TWI425915B

TWI425915B - New Pseudomonas bacteria

Info

Publication number: TWI425915B
Application number: TW098141083A
Authority: TW
Inventors: Masachika Maeda
Original assignee: Bioproject Co Ltd
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2014-02-11
Also published as: JP4913117B2; JP2010136668A; TW201036551A

Description

新型假單胞菌屬細菌

本發明係關於一種新型假單胞菌屬細菌，使用該新型假單胞菌屬細菌之蜜蜂、動物或植物的成長促進方法、疾病之防除方法、以及該細菌之培養方法者。

蜂蜜在歷史上是作為一種健康食品並且作為高級嗜好品而受到人們的重用，不僅在日本，即便在西歐、伊斯蘭圈及中華民族圈中蜂蜜亦為具有人氣之食品。

在日本用於生產上述蜂蜜之蜜蜂，至今一直使用日本蜜蜂即自古品種，但本品種因具有移動之習性而難以飼養，目前西洋蜜蜂成為蜂蜜生產中之主要品種。

對於西洋蜜蜂而言，因產生若干之疾病而帶來較大損失。其中，起因於腐蛆病病菌(歐洲腐蛆病Melissococus plutonius、美國腐蛆病paenibacillus larvae)之腐蛆病，由於成蜂吸食此病菌而傳染給幼蜂，於蜂幼蟲中產生病情而導致大量死亡。上述疾病係法定家畜傳染病，並且按照法律必須對發病蜂群進行焚燒處理。於預防疾病之對策中，雖使用含有抗生素(米羅米星)之「Apiten」(腐蛆病預防藥)，然而，產生有上述藥劑經由成蜂而混入至蜂蜜之事件，存在損害蜂蜜之純正性之顧慮。

此外，起因於真菌(ascosphaera apis)之白堊病，會於3至5 日齡之蜂幼蟲中高度感染，而導致大量死亡，但抗生素對真菌而毫無效果等，針對本疾病之有效解決方法很少。

此外，近年來於蜜蜂中產生病毒導致有整個蜂群消失之事態。上述情況被稱為蜜蜂群消散症候群，且急性麻痹等成為致命病毒。針對上述病毒疾病，亦未發現有效之藥劑。

於近年來抑制向食品原材料使用藥劑之社會性傾向中，因對蜂蜜中之殘留抗生素等之社會上的關心度提高，因此必須確立不使用藥劑之蜜蜂飼養方法。

另一方面，家畜、蔬菜類之疾病漸趨擴大，形成新型藥劑的使用與耐性菌的出現，或者是反覆產生新型疾病。對於上述疾病產生、擴大的理由之一，可列舉因多種多量之藥劑之使用而造成動物消化管內或者土壤等的環境中之微生物失衡。例如，於自然界中，病毒藉由細菌而受到抑制，但由於日常使用之抗生素而使細菌減少，因此自細菌的抑制中解放出之病毒增加。上述現象顯著地出現於固定使用抗生素(成長促進劑)之家畜現場。因此，必須向不依賴藥劑之動植物的生產方法轉變。

本方法因使用抑制作為上述疾病之原因之病原細菌、病原性真菌、病原病毒之增殖、感染之有用細菌來防除疾病，故藉由使用上述有用細菌而可降低、抑制藥劑。

通常而言，微生物係使用液體中添加有可溶性營養物之液體培養基而進行培養，且液體與固形培養基之比例，考慮到液體中之沉澱物而為100：1以下。然而，於上述液體培養之情況下，每單位ml之細菌收穫量較少，並且最大收穫量為10⁹~10¹⁰細菌細胞/ml左右，於向動植物投與之情況下，必須大量的培養微生物。因此，需要開發出大幅增加細菌收穫量之培養方法。

本發明所欲解決之問題在於提供一種去除蜜蜂、動物、蔬菜中作為病因之細菌、真菌或病毒之防除方法、以及促進蜜蜂、動物、蔬菜之成長之方法。

令人驚奇的是，本案發明者等提出一種藉由含有假單胞菌‧馮斯(Pseudomonas fons)MS-1株(委託編號FERMP-21673)，屬於假單胞菌‧馮斯，並且具有可抑制病原性之細菌、真菌及病毒對蜜蜂、動物或植物之感染及增殖之能力的細菌，來解决上述問題。本發明含有以下發明。

(1)一種細菌，係屬假單胞菌‧馮斯(Pseudomonas fons)，具有抑制病原性之細菌、真菌及病毒對蜜蜂、動物或植物之感染及增殖之能力。

(2)如(1)中之細菌，係假單胞菌‧馮斯MS-1株(委託編號FERM P-21673〉或其變異株。

(3)一種抑制病原性之細菌對蜜蜂、動物或植物感染及增殖之抑制劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(4)一種抑制病原性之真菌對蜜蜂、動物或植物感染及增殖之抑制劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(5)一種抑制病原性之病毒的蜜蜂、動物或植物感染及增殖之抑制劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(6)一種蜜蜂或動物之成長促進劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(7)一種植物之成長促進劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(8)一種用於蜜蜂、動物或植物而病因為細菌、真菌或病毒之疾病防除劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(9)一種用於蜜蜂或動物之飼料、食物、飼料添加劑或食物添加劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(10)一種肥料或肥料添加劑，係含有(1)或(2)之細菌。

(11)一種(1)或(2)之細菌之培養方法，其特徵在於，係使用由固形粉末配製而成之固體培養基而進行培養。

藉由使用本發明之新型假單胞菌屬細菌，可防止蜜蜂、動物、蔬菜之主要疾病即腐蛆病、白堊病、沙門氏桿菌症、禽流感病毒病、免疫不全病毒病、立枯病、瘡痂病等之患病之擴散。此外，藉由本發明之新型假單胞菌屬細菌，可獲得蜜蜂之成蜂數大幅增加，即蜂蜜之生產能率提高之效果，同時獲得家畜等之動物、蔬菜之成長促進效果。而且，上述結果亦顯示出可用作動物醫藥或者人體之健康食品。

此外，於使用固體培養基來培養新型假單胞菌屬細菌之情況下，可以高濃度地培養上述細菌，即可獲得高收穫量之上述細菌。

以下對本發明進行更詳細之說明。

1. 新型細菌

本發明之新型假單胞菌屬細菌係屬假單胞菌‧馮斯，且若為具有抑制病原性之細菌、真菌及病毒抑制蜜蜂、動物或植物之感染及增殖之能力的細菌則無特別之限定。對於「動物」及「植物」則由以下內容敍述。藉由本發明之新型假單胞菌屬細菌來抑制感染及增殖之細菌之例，可列舉腐蛆病菌(Melissoccoccus或Paenibacillus)、沙門氏桿菌症菌(Salmonella infantis)、立枯病菌(Ralstonia solanacearum)、瘡痂(瘡痂)病菌(Streptomyces scabies sacidiscabies)，真菌之例可列舉原真菌(Ascosphaera apis)，病毒之例可列舉禽流感病毒(H3N8)、比目魚貧血症病毒(IHNV)、輪狀病毒(Rotavirus)，但並非限定於此。

具有如上所述能力之細菌，最佳的是假單胞菌‧馮斯(Pseudomonas fons)MS-1株(委託編號FERM P-21673)，但並非限定於此，例如，可使用屬於16SrRNA之基因之部分排列以排列編號1表示之假單胞菌‧馮斯之細菌、以及具有以下之菌學的性質且分類於假單胞菌‧馮斯之細菌。

形狀：桿菌；長度：1~3微米；運動性：有；胞子形成：無；革蘭氏染色：陰性；OF測試：-

生育程度

經過1~2天左右之培養形成數mm之群體，顏色：薄茶色；光澤：無特別；表面：平滑；擴散性色素：無；pH：4.0(-)、5.0(+)、 5.6(+)、8.6(+)、10.0(+)溫度：中溫性7~45℃、NaCl：0~4%

硝酸還原：-；脫氮反應：-；吲哚：-；硫化氫：-；檸檬酸：-；硝酸鹽利用：-；色素產生：-；脲酶：-；氧化酶：+；鹽過氧化氫酶：+；DNA G+C；內容物：68mol%

除使用具有抑制病原性之細菌、真菌及病毒對蜜蜂、動物或植物之感染及增殖之能力之細菌，亦可較好的使用假單胞菌‧馮斯MS-1株之變異體。此處，所謂變異體係假單胞菌‧馮斯MS-1株誘發變異而進行處理之變異株。變異誘發處理可使用任意之適當之變異原而獲得。在此，作為「變異原」之詞語，應當理解為於廣義上例如，除具有變異原效果之藥劑之外，亦包含每當進行UV照射時而具有變異原效果者。作為適當之變異原之例，可列舉：乙基甲硫酸、UV照射、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基亞氨甲二胺、如溴尿嘧啶之核苷酸鹽基類似體及啶類，但亦可使用其他之任意有效之變異原而獲得。

對於本發明之新型假單胞菌屬細菌之培養而言，可使用固體培養基(大豆粉800g、米糠2200g、酵母萃取物4g、蒸餾水水1000ml與一般性之細菌用之培養基，且無特別限定組成。例如，可製作培養基5g、酵母萃取物3g、磷酸二鉀鈉0.2g、蒸餾水1000ml、pH7.2~7.4之培養基，並進行121℃、15分鐘之加熱滅菌而使用。

此外，於固體及液體中培養新型假單胞菌屬細菌時之培養容器，可使用用於一般之微生物之培養之裝置，且無特別限定方法。例如，於小規模之培養中，可使用試驗管、瓶子、培養皿等，於大規模之培養中，可使用發酵槽、能通氣攪拌之罐等。

為大量生產本發明之新型細菌，尤其理想的是使用由固形粉末所配製之固體培養基而進行培養。此處，作為固形粉末，可以大豆粉末、米糠粉末為主材料，並且較理想的是添加有少量之酵母萃取物及蛋白腖作為添加物之混合物。此外，可使用矽酸質粒子等之無機物質來作為固形粉末。本案發明者等發現，於固形粉末，將蒸餾水以每100g固形粉末添加20ml、40ml、60ml、80ml作為水分，並對上述細菌進行接種，於25℃、經由3天而進行培養之情況下，於添加有60ml以上之水分之培養基中，細菌可良好地進行增殖。其增殖量係達到10¹⁰~10¹²細菌細胞/g。較理想的是相對於固形粉末100g之水分量為80~140ml。此外，即便將矽酸質等之無機物粒子(粒徑約10μm)數10g添加至培養液1L中，假單胞菌屬細菌之生菌量約增加至10倍。較好的是，上述無機粒子之數量相對於培養液1升為20~50g之範圍。於進行固體培養、或者於液體培養基中添加有固形粉末之培養中，因本發明之新型細菌與高濃度之營養物接觸，或者於所謂固體附著物質附著有菌，故而細菌收穫量大幅增加。而且，此細菌收穫量比液體培養的情況的收穫量更大10~100倍。上述固體培養物藉由水及砂糖液之稀釋，而均質分散，故而可用作蜜蜂或動物之餌或者植物之肥料，或者向蜜蜂、動物或植物之生育環境之散佈劑。

於將本發明之細菌用於下述之用途之情況，其形態並無特別限定，可使用菌體或培養物或者其等之處理物等各種形態。此處，所謂「培養物」，係於固體或液體培養基中培養細菌、未進行菌體的分離之培養物(液體培養基之情況下為培養液)。所謂「處理物」，係含有所有藉由常法而對培養物進行處理之概念，例如，亦指培養物之稀釋物、濃縮物、乾燥物、凍結物等。

本發明之目的在於可於含有結束培養之菌體培養物與菌之狀態下直接使用。本發明之細菌於保存溫度5℃以下可有效保存2~3週左右之時間，藉由低溫輸送、冷藏庫保管，可有效的利用於蜜蜂、動物或植物之飼養、栽培。

可對結束培養之菌體培養物分開保管，並且添加葡萄糖或蔗糖之後進行凍結保管，從長期保存之觀點看是有效的。藉由將凍結之培養物原封不動的於-20℃以下保管，可保管6個月以上，並且長期地為蜜蜂、動物或植物之飼養、栽培而能有效利用。

結束培養之菌體培養物亦可乾燥之後進行使用。因菌之活力下降而具有導致效力下降之缺點，然而自長期保管可用於動植物之飼養、栽培之觀點看則較適合。對於乾燥方法雖無特別限定，但可使用例如噴霧乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥等。

本發明之細菌之培養物、菌體、或其等之處理物，可與使用目的(例如，養蜂用途、飼料用途、食品用途、肥料用途、醫藥用途、獸醫學用途、水產養殖用途)中所許可之賦形劑或載體一併使用。例如，作為可混合之物質，可列舉配合飼料、乳酸菌、桿狀菌、魚粉、穀物粉末、海藻粉末、無機物質粉末，並且若為可用於所期望之用途者，則可為任何種類。

2. 用於蜜蜂之用途

本發明之新型假單胞菌屬細菌於養蜂中疾病(尤其係腐蛆病及白堊病)之防除上有用。亦即，本發明係關於一種含有將有效量之新型假單胞菌屬細菌投與至蜜鋒或其幼蟲之步驟、及將作為病因之細菌、真菌或病毒(尤其係細菌或真茵)之蜜蜂的疾病去除之方法者。對將有效量之新型假單胞菌屬細菌向蜜蜂投與之方法並無特別限定，例如，可列舉向蜜蜂之幼蟲之餌(例如，砂糖液)添加新型假單胞菌屬細菌而進行攝食之方法、及向蜂箱等之生育環境中噴霧具有新型假單胞菌屬細菌之液體(例如，培養物之稀釋液)之方法等。尤其理想的是，於使用由蛋白腖、酵母萃取液、大豆蛋白腖所調配之固體培養基來培養新型假單胞菌屬細菌之情況下，藉由水或砂糖液來稀釋培養物，並向蜂箱噴霧或作為餌而使蜜蜂幼蟲進行攝食。有利的情況是，藉由新型假單胞菌屬細菌之投與而減少蜂幼蟲之疾病，並且提高幼蟲之生存率，故可使成蜂數大幅增加，此於實施例中可得到確認。

3. 用於動物之用途

本發明之新型假單胞菌屬細菌在對防除動物中之疾病(例如，由沙門氏桿菌症、輪狀病毒而導致之下痢及起因於其之成長不全)方面有用。此處，作為「防除」係包含治療、預防及抑制之概念。即，本發明係關於一種包含將有效量之新型假單胞菌屬細菌向動物投與之步驟，並且防除細菌、真菌或病毒為病因的動物的疾病之方法者。所謂「動物」，係指家畜(例如，牛、豬)、寵物、家禽(例如禽)、或人等。對於將有效量之新型假單胞菌屬細菌向動物投與之方法並無特別限定，例如，可列舉向動物之餌添加新型假單胞菌屬細菌而使家畜攝食之方法，及向動物之生育環境中噴霧含有新型假單胞菌屬細菌之液體之方法等。本案發明者等可實際確認沙門氏桿菌症之禽之抑制效果，及為嚴重成長不全原因之輪狀病毒導致的下痢之小牛之改善效果。進一步而言，亦可用於人體之健康食品中。

4. 用於植物之用途

本發明之新型假單胞菌屬細菌於防除植物中之疾病(例如，番茄之立枯病、芋頭類之瘡痂病)方面有用。此處，所謂「防除」係包含治療、預防及抑制之概念。即，本發明係關於一種含有將有效量之新型假單胞菌屬細菌施用於植物之步驟，並且將細菌、真菌或病毒為病因的植物的疾病之方法者。所謂「植物」係指蔬菜類、殼類等，具體而言，可列舉番茄、辣椒、花莖甘藍、芋頭類等蔬菜。對於將有效量之新型假單胞菌屬細菌向蔬菜施用之方法並無特別限定，例如，可列舉將有效量之新型假單胞菌屬細菌混合於土壤中之方法、及應用於植物體之方法、應用於種子之方法等。

此外，本發明係關於一種包含將有效量之新型假單胞菌屬細菌施用於植物之步驟並且促進植物之成長之方法者。本案發明者等確認於番茄、辣椒、及花莖甘藍中具有上述成長促進效果。對植物之施用方法按照如上所述內容操作。

〔實施例1〕〔假單胞菌‧馮斯MS-1株之單離及同定〕

1．本菌係自淡水環境所單離之菌株，並且具有以下所述之特徵。

2．形狀

桿菌、長度：1~3微米、運動性：有、胞子形成：無、革蘭氏染色：陰性、OF測試：-

3．生育程度

經過1~2天左右培養形成數mm之群體、色：薄茶色；光澤：無特別；表面：平滑；擴散性色素：無；pH：4.0(-)、5.0(+)、8.6(+)、9．0(+)、10.0(+)；溫度：中溫性7~45℃；NaCl：0~4%

4. 硝酸還原：-、脫氮反應：-、吲哚：-、硫化氫：-、檸檬酸：-、硝酸鹽利用：-、色素產生：-、脲酶：-、氧化酶：+、觸媒：+、DNAG+C內容物：68mol%

5. 16SrRNA之解析

於使用Sepa Gene試劑盒(三光純藥社製)而進行了核酸之萃取之後，藉由乙醇沉澱而回收核酸。對16SrRNA使用特異之2種共通引子而並未產生增幅，隨之，使用收集管(法瑪西亞公司製) 而進行精製。對所精製之PCR增幅產物，藉由應用生物系統377而對鹽基排列進行解析。其後，藉由光澤銀行(sheenbank)之數據庫而進行在線檢索。

以下，將Pseudomonas fons MS-1株之16SrRNA基因之鹽基排列作為對應之DNA資料而表示(表1)。

按照產業類別審查基準應用微生物工業改定版(專利廳編)之新種細菌之記載例，調查本菌之性狀，並基於Baumann(1984)而對其分類學上之位置進行討論，結果為並無與本菌相當之記載菌株，故而命名為Pseudomonas fons MS-1株。

本案發明者等將該菌株命名為假單胞菌‧馮斯MS-1株，並於平成20年9月18日作為獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物委託中心作為委託編號FERM-21673而受託。

〔實施例2〕〔假單胞菌‧馮斯MS-1株之病原細菌之增殖抑制能力〕

如下所示確認上述假單胞菌‧馮斯MS-1株具有抑制病原性細菌之增殖之能力。

於瓊脂培養基上預先塗抹的2根上述菌株的塗抹標本之間，移植沙門氏桿菌病菌Salmonella infantis、立枯病菌Ralstonia Solanacearum並於25℃下培養10天，其後將塗抹標本之間的病原菌的群體大小，與僅將病原菌作為對照區而進行培養之情況的群體大小進行比較，如表2所示，可抑制沙門氏桿菌、立枯病菌之增殖。表2中之「抑制率」係以百分率表示對照區培養基上之病原菌的群體的橫幅的大小，與試驗區之同菌的群體的相同大小之比。

進一步而言，以相同之方法亦可確認上述假單胞菌‧馮斯MS-1株具有抑制腐蛆病(Melissococcus plutonius及Paenibacillus larvae)與白堊病菌(Ascosphaera apis)增殖之能力。

〔實施例3〕〔假單胞菌‧馮斯MS-1株之病毒感染抑制能力〕

於自然界中，大量分佈有抑制病毒的感染，或者將病毒分解之細菌。於如上之自然界中，若使用抗生素則導致抑制病毒之細菌(抗病毒細菌)被消滅。另一方面，對於大多數抗生素而言，病毒保持有抵抗性。上述結果是，藉由使用抗生素，可將抗病毒細菌排除，因此病毒對其抑制要因較少之部分進行充分之感染、增殖。

養蜂時，藉由抗生素之使用，將腐蛆病菌等消滅，除此之外促進病毒之增殖，並且使病毒病流行之可能性增高。相同之情景於豚、禽、牛及魚之養殖時已經年發生。因此，於本研究中，對有用細菌MS-1株中之病毒抑制能進行測定。

如以下所述，可確認上述菌株假單胞菌‧馮斯MS-1株具有抑制病原性病毒之增殖之能力。再者，因尚無法培養作為蜜蜂之疾病原因之病毒，故作為保持外皮(capsid)之較相似之病毒，係採用禽流感病毒(H3N8)及傳染性造血器壊死症病毒(IHNV)作為對照病毒。亦即，病毒之惰性化，較多係起因於病毒外皮之分解、損傷導致，因此本實驗之結果為，啟示有含有蜜蜂之疾病原因之病毒較多具有病毒之惰性化。

首先，於狗之腎臟MDCK細胞之培養系統中，對上述MS-1株之培養上澄清液是否具有抑制禽流感之致病病毒即禽流感病毒(BUD/H3N8株)之感染作用進行測定。作用抑制效果係將抑制犬腎臟細胞的變性效果(CPE)的程度作為指標而進行判定。即，將犬之腎臟MDCK細胞置於1ml之液體培養基(含有10%牛血清成分、0.075%NaHCO₃、100IU/ml盤尼西林、100μg/ml鏈微素、1.6%Tris-HCl(pH7.8)含有)中，於25℃進行培養，並於其培養系統中，添加禽流感病毒(H3N8)培養液(0.1ml)及上述假單胞菌屬細菌MS-1株之培養上清液(0.1ml)。作為對照實驗，向上述培養系統中僅添加禽流感病毒(BUD/H3N8株)之培養液(0.1ml)。此處，所謂上述假單胞菌屬細菌之培養上清液，係將上述細菌於培養基中以25℃培養3天之後，進行旋落(4000rpm)而使菌體沉澱，並藉由0.22μm過濾器而過濾獲得之濾液。此外，作為禽流感病毒(BUD/H3N8株)之培養液，係指使用相同之上述培養液及犬之腎臟MDCK細胞而使禽流感病毒(H3N8)增殖後，藉由0.45μm之過濾器進行過濾而獲得之濾液。

經時測試添加上述菌體培養上清液後之CPE。CPE較低之情況，意味著即病毒之增殖受到抑制。將其結果分別表示於表3中，於添加有假單胞菌‧馮斯MS-1株之培養上清之情況下，禽流感病毒(BUD/H3N8株)之增殖受到抑制。

進而改變上述方法中之一部分，可確認假單胞菌‧馮斯MS-1株具有抑制傳染性造血器壞死症病毒(IHNV)之感染及增殖之能力。即，於上述方法中，使用鮭魚細胞(IHV)來取代禽流感病毒(H3N8)，並使用傳染性造血器壞死症病毒(IHNV)來進行調查，其結果為，假單胞菌屬細菌MS-1株培養上清液抑制了傳染性造血器壞死症病毒(IHNV)的增殖(表3)。再者，病毒之能力作為培養細胞感染價(TCID₅₀)而顯現。

〔實施例4〕〔腐蛆病菌對蜜蜂之攻擊試驗與假單胞菌屬細菌MS-1株之疾病防除效果〕

於閉鎖系統飼養室內設置3個網室，並於各個網室內個別導入蜜蜂的1個蜂群之總計3個蜂群，並進行飼養。對3個蜂群中之其中1個蜂群的蜂箱內噴霧投與MS-1株(投與群I)、對其他之1個蜂群，將MS-1株混合並投與至作為蜜蜂之餌料之砂糖液中(投與群Ⅱ)。而剩餘之一個蜂群則作為攻擊對照群，並未投與 MS-1株。於MS-1株投與期間中途對所有3個蜂群用腐蛆病菌進行攻擊，觀察攻擊後5週內之腐蛆疾病是否發作及蜂群之狀態(飼料攝取量、幼蟲數、幼蜂之狀態及成峰之活動狀態等)。其結果為，對於飼料之攝取量而言，3個蜂群中並無不同之處。而且，腐蛆病原菌之攻擊後，輕度地導致暫時性的幼蜂混亂是於3個蜂群中共通的，並且其數量有若干減少，但並未發現腐蛆病於MS-1株投與群中產生病症，而於攻擊對照群中則產生病症。亦即，於投與有用細菌之2個蜂群中，並未發現腐蛆病產生病症。

藉由如上所述可明瞭，藉由蜂群中之有用細菌MS-1株則可有效的防除腐蛆病之疾病(表4)。

〔實施例5〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株防除白堊病〕

將蜂群分裝於8個蜂箱，並將MS-1株之液體培養液稀釋液(稀釋為1/10倍)噴霧至蜂之蜂箱中，經由2個月來觀察白堊病之產生狀況。其結果為，於噴霧有MS-1株之蜂箱中，白堊病之發作受到抑制(表5)。表5之蜂蛆數之值，以將各實驗區4箱中的數量平均後所獲得之值表示。

〔實施例6〕〔假單胞菌‧馮斯MS-1株之蜜蜂之成長促進效果〕

對於上述保持高抗菌力之MS-1株，將其培養菌液混合於餌、水中，並投於蜂蜜中，從而測定針對整個蜂蜜之影響。

實驗時間約為2個月，實驗地點設在宮崎縣綾町及同縣之小林市，對於菌之投與採用以1天為單位，每日對蜜蜂進行檢測。上述投與試驗之結果為，判定於設置於6個部位之菌株投與區中發現對餌及水之攝取量存在少許之差異，而與對照區相比，於全部之菌株投與試驗區中，蜜蜂之健康程度並無問題，此外，發現蜂數有增加之傾向(表6)。表6之蜂數表示為每枚巢框(箱體)之平均值。

〔實施例7〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株之養禽之疾病防除與成長促進效果禽之飼養試驗中之體重增加〕

將出生後8天之禽雛(名古屋交趾禽)，每一區分別放入10隻，進行13天為止之6天之飼養試驗。

各區之構成係添加生菌量：5%(表7-1)、無添加生菌(表7-2)。

作為基礎飼料採用無混合有抗菌性之飼料(Balance up 18、日本配製飼料社製造)。

〔投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之雛禽之觀察項目之結果〕

食慾：良好

糞便性狀：固體狀(良好)

活力：良好

羽毛之光澤等：良好

飼料攝取量及體重：表7-1及表7-2(體重隨情況良好而增加)

剖檢(病理性狀之有無)：無肝臟之變色、萎縮、過剩之脂肪蓄積等

無腹部膨脹

無腎臟之結石等

無腸壁之異常

〔疾病防除效果〕

將小禽100隻分為2群，對其中1群投與假單胞菌‧馮斯MS-1株，而對另外1群未投與菌株。而且，將病原性沙門氏桿菌(Salmonella infantis)混合於配合飼料並向小禽投與後，於投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之小禽中，因沙門氏桿菌病而發作之小禽隻數大幅减少(表8)。

〔實施例8〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株而抑制小牛之下痢之效果〕

於小牛中，存在由輪狀病毒而產生下痢且難以進行食物之消化，因此導致成長顯著停滯之弊害。在此，於牛奶500ml混合100ml之假單胞菌‧馮斯MS-1株培養液而對小牛投與。即，將30頭小牛(黒毛和牛、生後約30天)分為3群，進行對第1群投與一次假單胞菌‧馮斯MS-1株、對第2群投與2次、對第3群並未投與之實證試驗。其結果為，於投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之小牛中，下痢症狀得到顯著地改善(表9)。

〔實施例9〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株之蔬菜之栽培試驗(成長促進與疾病防除效果)(表10，11)〕

將番茄之苗20棵以10棵為單位分為2群而進行栽植。其次，將假單胞菌‧馮斯MS-1混合於土壤中(10%)，並將其中25g施加於1群之10棵番茄之各苗之根圈，對另外1群並無施用菌株。而且，對於上述番茄測定3週後之成長(表10)。其結果為，可知投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之番茄之成長得到促進。

對2群上述經過3週之番茄，將立枯病菌(Ralstonia solanacearum)之菌液10⁸細胞/ml)20ml之量投與至整個番茄的根圈，並判定有無立枯病菌發生。其結果可明瞭，於投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之番茄中，疾病之發生得到抑制(表11)。

〔實施列10〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株之辣椒之栽培試驗〕

將辣椒之苗120棵(平均之主莖長10.8cm)以每60棵為單位分為2群而進行栽植。其次將假單胞菌‧馮斯MS-1株(10%)混合於土壤中，並將其25g施用於第1群之辣椒60棵之各苗之根圈，對第2群之60棵並未施用菌株。而且，對上述番茄測定4週後之成長(表12)。其結果可知若投與假單胞菌‧馮斯MS-1株則可促進辣椒之成長。

〔表12〕

〔實施例11〕〔藉由假單胞菌‧馮斯MS-1株之花莖甘藍之栽培試驗〕

花莖甘藍之種子約200個分為2群，將第1群之100個以置於網眼細小之網之狀態，浸漬於假單胞菌‧馮斯MS-1株液中30分鐘。對第2群之種子約100個並無浸漬。將上述種子置於含水之海綿塊上，並放置2週。其結果可知來自海綿塊上之花莖甘藍之種子發芽並且花莖伸展，故可對其莖之長度進行測定，且浸漬於假單胞菌‧馮斯MS-1株之種子發芽後之花莖成長較快(表13)。

〔實施例12〕〔芋頭類之瘡痂病之防除〕

於芋頭類(尤其係馬鈴薯)中，全國範圍內因放線菌(Streptomyces scabies，S.acidiscabies)而導致瘡痂病蔓延。因上述疾病自芋頭之表面感染並且於內部造成空洞，導致產生芋頭之生產量減小與味覺感降低之弊害，並且使商品價值下降。對於本疾病而言藥劑之效力較低。因此，將馬鈴薯之種子200個以100個為單位分成2組而進行栽植，並進行如下之試驗。即，假單胞菌‧馮斯MS-1株(10%)混合於土壤中，並將其50g施用於第1組馬鈴薯之種子100個，施用於各種芋頭之周圍，並未對另一組施用菌株。而且，對於上述馬鈴薯測定3個月後有無疾病(表14)。其結果可明瞭於投與假單胞菌‧馮斯MS-1株之馬鈴薯中，瘡痂病之產生受到抑制。再者，自作為種子之芋頭增加10個以上的芋頭。因此，將自1個種芋所增加的芋頭設為1群，並對100個種芋所衍生出之100群之芋頭測定有無患有瘡痂病。

〔實施例13〕〔假單胞菌‧馮斯MS-1株之固體培養方法〕

將大豆粉800g、米糠200g、酵母萃取物4g、蒸餾水1000ml混合而製作成固體培養基，並於121℃下進行15分鐘加之熱滅菌。於上述固體培養基中，添加以液體培養基(大豆蛋白腖5g、酵母萃取液3g、磷酸二鉀0.2g、蒸餾水1000ml、pH7．2~7.4)而培養之MS-1株培養液50ml並進行混合，並進行4天之培養。其結果為，固體培養而成之MS-1株之菌數/g，為液體培養而成之菌數/g的10~100倍(表15)。

此外，可將上述固體培養方法應用於普通之細菌用之培養基中。例如，即便於製作大豆蛋白腖5g、酵母萃取物3g、磷酸二鉀0.2g、蒸餾水1000ml、pH7.2~7．4之培養基並於其添加數10g(例：20~50g)之矽藻土(浮游植物類矽藻之外側之殼)等之無機粒子(粒径約10μm)，震盪之後進行培養之情況下，假單胞菌‧馮斯MS-1株之菌體量亦大幅增加。相同地，於添加有沸石等之無機物質之粒子之情況下，亦相同地菌體量增加(表16)。

再者，本發明之Pseudomonas fons MS-1可根據以下的菌株分類國際標準方法來鑑定，而得到與以往類似菌種之間的特徵，因而，被歸類為一種新型假單胞菌屬細菌：

1. 依據Okuzumi et al.(1981)分析法， MS-11菌株：格蘭氏染色屬陰性

MS-1菌株：具運動性

MS-1菌株：無擴散性色素

MS-1菌株：具氧化葡萄糖功用

2. 16SrRNA基因分析法/使用二種分析法

DNA was extracted with InstGene Mtix(Biorad,USA)

Primer STAR HS DNA Polymerase(TAKARA Bio,Japan)

以下為本發明之Pseudomonas fons MS-1菌株與以往類似菌種的比較表：

<110> 日本生技股份有限公司

<120> 新型假單胞菌屬細菌

<140> TW 098141083

<141> 2009-12-02

<150> JP 2008-315559

<151> 2008-12-11

<160> 1

<210> 1

<211> 1403

<212> DNA

<213> 桿菌

<400> 1

Claims

一種細菌，係屬於假單胞菌‧馮斯(Pseudomonas fons)MS-1株(委託編號FERM P-21673〕，具有可抑制病原性之細菌、真菌及病毒對蜜蜂、動物或植物感染及增殖之能力。
一種蜜蜂、動物或植物感染病原性細菌之抑制劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種蜜蜂、動物或植物感染病原性真菌之抑制劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種蜜蜂、動物或植物感染病原性病毒之抑制劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種蜜蜂或動物之成長促進劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種植物之成長促進劑，係含有申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種用於蜜蜂、動物或植物之疾病防除劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種用於蜜蜂或動物之飼料或飼料添加劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種用於蜜蜂或動物之食物或食物添加劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種肥料或肥料添加劑，係含有如申請專利範圍第1項所述之細菌。
一種如申請專利範圍第1項所述之細菌之培養方法，其特徵在於，係使用由固形粉末配製而成之固體培養基而進行培養。