生而來之殘留渣通常用於餵食動物。
從摩洛哥堅果樹中已發展出許多美容產品。已有許多針對該種子衍生而來之油的發明專利，例如利用溶劑獲得之油(專利案Fr 2 553 788)，富含非皂化物質之摩洛哥堅果油(專利案Fr 2 724 663)。
除了油之外之物質亦已經被申請專利，例如從在油萃取後獲得之種子渣中衍生而來之胜肽；油與從渣中衍生而來之胜肽之組合，供用於處置有關皮膚老化之問題(專利案Fr 2 756 183)。亦有一個有關摩洛哥堅果樹之葉子，從渣=從葉子取得之萃取物而來之蛋白質以及皂素之發明專利(專利案EP 1 213 025)、渣蛋白質(專利案EP 1 213 024)、渣皂素(專利案EP 1 430 900)。更近一些，寄存之專利申請案EP 1 968 536揭示從摩洛哥堅果樹果實之果肉中而來之萃取物於抗老化美容用品之用途。
因此，在皮膚和/或美容用途方面，對整個摩洛哥堅果樹之組成物均感興趣。
摩洛哥堅果樹係一種重要的資源植物，首先，生態上，因為其係一種“生態系統”植物。其完全適應乾旱之區域，其保護土壤免於水以及風之侵襲，因此防止沙漠推進摩洛哥。但亦經濟上的，因為其係具有多用途之樹木。
其為摩洛哥最重要的作物。因此，摩洛哥堅果樹森林受1925頒布之dahir(decree)之保護，聲明國家具有摩洛哥堅果樹森林之優先權，但當地居民具有使用權(果實、枯掉的木頭、摩洛哥堅果樹下之作物)。UNESCO最近將摩洛哥堅果樹森林歸類為生物圈保護區。
這就是為什麼使用其木頭或葉子於美容之用途，可能對此受保護之植物具有嚴重的後果。
另一個從植物中獲得有興趣之分子之方法，係製備全能性去分化細胞培養。使用去分化植物細胞亦可避免一些在發展美容用品期間遇到之工業化問題。有了細胞培養，不同植物批次或收成之間，有興趣物質之濃度的差異不見了。其亦為一種非破壞性技術，相對容易設定以及價格低廉。最後，其排除了萃取之需求，因為細胞在培養基中，且活性化合物不是在該培養基中，就是在細胞內之液體中。因此，簡單的研磨即可獲得此等化合物。
專利申請案WO03077881揭示一種供局部應用之組成物，含有至少一種去分化的以及經誘發的植物細胞體外培養物之均質物，用以合成至少一種植物抗毒素。植物材料較佳地衍生自藤蔓。
因此，此文件揭示可能為去分化以及經誘發的植物細胞之美容應用，誘發產生足夠量的次代謝物，使生物活性能在局部使用。
出奇地以及意外地，申請人已證實，衍生自去分化，但未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物，在抗老化、發炎以及療癒之領域中，具有良好的美容和/或皮膚活性。
所獲得之結果顯示出，特別在摩洛哥堅果樹方面，摩洛哥堅果樹細胞培養物(此例子係未經誘發的細胞)之另一應用可能落在上述之情況下。
此外，獲得本發明所揭示之製備物可排除誘發步驟之需求，誘發步驟在工業上係困難且昂貴的步驟；由於細胞生長緩慢，誘發會導致生物質產率低得多。
申請案WO03077881提到各種進行此誘發之方法，例如紫外線照射3天；二氧化碳24小時至2天；紫外線照射以及二氧化碳5天。
在本發明之架構下進行之方法(由細胞去分化從摩洛哥堅果樹衍生而來之植物材料，之後將細胞培養在懸浮液中構成)，可快速地產生此植物之細緻、豐富、均質以及無菌的生物質。細胞培養使其可能提供直接以細胞規模，生物合成此植物之途徑。
因此，本發明針對一種衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物；包含該製備物之美容或皮膚組成物；以及其於美容和/或皮膚醫學之用途；以及優先地用於處置皮膚老化、發炎以及療癒。
更一般地，呈懸浮液形式之植物組織體外培養物，提供一種產生直接從細胞之初級或次級代謝物衍生而來之活性有機化合物之方法。
懸浮液中之植物細胞係呈去分化狀態，其與用於動物細胞培養之幹細胞之狀態相似。因此，此等植物細胞理論上能夠產生在整個植物上觀察到之全部的代謝物。去分化會引起生物合成途徑之基因或表觀遺傳干擾，因此整個植株以及所產生之細胞株之間，化學特性之量與質相異。因此，理論上，在整個植株上不會觀察到之反應中間產物，可在細胞懸浮液中出現。此提供一個新的機會，可以取得“休眠的”化學生物多樣性。
就技藝目前之狀況而言，一般細胞培養之誘發作用(化學的、物理的、生物的)會刺激以及產生更多的次代謝物。在吾人本發明之方法中，吾人將證明，與大部分情況不同且出奇不意地，誘發不是必要的，且對生物質之生長以及所需之生物活性有害。
本發明之目的之一有關衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物。
“去分化植物細胞”意指任一種無任何特別特化的本質之植物細胞，換句話說係與天然狀態下植物之分生組織相似之生理狀態。此等細胞能夠自己生存，不依靠其它細胞。
去分化Argania spinosa 細胞係從樹上或幼枝摘取活的植物材料而來，包括葉子、葉柄、莖、樹皮、根、果實、種子、花以及花器或花苞，更特別地從葉子而來。
獲得該去分化細胞培養物之方法，可經任何熟悉此技藝之人士已知之體外方法獲得，例如，參考Murashige,T.,Skoog,F. 1962。A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496./Plant Culture Media,Vol-1 Formulations and Uses E. F. George,D. J. M. Puttock,and H. J. George(1987) Exegetics Ltd. Edington,Westbury,Wilts,BA134QG England。
依照本發明之製備物可藉由依順序進行下列步驟而得：
a)植物材料之殺菌，
b)該細胞之去分化，
c)於細胞懸浮液中放入無誘發劑之培養基，
d)在無誘發劑之培養基上，生物質增殖以及產生培養物，
以及獲得該製備物。
若目的係產生小量的生物質，則可在錐形瓶中製造製備物，若要大量生產，則在生物反應器中製造。例如，從錐形瓶中500ml的細胞懸浮液中收集到之乾生物質之平均數量為100g(即，200 g生物質/L細胞懸浮液)，而在10L生物反應器中收集到之平均乾生物質為3000g(300g/L的生物質)。
在生物反應器中之植物細胞培養，會遇到三種主要模式：
1.　不連續或分批培養，
2.　再充填/收取或分批補料培養，以及
3.　連續培養。
a.　植物材料殺菌步驟：
取Argania spinosa 之外植體以及更特別地葉子外植體，然後用次氯酸鈉或鈣溶液或氯化汞溶液，在室溫下淨化數分鐘。用無菌蒸餾水漂洗組織，之後在淨化結束後，用無菌蒸餾水至少清洗一次。
b.細胞去分化步驟
將淨化後之外植體置於層流操作台下，與其中已添加蔗糖以及生長因子(或荷爾蒙)之Murashige & Skoog瓊脂營養培養基接觸。此等生長荷爾蒙可控制外植體之細胞機制，藉以引起細胞分裂以及引起細胞群集或去分化的癒合組織(癒合組織發生)。每3至4週，將所獲得之癒合組織轉移到新的去分化營養培養基中。此培養基中之一些富含瓊脂之組份，會被癒合組織代謝掉或因空氣之作用而降解。
一般而言，以生長素(2-4二氯-苯氧基乙酸)以及細胞分裂素(激動素)為主的荷爾蒙組成物，經測試能成功地獲得快速以及徹底的去分化組織成易碎的癒合組織形式(癒合組織發生)，以及幫助傳移至液態培養基。將無菌的葉子外植體之近軸面放置成接觸由下列構成之瓊脂培養基：Murashige & Skoog培養基(Murashige,T.,Skoog,F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496)，具30g/L之蔗糖、8g/L之瓊脂、具0.5 mg/L之激動素以及0.75 mg/L之2--4二氯-苯氧基乙酸(24D)添加物，且在121℃(1巴)下高壓滅菌20分鐘前，調整至pH 6。將含有外植體之培養皿置於黑暗中，28℃下培育。該一癒合組織在2週後出現。每3-4週，將所獲得之癒合組織轉移至新的培養基中，用解剖刀分開該癒合組織，保持在2至3分公之大小。此等轉移持績2至6個月，直到獲得易碎的癒合組織。
c.　在無誘發劑之培養基中製造細胞懸浮液之步驟。
連續的轉移癒合組織於瓊脂培養基上之細胞去分化，導致易碎的癒合組織之形成。此細胞之間凝聚力之下降係去分化之結果，取決於植物，其可能在二至六個月之間發生。此狀態適合於轉移至液態培養基，因為其保證癒合組織瓦解成細胞懸浮液，同時使包含之機械應力減至最小。因此，將收集的易碎癒合組織引入(10-20體積%)至使用與瓊脂去分化培養基相同，但沒有明膠劑之配方製成之液態營養培養基。
因此該易碎的癒合組織，經振盪檯歷時2至3天之作用，崩散於液態培養基中，且所獲得之細胞懸浮液除去所有無崩散之癒合組織部分，因此形成均質的細胞懸浮液。使此懸浮液保持在培養物中，以獲得足夠密集的細胞總數。在此階段，進行該懸浮液之(繼代培養)或將該懸浮液稀釋於新的營養培養基中，然後以相同之方式開始培養。
最初的細胞懸浮液可藉由將約20至40 g之易碎的癒合組織置於500ml含有200 ml培養基之錐形瓶中開始。藉由振盪檯在115 rpm下2至3天之作用(在黑暗中29℃下)，該易碎的癒合組織因此崩散於液態培養基中。之後使用移液管收集細胞漂浮物，分開無崩散的殘留癒合組織群集。該細胞漂浮物因此形成均質細胞懸浮液。將此懸浮液保持在培養物中，以獲得“足夠”密集的細胞總數。培養所獲得之細胞懸浮液15天，之後藉由1：5稀釋於新的培養基中進行增殖，歷時相同的期間。調整培養基之組成(營養物、生長因子等等)，以便使生物質生產率最佳化。結果係最適合液態細胞懸浮液之ARGMS生物質增殖培養基(見表1)。此培養基係用於癒合組織發生之Murashige & Skoog培養基經修飾之版本。藉由添加KOH，將此培養基調整至pH 6，接著在121℃(p=1巴)下高壓滅菌20分鐘或通過0.2μm過濾消毒。
d.　在無誘發劑之培養基上，生物質增殖以及產生培養物。
在執行數次此繼代培養後，當所獲得之細胞密度在一段時間之內恆定時，細胞懸浮液亦穩定下來。為了使生物質生長率達到最大值，之後可能調整培養基之組成(營養物、生長因子等等)。於本發明之一特別具體例中，用作為生物質生產工具之最佳化的培養基係表1所述之培養基。
過濾細胞懸浮液，以便將其與胞外培養基或培養物漂浮物分開，然後使收集而得生物質於蒸餾水中回到懸浮液之狀態，然後在0℃下研磨。將獲得之均質物冷凍乾燥，或離心以便在冷凍乾燥之前淨化它。
使在“最佳”條件下製得之細胞培養穩定下來，然後將其保持在錐形瓶中(增殖培養)，每15天以1：5之比率稀釋該細胞懸浮液。此相當於接種約60g/L之新的生物質，在15天後產生約300g/L之細胞懸浮液之細胞培養，或視需要可接種於生物反應器中進行培養。
在錐形瓶或生物反應器中獲得之製備物可由下列構成：
-　細胞懸浮液(在本發明之目的方面，“細胞懸浮液”意指在其等培養基中之細胞(即，生物質))；
-　生物質(在本發明之目的方面，“生物質”意指與培養基分開之細胞群集，即，過濾後之細胞懸浮液；
-　於蒸餾水中還原成(或沒有還原)懸浮液後之研磨的(ground)生物質；
-　經離心或過濾研磨之生物質之淨化的汁液或漂浮物；
-　培養漂浮物(在本發明之目的方面，“培養漂浮物”係在培養期間，其中細胞仍存在之培養基，或細胞外培養基)。
不管關係到的是細胞懸浮液、生物質或研磨的生物質之漂浮物，其等均可以冷凍形式保持未改變之狀態，或添加保存物質，諸如苯氧-2-乙醇、苯甲醇或在歐洲指令之附錄VI中有關美容產品，標題“List of conservation agents that may be present in cosmetics”中出現之任何其它的保存產品。其等亦可稀釋於美容學上可接受之介質中，諸如乙二醇(丙二醇、丁二醇、聚乙二醇等等)，比例從10變化至60%。細胞懸浮液或生物質亦可經研磨，之後就以這樣的形式冷凍保存，或藉由添加保存物質或以上所述之介質。
研磨或不研磨，細胞懸浮液、生物質或生物質漂浮物亦可利用冷凍乾燥或霧化，然後就以這樣的形式保存，或在麥芽糊精、乳糖或二氧化矽類型之介質上或任何其它美容上可接受之介質上乾燥。
最後，細胞懸浮液可經由親和性色層分析，以有用的化合物增富：吸附在樹脂上(AmberliteXAD-21a類之聚苯乙烯共聚物等等)上，然後用諸如乙醇之適當的溶劑洗提。
以本發明之方法在最佳收集日(即，平均約15天)獲得之新鮮生物質，相當於約100至500克/升懸浮液，更佳地介於200與350克/升懸浮液之間。
下表陳述所獲得之產率(產率單位：克所獲得之產物/升細胞懸浮液)：
本發明亦有關美容或皮膚組成物，其包含如上所述之衍生自未經誘發之去分化摩洛哥堅果樹細胞的培養物之製備物作為活性組份。
較佳地，該製備物之量介於該組成物之總重量之0.1以及10%之間。甚至更佳地，該萃取物之量介於0.2%與5%之間。
本發明之美容組成物最好可呈任一種常用於局部或口服施用之美容用品之蓋侖(galenic)形式，較佳地局部施用。在經局部途徑投與方面，蓋侖形式可為乳霜、凝膠或軟膏或噴霧劑。口服配方擇自於包含下列之群組：錠劑、膠囊以及可供飲用之懸浮液之粉末。
本發明之美容組成物亦包含平常美容學上可相容之賦形劑。
可與美容組成物相容之平常的賦形劑，可為熟悉此技藝之人士已知之賦形劑中之任何一種，以便獲得該等如以所述，供局部施用之美容組成物。
本發明之美容和/或皮膚組成物可特別含有添加劑以及配方助劑，諸如乳化、清潔、發泡類型的界面活性劑等、錯合劑、增稠劑、膠凝劑、安定劑、保存劑，包括抗微生物劑以及抗氧化劑、調節劑、酸化劑、鹼化劑、軟化劑、著色劑以及香料。
發明人亦已證明，衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物具有下列活性：
-　抗氧化、抗自由基活性，以便限制有關內在以及外在老化之氧化過程以及發炎過程。
-　細胞外基質之活性，以便透過抑制金屬蛋白酶降解膠原蛋白，改善成人皮膚之機械特性(堅實、彈性、強度)。
最後，本發明有關在此所述之組成物，供用於處置皮膚老化、發炎以及療癒。
下列提供之範例係非限制性範例。
用於產生如本發明之製備物之範例
範例1：新鮮生物質/過程在錐形瓶中進行
分數批，依序對摩洛哥堅果樹葉子，較佳地3至4個月大之葉子進行殺菌：70%酒精1分鐘、2%次氯酸鈉3分鐘，之後用連續的脫礦質水浴沖洗持續8分鐘以及10分鐘。
使經滅菌之葉子外植體之近軸面與由下列構成之瓊脂培養基接觸：Murashige & Skoog培養基(Murashige,T.,Skoog,F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496)，具30g/L之蔗糖、8g/L之瓊脂，補充有0.5 mg/L之激動素以及0.75 mg/L之2-4二氯-苯氧基乙酸(2.4-D)，在121℃(1巴)下高壓滅菌20分鐘前，將pH調整至6。將含有外植體之培養皿置於黑暗中28℃下培育，增殖直到獲得易碎的以及安定的癒合組織。
最初的細胞懸浮液可藉由將約40 g之易碎的癒合組織置於500ml含有200 ml經高壓滅菌的培養基(組成述於以上提及之表1中)之錐形瓶中製得。
令培養物留在振盪檯上，在115 rpm下1週(黑暗中29℃)。之後用移液管收集細胞漂浮物，留下殘留的癒合組織群集。培養所獲得之細胞懸浮液15天，之後以1：5稀釋於新培養基中進行增殖，歷時相同的期間。
之後在真空下過濾該懸浮液，然後回收生物質。所獲得之新鮮生物質之產率為168 g/L。
將該生物質保持在-20℃下。
範例2：乾生物質
範例2a：乾生物質/過程在生物反應器中，分批培養進行
將四個如範例1中所述獲得之500ml細胞懸浮液錐形瓶，一起放在接種設備中，形成2L之接種體，將其倒入10L之生物反應器中，過程無菌。於此生物反應器中充填8L之最佳培養基(見表1)，補充30mg/L之前經滅菌之抗發泡劑，之後冷卻，然後利用該生物反應器殼內封閉式電路中之恆溫控制式水循環，保持在29.5℃下。
藉由飽和校正氧探針，然後將數據輸入電腦化的即時pO2 調整裝置。此裝置藉由注入無菌純氧進入該充氣系統，保持pO2 在80%。此生物反應器在流出氣體處(頂部空間)亦裝設有CO2 線上測量裝置，其在相同時間輸入數據至電腦化pCO2 調整裝置，以保持pCO2 在6%。此可藉由注入無菌大氣空氣進入混合氧之充氣裝置達成。該生物反應器亦裝設有螺旋槳式攪拌系統，轉速75RPM，用以攪拌細胞懸浮液，避免其沈積。在該生物反應器之出口側設置自動裝置，以便能無菌取樣以及監控生物質。
使分批培養保持在此等恆定溫度以及溶解的氣體條件下15至17天，以達到細胞密度280至320g/L之新鮮生物質。在此培養完全時，倒空生物反應器，之後在使用Bchner漏斗之過濾器上過濾，收集生物質。
使用“超音波清洗機”，冷研磨溶於相同容積的蒸餾水中之收集到之新鮮生物質，然後冷凍乾燥。
範例2b：乾生物質/過程在分批補料式培養10.0.0.1生物反應器中進行
如範例2a所述，將四個500ml細胞懸浮液錐形瓶用作為接種體。以範例2a中所示之方式製備生物反應器。以範例2a中所示方式製備溶解的氣體、溫度以及攪拌調整系統。
使最初的培養物維持在此等恆定溫度以及溶解氣體條件下15至17天，直到細胞密度到達280至320g/L之新鮮生物質。在此最初培養完全時，取出10L生物反應器中80%之內容物。之後收集8L之細胞懸浮液。在使用Bchner漏斗之過濾器過滤，收集此懸浮液中之生物質。收集到2240g至2560g之新鮮生物質。當冷卻時，使用超音波清潔器研磨溶於相同容積之蒸餾水中之收集到的新鮮生物質，然後冷凍乾燥。獲得100至130克冷凍乾燥的生物質。
在收集80%部分之同時，將8L事先經高壓滅菌以及冷卻的ARGMS培養基倒入生物反應器(含2L之細胞懸浮液)中，以便使培養體積回到10L。使分批補料式培養維持在此等恆定溫度以及溶解氣體條件下5至7天，直到細胞密度到達280至320g/L之新鮮生物質。此培養比該最初的培養快(較大的生產率)，因為生物質係呈持久的生理學細胞分裂狀態，因此倒新的營養培養基之特徵在於潛等期小於24個小時，且直接擴張生物質。在此分批補料式培養結束時，移除10L生物反應器中之80%。之後收集8L之細胞懸浮液。在使用Bchner漏斗之過濾器上過濾，收集此懸浮液之生物質。之後如之前，重啟培養。
範例2c：乾生物質/過程在連續培養生物反應器中進行
如範例2a所述，將四個500ml細胞懸浮液錐形瓶用作為接種體。以範例2a中所示之方式製備生物反應器。以範例2a中所示之方式製備溶解的氣體、溫度以及攪拌調整系統。
使最初的培養物維持在此等恆定溫度以及溶解氣體條件下10天，直到細胞密度到達150g/L以及瞬間新鮮生物質生長速率到達0.2 d-1 。在此階段，每1小時又20分鐘移除10L生物反應器中1.2%之內容物。此等樣本自動藉由倒入相同體積的新ARGMS至該生物反應器中補充。此方法維持細胞在恆定生理狀態以及細胞密度。
之後收集100至120ml之細胞懸浮液。在使用Bchner漏斗之過濾器上過濾，收集此懸浮液中之生物質。從每一樣本中收集到15g至18g之新鮮生物質。使用超音波清潔器冷磨溶於相同容積之蒸餾水中之新鮮生物質。每次的提取獲得之結果為0.71至0.85g之冷凍乾燥的生物質。之後維持該培養至少60天。理論上，其可能無時間限制的維持它。
連續培養比之前的模式好之優點在於，不需要再次製備需要清洗以及滅菌的生物反應器以及沒有細胞潛等期。抽取1至1.5%之細胞懸浮液後，自動以新的培養基補充於該生物反應器中，使在生物反應器中進行之培養基之組成產生最小的變化。因此，細胞總數不會有在其它培養模型中所觀察到，因潛等期產生之生物質體積產率的損失，而需製造任何的代謝重調整。
範例3：新鮮生物質漂浮物，該生物質係以如範例2a中所述之方式獲得
令20g以範例2a中所述之方式獲得之新鮮研磨的生物質，在10000g下離心15分鐘，然後收集漂浮物。之後冷凍乾燥。
平均產率係每克的新鮮生物質，產生30mg之冷凍乾燥漂浮物。
美容組成物之範例：
範例4：H/E配方
範例5：E/H配方
範例6：抗氧化活性之評估
化學發光
此方法利用光化學信號而產生自由基(過氧化自由基O2 °- )。氧化之強度比在正常條件下大1000倍。利用化學發光進行偵測，且用於評估油溶性或水溶性抗氧化萃取物或分子。結果以相等量的維他命C或Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)表示。敏感性係1奈莫耳級數。
結果之分析取決於二個標準，即曲線之形狀(積分)以及軟體所給的數值(奈莫耳)(Igor Popov and Gudrun Lewin. Methods in enzymology[44] vol 300. 437-456;Maibach I Howard and coll. Journal of Cosmetic Dermatology Vol 7(2) 96-100(2008))。
結果以欲獲得活性相當於1μg標準物(=Trolox)測得之活性時所需之樣本的μg表示(ACL Kit)。
結果：
於此測試中研究之抗氧化活性，代表化學發光專一地捕捉超氧化陰離子之能力。
依照範例2a製得之冷凍乾燥的生物質以及依照範例3製得之研磨的冷凍乾燥生物質之漂浮物，具有大致相等的抗自由基補捉活性。
獲得與1 μg之Trolox測得之活性相當之活性時，需要278 μg之冷凍乾燥生物質：活性相當於輔酶Q10，參考抗氧化分子。
獲得與1 μg之Trolox測得之活性相當之活性時，需要171 μg之研磨的冷凍乾燥生物質漂浮物。
自由基之產生會因外在侵略(冷、污染、煙草、紫外線)而增加，其係對皮膚細胞DNA以及細胞以及粒線體膜DNA產生傷害之原因。此等自由基在發炎過程中，亦扮演非常重要的角色。此等非常反應性代謝物係細胞氧化應力訊號之第二訊息，因此係發炎反應之早期中介物(A. Van Der Vliet and coll,Chem Biol Interaction 85: 95-116 1992)。
範例2a以及3中所述之製備物之抗自由基活性，可幫助抵抗內在以及外在皮膚老化以及發炎。
範例7：評估金屬蛋白活性在膠原蛋白形成細胞外基質上之抑制作用
細胞外基質(ECM)係一種動態結構，具組織之結構與調節角色。其給予皮膚飽滿以及機械特徵。在表皮處，其占據細胞間之空間，且其提供表皮結構支撐作用。其亦控制表皮細胞間之交換以及參與細胞活性。其由纖維，特別是膠原蛋白以及基礎物質(水、鹽、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖)構成。膠原蛋白係纖維蛋白，由三種經共價氫鏈連結之相同或相異之多肽鏈形成。膠原蛋白形成纖維網路之基本組份，且扮演提供皮膚抗性以及彈性之機器角色。
當細胞衰老時，ECM之大部分的組份會被稱作基質金屬蛋白酶(MMPs)之富含鋅之內胜肽類酵素分解(Hideaki Nagase § and J. Frederick Woessner. J Biol Chem,Vol. 274,Issue 31,21491-21494,July 30,1999)。其等係膜性或分泌的。所有的MMPs具有高度序列以及結構相似性，但具不同的基質專一性。MMP1或“間質膠原蛋白酶”主要分解第I型膠原蛋白(正當皮膚之表皮中含量為80%)且亦分解第II型、第VII型、第VIII型以及第X型膠原蛋白。
在使用專一性胜肽基質Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 之人類重組酵素之模型上，吾人已經利用螢光法定量分析，分析萃取物在直接酵素活性上之作用(David Leppertd and coll,Analytical Biochemistry 328(2004) 166-17)。
使活化的酵素與不同的製備物預培育，之後置入基質。酵素會打斷該胜肽，分開Mca螢光團(7甲氧基香豆素-4-基)乙醯基)與淬滅劑Dpa(N－3-(2,4-二硝基苯基)－L-2,3二胺基丙醯基)。之後，當在320nm下受激發時，該胜肽會放出螢光，波長405 nm。因此，測得MMP-1之酵素活性，且與放出之螢光成比例。
藉由此in tubo測試，吾人能夠偵測可能的MMP1活性抑制劑，一種在開始膠原蛋白分解作用上具重要角色之酵素。吾人測量MMP1活性抑制之百分比。
關於抑制劑或產物之酵素抑制作用的百分比之計算：
結果：
依照範例3製得之漂浮物顯著地抑制MMP1活性以及劑量依賴性從60至500 μg/ml。
測試依照範例2a製得之冷凍乾燥的生物質，從60至1000μg/ml。由於整個生物質之生化干擾，吾人無法測量抑制活性。然而，測試非常相似的萃取物，且顯示顯著的抑制，從60μg/ml至1000μg/ml。
依照範例3製得之萃取物在衰老發生時，可抵抗增加的MMP活性，且可促成維持膠原蛋白之機械角色，因此提供皮膚抗性以及彈性。
範例8：測量HaCaT角質細胞中TGF-β1之合成
TGF-β1(轉化生長因子-β1)屬於從不同的細胞類型分泌出之TGF-β超家族，在細胞生長以及多細胞反應與生物過程之調節上扮演重要角色。此超家族中細胞激素之主要活性為，其等會調節大部分細胞之增生，其等會刺激纖維母細胞之增生以及增加細胞外基質之形成(Lawrence,1996)。TGF-β1亦涉及損害之修護，癒合過程(Cullen et al.,1997)特別是藉由引起細胞之細胞骨架(肌動蛋白)的重組以及促進表皮細胞之移動(Boland et al.,1996)。在皮膚上大部分存在之細胞群集係角質細胞群集。其形成生長因子之重要來源，其可控制以及影響皮膚細胞(即纖維母細胞)之行為(Ghahary et al.,2001)。
裝置以及方法
未經誘發的生物質之產生：依照範例2a
經誘發的生物質之製備
製備無生長因子(激動素以及24D)之Murashige & Skoog培養基。添加KOH調整此培養基至pH 6，接著在121℃(p=1巴)下高壓滅菌20分鐘。之後，使用從增殖培養衍生而來之細胞懸浮液，以1：5之體積接種此培養基。誘發條件藉由無菌添加6-苯甲胺基嘌呤(BAP或(N-(苯甲基)-7H-嘌呤-6-胺)之濃縮溶液以及誘發劑(乙醯柳酸以及茉莉酮酸甲酯)於激動素DMSO中後立即製造。結果係EMS誘發培養基(見表4)。之後，使誘發的培養物在振盪檯(黑暗中115 RPM，29℃下)上維持15天。之後，於研磨以及離心之前，在Buchner漏斗上收集以乾燥新鮮生物質，以及利用冷凍乾燥安定化漂浮物。
用不同的萃取物處理HaCaT角質細胞5個小時，之後該等細胞在DMEM中，37℃下培育24個小時。將TGF-β1調配於ELISA套組之培養漂浮物中。
依照範例2a製得之未經誘發的摩洛哥堅果樹生物質以及誘發後獲得之摩洛哥堅果樹生物質，在人類HaCaT角質細胞中TGF-β1之合成上之作用，示於所附的第1圖中。其等顯示，在HaCaT角質細胞中，依照範例2a製得之未經誘發的摩洛哥堅果樹生物質(50μg/mL)刺激TGF-β1之合成48%，然而經誘發之摩洛哥堅果樹生物質抑制TGF-β1之合成26%。
範例9：人類角質細胞之增生以及細胞移動之測量
範例9.a：人類角質細胞之細胞增生之測量
損傷之癒合係一種複雜以及動態的生物過程，在組織之正常修護中，其涉及許多局部以及系統因子之交互作用。癒合之過程包含四個相互依賴的階段：止血、發炎、增生以及重建。增生必需包含三個清楚可見的過程，即，肉芽發生、收縮以及再上皮細胞化。
肉芽發生期間，可觀察到涉及修護過程之其餘部分之細胞增生，此等細胞移動至損害之部位。此等細胞包括巨噬細胞、纖維母細胞以及內皮細胞。巨噬細胞連續地釋出趨化因子以及生長因子。纖維母細胞在損害之底部建構細胞之生長所需之新的細胞基質。此支架促進細胞移動。
損害部位之收縮係減少損害部位之大小之機制，纖維母細胞在此收縮上扮演領導之角色。
再上皮細胞化由再生表皮構成，其覆蓋損害部位重新形成預防外在環境之有效的障壁，能使色素沈積以及恢復其知覺以及免疫功能。因此，其必然包括角質細胞之細胞移動以及增生過程，且亦包括分化此新-表皮以及恢復基底膜重新連接真皮與表皮。當基底細胞朝損害部位之中心移動使得損害部位之二側連結在一起時，細胞有絲分裂之波潮發生，填補移動所留下之空間，以及提供細胞給三維再生中之表皮組織。
角質細胞、纖維母細胞以及內皮細胞之增生步驟，可被視為一種確認活性組份之癒合活性之功能現象之一。纖維母細胞或內皮細胞之增生增加，會參與真皮之癒合，而角質細胞增生增加會參與再上皮化。
裝置以及方法：細胞增生
使用之技術測量併入S相之細胞的DNA中之核苷酸，5-溴基-2’-去氧尿嘧啶(BrdU)，一種胸腺嘧啶之類似物。
將從手術後丟棄之皮膚分離出來之角質細胞培養於完整KSFM(BPE 25 μg/m；EGF 1.5 mg/ml)中。在欲評估之分子的存在下，於37℃，5% CO2 大氣下培育該細胞48小時。
用偶合過氧化酶之抗BrdU抗體系統，評估與細胞增生速率成比例之併入的BrdU。添加過氧化酶之基質，使產生顏色反應(Biotrak Elisa System)。在450nm下測量相應的吸收值(DO)。因此，此數據與細胞增生成比率。
之後使用下式決定增生百分比：
注意：
對照組min =以最小量培養基培育之細胞
對照組max =以完整培養基培育之細胞
因此，對照組min 相應於0%增生，對照組max 相應於100%增生。
細胞增生之結果示於第2圖中，其說明依照範例2a製得之摩洛哥堅果樹生物質在人類角質細胞增生上之作用。
其等顯示，依照範例2a製得之摩洛哥堅果樹生物質在0.1 μg/mL下，會刺激人類角質細胞增生25%。當生物質在0.01 μg/mL下測試時，沒有測到作用。
範例9.b：人類角質細胞之細胞移動之測量
裝置以及方法：HaCaT角質細胞之細胞移動
用於研究細胞移動之操作程序以使用96井套組為基礎。此測試之原理由研究細胞朝向井(96井盤)之中心移動構成。為達到此目的，在每井之中心放上擋件，以便製造2 mm直徑之偵測區。之後將HaCaT細胞種在此擋件之四周。一旦細胞完全結合至擋件之四周表面時，移開該擋件，因此細胞可移動至該偵測區。將無擋件以及具活性組份之盤置於37℃下DMEM 0% SVF中培育24個小時。為評估細胞之移動，分析位於擋件所在之區的細胞的數量。將細胞標記上Hoechst 33342，使用快閃來察看，僅計數落在此區中之細胞。對每一種條件計數八個井之平均值。結果表示如下
-螢光強度(IF-與移動的細胞之數量成比例)。
-相對於對照組0% SVF之活性百分比：
注意：
IF(0% mig)相應於含有擋件之井之IF(螢光強度)，因此為背景雜訊。
第3圖顯示細胞移動之結果以及說明依照範例2a製得之摩洛哥堅果樹之生物質，在HaCaT角質細胞之移動上之作用。
其等顯示出，依照範例2a製得之摩洛哥堅果樹生物質，在0.01或0.03 μg/mL下，分別刺激HaCaT角質細胞移動79%以及73%。
第1圖說明未經誘發之摩洛哥堅果樹之生物質以及誘發後獲得之摩洛哥堅果樹生物質，在人類HaCaT角質細胞中TFG-β1之合成上之作用。
第2圖說明未經誘發之摩洛哥堅果樹之生物質在人類角質細胞之增生上之作用。
第3圖說明未經誘發之摩洛哥堅果樹之生物質在HaCaT角質細胞之移動上之作用。

Claims (6)

  1. 一種衍生自未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹(argan)細胞的體外培養物之製備物供用於製造一藥物之用途，該藥物係用於處置皮膚老化、發炎以及療癒。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該製備物係呈細胞懸浮液、生物質、研磨的(ground)生物質、研磨的生物質漂浮物或培養物漂浮物之形式。
  3. 一種美容或皮膚組成物，其包含一衍生自未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹(argan)細胞之培養物之製備物作為活性組份，以及美容學或皮膚上可接受之賦形劑，其中該製備物係呈細胞懸浮液、生物質、研磨的生物質、研磨的生物質漂浮物或培養物漂浮物之形式。
  4. 如申請專利範圍第3項之組成物，其特徵在於，該製備物之量介於該組成物之總重量的0.1至10%之間。
  5. 如申請專利範圍第3或4項之組成物，其供用於處置皮膚老化、發炎以及療癒。
  6. 一種製造如申請專利範圍第3項之美容或皮膚組成物的方法，其包括下列依序步驟：a)將含摩洛哥堅果樹細胞之植物材料殺菌藉以產生經殺菌的摩洛哥堅果樹細胞，b)該經殺菌的摩洛哥堅果樹細胞之去分化處理而產生去分化的摩洛哥堅果樹細胞，c)將該去分化的摩洛哥堅果樹細胞懸浮於無誘發劑之培養基中， d)在無誘發劑之培養基中增殖該去分化的摩洛哥堅果樹細胞而產生一未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹細胞族群，e)從該無誘發劑之培養基中獲取該未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹細胞族群，藉此獲得一衍生自未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹細胞的培養物之製備物，以及f)將一美容學或皮膚上可接受之賦形劑加入該衍生自未經誘發的去分化之摩洛哥堅果樹細胞的培養物之製備物。
TW100111022A 2010-03-31 2011-03-30 衍生自去分化、未經誘發之摩洛哥堅果樹細胞的體外培養物之製備物、其供處置皮膚老化、發炎與療癒之用途、以及獲得其等之方法 TWI513474B (zh)

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