TWI487537B

TWI487537B - 對抗腸病毒７１型之單株抗體及其用途

Info

Publication number: TWI487537B
Application number: TW100119393A
Authority: TW
Inventors: Hsuen Wen Chang; Charles Dwo-Yuan Sia; Pele Choi-Sing Chong; Chia Chyi Liu
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2010-06-09
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2015-06-11
Also published as: CN102702348A; CN102702348B; TW201143795A

Description

對抗腸病毒71型之單株抗體及其用途

本發明係關於免疫學之領域，且特別是關於與腸病毒71型結合及/或中和之單株抗體。

腸病毒71型為一種歸類於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)之正股RNA病毒。自從在1969年於美國加州出現第一件EV71型感染案例以來，全球各地定期會出現該病毒感染人類的案例。受到腸病毒71型(與其某些遺傳上相近的對應體，如柯沙奇病毒16(CA16)及CA10)感染，已知會造成輕微發疹症狀，在嬰兒及孩童身上可能顯示為口足手病(HFMD)/皰疹性咽峽炎。在過去10-12年中，亞洲-太平洋地區定期爆發腸病毒71型感染大流行，已經造成會導致許多受感染兒童死亡之肺水腫/出血症狀。於腸病毒71型基因群中，基因群B與C之病毒已經於1986年到2008年之間發生在台灣的大流行中被分離出來。1999年到2002年間的流行活動，主要是與基因群B病毒有關。在2006及2007年，鑑定出一種具有基因型B5之腸病毒71型，而且再度出現於2008年的台灣大流行中。

不斷竄出的腸病毒71型感染，已經被當做一種對全球公眾健康造成威脅的問題來討論。在過去，尚未有對治療腸病毒71型感染有效的抗病毒藥，及用來防治病毒大流行之有效預防性疫苗，而且預期在近期的未來仍無可利用者。對於過去10年來發生在中國的腸病毒71型大流行，已利用複合型人類迦瑪球蛋白，來治療罹患與腸病毒71型感染相關的腦炎患者。但是，該項試驗並未達到令人滿意的結果。另有將腸病毒71型暴露於VP1衣殼蛋白表面之免疫優勢抗原決定基SP70與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)共軛，產生能中和基因型C之腸病毒71型分離株(其已在中國巡迴流行)的鼠類單株抗體。

對於用來遞送至免疫系統之適當免疫調配物的選擇，可能會決定性影響所產生抗體之專一性。目前尚無可利用之單株抗體，能專一對抗近幾年已在台灣巡迴流行的腸病毒71型基因型B病毒株。

於一方面，本發明係關於一種單株抗體或其結合片段，其係專一地與SEQ ID NO: 55之多肽結合。

於另一方面，本發明係關於一種與腸病毒(EV)71型結合之單株抗體或其結合片段，其包含：a)具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的重鏈互補決定區域1(CDR1)多肽，與具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的重鏈互補決定區域2(CDR2)多肽；及b)具有SEQ ID NO: 72或73之胺基酸序列的輕鏈CDR1多肽，具有SEQ ID NO: 74或75之胺基酸序列的輕鏈CDR2多肽，與具有SEQ ID NO: 76或77之胺基酸序列的輕鏈CDR3多肽。

於另一方面，本發明係關於一種單離核酸，其包含編碼一包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的重鏈多肽之核苷酸序列。

於另一方面，本發明係關於一種單離核酸，其包含一編碼包含選自SEQ ID NO: 78、79、80及81之胺基酸序列的輕鏈多肽之核苷酸序列。

於另一方面，本發明係關於一種宿主細胞，其包含如前所述之單離核酸。

於另一方面，本發明係關於一種用於中和或保護對抗具有基因型B之腸病毒71型感染的組成物，其包含一或多種如前所述之單株抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。

於另一方面，本發明係關於一種組成物，其包含一種如前所述之單株抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。

再於另一方面，本發明係關於一種活體外偵測腸病毒71型是否存在一生物樣本中之方法，其包含：a)將該樣本與前述之組成物接觸；及b)分析該抗體之結合以測定腸病毒71型的存在。

又於另一方面，本發明係關於一種與腸病毒71型結合之單株抗體或其結合片段，其包含：a)包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的重鏈多肽；及b)包含選自SEQ ID NO: 78、79、80及81之胺基酸序列的輕鏈多肽。

本發明之此等及其他方面，將自下列較佳實施例之敘述，並結合所列圖式而彰顯出來，然而在不偏離本發明新穎創作概念之精神與範圍下，可進行各種變異及修改。

附隨的圖式係為例舉說明本發明之一或多種實施態樣，且與本說明書所載之實施方式一起用於闡釋本發明之原理。各圖式中所使用具有相同號數之符號元件，在各實施態樣中皆代表相同或相似的意義。

本說明書中所使用之術語通常在發明所屬技術領域中、本發明內文中及個別術語被使用之特定內文中具有其一般意義。以下(或說明書的其他地方)論述某些用於描述本發明之術語，以提供實施該策略者有關本發明內容額外的指引。為了方便起見，一些特殊術語將會使用斜體字與/或引號強調出來，但使用強調的標示並不會影響某一術語本身的範圍與意義；某一術語在同一內文中不論其是否被標示，其範圍與意義是相同的；同樣的事情有一個以上的說法是可理解的。因此，本文中所論述之一或多個術語可使用替代性的語言及同義詞，其是否在本文中被詳細描述或討論並不特別重要。一些特殊術語的同義詞一或多個同義詞之引用並不排除可使用其他同義詞。在本發明所使用之包括了任一本文中所論述之術語的實施例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明或任何所例舉術語之範圍與定義。同樣，本發明不受限於各種在本說明書中所載之實施態樣。

除非另有規定，本文中所使用的技術和科學術語，具有和發明所屬技術領域中具有通常知識者，所共通了解之相同的意義。若是在有所衝突的情況下，將在本文件(包括定義)提出管制。

本文中所使用的“約”、“大約”或“大概”應廣義地意指，在所給予數值或範圍之20%以內，較佳地10%以內，且更佳地5%以內。本文中所給予之數量為近似值，表示在無明確指示下，可引用術語“約”、“大約”或“大概”。

本發明所使用之“製備”一般應意指某物被製備、製造，及某一物質經過特殊製備。

本文中所使用的術語“抗體”意指一種免疫球蛋白分子，或具有可與特定抗原專一性結合之能力的免疫球蛋白分子片段。抗體為免疫學之領域中具有通常知識者所熟知的。本文中所使用的術語“抗體”不僅指全長抗體分子，亦包括保有抗原結合能力之抗體分子片段。此類片段亦為該項技藝所熟知，常用於活體外和活體內。尤其，本文中所使用的術語“抗體”不僅指全長之免疫球蛋白分子，亦包括具抗原結合活性的片段，例如已熟知的活性片段F(ab')₂ 、Fab、Fv及Fd。

一抗體之可變區域係稱作F_V 區，且其為與抗原結合的最重要區域。

Ig單體為一種"Y"-字型分子，其係由四條多肽鏈所組成；兩條相同的重鏈與兩條相同的輕鏈，彼此間以雙硫鍵相連結。Y-字型的臂部(例如)含有和抗原結合的位置，而因此能辨識特別的外來物。抗體的這個區域稱為Fab(片段，抗原結合)區域。其係由來自抗體之每一重鏈與輕鏈的，一個恆定區與一個可變區所組成。

本發明係關於四種腸病毒EV 71型-專一性中和抗體，命名為N1、N3、N4及N6。該等抗體係使用原始融合瘤技術分離得，包括將經過活的EV71/E59單離株免疫之BALB/c(H-2^d )小鼠脾臟與NS-1骨髓瘤細胞進行融合。中和抗體可用於製備用來治療感染之醫藥組成物，特別是用於阻斷病毒散播。

於該項技藝已知可將一哺乳動物抗體之非-CDR區域置換以同種動物或異種動物抗體的類似區域，而仍保持原始抗體之抗原決定基的專一性。此在研發及使用“人源化”抗體時最容易表示，其中係將非人類CDRs與人類FR及/或Fc/pFc'區域進行共價接合，而產生具有功能性之抗體。因此，例如，PCT國際公開案號WO 92/04381教示關於人源化鼠類RSV抗體之製造及使用，其中已將至少一部分鼠類FR區域，置換以人類來源的FR區域。此類抗體(包括具有抗原結合能力之全長抗體片段)，通常稱之為“嵌合型”抗體。可製造出此類其中抗-EV 71抗體之某些或全部FR區域，已經被置換成其他同源性人類FR區域的嵌合型抗體。

非人類(例如鼠類)抗體之人源化型式為嵌合型免疫球蛋白，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的免疫球蛋白鏈或片段(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂ 或抗體之其他抗原結合性次序列)。人源化抗體包括人類免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受體互補決定區域(CDR)之殘基，被置換以來自例如小鼠、大鼠或兔子等非人類物種(供者抗體)之CDR的殘基，其具有所希望之專一性、親和性及能力。於某些案例，係將人類免疫球蛋白之Fv骨架殘基置換以相對應的非人類殘基。人源化抗體亦可包含未出現在受者抗體中，或未存在於所引進之或骨架序列中的殘基。一般，人源化抗體會包含實質上全部至少一種(代表性地兩種)可變區域，其中全部或實質上全部CDR區域，係相當於非人類免疫球蛋白之CDR區域，且全部或實質上全部FR區域，為人類免疫球蛋白共有序列的FR區域。人源化抗體最佳亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，代表性的係來自人類免疫球蛋白[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596(1992)]。

將非人類抗體人源化的方法，為該項技藝所熟知。一般，人源化抗體具有一或多個從非人類來源導入的胺基酸殘基，此等非人類胺基酸殘基通常稱為“引進”殘基，代表性地取自一“引進”可變區域。人源化作用基本上可依照Winter與同僚所述之方法[Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-329(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988)]，藉由將嚙齒類CDRs或CDR序列取代人類抗體的對應序列。於是，此類“人源化”抗體為嵌合型抗體(U.S. Pat. No. 4,816,567)，其中已將實質上少於一個完整的人類可變區域，由來自非人類物種之相對應序列取代。實際應用上，人源化抗體代表性地為其中某些CDR殘基，及可能一些FR殘基被來自嚙齒類抗體中類似位置的殘基取代。

亦可使用各種該項技藝已知的技術，包括噬菌體展示抗體庫(phage display libraries)來製造人類抗體。Cole等人及Boerner等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人，單株抗體與癌症療法,Alan R. Liss,p. 77(1985)；及Boerner等人,J. Immunol.,147(1):86-95(1991))。同樣，可藉由將人類免疫球蛋白基因座導入基因轉殖動物，例如其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全被去活之小鼠中。於攻毒期間，觀察到有人類抗體製造，其非常類似於在人類各方面所觀察到的，包括基因重排、組裝及抗體譜(antibody repertoire)。此製程經描述於(例如)美國專利案5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016號。此類完全人類或人源化單株抗體，特別可用於不希望會引起對抗該抗體本身的免疫反應者。參見美國專利案7,622,113號，其完整以引用方式併入本文。

抗體可進行標定及固定於固態撐體上。語詞“標記”用於本文係指直接或間接與抗體接合，以致產生“被標定”抗體之可偵測化合物或組成物。標記本身為可偵測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)，或是酵素標記的情況，可催化進行受質化合物或組成物之化學變化使其為可偵測的。

為引發產生能夠交叉中和近幾年來在台灣巡迴流行之腸病毒71型基因型B病毒的單株抗體，將小鼠接種活的台灣單離株(具有基因型B4之EV71/59)，而令動物能引發對抗較廣範圍存在天然病毒抗原內之抗原決定基的B淋巴細胞。然後，可經由選殖方法來分離出，製造具有所希望特性之抗體的融合瘤。本發明描述由四種融合瘤純系所製造之單株抗體的特徵。

使用於細胞生產，並經過蔗糖梯度離心純化之，活的具有基因型B4之腸病毒71型(命名為EV71/E59)，為用來產生EV71-專一性單株抗體的免疫原。篩選出四種從經過EV71/E59-預先致免之BALB/c(H-2d)小鼠脾臟，與呈現穩定生長之NS-1骨髓瘤細胞進行融合所衍生得的融合瘤純系，用於進一步特徵分析。基於觀察到彼等於其κ輕鏈基因表現不同的互補決定區域(CDRs)，證明所產生之融合瘤確實是獨立的純系。由各別純系製造之經純化腹水，在西方轉漬分析中針對病毒衣殼蛋白(VP1)反應，且辨識位於C-端之共通抗原決定基的不同位置。每一單株抗體皆呈現有效對抗致免病毒株，及其他兩株分別屬次基因群B4與B5，命名為N0781-TW-01與N2838(常出現在台灣近幾次大流行)的中和活性。亦觀察到在中和EV71/E59病毒時，單株抗體會相互合作行動。

於本發明之一項具體實施例，該單株抗體為人源化抗體。

於本發明之另一項具體實施例，該單株抗體為抗體片段。

於另一方面，本發明係關於一種與腸病毒(EV) 71型結合之單株抗體或其結合片段，其包含：a)具有SEQ ID NO: 70之胺基酸序列的重鏈互補決定區域1(CDR1)多肽，與具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的重鏈互補決定區域2(CDR2)多肽；及b)具有SEQ ID NO: 72或73之胺基酸序列的輕鏈CDR1多肽，具有SEQ ID NO: 74或75之胺基酸序列的輕鏈CDR2多肽，與具有SEQ ID NO: 76或77之胺基酸序列的輕鏈CDR3多肽。

於本發明之一項具體實施例，該結合片段包含一Fv片段。

於本發明之另一項具體實施例，該結合片段包含一Fab片段。

於本發明之另一項具體實施例，該抗體為完全人類單株抗體。

於本發明之另一項具體實施例，該抗體為人源化單株抗體。

於本發明之另一項具體實施例，該抗體或結合片段係中和具有基因型B之腸病毒71型。

於本發明之另一項具體實施例，該抗體或結合片段包含具有SEQ ID NO: 82之胺基酸序列的重鏈多肽。

於本發明之另一項具體實施例，該抗體或結合片段包含具有選自SEQ ID NO: 78、79、80及81之胺基酸序列的輕鏈多肽。

於本發明之另一項具體實施例，該如前所述之單株抗體或其結合片段係經標定。

於本發明之另一項具體實施例，該如前所述之單株抗體或其結合片段係與腸病毒衣殼蛋白VP1結合。

於另一方面，本發明係關於一種用於中和或保護對抗基因型B之腸病毒71型感染的組成物，其包含一或多種如前所述之單株抗體或其結合片段；及一種醫藥上可接受的載體。

實施例

無意限制本發明的範圍，以下提供根據本發明之各種實施例所例舉的儀器、裝置、方法和其相關結果。應注意，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。此外，在本說明書中也提出並披露某些理論；然而，無論彼等是對的還是錯的，只要該發明是根據本發明所實施的，都應被限制在本發明的範圍之內，而不需考慮任何特定的理論或實施方案。

材料與方法 小鼠及免疫

將購自國家實驗動物中心(台灣)，並維持於由本中心動物照護及使用委員會檢定合格之動物養護設備，的六至七週齡雌性Balb/c(H-2d)小鼠各別進行免疫接種三次，每次經由腹膜內途徑免疫10⁶ 溶菌斑形成單位(PFUs)之，經過蔗糖梯度純化的EV71/E59病毒。於最後一次追加免疫10天後對動物抽血，並使用經熱去活之EV71/E59(HI-EV71/E59)病毒塗布的直接酵素聯結免疫吸附分析(ELISA)，來測定血清抗體。將已呈現最強對抗該病毒之抗體反應的小鼠，以相同劑量之活病毒施予最後一次追加免疫，經過7天之後，將其脾臟取出用於進行融合。

病毒之生產、純化及特徵分析

將得自美國菌種保藏中心(ATCC,Rockville,MD,USA)生長於VP-SFM無血清培養基(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。EV71/E59單離株係得自台灣疾病管制中心(CDC)。具基因型B4之N0781-TW-01及具基因型B5之N2838-TW-03係由Jen-Ren Wang教授(國立成功大學醫技系，台南，台灣)提供。藉由將各種病毒以10-5之感染複數(MOI)接種入，培養於850 cm² 旋轉培養瓶(Corning,NY,USA)之1.5-2.0×10⁸ VERO細胞培養物中，完成病毒之大量製造。將培養瓶固定於旋轉架(Wheaton,Millville,NJ,USA)上，置於37℃培養室中設定轉速為0.33 rpm以促進病毒生長。於5天後收取培養物上清液，通過0.65 μm濾膜(Sartorius,Hayward,CA,USA)過濾以去除細胞碎片，最後藉由將其通過Minimate 100K切向應力流動過濾(TFF)套管(Pall生命科學,Ann Arbor,MI,USA)，而濃縮至大約50.0 mL。將濃縮樣本置於10-50%連續蔗糖梯度(Merck,West Point,PA,USA)上，並於32,000rpm下離心3小時。將位於35-37%梯度之條帶部分收集，並對1.0 L 1×PBS,pH 7.2(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)交換三次進行透析。使用免疫溶菌斑形成分析，測定所純化得之病毒製備物的力價。

產生 EV71/E59-專一性單株抗體

將1.0×10⁷ 個從所選擇實驗小鼠取得之不含紅血球的脾臟細胞，與2×10⁷ NS-1細胞(ATCC,Rockville,MD,USA)，根據先前技藝所述已建立的方法(Kohler與Milstein(1975)“融合細胞之連續培養物分泌具有預定專一性的抗體”Nature 256,495-497)，使用購自Sigma/Aldrich(St Louis,MO,USA)之Hybri Max[p7306,PEG 3000-3700 Da溶於二甲亞碸(DMSO)]進行融合。從在HT(次黃嘌呤與胸苷)培養基(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)中生長良好之融合瘤收集培養物上清液。以每孔含0.3個細胞，於培養基[CM：補充以10.0%胎牛血清(Biological Industries,Kibbutz Beit Haemek,Israel)與青黴素/鏈黴素混合物(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之Dubecco’s修改的Eagle’s培養基(DMEM)(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)]中，在有5.0×10⁵ 個經照射(2000 rads)之BALB/c(H-2d)脾臟細胞(做為餵養細胞)存在下，進行可產生能中和致免病毒之EV71/E59-專一性抗體的融合瘤純系。將有生長之融合瘤增生，並經特徵分析確定其純系性(clonality)，及所產生之單株抗體的特性。

腹水之製造與純化

將藉由5×10⁵ 個注射入個別>6-月齡，經降植烷處理之BALB/c小鼠中的，各別融合瘤純系所產生之腹水液體，與0.04 mL之10%硫酸葡萄聚糖溶液(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)及1.0mL之1.0 M氯化鈣(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)，以1:0.04:1(v/v)之比例混合而使其去脂質。經過5分鐘後，將混合物於10,000×g下離心10分鐘(離心機型號：Legend Micro 17R,Sorvall Thermo Scientific)。收集上清液部分，並於1.0 L溶於dH₂ O之1×Tris緩衝食鹽水(TBS),pH 7.2(137mM NaCl與10mM Tris,Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)中進行透析過夜，之後將其加載至使用AKTA起動泵(GE Healthcare,鹽湖城,USA)之蛋白質G管柱上。將與蛋白質G結合之抗體，以10.0mM甘胺酸－HCl(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA),pH 3.0緩衝液溶析出。將溶析液以每1.0 mL流份收集，並立即對1.0 L之1×PBS. pH 7.2(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行透析。

分析EV71/E59-專一性單株抗體之V _H 與 V _L 區域

將使用購自Qiagen(Valencia,CA,USA)之RNeasy套組，從各融合瘤純系萃取得的RNA，以Transcriptor High Fidelity cDNA合成套組(Roche,IN,USA)中所提供的試劑進行反轉錄作用。將由各別融合瘤表現之κ鏈互補決定區域(CDR)，使用前向引子5’-GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3’(SEQ ID NO: 1)與簡併性反向引子5’-GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT-3’(SEQ ID NO: 2)，以下列循環程式：94℃下1分鐘，94℃下1.5分鐘，50℃下2.0分鐘，72℃下3.0分鐘，72℃下1.0分鐘，進行40次循環之聚合酶鏈反應(PCR)完成擴增。將得到的PCR產物以BciVI限制酶(Fermentas,St Leon Rot,德國)處理，將衍生自NSI融合夥伴之變異的κ鏈DNA進行切割。將經過切割之PCR產物於2.0%瓊脂糖凝膠(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)上進行電泳，使DNA片段分離。使用凝膠片段萃取套組(Geneaid,汐止市，台灣)，將位於大約360 bp之條帶萃取出，並寄送到Mission Bioteck(台灣，南港，台北，台灣)進行定序。

V_H 之CDRs(重鏈的高可變區)鏈係使用含有9種簡併性正向引子，與單一種反向引子(5’-AGG GGC CAG TGG ATA GAC-3’;SEQ ID NO: 3)進行擴增。該等正向引子為：OVH1(5’-SAG GTC CAG CTG CAG CAG YYT GG-3’;SEQ ID NO: 4)、OVH2(5’-CAG GTR CAG CTG AAG SAG TCA GG-3’;SEQ ID NO: 5)、OVH3(5’-GAK GTG CAG CTT CAG CAG TCR GG-3’;SEQ ID NO: 6)、OVH5-1(5’-GAV GTG AWG CTG GTG GAG TCT GA-3’;SEQ ID NO: 7)、OVH5-2(5’-GAV GTG AWG CTG GTG GAG TCT GG-3’;SEQ ID NO: 8)、OVH11(5’-GAA GTG CAG CTG TTG GAG ACT GG-3’;SEQ ID NO: 9)、OVH14-1(5’-GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GG-3’;SEQ ID NO: 10)、OVH14-2(5’-GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GT-3’;SEQ ID NO: 11)及OVH15(5’-CAG GTT CAC CTA CAA CAG TCT GG-3’;SEQ ID NO: 12)。用於產生具有大約300 bp之DNA片段的PCR程式設定如下：92℃下3分鐘，92℃下1分鐘，68℃下30秒，72℃下1分鐘，72℃下10分鐘，進行25次循環。從2.0%瓊脂糖凝膠萃取出所預期的PCR產物，並加以處理定序。

SDS-PAGE與西方轉漬分析

將20微升經由BCA蛋白質分析(Pierce,Rockford,IL,USA)測定，含有0.12 μg總體蛋白質之經過蔗糖梯度純化、熱去活化(於85℃熱水中10分鐘)的EV71/E59病毒，與5.0 μL之5×濃縮加樣染料(Bionovas Biotech Co.,Ltd.,多倫多，加拿大)混合，並於10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠，於1×Tris-甘胺酸SDS-電泳緩衝液(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)中進行電泳分析。使用Mini Trans-Blot Cell(Biorad)，將經電泳分離之病毒蛋白質轉移至PVDF膜(Biorad,Hercules,CA,USA)上。將含有蛋白質之膜於5.0%配製於PBS,pH 7.2(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之脫脂牛奶(安佳，紐西蘭)中進行封阻，清洗，然後置於Mini-Protene II Multiscreen裝置(Biorad,Hercules,CA,USA)中。將2.0 μg配製於分析緩衝液(1.0%脫脂牛奶溶於PBS,pH 7.2)之各別測試單株抗體(N1、N3、N4或N6)加入反應室中。將膜以0.5mL經1:10,000稀釋(於分析緩衝液)之山辣根過氧化酶(HRP)-共軛的驢子抗-小鼠抗血清(Jackson Immuno-Research Lab.,West Grove,PA,USA)處理。經過0.5小時培育後，將膜清洗，置於衛生紙上印乾，然後將之化學發光受質(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA)淹蓋於該膜上。將膜於X-光底片(柯達,Rochester,NY,USA)上曝光0.5、1.5及10分鐘，以偵測結合狀況。

肽類合成

由Kelowna國際科學公司(三重市，台灣)合成總共57種，跨越具基因型C2之腸病毒71型單離株(命名為TW/2086/98)之全長VP1衣殼蛋白，相互重疊10個胺基酸的15-員肽類(表1)，用以分析可對抗EV71/E59之VP1衣殼蛋白的N1、N3、N4及N6單株抗體之細密專一性特徵。已藉由使用高效能液態層析術(HPLC)，將用於本研究之各別肽類純化至>90%純度。表1列示用於分析N1、N3、N4及N6單株抗體之細密專一性特徵的15-員肽類。

各別肽類係以得自CDC(台灣)之基因型C2腸病毒71型單離株(TW/2086/98)之蛋白質序列為基礎，由Kelowna國際科學公司(三重市，台灣)合成。各肽類於使用前已經高效能液態層析術(HPLC)純化至>90%純度。被每一單株抗體辨識之肽VC43，以粗體字標示出來。

抗原決定基定位ELISA

使用兩種不同型式涉及使用購自NUNC(Napperville,IL,USA)之MaxiSorp與CovaLink NH ELISA平盤，來固著受測試的肽類。將重建於5.0% DMSO(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)之受測試肽類以碳酸鹽-碳酸氫鹽塗層緩衝液(Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)稀釋至10.0 μg/mL。各平盤以2.0 mg/mL匯集五種相鄰肽類之混合物進行塗覆，或將受測試肽類各別地塗覆於MaxiSorp平盤的各孔上。依照Sondergard-Andersen等人(1990)(“經共價聯結之肽類用於酵素聯結免疫吸附分析”J. Immunol. Methods 131,99－104)所述，完成肽類於平盤上之塗覆程序。於靜置過夜(用於MaxiSorp平盤)或於室溫下靜置分鐘(用於CovaLink平盤)後，將平盤清洗，並於3.0%配製於PBS,pH 7.2(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)之脫脂牛奶中進行封阻。然後將各種不同濃度配製於分析緩衝液(1.0%脫脂牛奶溶於PBS,pH 7.2)之各別經純化單株抗體加入各測試孔中。於1小時後，將100.0 μL以1:10,000稀釋，配製於分析緩衝液之HRP-共軛的驢子抗-小鼠抗血清(Jackson Immuno-Research Lab.,West Grove,PA,USA)加入以進行偵測。清洗各孔，並將50 μL之TMB過氧化酶受質(SureBlueTM,KPL,Gaithersburg,MD,USA)加至各分析孔中。於20分鐘後，藉由將50.0 μL之2.0 N H₂ SO₄ (Sigma/Aldrich,St Louis,MO,USA)加入各孔以終止進一步呈色。於ELISA計讀機(Spectra Max M2 model,Sunnydale,CA,USA)中，於450 nm下記錄吸光值。

免疫-溶菌斑形成抑制分析

將2.5×10⁵ 個再懸浮於1.0 ml CM之橫紋肌肉瘤(RD)細胞(ATCC,Rockville,MD,USA)培養於24-孔組織培養盤(Corning生命科學,Corning,NY,USA)的各孔中。將細胞置於以5.0% CO₂ 平衡之37℃培養箱中過夜形成單層。取出培養物上清液，並將200.0 μL含有100 PFUs已經與各種不同濃度之皆屬於IgG2a次類的各別單株抗體，或含有四種單株抗體之混合物預先培養(過夜)的各測試病毒，之CM加至各別含有RD細胞的培養孔中。亦分析無添加單株抗體，或有添加IgG2a單株抗體(純系#20102，R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)之培養物，分別做為陽性與陰性對照組。於37℃下培養1小時後，將0.5mL之1.1%甲醇纖維素(Merck,West Point,PA,USA)淹蓋於細胞上。將持續於以5.0% CO₂ 平衡之37℃培養箱中培養兩天。取出培養物上清液，並將0.5mL配製於PBS(pH 7.2)之3.7%福馬林(Merck,West Point,PA,USA)溶液加至細胞。於次日將福馬林移除，然後將100.0 μL之1比5000稀釋(配製於分析緩衝液)的抗-小鼠EV71-專一性單株抗體MAB 979(Chemicon,Temecula,CA,USA)加入各別測試孔中。1小時後，將平盤清洗並將100.0 μL之1比50,000稀釋(配製於分析緩衝液)的抗-小鼠IgG-HRP共軛抗體(Serotec,Kidlington,Oxford,UK)加入以進行偵測。清洗平盤，並將100.0 μL之TMB過氧化酶受質(KPL,Gaithersburg,MD,USA)加至各分析孔中。令反應於黑暗中呈色30分鐘。於光學顯微鏡下計數呈現黑色斑點的溶菌斑。病毒力價係以每毫升兩組所測試EV71/E59製劑之最高稀釋度中所得PFUs平均值表示(Chang等人(2011)“可交叉中和人類腸病毒基因型B單離株的鼠類單株抗體之製造”Journal of Virological Methods 173: 189-195，其以引用方式併入本文)。

結果 EV71-專一性單株抗體之IgG抗體亞型鑑定(isotyping)及純化

利用原始融合瘤技術，分離到四種EV71-專一性中和抗體，分別命名為N1、N3、N4及N6。使用單株抗體亞型鑑定套組(Thermo Scientific,USA)，決定N1、N3、N4及N6的抗體亞型(isotypes)。圖1顯示每一測試抗體之抗體亞型皆為IgG2a。

使用藉由將20.0 μL經熱處理(95℃下5分鐘)之已純化小鼠腹水液(稱為N1、N3、N4及N6)，與5.0 μL之5×濃縮加樣染料(Bionovas,台灣)混合而加載於10% SDS-聚丙烯醯胺(Amersham Biosciences)凝膠上，進行的SDS-PAGE分析免疫球蛋白(Ig)之純度與同一性。然後將凝膠於100V下，於於1×Tris-甘胺酸SDS-電泳緩衝液中進行電泳90分鐘。將凝膠以購自Biorad之1x考瑪斯藍(CB)溶液染色，隨後置於7.0%醋酸中去染。由SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAG)電泳顯示，從位於54 KDa及25KDa之清楚蛋白質條帶(相當於免疫球蛋白G(IgG)的重鏈與輕鏈)判斷，得到高度純化的腹水液(圖2)。

已純化之腹水液的西方轉漬分析

如圖3所示，各別單株抗體會辨識從經過蔗糖梯度純化之腸病毒EV71/E59樣本，進行電泳解析後位於大約36 kDa的病毒蛋白質。據報導，表現於桿狀病毒之重組具有此分子量(Chung等人,2006)。有趣的是，各別EV71/E59-專一性單株抗體亦會與一種較VP1稍大(大約38 kDa)，也存在EV71/E59製劑中經電泳分開的蛋白部分(Pr)結合。此蛋白之特性仍需進一步研究。圖3顯示於西方轉漬分析中，經過蛋白質G管柱純化之單株抗體(N1、N3、N4及N6)對抗已純化HI-EV71/E59製劑的反應性。該項分析係以2.0 mg/mL各別單株抗體，對1.2 μg/mL已純化EV71/E59病毒製劑之電泳分析結果進行者。

CDR序列分析

圖4列示N1、N3、N4及N6抗體之輕鏈(V_L )可變區的胺基酸序列。術語“FW”代表骨架；區域內的變異型胺基酸係以加框表示。所得之序列數據顯示，分泌N1及N4抗體之融合瘤具有相同的CDR1與CDR2，但是彼等的CDR3不同；而產生N3及N6抗體之融合瘤表現不同組，具有相同CDR1與CDR2，但是不同CDR3的κ鏈組合(圖4)。此等觀察結果支持N1、N3、N4及N6抗體係由不同融合瘤純系製造。圖1顯示於製造N1、N3、N4及N6抗體之融合瘤所表現的κ輕(L)鏈及重(H)鏈中之CDRs序列。

對於融合瘤中所表現的重鏈，並無發現彼等含有不同的CDRs。於圖5列示N1、N3、N4及N6抗體重(H)鏈之共同胺基酸序列。此表示，抗體N1、N3、N4及N6共有相同的V_H 胺基酸序列。

抗原決定基定位研究

自兩種ELISA型式獲得的結果顯示，匯集混合物9含有可由各種單株抗體辨識之肽類(圖6A-B)。藉由將匯集混合物9中所含之肽類各別塗覆於MaxiSorp及CovaLink NH ELISA平盤上，所進行的細密抗源決定基分析鑑定出命名為VC43之肽類，包含胺基酸序列FGEHKQEKDLEYGAC(SEQ ID NO: 55)，其為可被各種單株抗體辨識之標靶物(圖6C-D)。圖6A-D顯示抗原決定基定位研究之結果。使用Maxisorp平盤與CovaLink平盤來塗覆15-員VP1肽類。於各測試中使用10.0 μg/mL各別單株抗體。所示之結果代表每對分別以塗覆於Maxisorp平盤(A)、CovaLink平盤(B)之匯集肽類，及塗覆於此等平盤之各別肽類(C與D)所進行的雙重複組之平均吸光值。

單株抗體之病毒中和活性

由此等研究所獲得之結果顯示，各別單株抗體有效對抗用於致免作用之EV71/E59單離株，以及具有基因型B4之N0781-TW-01、和具有基因型B5之N2838-TW-03(已發現常出現在台灣近幾年之爆發流行中)的中和活性。於3log₁₀ μg/mL下，N3及N6單株抗體完全(100.0%)阻斷所測試之各病毒單離株對RD細胞的感染性(圖7B與7D)。在此濃度下，N1與N4單株抗體亦可完全中和EV71/E59及N0781-TW-01病毒，但是被中和的N2838-TW-03感染性分別達81.0%及88.0%(圖7A與7C)。注意到，單株抗體在中和EV71/E59單離株方面會合作執行作用。於顯著較低的抗體匯集混合物樣本濃度(2.04log₁₀ μg/mL)下，可達到完全抑制EV71/E59病毒感染性(圖7E)。圖4顯示各別及匯集之EV71/E59-專一性單株抗體的病毒中和活性測定結果。結果顯示100PFUs之各別所測試純化的EV71病毒：EV71/E59(▲)、N0781-TW-01(■)或N2838-TW-03(‧)對各種不同濃度之各別單株抗體(A-D)，及匯集的單株抗體樣本(E)所得之%中和作用。亦分析鼠類IgG2a次類單株抗體(純系#20102，R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)做為對照組(◆)。

結論

本實例之目的係為引發產生可呈現對抗基因型B之EV71單離株(常出現在台灣近幾年的爆發流行中)之強烈中和活性的單株抗體，做為研發治療劑之目標物。使用活EV71/E59進行免疫，分離得四株融合瘤可製造屬於IgG2a次類之單株抗體，能辨識位於VP1之胺基酸211-225的共同抗源決定基(VC43)內的不同抗原性部位。該等單株抗體呈現適度差別的抗基因型B病毒之中和活性。在3log₁₀ μg/mL之較高濃度下，N3及N6單株抗體能夠完全抑制，100 PFUs用於致免作用之EV71/E59病毒、具有相同基因型之N0781-TW-01、以及具有基因型B5之N2838-TW-03的感染。雖然N1與N4單株抗體在此濃度下，亦可完全中和基因型B病毒，但彼等在中和N2838-TW-03單離株方面，較N3及N6單株抗體功效稍差。關於該等單株抗體在中和EV71/E59病毒時具有相加效果的發現，說明彼等可辨識VC43抗源決定基內的不同結構部位。

前述已揭示本發明之舉例性實施例，其只是作為舉例與說明之目的，而非用於將本發明限制在所揭示的特定形式。經由上述教示可能產生很多修改和變化。

所選擇及描述之具體實施例，是為了解釋本發明之原理及實際應用，使發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠利用本發明與各種實施態樣，對其進行各種修飾以符合所預期的特別用途。可作替換之實施態樣對發明所屬技術領域中具有通常知識者而言將是顯而易知的，並不會脫離本發明之精神及範圍。因此，本發明的範圍係由後附之申請專利範圍所界定，不限於先前的說明及本文中所描述之舉例性實施態樣。

於本發明說明中有引用及論述一些參考文獻，包括專利案、專利申請案與各種公開資料。此類參考文獻之引用及/或論述僅為闡明本發明之說明而提供，並非認可任何此類參考文獻皆為本發明之“先前技術”。本案說明書中所引用及論述的所有參考文獻皆以其全文完整地被引用。

<110>　國家衛生研究院CHANG,HSUEN-WENSIA,CHARLES DWO-YUANCHONG,PELE CHOI-SINGLIU,CHIA-CHYI

<120>　對抗腸病毒71型之單株抗體及其用途

<130>　10008-00022

<150>　US 61/352,871

<151>　2010-06-09

<160>　82

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子

<400>　1

<210>　2

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　2

<210>　3

<211>　18

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　反向引子

<400>　3

<210>　4

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH1

<400>　4

<210>　5

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH2

<400>　5

<210>　6

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH3

<400>　6

<210>　7

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH5-1

<400>　7

<210>　8

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH5-2

<400>　8

<210>　9

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH11

<400>　9

<210>　10

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH14-1

<400>　10

<210>　11

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH14-2

<400>　11

<210>　12

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人造序列

<220>

<223>　前向引子OVH15

<400>　12

<210>　13

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC1

<400>　13

<210>　14

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 2

<400>　14

<210>　15

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 3

<400>　15

<210>　16

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 4

<400>　16

<210>　17

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 5

<400>　17

<210>　18

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 6

<400>　18

<210>　19

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 7

<400>　19

<210>　20

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 8

<400>　20

<210>　21

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 9

<400>　21

<210>　22

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 10

<400>　22

<210>　23

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 11

<400>　23

<210>　24

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 12

<400>　24

<210>　25

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 13

<400>　25

<210>　26

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 14

<400>　26

<210>　27

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 15

<400>　27

<210>　28

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 16

<400>　28

<210>　29

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 17

<400>　29

<210>　30

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 18

<400>　30

<210>　31

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 19

<400>　31

<210>　32

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 20

<400>　32

<210>　33

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 21

<400>　33

<210>　34

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 22

<400>　34

<210>　35

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 23

<400>　35

<210>　36

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 24

<400>　36

<210>　37

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 25

<400>　37

<210>　38

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 26

<400>　38

<210>　39

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 27

<400>　39

<210>　40

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 28

<400>　40

<210>　41

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 29

<400>　41

<210>　42

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 30

<400>　42

<210>　43

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 31

<400>　43

<210>　44

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 32

<400>　44

<210>　45

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 33

<400>　45

<210>　46

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 34

<400>　46

<210>　47

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 35

<400>　47

<210>　48

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 36

<400>　48

<210>　49

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 37

<400>　49

<210>　50

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 38

<400>　50

<210>　51

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 39

<400>　51

<210>　52

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 40

<400>　52

<210>　53

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 41

<400>　53

<210>　54

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 42

<400>　54

<210>　55

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 43

<400>　55

<210>　56

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 44

<400>　56

<210>　57

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 45

<400>　57

<210>　58

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 46

<400>　58

<210>　59

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 47

<400>　59

<210>　60

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 48

<400>　60

<210>　61

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 49

<400>　61

<210>　62

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 50

<400>　62

<210>　63

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 51

<400>　63

<210>　64

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 52

<400>　64

<210>　65

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 53

<400>　65

<210>　66

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 54

<400>　66

<210>　67

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 55

<400>　67

<210>　68

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 56

<400>　68

<210>　69

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VC 57

<400>　69

<210>　70

<211>　5

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VH CDR1

<400>　70

<210>　71

<211>　17

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　VH CDR2

<400>　71

<210>　72

<211>　17

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N6,N3 CDR1

<400>　72

<210>　73

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N1,N4 CDR1

<400>　73

<210>　74

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N6,N3 VL CDR2

<400>　74

<210>　75

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N1,N4 VL CDR2

<400>　75

<210>　76

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N6,N1 VL CDR3

<400>　76

<210>　77

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N3,N4 VL CDR3

<400>　77

<210>　78

<211>　111

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N6 VL

<400>　78

<210>　79

<211>　107

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N3 VL

<400>　79

<210>　80

<211>　112

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N1 VL

<400>　80

<210>　81

<211>　109

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N4 VL

<400>　81

<210>　82

<211>　118

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　N6,N3,N1,N4 VH

<400>　82

圖1為顯示同型N1、N3、N4及N6抗體之吸光值圖。

圖2為顯示分別含有所指定單株抗體N1、N3、N4及N6之腹水液體樣本之凝膠電泳分析結果的照片。

圖3為顯示E71/E59病毒蛋白分別由存在腹水液體樣本中之所指定單株抗體N1、N3、N4及N6結合的西方轉漬分析結果的照片。

圖4列示N1、N3、N4及N6抗體之輕鏈可變區(V_L )的單字母胺基酸序列。FW：骨架；CDR：互補決定區域

圖5列示N1、N3、N4及N6單株抗體之重鏈可變區(V_H )的共有胺基酸序列。

圖6A-6D顯示抗原決定基定位分析的結果。

圖7為顯示各別及混合型抗體之中和活性的分析結果圖。

Claims

一種單株抗體，其包含：a)具有SEQ ID NO：82之胺基酸序列的重鏈多肽；及b)具有SEQ ID NO：72或73之胺基酸序列的輕鏈CDR1多肽，具有SEQ ID NO：74或75之胺基酸序列的輕鏈CDR2多肽，與具有SEQ ID NO：76或77之胺基酸序列的輕鏈CDR3多肽。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體為一完全人類單株抗體。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體為一人源化單株抗體。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體係與腸病毒(EV)71型結合。
如申請專利範圍第4項所述之抗體，其中該抗體係中和腸病毒71型。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體包含具有選自SEQ ID NO：78、79、80及81之胺基酸序列的輕鏈多肽。
如申請專利範圍第1-6項中任一項所述之單株抗體，其係經標定者。
如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體係與腸病毒衣殼蛋白VP1結合。
如申請專利範圍第8項所述之抗體，其中該抗體係專一地與SEQ ID NO：55之多肽結合。
一種單離核酸，其包含編碼一包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的重鏈多肽之核苷酸序列。
一種單離核酸，其包含一編碼包含選自SEQ ID NO：78、79、 80及81之胺基酸序列的輕鏈多肽之核苷酸序列。
一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第10或11項所述之單離核酸。
一種用於中和或保護對抗腸病毒71型感染的組成物，其包含一種或一種以上如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之單株抗體；及一種醫藥上可接受的載體。
一種組成物，其包含如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之單株抗體；及一種醫藥上可接受的載體。
一種活體外偵測腸病毒71型是否存在一生物樣本中之方法，其包含：a)將該樣本與如申請專利範圍第14項所述之組成物接觸；及b)分析該抗體之結合，以決定腸病毒71型的存在。