MX2011000616A

MX2011000616A - Composiciones y metodos de uso para anticuerpos terapeuticos.

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Publication number: MX2011000616A
Application number: MX2011000616A
Authority: MX
Inventors: Stefanie Urlinger; Christoph Heusser; Julia Neugebauer; Eveline Schaadt; Maximilian Woisetschlaeger
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2011-02-24
Also published as: NI201100017A; JP5767109B2; SMAP201100010A; US20120183529A1; RS54299B1; HUE025778T2; PL2315780T3; EP2315780B1; TW201006493A; CA2730063C; CA2730063A1; BRPI0915928A2; SI2315780T1; US20100021452A1; EA201100191A1; US9340620B2; BRPI0915928B8; US9382326B2; ECSP11010761A; CY1116800T1

Abstract

Anticuerpos que se enlazan específicamente al receptor de BAFF (BAFFR). De una manera más específica, anticuerpos que son antagonistas del BAFFR, con actividad consumidora de células-B in vivo, y composiciones y métodos de uso para estos anticuerpos con el fin de tratar los trastornos patológicos que puedan ser tratados mediante la aniquilación o el consumo de las células-B, tales como lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide, u otras enfermedades autoinmunes o linfomas, leucemias, y mielomas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO PARA ANTICUER TERAPÉUTICOS La presente invención se refiere a anticuerpos que se específicamente con el receptor de BÁFF (BAFFR). La invenci específicamente se refiere a anticuerpos específicos q antagonistas de BAFFR con una actividad consumidora .de c in vivo, y a composiciones y métodos de uso para estos antic con el fin de tratar trastornos patológicos que se pueda mediante la aniquilación o consumo de las células-B, tale lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide u enfermedades autoinmunes, o linfomas, leucemias y mielomas BAFFR (también conocido como BR3, TNFRSF13C, o es un miembro de la superfamilia de receptores del fa necrosis tumoral. Se expresa predominantemente en los linf y en un subconjunto de células-T. BAFFR se enlaza específic al factor de necrosis tumoral miembro de la familia BLyS ( interleuc¡na-21 , o el ligando CD40. Debido a la presencia de en algunas células-T, BLyS puede actuar como un fac estimulante para la activación de las células-T. BLyS tambié enlazarse a dos receptores adicionales que se encuentran s células-B, TACI y BCMA.

La sobre-expresión de BLyS o BAFFR en los ratones co hiperplasia de células-B y al desarrollo de auto-inmunidad si con las características clásicas del lupus eritematoso si (SLE). En adición, los ratones (NZBxNZW)FI enfermos y MR autoinmunes, que representan modelos animales del eritematoso sistémico, contienen mayores concentraciones d en el suero, y los niveles de BLyS se correlacionan con el p de la enfermedad. También se encuentran mayores niveles d en los pacientes humanos que sufren de lupus eritematoso si artritis reumatoide, síndrome de Sjógren, granulomatosis de y malignidades de las células-B. Adicionalmente, el fenotip enfermedad en los modelos animales de enfermedades autoi eficacia clínica con un anticuerpo de bloqueo anti-BLyS pacientes de artritis reumatoide y lupus eritematoso sis subestiman el papel patogénico de BLyS en estos tra autoinmunes.

La señalización inducida por BLyS también parec involucrada en la sobrevivencia de las células-B malig apoptosis de las células-B de leucemia linfocítica crónica s rescatar mediante la adición de BLyS recombinante o Inversamente, La apoptosis de las células-B de leucemia lin crónica aumenta mediante la adición de las proteínas de fu BAFFR solubles, o mediante los anticuerpos anti-APRIL, in que BLyS y APRIL podrían servir como factores de crec autocrinos para las células-B malignas. BAFFR se expresa variedad de tejidos enfermos, incluyendo mieloma múltiple y no de Hodgkin. Actualmente, los tratamientos disponibles par enfermedades autoinmunes son los inmunosupresores con secundarios graves que no curan la enfermedad, pero que métodos para tratar lupus eritematoso sistémico y/o reumatoide y otras enfermedades autoinmunes relacionada como agentes qeu interfieran con la señalización de BA donde se sospeche que BLyS contribuye a la enfermedad.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporc anticuerpo o una proteína funcional que comprende una por enlace de antígeno de este anticuerpo para un objetivo polipéptido de BAFFR (SEQ ID NO:87), caracterizado po anticuerpo o la proteína funcional se enlaza especifícam polipéptido de BAFFR. En una modalidad, el anticuerpo o la funcional es a partir de un mamífero, que tiene un origen t humano o de camélido, o es un anticuerpo humanizado. modalidad particular, el anticuerpo anti-BAFFR se caracter tener una región de enlace de antígeno que es específica proteína objetivo de BAFFR, y se enlaza a BAFFR o a un fra de BAFFR.

En una modalidad, los anticuerpos de acuerdo con la in anticuerpos de la invención son antagonistas de BAFFR sin a agonista y agotan las células-B humanas in vitro e in vivo.

El enlace se puede determinar mediante uno o más que se pueden utilizar para medir una actividad, la cual es cu de antagonismo o agonismo por parte del anticuerpo. De pref los ensayos miden cuando menos uno de los efectos del ant sobre BAFFR, los cuales incluyen: actividad de prolifera células-B humanas inducida por BLyS, de producción de lgG1 consumo de células-B humanas.

En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos enlazan específicamente a la región de enlace de BLyS de En una modalidad relacionada, la invención proporciona anti que se enlazan a una región de BAFFR entre los aminoácid 43 de la SEQ ID NO:87 y, por ejemplo, se enlazan cuando PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (SEQ ID NO 88).

De acuerdo con otra modalidad particular, los anticue enlazan a BAFFR con una KD de 100 nM o menos, de 1 preferible el 90 por ciento en un modelo de ratón comparánd los animales de control no tratados.

En algunas modalidades particulares, los anticuerpos invención no reaccionan cruzadamente con una proteína rela con BAFFR, y más particularmente, no reaccionan cruzadame el receptor de TACI o BCMA humano.

En otra modalidad relacionada, los anticuerpos de acue la invención son anticuerpos de IgG 1 completamente hum humanizados con una actividad de citotoxicidad celular depe del anticuerpo (ADCC) y se enlazan a una región de comprendida entre los aminoácidos 17 y 43 de la SEQ ID N por ejemplo, cuando menos los siguientes p PTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLR (SEQ ID NO 88), y consu células-B in vitro con una EC50 de 10 nM o menos, de 1 n o o de 100 pM o menos.

En otra modalidad relacionada, los anticuerpos de acue la invención son anticuerpos humanos producidos m disminuyen, o inhiben el enlace de BLyS a BAFFR, y que ag células-B in vitro e in vivo. En ciertas modalidades, los anti de la invención se derivan a partir de secuencias de cadena y ligera particulares y/o comprenden características estru particulares, tales como regiones CDR que comprenden sec de aminoácidos particulares. La invención proporciona anti aislados, métodos para la elaboración de estos antic inmunoconjugados y moléculas multivalentes o multiespecífi comprenden estos anticuerpos, y composiciones farmacéuti contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o m biespecíficas de la invención. La invención también se r métodos para utilizar los anticuerpos con el fin de inhi ejemplo, antagonizar, la función de BAFFR, con el obj demorar, prevenir, prevenir el establecimiento de, o in desarrollo de un trastorno o condición asociada con la prese BLyS y/o BAFFR, por ejemplo, que dé como resultado el trat de un trastorno patológico que sea mediado por BAFFR, o Con el objeto de que la presente invención se pueda e más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se e definiciones adicionales a través de toda la descripción detall El término "respuesta inmune" se refiere a la acción ejemplo, los linfocitos, las células presentadoras de a células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas s producidas por las células anteriores o por el hígado (ind anticuerpos, citoquinas, y complemento), dando como result daño selectivo a, destrucción de, o eliminación en el cuerpo h de patógenos invasores, células o tejidos infectados con pat células cancerosas, o, en los casos de autoinmunidad inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "senda de transducción de señales" o "activi señalización" se refiere a una relación causal bioquímica inic términos generales por una interacción de proteína-prote como el enlace de un factor de crecimiento al receptor A, como resultado la transmisión de una señal a partir de una Patente del TCP Números WO200004032 y WO2006073 refieren a anticuerpos anti-BAFFR en general. La Publ Internacional Número WO2006073941 describe anti específicos anti-BAFFR.

El término "anticuerpo", como se hace referencia presente, incluye a los anticuerpos completos y cualquier fra de enlace de antígeno (es decir, la "porción de enlace antíg las cadenas individuales de los mismos. Un "anticuerpo" presenta naturalmente es una glicoproteína que comprende al dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) intercon por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está compu una región variable de cadena pesada (abreviada en la p como VH) y una región constante de cadena pesada. La constante de cadena pesada está compuesta de tres dominio CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL región constante de cadena ligera. La región constante de cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enla interactúa con un antígeno. Las regiones constantes anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a o factores del huésped, incluyendo distintas células del inmune (por ejemplo, las células efectoras) y el primer com (Clq) del sistema clásico de complementos.

El término "porción de enlace de antígeno" de un anticu simplemente "porción de antígeno"), como se utiliza en la pr se refiere a un anticuerpo de longitud completa, o a uno fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacida enlazarse específicamente a un antígeno (por ejemplo, una de BAFFR). Se ha mostrado que la función de enlace de antí un anticuerpo se puede llevar a cabo mediante los fragmento anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragme enlace abarcados dentro del término de "porción de enl antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fra monovalente que consiste en los dominios V¡_, VH, CL y VL y el VH, son codificados por genes separados, se pued empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador s que les permite hacerse como una sola cadena de proteína cual las regiones VL y VH forman pares para formar m monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) también Bird y colaboradores, 1988, Science 242: 423-426; y y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 5879-5883). anticuerpos de una sola cadena también pretenden estar ab dentro del término "región de enlace de antígeno" de un anti Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando las t convencionales conocidas para los expertos en este camp fragmentos son seleccionados por su utilidad de la misma que lo son los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la prese refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre d anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénic ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente, se a una preparación de moléculas de anticuerpos de un composición molecular. Una composición de anticuerpo mon exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un particular.

El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la pr pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables cuales tanto las regiones de estructura como las r determinantes de complementariedad se derivan a pa secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo c una región constante, la región constante también se deriva de estas secuencias humanas, por ejemplo, las secuencia línea germinal humana, o las versiones mutadas de las sec de la línea germinal humana, o los anticuerpos que co secuencias de estructura en consenso derivadas a partir del de secuencias en la estructura humana, por ejemplo, c describe en Knappik y colaboradores (2000, J Mol Biol 296, 5 colaboradores; Al Lazikani y colaboradores, (1997), J. Mol. B 927 948).

Los anticuerpos humanos de la invención pueden residuos de aminoácidos que no están codificados por sec humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específica de! sitio in vitro o por mutación som vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como s en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los cu hayan injertado las secuencias de CDR derivadas de l germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ra las secuencias de estructura humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refier anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, los tienen regiones variables en donde tanto las regiones de es como las regiones determinantes de complementariedad, se a partir de secuencias humanas. En una modalidad, los anti monoclonales humanos se producen mediante un hibrido r 14 (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómi los genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma prep partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de un huésped transformada para expresar el anticuerpo huma ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios, recombin anticuerpos preparados, expresados, creados o aislad cualquier otro medio que implique separar toda o una porció gen de inmunoglobulina humana, secuencias para otras sec de ADN. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen r variables en las cuales las regiones de estructura y las r determinantes de complementariedad se derivan a partir secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal hum ciertas modalidades, sin embargo, estos anticuerpos h recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, se usa un animal transgénico para las secuencias de la Ig hu mutagénesis somática in vivo), y de este modo, las secuen pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce a un antígeno anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de una intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo enlaza específicamente a un antígeno".

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "se específicamente al polipéptido de BAFFR" pretende referirs anticuerpo que se enlaza al polipéptido de BAFFR humano KD de 100 nM o menos, de 10 nM o menos, o de 1 nM o men anticuerpo que "tiene reacción cruzada con un antígeno dist BAFFR" pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza antígeno con una KD de 0.5 x 10"8 M o menos, de 5 x 10"9 M o o de 2 x 10"9 M o menos. Un anticuerpo que "no tiene r cruzada con un antígeno particular" pretende referirse anticuerpo que se enlaza a ese antígeno, con una KD de 1.5 o mayor, o con una KD de 5 a 10 x 10"8 M, o de 1 x 10"7 M o En ciertas modalidades, estos anticuerpos que no tienen r ensayo de producción de IgG 1 de célula-B humanas. Los ej del ensayo de proliferación de células-B humanas y del en producción de lgG1 se describen con mayores detalles Ejemplos que se encuentran más adelante. En algunas modal los anticuerpos reducen, disminuyen, o inhiben la actividad i por BLyS, como se mide en un ensayo de proliferación de c humanas, a una IC50 de 10 nM o menos, de 1 nM o menos, o pM o menos. En algunas modalidades, los anticuerpos inh actividad inducida por BLyS, como se mide en un ens producción de lgG1, a una IC50 de 10 nM o menos, de 1 nM o o de 100 pM o menos.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "sin a agonista" pretende referirse a un anticuerpo que no aumenta manera significativa la actividad de señalización mediada por en ausencia de BLyS en un ensayo basado en células, tal c ensayo de proliferación de células-B humanas. Estos ens describen con mayores detalles en los Ejemplos que se enc ensayos se describen con mayores detalles en los Ejemplos encuentran más adelante.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que cons células-B in vivo pretende referirse a un anticuerpo que re vivo el porcentaje de células-B hasta por el 70 por cie preferencia por el 80 por ciento, y más preferiblemente por el ciento, como se mide mediante la selección de células activ fluorescencia (FACS) de las células-B. Estos ensayos se de con mayores detalles en los Ejemplos que se encuentr adelante.

El término "KaSoc" o "Ka", como se utiliza en la pr pretende referirse al índice de asociación de una ínte particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término "Kd", como se utiliza en la presente, pretende referirse al ín disociación de una interacción particular de anticuerpo-antíg término "Kd", como se utiliza en la presente, pretende referir constante de disociación, que se obtiene a partir de la propor sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigé región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a tra fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numeroso mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad.

Como se utiliza en la presente, el término "avidez" se r una medida informativa de la estabilidad global o de la fue complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres f principales: afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia t antígeno como del anticuerpo; y la configuración estructural partes que interactúan. Finalmente, estos factores defi especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de anticuerpo particular se enlace a un epítopo de antígeno preci Como se utiliza en la presente, el término actividad de o de "citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo" se refi actividad consumidora de células-B humanas. La activi citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo se puede mediante los ensayos de consumo de células-B humanas d trímeros, o multímeros de cualquiera de las construcciones d en la presente, de los anticuerpos anti-BAFFR. Estos multím pueden generar a través de enlace covalente entre los individuales, por ejemplo, imitando el enlace natural del térmi N, o imitando los dimeros de anticuerpo que se mantienen j través de sus regiones constantes. Los enlaces diseñado interfase de Fc/Fc pueden ser covalentes o no covalent adición, se pueden utilizar componentes de dimerizació multimerización diferentes de Fe en los híbridos de BAFF crear estas estructuras de orden más alto. Por ejemplo, es utilizar dominios de multimerización, tales como el domi trimerización descrito en Borean (Publicación Internacional WO2004039841 ), o el dominio de pentamerización descrit Solicitud de Patente Publicada Número W098/18943.

Como se utiliza en la presente, el término "selectivida un anticuerpo, se refiere a un anticuerpo que se enlaza polipéptido objetivo, pero no a los polipéptidos estrech reptiles, etc.

Como se utiliza en la presente, el término "opti significa que una secuencia de nucleótidos se ha altera codificar una secuencia de aminoácidos que utiliza codones preferidos en la célula u organismo de producción, en gene célula eucariótica, por ejemplo una célula de Pichia, una c Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO) célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se para retener completamente, o tanto como sea posible, la se de aminoácidos originalmente codificada por la secuen nucleótidos inicial, la cual también se conoce como la se "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente diseñado para tener codones que son preferidos en las cél mamífero de ovario de hámster chino; sin embargo, también s en la presente la expresión optimizada de estas secuencias células eucarióticas. Las secuencias de aminoácidos codifica las secuencias de nucleótidos optimizadas también son r ejemplo, la afinidad de enlace) de los anticuerpos media ensayos convencionales conocidos en este campo, tales c análisis Biacore. Los ensayos para evaluar los efectos anticuerpos sobre las propiedades funcionales del BAFF ejemplo, enlace del receptor, prevención o inducción de prolif de células-B humanas, o producción de IgG) se describen co detalle en los Ejemplos.

De conformidad con lo anterior, se entenderá anticuerpo que "inhibe" una o más de estas propiedades func de BAFFR (por ejemplo, las actividades bioqu inmunoquímicas, celulares, fisiológicas, u otras acti biológicas, o similares), como se determine de acuerdo metodologías conocidas en la técnica y como se describe presente, se refiere a una disminución estadísticamente signi en la actividad particular en la relación con la que se ve en a del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticu control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo qu presente para significar la capacidad de un anticuerpo u otro de enlace para interferir con el enlace de otros anticue agentes de enlace con BAFFR en un ensayo de enlace com convencional.

La capacidad o la extensión hasta la cual un anticuerp agente de enlace es capaz de interferir con el enlace anticuerpo o molécula de enlace para BAFFR, y por consigui se puede decir que se bloquea cruzadamente de acuerdo invención, se puede determinar empleando ensayos de enl competencia convencionales. Un ensayo adecuado involucra de la tecnología Biacore (por ejemplo, mediante el u instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), la cua medir el grado de las interacciones utilizando la tecnolo resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo para m bloqueo cruzado utiliza un planteamiento basado en ELISA.

Otros detalles sobre ambos métodos se dan en los Ejem De acuerdo con la invención, un anticuerpo de bloqueo de entre el 70 por ciento y el 0.1 por ciento (por ejemplo, de 70 por ciento y el 4 por ciento), y muy específicamente de ent por ciento y el 0.1 por ciento (por ejemplo, de entre el 65 por el 4 por ciento) del máximo enlace teórico (como se anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de enl combinación.

Un anticuerpo se define como de bloqueo cruzado en el ELISA, como se describe en los Ejemplos, si el anticuerp BAFFR en fase de solución es capaz de provocar una reduc entre el 60 por ciento y el 100 por ciento, específicamente d el 70 por ciento y e! 100 por ciento, y de una manera muy es de entre el 80 por ciento y el 100 por ciento, de la señal de de de BAFFR (es decir, la cantidad de BAFFR enlazada anticuerpo recubierto), comparándose con la señal de detec BAFFR obtenida en ausencia del anticuerpo anti-BAFFR en solución (es decir, los pozos de control positivo).

Anticuerpos Recombinantes anticuerpos de la invención se muestran en las SEQ ID NOs: Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos de cadena de longitud completa preferidas de los anticuerpos de la inven muestran en las SEQ ID NOs: 75-78, respectivamente, ejemplos de secuencias de aminoácidos de cadena pesada de longitud completa preferidas son los de aquéllas codifica las secuencias de ADN correspondientes contenidas plásmidos pBW510 y pBW512, como fueron depositados por Pharma AG, Forum 1, CH-4002 Basilea, Suiza, en DS Z el abril de 2009, con los Números de Acceso DSM22542 y DS respectivamente. Otros anticuerpos de la invención inclu aminoácidos que se han mutado mediante supresión, inser sustitución de aminoácidos, y que no obstante, tienen una id de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, o el 95 por cient regiones CDR, con las regiones CDR ilustradas en las sec descritas anteriormente, incluyendo las regiones CDR codi por las secuencias de ADN correspondientes de los pl Además, las secuencias de nucleótidos progenitoras de pesada variable se muestran en la SEQ ID NO: 64. Las sec de nucleótidos progenitoras de cadena ligera variable se m en la SEQ ID NO: 57. Las secuencias de nucleótidos de ligera de longitud completa optimizadas para la expresión célula de mamífero, se muestran en las SEQ ID NOs: 83-secuencias de nucleótidos de cadena pesada de longitud c optimizadas para la expresión en una célula de mamíf muestran en las SEQ ID NOs: 79-82. Otros anticuerpos invención incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que mutado, y que no obstante, tienen una identidad de cuando m 60, el 70, el 80, el 90, o el 95 por ciento con las secuencias d anteriormente. En algunas modalidades, incluyen las secuen aminoácidos mutantes en donde se han mutado no más de 1 , ó 5 aminoácidos mediante supresión, inserción, o sustitu aminoácidos, en las regiones variables, al compararse regiones variables ilustradas en la secuencia descrita anterior anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs). Cua mezclan y se emparejan estas cadenas, una secuencia VH a p un par de VH/VL particular, debe ser reemplazada con una se VH estructuralmente similar. De la misma manera, una secue cadena pesada de longitud completa a partir de un par partic cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de l completa, debe ser reemplazada con una secuencia de pesada de longitud completa estructuralmente similar. De la manera, una secuencia VL a partir de un par particular de debe ser reemplazada con una secuencia VL estructur similar. De la misma manera, una secuencia de cadena li longitud completa a partir de un par particular de cadena pes longitud completa/cadena ligera de longitud completa, de reemplazada con una secuencia de cadena ligera de l completa estructuralmente similar. De conformidad con lo a en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recom aislado o una región de enlace de antígeno del mismo, el cua cadena pesada de longitud completa que comprende una se de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste SEQ ID NOs: 75-78; y una cadena ligera de longitud compl comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a p grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 71-74; en do anticuerpo se enlaza específicamente al BAFFR, o (ii) una proteína funcional, la cual comprende una por enlace de antígeno de la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona: (i) un anticuerpo recombinante aislado, el cual tie cadena pesada de longitud completa codificada por una secue nucleotidos que se ha optimizado para la expresión en una c un mamífero, seleccionada a partir del grupo que consiste SEQ ID NOs: 79-82; y una cadena ligera de longitud c codificada por una secuencia de nucleotidos que se ha opt para la expresión en la célula de un mamífero, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 83-86; en d Las secuencias de aminoácidos de las CDF s VL de los antic se muestran en las SEQ ID NOs: 22-28. Las secuenc aminoácidos de las CDR2s VL de los anticuerpos se muestra SEQ ID NOs: 29-35. Las secuencias de aminoácidos de las VL de los anticuerpos, se muestran en las SEQ ID NOs: 36-regiones CDR estipuladas en las SEQ ID NOs: 1-42, delineadas utilizando el sistema de Kabat (Kabat, E. colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immun Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y S Humanos de los Estados Unidos, N IH-Publicación No.91-324 Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede en BAFFR, y que la especificidad de enlace de antíg primordialmente proporcionada por las regiones CDR1, 2, y secuencias de CDR1, 2, y 3 de VH, y las secuencias de CDR1 de VL, se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las r determinantes de complementariedad a partir de dif anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, conteniend similar. De la misma manera, cuando se mezclan y se empar secuencias de CDR VL, las secuencias de CDR1, CDR2, y/o partir de una secuencia VL particular, deben ser reemplaza secuencias de CDR estructuralmente similares. Será fác evidente para el experto ordinario que se pueden er secuencias novedosas de VH y VL sustituyendo una o más sec de la región de CDR VH y/o VL con secuencias estructur similares, a partir de las secuencias de CDR mostradas presente para los anticuerpos monoclonales de la p invención.

En algunas modalidades, los anticuerpos recomb aislados, o las regiones de enlace de antígeno de los tienen: una CDR1 de región variable de cadena pesa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a p grupo que consiste en las SEQ ID ÑOs: 1-7, una CDR2 de variable de cadena pesada que comprende una secuen aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en l variable de cadena ligera que comprende una secuen aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en \ ID NOs: 36-42; en donde el anticuerpo se enlaza específic con BAFFR.

En cierta modalidad, el anticuerpo comprende: una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 16; un de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 23; un de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30 CDR3 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3 En cierta modalidad, el anticuerpo comprende: una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 10; un de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: CDR1 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: CDR2 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID N En cierta modalidad, el anticuerpo comprende: una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 5; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 12; un de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 CDR1 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: CDR2 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID N una CDR3 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID N En cierta modalidad, el anticuerpo comprende: una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 6; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13; un de región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: CDR1 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: CDR2 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID N una CDR3 de región variable de cadena ligera de la SEQ ID N En cierta modalidad, el anticuerpo comprende: una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; una C región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; un regiones variables o las cadenas de longitud completa del ant se obtienen a partir de un sistema que utilice los ge inmunoglobulina de la línea germinal humana. Estos si incluyen la inmunización de un ratón transgénico que lleve g inmunoglobulina humana con el antígeno de interés, o el ras una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana exhibido fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano qu producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobuli línea germinal humana se puede identificar como tal medi comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulina línea germinal humana, y seleccionando la secuen inmunoglobulina de la línea germinal humana que tenga la se más cercana (es decir, el mayor porcentaje de identida secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano qu producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobuli línea germinal humana particular, puede contener diferen anticuerpo humano como humano cuando se compara secuencias de aminoácidos de inmunogíobulina de la línea g de otras especies (por ejemplo, las secuencias de la línea g de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano pu cuando menos el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por cí 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento, o inclusive menos el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secue aminoácidos codificada por el gen de inmunogíobulina de l germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado a p una secuencia de la línea germinal humana particular no más de diez diferencias de aminoácidos de la secuen aminoácidos codificada por el gen de inmunogíobulina de l germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano exhibir una diferencia de no más de 5, o inclusive de no más 2, ó 1 aminoácido a partir de la secuencia de aminoácidos co por el gen de inmunogíobulina de la línea germinal. descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retie propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-BA la invención.

Por ejemplo, la invención proporciona un ant recombinante aislado (o una proteína funcional que compre porción de enlace de antígeno del mismo), que compren región variable de cadena pesada y una región variable de ligera, en donde: la región variable de cadena pesada co una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el ciento, o cuando menos el 90 por ciento idéntica a una secue aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en l ID NOs: 50-56; la región variable de cadena ligera compren secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por CÍ cuando menos el 90 por ciento idéntica a una secuen aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en l ID NOs: 43-49; el anticuerpo se enlaza específicamente a B el anticuerpo exhibe cuando menos una de las sig completa comprende una secuencia de aminoácidos que es menos el 80 por ciento, o cuando menos el 90 por ciento id una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del gru consiste en las SEQ ID NOs: 75-78; la cadena ligera de l completa comprende una secuencia de aminoácidos que es menos el 80 por ciento, o cuando menos el 90 por ciento id una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del gru consiste en las SEQ ID NOs: 71-74; el anticuerpo se específicamente a BAFFR, y el anticuerpo exhibe cuando me de las siguientes propiedades funcionales: inhibe la prolifera células-B inducida por BLyS, o la producción de lgG1 induc BLyS, y consume las células-B in vitro o in vivo.

En otro ejemplo, la invención proporciona un ant recombinante aislado (o una proteína funcional que compre porción de enlace de antígeno del mismo), que compren cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de l completa, en donde: la cadena pesada de longitud comp enlaza específicamente a BAFFR, y el anticuerpo exhibe menos una de las siguientes propiedades funcionales: in proliferación de células-B inducida por BLyS, o la produc lgG1 inducida por BLyS, y consume las células-B in vitro o in En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibi más, dos o más, o tres de las propiedades funcionales dis anteriormente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un ant humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimér preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo de IgG 1 complet humano.

En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos V pueden ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, 70 por ciento, ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por cie por ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias esti anteriormente. En otras modalidades, las secuencias de amin VH y/o VL pueden ser idénticas, excepto por una sustitu aminoácido en no más de una, dos, tres, cuatro, o cinco pos codificado para determinar la función retenida (es de funciones estipuladas anteriormente), utilizando los funcionales descritos en la presente.

En otras modalidades, las secuencias de aminoáci cadena pesada de longitud completa y/o de cadena ligera de l completa pueden ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, el ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ci por ciento, 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas secuencias estipuladas anteriormente. Un anticuerpo que te cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de l completa con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o con las cadenas pesadas de longitud completa de cualquier SEQ ID NOs: 75-78 y con las cadenas ligeras de longitud c de cualquiera de las SEQ ID NOs: 71-74, respectivamente, s obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dir sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena polimerasa) de las moléculas de ácido nucleico que codifiq 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias esti anteriormente.

En otras modalidades, las regiones variables de las sec de nucleotidos de cadena pesada y/o de cadena ligera puede 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, o el 99 po idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente.

Como se utiliza en la presente, el porcentaje de identida las dos secuencias es una función del número de pos idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de iden # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), toma cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, necesiten introducir para una alineación óptima de l secuencias. La comparación de las secuencias y la determina porcentaje de identidad entre las dos secuencias, se pueden cabo utilizando un algoritmo matemático, como se desc utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 453, 1970), el cual se ha incorporado en el programa GA paquete de software GCG (disponible en http://www.gc utilizando ya sea una matriz Blossom 62, o bien una matriz P y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4, y un p longitud de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6.

Anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invenció una región variable de cadena pesada que comprende las sec de CDR1, CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena lig comprende las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3, en dond más de estas secuencias de CDR tienen las secuenc aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos desc la presente, o modificaciones conservadoras de las misma donde los anticuerpos retienen las propiedades fun deseadas de los anticuerpos anti-BAFFR de la invenci conformidad con lo anterior, la invención proporciona un a n t secuencias de aminoácidos de CDR2 de región variable de pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste en las NOs: 8-14, y las modificaciones conservadoras de las mis secuencias de aminoácidos de la CDR3 de región variable de pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste en las NOs: 15-21, y las modificaciones conservadoras de las misr secuencias de aminoácidos de la CDR1 de región variable de ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste en las NOs: 22-28, y las modificaciones conservadoras de las misn secuencias de aminoácidos de la CDR2 de región variable de ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste en las NOs: 29-35, y las modificaciones conservadoras de las mis secuencias de aminoácidos de la CDR3 de región variable de ligera se seleccionan a partir del grupo que consiste en la NOs: 36-42, y las modificaciones conservadoras de las mis anticuerpo se enlaza específicamente a BAFFR, y el a nt exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funci En otras modalidades, un anticuerpo de la in optimizado para la expresión en una célula de mamífero, tie secuencia de cadena pesada de longitud completa y una se de cadena ligera de longitud completa, en donde una o más d secuencias tienen las secuencias de aminoácidos especi basadas en los anticuerpos descritos en la presente, modificaciones conservadoras de las mismas, y en don anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas anticuerpos anti-BAFFR de la invención. De conformidad anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal optimizado para la expresión en una célula de mamífero, consiste en una cadena pesada de longitud completa y una ligera de longitud completa en donde: la cadena pesada de l completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de las SEQ ID NOs: 75-78, y las modific conservadoras de las mismas; y la cadena ligera de l completa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas enlistadas discutidas anteriormente. Estos anticuerpos pued por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humaniza anticuerpos quiméricos.

Como se utiliza en la presente, el término "modificacio secuencia conservadoras" pretende referirse a las modificaci aminoácidos que no afectan de una manera significativa ni las características de enlace del anticuerpo que conti secuencia de aminoácidos. Estas modificaciones conser incluyen sustituciones, adiciones, y supresiones de aminoáci pueden introducir modificaciones en un anticuerpo de la in mediante las técnicas convencionales conocidas en este tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis medi reacción en cadena de la polimerasa.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son a en donde el residuo de aminoácido es reemplazado con un de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la téc han definido las familias de residuos de aminoácidos que ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y con cadenas l aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, his Por consiguiente, uno o más residuos de aminoácidos dentro regiones CDR de un anticuerpo de la invención pued reemplazados con otros residuos de aminoácidos a partir misma familia de cadena lateral, y el anticuerpo alterado se probar para determinar la función retenida utilizando los e funcionales descritos en la presente.

Anticuerpos que se Enlazan al Mismo Epítopo q Anticuerpos Anti-BAFFR de la Invención En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos enlazan al mismo epítopo que los diferentes anticuerpos anti-específicos de la invención descritos en la presente. To anticuerpos descritos en los ejemplos que sean capaces de b el efecto inducido por BLyS, se enlazan al mismo epítopo en con una alta afinidad, estando este epítopo comprendido e aminoácidos de la SEQ ID NO: 88. enlace con el BAFFR humano; este anticuerpo, de acuerdo c teoría no limitante, puede enlazarse al mismo epítopo o a un relacionado (por ejemplo, un epítopo estructuralmente si especialmente proximal) sobre el BAFFR humano que el ant con el que compite. Por consiguiente, otro aspecto de la in proporciona anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno que compiten con, los anticuerpos que se dan a conocer presente por las secuencias. En cierta modalidad, el anticue se enlaza al mismo epítopo sobre el BAFFR humano q anticuerpos de la presente invención, es un anticuerpo recom humano. Estos anticuerpos recombinantes humanos se preparar y aislar como se describe en los Ejemplos.

Anticuerpos Diseñados y Modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuen y/o VL mostradas en la presente como material de partid diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificad Un tipo de diseño de región variable que se puede I cabo es el injerto de la CDR. Los anticuerpos interactúan antígenos objetivo predominantemente a través de los resid aminoácidos que se localizan en las seis regiones determina complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. P razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las r determinantes de complementariedad son más diversas en anticuerpos individuales que las secuencias que están fuera regiones determinantes de complementariedad. Debido a secuencias de las regiones determinantes de complementarie responsables de la mayoría de las interacciones de anti antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes qu las propiedades de los anticuerpos que se presenten natur específicos, mediante la construcción de vectores de expresi incluyan las secuencias de las regiones determinant complementariedad a partir del anticuerpo que se p naturalmente específico injertado sobre las regiones de estru De conformidad con lo anterior, otra modalidad de la in pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado anti-BAFFR, proteína funcional que comprende una porción de enlace de a del mismo, que comprende una región variable de cadena que comprende las secuencias de CDR1, que tienen una se de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste SEQ ID NOs: 1-7; las secuencias de CDR2 que tienen una se de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste SEQ ID NOs: 8-14; las secuencias de aminoácidos de CD tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de que consiste en las SEQ ID NOs: 15-21, respectivamente; región variable de cadena ligera que tiene las secuencias d que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a p grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 22-28; las secuen CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos selecció partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-35 secuencias de CDR3 que consisten en una secuen Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal p genes de región variable de cadena pesada y ligera huma pueden encontrar en la base de datos de secuencias de l germinal humana "VBase" (disponible en la Internet en w cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., y colabor 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Unidos, NIH Publicación Número 91-3242; Tomlinson, I. colaboradores, 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. colaboradores, 1994 Eur. J immunoL 24:827-836.

Un ejemplo de las secuencias de estructura para utiliz los anticuerpos de la invención es el de aquéllas q estructuralmente similares a las secuencias de estructura úti por los anticuerpos seleccionados de la invención, por ejem secuencias en consenso y/o las secuencias de estructura úti por los anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuen de CDR 1 , 2, y 3, y las secuencias VL de CDR1, 2, y 3, se enlace de antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las P de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,5 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen y colaboradores).

Otro tipo de modificación de región variable es mu residuos de aminoácidos dentro de las regiones VH y/o VL de CDR2, y/o CDR3, para mejorar de esta manera una propiedades de enlace (por ejemplo, la afinidad) del anticu interés, conocida como "maduración de afinidad". Se puede I cabo la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis medi reacción en cadena de la polimerasa para introducir las muta y se puede evaluar el efecto sobre el enlace del anticuerpo, propiedad funcional de interés, en ensayos in vitro o in vivo, c describe en la presente, y como se proporciona en los Ejem pueden introducir modificaciones conservadoras (como se anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adi o supresiones de aminoácidos. Más aún, típicamente no se más de 1, 2, 34, ó 5 residuos dentro de una región CDR. comparándose con tas SEQ ID NOs: 1-7; una región CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de que consiste en las SEQ ID NOs: 8-14, o una secue aminoácidos que tiene 1 , 2, 3, 4, ó 5 sustituciones, supresi adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NO una región CDR3 VH que tiene una secuencia de amin seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N 21, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1, 2, 3, sustituciones, supresiones, o adiciones de amino comparándose con las SEQ ID NOs: 15-21; una región CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir de que consiste en las SEQ ID NOs: 22-28, o una secue aminoácidos que tiene 1, 2, 3, 4, ó 5 sustituciones, supresi adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID N 28; una región CDR2 VL que tiene una secuencia de amin seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N 35, o una secuencia de aminoácidos que tiene 1, 2, 3, Andamiajes Alternativos Se puede emplear una amplia variedad de estruc andamiajes de anticuerpos/inmunoglobulinas, siempre polipéptido resultante incluya cuando menos una región de que se enlace específicamente al BAFFR. Estas estruc andamiajes incluyen los cinco idiotipos principales inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas (tale aquéllos dados a conocer en cualquier otra parte de la pres incluyen inmunoglobulinas de otras especies de animale tengan de preferencia aspectos humanizados. En este aspec de un interés particular los anticuerpos de cadena individuales, tales como aquéllos identificados en los camélid expertos en este campo continúan descubriendo y desarr novedosas estructuras, andamiajes, y fragmentos.

En un aspecto, la invención pertenece a la genera anticuerpos no basados en inmunoglobulina, utilizando and que no son de inmunoglobulina, sobre los cuales se pueden secciones (anticuerpos de camélido y andamiaje que no anticuerpo) .

Anticuerpos de Camélido Se han caracterizado las proteínas de anticuerpo obte partir de miembros de la familia del camello y del dror (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius) , incluyen miembros del nuevo mundo, tales como las especies de llam páceos, Lama glama y Lama vicugná), con respecto al complejidad estructural, y antigenicidad para los sujetos hu Ciertos anticuerpos de IgG de esta familia de mamíferos, c encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras, y tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cua típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas cadenas ligeras, para los anticuerpos de otros animales. V Publicación de Patente Internacional del TCP PCT/EP93/02214 (Publicación Internacional Número WO 94 publicada el 3 de marzo de 1994). 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin, M. y colabor 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M . y colaboradore Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo, colaboradores, 2002 Int. J. Cáncer 89: 456-62; y Lauwerey colaboradores, 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Las bibl diseñadas de anticuerpos de camélido y de fragmen anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejem Ablynx, Ghent, Bélgica. Como con otros anticuerpos de ori humano, una secuencia de aminoácidos de un anticue camélido se puede alterar de una manera recombinante para una secuencia que se parezca más estrechamente a una se humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humaniza consiguiente, se puede reducir adicionalmente la baja antig natural de los anticuerpos de camélido para los seres humano El nanocuerpo de camélido tiene un peso molec aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamen nanocuerpo de camélido puede inhibir, como un resultado del a un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha, proteína objetivo, y por consiguiente, puede servir en una ca que se parezca más estrechamente a la función de un fár bajo peso molecular clásico que la de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto da resultado además que los nanocuerpos de camélido extremadamente termoestables, estables a un pH extremo digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Otra conse es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente d sistema circulatorio hacia los tejidos, e inclusive cruzan la hematoencefálica, y pueden tratar trastornos que afecten a nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar además el transp fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la S de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica l 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. características, combinadas con la baja antigenicidad para lo naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido camélido en seguida de la inmunización con BAFFR o un fra peptídico del mismo, empleando las técnicas descritas en la p para otros anticuerpos. De una manera alternativa, el nanocu camélido anti-BAFFR se diseña, es decir, se produce, m selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fag exhiban las proteínas de nanocuerpo de camélido apropiad mutadas, utilizando procedimientos de paneo, con BAFFR c objetivo, como se describe en los Ejemplos de la presente. modalidad, un anticuerpo de la divulgación se cameliza, par una estructura de camélido, y las regiones CDR1, CDR2, y/ VH como se dan a conocer en la presente. Los nano diseñados se pueden hacer además a la medida mediante ing genética, para tener una vida media en un sujeto receptor minutos a dos semanas. En una modalidad específica, el ant o nanocuerpo de camélido se obtiene mediante el injerto secuencias de las regiones determinantes de complementarte Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domant (Cambridge, MA) y Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), lip (Anticalina) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), pr inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmac Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc. (Mountain View Proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-crist ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania), miméti epítopos de proteína (Polyphor Ltd, Allschwil, Suiza), (i) Andamiaje de Fibronectina.

Los andamiajes de fibronectina se basan de preferenci dominio de fibronectina tipo II (por ejemplo, el décimo modul fibronectina tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronecti III tiene siete y ocho cadenas beta, las cuales se distribuye dos hojas beta, las cuales se empacan ellas mismas unas otras para formar el núcleo de la proteína, y además contiene (análogos a las regiones determinantes de complementaried conectan las cadenas beta unas con otras, y se exponen al s unidad de reconocimiento de antígeno entera en la IgG de ca de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no inmunoglobulina imita las propiedades de enlace de antíge son similares en su naturaleza y afinidad a las de los antic Estos andamiajes se pueden utilizar en una estrategia de s aleatoria y mezcla de ciclos in vitro que es similar al proc maduración de afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas m basadas en fibronectina se pueden utilizar como andamia donde las regiones de ciclo de la molécula pueden ser reernp con las regiones determinantes de complementariedad invención empleando técnicas de clonación convencionales, (ii) Anquirina - Componentes Moleculares.

La tecnología se basa en la utilización de proteín módulos de repetición derivados de anquirina como andamiaj soportar las regiones variables, las cuales se pueden utiliz enlazarse a diferentes objetivos. El módulo de repetic anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste dominios-A. Los avímeros consisten en un número de dif monómeros de "dominio-A" (de 2 a 10) enlazados por m enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que enlazarse al antígeno objetivo utilizando la metodología descr ejemplo, en las Patentes Números 20040175756; 20050 20050048512; y 20060008844. (iv) Proteína A - Affibody.

Los ligandos de afinidad Affibody® son proteínas pequeñas compuestas de un haz de tres hélices basado andamiaje de uno de los dominios de enlace de IgG de la Prot La Proteína A es una proteína superficial a partir de la Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consist aminoácidos, trece de los cuales se seleccionan aleatoriamen generar las bibliotecas Affibody®, con un gran número de v de ligandos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Un Norteamérica Número US 5,831,012). Las moléculas Affibody a los anticuerpos, tienen un peso molecular de almacenamiento de los compuestos químicamente sensi insolubles. Existen varias lipocalinas naturales en los te líquidos corporales humanos.

La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglo con ciclos hipervariables sobre la parte superior de una es rígida. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos fragmentos recombinantes, las lipocalinas se componen de u cadena de polipéptido con 160 a 180 residuos de aminoácid es3 justo marginalmente más grande que un solo domi inmunoglobulina.

El conjunto de cuatro ciclos, que forma la buchaca de muestra una plasticidad estructural pronunciada, y tole variedad de cadenas naturales. Por consiguiente, el sitio de se puede reconfigurar en un proceso registrado, con el ob reconocer las moléculas objetivo prescritas de diferente for una alta afinidad y especificidad.

Una proteína de la familia de lipocalina, la proteína de Affilin pueden seleccionarse muy rápidamente a partir bibliotecas, cada una de las cuales se basa en una prot andamiaje diferente derivada del ser humano.

Las moléculas AfftlinMR no muestran ninguna hor estructural con las proteínas de inmunoglobulina. Scil emplea dos andamiajes de AffilinMR, uno de los cuales es cristalino, una proteína de lente de ojo estructural humana, y es de las proteínas de la superfamilia de "ubiquitina". andamiajes humanos son muy pequeños, muestran un estabilidad a la temperatura, y son casi resistentes a los cam pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad s principalmente a la estructura de la hoja beta expandida proteínas. Los ejemplos de las proteínas derivadas del cristalino se describen en la Publicación Internacional WO200104144, y los ejemplos de las proteínas de "tipo ubi se describen en la Publicación Internacional I WO2004106368. donde se han hecho modificaciones a los residuos de est dentro de la VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propieda anticuerpo. Típicamente, estas modificaciones de estruct hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerp ejemplo, un planteamiento es "retro-mutar" uno o más resid estructura hasta la secuencia de la línea germinal correspo De una manera más específica, un anticuerpo que haya mutación somática puede contener residuos de estructu difieran de la secuencia de la línea germinal a partir de la derive el anticuerpo. Estos residuos se pueden identificar m la comparación de las secuencias de estructura del anticue las secuencias de la línea germinal a partir de los cuales se d anticuerpo. Para regresar a las secuencias de la región de est hasta su configuración de la línea germinal, las mut somáticas se pueden "retro-mutar" hasta la secuencia de ? germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al mutagénesis mediada por reacción en cadena de la poli describe con mayor detalle en la Publicación de Patente Estados Unidos de Norteamérica Número 20030153043 por colaboradores.

En adición o de una manera alternativa a las modific hechas dentro de la estructura o de las regiones determina complementariedad, los anticuerpos de la invención se diseñar para incluir modificaciones dentro de la regi típicamente para alterar una o más propiedades funciona anticuerpo, tales como la vida media en suero, la fijac complemento, el enlace del receptor Fe, y/o la citotoxicidad dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se unir o más fracciones químicas al anticuerpo), o se puede m para alterar su glicosilación, nuevamente con el fin de altera más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una d modalidades se describe con mayor detalle más adela numeración de los residuos en la región Fe es aquélla del ín de las cadenas ligera y pesada, o con el fin de aumentar o di la estabilidad del anticuerpo.

En otra modalidad, se muta la región de articulación anticuerpo para disminuir la vida media biológica del anticuer específicamente, se introducen una o más mutación aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-C fragmento de articulación Fe, de tal manera que el anticuerp el enlace de Proteína A de Estafilocosilo deteriorado (S relación con el enlace de SpA del dominio de articulación Fe Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Pat los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,165,745 por colaboradores.

En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para aum vida media biológica. Son posibles diferentes planteamient ejemplo, se pueden introducir una o más de las sig mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375 reemplazando cuando menos un residuo de aminoácido residuo de aminoácido diferente, con el fin de alterar las fu efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más amin pueden reemplazados con un residuo de aminoácido diferente manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un efector, pero retenga la capacidad de enlace de antíg anticuerpo progenitor. El ligando efector con el cual se a afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe, o el com C1 del complemento. Este planteamiento se describe con detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norte Números 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter y colabora En otra modalidad, uno o más aminoácidos seleccion partir de los residuos de aminoácidos, pueden ser reemplaza un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el ant tenga un enlace de C1q alterado, y/o una citotoxicidad depe del complemento (CDC) reducida o abolida. Este planteami describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Un celular dependiente del anticuerpo (ADCC), y/o para aume afinidad del anticuerpo por un receptor de FCY, medi modificación de uno o más aminoácidos. Este planteamie describe adicionalmente en la Publicación del TCP WO00/42072 por Presta. Más aún, los sitios de enlace sobre humana para FcvRI, FCYRII, Fcy RUI y FcRn, se han mapead han descrito las variantes con un mejor enlace (véase Shield y colaboradores, 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604).

En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo agí ic (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosila puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del ant por el antígeno. Estas modificaciones de carbohidratos se llevar a cabo mediante, por ejemplo, la alteración de uno o má de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por e se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos q como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosila anticuerpo hipofucosilado o no fucosilado que tenga can reducidas de residuos de fucosilo o ningún residuo de fucosil anticuerpo que tenga un aumento de estructuras de GlcI bisección. Se ha demostrado que estos patrones de glico alterada aumentan la capacidad de citotoxicidad celular depe del anticuerpo de los anticuerpos. Estas modificación carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, medí expresión del anticuerpo en una célula huésped con una ma de glicosilación alterada. Las células con la maquina glicosilación alterada han sido descritas en este campo, y se utilizar como células huésped en donde se expresan los anti recombinantes de la invención, para producir de esta ma anticuerpo con una glicosilación alterada. Por ejemplo, la Europea Número EP 1,176,195 por Hang y colaboradores, d una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrum cual codifica una fucosil-transferasa, de tal manera q anticuerpos expresados en esta línea celular capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos en con Asn(297), que también da como resultado una hipofuco de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase t Shields, R. L. y colaboradores, 2002 J. Biol. Chem. 277 26740). La Publicación del TCP Número WO 99/54342 por U colaboradores, describe líneas celulares diseñadas para expr glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteína (por e beta(1 ,4)-N-acetil-glucosaminil-transferasa III (GnTlll)), manera que los anticuerpos expresados en las líneas c diseñadas exhiben un aumento de estructuras de Glc bisección, lo cual da como resultado un aumento en la activ la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo de los anti (véase también Umana y colaboradores, 1999 Nat. Biotech. 180). Eureka Therapeutics describe además células de mamí ovario de hámster chino genéticamente diseñadas para anticuerpos con un patrón de glicosilación de mamífero desprovisto de residuos de fucosilo (http://www.eurekai puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media bi (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Con el fin de pe anticuerpo, el anticuerpo, o el fragmento del mismo, típicam hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster r o un derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en dond más grupos PEG lleguen a unirse al anticuerpo o al fragm anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo median reacción de acilación o una reacción de alquilación con una m de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo an Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" p abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utiliza derivar otras proteínas, tales como mono-alcoxilo (de 1 a 10 de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol, o polietilenglicol-maleim ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteín conocidos en este campo, y se pueden aplicar a los anticuerp invención. Véanse, por ejemplo, la Patente Europea Númer y colaboradores, Patente Europea Número EP0322094.

Otra posibilidad es una fusión de cuando menos la re enlace de antígeno del anticuerpo de la invención con pr capaces de enlazarse a las proteínas del suero, tales c albúmina de suero humano, para aumentar la vida medi molécula resultante. Este planteamiento se describe, por eje Nygren y colaboradores, Patente Europea Número EP 04865 Métodos para Diseñar los Anticuerpos Alterados Como se discute anteriormente, los anticuerpos anti que tienen las secuencias VH y VL o las secuencias de pesada y ligera de longitud completa mostradas en la prese pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos anti-BAFFR, m la modificación de las secuencias de cadena pesada y/o de ligera de longitud completa, las secuencias VH y/o VL, o las r constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro de la invención, se utilizan las características estructurales anticuerpo anti-BAFFR de la invención para crear anticuerp recombinante con las regiones de estructura conocidas y/o co regiones determinantes de complementariedad, para anticuerpos anti-BAFFR recombinantemente diseñados adic de la invención, como se discute anteriormente. Otros ti modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección ante material de partida para el método de diseño es una o más secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una regiones determinantes de complementariedad de las mismas, fin de crear el anticuerpo diseñado, no es necesario p realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticue tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionada presente, o una o más regiones determinante complementariedad de las mismas. En su lugar, se úti información contenida en las secuencias como el material de para crear secuencias de una "segunda generación" deriv partir de las secuencias originales, y luego se prepar secuencias de la "segunda generación" y se expresan cor grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15-21; y una secue anticuerpo de región variable de cadena ligera que tie secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que con las SEQ ID NOs: 22-28, una secuencia de CDR2 seleccio partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 29-35, secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que con las SEQ ID NOs: 36-42; alterar cuando menos un resi aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región de cadena pesada y/o dentro de la secuencia de anticue región variable de cadena ligera, para crear cuando men secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuen anticuerpo alterada como una proteína.

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la in proporciona un método para la preparación de un anticuer BAFFR optimizado para la expresión en una célula de mamí cual consiste en: una secuencia de anticuerpo de cadena pe longitud completa que tiene una secuencia seleccionada a p La secuencia de anticuerpo alterada también se puede p mediante el rastreo de bibliotecas de anticuerpos que secuencias de CDR3 fijas seleccionadas entre el grupo que c en las SEQ ID NOs: 15-21 y las SEQ ID NOs: 36-42, determinantes de enlace esencial mínimo, como se describe Patente de los Estados Unidos de Norteamérica US20050255552, y la diversidad sobre las secuencias de CDR2. El rastreo se puede llevar a cabo de acuerdo con c tecnología de rastreo apropiada para rastrear anticuerpos a p bibliotecas de anticuerpos, tal como la tecnología de exhibi fagos.

Se pueden emplear las técnicas de biología m convencionales para preparar y expresar la secuencia de ant alterada. El anticuerpo codificado por las secuencias de ant alteradas, es uno que retiene una, algunas, o todas las prop funcionales de los anticuerpos anti-BAFFR descritos en la pr cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se lim técnica y/o descritos en la presente, tales como los que se e en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs).

En ciertas modalidades de los métodos del dis anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones manera aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte secuencia de codificación de un anticuerpo anti-BAFFR, anticuerpos anti-BAFFR modificados resultantes se pueden para determinar la actividad de enlace y/ u otras propi funcionales, como se describe en la presente. Los méto mutación se han descrito en este campo. Por ejemplo, la Publ del TCP Número WO 02/092780 por Short, describe métod crear y rastrear mutaciones de anticuerpos utilizando mutagén saturación, ensamble de ligamiento sintético, o una combina los mismos. De una manera alternativa, la Publicación d Número 03/074679 por Lazar y colaboradores, describe para utilizar los métodos de rastreo de computación con el optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos. completa optimizadas para la expresión en una célula de m se muestran en las SEQ ID NOs: 79-82.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en las enteras, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. U nucleico está "aislado" o "se hace sustancialmente puro" cu purifica de otros componentes celulares u otros contaminan ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, rr técnicas convencionales, incluyendo tratamiento álcali formación de bandas de CsCI, cromatografía en c electroforesis en gel de agarosa, y otras bien conocidas campo. Véase F. Ausubel, y colaboradores, Editores, 1987 Protocols in Molecular Biology, Greene Publishíng and Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invenció ser, por ejemplo, ADN ó ARN, y puede o no contener sec intrónicas. En una modalidad, el ácido nucleico es una molé ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector, t anticuerpo hecho por el hibridoma, se pueden obtener m técnicas convencionales de amplificación con reacción en ca la polimerasa o clonación del ADNc. Para los anticuerpos ob a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por e utilizando las técnicas de exhibición de fagos), el ácido nucle codifique el anticuerpo se puede recuperar a partir de dif clones de fagos que sean miembros de la biblioteca.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que c los segmentos VH y VL( estos fragmentos de ADN se manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recom convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de variable hasta genes de cadena de anticuerpo de longitud co hasta genes de fragmentos Fab, o hasta un gen de scFv. E manipulaciones, un fragmento de ADN que codifique VL ó enlaza operativamente a otra molécula de ADN, o a un fra que codifique otra proteína, tal como una región consta anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operati enlace operativo del ADN que codifique VH a otra molécula que codifique las regiones constantes de cadena pesada (CH y CH3). Las secuencias de los genes de región constante de pesada humanos son conocidas en este campo (véase, por e Kabat, E. A., y colaboradores, 1991 Sequences of Prot Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH Publicación 91-3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regi pueden obtener mediante una amplificación convencion reacción en cadena de la polimerasa. la región constante de pesada puede ser una región constante de lgG1, lgG2, lgG3 IgA, IgE, IgM ó IgD. En algunas modalidades, la región const cadena pesada se selecciona entre los isotipos de IgG 1. Para de cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codific puede enlazar operativamente a otra molécula de ADN que c solamente la región constante de cadena pesada CH1.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede c NIH Publicación Número 91-3242), y los fragmentos de A abarcan estas regiones se pueden obtener mediant amplificación convencional con reacción en cadena de la poli La región constante de cadena ligera puede ser una región co kappa o lambda.

Con el fin de crear un gen de scFv, los fragmentos de A codifican VH y VL se enlazan operativamente a otro fragme codifique un enlazador flexible, por ejemplo, que codifi secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal manera secuencias VH y VL se puedan expresar como una proteína sola cadena contigua, con las regiones VL y VH unidas enlazador flexible (véanse, por ejemplo, Bird y colaboradore Science 242:423-426; Huston y colaboradores, 1988 Pro Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; McCafferty y colaboradore Nature 348:552-554).

Generación de los Anticuerpos Monoclonales de la Invenci Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden procedimiento bien establecido. Los protocolos y técni inmunización para el aislamiento de los esplenocitos inmu para la fusión son conocidos en este campo. Los compone fusión (por ejemplo, las células de mieloma de murino) procedimientos de fusión, también son conocidos.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la p invención se pueden preparar basándose en la secuencia anticuerpo monoclonal de murino preparado como se d anteriormente. El ADN que codifique las inmunoglobulinas de pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de m interés, y se puede diseñar para contener secuenc inmunoglobulina que no sea de murino (por ejemplo, h empleando técnicas de biología molecular convencional ejemplo, con el fin de crear un anticuerpo quimérico, las r variables de murino se pueden enlazar a las regiones con humanas empleando los métodos conocidos en este campo por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norte En cierta modalidad, los anticuerpos de la invenci anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoc humanos dirigidos contra BAFFR, se pueden generar úti ratones transgénicos o transcromosómicos que lleven par sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones refer la presente como ratones HuMAb y ratones KM, respectivam son referidos colectivamente en la presente como "ratone humana".

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene mini-/oc/ del inmunoglobulina humana, que codifican las secuenci inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera hum reconfiguradas, junto con las mutaciones dirigidas que inacti foci de la cadena µ y ? endógenos (véase, por ejemplo, Lo colaboradores, 1994 Nature 368(6474): 856-859). De conf con lo anterior, los ratones exhiben una expresión reducida d de ratón o ?, y, en respuesta a la inmunización, los transg adicionalmente en Taylor, L. y colaboradores, 1992 Nuclei Research 20:6287-6295; Chen, J. y colaboradores, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradore Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94:3720-3724; Choi y colabor 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y colaboradore EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y colaboradores, 1994 J. I 152:2912-2920; Taylor, L. y colaboradores, 1994 Inter Immunology 579-591; y Fishwild, D. y colaboradores, 1996 Biotechnology 14: 845-851). Véanse además las Patentes Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,5 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,8 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; la Patente Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807 a S colaboradores; las Publicaciones del TCP Números WO 92 WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/2488 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y la Publicación del TCP WO 01/14424 a Korman y colaboradores.

Todavía además, en la técnica están disponibles si animales transgénicos alternativos que expresan los ge inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reprod anticuerpos anti-BAFFR de la invención. Por ejemplo, se utilizar un sistema transgénico alternativo referido como e ratón (Abgenix, Inc.). Estos ratones se describen, por ejemplo Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,9 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 a Kucherl colaboradores.

Más aún, en la técnica están disponibles sistemas a transcromosómicos alternativos que expresan los gen inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reprod anticuerpos anti-BAFFR de la invención. Por ejemplo, se utilizar los ratones que llevan tanto un transcromosoma de pesada humano como un transcromosoma de cadena ligera h referidos como "ratones TC"; estos ratones se descri Tomizuka y colaboradores, 2000 Proc. Nati. Acad. Sc EUA anticuerpos humanos están establecidos en la materia, describen en los Ejemplos que se encuentran más adelante. por ejemplo: las Patentes de los Estados Unidos de Norte Números 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 a Lad colaboradores; las Patentes de los Estados Unidos de Norte Números 5,427,908 y 5,580,717 a Dower y colaborador Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5, y 6,172,197 a McCafferty y colaboradores; y las Patentes Estados Unidos de Norteamérica Números 5,885,793; 6,5 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 a Griff colaboradores.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la in también se pueden preparar utilizando ratones SCID, en los se hayan reconstituido las células inmunes humanas, de tal que se pueda generar una respuesta de anticuerpo humana de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5, ratón. Los hibridomas resultantes se pueden rastrear para dét la producción de los anticuerpos específicos del antíge ejemplo, las suspensiones de células individuales de los li esplénicos a partir de los ratones inmunizados se pueden f con una sexta parte del número de células de mieloma de r secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), con PEG al ciento. Las células se aplican a aproximadamente 2x145 en de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación semanas en un medio selectivo que contenga suero de clon 20 por ciento, medio acondicionado "653" al 18 por ciento, O 5 por ciento (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sodio HEPES 5 mM, 2-mercapto-etanol 0.055 mM, 50 Unidades/mili penicilina, 50 miligramos/mililitro de estreptomicin miligramos/mililitro de gentamicina, y 1X HAT (Sigma; el agrega 24 horas después de la fusión). tíespu aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultiv medio en donde el HAT es reemplazado con HT. Entonces se pueden cultivar entonces in vitro para generar pequeñas can de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido p caracterización.

Con el fin de purificar los anticuerpos monoclonales hu los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en m centrífugos de 2 litros para la purificación del anticuerpo mon Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes cromatografía por afinidad con la proteína A-Sepharose (Pha Piscataway, N. J.). La IgG eluida se puede verificar m electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto rend para asegurar la pureza. La solución reguladora se intercambiar en suero regulado con fosfato, y la concentra puede determinar mediante la OD28o> utilizando un coefici extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales se pueden p alícuotas, y se pueden almacenar a -80°C.

Generación de Transfectomas que Producen Antic Monoclonales o completa mediante técnicas de biología molecular convenc (por ejemplo, amplificación con reacción en cadena de la poli o clonación del . ADNc utilizando un hibridoma que exp anticuerpo de interés), y los ADNs se pueden insertar en los v de expresión, de tal manera que los genes se operativamente a las secuencias de control de transcripci traducción. En este contexto, el término "enlazado operativ pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un ve tal manera que las secuencias de control de transcripció traducción dentro del vector sirven para su función preten regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo.

El vector de expresión y las secuencias de control de ex se seleccionan para ser compatibles con la célula hués expresión utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un separado, o más típicamente, ambos genes se insertan en el vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan las regiones constantes de cadena pesada y constantes de ligera del isotipo deseado, de tal manera que el segmento enlace operativamente a los segmentos VH dentro del vect segmento VL se enlace operativamente al segmento CL de vector. Adicionalmente o de una manera alternativa, el ve expresión recombinante puede codificar un péptido de se facilite la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de un huésped. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clona vector, de tal manera que el péptido de señal se enlace de marco al término amino del gen de la cadena de anticue péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglo un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína que no es inmunoglobulina).

En adición a los genes de cadena de anticuerpo, los v de expresión recombinante de la invención llevan sec reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cad anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia regu puede depender de factores tales como la elección de la huésped que se vaya a transformar, del nivel de expre proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la ex de células huésped de mamífero incluyen los elementos vira dirigen altos niveles de expresión de proteína en las cél mamífero, tales como los promotores y/o los potenciadores de a partir de citomegalovirus (CMV), virus de simio 40 adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío mayor de ade (AdMLP)), y polioma. De una manera alternativa, se pueden las secuencias reguladoras no virales, tales como el prom ubiquitina o el promotor de P-globina. Todavía además, se utilizar los elementos reguladores compuestos de secuen diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SR contiene secuencias a partir del promotor temprano de SV4 repetición terminal larga del virus de leucemia de células-T h tipo 1 (Takebe, Y. y colaboradores, 1988 Mol. Cel Biol. 8:466 En adición a los genes de cadena de anticuerpo y Axel y colaboradores). Por ejemplo, típicamente, el gen m seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como higromicina, o metotrexato, a una célula huésped en donde introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables i el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse células huésped de DHFR con selección/amplificaci metotrexato), y el gen neo (para la selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los v de expresión que codifiquen las cadenas pesada y lig transfectan en una célula huésped mediante t convencionales. Las diferentes formas del término "transí pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comú empleadas para la introducción de ADN exógeno en una huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electrop precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-d y similares. Teóricamente, es posible expresar los anticuerp invención en células huésped ya sean procarióticas activos (Boss, M. A. y Wood, C. R., 1985 Immunology Toda 13).

Las células huésped de mamífero para expres anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las cél ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo las célul de DHFR, descritas por Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Nati. Ac EUA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable FR, por ejemplo, cómo se describe en R. J. Kaufman y P. A. 1982 Mol. Biol. 159:601-621, las células de mieloma NSO, las COS, y las células SP2). En particular, para utilizarse con las de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sist expresión genética GS mostrado en la Publicación Inter Número WO 87/04462, en la Publicación Internacional WO89/01036, y en la Patente Europea Número EP 338,841. modalidad, las células huésped de mamífero para expré anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las celulares de mamífero deficientes para la expresión del ge anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de empleando métodos de purificación de proteína convencionale Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención proporci anticuerpo anti-BAFFR, o un fragmento del mismo, conjugad fracción terapéutica, tal como una citotoxina, un fárma ejemplo, un inmunosupresor), o una radiotoxina. Estos conj son referidos en la presente como "inmunoconjugados inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son r como "inmunotoxinas". Una citotoxina o un agente citotóxico cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que a) las células. Los ejemplos incluyen taxón, citocalac gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, eto tenoposida, vincristina, vinblastina, t. colquicina, doxorr daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitr actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, pr tetracaína, lidocaína, propanolol, y puromicina, y anál (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibiótico ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleo mitramicina, y antramicina (A C)), y agentes anti-mitótic ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que se conjugar a un anticuerpo de la invención incluyen duocar caliqueamicinas, maytancinas, y auristatinas, y derivados mismas. Un ejemplo de un conjugado de caliqueamicina-ant está comercialmente disponible (MylotargTm; Wyeth-Ayerst).

Las citotoxinas se pueden conjugar a ios anticuerpo invención utilizando la tecnología de los enlazadores dispon este campo. Los ejemplos de tos tipos de enlazadores que utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluye no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulf enlazadores que contienen péptido. Se puede selecció enlazador que sea, por ejemplo, susceptible a la diso mediante un pH bajo dentro del compartimiento lisoso Cell 3:207-212; Alien, T. ?. , 2002 Nat. Rev. Cáncer 2:7 Pastan, I. y Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 1091; Senter, P. D. y Springer, C. J., 2001 Adv. Drug Del¡ 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también se conjugar a un isótopo radioactivo para generar pr radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como inmunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radioactivos pueden conjugar a los anticuerpos para utilizarse diagnóstica terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131, i itrio90, y lutecio177. Los métodos para la preparación de lo inmunoconjugados están establecidos en la técnica. Los ejem los radio-inmunoconjugados están comercialmente disp incluyendo ZevalinMR (DEC Pharmaceuticals), y BexxarMR Pharmaceuticals), y se pueden emplear métodos similares preparación de los radio-inmunoconjugados utilizand anticuerpos de la invención. difteria; una proteína, tal como factor de necrosis tu interferón-?; o modificadores de la respuesta biológica, tale por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (??_-1"), interleucina-2 ( interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de mac de granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulante de colon granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar esta fracción terapéutic anticuerpos son bien conocidas; véanse, por ejemplo, colaboradores "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting O In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer T Reisfeld y colaboradores (Editores), páginas 243-56 (Alan Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores "Antibodies For Drug D en Controlled Drug Delivery (Segunda Edición), Robi colaboradores (Editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer The Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Applications, Pinchera y colaboradores (Editores), páginas ? ¡específicas o multiespecíficas que comprenden un anticuer BAFFR, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticu la invención, o las regiones de enlace de antígeno del mis pueden derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ej otro péptido o a otra proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o para un receptor), con el fin de generar una molécula bies que se enlace a cuando menos dos sitios de enlace o m objetivo diferentes. El anticuerpo de la invención, de he puede derivar o enlazar a más de una molécula funcional d para generar moléculas multiespecíficas que se enlacen a dos sitios de enlace y/o moléculas objetivo diferentes; moléculas multiespecíficas también pretenden ser abarcada término "molécula biespecífica", como se utiliza en la presen el fin de crear una molécula biespecífica de la invenci anticuerpo de la invención se puede enlazar funcionalmen ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, as no covalente, o de otra manera), a una o más moléculas de epítopo objetivo. Otro ejemplo es una molécula biespecífi comprende cuando menos una primera especificidad de enla BAFFR, y una segunda especificidad de enlace para un dentro de CD20.

Adicionalmente, para la invención en donde la m biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir una tercera especificidad de enlace, en adición a los pri segundo epítopos objetivo.

En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la in comprenden, como una especificidad de enlace, cuando me anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, incluyendo, por e un Fab, Fab1, F(ab')2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El ant también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena o cualquier fragmento mínimo dei mismo, tal' como un Fv, construcción de una sola cadena, como se describe en L colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norte Número 4,946,778, el contenido de la cual se in ? ¡específica se puede generar por separado, y luego se conjugar unas con otras. Cuando las especificidades de enl proteínas o péptidos, se pueden utilizar una variedad de age acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalen ejemplos de los agentes de reticulación incluyen Proteína A, imida, tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (SATA), 5,5'-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), o-feni!en-dima!eimida (oPD ditiopiridil)-propionato de N-succinimidilo (SPDP), y 4-(N-mal metil)-ciclohexan-1 -carboxilato de sulfo-succinimidilo (sulfo (véanse, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores, 1984 J. Ex 160:1686; Liu, MA y colaboradores, 1985 Proc. Nati. Acad. S 82:8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulu Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan y colaboradore Science 229:81-83); y Glennie y colaboradores, 1987 J. I 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, Cuando las especificidades de enlace son anticuer particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una p de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, o ligando Una molécula biespecífica de la invención puede ser una m de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de u cadena y un determinante de enlace, o una molécula biespec una sola cadena que comprenda dos determinantes de enla moléculas biespecíficas pueden comprender cuando men moléculas de una sola cadena. Los métodos para la prepara las moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,260,203 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,4 en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica f 4,881,175; en la Patente de los Estados Unidos de Norte Número 5,132,405; en la Patente de los Estados Uni Norteamérica Número 5,091,513; en la Patente de los Unidos de Norteamérica Número 5,476,786; en la Patente Estados Unidos de Norteamérica Número 5,013,653; en la Pat complejos de proteína-anticuerpo de interés particular, medi empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anti específico para el complejo de interés.

Anticuerpos Multi alentes En otro aspecto, la presente invención proporciona anti multivalentes que comprenden cuando menos dos porció enlace de antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpo invención, que se enlazan a BAFFR. En una modalid anticuerpos multivalentes proporcionan cuando menos 2, porciones de enlace de antígeno de los anticuerpos. Las po de enlace de antígeno se pueden enlazar entre sí por m fusión de proteína o de un enlace covalente o no covalente. manera alternativa, se han descrito los métodos de enlace moléculas biespecíficas. Los compuestos tetravalentes se obtener, por ejemplo, mediante la reticulación de los anticue la invención con un anticuerpo que se enlace a las r constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, l combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticue inmunoconjugados, o moléculas biespecíficas de la invenci ejemplo, una composición farmacéutica de la invención comprender una combinación de anticuerpos que se enl diferentes epítopos sobre el antígeno objetivo, o que actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la invención tam pueden administrar en la terapia de combinación, es combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la tera combinación puede incluir un anticuerpo anti-BAFFR de la p invención, combinado con cuando menos otro agent inflamatorio u otro agente quimioterapéuttco, por ejemplo, un citotóxico, contra el cáncer, o anti-prolíferativo. Los ejemplo agentes terapéuticos que se pueden utilizar en la ter combinación se describen con mayor detalle más adelante sección sobre usos de los anticuerpos de la invención.

Como se utiliza en la presente, un "vehículo farmacéutic biespecífica, se puede recubrir en un material para prot compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones n que puedan inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden una o más sales farmacéuticamente aceptables. Un farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que ret actividad biológica deseada del compuesto progenitor, y no ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, B M., y colaboradores, 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejem estas sales incluyen las sales de adición de ácido y las s adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen derivadas a partir de los ácidos inorgánicos no tóxicos, tale ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, brom yodhídrico, fosforoso, y similares, así como a partir de los orgánicos no tóxicos, tales como los ácidos mono- y di-carb alifáticos, los ácidos alcanoicos sustituidos por fenilo, los hidroxi-alcanoicos, los ácidos aromáticos, los ácidos su de los antioxidantes farmacéuticamente aceptables in antioxidantes solubles en agua, tales como ácido as clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sulfito de sodio, y similares; antioxidantes solubles en agu como palmitato de ascorbilo, hidroxi-anisol butilado (BHA), tolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-toco similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido ácido etilen-diamina-tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido ta ácido fosfórico, y similares.

Los ejemplos de los vehículos acuosos y no acuosos pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la in incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propile polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres or inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materia recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimie parabeno, cloro-butanol, ácido sórbico de fenol, y similares. T puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como az cloruro de sodio, y similares, en las composiciones. En adic puede provocar una absorción prolongada de la forma farma inyectable mediante la inclusión de agentes que dem absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables i soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estéril la preparación extemporánea de soluciones o dispe inyectables estériles. El uso de estos medios y agentes ? sustancias farmacéuticamente activas es conocido en este Excepto hasta donde cualquier medio convencional o age incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del en las composiciones farmacéuticas de la invención, Tam pueden incorporar compuestos activos complementarios composiciones.

Las composiciones terapéuticas típicamente deb mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, medí mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el cas dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. En muchos ca pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcare alcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodi composición. Se puede provocar una absorción prolongada composiciones inyectables mediante la inclusión en la comp de un agente que demore la absorción, por ejemplo, s monoestearato y gelatina.

Se pueden encontrar revisiones sobre el desarrollo formulaciones de proteína estables (por ejemplo, anticuer Cleland y colaboradores (1993) Crit. Reviews. Ther. Drug Systems 0(4):307-377, y Wei Wang (1999) Int. J. Pharma 185:129-88. Se pueden encontrar discusiones de form adicionales para los anticuerpos, por ejemplo, en Daugherty (2006) Advanced Drug Delivery Reviews 58: 686-706; Pate los Estados Unidos de Norteamérica Números US 61 inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, gl propileng licol , u otros solventes sintéticos; agentes antibact tales como alcohol bencílico o metil-parabenos; antioxidante como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelante como ácido etilen-diamino-tetra-acético; reguladores del p como acetatos, citratos, o fosfatos; y agentes para el ajust tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se ajusfar con ácidos p bases, tales como ácido clorhídrico o hi de sodio. Estas preparaciones se pueden encerrar en amp jeringas desechables, o frascos de múltiples dosis hechos de de plástico.

Las soluciones inyectables estériles se pueden p mediante la incorporación del anticuerpo de la invención cantidad requerida en un solvente apropiado con uno combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, se requiera, seguido por microfiltración para la esterilizaci términos generales, las dispersiones se preparan medi Cuando se administra una cantidad terapéuticamente de un anticuerpo de la invención, por ejemplo, mediante in intravenosa, cutánea, o subcutánea, el agente de enlace está forma de una solución acuosa exenta de pirógeno, parenter aceptable. La preparación de estas soluciones de p parenteralmente aceptables, teniendo la debida considerac pH, isotonicidad, estabilidad, y similares, está dentro experiencia de la técnica. Una composición farmacéutica p para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea, debe co en adición a los agentes de enlace, un vehículo isotónico, t inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyec dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyec Ringer lactada, u otro vehículo, como se conocen en este Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación t pueden contener estabilizantes, conservadores, reguladores anttoxidantes, u otros aditivos conocidos por los expertos campo. aproximadamente el 0.01 por ciento a aproximadamente el ciento de ingrediente activo, de aproximadamente el 0.1 por aproximadamente el 70 por ciento, o de aproximadamente e ciento a aproximadamente el 30 por ciento de ingrediente ac combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporci respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terap Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se administrar varias dosis divididas a través del tiempo, o la d puede reducir o aumentar proporcionalmente, como sea indic las exigencias de la situación terapéutica. Es especi conveniente formular las composiciones parenterales en un unitaria de dosificación para una facilidad de administr uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosifi como.se utiliza en la presente, se refiere a las unidades físiC separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los que se vayan a tratar; cada unidad contiene una c individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación es intervalo de aproximadamente 0.0001 a 100 miligramos/kilog más usualmente de 0.01 a 5 miligramos/kilogramo del peso c del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser miligramos/kilogramo de peso corporal, de 1 miligramo/kilogr peso corporal, de 3 miligramos/kilogramo de peso corpora miligramos/kilogramo de peso corporal, o de 10 miligramos/kil de peso corporal, o dentro del intervalo de 1 miligramos/kilogramo. Un régimen de tratamiento de ejemplo la administración una vez por semana, una vez cada dos se una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, un mes, una vez cada tres meses, o una vez cada 3 a 6 mes regímenes de dosificación para un anticuerpo anti-BAFFR invención incluyen 1 miligramo/kilogramo de peso corpor miligramos/kilogramo de peso corporal mediante admini intravenosa, dándose el anticuerpo utilizando uno de los sig normalmente se administra en múltiples ocasiones. Los i nt entre las dosificaciones individuales pueden ser, por e semanalmente, mensualmente, cada tres meses, o anualmen intervalos también pueden irregulares, como se indica medi medición de los niveles en sangre del anticuerpo para el a objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosifica ajusta para alcanzar una concentración de anticuerpo en pía aproximadamente 1 a 1,000 microgramos/mililitro, y en métodos, de aproximadamente 25 a 300 microgramos/mililitro.

De una manera alternativa, el anticuerpo se puede ad como una formulación de liberación sostenida, en cuyo c requiere una administración menos frecuente. La dosificaci frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerp paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran media más larga, seguidos por los anticuerpos humanizad anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no human dosificación y la frecuencia de administración pueden paciente muestre una aminoración parcial o completa síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede admini paciente un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes en las composiciones farmacéuticas de la presente inven pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente acti sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada paciente particular, composición, y modo de administración, sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación selec dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, i ncl la actividad de las composiciones particulares de la p invención empleadas, o del éster, sal, o amida de las misma vía de administración, del tiempo de administración, de la ve de excreción del compuesto particular empleado, de la durac tratamiento, de otros fármacos, compuestos, y/o materiales úti en combinación con las composiciones particulares empleada edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica Una composición de la presente invención se puede adm mediante una o más vías de administración, utilizando uno o una variedad de métodos conocidos en este campo. Com apreciado por el experto, la vía y/o el modo de admini variarán dependiendo de los resultados deseados. Las v administración para los anticuerpos de la invención i intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, SUDC espinal, u otras vías de administración parenteral, por e mediante inyección o infusión. La frase "administración pare como se utiliza en la presente, significa los modos de admini diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente m inyección, e incluye, sin limitación, la inyección e i intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intrac intraorbttal, intracardíaca, intradérmica, intraper transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-arterial, subc subaracnoidea, intraespinal, épidural, e intraesternal.

De una manera alternativa, un anticuerpo de la inven pueden utilizar polímeros biocompatibles biodegradables, tale etileno-acetato de vi ni lo , poli-anhídridos, poli-ácido gl colágeno, poli-orto-ésteres, y poli-ácido láctico. Muchos para la preparación de estas formulaciones están patentado generalmente conocidos por los expertos en este campo. Véa ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery S J. R. Robinson, Editor, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administr dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, modalidad, una composición terapéutica de la invención se administrar con un dispositivo para inyección hipodérmica sin tal como los dispositivos mostrados en las Patentes de los Unidos de Norteamérica Números 5,399,163; 5,383,851; 5,3 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 ó 4,596,556. Los ejemplos implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente in incluyen: Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,487,603, la cual muestra una bomba para micro-i un aparato para infusión implantable de flujo variable, suministro continuo del fármaco; Patente de los Estados Un Norteamérica Número 4,439,196, la cual muestra un sist suministro de fármaco osmótico que tiene compartimien múltiples cámaras; y Patente de los Estados Unidos de Norte Número 4,475,196, la cual muestra un sistema de sumini fármaco osmótico. Los expertos en este campo conocen otros implantes, sistemas de suministro, y módulos.

En ciertas modalidades, los anticuerpos monoc humanos de la invención se pueden formular para asegu distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos alt hidrof ílicos. Con el fin de asegurar que los compuestos terap de la invención crucen la barrera hematoencefálica (si se de pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los mét fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,811; 5,374 Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y colabor 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais y colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de Proteín tensoactivo (Briscoe y colaboradores, 1995 Am. J. 1233:134); página 120 (Schreier y colaboradores, 1994 Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; . L. Lau 1994 FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler, Immunomethods 4:273.

Usos y Métodos de la Invención Los anticuerpos de la presente invención tienen utilid diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo moléculas se pueden administrar a las células en culti ejemplo, in vitro o in vivo, o a un sujeto, por ejemplo, in vi tratar, prevenir, o diagnosticar una variedad de trastornos. El "sujeto", como se utiliza en la presente, pretende incluir a a humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tale las células-B humanas, mediante la administración d composición que comprende una dosis terapéuticamente efici los anticuerpos de la invención.

Como se utiliza en la presente, "un trastorno relacion BAFFR" incluye las condiciones asociadas con, o caracterizad niveles de BLyS aberrantes, y/o con las enfermedades o cond que puedan ser tratadas mediante el consumo o aniquilación células-B. Éstas incluyen las condiciones inflamatorias, ale condiciones alérgicas, reacciones de hipersensi enfermedades autoinmunes, infecciones graves, y rech trasplante de órganos o tejidos. Éstas incluyen además neo de células-B.

Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se pueden para el tratamiento de receptores de trasplantes de corazón, corazón-pulmón combinados, hígado, riñon, páncreas, piel, o incluyendo rechazo de alo-injerto o rechazo de xeno-injerto, y prevención de la enfermedad del injerto contra el huésped, t condiciones inflamatorias y enfermedades reumáticas que inv pérdida ósea, dolor inflamatorio, espondiloartropatías, ind espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, soriática, y artritis enteropática, hipersensibilidad (incluyend hipersensibilidad de las vías respiratorias como hipersens dérmica), y alergias. Las enfermedades auto-inmunes esp para las cuales se pueden emplear los anticuerpos de la in incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyend ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia de g rojos puros, y trombocitopenia idiopática), hemofilia A ad enfermedad de aglutinina fría, crioglobulinemia, trombocitopénica trombótica, síndrome de Sjógren, lupus erite sistémico, trastornos musculares inflamatorios, polic esclerodermia, vasculitis citoplásmica anti-neutróftlos asocia anticuerpos, neuropatía mediada por Ig , síndrome de ops mioclonos, granulomatosis de Wegener, dermatomiocitis, h activa crónica, miastenia gravis, soriasis, síndrome de artritis soriática y glomerulonef ritis (con y sin síndrome nefróti ejemplo incluyendo síndrome nefrótico idiopático o nefrop cambio mínimo), tumores, enfermedad inflamatoria de la piel córnea, miocitis, aflojamiento de implantes óseos, tra metabólicos, tales como ateroesclerosis, diabetes, y dislipide Los anticuerpos de la invención también son útiles tratamiento, la prevención, o la aminoración de asma, bro neumoconiosis, enfisema pulmonar, y otras enferm obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias.

Los anticuerpos de la invención también son útiles tratamiento de las enfermedades del metabolismo óseo, inc osteoartritis, osteoporosis, y otros artrítidos inflamatorios, y ósea en general, incluyendo pérdida ósea relacionada con la en particular enfermedad periodontal.

Debido a que el enlace de BAFFR a los linfocitos san periféricos humanos y a la línea de células-B humanas es por los polipéptidos de BAFFR, los anticuerpos de la in múltiple. Otros neoplasmas de células-B están abarcados de alcance de la invención.

Los anticuerpos de la invención se pueden administrar único ingrediente activo, o en conjunto con, por ejemplo, c adyuvante para, o en combinación con, otros fármacos, por e agentes inmunosupresores o inmunomoduladores, u otros anti-inflamatorios, u otros agentes citotóxicos o contra el cán ejemplo, para el tratamiento o la prevención de las enferm mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos invención se pueden utilizar en combinación con DMAF ejemplo, sales de Oro, sulfalazina, anti-malarias, metotrex penicilamina, azatioprina, ácido micofenólico, ciclospori tacrolimus, sirolimus, minociclina, leflunomida, glucocorticoi inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK modulador de la recirculación de linfocitos, por ejemplo FT análogos de FTY720; un inhibidor de mTOR, por ejemplo rapa 40-O-(2-hidroxi-etil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23 CD52, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros com inmunomoduladores, por ejemplo una molécula de recombinante que tenga cuando menos una porción del extracelular de CTLA4 ó un mutante de la misma, por e cuando menos una porción extracelular de CTLA4 o un mutan misma, unida a una secuencia de proteína que no sea CTL ejemplo CTLA4lg (por ejemplo, designada como ATCC 6862 mutante de la misma, por ejemplo LEA29Y; inhibidores de m de adhesión, por ejemplo antagonistas de LFA-1, antagoni ICAM-1 ó -3, antagonistas de VCAM-4, o antagonistas de V un agente quimioterapéutico, por ejemplo paclitaxel, gemc cisplatino, doxorrubicina, o 5-fluoro-uracilo; agentes anti-T ejemplo anticuerpos monoclonales para TNF, por ejemplo infl adalimumab, CDP870, o construcciones receptoras para T TNF-RII, por ejemplo Etanercept, PEG-TNF-RI; bloqueadores citoquinas pro-inflamatorias, bloqueadores de IL-1 , por Anakinra o la trampa de IL-1, AAL160, ACZ 885, bloqueadore proporciona, en un aspecto todavía adicional: un método como se define anteriormente, el cual compr co-adminístración, por ejemplo, de una manera concomitant secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva antagonista de BAFFR, por ejemplo, un anticuerpo de la inve cuando menos una segunda sustancia de fármaco, siend segunda sustancia de fármaco un fármaco inmuno-supresor/i modulador, anti-inflamatorio, quimioterapéutico, anti-infeccio ejemplo, como se indica anteriormente.

O una combinación terapéutica, por ejemplo un k comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de: antagonista de BAFFR, por ejemplo un anticuerpo de la inve b) cuando menos una segunda sustancia seleccionada a parti fármaco inmuno-supresor/inmuno-modulador, anti-infla quimioterapéutico, o anti-infeccioso, por ejemplo, como se anteriormente. El kit puede comprender instrucciones p administración.

En una modalidad específica, los anticuerpos de la in se pueden administrar en combinación con otro agente ani de células-B, es decir, por ejemplo, un anticuerpo con dire CD20 con actividad de ADCC, tal como Rituximab.

En otra modalidad, los anticuerpos de la invenc administran solamente a la población de pacientes q seleccionada entre los pacientes que sufran de lupus erite sistémico o artritis reumatoide, y que exhiban un nivel anó suero de BLyS. En otra modalidad, los anticuerpos de la inven administran solamente a una población de pacientes q seleccionada de entre el grupo de pacientes que respon tratamiento contra BLyS. Los biomarcadores que identifique pacientes que tengan una mayor probabilidad de respo tratamiento contra BLyS pueden ser cualquiera de los siguie limitarse a los mismos: niveles elevados de BLyS en suero, elevados de ciertos subconjuntos de células-B, presencia o a BAFFR se detectan y se comparan entre la muestra y el cont ejemplo, los métodos de detección convencionales, bien co en la técnica, tales como ELISA y los ensayos citométricos d se pueden llevar a cabo utilizando las composiciones invención.

De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la in proporciona además métodos para detectar la presencia de (por ejemplo, el antígeno de BAFFR humano) en una muestra, medir la cantidad de BAFFR, los cuales comprenden po contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticu la invención, o con una región de enlace de antígeno del mis se enlace específicamente al BAFFR, bajo condiciones que p la formación de un complejo entre el anticuerpo o la porc mismo y el BAFFR. Entonces se detecta la formación de un co en donde una diferencia en la formación del complejo e muestra comparada con la muestra de control, indica la prese BAFFR en la muestra. una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del término "etiqueta" incluye cualquier escrito o material reg suministrado sobre o con el kit, o que acompañe de otra ma kit. El kit puede comprender además herramientas para diag si un paciente pertenece a un grupo que responda a un trat con el anticuerpo anti-BAFFR, como se define anteriormente.

Habiéndose descrito completamente la invención, se adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos y reivindica los cuales son ilustrativos y no pretenden ser adicion limitantes.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra los resultados de la artritis induc colágeno (CIA) en ratones DBA/1 (MCOL37) después inmunización en el día cero, del refuerzo en el día 21, y del in tratamiento en el día -9. Los símbolos cuadrados muestran el de las patas para el anticuerpo anti-BAFF - MOR6743-mlgG una dosis igual a 200 microgramos/200 mic periféricas CD20+ y CD40+ en tres mono cinomolgos despué administración intravenosa de 20 miligramos/kilogramo anticuerpos anti-BAFFR (MOR06654).

La Figura 3A muestra el número absoluto de las sanguíneas periféricas CD20+ y CD40+ en tres monos cino después de la administración intravenosa d microgramos/kilogramo de los anticuerpos anti-BAFFR (MOR0 La Figura 3B muestra el número absoluto de sanguíneas periféricas CD20+ y CD40+ en tres monos cino después de la administración intravenosa d microgramos/kilogramo de los anticuerpos anti-BAFFR no fuco (MOR06654).

Partes Experimentales 1. Ensayos de Rastreo.

Rastreo FACS de ios paneos iniciales.

Para la detección de los anticuerpos Fab de enlace de del primer rastreo primario, por ejemplo, el rastreo de exhibi 35 microlitros del Msado bacteriano que contiene Fab en un v final de 100 microlitros de regulador FACS, y se incuban s agitador a 4°C durante 1 hora Luego las células se lavan una regulador FACS, y se vuelven a suspender en anticuerpo sec de IgG de cabra anti-humano conjugado con ficoeritrina, el ha diluido a 1:200 en regulador FACS. Después de 1 h incubación a 4°C sobre un agitador, las células se lavan nuev una vez con regulador de FACS, se vuelven a suspen regulador FACS, y se mide el enlace de superficie célul ejemplo, mediante la intensidad de fluorescencia de las célul instrumento FACSArray (Becton Dickinson).

ELISA de captura de Fe.

Con el fin de identificar los anticuerpos Fab que se enla BAFFR en los clones enriquecidos a partir de la exhibición d se rastrean los Usados de clones de E. coli seleccionados establecimiento de ELISA de captura de Fe como sigue: las Maxisorp de 384 pozos se recubren con 20 microgramos/mili las placas. Subsiguientemente, se detectan los Fabs que se con BAFFR:Fc mediante incubación con IgG de cabra anti-conjugada con fosfatasa alcalina, específica de Fab, diluida a en MPBST al 0.5 por ciento, seguido por la adición del sust fluorescencia AttoPhos (Roche Diagnostics). La emisi fluorescencia a 535 nanometros se registra con una excitació nanometros en un lector de placas TECAN Spectrafluor.

ELISA de captura de Fab.

Para la detección de los anticuerpos Fab que se enla BAFFR a partir de la exhibición de fagos, se rastrean los lis los clones de E. coli seleccionados en un establecimiento E captura de Fab: las placas Maxisorp de 384 pozos se recub un anticuerpo específico del fragmento Fd, de IgG de ovej humano, diluido a 1:1000 en suero regulado con fosfato dur noche a 4°C. Al día siguiente, las placas se lavan y se bloqu TBS/Tween al 0.5 por ciento/polvo de leche al 5 por ciento ( al 5 por ciento) durante 1 hora a temperatura ambiente. En p (Zymax), diluida a 1:3000 en PBST al 2.5 por ciento, seguid adición del sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche Diagn La emisión de la fluorescencia a 535 nanómetros se registró excitación a 430 nanómetros en un lector de placas Spectrafluor.

ELISA de enlace de BAFFR-BLyS.

Con el fin de identificar directamente los anti inhibidores, se rastrean los Fabs marcados con FLAG en un de enlace de BAFFR-BLyS: las placas Maxisorp de 96 po recubren con 1 microgramo/mililitro de hsBLyS en suero r con fosfato durante la noche a 4°C. Al día siguiente, las pl lavan y se bloquean con suero regulado con fosfato/albú suero bovino al 2 por ciento durante cuando menos 1 temperatura ambiente. En paralelo, los lisados bacterian contienen Fab se bloquean con üna concentración final de al de suero bovino al 2.5 por ciento. Los lisados bact previamente bloqueados se incuban con 5 microgramos/milil detecta el bio-BAFFR:Fc enlazado a BLyS mediante incubaci estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Zymax) di 1:3000 en suero regulado con fosfato/albúmina de suero bo 2.5 por ciento, seguido por la adición del sustrato de flúore AttoPhos (Roche Diagnostics) . La emisión de fluorescencia nanómetros se registra con una excitación a 430 nanómetro lector de placas TECAN Spectrafluor.

En el caso de que se utilicen FABS purificados en luga Usados bacterianos, se omite el paso de reticulación de anti-F Rastreo FACS después de la maduración.

Segunda maduración: Para el rastreo de los enlazantes a partir de la madura puede llevar a cabo el análisis FACS como se describe, siguientes cambios: el lisado de los clones de E. coli selecci se diluye hasta que las señales máximas estén debajo saturación. Los lisados se analizan para determinar el enlac células Raji. Se mezclan 5x104 células por 96 pozos c La determinación de afinidad en solución se puede l cabo básicamente como se describe en la literatura (Fri colaboradores (1985) J. Immunol. Meth. 77, 305-319, y H colaboradores (2005) Anal. Biochem. 339, 182-184). Con el o mejorar la sensibilidad y la precisión del método SET, el mé transfiere desde el ELISA clásico hasta la tecnología B basada en SL. Un miligramo/mililitro de anticuerpos específi fragmento Fe de IgG de cabra anti-humano (Fab)2 o de cab ratón (Dianova) se marcó con BV-tagMR NHS-Ester (Bioveris Witney, Oxfordshire, Reino Unido) de acuerdo con las instru del fabricante. El experimento se lleva a cabo en pla microtitulación de polipropileno, y con suero regulado con fo un pH de 7.4 complementado con albúmina de suero bovino por ciento y Tween 20 al 0.02 por ciento como regulador de El BAFFR:Fc no marcado se diluye en serie 2n. Los po antígeno se utilizan para determinar los valores Smax. Despu adición del Fab 100 pM (concentración final en el volumen fin sobre un agitador Eppendorf (700 revoluciones por min temperatura ambiente, se detectan las señale electroquimiluminiscenia, utilizando una Estación de Trabajo SERIES® (Bioveris Europe).

Determinación de KD Biacore sobre el antígeno direct recubierto.

Las constantes cinéticas kactivada y kdesact¡vada se determi diluciones en serie del enlace de Fab respectivo ya sea al BA capturado con Fe, o bien al BAFFR:Fc covalentemente inmo (Alexis), o al BAFFR (Peprotech), utilizando el instrumento 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia). Para la inmovilización coval los antígenos o del estándar de anticuerpo de captura anti utiliza la química de acoplamiento de amina con EDC-NH mediciones cinéticas se hacen en suero regulado con fosfat 136 m , KCI 2.7 mM, Na2HP04 10 mM, KH2P04 1.76 mM, pH a una velocidad de flujo de 20 microlitros/minuto, úti concentraciones de Fab en el intervalo de 1.5 a 500 nM. El tie ciento, el cual se filtró estéril (tamaño de poros de 1.2 y mieras) antes de usarse, con el objeto de remover los agreg proteína después de la descongelación.

Determinación de ios valores IC50 en el ensayo de enl BAFFR-BLyS (FACS de competencia).

El ensayo de enlace de BAFFR-BLyS se lleva a cabo úti células Raji que expresan el BAFFR endógeno. Los específicos de BAFFR se utilizan en diluciones finales en el i de 40 a 0.001 nM. Los FABS diluidos se incuban en placas pozos con 5x104 células Raji por pozo durante 1 hora a 4°C s agitador. Entonces se agrega el hsBLyS biotinilado concentración final de 25 nanogramos/mililitro, y las cél incuban durante 30 minutos a 4°C sobre un agitador. Las cél lavan dos veces con el regulador FACS, y luego se vu suspender en estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Diano se ha diluido a 1:200 en regulador FACS. El teñido se lleva durante 1 hora a 4°C sobre un agitador. Finalmente, las cél pozos se lavan cuatro veces con suero regulado con fosfato 20 al 0.05 por ciento (PBST), y luego se bloquean durante 1 37°C con PBST que contiene albúmina de suero bovino al ciento, seguido por cuatro pasos de lavado con PBST. Se ag proteína de fusión de BAFFR:Fc humana biotinilada (Axxor nanogramos/mililitro, y se captura durante 1 hora a 37°C, ju concentraciones crecientes de anticuerpos anti-BAFFR. Des otra ronda de lavado, se agrega ExtrAvidin-fosfatasa (Sigma) a los pozos, y se incuban durante 30 minutos a 3 fosfatasa enlazada se detecta mediante la adición de una s que contiene fosfato de p-nitro-fenilo en dietanolamina (Sig reacción de color se detiene después de aproximadame minutos con un volumen igual de hidróxido de sodio 2N, y se absorbencia a 405 nanómetros sobre un lector de (SpectraMax 190, Molecular Devices).

Determinación de ios vaiores IC50 en ei ensayo de enl péptido de BAFFR (miniBR3) - BLyS (ELISA de competenci con concentraciones crecientes de anticuerpos anti-BAFFR. D de otra ronda de lavado, se agrega ExtrAvidin-fosfatasa (Sigma) a los pozos, y se incuban durante 30 minutos a 3 fosfatasa enlazada se detecta mediante la adición de una s que contiene fosfato de p-nitro-fenilo en dietanolamina (Sig reacción de color se detiene después de aproximadame minutos con un volumen igual de hídróxido de sodio 2N, y se absorbencia a 405 nanómetros sobre un lector de (SpectraMax 190, Molecular Devices).

Análisis de reactividad cruzada con el BAFFR de cinomolg Se prueba la reactividad cruzada de los Fabs con el BA cinomolgo en el análisis de titulación FACS sobre células HE transfectadas con BAFFR de cinomolgo. Los Fabs candidatos se utilizan en diluciones en el intervalo de 177 nM a 0.001 Fabs diluidos se incuban en placas de 96 pozos con 5x104 por pozo durante 1 hora a 4°C sobre un agitador. Enton células se lavan dos veces con regulador FACS, y se vu Se prueba la reactividad cruzada de los Fabs con BCM análisis de titulación FACS sobre células HEK293T transfecta BCMA. Los Fabs se utilizan en concentraciones finales intervalo desde alto nM o inclusive µ bajando hasta pM. El de las células y la detección del enlace de Fab se llevan como se describe.

ELISA Las placas Maxisorp de 384 pozos se recubren dur noche a 4°C con un anticuerpo de captura específico del fra Fcy de IgG de cabra anti-humano. Después del recubrimie pozos se lavan dos veces con suero regulado con fosfato/Tw al 0.05 por ciento (PBST), y luego se bloquean durante 1 temperatura ambiente con PBST conteniendo polvo de leche ciento, seguido por dos pasos de lavado con PBST. Se agre proteínas de fusión de Fe recombinantes BCMA y TACI capturan durante 1 hora a temperatura ambiente. Enton agregan los Fabs específicos de BAFFR purificados y diluido 3. Ensayos funcionales basados en células.

Co-estímuio inducido por BLyS de ia proliferación de cé humanas.

Se purificaron los Itnfocitos-B sin tocarse a partir de mononucleares de sangre periférica, mediante el consumo d tipos de células, utilizando el kit de aislamiento de células-B (Milteny Biotec). Para inducir la proliferación de las célula sembraron 100 microlitros que contenían 1x105 células en pl 96 pozos de fondo redondo en cinco réplicas. El BLyS humano se agregó en una concentración de 3 nanogramos/ junto con perlas al 0.35 por ciento (volumen/volumen) acopla anticuerpos de IgM anti-humanos. Con el objeto de determi potencias inhibidoras, se agregaron anticuerpos anti-BA diferentes concentraciones. Para la determinación d propiedades agonistas de los anticuerpos anti-BAFFR, las cé indujeron con perlas al 0.35 por ciento (volumen/volumen) ac con los anticuerpos de IgM anti-humanos, y concentr mononucleares de sangre periférica, mediante el consumo d tipos de células, utilizando el kit de aislamiento de células-B (Milteny Biotec). Para inducir la síntesis de I gG 1 , se sembrar microlitros que contenían 1x105 células en placas de 96 po fondo redondo, en cinco réplicas, y se estimularon nanogramos/mililitro de BLyS soluble humano, junto co nanogramos/mililitro de IL-21 humana (Pepro Tech Inc.). objeto de determinar sus potencias inhibidoras, se agrega anticuerpos anti-BAFFR en diferentes concentraciones. P determinación de las propiedades agonistas de los anticuerp BAFFR, las células se indujeron con 100 nanogramos/mililitro 21 humana, y con concentraciones crecientes de anticuerp BAFFR (no se agregó BLyS adicional). Las células se cul durante 9 días, y se recolectaron los sobrenadantes. La I determinó en los sobrenadantes celulares mediante el inmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA).

Ensayo de citotoxicidad celular dependiente del anti aislamiento de células aniquiladoras humanas MACS ( Biotec). Se incubaron concentraciones crecientes de antic anti-BAFFR en 100 microlitros, con 1.104 células-B en 50 mic del medio de cultivo, en las placas de 96 pozos en form (Corning) durante 20 minutos. Entonces, se agregaron 50 mic que contenían 1x105 células aniquiladoras naturales, y se inc durante 4 horas a 37°C. Las células se centrifugaron, removieron 150 microlitros de sobrenadante. Las células se v a suspender, y se agregaron 10 microlitros de una dilución d de 7-amino-actinomicina D (7-AAD, Becton Dickinson). Las se enumeraron en un instrumento FACScalibur (Becton Dickin análisis de datos de las células positivas para 7-AAD se llevó utilizando el software CelIQuest Pro (Becton Dickinson). 4. Ensayos funcionales in vivo.

Ensayo de consumo de células-B in vivo.

Se evaluaron los efectos de consumo de los anticuerp BAFFR sobre los números de células-B como sigue: por un incremento en la proporción de células-T a células-B. b) Se determinan los números absolutos de células-células/microlitro de sangre mediante citometría de flujo, úti el anticuerpo anti-CD19 fluorescentemente marcado, en comb con tubos TruCOUNT (Cat. # 340334; Becton Dickinson, Sa CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de modelo animal de CIA, Se ha propuesto que la artritis inducida por colágen refleja muchos aspectos de las enfermedades humanas. La inducida por colágeno se induce mediante la inmunización d generalmente susceptibles de ratones con colágeno tipo adyuvante, y esto es mediado por reacciones autoinmun incluyen la generación de auto-anticuerpos, los cuales se entonces a una región particular del colágeno tipo II (Cll). Ta linfocitos-B como los linfocitos-T son importantes en la pato de la artritis inducida por colágeno, la histología articulaciones en el modelo animal tiene muchas similitudes anti-BAFFR o de anticuerpos de control de isotipo en un r profiláctico (día -10 a aproximadamente día 36). Se monit hinchamiento de la pata a través de todo el experimento c indicador de la gravedad de la enfermedad. La histología se cabo sobre las patas al final del experimento si se observa del hinchamiento. El consumo de células-B en el bazo, en la y en los nodos linfáticos, se puede evaluar mediante aisl celular y análisis FACS. Se lleva a cabo el ELISA p anticuerpos anti-colágeno, con el fin de investigar si tam suprime la titulación de anticuerpos. Se presume que los anti tienen una buena eficacia en el modelo animal de CIA si exhib reducción estadísticamente significativa en el hinchamiento, se ha aplicado una prueba de múltiples comparaciones de D (ANOVA DE UNA VÍA). Usualmente, esto se traduce has reducción del 50 por ciento en el hinchamiento de la pata a del curso del tiempo, con una baja variación entre los a dentro de cada grupo.

Tabla 1 Correspondencia de mAb# y SEQ IDs mAb# HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LC MOR06743 N0:2 N0:9 N0:16 NO:23 NO:30 NO OR06654 N0:3 NO:10 N0:17 NO:24 N0:31 NO OR07342 N0:4 N0:11 N0:18 NO:25 NO:32 NO OR07347 N0:5 N0:12 N0:19 NO:26 NO:33 NO MOR07348 N0:6 NO:13 NO:20 NO:27 NO:34 NO OR07349 N0:7 NO:14 N0:21 NO:28 NO:35 NO Tabla 2 de los anticuerpos Fab sobre las células Raji y las H hBAFFR transfectadas Debido a que la glutamina que se encuentra en MOR07 formato de Fab humano se determinan en un ensayo de inhibi enlace de BAFFR-BLyS, mediante titulación de Fab sobre Raji (FACS). Los resultados de estos análisis se enlista Tabla 3.

Tabla 3 Valores IC50 para la inhibición del enlace de BAFFR-BLyS formato de Fab humano sobre células Raji MORO IC50 [nM] 6654 0.09 / 0.37 / 0.30 / 0.16 6743 0.13 / 0.17 7342 0.09 7347 0.02 7348 0.20 interacción entre el dominio extracelular de BAFFR (prote fusión de BAFFR:Fc) y el BLyS soluble humano. Tamb determinan los valores IC50 en un ELISA competitivo sími donde se titulan los anticuerpos de la invención para inhibir el de un péptido derivado de BAFFR (miniBR3) al ensayo de soluble humano.

Los resultados de estos análisis se enlistan en la Tabla Tabla 4 Valores IC5o para la inhibición del enlace de BAFFR-BLyS formato de lgG2 humana IC50 del ELISA de IC50 de ELISA de MORO competencia de competencia del pépt BLyS/B AFFR: Fe [n ] de BLyS/BAFFR [n Hu Fab Hu lgG2 Hu lgG2 Análisis de reactividad cruzada con BCMA y TACI.

BCMA y TACI son proteínas que están relacionad BAFFR, y también pueden enlazarse al ligando BLyS. Los F prueban para determinar la reactividad cruzada indeseada co dos proteínas. La reactividad cruzada de los enlazantes para se prueba en la proteína recombinante en un ELISA, y en el a de superficie celular en el análisis FACS.

En el ELISA, los Fabs se titulan desde 400 nM bajand 0.005 nM sobre BAFFR:Fc capturado en una placa Maxis medio de un anticuerpo de Fe anti-humano. Solamente MORO MOR07346 muestran alguna reactividad cruzada con BCMA e concentraciones de Fab >100 nM. En contraste, MOR MOR07347, MOR07348, MOR07349 no muestran enlace algu BCMA arriba del fondo. Todos los Fabs satisfacen un fa discriminación de 1,000 veces.

En el FACS, se analizan los siguientes Fabs sobre HEK293 transfectadas con BCMA, y se titulan desde 1 µ?? MOR07349 no se enlazan al BCMA hasta una concentración de 1 µ?.

Potencia de los anticuerpos de la invención en ensa células-B funcionales.

Potencia y agonismo de los anticuerpos en el ensa proliferación de células-B co-estimulante mediada por BLy Las células-B derivadas de sangre humana prima estimulan con anticuerpos anti-lgM y con BLyS soluble human inducir la proliferación de las células-B. Los anticuerpos invención se titulan para bloquear el efecto co-estimulante d Con el objeto de medir los efectos agonistas (es decir, de tip de los anticuerpos, las células-B se estimulan con los antic anti-lgM solos. Los anticuerpos de BAFFR se titulan para me mejora potencial de la proliferación de las células-B. Los res de estos análisis se muestran en la Tabla 5 para diferentes fo de anticuerpos de BAFFR (Fab, lgG2, e IgG 1 humanos).

Tabla 5 Formato MORO Proliferación de células-B IC50 de EC50 de agonis inhibición [nM] [nM] Fab 6743 2 >187 Fab 7342 0.9 >187 Fab 7347 1.3 >187 Fab 7348 2.9 >187 Fab 7349 3.5 >187 lgG2 6654 0.084 >187 lgG2 6743 0.032 >187 lgG2 7342 0.041 >187 igG2 7347 0.043 >187 Formato MORO Proliferación de células-B IC50 de EC50 de agonis inhibición [nM] [nM] igGi 7349 0.079 >187 Potencia y agonismo de los anticuerpos en el ens producción de lgG1 de células-B co-estimulante media BLyS.

Las células-B derivadas de sangre humana prima estimulan con IL-21 y con BLyS soluble humano para ind producción de lgG1. Los anticuerpos de la invención se titul bloquear el efecto co-estimulante de BLyS. Con el objeto d los efectos agonistas (es decir, de tipo BLyS) de los anticuer células-B se estimulan con la IL-21 sola. Los anticuerpos anti-se titulan para medir una mejora potencial de la secreción d Formato MORO Producción de lgG1 de células-B IC50 de EC50 de inhibición [nM] agonismo [nM] igG2 6743 0.018 >62.5 lgG2 7342 0.023 >62.5 igG2 7347 0.024 >62.5 igG2 7348 0.088 >62.5 igG2 7349 0.039 >62.5 Potencia de ios anticuerpos para provocar la aniquilación células-B en el ensayo de ADCC.

Se ermite ue los anticuer os anti-BAFFFt n n r Tabla 7 EC50 que muestra la actividad de aniquilación de células-B anticuerpos de la invención en un formato de lgG1 e lg Ejemplo 2: Eficacia in vivo en un modelo CIA de ratón.

Los ratones se trataron con 200 microgramos/ani anticuerpo anti-BAFFR (conjugado con lgG2a de murino), o anticuerpo de control de isotipo, 9, 6, y 2 días antes significativa el hinchamiento, comparándose con su anticuerp CSA de control.

Ejemplo 3: Consumo de células-B periféricas en el cinomolgo.

Los monos cinomolgos se trataron con dosis cada semanas de 20 miligramos/kilogramo intravenosament anticuerpo monoclonal anti-BAFFR humano, MOR06654 (lgG1 determinaron los números de células-B en sangre en dif puntos del tiempo antes de la dosis y después de la dosis m análisis FACS. Dicho de una manera breve, las muestras de se incubaron con el anticuerpo anti-CD20 marcado con flúore (CD20-PE anti-humano, clon 2H7, BD, Cat. #555623), o anticuerpo anti-CD40 (CD40-APC anti-humano, clon 5C3 B #555591) en tubos True Count (BD, Cat. #340334). Los result muestran en la Figura 2.

Las células-B se consumieron rápidamente en los tratados, bajando hasta una media del 33 por ciento del núm reversible, y permite el restablecimiento de la omeostasia de c B normal después de la eliminación del anticuerpo de la circul Ejemplo 4: Consumo de células-B más fuerte y más sos con anticuerpos no fucosilados.

En un segundo experimento, los monos cinomolgos se t con una sola dosis de MOR06654 (IgGt), o con la varia fucosilada MOR06654B. MOR06654B se produjo utilizando las celulares PotelligentMR (Biowa, Inc.)- Estas líneas celular líneas celulares de mamífero de CHO, con eliminación genét gen que codifica la fucosil-transferasa. Los antic (MOR06654B) producidos en estas líneas celulares no fucosilados- Esta vez, la única dosis fue solamente m i crog ramos/kilogramo intravenosamente.

Como se muestra en la Figura 3, se observó una re marginal pero observable de las células-B mediante el trat con 20 microgramos/kilogramo intravenosamente de MOR0665 día 7 (reducción media del 22 por ciento, n = 3). La disminución para determinar si un anticuerpo u otro agente de enlace b cruzadamente o es capaz de bloquear cruzadamente los antic de acuerdo con la invención. Se apreciará que el ensayo se utilizar con cualquiera de los agentes de enlace de BAFFR d en la presente.

La máquina Biacore (por ejemplo, la BIAcore 3000) se o línea con las recomendaciones del fabricante.

El BAFFR se puede acoplar, por ejemplo, con un chip CM5, por medio de la química de acoplamiento de rutinariamente utilizada, por ejemplo, acoplamiento de amin NHS, para crear una superficie recubierta con BAFFR. Con el de obtener niveles mensurables de enlace, típicamente se acoplar de 200 a 800 unidades de resonancia de BAFFR al chi cantidad da niveles mensurables de enlace, y al mismo tie fácilmente saturable mediante las concentraciones del reac prueba que se está utilizando).

Una manera alternativa de unir el BAFFR al chip Biac a 1 , de los sitios de enlace, en un regulador adecuado para c mezcla de prueba. El regulador utilizado es típicamente un re que se utilice normalmente en la química de proteínas, tal co ejemplo, suero regulado con fosfato (NaCI 136 mM, KCI 2. Na2HP04 10 mM, KH2P04 1.76 mM, pH de 7.4). Cuando se c las concentraciones sobre una base del sitio de enlace, se que el peso molecular de un anticuerpo es el peso molecular t anticuerpo dividido entre el número de los sitios de enlace o (es decir, BAFFR) sobre ese anticuerpo.

La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de debe ser suficientemente alta para asegurar la saturación sitios de enlace para ese anticuerpo sobre las moléculas de que se enlacen sobre el chip Biacore. Los anticuerpos en la están a la misma concentración molar (sobre una base de enl esa concentración sería típicamente de entre 1.0 m y 1 (sobre una base del sitio de enlace).

También se preparan soluciones separadas que contie aproximadamente 1 minuto. Es importante que no se dañ moléculas de BAFFR que estén enlazadas al chip.

La solución del primer anticuerpo solo se pasa entonce la superficie recubierta por BAFFR, y se registra el Posteriormente, el chip se trata para remover todo el anti enlazado sin dañar el BAFFR enlazado al chip, por ejemp medio del tratamiento con ácido anteriormente mencionado.

La solución del segundo anticuerpo solo se pasa en sobre la superficie recubierta con BAFFR, y se registra la c de enlace.

El máximo enlace teórico se puede definir como la su enlace a BAFFR de cada anticuerpo por separado. Entonces compara con el enlace real de la mezcla de anticuerpos medid enlace real es más bajo que aquél del enlace teórico, l anticuerpos están bloqueándose cruzadamente uno al otro.

Ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA.

También se puede detectar el bloqueo cruzado El anticuerpo que se recubre sobre los pozos, y el anti en solución, competirán por el enlace del número 1 i m ita moléculas de BAFFR. Luego la placa se lava para rem BAFFR-Fc que no se haya enlazado al anticuerpo recubi también para remover el segundo anticuerpo en fase de soluci como cualesquiera complejos formados entre el segundo anti en fase de solución y el BAFFR-Fc. Luego se mide la canti BAFFR enlazado utilizando un reactivo de detección de apropiado. Un anticuerpo en solución que sea capaz de bl cruzadamente el anticuerpo recubierto, será capaz de provoc disminución en el número de moléculas de BAFFR con las pueda enlazar el anticuerpo recubierto en relación con el núm moléculas de BAFFR con las que se pueda enlazar el anti recubierto en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solu Este ensayo se describe con mayor detalle adicionalmen adelante para dos anticuerpos denominados como Ab-X y Ab-Y caso en donde se selecciona Ab-X para ser el anti ELISA. Entonces se agrega el BAFFR-Fc, de tal manera q moles de BAFFR-Fc agregados por pozo son cuando menos 2 más bajos que los moles de sitios de enlace de BAFFR de Ab se utilizaron para el recubrimiento de cada pozo. En seguida período de incubación adecuado, la placa ELISA se lava, y se un reactivo de detección de BAFFR para medir la cantidad de específicamente enlazado con el anticuerpo anti-BAFFR rec (en este caso, Ab-X). La señal del fondo para el ensayo se como la señal obtenida en los pozos con el anticuerpo recubie este caso, Ab-X)p el segundo anticuerpo en fase de solución ( caso, Ab-Y), el regulador de BAFFR solamente (es decir, n BAFFR), y los reactivos de detección de BAFFR. La señal de positivo para el ensayo se define como la señal obtenida pozos con el anticuerpo recubierto (en este caso, Ab-X), el re del segundo anticuerpo en fase de solución solamente (es ningún segundo anticuerpo en fase de solución), BAFFR, reactivos de detección de BAFFR. El ensayo ELISA n anticuerpo que se recubre sobre la placa ELISA, y Ab-Y anticuerpo competidor que está en solución, y 2) el formato donde Ab-Y es el anticuerpo que se recubre sobre la placa E Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado o una proteína funcion comprende una porción de enlace de antígeno de un anticuer un polipéptido de BAFFR objetivo (SEQ ID NO: 87), caract porque el anticuerpo o la proteína funcional se enlaza al poli de BAFFR con una KD de 100 nM o menos, e inhibe la prolif de células-B humanas inducida por BLyS con una IC50 de air de 10 nM o menos, y consume las células-B in vivo o in vitro. 2. El anticuerpo aislado o la proteína funcional reivindicación 1t en donde este anticuerpo o proteína fu consume las células-B in vitro con una IC50 de 10 nM o meno nM o menos, o de 100 pM o menos, como se mide en un ens ADCC de consumo de células-B humanas. 3. El anticuerpo o proteína funcional de cualquiera reivindicaciones 1 y 2, en donde este anticuerpo o proteína fu es capaz de reducir in vivo el porcentaje de células-B hasta el reivindicaciones 1 a 4, el cual es un anticuerpo de completamente humano o humanizado. 6. El anticuerpo de la reivindicación 5, el cual com una región de aminoácidos Fe mutada o químicamente modi en donde esta región de Fe mutada o químicamente mod proporciona una mayor actividad de ADCC, al compararse región de Fe de tipo silvestre. 7. El anticuerpo de la reivindicación 5 ó 6, el c produce mediante la expresión recombinante en una línea que carece de fucosil-transferasa, por ejemplo, una línea cel mamífero con una expresión deficiente del gen FUT8 que cod fucosil-transferasa, aumentando de esta manera la activi ADCC de los anticuerpos producidos en la misma, comparándo la línea celular que expresa el gen FUT8 de tipo silvestre. 8. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se enlaza región del BAFFR entre los aminoácidos 17 y 43, tal co reivindicaciones 1 a 9, que comprende la secuencia de poli VH que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 70, el 80, el 90, el 95, o el 100 por ciento con cuando menos las SEQ ID NOs: 50-56. 11. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que compre secuencia de polipéptido VL que tiene una identidad de secue cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 100 por cie cuando menos una de las SEQ ID NOs: 43-49. 12. El anticuerpo o la proteína funcional de acuerdo reivindicaciones 1 a 11, que comprende una secuen aminoácidos de cadena pesada de longitud completa que tie identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, e 95, o el 100 por ciento con cuando menos una de las SEQ I 75-78. 13. Un anticuerpo que comprende cualquiera de: (a) la secuencia de cadena pesada de la SEQ cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que compren secuencias VH y VL que tienen una identidad de secuencia de menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 100 por ciento secuencias VH y VL correspondientes de cuando menos un ant de la reivindicación 13. 15. El anticuerpo o la proteína funcional de acuerdo reivindicación 14, que comprende: una CDR1 de la región vari cadena pesada que comprende una secuencia de amin seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N una CDR2 de la región variable de cadena pesada que com una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del gru consiste en las SEQ ID NOs: 8-14; una CDR3 de la región v de cadena pesada que comprende una secuencia de amin seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID N 21; una CDR1 de la región variable de cadena ligera que com una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del gru consiste en las SÉQ ID NOs: 22-28; una CDR2 de la región v anticuerpo de la reivindicación 13. 17. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el cual b cruzadamente o es bloqueado cruzadamente por cuando me anticuerpo de la reivindicación 13, para evitar su enlace con B 18. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para utilizarse c medicamento. 19. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para el tratamiento trastorno patológico que sea mediado por el receptor de BAFF pueda ser tratado mediante la aniquilación o el consumo células-B. 20. El anticuerpo o la proteína funcional de acuer cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para el tratamie enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide eritematoso sistémico. farmacéuticamente aceptable. 24. La composición farmacéutica de la rei indicación 2 la cual comprende adicionalmente otros ingredientes activos. 25. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuer proteína funcional de acuerdo con cualquiera de las reivindic 1 a 21. 26. Un vector de clonación o de expresión que com uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 2 27. Un vector de clonación o expresión de acuerdo reivindicación 26, el cual comprende cuando menos un nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste en las NOs: 79-86, o un fragmento que codifique cuando menos una CDR. 28. Una célula huésped, la cual comprende uno vectores de clonación o expresión de acuerdo co reivindicaciones 26 y 27. 29. Un proceso para la producción de un anticuerpo o expresión de un gen que codifica la fucosil-transfera preferencia una línea celular de CHO deficiente para el gen FU