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CN116355083B - 特异性结合脊髓灰质炎病毒i型抗原的抗体 - Google Patents

特异性结合脊髓灰质炎病毒i型抗原的抗体 Download PDF

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CN116355083B CN202310619965.8A CN202310619965A CN116355083B CN 116355083 B CN116355083 B CN 116355083B CN 202310619965 A CN202310619965 A CN 202310619965A CN 116355083 B CN116355083 B CN 116355083B
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Abstract

本发明公开了特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体。该抗体具有特异性强、亲和力高的特点，可用于检测样品中I型脊髓灰质炎病毒的存在或水平，以及针对脊髓灰质炎病毒的治疗，具有良好的应用前景。

Description

特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体。
背景技术
脊髓灰质炎俗称“小儿麻痹症”，是由脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）3种血清型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型）引起的一种急性传染病，大部分感染者无明显症状或临床症状很轻。但在一些罕见病例中，脊髓灰质炎病毒可侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神经细胞，导致患者出现肢体弛缓性麻痹、严重可引起呼吸麻痹甚至死亡，平均每200名感染者就会出现1例麻痹病例。它是一种很古老的病毒，早在公元前就存在于人类社会中，最早的证据来自于古埃及的石壁画上的具有显著脊髓灰质炎特征的一个人物。直到上世纪30年代初三种脊髓灰质炎病毒相继被分离出来，由此拉开了脊髓灰质炎病毒疫苗研究的序幕。
脊髓灰质炎病毒是一种无包膜单股正链 RNA 病毒，属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。病毒颗粒为直径 27~30nm 的正二十面体球形结构。基因组全长约7500bp，由5’端非编码区、编码区(P1 区、p2区和p3区)和3’端非编码区组成。P1 区编码主要结构蛋白P1，它可进一步被分解为VP0、VP1和VP3三种蛋白，这三种蛋白和子代 RNA 组装成原病毒颗粒，VP0在组装中进一步切割为 VP4 和VP2 蛋白，从而完成成熟病毒颗粒的组装。VP0、VP1和VP3组装成一个聚体蛋白单位，五个聚体蛋白单位组装成一个聚体蛋白，12个聚体蛋白组装成一个80S 的前衣壳蛋白，即为一个完整颗粒。
脊髓灰质炎病毒在复制的过程中可产生两种抗原：致密（Density，D）抗原和无核心（Coreless，C）抗原。其中D抗原是天然形式的抗原，是病毒的主要有效成分，可激发机体产生保护性的中和抗体。脊髓灰质炎病毒具有热不稳定性的特征，当50℃或更高温度加热时，病毒抗原衣壳蛋白经历构象变化，从天然形式的D抗原转换为非天然或加热形式的C抗原，而C抗原则不能刺激机体产生保护性中和抗体。因此，D抗原能够作为针对脊髓灰质炎的治疗或检测靶标。例如，目前脊髓灰质炎病毒疫苗的主要质控评价标准就是疫苗的D抗原含量。但是，在现有技术中缺乏针对D抗原的特异性强的中和抗体。因此，解决上述问题成为当务之急。
发明内容
解决的技术问题：
本发明针对现有技术中缺乏针对D抗原的特异性强的中和抗体的缺陷，提供了一种特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体。
具体地，本发明提供了一种抗体或抗原结合部分，其能够特异性地结合脊髓灰质炎病毒D抗原。
本发明提供的技术方案：
特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体，所述抗体包含有：依次如SEQ IDNO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列和依次如SEQ ID NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
在本公开中，所述与其80％以上同一性的，是指与本发明中所述核苷酸、氨基酸序列具有80％以上同一性，其可以为具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，可以以合适的方式对本发明中所述核苷酸、氨基酸序列进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的表达水平、亲和力和/或解离性质，而这些突变后的核苷酸或氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
在本公开中，所述生物学活性一般指免疫活性。可以对本公开所述的抗体进行修饰，其目的是为了实现某些功能而并不影响所述突变体整体的生物学活性。所述修饰可以为选自糖基化修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、辅酶修饰或酰基化修饰中的至少一种。
在本公开的一些实施方式中，所述抗体可以包含依次如SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列的至少一种，或依次如SEQ ID NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列的至少一种，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
在本公开的另一些实施方式中，所述抗体可以包含依次如SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列的至少一种，和依次如SEQ ID NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列的至少一种，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方式中，所述抗体还包含Fc段。所述Fc段可以为经过修饰的，从而增强其ADCC活性。
作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述抗体包含有如SEQ ID NO .7所示的重链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO .8所示的轻链可变区的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
在本公开的一些实施方式中，上述抗体可以为人、人源化抗体或嵌合抗体。
本发明的另一个方面，是提供了特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗原结合部分，所述抗原结合部分包含有：依次如SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列和依次如SEQ ID NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列；
其中，所述抗原结合部分为Fab、Fab '、F(ab ')2、Fd、dAb、互补决定区片段或单链抗体。
在本公开的一些实施方式中，还提供了一种多价抗体，所述多价抗体包含有一个或多个上述抗体或抗原结合部分。
在本公开的一些实施方式中，还提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含有上述抗体或抗原结合部分。所述双特异性抗体的另一部分包含有特异性结合其他靶蛋白的抗体或抗原结合部分。
本发明的另一个方面，是提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述抗体或抗原结合部分中所述的氨基酸序列。
作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码所述重链可变区的氨基酸序列或轻链可变区的氨基酸序列；
编码所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO .9所示，编码所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO .10所示，或与所述多核苷酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸序列可以以合适的方法插入到任意合适的表达载体中，例如，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含所述多核苷酸的序列。
本发明的另一个方面，是提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含有所述抗体，或所述抗原结合部分。
本发明的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有所述的抗体，或所述的抗原结合部分。
在本公开的一些实施方式中，还提供了一种特异性结合脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的第二抗体，所述第二抗体包含有SEQ ID NO .11-13所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和/或SEQ ID NO .14-16所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述第二抗体包含有如SEQ ID NO .17所示的重链可变区氨基酸序列和/或如SEQ ID NO .18所示的轻链可变区氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有80%以上同一性且具有相同或基本相同生物学活性的氨基酸序列。
作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述第二抗体包含由SEQ ID NO .19所示的编码所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列，SEQ ID NO .20所示的编码所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列。
本发明的另一个方面，是提供了所述的抗体、所述的抗原结合部分、所述的分离的核苷酸、所述的载体、所述的分离的细胞或所述的试剂盒在检测样品中脊髓灰质炎病毒I型抗原的存在或者水平中的用途。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的抗体、所述的抗原结合部分、所述的分离的核苷酸、所述的载体、所述的分离的细胞，以及药学上可接受的载体。
本公开药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
同样，本公开药物组合物也可以和其他合适的药物联合应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括所述的抗体或所述的抗原结合部分，其与治疗剂或可检测标记物连接；
所述治疗剂包括药物、酶、毒素、细胞因子或放射性核素。
上述治疗剂可以选自细胞毒剂、免疫调节剂、治疗性蛋白、生物聚合物或寡核苷酸。
本发明的另一个方面，是提供了所述的药物组合物或所述的免疫缀合物在制备治疗I型脊髓灰质炎病毒感染及其引起的疾病的药物中的用途。所述的药物组合物或所述的免疫缀合物可以具有中和I型脊髓灰质炎病毒的功能。
本发明的有益效果：
本发明提供的特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体具有特异性强、亲和力高的特点，可用于检测样品中I型脊髓灰质炎病毒的存在或水平，以及针对脊髓灰质炎病毒的治疗，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本公开实施例中制备的抗原脊髓灰质炎病毒Ⅰ型VLP的电镜观察结果图。
序列说明
SEQ ID NO.1-3为本公开实施例中抗体重链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4-6为本公开实施例中抗体轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.7为本公开实施例中抗体的重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO.8为本公开实施例中抗体的轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO.9为本公开实施例中抗体的重链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO.10为本公开实施例中抗体的轻链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO.11-13为本公开实施例中第二抗体的重链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.14-16为本公开实施例中第二抗体的轻链可变区CDR1-3的氨基酸序列；
SEQ ID NO.17为本公开实施例中第二抗体的重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO.18为本公开实施例中第二抗体的轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO.19为本公开实施例中第二抗体的重链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO.20为本公开实施例中第二抗体的轻链可变区核苷酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。分子生物学常见术语的定义可见Lewin’s GENES XII， JocelynE.Krebs / Elliott S.Goldstein / Stephen T.Kilpatrick，出版Jones & Bartlett，2018。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“一个(一种)”(“a”、“an”和“the”)包括复数指示物。术语“多个(多种)”是指两个(种)或更多个(种)。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
定义：
术语“抗体”，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为 IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区 (VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL) 分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
术语“抗原结合部分”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合片段”。通常参见，Fundamental Immunology ,Ch .7(Paul ,W .,ed .,第2版，Raven Press ,N .Y .(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv等。
术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab′)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
术语“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature ,256:495 ,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U .S .P 4 ,816 ,567)。
术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。
术语“中和抗体”是指，能清楚或显著降低目标病毒或假病毒的毒力的抗体或抗体片段。
术语“表位”是指，抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位，可以是线性的表位，也可以是构象的表位。
本发明中使用的“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用。
本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示，例如：丙氨酸可用A或Ala表示。
术语“佐剂”是指，非特异性免疫增强剂，与抗原混合后可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，包括但不限于铝佐剂如氢氧化铝，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂等。
术语“脊髓灰质炎病毒VLP”是指，有体外表达的脊髓灰质炎病毒结构蛋白组装而成的病毒样颗粒，如脊髓灰质炎病毒Ⅰ型VLP就是指，体外表达的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型结构蛋白组装而成的病毒样颗粒。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
实施例
实施例1：杂交瘤细胞的制备及筛选
（1）免疫原的制备
制备脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的单克隆抗体所使用的免疫原为脊髓灰质炎病毒Ⅰ型VLP蛋白，是利用汉逊酵母细胞经体外重组表达自组装成的VLP，经透射电镜观察可见图1所示的病毒样颗粒，直径在20-40nm之间，呈球形。将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原与等体积的福氏完全佐剂(CFA)或福氏不完全佐剂(IFA)混合，利用超声充分乳化，制备相应的免疫原。
（2）动物免疫
第0天用与弗氏完全佐剂（CFA）混合的免疫原，经背部皮下多点注射小鼠，免疫3只小鼠，0.2mg次/只，共免疫4次，每次间隔1周，第3次免疫后采集小鼠血清，利用以下所示的间接ELISA方法检测抗体效价，如表1中的结果显示，小鼠血清抗体效价均在1：50000以上，均可用于融合。
表1. 三只小鼠血清抗体ELISA检测结果
（3）间接ELISA法
脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原包被96孔板，100ng/孔。阴性对照(NC)孔加入含5％脱脂奶粉的PBS溶液100μl，4℃过夜；弃去孔中液体，PBS洗板3次，加入含5％脱脂奶粉的PBS溶液，250μl /孔，室温封闭1小时；弃去孔中液体，PBS洗板1次，加入一抗（尾血从1：500至1：50000梯度稀释；杂交瘤细胞培养上清从1：1 比例进行稀释；小鼠腹水从1：1000至1：200000梯度稀释），室温孵育1小时；弃去孔中液体，PBS洗板3次，加入HRP偶联的羊抗鼠IgG Fc(1：2000比例稀释)，室温孵育1小时；弃去孔中液体，PBS洗板5次，加入底物A和B 液，50μl/孔，室温避光反应20min；加入50μl终止液终止反应，上酶标仪测定A450，以A450(阳性)>2倍A450 (NC)作为判断标准。
（4）杂交瘤细胞的制备及筛选
取抗体效价最高的1#小鼠用于融合。融合前3天用与弗氏不完全佐剂（IFA）混合的免疫原进行加强免疫，0.08ml/只，取脾脏分离脾细胞进行细胞融合。首先分离单个脾细胞，经PEG4000(500g/L)与鼠骨髓瘤SP 2/0细胞按4：1比例融合，用含20％FBS和2％HAT的DMEM培养基，在96孔板中37℃恒温培养14天；收集上清，筛选阳性克隆细胞，进一步用含20％FBS的DMEM培养基扩大培养，收集上清，进行复筛，复筛出的阳性克隆细胞扩大培养，收集上清，经冻存和复苏获得阳性克隆，收集上清。按间接ELISA法检测培养上清，筛选上清阳性的细胞株。结果如表2所示。从564株细胞株中筛选到28株阳性细胞株，最终从中挑选能够稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的单克隆抗体的细胞株共计23株，NC为阴性对照，PC为阳性对照。
表2. 稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的单克隆抗体的细胞株上清液ELISA检测结果
（5）杂交瘤细胞分泌上清液的特异性抗体检测
利用间接ELISA法，包被原分别为脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原，100ng/孔。对该28株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体进行检测，结果显示有23株杂交瘤细胞分泌在细胞上清液的抗体对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原反应为阳性，对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原反应为阴性（如表2所示），确定该23株杂交瘤细胞为型别特异性抗体。
（6）中和抗体活性检测
使用脊髓灰质炎假病毒中和试验方法检测抗体的中和活性及其抗体滴度，检测抗体清除假病毒或显著降低假病毒毒力的能力，具体如下：
1）使用细胞培养基在96孔细胞培养板中稀释待测血清，共稀释8个梯度，同时设立培养基替代抗体的对照孔（阴性对照）及培养基对照孔（空白对照），每孔均100μl。
2）使用培养基将脊髓灰质炎Ⅰ型假病毒稀释至工作滴度，每孔100μl加入板中，空白对照孔加入100μl培养基，37℃孵育2小时。
3）将RD细胞制成活细胞密度3×105/ml的细胞悬液，每孔100μl加入板中，37℃、5％浓度 CO2培养箱中培养12~20小时。
4）甩去96孔细胞培养板内培养基并在吸水纸上轻轻扣干，每孔加入50μl DPBS后，再加入50μl配制好的荧光素酶反应底物（注意加样槽的避光），室温避光反应2min，上机检测（Luciferase通道读取1000ms）各孔的RLU值。
5）根据以下公式计算供试品孔的感染抑制率：感染抑制率=1－(供试品孔RLU－空白对照RLU)/(阴性对照RLU－空白对照RLU)。采用Reed-Muench法计算供试品中和滴度：以供试品各稀释度中大于50%抑制率的最小值作为“大于50%的抑制率”，以小于50%抑制率的最大值作为“小于50%的抑制率”；计算距离比例：距离比例=(大于50%的抑制率-50)/(大于50%的抑制率-小于50%的抑制率)计算50%抑制率稀释度对数：50%抑制率稀释度对数=高50%稀释度的对数+距离比例×稀稀释系数的对数，供试品中和滴度为50%阳转终点稀释倍数。
结果如表3所示，2株杂交瘤细胞株4G1和5E11为具有中和活性的克隆。
表3. 杂交瘤细胞分泌上清液的中和抗体活性检测结果
（7）腹水制备、抗体纯化及抗体效价检测
选取其中6株杂交瘤细胞制备腹水，每株克隆细胞接种2只小鼠，8~10天收集腹水，利用Protein G亲和柱纯化腹水，获得纯化抗体，并对腹水抗体和纯化后抗体进行ELISA检测。结果如表4、5所示，6株杂交瘤细胞分泌的抗体效价均达到20万以上，且纯化后抗体识别免疫原滴度均达到0.005ug/ml。
表4. 小鼠腹水抗体ELISA检测结果
表5. 纯化后抗体ELISA检测结果
（8）生物素标记
将纯化后的6株抗体分别进行生物素标记，随后进行不同抗体配对测试。用生物素标记了抗体，以未标记抗体作为包被抗体进行了配对实验，配对结果显示，多组配对曲线均有梯度，优先选择具有中和活性的抗体4G1和5E11和检测样品信号较好的6A10，综合配对结果选择4G1作为包被抗体，6A10-Biotin作为检测抗体，如表6所示。
表6.配对抗体ELISA检测结果
（9）杂交瘤细胞的传代培养及保存
将上述杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，4G1和6A10两株杂交瘤细胞仍然能够生长良好、稳定传代，可以持续稳定分泌抗脊髓灰质炎Ⅰ型的单克隆抗体。
获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭，因此有必要对细胞株进行保存。保存方法如下：去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。1000rpm/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞/ml。取样，用台盼兰染色，计数活细胞数量应在95％以上。最终用无菌注射器将细胞分装至安瓶中，每瓶0.5ml~1.0ml，熔封安瓶。4℃静置2小时后转移入-70℃冰箱中15小时，最后转入液氮中冻存。
实施例2：4G1抗体的鉴定
（1）杂交瘤细胞的传代培养及保存
选择成年 BALB/c 小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7~10天后腹腔接种第16代clone4G1杂交瘤细胞，每只小鼠1×106~2×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，用9号针头采集腹水。
（2）抗体的纯化
将腹水13000rpm/min 离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G亲和层析进行纯化，最终得到脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的单克隆抗体 clone4G1，浓度在3mg/ml以上。
（3）抗体纯度检测
将纯化后的抗体进行12%SDS-PAGE电泳，纯度在95%以上。
（4）抗体轻链及重链可变区基因序列测定
提取4G1杂交瘤细胞的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，4G1的可变区基因序列：重链如SEQID NO .9所示，轻链如 SEQ ID NO .10所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。4G1的可变区氨基酸序列：重链如SEQ ID NO .7所示，轻链如SEQ IDNO .8所示。
（5）抗体型别特异性的检测
如实施例1（5）杂交瘤细胞分泌上清液的特异性抗体检测结果显示，4G1抗体仅对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原反应为阳性，对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原检测结果均为阴性，证明4G1抗体为型别特异性单克隆抗体。
（6）抗体中和活性鉴定
如实施例1（6）的抗体中和活性检测结果显示，4G1抗体为具有中和活性的单克隆抗体。将纯化后的抗体按照实施例1（6）的中和抗体检测方法进行检测，结果显示中和滴度为40405。
实施例3：6A10抗体（第二抗体）的鉴定
（1）杂交瘤细胞的传代培养及保存
选择成年 BALB/c 小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7~10天后腹腔接种第16代clone6A10杂交瘤细胞，每只小鼠1×106~2×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，用9号针头采集腹水。
（2）抗体的纯化
将腹水13000rpm/min 离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G亲和层析进行纯化，最终得到脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的单克隆抗体clone6A10。
（3）抗体纯度检测
将纯化后的抗体进行12%SDS-PAGE电泳，纯度在95%以上。
（4）抗体轻链及重链可变区基因序列测定
提取6A10杂交瘤细胞的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，6A10的可变区基因序列：重链如SEQID NO .19所示，轻链如 SEQ ID NO .20所示。将获得的核苷酸序列翻译成氨基酸序列。6A10的可变区氨基酸序列：重链如SEQ ID NO .17所示，轻链如SEQ IDNO .18所示。
（5）抗体型别特异性的检测
如实施例1（5）杂交瘤细胞分泌上清液的特异性抗体检测结果显示，6A10抗体仅对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原反应为阳性，对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原检测结果均为阴性，证明6A10抗体为型别特异性单克隆抗体。
（6）抗体中和活性鉴定
如实施例1（6）的抗体中和活性检测结果显示，6A10抗体不具有中和活性。
实施例4：脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原检测试剂盒
利用实施例1得到的单克隆抗体4G1和6A10进行脊髓灰质炎病毒Ⅰ型双抗夹心ELISA 试剂盒的研制，用以检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原水平。
（1）双抗体夹心ELISA方法的建立
1）试剂盒原理：
4G1和6A10两株抗体均为脊髓灰质炎病毒Ⅰ型型别特异性抗体，且4G1株抗体具有中和活性，以4G1作为包被抗体，以6A10作为生物素标抗体，建立双抗夹心 ELISA检测试剂盒。当将待检样品溶液或标准品溶液加入已经预包被有4G1抗体的酶标板，加入6A10-Biotin二抗，再加入HRP标记的亲和素，用显色液显色，样品吸收值与样品中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的含量在线性范围内成正相关，与标准曲线比较即可得出样品中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的含量。同时也可根据酶标板上的颜色深浅，通过与系列浓度的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原标准品溶液颜色的比较，粗略判断样品中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原的浓度范围。
2）试剂盒的组成
（1）包被有包被抗体的酶标板：包被抗体为4G1型别特异性中和单抗，用包被缓冲液将包被抗体稀释成5μg/ml，包被于96孔酶标板上，每孔加入100μl，置于4℃环境孵育8小时。弃去包被液，洗涤液洗涤3次，拍干。然后在酶标板中加入封闭液，每孔100μl，37℃环境孵育1.5小时。倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。其中，所用的包被缓冲液是pH值为9.5、0.5mol/L碳酸盐缓冲液；所用封闭液是含有终浓度为3％(质量百分含量) 牛血清白蛋白的PBS。
（2）生物素标抗体：标记物为生物素，被标抗体为6A10型别特异性单抗，生物素标抗体的工作浓度为0 .25μg/ml（1:100倍稀释）。
（3）酶标亲和素：工作浓度为1:100倍稀释。
（4）Casein：每包为0.5g，配制成含有终浓度为5％(质量百分含量) Casein的PBS，作为稀释液。
（5）底物显色液：由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢，显色液B液为邻苯二胺。
（6）终止液：1-2mol/L硫酸溶液。
（7）20X浓缩洗涤液：含有在浓缩洗涤液中的终浓度为0.5％(质量百分含量)吐温20、0.3mol/L的磷酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶。
（8）试剂盒说明书。
（2）试剂盒特异性验证
将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原配置成80ng/ml的供试品，利用脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原检测试剂盒对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原、脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原三种抗原进行 ELISA检测，结果如表7所示，可见脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原检测试剂盒对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原检测为阳性，对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅲ型抗原检测为阴性，试剂盒特异性良好。
表7. 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原试剂盒特异性验证
（3）试剂盒灵敏度验证
试剂盒检测的最低抗原浓度是确定试剂盒灵敏度的关键。将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原配置成10ug/ml的供试品，分别稀释到80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml。利用试剂盒对稀释后的样品重复测定6次，将6次标准曲线检测下限取均值，最终确定试剂盒灵敏度为5ng/ml。
（4）试剂盒精密度验证
1）精密度验证—板内差异
将3个浓度分别为60ng/ml，30ng/ml和15ng/ml的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原分别加入酶标板中，每个抗原浓度做5个复孔(n＝6)，以样品稀释液作为阴性对照。计算酶标板内相同浓度的各孔间OD值变异系数 (Coefficient of variation ,CV)，结果如表8显示，板内CV(％)值均小于15％，表明该试剂盒板内精密度良好。
表8. 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原试剂盒板内变异系数
2）板间差异
将3个浓度分别为60ng/ml，30ng/ml和15ng/ml的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原分别加入酶标板中，每个抗原浓度做5个复孔(n＝6)，以样品稀释液作为阴性对照。计算酶标板内相同浓度的各孔间OD值变异系数 (Coefficient of variation ,CV)，结果如表9显示，板间CV(％)值均小于20％，表明该试剂盒板内精密度良好。
表9. 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原试剂盒板间变异系数
（5）试剂盒准确度验证
将3个浓度分别为60ng/ml，30ng/ml和15ng/ml的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原分别加入酶标板中，以抗原含量对应其吸光度值做标准曲线，计算每个抗原的蛋白浓度，分析试剂盒的准确度。结果如表10所示，每个抗原的准确度介于88%-107%之间，试剂盒准确度良好。
表10. 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原试剂盒准确度分析
（6）试剂盒重复性验证
将脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原稀释至80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml共5个浓度，以样品稀释液作为阴性对照，以供试品中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原含量对应其吸光度值做标准曲线，每个浓度检测6次，标准曲线的线性相关系数R2结果如表11所示，相关系数R2均不低于0.99，表明该检测方法线性相关性及重复性较好。
表11. 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原试剂盒线性相关性及重复性验证
（7）试剂盒保存期实验
试剂盒保存条件为2~8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)，脊髓灰质炎病毒Ⅰ型抗原实际测定值均在正常范围之内。暂且认为试剂盒可以在2~8℃至少可以保存6个月以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体，其特征在于，所述抗体包含有：依次如SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列和依次如SEQ IDNO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列。
2.特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗体，其特征在于，所述抗体包含有如SEQ IDNO .7所示的重链可变区的氨基酸序列和如SEQ ID NO .8所示的轻链可变区的氨基酸序列。
3.特异性结合脊髓灰质炎病毒I型抗原的抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分包含有：依次如SEQ ID NO.1-3所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列和依次如SEQ ID NO.4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域的氨基酸序列；
其中，所述抗原结合部分为Fab、Fab '、F(ab ')2、Fd、dAb或单链抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
5.分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码如权利要求1、2或3的抗体或抗原结合部分中所述的氨基酸序列。
6.载体，其特征在于，所述载体包含有如权利要求5所述的多核苷酸的序列。
7.分离的细胞，其特征在于，所述分离的细胞包含有如权利要求1、2或4所述的抗体，或如权利要求3所述的抗原结合部分。
8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如权利要求1、2或4所述的抗体，或如权利要求3所述的抗原结合部分。
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1、2或4所述的抗体、如权利要求3所述的抗原结合部分、如权利要求5所述的分离的核苷酸、如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的分离的细胞，以及药学上可接受的载体。
10.免疫缀合物，其特征在于，所述免疫缀合物包括如权利要求1、2或4所述的抗体或如权利要求3所述的抗原结合部分，其与治疗剂或可检测标记物连接；
所述治疗剂包括药物、酶、毒素、细胞因子或放射性核素。
11.如权利要求9所述的药物组合物或如权利要求10所述的免疫缀合物在制备治疗I型脊髓灰质炎病毒感染引起的脊髓灰质炎的药物中的用途。
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