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TWI508742B - 治療性抗體之組合物及使用方法 - Google Patents

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TWI508742B
TWI508742B TW098124126A TW98124126A TWI508742B TW I508742 B TWI508742 B TW I508742B TW 098124126 A TW098124126 A TW 098124126A TW 98124126 A TW98124126 A TW 98124126A TW I508742 B TWI508742 B TW I508742B
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chain variable
baffr
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TW098124126A
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TW201006493A (en
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Christoph Heusser
Julia Neugebauer
Eveline Schaadt
Stefanie Urlinger
Maximilian Woisetschlaeger
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Novartis Ag
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Description

治療性抗體之組合物及使用方法
本發明係關於與BAFF受體(BAFFR)特異性結合之抗體。本發明更特定言之係關於為具有活體內B細胞消除活性之BAFFR拮抗劑的特異性抗體，及用於治療可藉由殺死或消除B細胞治療之病理學病症(諸如全身性紅斑狼瘡症或類風濕性關節炎或其他自體免疫疾病或淋巴瘤、白血病及骨髓瘤)的該等抗體之組合物及使用方法。
BAFFR(亦稱為BR3、TNFRSF13C或CD268)為腫瘤壞死因子受體總科之成員。其主要表現於B-淋巴細胞及T細胞亞群上。BAFFR與腫瘤壞死因子家族成員BLyS(亦稱為BAFF、CD257、TALL-1、THANK、TNFSF13B、ZTNF4)特異性結合，BLyS可由多種不同細胞類型(最特別為骨髓細胞)表現。在功能上，BLyS/BAFFR配體-受體對決定性地涉及於未成熟移行B細胞(immature transitional B-cell)之成熟及成熟B細胞之存活、遷移及活化(包括同型類別轉換)中。BLyS可單獨作用或與B細胞受體(BCR)、介白素-4、介白素-21或CD40配體協同作用。由於一些T細胞上存在BAFFR，故BLyS可充當T細胞活化之協同刺激因子。BLyS亦可與B細胞上所見之兩個額外受體(TACI及BCMA)結合。
小鼠體內BLyS或BAFFR之過度表現使B細胞增殖且產生具有全身性紅斑狼瘡症(SLE)典型特徵之全身性自體免疫。此外，代表SLE動物模型之患病(NZBxNZW)F1及自體免疫MRL-lpr/lpr小鼠在血清中含有增加之BLyS濃度，且BLyS含量與疾病進程有關。BLyS含量增加亦見於患有SLE、類風濕性關節炎、修格蘭氏症候群(Sjgren's syndrome)、韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)及B細胞惡性疾病之人類患者。此外，可藉由用可溶性受體融合蛋白阻斷BLyS使自體免疫疾病(諸如類風濕性關節炎(例如膠原蛋白誘發之關節炎)、SLE及多發性硬化症(例如實驗性自體免疫腦脊髓炎))之動物模型中的疾病表型部分復原。類似地，用BAFFR：Fc融合蛋白治療藉由阻斷B細胞存活而抑制慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。阻斷性抗BLyS抗體在類風濕性關節炎及SLE患者中之臨床功效資料強調BLyS在此等自體免疫病症中之病原性作用。
BLyS誘發之信號轉導亦表現出涉及於惡性B細胞存活中。B-CLL細胞之細胞凋亡可藉由添加重組BLyS或APRIL援救。相反地，藉由添加可溶性BAFFR融合蛋白或藉由抗APRIL抗體可增加B-CLL細胞之細胞凋亡，表明BLyS及APRIL可充當惡性B細胞之自分泌生長因子。BAFFR表現於多種患病組織(包括多發性骨髓瘤及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))上。此等自體免疫疾病之現行療法為具有嚴重副作用之免疫抑制劑，其不能治癒該疾病而旨在改良該疾病之體征及症狀(疾病改善藥)。目前用於SLE及RA中之大多數免疫抑制劑(如皮質類固醇、環磷醯胺、甲胺喋呤及硫唑嘌呤)產生全身性消炎作用，該作用因影響免疫系統之所有效應臂而具有嚴重感染之風險。因此，仍需要治療SLE及/或RA及其他相關自體免疫疾病之組合物及方法，諸如干擾BAFFR信號轉導之藥劑，其中懷疑BLyS促成疾病。
因此，在一態樣中，本發明提供一種用於BAFFR多肽(SEQ ID NO：87)中之標靶的抗體或包含該抗體之抗原結合部分的功能蛋白，其特徵在於該抗體或功能蛋白與BAFFR多肽特異性結合。在一實施例中，抗體或功能蛋白來自哺乳動物，具有諸如人類或駱駝之來源或為人類化抗體。在一特定實施例中，抗BAFFR抗體之特徵在於具有對標靶蛋白BAFFR具特異性且與BAFFR或BAFFR之片段結合之抗原結合區。
在一實施例中，本發明之抗體為無促效活性或具有低促效活性之BAFFR拮抗劑。在某些實施例中，抗體或功能片段與標靶蛋白BAFFR結合且減少或抑制BLyS與BAFFR結合。在一相關實施例中，抗體或功能片段抑制BLyS誘發之人類B細胞增殖及/或IgG1產生。
在另一實施例中，本發明之抗體活體外及活體內消除B細胞。本發明之抗體更佳為無促效活性之BAFFR拮抗劑且活體外及活體內消除人類B細胞。
該結合可藉由一或多個可用於量測抗體之活性(拮抗作用或促效作用)的檢定來測定。該等檢定較佳量測抗體對BAFFR之至少一種作用，該等作用包括BLyS誘發之人類B細胞增殖、IgG1產生及/或人類B細胞消除活性。
在另一實施例中，本發明提供與BAFFR之BLyS結合區特異性結合之抗體。在一相關實施例中，本發明提供與BAFFR中SEQ ID NO：87之胺基酸17與43之間的區域結合的抗體，且(例如)其至少與PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO 88)結合。
根據另一特定實施例，抗體與BAFFR以100 nM或100 nM以下、10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下之KD 值結合，以約10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下之IC50 值抑制BLyS誘發之人類B細胞增殖，且以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下之EC50 值活體外消除B細胞。
在另一相關實施例中，該等抗體使小鼠模型與未處理對照動物相比活體內血液及組織中B細胞之百分比減少達70%，較佳80%，且更佳90%。
在某些特定實施例中，本發明之抗體不與BAFFR相關蛋白交叉反應，且更特定言之不與人類TACI或BCMA受體交叉反應。
在另一相關實施例中，本發明之抗體為具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之完全人類或人類化IgG1抗體，且與BAFFR中包含在SEQ ID NO：87之胺基酸17與43之間的區域及(例如)至少以下肽PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR(SEQ ID NO 88)結合，且以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下之EC50 值活體外消除B細胞。
在另一相關實施例中，本發明之抗體為藉由在缺乏海藻糖基轉移酶之細胞株(例如缺乏編碼海藻糖基轉移酶之FUT8基因之表現從而與表現FUT8基因之野生型細胞相比增加ADCC活性的哺乳動物細胞株)中重組表現產生之人類抗體。
本發明係關於干擾、減少或抑制BLyS與BAFFR結合且活體外及活體內消除B細胞之經分離抗體，尤其人類或人類化抗體。在某些實施例中，本發明之抗體衍生自特定重鏈及輕鏈序列且/或包含特定結構特徵，諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。本發明提供經分離抗體，製備該等抗體之方法，包含該等抗體之免疫結合物及多價或多特異性分子，及含有本發明之抗體、免疫結合物或雙特異性分子之醫藥組合物。本發明亦係關於使用抗體抑制(例如拮抗)BAFFR之功能以延緩與BLyS及/或BAFFR之存在有關之病症或病狀、預防該病症或病狀、預防該病症或病狀之發作或抑制該病症或病狀之發展，例如使得可治療由BAFFR所介導或可藉由殺死或消除B細胞治療之病理學病症的方法；該病理學病症例如自體免疫疾病，諸如全身性紅斑狼瘡症(SLE)或類風濕性關節炎(RA)，或B細胞贅瘤，諸如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。因此，該等抗體、抗體片段或抗原結合蛋白可用作預防用途或作為治療方法之一部分。為使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。其他定義將在整個實施方式中進行闡述。
術語「免疫反應」係指例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞及由以上細胞或肝臟產生之可溶性巨分子(包括抗體、細胞激素及補體)對侵襲性病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性炎症的情況下對正常人類細胞或組織產生選擇性損害、破壞或使其自人體消除的作用。
「信號轉導路徑」或「信號轉導活性」係指通常由蛋白-蛋白相互作用(諸如生長因子與受體之結合)引發而使信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分的生物化學因果關係。一般而言，該傳輸包括在一系列引起信號轉導之反應中使一或多個蛋白質上之一或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基特異性磷酸化。倒數第二個過程通常包括細胞核事件，引起基因表現變化。
術語BAFFR或BAFF受體係指如SEQ ID NO：87所定義之人類BAFFR。PCT專利公開案WO 200004032及WO 2006073941通常係指抗BAFFR抗體。WO 2006073941描述特異性抗BAFFR抗體。
如本文中所提及之術語「抗體」包括全抗體及任何抗原結合片段(亦即「抗原結合部分」)或其單鏈。天然存在之「抗體」為包含由二硫鍵互連之至少兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L)的醣蛋白。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH )及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含3個結構域，即CH1、CH2及CH2。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL )及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL 。VH 及VL 區可進一步再分為稱為互補決定區(CDR)之高變區，其與稱為構架區(FR)之較保守區域交替。各VH 及VL 係由3個CDR及4個FR組成，其自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該等重鏈及輕鏈可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組份(Clq)。
如本文中所用之術語抗體之「抗原結合部分」(或簡稱「抗原部分」)係指保留與抗原(例如BAFFR之一部分)特異性結合之能力的全長抗體或抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段來執行。包涵於術語抗體之「抗原結合部分」內之結合片段的實例包括Fab片段，即由VL 、VH 、CL 及CH1域組成之單價片段；F(ab)2 片段，即包含兩個在鉸鏈區由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；由VH 及CH1域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL 及VH 域組成之Fv片段；由VH 域組成之dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)；及經分離之互補決定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL 及VH )係由獨立基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接子將其接合，該合成連接子使其能夠形成VL 區與VH 區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見(例如)Bird等人。1988 Science 242：423-426；及Huston等人。1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。該等單鏈抗體亦意欲包含於術語抗體之「抗原結合區」內。使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得此等抗體片段，且以與全抗體相同之方式篩選該等片段之效用。
如本文中所用「經分離抗體」係指大體上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如與BAFFR特異性結合之經分離抗體大體上不含特異性結合除BAFFR以外之抗原的抗體)。然而，與BAFFR特異性結合之經分離抗體可對其他抗原(諸如來自其他物種之BAFFR分子)具有交叉反應性。此外，經分離之抗體可大體上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文所用之術語「單株抗體」或「單株抗體組成」係指具有單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成對特定抗原決定基呈現單一結合特異性及親和力。
如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有構架區及CDR區均源自具有人類來源之序列的可變區之抗體。此外，若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自該等人類序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變型式，或含有源自人類構架序列分析之一致構架序列之抗體，例如如Knappik等人(2000.J Mol Biol 296,57-86)所述。可使用熟知編號方案定義免疫球蛋白可變域(例如CDR)之結構及位置，該等編號方案例如Kabat編號方案、Chothia編號方案、Kabat與Chothia之組合(AbM)等(參見例如Sequences of Proteins of Immunological Interest,美國健康及公共服務部(U.S.Department of Health and Human Services)(1991),Kabat等人編；Al Lazikani等人(1997)J.Mol.Bio.273：927948)。
本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變所引入之突變)。然而，如本文所用之術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已接枝於人類構架序列上之抗體。
術語「人類單株抗體」係指呈現單一結合特異性之抗體，其具有構架區與CDR區均源自人類序列之可變區。在一實施例中，人類單株抗體係由包括與永生化細胞融合之B細胞的融合瘤產生，該B細胞係由具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)獲得。
如本文所用之術語「重組人類抗體」包括所有藉由重組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如自針對人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離之抗體；自經轉化以表現人類抗體之宿主細胞(例如自轉染瘤)分離之抗體；自重組組合人類抗體文庫分離之抗體；及藉由涉及將所有或一部分人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接之任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有構架區及CDR區係源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，可對該等重組人類抗體進行活體外突變誘發(或當使用針對人類Ig序列之轉殖基因動物時，進行活體內體細胞突變誘發)且因此重組抗體之VH 及VL 區之胺基酸序列為儘管源自人類生殖系VH 及VL 序列且與之相關但可能不天然存在於活體內人類抗體生殖系譜內之序列。
如本文中所用之「同型」係指由重鏈恆定區基因所提供之抗體種類(例如IgM、IgE、IgG，諸如IgG1或IgG2)。
短語「識別抗原之抗體」或「對抗原具特異性之抗體」在本文中與術語「與抗原特異性結合之抗體」可互換使用。
如本文所用之「與BAFFR多肽特異性結合」之抗體意欲指與人類BAFFR多肽以100 nM或100 nM以下、10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下之KD 值結合之抗體。「與除BAFFR以外之抗原交叉反應」之抗體意欲指以0.5×10-8 M或0.5×10-8 M以下、5×10-9 M或5×10-9 以下或2×10-9 M或2×10-9 M以下之KD 值與此抗原結合之抗體。「不與特定抗原交叉反應」之抗體意欲指以1.5×10-8 M或1.5×10-8 M以上之KD 值，或5-10×10-8 M或1×10-7 M或1×10-7 M以上之KD 值與彼抗原結合之抗體。在某些實施例中，該等不與該抗原交叉反應之抗體在標準結合檢定中展現基本上不可偵測之與此等蛋白質的結合。
如本文所用之術語「拮抗劑抗體」意欲指在人類B細胞檢定(諸如人類B細胞增殖檢定或人類B細胞IgG1產生檢定)中，在BLyS存在下降低、減少及/或抑制BAFFR誘發之信號轉導活性的抗體。人類B細胞增殖檢定及IgG1產生檢定之實例更詳細描述於以下實例中。在一些實施例中，如人類B細胞增殖檢定中所量測，抗體以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下之IC50 值降低、減少或抑制BLyS誘發之活性。在一些實施例中，如IgG1產生檢定中所量測，抗體以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下之IC50 值抑制BLyS誘發之活性。
如本文所用之「無促效活性」之抗體意欲指在基於細胞之檢定(諸如人類B細胞增殖檢定)中，在不存在BLyS的情況下不會顯著增加BAFFR介導之信號轉導活性的抗體。該等檢定更詳細描述於以下實例中。
如本文所用之活體外消除B細胞之抗體意欲指如人類B細胞消除檢定(ADCC)中所量測，以10 nM或10 nM以下之EC50 值，較佳以1 nM或1 nM以下之EC50 值，更佳以100 pM或100 pM以下之EC50 值消除B細胞的抗體。該等檢定更詳細描述於以下實例中。
如本文所用之活體內消除B細胞之抗體意欲指如由B細胞之螢光活化細胞分選(FACS)所量測，使B細胞之百分比活體內降低達70%，較佳80%且更佳90%的抗體。該等檢定更詳細描述於以下實例中。
如本文所用之術語「Kassoc 」或「Ka 」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「Kdis 」或「Kd 」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD 」意欲指解離常數，其係由Kd 與Ka 之比率(亦即Kd /Ka )獲得且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD 值可使用此項技術中已確立之方法測定。一種測定抗體KD 值之方法係藉由使用表面電漿共振或使用生物感應器系統(諸如Biacore系統)達成。
如本文所用之術語「親和力」係指單一抗原位點處抗體與抗原之間相互作用之強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由微弱的非共價力與抗原在諸多位點處相互作用；相互作用愈多，親和力愈強。
如本文所用之術語「親和力強度(Avidity)」係指提供關於抗體-抗原複合物之總穩定性或強度資訊之量度。其受三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體二者之價數；及相互作用部分之結構排列。最終此等因素定義抗體之特異性，亦即特定抗體與正確抗原之抗原決定基結合之可能性。
如本文所用之術語「ADCC」或「抗體依賴性細胞毒性」活性係指人類B細胞消除活性。ADCC活性可藉由上述人類B細胞消除檢定量測。
為獲得較高親和力強度探針，可建構二聚結合物(與FACS標記偶合之兩個抗體蛋白分子)，由此使得低親和力相互作用(諸如與生殖系抗體之相互作用)更易於由FACS偵測。此外，增加抗原結合之親和力強度的另一方式涉及產生抗BAFFR抗體之本文所述任一構築體之二聚物、三聚物或多聚物。該等多聚物可經由個別模組之間的共價結合而產生，例如藉由模擬天然C末端與N末端結合或藉由模擬經由恆定區結合在一起之抗體二聚物而產生。經工程改造至Fc/Fc界面之鍵可為共價鍵或非共價鍵。此外，除Fc以外的二聚或多聚搭配物可用於在BAFFR雜交物中產生該等高級結構。舉例而言，可能使用多聚域，諸如Borean(WO 2004039841)中所述之三聚域或公開專利申請案WO 98/18943中所述之五聚域。
如本文所用之術語抗體之「選擇性」係指抗體與特定標靶多肽結合而不與密切相關之多肽結合。
如本文中所用之術語抗體之「高親和力」係指抗體對於標靶抗原具有1 nM或1 nM以下之KD 值。如本文所用之術語「個體」包括任何人類或非人類動物。
術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
如本文中所使用之術語「經最佳化」意謂核苷酸序列經改變以使用較佳在產生細胞或生物體，通常真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia )之細胞、木黴(Trichoderma )之細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞中之密碼子編碼胺基酸序列。經最佳化核苷酸序列經工程改造以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列，其亦稱為「親本」序列。本文中之經最佳化序列已經工程改造以具有較佳在CHO哺乳動物細胞中之密碼子，然而，本文中亦預想此等序列在其他真核細胞中之經最佳化表現。由經最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為經最佳化。
本發明之多個態樣在以下子部分中進一步詳細描述。
評估抗體與多個物種之BAFFR的結合能力之標準檢定為此項技術中已知的，包括(例如)ELISA、西方墨點法及RIA。合適之檢定在實例中進行詳細描述。抗體之結合動力學(例如結合親和力)亦可藉由此項技術中已知之標準檢定，諸如藉由Biacore分析來評定。評估抗體對BAFFR功能特性之作用(例如受體結合、阻止或誘發B細胞增殖或IgG產生)的檢定在實例中進一步詳細描述。
因此，如根據此項技術已知及本文中所述之方法所測定，「抑制」一或多種此等BAFFR功能特性(例如，生物化學活性、免疫化學活性、細胞活性、生理活性或其他生物活性，或其類似活性)的抗體應理解為係關於特定活性相對於不存在抗體的情況下(例如或當存在具有不相關特異性之對照抗體時)所見之活性統計上顯著減少。抑制BAFFR活性之抗體實現量測參數之至少10%，至少50%、80%或90%之該統計上顯著之減少，且在某些實施例中，本發明之抗體可抑制大於95%、98%或99%之BAFFR功能活性。
術語「交叉阻斷(cross-block，cross-blocked及cross-blocking)」在本文中可互換使用意謂在標準競爭性結合檢定中抗體或其他結合劑干擾其他抗體或結合劑與BAFFR結合之能力。
可使用標準競爭結合檢定測定抗體或其他結合劑能夠干擾另一抗體或結合分子與BAFFR結合之能力或程度，且因此確定能否稱其為本發明之交叉阻斷。一個合適檢定包括使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿共振技術量測相互作用之程度。量測交叉阻斷之另一檢定使用基於ELISA之方法。
實例中給出兩種方法之進一步詳述。
根據本發明，在所述BIAcore交叉阻斷檢定中，本發明之交叉阻斷抗體或其他結合劑與BAFFR結合以使所記錄之抗體或結合劑之組合(混合物)的結合介於呈組合形式之兩種抗體或結合劑之最大理論結合(如上所定義)的80%與0.1%之間(例如80%至4%)，特定言之介於最大理論結合的75%與0.1%之間(例如75%至4%)，且更特定言之介於70%與0.1%之間(例如70%至4%)，且更特定言之介於最大理論結合的65%與0.1%之間(例如65%至4%)。
如實例中所述之ELISA檢定中，若與不存在溶液相抗BAFFR抗體的情況下(亦即陽性對照孔)獲得之BAFFR偵測信號相比，溶液相抗BAFFR抗體能夠引起BAFFR偵測信號減少60%至100%、特定言之70%至100%，且更特定言之80%至100%，則將該抗體定義為具交叉阻斷性。
重組抗體
本發明之抗體包括如實例中所述分離且在結構上表徵之人類重組抗體。本發明之經分離抗體的VH 胺基酸序列如SEQ ID NO：50-56所示。本發明之經分離抗體的VL 胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43-49所示。本發明之抗體的較佳全長輕鏈胺基酸序列之實例如SEQ ID NO：71-74所示。本發明之抗體的較佳全長重鏈胺基酸序列之實例分別如SEQ ID NO：75-78所示。抗體之較佳全長重鏈及輕鏈胺基酸序列之其他實例為由質體pBW510及pBW512(2009年4月29日由Novartis Pharma AG,Forum 1,CH-4002 Basel,Switzerland分別以寄存編號DSM22542及DSM22543寄存於DSMZ中)中所含之相應DNA序列編碼之彼等胺基酸序列。本發明之其他抗體包括已藉由胺基酸刪除、插入或取代突變，但CDR區仍與上述序列中所述之CDR區(包括由質體pBW510及pBW512(2009年4月29日由Novartis Pharma AG,Forum 1,CH-4002 Basel,Switzerland分別以寄存編號DSM22542及DSM22543保存於DSMZ中)之相應DNA序列編碼之CDR區)具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括突變胺基酸序列，其中當與上述序列中所述之CDR區相比時CDR區中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸已藉由胺基酸刪除、插入或取代而突變。
此外，可變重鏈親本核苷酸序列係以SEQ ID NO 64展示。可變輕鏈親本核苷酸序列係以SEQ ID NO 57展示。經最佳化以表現於哺乳動物細胞中之全長輕鏈核苷酸序列係以SEQ ID NO 83-86展示。經最佳化以表現於哺乳動物細胞中之全長重鏈核苷酸序列係以SEQ ID NO 79-82展示。本發明之其他抗體包括已突變，但仍與上述序列具有至少60%、70%、80%、90%或95%一致性之胺基酸或核酸。在一些實施例中，其包括突變胺基酸序列，其中當與以上述序列所述之可變區相比時可變區中不超過1個、2個、3個、4個或5個胺基酸已藉由胺基酸刪除、插入或取代而突變。
因為此等抗體中之每一者均結合相同抗原決定基，且為相同親本抗體之子代，故VH 、VL 、全長輕鏈及全長重鏈序列(核苷酸序列及胺基酸序列)可「經混合且匹配」以產生本發明之其他抗BAFFR結合分子。該等「經混合且匹配」抗體之BAFFR結合可使用以上及實例中所述之結合檢定(例如ELISA)測試。當此等鏈經混合且匹配時，特定VH /VL 對之VH 序列應經結構上類似之VH 序列替代。同樣，特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列應經結構上類似之全長重鏈序列替代。同樣，特定VH /VL 對之VL 序列應經結構上類似之VL 序列替代。同樣，特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構上類似之全長輕鏈序列替代。因此，在一態樣中，本發明提供一種經分離重組抗體或其抗原結合區，其具有：包含選自由SEQ ID NO：50-56組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含選自由SEQ ID NO：43-49組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體與BAFFR特異性結合。
在另一態樣中，本發明提供：
(i)一種經分離重組抗體，其具有：包含選自由SEQ ID NO：75-78組成之群的胺基酸序列的全長重鏈；及包含選自由SEQ ID NO：71-74組成之群的胺基酸序列的全長輕鏈；其中該抗體與BAFFR特異性結合，或
(ii)一種功能蛋白，其包含該抗體之抗原結合部分。
在另一態樣中，本發明提供：
(i)一種經分離重組抗體，其具有：由選自由SEQ ID NO：79-82組成之群的經最佳化以表現於哺乳動物細胞中的核苷酸序列編碼的全長重鏈；及由選自由SEQ ID NO：83-86組成之群的經最佳化以表現於哺乳動物細胞中的核苷酸序列編碼的全長輕鏈；其中該抗體與BAFFR特異性結合；或
(ii)一種功能蛋白，其包含該抗體之抗原結合部分。
抗體之VH CDR1之胺基酸序列係如SEQ ID NO：1-7所示。抗體之VH CDR2之胺基酸序列係如SEQ ID NO：8-14所示。抗體之VH CDR3之胺基酸序列係如SEQ ID NO：15-21所示。抗體之VL CDR1之胺基酸序列係如SEQ ID NO：22-28所示。抗體之VL CDR2之胺基酸序列係如SEQ ID NO：29-35所示。抗體之VL CDR3之胺基酸序列係如SEQ ID NO：36-42所示。以SEQ ID NO：1-42所述之CDR區係使用Kabat系統(Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康及公共服務部，NIH公開號91-3242)描繪。
假定該等抗體中之每一者可與BAFFR結合且主要由CDR1、2及3區提供抗原結合特異性，則VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可「經混合且匹配」(亦即，不同抗體之CDR可經混合且匹配，各抗體含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以產生本發明之其他抗BAFFR結合分子。該等「經混合且匹配」之抗體之BAFFR結合可使用以上及實例中所述之結合檢定(例如ELISA)來測試。當VH CDR序列經混合且匹配時，特定VH 序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構類似之CDR序列替代。同樣，當VL CDR序列經混合且匹配時，特定VL 序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構類似之CDR序列替代。應為一般熟習此項技術者顯而易見，新穎VH 及VL 序列可藉由以與本文中對本發明之單株抗體所示的CDR序列結構類似之序列取代一或多個VH 及/或VL CDR區序列而產生。
在一些實施例中，經分離重組抗體或其抗原結合區具有：包含選自由SEQ ID NO：1-7組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；包含選自由SEQ ID NO：8-14組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；包含選自由SEQ ID NO：15-21組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；包含選自由SEQ ID NO：22-28組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；包含選自由SEQ ID NO：29-35組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及包含選自由SEQ ID NO：36-42組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；其中該抗體與BAFFR特異性結合。
在一特定實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：2之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：9之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：16之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：23之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：30之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：37之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：3之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：10之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：17之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：24之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：31之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：4之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：11之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：18之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：25之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：32之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：39之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：5之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：12之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：19之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：33之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：40之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：6之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：13之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：20之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：27之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：34之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：41之輕鏈可變區CDR3。
在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO：7之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：14之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：21之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：28之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：35之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：42之輕鏈可變區CDR3。
如本文中所使用之人類抗體包含重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈，若該抗體之可變區或全長鏈係由使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，則其為特定生殖系序列「之產物」或「源自」該特定生殖系序列。該等系統包括以所關注之抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以所關注之抗原來篩選在噬菌體上呈現之人類免疫球蛋白基因文庫。為人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可如藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列比較，且選擇序列最接近(亦即最大一致性百分比)該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。為特定人類生殖系免疫球蛋白序列「之產物」或「源自」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與該生殖系序列相比可含有胺基酸差異，此係歸因於(例如)天然存在之體細胞突變或有意引入定點突變。然而，所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如，鼠類生殖系序列)相比時將該人類抗體鑑別為人類抗體的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。一般而言，源自特定人類生殖系序列之人類抗體與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比將呈現不超過10個胺基酸之差異。在某些情況下，人類抗體與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比可呈現不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。
同源抗體
在另一實施例中，本發明之抗體具有全長重鏈及輕鏈胺基酸序列；全長重鏈及輕鏈核苷酸序列、可變區重鏈及輕鏈核苷酸序列，或與本文所述抗體之胺基酸及核苷酸序列同源之可變區重鏈及輕鏈胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明之抗BAFFR抗體之所需功能特性。
舉例而言，本發明提供一種經分離重組抗體(或包含其抗原結合部分之功能蛋白)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：該重鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：50-56組成之群之胺基酸序列至少80%或至少90%一致之胺基酸序列；該輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO：43-49組成之群之胺基酸序列至少80%或至少90%一致之胺基酸序列；該抗體與BAFFR特異性結合，且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之IgG1產生，且其活體外或活體內消除B細胞。
在另一實例中，本發明提供一種經分離重組抗體(或包含其抗原結合部分之功能蛋白)，其包含全長重鏈及全長輕鏈，其中：該全長重鏈包含與選自由SEQ ID NO 75-78組成之群之胺基酸序列至少80%或至少90%一致之胺基酸序列；該全長輕鏈包含與選自由SEQ ID NO 71-74組成之群之胺基酸序列至少80%或至少90%一致之胺基酸序列；該抗體與BAFFR特異性結合，且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之IgG1產生，且其活體外或活體內消除B細胞。
在另一實例中，本發明提供一種經分離重組抗體(或包含其抗原結合部分之功能蛋白)，其包含全長重鏈及全長輕鏈，其中：該全長重鏈係由與選自由SEQ ID NO 79-82組成之群之核苷酸序列至少80%或至少90%一致之核苷酸序列編碼；該全長輕鏈由與選自由SEQ ID NO 83-86組成之群之核苷酸序列至少80%或至少90%一致之核苷酸序列編碼；該抗體與BAFFR特異性結合，且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之IgG1產生，且其活體外或活體內消除B細胞。
在多個實施例中，該抗體可展示上述功能特性中之一或多者，兩者或兩者以上，或三者。該抗體可為(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。該抗體較佳為全人類IgG1抗體。
在其他實施例中，VH 及/或VL 胺基酸序列可與上述序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，VH 及/或VL 胺基酸序列除不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置上之胺基酸取代以外可為一致的。具有分別與SEQ ID NO 50-56之VH 區及SEQ ID NO 43-49之VL 區具有高(亦即80%或80%以上)一致性之VH 區及VL 區的抗體可藉由分別使編碼SEQ ID NO：64-70及57-63之核酸分子突變(例如定點突變或PCR介導之突變)獲得，繼而使用本文所述之功能檢定測試所編碼之變異抗體所保留之功能(亦即上述功能)。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可與上述序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。具有分別與SEQ ID NO 75-78中之任一者之全長重鏈及SEQ ID NO 74-74中之任一者之全長輕鏈具有高(亦即80%或80%以上)一致性之全長重鏈及全長輕鏈的抗體可藉由分別使編碼SEQ ID NO：79-82及SEQ ID NO 83-86之核酸分子突變(例如定點突變或PCR介導之突變)獲得，繼而使用本文所述之功能檢定測試所編碼之變異抗體所保留之功能(亦即上述功能)。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可與上述序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在其他實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與上述序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文中所使用之兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列所共用之相同位置數而變化(亦即一致性%=相同位置數/位置總數×100)，考慮為達成兩個序列之最佳比對所需要引入之間隙數及各間隙之長度。兩個序列之間的序列比較及一致性百分比測定可使用下述數學算法來達成。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之算法(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)，使用PAM120權重殘基表(weight residue table)，12之間隙長度罰分及4之間隙罰分來測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用已併入GCG套裝軟體(可在http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6長度權重來測定。
具有保守性修飾之抗體
在某些實施例中，本發明之抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多者具有基於本文中所述抗體之特定胺基酸序列或其保守性修飾，且其中該等抗體保留本發明之抗BAFFR抗體之所需功能特性。因此，本發明提供一種經分離重組抗體，或包含其抗原結合部分之功能蛋白，其由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：該等重鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：1-7組成之群及其保守性修飾；該等重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：8-14組成之群及其保守性修飾；該等重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：15-21組成之群及其保守性修飾；該等輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：22-28組成之群及其保守性修飾；該等輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：29-35組成之群及其保守性修飾；該等輕鏈可變區之CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：36-42組成之群及其保守性修飾；該抗體與BAFFR特異性結合，且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之IgG1產生，且其活體外或活體內消除B細胞。
在多個實施例中，該抗體可展現上述所列之功能特性中之一或多者，兩者或兩者以上，或三者或三者以上。該等抗體可為(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
在其他實施例中，本發明之經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中此等序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體之特定胺基酸序列或其保守性修飾，且其中該等抗體保留本發明之抗BAFFR抗體之所需功能特性。因此，本發明提供一種經最佳化以在哺乳動物細胞中表現之經分離單株抗體，其由全長重鏈及全長輕鏈組成，其中：該全長重鏈具有選自SEQ ID NO：75-78之群之胺基酸序列及其保守性修飾；且該全長輕鏈具有選自SEQ ID NO：71-74之群之胺基酸序列及其保守性修飾；該抗體與BAFFR特異性結合；且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之IgG1產生，且其活體外或活體內消除B細胞。
在多個實施例中，該抗體可展現上述所列之功能特性中之一或多者，兩者或兩者以上，或三者或三者以上。該等抗體可為(例如)人類抗體、人類化或嵌合抗體。
如本文中所使用之術語「保守性序列修飾」意指並不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守性修飾包括胺基酸取代、添加及刪除。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點突變及PCR介導之誘變而引入本發明之抗體中。
保守性胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中進行定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明之抗體之CDR區內的一或多個胺基酸殘基可以來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且可使用本文中所述之功能檢定來測定變異抗體所保留之功能。
與本發明之抗BAFFR抗體結合相同抗原決定基之抗體
在另一實施例中，本發明提供與本文所述之本發明之多種特異性抗BAFFR抗體結合相同抗原決定基之抗體。實例中所述之能夠阻斷BLyS誘發之作用的所有抗體以高親和力結合BAFFR中之相同抗原決定基，該抗原決定基包含於SEQ ID NO：88之胺基酸之間。
因此其他抗體可基於其在標準BAFFR結合檢定中與本發明之其他抗體交叉競爭(例如，以統計上顯著之方式競爭性抑制與其他抗體之結合)之能力來鑑別。測試抗體抑制本發明之抗體與人類BAFFR結合之能力展示測試抗體可與彼抗體競爭結合人類BAFFR；根據非限制性理論，該抗體可與跟其競爭之抗體結合人類BAFFR上之相同或相關(例如結構上類似或空間上接近)抗原決定基。因此，本發明之另一態樣提供與本文依次揭示之抗體結合相同抗原且與該等抗體競爭之抗體。在一特定實施例中，與本發明之抗體結合人類BAFFR上相同抗原決定基之抗體為人類重組抗體。該等人類重組抗體可如實例中所述製備且分離。
經工程改造及修飾之抗體
此外，本發明之抗體可使用具有本文中所示之VH 序列及/或VL 序列中之一或多者的抗體作為起始物將經修飾之抗體工程改造來製備，該經修飾之抗體可具有與起始抗體不同之特性。抗體可藉由修飾一或兩個可變區(亦即，VH 及/或VL )內，例如在一或多個CDR區內及/或在一或多個構架區內之一或多個殘基來工程改造。或者或另外，抗體可藉由修飾在恆定區內之殘基(例如)以改變該抗體之效應功能來工程改造。
可執行之一類可變區工程改造為CDR接枝。抗體主要經由位於重鏈及輕鏈之六個互補決定區(CDR)內之胺基酸殘基與靶抗原相互作用。因此，在個別抗體之間，CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列差異更大。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可能藉由建構包括來自特定天然產生抗體並接枝於具有不同特性之不同抗體之構架序列上的CDR序列之表現載體來表現模擬特定天然產生抗體之特性的重組抗體(參見(例如)Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.；參見U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號；及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本發明之另一實施例係關於一種經分離單株抗BAFFR抗體或包含其抗原結合部分之功能蛋白，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區分別包含具有選自由SEQ ID NO：1-7組成之群之胺基酸序列的CDR1序列、具有選自由SEQ ID NO：8-14組成之群之胺基酸序列的CDR2序列、具有選自由SEQ ID NO：15-21組成之群之胺基酸序列的CDR3序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區分別包含具有選自由SEQ ID NO：22-28組成之群之胺基酸序列的CDR1序列、具有選自由SEQ ID NO：29-35組成之群之胺基酸序列的CDR2序列及由選自由SEQ ID NO：36-42組成之群之胺基酸序列組成之CDR3序列。因此，該等抗體含有單株抗體之VH 及VL CDR序列，亦可含有與此等抗體不同之構架序列。
該等構架序列可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNA資料庫或已出版參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開號91-3242；Tomlinson,I.M.等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836中。
用於本發明抗體的構架序列之一個實例為結構類似於本發明所選抗體所用之構架序列(例如一致序列)及/或本發明單株抗體所用之構架序列者。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可接枝於與產生構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所見的序列具有一致序列之構架區上，或者該等CDR序列可接枝於與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些情況下，使構架區內之殘基突變以保持或增強該抗體之抗原結合能力為有益的(參見例如Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)。
另一類可變區修飾為使VH 及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變以由此改良所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可執行定點突變或PCR介導之突變以引入突變，對抗體結合或所關注之其他功能特性之影響可以如本文中所述及實例中所提供之活體外或活體內檢定評估。可引入保守性修飾(如上所述)。該等突變可為胺基酸取代、添加或刪除。此外，通常CDR區內不超過1個、2個、3個、4個或5個殘基改變。
因此，在另一實施例中，本發明提供分離之抗BAFFR單株抗體或包含其抗原結合部分之功能蛋白，其由以下組成：重鏈可變區，其具有由一個選自SEQ ID NO：1-7之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：1-7相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加的胺基酸序列組成之VH CDR1區，具有一個選自由SEQ ID NO：8-14組成之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：8-14相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加之胺基酸序列的VH CDR2區，具有一個選自由SEQ ID NO：15-21組成之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：15-21相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加之胺基酸序列的VH CDR3區；具有一個選自由SEQ ID NO：22-28組成之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：22-28相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加之胺基酸序列的VL CDR1區，具有一個選自由SEQ ID NO：29-35組成之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：29-35相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加之胺基酸序列的VL CDR2區，及具有一個選自由SEQ ID NO：36-42組成之群之胺基酸序列或一個與SEQ ID NO：36-42相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、刪除或添加之胺基酸序列的VL CDR3區。
將抗原結合域接枝於替代性構架或骨架中
可使用各種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括至少一個與BAFFR特異性結合之結合區即可。該等構架或骨架包括5種主要個體基因型之人類免疫球蛋白，或其片段(諸如本文中別處所揭示者)，且包括其他動物物種之免疫球蛋白，較佳具有人類化態樣。單一重鏈抗體(諸如在駱駝科(camelid)中得以鑑別之單一重鏈抗體)在此方面備受關注。熟習此項技術者繼續發現及開發新穎構架、骨架及片段。
在一態樣中，本發明係關於使用可接枝有本發明之CDR的非免疫球蛋白骨架來產生非免疫球蛋白基抗體。可使用已知或未來非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含對於SEQ ID NO：87之靶蛋白具有特異性之結合區即可。本文中將該等化合物稱為「包含標靶特異性結合區之多肽」。非免疫球蛋白構架之實例在以下部分中進行進一步描述(駱駝科抗體及非抗體骨架)。
駱駝科抗體
由駱駝及單峰駝(雙峰駝(Camelus bactrianus )及單峰駝(Camelus dromaderius ))家族之成員(包括新大陸成員，諸如美洲駝種(羊駝(Lama paccos )、大羊駝(Lama glama )及小羊駝(Lama vicugna )))獲得之抗體蛋白已針對尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性進行表徵。在自然界中發現之此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺乏輕鏈，且因此在結構上不同於其他動物之抗體的具有兩個重鏈及兩個輕鏈之典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(1994年3月3日公開之WO 94/04678)。
駱駝科抗體中為鑑別為VHH 之小型單一可變域的區域可藉由遺傳工程改造獲得以產生對標靶具有高親和力之小蛋白質，產生稱為「駱駝科奈米抗體」之低分子量抗體衍生蛋白。參見1998年6月2日頒布之美國專利第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788；Pleschberger,M.等人。2003 Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo,V.等人。2002 Int J Cancer 89：456-62；及Lauwereys,M.等人。1998 EMBO J 17：3512-3520。駱駝科抗體及抗體片段之工程改造文庫可購得，例如購自Ablynx,Ghent,Belgium。如同非人類來源之其他抗體一般，駱駝科抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得更接近人類序列之序列，亦即奈米抗體可「人類化」。因此，可進一步減小駱駝科抗體對人類之天然低抗原性。
駱駝科奈米抗體具有約為人類IgG分子之十分之一的分子量，且該蛋白質具有僅為幾奈米之實體直徑。該小尺寸所引起之一結果為駱駝科奈米抗體結合功能上不可為較大抗體蛋白所見之抗原位點之能力，亦即駱駝科奈米抗體適用作偵測使用經典免疫技術隱藏之抗原之試劑且適用作可能之治療劑。因此，小尺寸所引起之另一結果為駱駝科奈米抗體可由於與靶蛋白之凹槽或較窄間隙中之特定位點結合而具有抑制作用，且因此可以與經典抗體之功能相比更接近經典低分子量藥物之功能的能力發揮作用。
低分子量及緊湊之尺寸進一步使駱駝科奈米抗體極其熱穩定，對極端pH值及蛋白水解消化穩定，且具有極弱抗原性。另一結果為駱駝科奈米抗體易於自循環系統移至組織中，且甚至橫穿血腦屏障且可治療影響神經組織之病症。此外，奈米抗體可便利於藥物橫穿血腦屏障輸送。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。此等特徵與對人類之低抗原性組合指示較大之治療潛力。此外，此等分子可在原核細胞(諸如大腸桿菌(E.coli ))中完全表現且表現為與噬菌體之融合蛋白且具有功能性。
因此，本發明之特徵為一種對BAFFR具有高親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體係在駱駝科動物中天然產生，亦即由駱駝科以BAFFR或其肽片段使用本文對於其他抗體所述之技術免疫之後產生。或者，將抗BAFFR駱駝科奈米抗體工程改造，亦即藉由(例如)如本文實例中所述使用淘選程序以BAFFR作為標靶自噬菌體呈現之經適當誘變之駱駝科奈米抗體蛋白的文庫選擇產生。在一實施例中，本揭示案之抗體經駱駝化，其具有如本文所揭示之駱駝構架及VH CDR1、CDR2及/或CDR3區。工程改造奈米抗體可進一步按要求經遺傳工程改造以在接受個體體內具有45分鐘至兩週之半衰期。在一特定實施例中，如(例如)PCT/EP93/02214所述，藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈的CDR序列接枝於奈米抗體或單域抗體構架序列中來獲得駱駝科抗體或奈米抗體。
非抗體骨架
已知非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)阿第汀(Adnectin)(纖維結合蛋白)(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、錨蛋白(ankyrin)(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd(Cambridge,MA)及Ablynx nv(Zwijnaarde,Belgium))、脂質運載蛋白(lipocalin)(Anticalin)(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小分子免疫藥物(small modular immuno-pharmaceutical)(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、maxybody(Avidia,Inc.(Mountain View,CA))、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及affilin(γ-晶狀體球蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle,Germany)、蛋白質抗原決定基模擬劑(Polyphor Ltd,Allschwil,Switzerland)。
(i)纖維結合蛋白骨架
纖維結合蛋白骨架較佳係基於III型纖維結合蛋白域(例如，III型纖維結合蛋白之第十個模組(10 Fn3域))。III型纖維結合蛋白域具有分布於兩個β摺疊之間的7或8條β鏈，該等β摺疊本身彼此緊挨以形成該蛋白質的核心，且另外含有將該等β鏈彼此連接且暴露於溶劑之環(與CDR類似)。在β摺疊夾層之各邊緣處存在至少三個該等環，其中該邊緣為該蛋白質垂直於β鏈之方向的邊界(US 6,818,418)。
此等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，儘管總摺疊與包含駱駝及美洲駝IgG中之整個抗原識別單元之最小功能抗體片段(重鏈可變區)的總摺疊密切相關。由於此結構，非免疫球蛋白抗體模擬在本質及親和力上與抗體之抗原結合特性類似之抗原結合特性。此等骨架可用於與活體內抗體之親和力成熟的過程類似之活體外環隨機化及改組策略中。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中可使用標準選殖技術以本發明之CDR替代該分子之環區。
(ii)錨蛋白-分子搭配物
該技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組的蛋白質作為用於承載可變區之骨架，該等可變區可用於與不同標靶結合。該錨蛋白重複模組為由兩個反向平行之α-螺旋及一個β-翻轉組成的具有33個胺基酸之多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。
(iii)Maxybody/Avimer-Avidia
Avimer係來源於含天然A域之蛋白質，諸如LRP-1。此等結構域本質上用於蛋白質-蛋白質相互作用且人類有250餘種蛋白質在結構上基於A域。Avimer係由大量經由胺基酸連接子連接之不同「A-域」單體(2-10個)組成。可使用(例如)20040175756、20050053973、20050048512及20060008844中所述之方法產生可與靶抗原結合之Avimer。
(vi)蛋白A-Affibody
Affibody親和配體為由基於蛋白A之一個IgG結合域之骨架的3螺旋束組成的小型單純蛋白質。蛋白A為來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )之表面蛋白。此骨架域由58個胺基酸組成，隨機選擇其中13個胺基酸以產生具有大量配體變異體之Affibody文庫(參見(例如)US 5,831,012)。Affibody分子模擬抗體，與抗體之150 kDa之分子量相比其具有6 kDa之分子量。儘管Affibody分子尺寸較小，但其結合位點仍與抗體之結合位點類似。
(v)Anticalins-Pieris
Anticalins為由Pieris ProteoLab AG公司開發之產品。其係來源於脂質運載蛋白，一群分布廣泛之小型且穩固之蛋白質，其通常涉及於化學上敏感或不溶性化合物之生理輸送或儲存中。若干種天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。
該蛋白質架構與免疫球蛋白類似，其中高變環位於剛性構架之頂部。然而，與抗體或其重組片段相對比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈(其僅略大於單一免疫球蛋白域)組成。
構成結合袋之四個環之組展示顯著結構可塑性且容許多個側鏈。結合位點因此可以專屬方法再成型以便以高親和力及特異性識別具有不同形狀之指定標靶分子。
脂質運載蛋白家族之一種蛋白質，即大菜粉蝶(Pieris Brassicae )之膽汁三烯結合蛋白(BBP)已用以藉由誘變四個環之組來產生抗運載蛋白。描述「抗運載蛋白」之專利申請案之一實例為PCT WO 199916873。
(vi)Affilin-Scil Proteins
AffilinTM 分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經設計以對蛋白質及小分子具有特異性親和力。新穎AffilinTM 分子可自兩個文庫極快速地選出，每一個文庫係基於不同的人類產生之骨架蛋白。
AffilinTM 分子並不展示與免疫球蛋白蛋白質的任何結構同源性。Scil Proteins使用兩種AffilinTM 骨架，其中之一者為γ結晶，即一種人類結構眼晶狀體蛋白，且另一者為「泛素」總科蛋白質。兩種人類骨架均極小，展示高溫穩定性且幾乎抵抗pH值變化及變性劑。此高穩定性主要係歸因於該等蛋白質經擴大之β摺疊結構。γ結晶產生之蛋白質之實例描述於WO 200104144中且「泛素樣」蛋白之實例描述於WO 2004106368中。
(vii)蛋白質抗原決定基模擬劑(PEM)
PEM為中等尺寸環狀肽樣分子(MW 1-2 kDa)，其模擬蛋白質之β髮夾二級結構，即蛋白質-蛋白質相互作用所涉及之主要二級結構。
構架或Fc工程改造
本發明之經工程改造抗體包括已對VH 及/或VL 內之構架殘基進行修飾(例如)以改良抗體特性的抗體。通常進行該等構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「復原突變(backmutate)」成相應生殖系序列。更特定言之，已進行體細胞突變之抗體可含有與產生抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將該等抗體構架序列與產生該抗體之生殖系序列比較來鑑別。為使該等構架區序列復原為其生殖系組態，可藉由(例如)定點突變或PCR介導之突變來使體細胞突變「復原突變」成生殖系序列。該等經「復原突變」之抗體亦意欲為本發明所涵蓋。
另一類構架修飾涉及使該構架區內，或甚至在一或多個CDR區內之一或多個殘基突變以移除T細胞抗原決定基由此降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除構架區或CDR區內進行之修飾以外，或取而代之，可使本發明之抗體經工程改造以包括Fc區內之修飾通常以改變該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分連接於抗體上)或經修飾以改變其糖基化，以再次改變該抗體之一或多種功能特性。以下進一步詳細描述此等實施例中之每一者。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。
在一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得改變(例如增加或減少)該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以(例如)便利於輕鏈及重鏈之組裝或增強或降低該抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短該抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得該抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於原生Fc鉸鏈域SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，該抗體經修飾以延長其生物半衰期。多種方法可行。舉例而言，如Ward之美國專利第6,277,375號中所述，可引入下列突變中之一或多種：T252L、T254S、T256F。或者，為延長生物半衰期，如Presta等人之美國專利第5,869,046及6,121,022號中所述，可使抗體在CH1或CL區內發生改變以含有取自IgG Fc區之CH2域之兩個環的結合抗原決定基之補救受體。
在其他實施例中，藉由以不同胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來使Fc區改變以改變該抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可以不同胺基酸殘基替代以使得該抗體所具有的對效應配體之親和力改變但保留該親本抗體之抗原結合能力。對其之親和力改變之效應配體可為(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號與第5,648,260號中。
在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可以不同胺基酸殘基替代以使該抗體具有改變之C1q結合及/或減少或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以由此改變該抗體結合補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在另一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加該抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加該抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已對人類IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點進行定位且描述具有改良結合之變異體(參見Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在另一實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備去糖基化之抗體(亦即缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以(例如)增加該抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而去除一或多個可變區構架糖基化位點由此去除彼位點處之糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
或者或另外，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如海藻糖基殘基量減少或無海藻糖基殘基之低海藻糖基化或未海藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。該等改變之糖基化模式已經證實可增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)使抗體在糖基化方式改變之宿主細胞中表現來完成。糖基化方式改變之細胞在此項技術中已加以描述且可用作表現本發明之重組抗體由此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述具有經功能性破壞之FUT8基因(其編碼海藻糖基轉移酶)的細胞株以使在該細胞株中表現之抗體展現低海藻糖基化或無海藻糖基殘基。因此，在一實施例中，藉由在展現低海藻糖基化或未海藻糖基化模式之細胞株(例如編碼海藻糖基轉移酶之FUT8基因表現缺乏之哺乳動物細胞株)中重組表現產生本發明之抗體。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株Lecl3細胞，其具有降低之將海藻糖連接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力，亦使在彼宿主細胞中表現之抗體低海藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現修飾醣蛋白之醣基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞株，以使得在工程改造細胞株中表現之抗體展現之二分GlcNac結構增加，其使得該等抗體之ADCC活性增加(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。Eureka Therapeutics另外描述經遺傳工程改造之CHO哺乳動物細胞，其能夠產生具有改變之哺乳動物糖基化模式且無海藻糖基殘基之抗體(http：//www.eurekainc.com/about_us/companyoverview.html)。或者，本發明之抗體可在經工程改造而呈類哺乳動物糖基化模式且能夠產生缺乏海藻糖作為糖基化模式之抗體的酵母或絲狀菌中產生(參看(例如)EP 1297172B1)。
本發明所涵蓋之本文中之抗體的另一種修飾為聚乙二醇化。抗體可經聚乙二醇化以(例如)延長該抗體之生物(例如血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在使一或多個PEG基團連接於該抗體或抗體片段上之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文中所使用之術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用以衍生其他蛋白質之任何形式之PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或單(C1-C10)芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化之抗體。用於使蛋白質聚乙二醇化之方法在此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參見(例如)Nishimura等人之EP 0 154 316或Ishikawa等人之EP 0 401 384。
本發明所涵蓋之抗體之另一種修飾為使本發明之抗體的至少抗原結合區與血清蛋白(諸如人類血清白蛋白或其片段)結合或蛋白融合以延長所得分子之半衰期。該方法(例如)描述於Ballance等人之EP 0322094中。
另一可能性為使本發明之抗體的至少抗原結合區與能夠結合血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)之蛋白質融合以延長所得分子之半衰期。該方法(例如)描述於Nygren等人之EP 0 486 525中。
將改變之抗體工程改造的方法
如以上所論述，具有本文所示之VH 及VL 序列或全長重鏈及輕鏈序列之抗BAFFR抗體可用於藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH 及/或VL 序列或其所連接之恆定區來產生新的抗BAFFR抗體。因此，在本發明之另一態樣中，使用本發明之抗BAFFR抗體之結構特徵來產生結構相關之抗BAFFR抗體，其保留本發明之抗體之至少一種功能特性，諸如與人類BAFFR結合以及抑制BAFFR之一或多種功能特性(例如拮抗活性、B細胞消除活性)。
舉例而言，本發明之抗體之一或多個CDR區或其突變體可與已知構架區及/或其他CDR重組組合以產生如以上所述之本發明之其他經重組工程改造之抗BAFFR抗體。其他類型之修飾包括先前部分中所述之修飾。工程改造方法之起始物為本文中所提供之VH 及/或VL 序列中之一或多者，或其一或多個CDR區。為產生工程改造抗體，並不必需實際上製備具有本文中所提供之VH 序列及/或VL 序列中之一或多者，或其一或多個CDR區的抗體(亦即表現為蛋白質)。而是將該(該等)序列中所含有之資訊用作產生來源於原始序列之「第二代」序列的起始物，且隨後製備「第二代」序列且表現為蛋白質。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備抗BAFFR抗體(該抗BAFFR抗體由以下組成：重鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：1-7組成之群之CDR1序列、選自由SEQ ID NO：8-14組成之群之CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：15-21組成之群之CDR3序列；及輕鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：22-28組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：29-35組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：36-42組成之群的CDR3序列)；改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個改變之抗體序列；及使該改變之抗體序列表現為蛋白質之方法。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之抗BAFFR抗體(該抗BAFFR抗體由以下組成：具有選自SEQ ID NO：75-78之群之序列的全長重鏈抗體序列；及具有選自71-74之群之序列的全長輕鏈抗體序列)；改變該全長重鏈抗體序列及/或該全長輕鏈抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個改變之抗體序列；及使該改變之抗體序列表現為蛋白質之方法。
改變之抗體序列亦可藉由篩選具有選自由SEQ ID NO：15-21及SEQ ID NO：36-42組成之群之固定CDR3序列或如US 20050255552中所述之最小必需結合決定子及CDR1及CDR2序列之多樣性的抗體文庫來製備。篩選可根據適合於自抗體文庫篩選抗體之任何篩選技術(諸如噬菌體呈現技術)進行。
標準分子生物學技術可用以製備及表現改變之抗體序列。由改變之抗體序列編碼之抗體為保留本文所述之抗BAFFR抗體之一種、一些或所有功能特性之抗體，該等功能特性包括(但不限於)與人類BAFFR特異性結合；及/或其抑制BLyS誘發之B細胞增殖或BLyS誘發之LgG1產生；及/或活體外或活體內消除人類B細胞。
改變之抗體可展現以上所述之功能特性中之一或多者，兩者或兩者以上，或三者或三者以上。
改變之抗體之功能特性可使用此項技術中可用及/或本文中所述之標準檢定，諸如實例中所述之標準檢定(例如ELISA)來評定。
在使本發明之抗體工程改造之方法的某些實施例中，可沿整個或一部分抗BAFFR抗體編碼序列隨機或選擇性引入突變，且可如本文中所述對所得經修飾之抗BAFFR抗體之結合活性及/或其他功能特性進行篩選。突變方法於此項技術中已加以描述。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和誘變、合成接合組裝或其組合產生及篩選抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算篩選方法來使抗體之生化特性最佳化之方法。
編碼本發明之抗體的核酸分子
本發明之另一態樣係關於編碼本發明之抗體的核酸分子。經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之全長輕鏈核苷酸序列之實例係以SEQ ID NO：83-86展示。經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之全長重鏈核苷酸序列之實例係以SEQ ID NO：79-82展示。
核酸可存在於全細胞中，存在於細胞溶解物中，或可為呈部分純或大體上純之形式的核酸。當核酸藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl染帶顯示術(CsCl banding)、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術)自其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)純化分離時，其為「經分離」或「表現為大體上純的」。參見F.Ausubel等人編輯。1987 Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本發明之核酸可為(例如)DNA或RNA，且可能含有或可能不含有內含子序列。在一實施例中，該核酸為cDNA分子。核酸可存在於諸如噬菌體呈現載體之載體中，或存在於重組質體載體中。
本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由融合瘤(例如，如下進一步描述之由帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠製備的融合瘤)表現之抗體而言，編碼由該融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於由免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體呈現技術)獲得之抗體而言，編碼該抗體之核酸可自作為該文庫之成員的多個噬菌體純系回收。
獲得編碼VH 及VL 區段之DNA片段後，即可藉由標準重組DNA技術進一步處理此等DNA片段(例如)以使該等可變區基因轉化為全長抗體鏈基因，轉化為Fab片段基因或scFv基因。在此等處理中，將編碼VL 或VH 之DNA片段操作性連接至另一DNA分子或連接至編碼另一蛋白質之片段(諸如抗體恆定區或可撓性連接子)。如此上下文中所用之術語「操作性連接」意欲意謂兩個DNA片段以功能方式接合，例如使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框，或使得該蛋白質在所需啟動子的控制下表現。
可藉由將編碼VH 之DNA操作性連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來將編碼VH 區之經分離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見，例如Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國健康與公共服務部，NIH公開號91-3242)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區在IgG1同型中選擇。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼VH 之DNA操作性連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子上。
可藉由將編碼VL 之DNA操作性連接至編碼輕鏈恆定區CL 之另一DNA分子來將經分離之編碼VL 區之DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中已知(參見(例如)Kabat,E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國健康及公共服務部，NIH公開號91-3242)，且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，將編碼VH 及VL 之DNA片段操作性連接至編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4 -Ser)3 )之另一片段上，以使得VH 及VL 序列可表現為鄰近單鏈蛋白，其中VL 區與VH 區由可撓性連接子接合(參見(例如)Bird等人，1988 Science 242：423-426；Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990 Nature 348：552-554)。
本發明之單株抗體的產生
單株抗體(mAb)可藉由多種技術來製備，該等技術包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。可使用產生單株抗體之多種技術，例如B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉化。
用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。在小鼠中產生融合瘤為已確立之程序。分離經免疫脾細胞以供融合之免疫方案及技術在此項技術中已知。亦已知融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
本發明之嵌合抗體或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可使用標準分子生物學技術由所關注之鼠類融合瘤獲得且可經工程改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法來使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見(例如)Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區插入人類構架中。參見(例如)Winter之美國專利第5225539號及Queen等人之美國專利第5530101號；第5585089號；第5693762號及第6180370號。
在一特定實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對BAFFR之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小基因座(miniloci)以及使內源μ及κ鏈基因座失活之靶向突變(參見(例如)Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現出小鼠IgM或κ表現減少，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因回應免疫作用進行類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGκ單株抗體(Lonberg,N.等人，1994如前述；評述於Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中)。下列文獻中進一步描述HuMAb小鼠之製備及用途及該等小鼠所帶有之基因組修飾：Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851。此外參見皆為Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；皆為Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884及WO 99/45962號；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如帶有人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠產生。該等小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物系統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗BAFFR抗體。舉例而言，可使用稱為Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代性轉殖基因系統。該等小鼠描述於(例如)Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗BAFFR抗體。舉例而言，可使用稱為「TC小鼠」之帶有人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛於此項技術中已加以描述(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)且可用於產生本發明之抗BAFFR抗體。
亦可使用噬菌體呈現方法篩選人類免疫球蛋白基因文庫來製備本發明之人類重組抗體。該等用於分離人類抗體之噬菌體呈現方法在此項技術中已確立或描述於以下實例中。參見(例如)：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠製備，其中已將人類免疫細胞重構於該等小鼠中從而可在免疫之後產生人類抗體反應。該等小鼠係描述於(例如)Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
產生人類單株抗體之融合瘤之產生
為獲得產生本發明之人類單株抗體之融合瘤，可將經免疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞分離且與適當永生化細胞株(諸如小鼠骨髓瘤細胞株)融合。可對所得融合瘤就抗原特異性抗體之產生進行篩選。舉例而言，可以50% PEG將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之一數量之P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)融合。將細胞以約2×145塗布於平底微量滴定板內，繼而在含有20%胎純系血清、18%「653」改良性培養基、5% origen(IGEN)、4 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、5 mM HEPES、0.055 mM 2-巰基乙醇、50單位/毫升青黴素、50 mg/ml鏈黴素、50 mg/ml健他黴素(gentamycin)及1×HAT(Sigma；融合後24小時添加HAT)之選擇性培養基中培育兩週。約兩週之後，可將細胞在以HT替代HAT之培養基中培養。隨後可藉由ELISA篩選個別孔之人類單株IgM及IgG抗體。出現廣泛融合瘤生長之後，通常可在10-14日後觀察培養基。再塗布分泌抗體之融合瘤，再次篩選，且若對人類IgG仍為陽性，則可藉由限制稀釋法將單株抗體次選殖至少兩次。隨後可在活體外培養穩定次純系以在組織培養基內產生少量抗體以供表徵。
為純化人類單株抗體，可使所選融合瘤在2公升旋轉瓶中生長以進行單株抗體純化。可將上清液過濾且濃縮，隨後以蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親和力層析。可將經溶離之IgG藉由凝膠電泳及高效液相層析檢驗以確保純度。可將緩衝溶液替換為PBS，且可使用1.43消光係數藉由OD280 測定濃度。可將單株抗體等分且儲存於-80℃下。
產生單株抗體之轉染瘤之產生
本發明之抗體亦可使用(例如)此項技術中熟知之重組DNA技術與基因轉染方法之組合在宿主細胞轉染瘤中產生(例如Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例而言，為表現該等抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術(例如，PCR擴增或cDNA選殖，使用表現所關注抗體之融合瘤)獲得，且該等DNA可插入表現載體中以使得該等基因與轉錄及轉譯控制序列操作性連接。在此上下文中，術語「操作性連接」意欲意謂將抗體基因接合至載體內以使載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因轉錄及轉譯之預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立載體中，或更通常將兩種基因插入同一表現載體中。藉由標準方法(例如該抗體基因片段與載體上之互補限制位點的接合，或若不存在限制位點則為平端接合)將該等抗體基因插入表現載體中。可使用本文所述之抗體之輕鏈及重鏈可變區產生任何抗體同型之全長抗體基因，此係藉由將該等可變區插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，以使得VH 區段與載體內之CH區段操作性連接且VL 區段與載體內之CL區段操作性連接。或者或另外，重組表現載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。該抗體鏈基因可經選殖至載體中以使得該信號肽與該抗體鏈基因之胺基末端同框連接。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即來自非免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。
除抗體鏈基因以外，本發明之重組表現載體帶有控制抗體鏈基因在宿主細胞中表現之調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。該等調控序列描述於(例如)Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可視諸如待轉化宿主細胞之選擇、所需蛋白質表現量等因素而定。哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括引導哺乳動物細胞內高蛋白質表現量的病毒元件，諸如來源於細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒40(Simian Virus 40,SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多形瘤之啟動子及/或增強子。或者，可使用非病毒性調控序列，諸如泛素啟動子或P-血球蛋白啟動子。此外，調控元件由來自不同來源(諸如SRa啟動子系統)之序列組成，其含有來自SV40早期啟動子之序列及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列(Takebe,Y.等人，1988 Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列以外，本發明之重組表現載體可帶有其他序列，諸如調控載體在宿主細胞中複製之序列(例如，複製起點)及可選標記基因。該可選標記基因便利於選擇載體已引入其中之宿主細胞(參見(例如)均為Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，通常可選標記基因賦予載體已引入其中之宿主細胞對諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤之藥物的抗性。可選標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr-宿主細胞中之甲胺喋呤選擇/擴增)及neo基因(用於G418選擇)。
為表現輕鏈及重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。多種形式之術語「轉染」意欲涵蓋通常用於將外源DNA引入原核宿主細胞或真核宿主細胞中之各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及其類似技術。理論上可能使本發明之抗體在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表現。論述了抗體在真核細胞(尤其哺乳動物宿主細胞)中之表現，此係由於該等真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更有可能組裝及分泌經適當摺疊且免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生高產率之活性抗體而言無效(Boss,M.A.及Wood,C.R.,1985 Immunology Today 6：12-13)。
用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括Urlaub及Chasin,1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中所述之dhfr-CHO細胞，與例如R.J.Kaufman及P.A.Sharp,1982 Mol.Biol.159：601-621中所述之DH FR可選標記、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞一起使用)。詳言之，對於與NSO骨髓瘤細胞一起使用，另一表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所示之GS基因表現系統。在一實施例中，例如如US 6,946,292B2所述，用於表現本發明之重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括FUT8基因表現缺乏之哺乳動物細胞株。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將該等宿主細胞培養歷時足以使抗體在宿主細胞內表現或使抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基內的時段來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
免疫結合物
在另一態樣中，本發明之特徵為一種與治療性部分(諸如細胞毒素)、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素結合之抗BAFFR抗體或其片段。該等結合物在本文中稱作「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱作「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括有損於(例如殺死)細胞之任何藥劑。實例包括毒素(toxin)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、硫代秋水仙鹼(t.colchicin)、阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoid)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌黴素(puromycin)及其類似物或同系物。治療劑亦包括(例如)抗代謝物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(5-fluorouracil dacarbazine))、消融劑(例如氮芥(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chloraxnbucil)、美法侖(meiphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannitol)、鏈脲菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順二氯二胺鉑(II)(cis-dichlorodiamine platinum(II))(DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾黴素(daunorubicin，之前為daunomycin)及阿黴素)、抗生素(例如放線菌素(dactinomycin，之前為actinomycin)、博來黴素(bleomycin)、光神黴素及安麯黴素(anthramycin)(AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
可與本發明抗體結合之治療性細胞毒素之其他實例包括多卡米辛(duocarmycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)及奧瑞他汀(auristatin)及其衍生物。卡奇黴素抗體結合物之一實例為可購得的(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
可使用此項技術中可獲得之連接子技術將細胞毒素與本發明之抗體結合。已用於使細胞毒素與抗體結合之連接子類型之實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽連接子。可選擇(例如)易於在低pH值下在溶酶體代謝區內裂解或易於經蛋白酶(諸如較佳表現於腫瘤組織中之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))裂解的連接子。
關於細胞毒素類型、連接子及使治療劑與抗體結合之方法的其他論述，亦參見Saito,G.等人，2003 Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail,P.A.等人，2003 Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne,G.,2003 Cancer Cell 3：207-212；Allen,T.M.,2002 Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan,I.及Kreitman,R.J.,2002 Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter,P.D.及Springer,C.J.,2001 Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
本發明之抗體亦可與放射性同位素結合以產生細胞毒性放射性藥物，亦稱作放射性免疫結合物。可與抗體結合以達成診斷性或治療性用途之放射性同位素的實例包括(但不限於)碘131 、銦111 、釔90 及鑥177 。此項技術中已確立製備放射性免疫結合物之方法。放射性免疫結合物之實例可購得，包括ZevalinTM (DEC Pharmaceuticals)及BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals)，且類似方法可用以製備使用本發明之抗體的放射性免疫結合物。
本發明之抗體結合物可用以修飾指定生物反應，且藥物部分並不應視為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質或多肽。該等蛋白質可包括(例如)酶促活性毒素或其活性片段，諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應修飾劑，諸如淋巴介質、介白素-1(「IL-1」)、介白素-2(「IL-2」)、介白素-6(「IL-6」)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(「GM-CSF」)、顆粒球細胞群落刺激因子(「G-CSF」)或其他生長因子。
已熟知使該治療性部分與抗體結合之技術，參見(例如)Amon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」，Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」，Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)；及Thorpe等人，「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」，Inmunol.Rev.,62：119-58(1982)。
雙特異性分子
在另一態樣中，本發明之特徵為包含本發明之抗BAFFR抗體或其片段之雙特異性或多特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合區可衍生為或連接至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)(例如受體之另一抗體或配體)以產生與至少兩個不同結合位點或靶分子結合之雙特異性分子。實際上，本發明之抗體可衍生為或連接至一個以上其他功能分子以產生結合兩個以上不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子；該等多特異性分子亦意欲為本文中所使用之術語「雙特異性分子」所涵蓋。為產生本發明之雙特異性分子，可將本發明之抗體與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑)功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方法)以產生雙特異性分子。
因此，本發明包括包含至少一種對BAFFR之第一結合特異性及對第二靶抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。舉例而言，第二靶抗原決定基為BAFFR中不同於第一靶抗原決定基之另一抗原決定基。另一實例為包含至少一種對BAFFR之第一結合特異性及對CD20內之抗原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。
此外，對於雙特異性分子具有多特異性之發明而言，除第一及第二靶抗原決定基以外，該分子亦可另外包括第三結合特異性。
在一實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一抗體或其抗體片段(包括(例如)Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚物，或其任意最小片段，諸如Fv或如Ladner等人之美國專利第4,946,778號中所述之單鏈構築體，該專利之內容以引用的方式明確併入本文中。
可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠類單株抗體、嵌合單株抗體及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將結合特異性組份結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異性可獨立地產生且隨後彼此結合。當結合特異性為蛋白質或肽時，可將多種偶合劑或交聯劑用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)(參見(例如)Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括下列文獻中所述之方法：Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78,118-132號；Brennan等人，1985 Science 229：81-83；及Glennie等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，其均可購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合特異性為抗體時，其可藉由兩個重鏈之C末端鉸鏈區之氫硫基鍵結而結合。在一特定實施例中，該鉸鏈區在結合之前經修飾以含有奇數個氫硫基殘基，例如1個。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中經編碼且在同一宿主細胞中表現及組裝。若雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2 或配體×Fab融合蛋白，則此方法尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一單鏈抗體及一結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於(例如)美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由(例如)酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(REA)、FACS分析、生物檢定(例如生長抑制)或西方墨點檢定來證實。此等檢定中之每一者通常藉由使用對所關注之複合物具有特異性的經標記試劑(例如抗體)來偵測特別關注之蛋白質-抗體複合物的存在。
多價抗體
在另一態樣中，本發明提供多價抗體，其包含本發明之抗體與BAFFR結合之至少兩個相同或不同抗原結合部分。在一實施例中，該等多價抗體提供該等抗體之至少兩個、三個或四個抗原結合部分。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵聯連接在一起。或者，鍵聯之方法已關於雙特異性分子描述。可(例如)藉由使本發明之抗體與結合本發明之抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)的抗體進行抗體交聯來獲得四價化合物。
醫藥組合物
在另一態樣中，本發明提供一種組合物(例如醫藥組合物)，其含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配的本發明之一種單株抗體或其抗原結合部分或單株抗體或其抗原結合部分之組合。該等組合物可包括本發明之一種抗體或免疫結合物或雙特異性分子或(例如，兩種或兩種以上不同)抗體或免疫結合物或雙特異性分子之組合。舉例而言，本發明之醫藥組合物可包含與靶抗原上之不同抗原決定基結合或具有互補活性之抗體之組合。
本發明之醫藥組合物亦可以組合療法，亦即與其他藥劑組合投與。舉例而言，組合療法可包括與至少一種其他消炎劑或另一化學治療劑(例如細胞毒性劑、抗癌劑或抗增殖劑)組合的本發明之抗BAFFR抗體。可用於組合療法中之治療劑的實例更詳細描述於以下關於本發明之抗體之用途的部分中。
如本文中所使用之「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、衣料、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似載劑。載劑應適合於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、經脊椎或經表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦即抗體、免疫結合物或雙特異性分子)可包覆於保護該化合物免受可使該化合物失活之酸及其他自然條件之作用的材料中。
本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。「醫藥學上可接受之鹽」係指保留母體化合物之所需生物活性且並不賦予任何不當毒理學作用的鹽(參見(例如)Berge,S.M.等人，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括來源於以下各酸之鹽：無毒性無機酸，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及無毒性有機酸，諸如脂族單羧酸及二羰酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括來源於以下之鹽：鹼土金屬，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及無毒性有機胺，諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及其類似物。
本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血基棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。
可用於本發明之醫藥組合物中之合適水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可(例如)藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由保持所需粒度及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可藉由前述滅菌程序及藉由包涵多種抗菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物存在。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。此外，可注射藥物形式之吸收延長可藉由包涵延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液，及用於臨用製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。醫藥學活性物質之該等介質及試劑之用途在此項技術中已知。除非任何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋將其用於本發明之醫藥組合物中。亦可在該等組合物中併入補充性活性化合物。
治療組合物通常在製造及儲存條件下必須為無菌且穩定的。可將組合物調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適合於高藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物)及其合適混合物。可(例如)藉由使用衣料(諸如卵磷脂)、在分散液之情況下藉由保持所需粒度及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。在多種情況下，組合物中可包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物之吸收延長可藉由在該組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
關於穩定蛋白(例如抗體)調配物之產生的評述可見於Cleland等人(1993)Crit.Reviews.Ther.Drug Carrier Systems 10(4)：307-377及Wei Wang(1999)Int.J.Pharmaceutics 185：129-88中。抗體之其他調配物論述可見於以下文獻中，例如Daugherty及Mrsny(2006)Advanced Drug Delivery Reviews 58：686-706；US 6171586；US 4618486；US 20060286103；WO 06044908；WO 07095337；WO 04016286；Colandene等人(2007)J.Pharm.Sci 96：1598-1608；Schulman(2001)Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：S6-S11及其他已知參考文獻。
用於皮內或皮下施用之溶液或懸浮液通常包括一或多種以下組份：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理食鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如伸乙基二胺四乙酸；緩衝液，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及用於調節張力之藥劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼(諸如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH值。該等製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、可拋棄型注射器或多次劑量小瓶中。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之本發明之抗體與上文所列舉之一種成份或成份組合一起併入適當溶劑中，視需要繼而進行滅菌微過濾來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有基本分散介質及來自上文所列舉之其他所需成份。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其產生活性成份外加來自其先前經無菌過濾之溶液的任何其他所需成份的粉末。
當治療有效量之本發明之抗體藉由(例如)靜脈內、經皮或皮下注射投與時，結合劑將呈無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式。與pH值、等張性、穩定性及其類似因素具有適當相關性之該等非經腸可接受之蛋白溶液的製備在此項技術之技能範圍內。除結合劑以外，用於靜脈內、經皮或皮下注射之較佳醫藥組合物亦應含有等張媒劑，諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液、乳酸化林格氏注射液或如在此項技術中已知之其他媒劑。本揭示案之醫藥組合物亦可含有穩定劑、防腐劑、緩衝液、抗氧化劑或熟習此項技術者已知之其他添加劑。
可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成份的量應視所治療之個體及特定投藥模式而定。可與載劑物質組合以產生單一劑型之活性成份的量通常為產生治療效應之組合物的量。一般而言，以100%計，此量在約0.01%至約99%與醫藥學上可接受之載劑組合的活性成份，約0.1%至約70%，或約1%至約30%活性成份之範圍內。
給藥方案經調整以提供最佳所要反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或如治療情況之緊急性所示，可按比例減少或增加劑量。將非經腸組合物調配成易於投與且劑量均一之單位劑型尤其有利。如本文中所使用之單位劑型係指適合作為用於待治療個體之單次劑量的實體上離散之單位；各單位含有經計算以產生所要治療效應之預定量的活性化合物以及所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格由活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效應，及在混配該活性化合物用於治療個體之敏感性的技術中所固有之限制規定且直接視其而定。
為投與抗體，劑量在每公斤主體體重約0.0001 mg至100 mg，且更通常每公斤主體體重0.01 mg至5 mg之範圍內。舉例而言，劑量可為每公斤體重0.3 mg、每公斤體重1 mg、每公斤體重3 mg、每公斤體重5 mg或每公斤體重10 mg，或在每公斤1-10 mg範圍內。例示性治療方案需要每週投藥一次，每兩週投藥一次，每三週投藥一次，每四週投藥一次，每月投藥一次，每三個月投藥一次或每三至六個月投藥一次。本發明之抗BAFFR抗體之給藥方案包括每公斤體重靜脈內投與1 mg或3 mg，其中該抗體係使用以下給藥方案中之一者給予：每四週一次，6次劑量，隨後每三個月一次；每三週一次；每公斤體重3 mg一次，繼而每三週每公斤體重1 mg。
在一些方法中，同時投與兩種或兩種以上具有不同結合特異性之單株抗體，在該情況下，所投與之各抗體之劑量處於指定範圍內。抗體通常經多次投與。單次給藥之間的時間間隔可為(例如)每週、每月、每三個月或每年。時間間隔亦可如藉由量測患者體內靶抗原之抗體的血液含量所指示為不規則的。在一些方法中，調整劑量以使血漿抗體濃度達到約1-1000 μg/ml且在一些方法中為約25-300 μg/ml。
或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在該情況下，需要較低頻率之投藥。劑量及頻率視抗體在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人類抗體展示最長半衰期，其次為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥之劑量及頻率可視治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應用中，以相對不頻繁之時間間隔投與相對較低之劑量歷經較長時段。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，時常需要相對較短時間間隔之相對較高之劑量直至疾病進程得以減緩或終止或直至患者展示疾病症狀的部分或完全改善。此後，可向患者施以預防性方案。
本發明之醫藥組合物中活性成份之實際劑量水準可經變化以獲得對於特定患者、組合物及投藥模式而言有效達成所需治療反應，而對患者不具有毒性的活性成份之量。選定劑量水準應視多種藥物代謝動力學因素而定，該等因素包括所用之本發明之特定組合物或其酯、鹽或醯胺的活性；投藥途徑；投藥時間；所用特定化合物之排泄速率；治療持續時間；與所用特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或物質；所治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。
「治療有效劑量」之本發明之抗BAFFR抗體可使得疾病症狀嚴重性降低，無疾病症狀時段之頻率及持續時間增加，或預防由於疾病病痛所致之損傷或殘疾。
本發明之組合物可藉由一或多種投藥途徑使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥途徑及/或投藥模式將視所需結果而變化。本發明之抗體之投藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、經脊椎或其他非經腸投藥途徑(例如藉由注射或輸注)。如本文中所使用之短語「非經腸投藥」意謂除腸內及局部投藥以外，通常藉由注射之投藥模式，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及腦幹內注射及輸注。
或者，本發明之抗體可藉由諸如局部、表皮或黏膜投藥途徑之經腸途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部投與。
活性化合物可與保護該化合物免於快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之諸多方法已申請專利或通常為熟習此項技術者所知。參見(例如)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治療組合物可以此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例而言，在一實施例中，本發明之治療組合物可以無針皮下注射裝置投與，諸如美國專利第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號或第4,596,556號中所示之裝置。適用於本發明之熟知植入物及模組之實例包括：美國專利第4,487,603號，其展示一種用於以控制速率分配藥物之可植入式微輸注泵；美國專利第4,486,194號，其展示一種用於經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國專利第4,447,233號，其展示一種用於以精確輸注速率傳遞藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其展示一種用於持續藥物傳遞之可變流速可植入式輸注設備；美國專利第4,439,196號，其展示一種具有多腔隔室之滲透性藥物傳遞系統；及美國專利第4,475,196號，其展示一種滲透性藥物傳遞系統。多種其他此類植入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者所知。
在某些實施例中，可調配本發明之人類單株抗體以確保在活體內適當分布。舉例而言，血腦屏障(BBB)排除許多高親水性化合物。為確保本發明之治療化合物橫穿BBB(若需要)，可將其調配(例如)於脂質體中。對於製備脂質體之方法，參見(例如)美國專利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂質體可包含一或多個部分，該等部分經選擇性輸送至特定細胞或器官中，由此增強靶向藥物傳遞(參見(例如)V.V.Ranade,1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。例示性靶向部分包括葉酸鹽或生物素(參見(例如)Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；界面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen,1994 FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler,1994 Immunomethods 4：273。
本發明之用途及方法
本發明之抗體具有活體外及活體內診斷及治療效用。舉例而言，此等分子可投與至培養物中(例如活體外或活體內)，或個體體內(例如活體內)之細胞中以治療、預防或診斷多種病症。如本文中所使用之術語「個體」意欲包括人類動物及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動物及爬行動物。
該等方法尤其適用於治療、預防或診斷BAFFR相關病症及/或自體免疫疾病，例如全身性紅斑狼瘡症或類風濕性關節炎。
本發明亦提供藉由投與包含治療有效劑量之本發明之抗體的組合物來消除動物體內B細胞，較佳消除或殺死人類B細胞的方法。
如本文所用之「BAFFR相關病症」包括與異常BLyS含量有關或藉由異常BLyS含量表徵之病狀，及/或可藉由消除或殺死B細胞治療之疾病或病狀。其包括發炎病狀、過敏症及過敏性病狀、過敏反應、自體免疫疾病、嚴重感染及器官或組織移植排斥。其另外包括B細胞贅瘤。
舉例而言，本發明之抗體可用於治療心臟移植、肺移植、聯合心肺移植、肝臟移植、腎移植、胰腺移植、皮膚移植或角膜移植之接受者，包括同種異體移植排斥或異種移植排斥，且用於(諸如)在骨髓移植之後預防移植物抗宿主病，及與器官移植相關之動脈硬化。
本發明之抗體適用於治療、預防或改善自體免疫疾病及發炎病狀，尤其為病因包括自體免疫因素之發炎病狀，諸如關節炎(例如類風濕性關節炎、慢性漸進性關節炎及變形性關節炎)及風濕性疾病(包括涉及骨質流失、炎性疼痛之發炎病狀及風濕性疾病)、脊椎關節病(包括強直性脊椎炎)、萊特氏症候群(Reiter syndrome)、反應性關節炎、牛皮癬性關節炎及腸病性關節炎，過敏(包括氣管過敏及真皮過敏)及過敏症。可使用本發明之抗體的特定自體免疫疾病包括自體免疫血液學病症(包括(例如)溶血性貧血症、再生不全性貧血症、純紅血球貧血症及特發性血小板減少症)、後天性A型血友病、冷凝集素病、冷球蛋白血症、血栓性血小板減少性紫癜、修格蘭氏症候群(Sjgren's syndrome)、全身性紅斑狼瘡症、發炎肌肉病症、多軟骨炎、硬皮病、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關血管炎、IgM介導之神經病、斜視眼陣攣肌陣攣症候群、韋格納氏肉芽腫病(Wegener granulomatosis)、皮肌炎、慢性活動型肝炎、重症肌無力、牛皮癬、史蒂芬-強森症候群(Steven-Johnson syndrome)、尋常天疱瘡、落葉型天疱瘡、特發性口炎性腹瀉、自體免疫發炎性腸道疾病(包括(例如)潰瘍性結腸炎、克羅恩氏症(Crohn's disease)及腸激躁症候群)、內分泌眼病、葛瑞夫茲氏症(Graves' disease)、類肉瘤病、多發性硬化症、視神經脊髓炎、原發性膽汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前葡萄膜炎、中葡萄膜炎及後葡萄膜炎以及全葡萄膜炎)、乾燥性角膜結膜炎及春季角膜結膜炎、肺間質纖維化、牛皮癬性關節炎及絲球體腎炎(有或無腎病症候群，例如包括特發性腎病症候群或微小病變性腎病)、腫瘤、皮膚及角膜之發炎疾病、肌炎、骨植入物鬆弛、代謝失調(諸如動脈粥樣硬化、糖尿病及血脂異常)。
本發明之抗體亦適用於治療、預防或改善哮喘、支氣管炎、肺塵埃沈著病、肺氣腫及其他氣管阻塞性或發炎疾病。
本發明之抗體亦適用於治療骨代謝疾病，包括骨關節炎、骨質疏鬆症及其他發炎性關節炎皮疹，且通常為骨質流失，包括年齡相關之骨質流失，且尤其為牙周病。
因為BAFFR與人類外周血淋巴細胞及與人類B細胞株之結合係由BAFFR多肽所介導，故本發明之抗體亦可適用於診斷或治療B細胞贅瘤。該等疾病及病狀之實例包括(但不限於)B細胞非霍奇金氏淋巴瘤，諸如小淋巴細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)；前驅體B淋巴母細胞白血病；及B細胞慢性淋巴細胞白血病，及多發性骨髓瘤。其他B細胞贅瘤涵蓋於本發明之範疇內。
本發明之抗體可以唯一活性成份形式投與，或與其他藥物(例如免疫抑制或免疫調節劑或其他消炎劑或其他細胞毒性劑或抗癌劑)聯合(例如作為該等其他藥物之佐劑或與其他藥物組合)投與(例如)以治療或預防上述疾病。舉例而言，本發明之抗體可與以下各物組合使用：DMARD，例如金鹽、柳氮磺吡啶(sulphasalazine)、抗瘧藥(antimalarias)、甲胺喋呤、D-青黴胺(D-penicillamine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、黴酚酸(mycophenolic acid)、環孢素(cyclosporine A)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、二甲胺四環素(minocycline)、來氟米特(leflunomide)、糖皮質激素(glococorticoids)；鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如環孢素A或FK 506；淋巴細胞再循環調節劑，例如FTY720及FTY720類似物；mTOR抑制劑，例如雷帕黴素(rapamycin)、40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性之子囊黴素，例如ABT-281、ASM981等；皮質類固醇；環磷醯胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；甲胺喋呤；咪唑立賓(mizoribine)；黴酚酸；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)；15-去氧史帕胍淋(15-deoxyspergualine)或其免疫抑制同源物、類似物或衍生物；免疫抑制單株抗體，例如白血球受體之單株抗體，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD11a、CD25、CD28、CD40、CD45、CD52、CD58、CD80、CD86或其配體；其他免疫調節化合物，例如具有CTLA4或其突變體之胞外域(例如CTLA4或其與非CTLA4蛋白序列接合之突變體(例如CTLA4Ig(例如稱為ATCC 68629之CTLA4Ig)或其突變體(例如LEA29Y))的至少胞外部分)之至少一部分的重組結合分子；黏著分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化學治療劑，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatinum)、阿黴素或5-氟尿嘧啶；抗TNF劑，例如TNF之單株抗體，例如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、CDP870，或TNF-RI或TNF-RII之受體構築體，例如依那西普(Etanercept)、PEG-TNF-RI；前發炎性細胞激素之阻斷劑、IL-1阻斷劑(例如阿那白滯素(Anakinra)或IL-1 trap)、AAL160、ACZ 885、IL-6阻斷劑；趨化因子阻斷劑，例如蛋白酶(例如金屬蛋白酶)之抑制劑或活化劑、抗IL4抗體、抗IL-15抗體、抗IL-6抗體、抗IL-21抗體、抗IL-12抗體、抗p40抗體、抗IL-17抗體、抗CD20抗體、NSAID(諸如阿司匹林(aspirin))或抗感染劑(列項並不限於所提及之藥劑)。
根據上文，本發明在另一態樣中提供：如上所定義之方法，其包含共投與(例如伴隨或依次投與)治療有效量之BAFFR拮抗劑(例如本發明之抗體)及至少一種第二藥物，該第二藥物為免疫抑制劑/免疫調節劑、消炎化學治療藥或抗感染藥，例如如上所示之藥物。
或一種治療組合(例如套組)，其包含治療有效量之a)BAFFR拮抗劑，例如本發明之抗體，及b)至少一種選自免疫抑制劑/免疫調節劑、消炎化學治療劑或抗感染藥(例如如上所指示之藥物)之第二物質。該套組可包含用於其投藥之說明。
若本發明之抗體與其他免疫抑制劑/免疫調節劑、消炎化學治療劑或抗感染療法聯合投與，則共投與組合化合物之劑量當然將視所用共投與藥物之類型(例如其是否為DMARD、抗TNF、IL-1阻斷劑或其他類型)、所用特定藥物、所治療病狀等而變化。
在一特定實施例中，本發明之抗體可與另一殺B細胞藥劑(亦即例如靶向CD20之具有ADCC活性之抗體，諸如利妥昔單抗(Rituximab))組合投與。
在其他實施例中，僅向選自患有SLE或RA且展現異常BLyS血清含量之患者的患者群體投與本發明之抗體。在其他實施例中，僅向選自對抗BLyS療法起反應之患者之群的患者群體投與本發明之抗體。鑑別具有增加之對抗BLyS治療起反應之可能性的患者之生物指標可為(但不限於)以下生物指標中之任一者：增加之血清BLyS含量、增加之特定B細胞亞群含量、特定類型之自身抗體之存在與否。
在一實施例中，本發明之抗體可用於偵測BAFFR之含量或含有BAFFR之細胞之含量。此可(例如)藉由使樣品(諸如活體外樣品)及對照樣品與抗BAFFR抗體在使該抗體與BAFFR之間形成複合物的條件下接觸來達成。偵測樣品及對照物中抗體與BAFFR之間所形成的任何複合物且將其進行比較。舉例而言，可使用本發明之組合物來執行此項技術中所熟知之標準偵測方法，諸如ELISA及流式細胞計數檢定。
因此，在一態樣中，本發明另外提供用於偵測樣品中BAFFR(例如人類BAFFR抗原)之存在，或量測BAFFR之量的方法，其包含使該樣品及對照樣品與特異性結合BAFFR之本發明之抗體或其抗原結合區在使該抗體或其部分與BAFFR之間形成複合物的條件下接觸。隨後偵測複合物之形成，其中樣品與對照樣品之間相比較之複合物形成差異指示樣品中存在BAFFR。
由本發明之組合物(例如抗體、人類抗體及雙特異性分子)及使用說明書組成的套組亦在本發明之範疇內。該套組可另外含有至少一種其他試劑，或本發明之一或多種其他抗體(例如，具有與靶抗原上不同於第一抗體之抗原決定基結合之互補活性的抗體)。套組通常包括表明套組內容物之所欲用途的標籤。術語標籤包括套組上所提供或與套組一起提供或以其他方式附於該套組之任何書寫或記錄材料。套組可另外包含診斷患者是否屬於如上所定義之對抗BAFFR抗體治療起反應之群之方法。
本發明已加以充分描述，其由為說明性且並不意欲進一步限制本發明之以下實例及申請專利範圍進一步說明。
實驗部分 1.篩選檢定 初始淘選之FACS篩選
為偵測來自第一初始篩選(例如噬菌體呈現篩選)之與BAFFR結合之Fab抗體，及/或為進行ELISA陽性純系之第二篩選方法，可以FACS如下篩選所選大腸桿菌純系之溶解物：對各別細胞株之細胞(親本細胞或經BAFFR轉染之細胞)進行計數，且將其在PBS/3% FCS/0.02% NaN3 (FACS緩衝液)中調節為2×107 個細胞/毫升。在96孔圓底板中，將2×105 個細胞與35 μl含Fab細菌溶解物在最終體積為100 μl FACS緩衝液中混合且在4℃下在震盪器上培育一小時。隨後用FACS緩衝液洗滌細胞一次，且將其再懸浮於已於FACS緩衝液中以1：200稀釋之與藻紅素結合之山羊抗人類IgG二次抗體中。在4℃下於震盪器上培育一小時之後，將細胞用FACS緩衝液再洗滌一次，再懸浮於FACS緩衝液中，且(例如)在FACSArray儀器(Becton Dickinson)中經由細胞之螢光強度量測細胞表面結合。
Fc捕捉ELISA
為鑑別來自噬菌體呈現之富集純系中與BAFFR結合之Fab抗體，在Fc捕捉ELISA裝置中如下篩選所選大腸桿菌純系之溶解物：在4℃下用20 μg/ml於PBS中稀釋之山羊抗人類IgG Fc塗布Maxisorp 384孔板隔夜。次日，將該等板洗滌，用5% MTBST阻斷，且在室溫下與5 μg/ml BAFFR：Fc(Alexis)一起培育一小時。同時，用最終濃度為2.5%之奶粉阻斷含Fab細菌溶解物。隨後，將預阻斷之細菌溶解物添加至板上所捕捉之BAFFR：Fc中。隨後藉由與於0.5% MPBST中以1：5000稀釋的與鹼性磷酸酶結合之Fab特異性山羊抗人類IgG一起培育，繼而添加AttoPhos螢光受質(Roche Diagnostics)來偵測與BAFFR：Fc結合之Fab。在TECAN Spectrafluor板讀取器中記錄在430 nm下激發之535 nm下之螢光發射。
Fab捕捉ELISA
為偵測來自噬菌體呈現之與BAFFR結合之Fab抗體，在Fab捕捉ELISA裝置中篩選所選大腸桿菌純系之溶解物：在4℃下用綿羊抗人類IgG(Fd片段特異性抗體，在PBS中以1：1000稀釋)塗布Maxisorp 384孔板隔夜。次日，將該等板洗滌且在室溫下用TBS/0.05% Tween/5%奶粉(5% MTBST)阻斷一小時。同時，用最終濃度為2.5%之奶粉阻斷含Fab細菌溶解物。隨後，將預阻斷之細菌溶解物添加至板上所固定之捕捉抗體中。隨後使所捕捉之HuCAL-Fab片段與1 μg/ml經結合生物素之BAFFR：Fc(在PBST中稀釋)結合，其最終藉由與結合至鹼性磷酸酶(Zymax)且在2.5% MPBST中以1：3000稀釋之抗生蛋白鏈菌素一起培育，繼而添加AttoPhos螢光受質(Roche Diagnostics)來偵測。在TECAN Spectrafluor板讀取器中記錄在430 nm下激發之535 nm下之螢光發射。
BAFFR-BLyS結合ELISA
為直接鑑別抑制性抗體，以BAFFR-BLyS結合ELISA篩選經FLAG標記之Fab：在4℃下用1 μg/ml於PBS中之hsBLyS塗布MaxiSorp 96孔板隔夜。次日，將該等板洗滌且在室溫下用PBS/2% BSA阻斷至少一小時。同時，用最終濃度為2.5%之BSA阻斷含Fab細菌溶解物。將預阻斷細菌溶解物與5 μg/ml單株抗FLAG M2抗體一起培育30分鐘以藉由交聯提高抑制活性，且隨後在室溫下在略微震盪下再經30分鐘添加10 ng/ml經結合生物素之BAFFR：Fc(在PBS/2% BSA中稀釋)。將預培育溶解物/bio-BAFFR：Fc混合物添加至板所結合之hsBLyS中。在室溫下30分鐘且洗滌之後，藉由與結合至鹼性磷酸酶(Zymax)且在PBS/2.5% BSA中以1：3000稀釋之抗生蛋白鏈菌素一起培育，繼而添加AttoPhos螢光受質(Roche Diagnostics)來偵測與BLyS結合之bio-BAFFR：Fc。在TECAN Spectrafluor板讀取器中記錄在430 nm下激發之535 nm下之螢光發射。
若使用經純化之Fab替代細菌溶解物，則省略抗FLAG交聯步驟。
成熟後FACS篩選 第二成熟期：
為篩選來自成熟期之結合物，可如所述進行FACS分析，其中進行以下改變：稀釋所選大腸桿菌純系之溶解物直至最大信號低於飽和。分析溶解物與Raji細胞之結合。將96孔每孔之5×104 個細胞與100 μl經不同稀釋之細菌溶解物混合。如所述進行與細胞結合之Fab之偵測。根據其信號強度對純系分級。
2.由篩選檢定鑑別之抗體的親和力測定
使用BioVeris進行KD 值測定的溶液平衡滴定(SET)法可基本上如文獻(Friquet等人(1985)J.Immunol.Meth.77,305-319及Haenel等人(2005)Anal.Biochem.339,182-184)所述於溶液中進行親和力測定。為改良SET法之敏感性及精確性，使該方法由經典ELISA轉變為基於ECL之BioVeris技術。根據製造商之說明，用BV-標籤TM NHS酯(Bioveris Europe,Witney,Oxfordshire,UK)標記1 mg/ml山羊抗人類(Fab)2 或山羊抗小鼠IgG(Fc片段特異性抗體)(Dianova)。在聚丙烯微量滴定板及補充有0.5% BSA及0.02% Tween 20之作為檢定緩衝液之PBS(pH 7.4)中進行該實驗。將未標記之BAFFR：Fc以2n連續稀釋。使用無抗原之孔來測定Smax值。添加100 pM Fab(在75 μl最終體積中之最終濃度)之後，將混合物在室溫下培育2小時。隨後每孔添加25 μl塗布有0.25 μg/ml經結合生物素之BAFFR：Fc抗原之Dynabeads(0.4 mg/ml M-280抗生蛋白鏈菌素，DYNAL，Hamburg)與經BV-標籤標記之偵測抗體(對於抗人類Fab以1：4000之最終稀釋度或對於抗小鼠IgG以1：2000之最終稀釋度)之混合物。在室溫下在Eppendorf震盪器(700 rpm)上培育30分鐘之後，使用M-384 SERIES工作站(Bioveris Europe)偵測電化學發光信號。
經直接塗布抗原上之Biacore KD 值測定
使用BIAcore 3000儀器(BIAcore,Uppsala,Sweden)用與捕捉Fc之BAFFR：Fc或與共價固定之BAFFR：Fc(Alexis)或BAFFR(Peprotech)結合之各別Fab之連續稀釋液測定動力學常數kon 及koff 。為共價固定抗原或抗Fc捕捉抗體，使用標準EDC-NHS胺偶合化學作用。在PBS(136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2 HPO4 、1.76 mM KH2 PO4 ，pH 7.4)中在20 μl/min之流動速率下使用在1.5 nM至500 nM範圍內之Fab濃度進行動力學量測。各濃度之注射時間為1分鐘，繼而為3分鐘或15分鐘解離階段。為進行再生，兩次施用甘胺酸/HCl(pH 1.5)之注射液。使用BIA評估軟體3.1(BIAcore)擬合所有感應圖(sensogram)。
為在10%人類血清存在下測定親和力，在含有10%人類血清之PBS中進行動力學量測，該人類血清在使用之前經無菌過濾(孔隙尺寸為1.2 μm及0.2 μm)以移除解凍之後的蛋白凝集物。
BAFFR-BLyS結合檢定(競爭FACS)中之IC50 值測定使用表現內源BAFFR之Raji細胞進行BAFFR-BLyS結合檢定。以40 nM至0.001 nM範圍內之最終稀釋液形式使用BAFFR特異性Fab。在4℃下於震盪器上將經稀釋Fab在96孔板中與每孔5×104 個Raji細胞一起培育1小時。隨後添加最終濃度為25 ng/ml之經結合生物素之hsBLyS，且將細胞在4℃下於震盪器上培育30分鐘。將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，且接著再懸浮於已在FACS緩衝液中以1：200稀釋之與藻紅素結合之抗生蛋白鏈菌素(Dianova)中。在4℃下於震盪器上進行染色一小時。最終將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，再懸浮於FACS緩衝液中，且在FACSArray儀器(Becton Dickinson)中經由螢光細胞計數偵測與細胞表面BAFFR結合之BLyS。
BAFFR：Fc-BLyS結合檢定(競爭ELISA)中之IC50 值測定在4℃下用人類可溶性BLyS塗布96孔MaxiSorp板隔夜。
塗布之後，將孔用PBS/0.05% Tween20(PBST)洗滌4次，且隨後在37℃下用含有1%牛血清白蛋白之PBST阻斷1小時，繼而用PBST進行4次洗滌步驟。添加20 ng/ml之經結合生物素之人類BAFFR：Fc融合蛋白(Axxora)，且在37℃下以增加濃度之抗BAFFR抗體捕捉1小時。再洗滌一輪之後，將ExtrAvidin-鹼性磷酸酶(Sigma)添加至孔中且在37℃下培育30分鐘。藉由添加於二乙醇胺中含有磷酸對硝基苯酯之溶液(Sigma)偵測結合之磷酸酶。在約20分鐘之後用等體積2 N氫氧化鈉中止顏色反應，且在405 nm下在板讀取器(SpectraMax 190,Molecular Devices)上量測吸光度。
BAFFR肽(miniBR3)-BLyS結合檢定(競爭ELISA)中之IC50 值測定
在4℃下用人類可溶性BLyS塗布96孔MaxiSorp板隔夜。塗布之後，將孔用PBS/0.05% Tween20(PBST)洗滌4次，且隨後在37℃下用含有1%牛血清白蛋白之PBST阻斷1小時，繼而用PBST進行4次洗滌步驟。添加20 ng/ml之經結合生物素之BAFFR產生之肽(miniBR3,PiCHEM,Austria)，且在37℃下以增加濃度之抗BAFFR抗體捕捉1小時。再洗滌一輪之後，將ExtrAvidin-鹼性磷酸酶(Sigma)添加至孔中且在37℃下培育30分鐘。藉由添加於二乙醇胺中含有磷酸對硝基苯酯(Sigma)之溶液偵測結合之磷酸酶。在約20分鐘之後用等體積2 N氫氧化鈉中止顏色反應，且在405 nm下在板讀取器(SpectraMax 190,Molecular Devices)上量測吸光度。
與獼猴BAFFR之交叉反應性的分析
在對經獼猴BAFFR轉染之HEK293T細胞的FACS滴定分析中測試Fab與獼猴BAFFR之交叉反應性。以177 nM至0.001 nM範圍內之稀釋液形式使用最終候選Fab。在4℃下於震盪器上將經稀釋Fab在每孔具有5×104 個細胞之96孔板中培育1小時。隨後將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，且再懸浮於已在FACS緩衝液中以1：200稀釋之與藻紅素結合之山羊抗人類IgG(Dianova)中。在4℃下於震盪器上進行染色1小時。最終將細胞用FACS緩衝液洗滌兩次，且在FACSArray儀器(Becton Dickinson)中經由螢光細胞計數來偵測Fab結合。
與BCMA及TACI之交叉反應性的分析 FACS
在對經BCMA轉染之HEK293T細胞的FACS滴定分析中測試Fab與BCMA之交叉反應性：以在高nM或甚至μM下至pM範圍內之最終濃度使用Fab。如所述進行細胞之染色及Fab結合之偵測。
ELISA
在4℃下用山羊抗人類IgG(Fcγ片段特異性捕捉抗體)塗布384孔MaxiSorp板隔夜。塗布之後，將孔用PBS/0.05% Tween20(PBST)洗滌兩次，且隨後在室溫下用含有5%奶粉之PBST阻斷1小時，繼而用PBST進行兩次洗滌步驟。添加重組BCMA及TACI Fc融合蛋白，且在室溫下捕捉1小時。隨後添加經純化且稀釋之BAFFR特異性Fab，且將板在室溫下培育1小時。為偵測Fab，添加與鹼性磷酸酶(AP)結合之Fab特異性山羊抗人類IgG，且將板在室溫下培育1小時。各培育步驟之後，用PBST洗滌孔五次。為偵測AP結合物，根據製造商之說明使用AttoPhos(Roche)。使用TECAN Spectrafluor板讀取器量測螢光。
3.基於細胞之功能性檢定 BLyS誘發之人類B細胞增殖之協同刺激
藉由使用MACS B細胞分離套組II(Miltenyi Biotec)消除其他細胞類型而自周邊血液單核細胞純化未改變(Untouched)之B淋巴細胞。為誘發B細胞增殖，將100 μl含有1×105 個細胞之物質以一式五份接種於圓底96孔板中。添加3 ng/ml濃度之人類可溶性BLyS以及0.35%(體積/體積)與抗人類IgM抗體偶合之珠粒。為測定其抑制性效能，以不同濃度添加不同濃度之抗BAFFR抗體。為測定抗BAFFR抗體之促效特性，用0.35%(體積/體積)與抗人類IgM抗體偶合之珠粒及增加濃度之抗BAFFR抗體(不另外添加BLyS)誘發細胞。之後，將細胞培養3天。在最後12小時，每孔添加1 μCi氚化胸苷。於過濾器上收集細胞，且在閃爍計數器中定量細胞相關之放射性。
BLyS誘發之人類B細胞IgG1產生之協同刺激藉由使用MACS B細胞分離套組II(Miltenyi Biotec)消除其他細胞類型而自周邊血液單核細胞純化未改變之B淋巴細胞。為誘發IgG1合成，將100 μl含有1×105 個細胞之物質一式五份接種於圓底96孔板中，且用3 ng/ml人類可溶性BLyS以及100 ng/mL人類IL-21(Pepro Tech Inc.)刺激。為測定其抑制性效能，添加不同濃度之抗BAFFR抗體。為測定抗BAFFR抗體之促效特性，用100 ng/mL人類IL-21及增加濃度之抗BAFFR抗體(未另外添加BLyS)誘發細胞。將細胞培養9天且收集上清液。藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)測定細胞上清液中之IgG1。
抗體依賴性細胞毒性檢定(ADCC)
藉由使用MACS B細胞分離套組II(Miltenyi Biotec)消除其他細胞類型而自周邊血液單核細胞(PBMC)純化未改變之B淋巴細胞。類似地，藉由使用MACS人類NK細胞分離套組(Milteny Biotech)於AutoMAC裝置上負性消除而自PBMC純化自體性天然殺手(NK)細胞。將100 μl中增加濃度之抗BAFFR抗體與50 μl培養基中之1×104 個B細胞在V形96孔板(Corning)中一起培育20分鐘。隨後，添加50 μl含有1×105 個NK細胞之物質，且在37℃下培育4小時。使細胞減速旋轉(spun down)且移除150 μl上清液。將細胞再懸浮，且添加10 μl 7-胺基放線菌素D(7-AAD,Becton Dickinson)之1：100稀釋液。在FACScalibur(Becton Dickinson)儀器中對細胞進行計數。使用CellQuest Pro軟體(Becton Dickinson)進行7-AAD陽性細胞之數據分析。
4.活體內功能性檢定 活體內B細胞消除檢定
如下評定抗BAFFR抗體對B細胞數之消除作用：
a)藉由用螢光標記之對B細胞及T細胞表面標記(分別為CD3及CD19)具特異性之抗體對全血或經分離周邊血液單核細胞(PBMC)染色來量測血液淋巴細胞代謝區中B細胞之相對數量。藉由流式細胞儀定量CD3及CD19陽性細胞之相對百分比，且B細胞之選擇性減少可由T細胞與B細胞之比率增加表示。
b)根據製造商之說明藉由流式細胞儀使用螢光標記之抗CD19抗體以及TruCOUNT管(目錄號340334；Becton Dickinson,San Jose CA)，以每微升血液之細胞數形式測定絕對B細胞數。
CIA動物模型檢定
已提出膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)反映人類疾病之諸多態樣。CIA係藉由用佐劑中之II型膠原蛋白使小鼠之遺傳敏感品系免疫而誘發，且由自體免疫反應(包括自體抗體產生，該自體抗體隨後與II型膠原蛋白(CII)之特定區結合)介導。在CIA之發病機制中B淋巴細胞及T淋巴細胞均很重要。動物模型中之關節組織學與人類疾病具有諸多類似性，其中諸如滑膜增生、邊緣糜爛及軟骨表面破壞之態樣為一些病理生理學特徵。
在第0天用II型膠原蛋白(C-II)免疫且隨後在第21天用C-II進行加強劑處理之後，DBA/1小鼠通常產生嚴重關節炎症狀。在本發明之研究中，在預防性療法中，每週兩次用每隻小鼠200微克抗BAFFR抗體或同型對照抗體對小鼠進行腹膜內處理(第-10日至約第36日)。在整個實驗中監測作為疾病嚴重程度指示物之爪腫脹。在實驗結束時，若觀察到腫脹功效，則對爪進行組織學分析。藉由細胞分離及FACS分析可評定脾臟、血液及淋巴結中之B細胞消除。進行抗膠原蛋白抗體之ELISA以研究是否亦抑制抗體力價。在應用杜奈特多重比較檢驗(Dunnetts multiple comparison test)(單因素方差分析)時，若展現統計上顯著之腫脹減輕，則假定抗體在CIA動物模型中具有良好功效。通常此體現為爪腫脹隨時間過程減輕50%，其中各組內動物之間差異較小。
實例：
下表描述本發明抗體之特定實例的相應CDR之SEQ ID編號。HCDR1、HCDR2及HCDR3表示抗體重鏈之CDR1、CDR2及CDR3，且LCDR1、LCDR2及LCDR3表示抗體輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3。
實例之詳細表徵
以FACS測定人類Fab形式之本發明抗體之EC50 值藉由以FACS進行Fab滴定來測定Fab對經轉染HEK293細胞以及表現內源BAFFR之Raji細胞之EC50 值。
因為在MOR07347中在HCDR3位置110中發現之麩醯胺酸似乎有利，故亦將此位置引入交叉純系MOR6743中而產生抗體MOR07685。此抗體展示FACS滴定中所測定之與MOR06743及MOR07347相當之EC50 值。
BAFFR-BLyS結合檢定中之Fab IC50 值測定(FACS)在BAFFR-BLyS結合抑制檢定中藉由Fab滴定(FACS)測定人類Fab形式之本發明抗體對Raji細胞之IC50 值。此等分析之結果係列於表3中。
BAFFR-BLyS結合檢定(ELISA)中之抗體IC50 值測定
在競爭ELISA中測定人類Fab及IgG2形式之本發明抗體之IC50 值，其中抗體經滴定以抑制BAFFR(BAFFR：Fc融合蛋白)之胞外域與人類可溶性BLyS之間的相互作用。亦在類似競爭ELISA中測定IC50 值，其中本發明之抗體經滴定以抑制BAFFR產生之肽(miniBR3)與人類可溶性BLyS檢定之結合。
此等分析之結果係列於表4中。
與BCMA及TACI之交叉反應性的分析
BCMA及TACI為與BAFFR相關之蛋白質且亦可結合配體BLyS。測試Fab與此兩種蛋白質之不當交叉反應性。在ELISA中對重組蛋白且在FACS分析中對細胞表面抗原測試結合物與BCMA之交叉反應性。
在ELISA中，對於經由抗人類Fc抗體捕捉於Maxisorp板之BAFFR：Fc，自400 nM滴定Fab直至0.005 nM。在大於100 nM之高Fab濃度下，僅MOR07342及MOR07346展示一定程度之與BCMA之交叉反應性。相比之下，MOR06654、MOR07347、MOR07348、MOR07349與BCMA未展示高於背景之結合。所有Fab均滿足1000倍辨別因子。
在FACS中，對經BCMA轉染之HEK293細胞分析以下Fab且自1 μM滴定該等Fab直至0.005 nM：MOR06654、MOR06743、MOR07342、MOR07347、MOR7348及MOR07349。在330 nM下，僅MOR07342展示增加之結合信號，其比背景高2倍。在此濃度下所有其他測試Fab均未展示信號。在1 μM之Fab濃度下，MOR06654、MOR06743及MOR07347展示比背景高3-4倍之信號。MOR07342展示信號比背景高20倍的與經BCMA轉染之細胞的結合。在Fab濃度達1 μM下，MOR007348及MOR07349仍完全不與BCMA結合。
功能性B細胞檢定中本發明抗體之效能 BLyS介導之協同刺激B細胞增殖檢定中抗體之效能及促效作用
用抗IgM抗體及人類可溶性BLyS刺激初始人類血液產生之B細胞以誘發B細胞增殖。滴定本發明之抗體以阻斷BLyS之協同刺激作用。為量測抗體促效(亦即類BLyS)作用，單獨用抗IgM抗體刺激B細胞。滴定BAFFR抗體以量測B細胞增殖之潛在改良。將不同BAFFR抗體形式(人類Fab、IgG2及IgG1)之此等分析之結果展示於表5中。
BLyS介導之協同刺激B細胞IgG1產生檢定中抗體之效能及促效作用
用IL-21及人類可溶性BLyS刺激初始人類血液產生之B細胞以誘發IgG1產生。滴定本發明之抗體以阻斷BLyS之協同刺激作用。為量測抗體促效(亦即類BLyS)作用，單獨用IL-21刺激B細胞。滴定抗BAFFR抗體以量測IgG1分泌之潛在改良。此等分析之結果係展示於表6中。
ADCC檢定中抗體引起B細胞殺死之效能
使增加濃度之抗BAFFR抗體與初始人類血液產生之B細胞結合，隨後添加自體性天然殺手(NK)細胞以誘發殺死反應。四小時之後，藉由FACS計數凋亡細胞數。將IgG1及IgG2抗體形式之此等分析之結果展示於表7中。
實例2：CIA小鼠模型中之活體內功效
在用完全弗氏佐劑(complete Freunds adjuvant)中之牛2型膠原蛋白免疫前9天、6天及2天，用每隻動物200微克抗BAFFR抗體(與鼠類IgG2a結合)或同型對照抗體處理小鼠。在整個實驗中每週以每隻小鼠200微克施用抗體兩次(直至免疫後第35天)。免疫後21天，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水中之牛2型膠原蛋白對小鼠進行加強。自加強之日起每隔2至3天評定腫脹。如圖1所示，抗BAFFR抗體在與其對照抗CSA抗體相比時使腫脹顯著減輕。
實例3：獮猴體內外周B細胞之消除
藉由每週靜脈內給予4個劑量之20 mg/kg之抗人類BAFF-R單株抗體MOR06654(IgG1/k)處理獼猴。藉由FACS分析在不同給藥前及給藥後時間點測定血液中之B細胞數。簡言之，將血液樣品與螢光標記之抗CD20抗體(抗人類CD20-PE，純系2H7，BD，目錄號555623)或抗CD40抗體(抗人類CD40-APC，純系5C3，BD，目錄號555591)一起在True Count管(BD，目錄號340334)中培育。結果係展示於圖2中。
在經處理猴體內B細胞快速消除降至給藥前B細胞數之33%之平均值(n=3)。後續給藥使B細胞減少保持或增加。在第56日(亦即最後給藥之後45天)，B細胞減少之平均值為85%(n=3)。第56日之後觀察到B細胞數之逐漸增加。
總之，用人類抗BAFF-R抗體處理使獼猴體內外周B細胞快速且持續減少。此藥效學作用為可逆的，使得抗體自循環消除之後，可恢復正常B細胞內穩定。
實例4：未海藻糖基化抗體更強且更持續之B細胞消除
在第二實驗中，用單次劑量之MOR06654(IgG1)或未海藻糖基化變異體MOR06654B處理獼猴。使用PotelligentTM 細胞株(Biowa,Inc.)產生MOR06654B。此等細胞株為剔除編碼海藻糖基轉移酶之基因的CHO哺乳動物細胞株。該等細胞株中所產生之抗體(MOR06654B)未經海藻糖基化。在此處單次劑量僅為靜脈內20 μg/kg。
如圖3所示，藉由用20 μg/kg MOR06654靜脈內處理，在第7日觀察到B細胞之少量但可觀察到之減少(平均減少22%，n=3)。對於缺乏海藻糖之抗體MOR06654B而言，外周B細胞之減少更顯著且更持續。此處，減少達到57%(n=3)，且在單次給藥之後28天仍為約40%(n=3)。
實例5：篩選交叉阻斷本發明之BAFFR結合抗體的抗體 Biacore交叉阻斷檢定
以下一般性描述確定抗體或其他結合劑是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷本發明之抗體的合適Biacore檢定。應瞭解該檢定可用於本文所述之任何BAFFR結合劑。
根據製造商之建議聯機操作Biacore機(例如BIAcore 3000)。
BAFFR可與(例如)CM5 Biacore晶片經由常規使用之胺偶合化學作用(例如EDC-NHS胺偶合)偶合以產生經BAFFR塗布之表面。為獲得可量測程度之結合，通常可使200-800共振單位之BAFFR與晶片偶合(此量產生可量測之結合程度且同時可易於藉由所用測試試劑之濃度來飽和)。
使BAFFR與BIAcore晶片連接之替代性方式係藉由使用「經標記」形式之BAFFR，例如N末端或C末端經His標記之BAFFR。在此形式中，使抗His抗體與Biacore晶片偶合，且隨後使經His標記之BAFFR通過晶片表面且為抗His抗體所捕捉。
將待評定彼此交叉阻斷之能力的兩種抗體以結合位點之化學計量之量(例如莫耳比1：1)在合適緩衝液中混合以產生測試混合物。所用緩衝液通常為蛋白質化學作用中常用之緩衝液，諸如PBS(136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2 HPO4 、1.76 mM KH2 PO4 ，pH 7.4)。當基於結合位點計算濃度時，假定抗體之分子量為抗體之總分子量除以彼抗體上標靶(亦即BAFFR)結合位點數。
測試混合物中各抗體之濃度應足夠高以確保彼抗體關於結合於BIAcore晶片上之BAFFR分子之結合位點飽和。混合物中之抗體為相同莫耳濃度(以結合計)且彼濃度通常在1.0 mM與1.5 mM之間(以結合位點計)。
亦製備單獨含有獨立抗體之獨立溶液。用於此等獨立溶液之緩衝液應為與測試混合物所用相同之緩衝液且為相同濃度。
使測試混合物通過經BAFFR塗布之BIAcore晶片且記錄結合。此後藉由以(例如)酸(諸如30 mM HCl)處理晶片約1分鐘來移除經結合之抗體。重要的是不損壞與晶片結合之BAFFR分子。
隨後使單獨第一抗體之溶液通過經BAFFR塗布之表面且記錄結合。此後，處理晶片以在不損壞與晶片結合之BAFFR的情況下例如經由上述酸處理移除所有經結合之抗體。
隨後使單獨第二抗體之溶液通過經BAFFR塗布之表面且記錄結合之量。
最大理論結合可定義為各抗體各別與BAFFR結合之總和。隨後將其與所測量抗體混合物之實際結合相比較。若實際結合低於理論結合，則兩種抗體彼此交叉阻斷。
基於ELISA之交叉阻斷檢定
抗BAFFR抗體或另一BAFFR結合劑之交叉阻斷亦可藉由使用ELISA檢定偵測。
ELISA檢定之一般原理包括將抗BAFFR抗體塗布於ELISA板之孔上。隨後添加過量的溶液形式(亦即不與ELISA板結合)之可能交叉阻斷之第二抗BAFFR抗體。隨後將限制量之BAFFR-Fc添加至孔中。
塗布於孔上之抗體與溶液形式之抗體將競爭結合有限數量之BAFFR分子。隨後洗滌板以移除未與所塗布抗體結合之BAFFR-Fc且亦移除第二溶液相抗體以及第二溶液相抗體與BAFFR-Fc之間所形成的任何複合物。隨後使用適當BAFFR偵測試劑測量結合之BAFFR之量。能夠交叉阻斷塗布抗體之溶液形式抗體能夠使塗布抗體可結合之BAFFR分子數相對於第二溶液相抗體不存在下塗布抗體可結合之BAFFR分子數降低。
該檢定在下文中關於稱為Ab-X及Ab-Y之兩種抗體進一步更詳細描述。在選擇Ab-X為固定抗體的情況下，將其塗布於ELISA板之孔上，之後該板以適合阻斷溶液阻斷以使隨後添加之試劑的非特異性結合最小。隨後將過量Ab-Y添加至ELISA板中以使每孔Ab-Y BAFFR結合位點之莫耳數至少10倍高於塗布ELISA板期間每孔所用Ab-X BAFFR結合位點之莫耳數。隨後添加BAFFR-Fc以使每孔所添加BAFFR-Fc之莫耳數至少25倍低於塗布各孔所用之Ab-X BAFFR結合位點之莫耳數。培育適合時段之後，洗滌ELISA板，且添加BAFFR偵測試劑以測量塗布抗BAFFR抗體(在此情況下為Ab-X)特異性結合之BAFFR之量。該檢定之背景信號定義為在具有塗布抗體(在此情況下為Ab-X)、第二溶液相抗體(在此情況下為Ab-Y)、僅BAFFR緩衝液(亦即無BAFFR)及BAFFR偵測試劑之孔中所獲得之信號。該檢定之陽性對照信號定義為在具有塗布抗體(在此情況下為Ab-X)、僅第二溶液相抗體緩衝液(亦即無第二溶液相抗體)、BAFFR及BAFFR偵測試劑之孔中所獲得之信號。ELISA檢定需要以陽性對照信號為背景信號之至少6倍的方式進行。
為避免來源於選擇何種抗體用作塗布抗體及選擇何種抗體用作第二(競爭)抗體之任何人為因素(例如Ab-X與Ab-Y對BAFFR顯著不同之親和力)，交叉阻斷檢定需要以兩種形式進行：1)形式1，其中Ab-X為塗布於ELISA板上之抗體且Ab-Y為溶液形式之競爭抗體，及2)形式2，其中Ab-Y為塗布於ELISA板上之抗體且Ab-X為溶液形式之競爭抗體。
圖1展示免疫後第0天、加強劑處理第21天及處理起始日第-9日，DBA/1小鼠中膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)之結果(MCOL37)。正方形符號展示抗BAFF Ab-MOR6743-mIgG2a(劑量等於腹膜內200 μg/200 μl，一週兩次(n=8))之爪得分。三角形符號展示同型抗CSA-IgG2a對照物(劑量等於腹膜內200 μg/200 μl，一週兩次(n=7))之爪得分。統計學方法：杜奈特多重比較檢驗(Dunnett Multiple Comparisons Test)(單因子方差分析(One-way ANOVA))。與媒劑對照相比(p<0.05*，p<0.01**，p>0.05n.s.)；圖2展示在3隻獼猴中靜脈內投與抗BAFFR(MOR06654)抗體20 mg/kg之後CD20+及CD40+外周血液細胞之絕對數量；圖3A展示在3隻獼猴中靜脈內投與抗BAFFR(MOR06654)抗體20 μg/kg之後CD20+及CD40+外周血液細胞之絕對數量；及圖3B展示在3隻獼猴中靜脈內投與未海藻糖基化抗BAFFR(MOR06654)抗體20 μg/kg之後CD20+及CD40+外周血液細胞之絕對數量。
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無元件符號說明

Claims (39)

  1. 一種經分離抗體或功能蛋白，其包含：SEQ ID NO：2之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：9之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：16之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：23之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：30之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：37之輕鏈可變區CDR3；或SEQ ID NO：3之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：10之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：17之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：24之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：31之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區CDR3；或SEQ ID NO：4之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：11之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：18之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：25之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：32之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：39之輕鏈可變區CDR3；或SEQ ID NO：5之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：12之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：19之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：33之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：40之輕鏈可變區CDR3；或SEQ ID NO：6之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：13之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：20之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：27之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：34之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：41之輕鏈可變區CDR3；或SEQ ID NO：7之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：14之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：21之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：28之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：35之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：42之輕鏈可變區CDR3；且其中該抗體或功能蛋白以100nM或以下之KD 結合BAFFR多肽，且以約10nM或以下之IC50 抑制BLyS誘發之人類B細胞增殖，且在活體內或活體外消除(depletes)B細胞。
  2. 一種經分離抗體或功能蛋白，其包含標靶BAFFR多肽(SEQ ID NO：87)之抗體之抗原結合部分，其特徵在於該抗體或功能蛋白包含與SEQ ID NO：50-56中之至少一者具有至少95%序列一致性的VH 多肽序列，以及與SEQ ID NO：43-49中之至少一者具有至少95%序列一致性的VL 多肽序列，且其中該抗體或功能蛋白以100nM或以下之KD 結合BAFFR多肽，且以約10nM或以下之IC50 抑制BLyS誘發之人類B細胞增殖，且在活體內或活體外消除(depletes)B細胞。
  3. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：51之VH 多肽序列以及SEQ ID NO：44之VL 多肽序列。
  4. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：52之VH 多肽序列以及SEQ ID NO：45之VL 多肽序列。
  5. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：53之VH 多肽序列以及SEQ ID NO：46之VL 多肽序列。
  6. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：54之VH 多肽序列以及SEQ ID NO：47之VL 多肽序列。
  7. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：55之 VH 多肽序列以及SEQ ID NO：48之VL 多肽序列。
  8. 如請求項2之抗體或功能蛋白，其包含SEQ ID NO：56之VH 多肽序列以及SEQ ID NO：49之VL 多肽序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體或功能蛋白，其包含與SEQ ID NO：75-78中之至少一者具有至少95%序列一致性的全長重鏈胺基酸序列，以及與SEQ ID NO：71-74中之至少一者具有至少95%序列一致性的全長輕鏈胺基酸序列。
  10. 一種抗體，其包含SEQ ID NO：75之重鏈序列及SEQ ID NO：71之輕鏈序列。
  11. 一種抗體，其包含SEQ ID NO：76之重鏈序列及SEQ ID NO：72之輕鏈序列。
  12. 一種抗體，其包含SEQ ID NO：77之重鏈序列及SEQ ID NO：73之輕鏈序列。
  13. 一種抗體，其包含SEQ ID NO：78之重鏈序列及SEQ ID NO：74之輕鏈序列。
  14. 如請求項1至8及10至13中任一項之經分離抗體或功能蛋白，其中如人類B細胞消除ADCC檢定中所測量，該抗體或功能蛋白以10nM或以下之EC50 活體外消除B細胞。
  15. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其中如B細胞之螢光活化細胞分選(FACS)所測量，與未處理之對照物相比，該抗體或功能蛋白在活體內能夠使B細胞之百分比減少至多90%。
  16. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其 中該抗體或功能蛋白無促效活性。
  17. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其為完全人類IgG1抗體或人類化IgG1抗體。
  18. 如請求項1至8及10至13之抗體或功能蛋白，其包含經突變或經化學修飾之胺基酸Fc區，其中與野生型Fc區相比，該經突變或經化學修飾之Fc區提供增加之ADCC活性。
  19. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其中該抗體或功能蛋白係低海藻糖基化或未海藻糖基化且具減少量之海藻糖基殘基或不具海藻糖基殘基。
  20. 如請求項19之抗體，其係在缺乏編碼海藻糖基轉移酶之FUT8基因表現之哺乳動物細胞株經重組表現產生，藉此相較於表現野生型FUT8基因之細胞株，增加所產生抗體之ADCC活性。
  21. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其係用作藥物。
  22. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其係用於治療由BAFF受體所介導或可由殺死或消除B細胞治療之病理學病症。
  23. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其係用於治療自體免疫疾病。
  24. 如請求項23之抗體或功能蛋白，其係用於治療類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡症、修格蘭氏症候群(Sjögren's syndrome)、尋常天疱瘡或多發性硬化症。
  25. 如請求項1至8及10至13中任一項之抗體或功能蛋白，其係用於治療B細胞贅瘤。
  26. 如請求項25之抗體或功能蛋白，其中該B細胞贅瘤係淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
  27. 如請求項25之抗體或功能蛋白，其係用於治療B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin's lymphoma)。
  28. 如請求項27之抗體或功能蛋白，其中該B細胞非霍奇金氏淋巴瘤係小淋巴細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、彌漫性大細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、前驅體B淋巴母細胞白血病、B細胞慢性淋巴細胞白血病及多發性骨髓瘤。
  29. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至28中任一項之抗體或功能蛋白。
  30. 如請求項29之醫藥組合物，其與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑結合。
  31. 如請求項29或30之醫藥組合物，其另外包含其他活性成份。
  32. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體或功能蛋白，其用於治療類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡症、修格蘭氏症候群、多發性硬化症、尋常天疱瘡、淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。
  33. 一種經分離核酸，其編碼如請求項1至20中任一項之抗體或功能蛋白。
  34. 一種選殖或表現載體，其包含一或多個如請求項33之核酸。
  35. 一種宿主細胞，其包含一或多個如請求項34之選殖或表現載體。
  36. 一種產生如請求項1至20中任一項之抗體或功能蛋白之方法，其包含培養含有編碼如請求項1至20中任一項之抗體或功能蛋白之一或多個核酸之宿主細胞。
  37. 如請求項36之方法，其中該宿主細胞為缺乏海藻糖基轉移酶表現之細胞株。
  38. 如請求項37之方法，其中該細胞株為缺乏編碼海藻糖基轉移酶之基因表現的哺乳動物細胞。
  39. 如請求項38之方法，其中該缺乏編碼海藻糖基轉移酶之基因表現的哺乳動物細胞為缺乏該FUT8基因之CHO細胞株。
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