TWI399382B

TWI399382B - 突變型雞傳染性華氏囊病病毒ｖｐ２蛋白及其用途

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Publication number: TWI399382B
Application number: TW97145265A
Authority: TW
Original assignee: Nat Univ Chung Hsing
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2013-06-21
Also published as: TW201020263A

Description

突變型雞傳染性華氏囊病病毒VP2蛋白及其用途

本發明係關於經定點突變產生之突變型雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白質，該突變型VP2蛋白質具有較野生型更佳的產量及免疫原性。本發明進一步關於該等突變型VP2蛋白質用於IBDV檢驗，及製造疫苗之用途。

傳染性華氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)是造成雞隻傳染性華氏囊病變(infectious bursal disease,IBD)的病原，其疫情開始於1962年美國甘保羅郡(Gumboro)，故又稱為甘保羅病變(Nick等人，J.Virol. 18：227－234,1976)。傳染性華氏囊在病毒學分類上屬於Birnaviridae 病毒科Aviberinavirus 病毒屬，其於病毒鞘蛋白(capid)外殼並無封套(envelope)包裏，病毒形態呈T＝13之右旋對稱的二十面體(icosahedral symmetry)，粒徑約61－65 nm(Ozel與Gelderblom,Semin Cell Biol 5：83－93,1985)，其單層之外鞘結構是由外側VP2蛋白以及位於內側的VP3蛋白所構成，另外內側還有少量的蛋白VP1、VP4及非結構性蛋白VP5(Mundt等人，J.Virol. 71：5647－5651,1997)。內部具有兩段雙股RNA片段(Kibenge等人，J.Gen.Virol. 69：1757－1775,1988)，病毒主要分為兩種血清型，其中血清I型主要感染幼雞；血清II型主要感染火雞，並無病原性(Wyeth與Cullen，Vet Rec 102：362－363,1978；Okoye與Uzoukwu，Avian Dis 25：1034－1038,1981)。

當幼雞遭受傳染性華氏囊病毒感染後，病毒會針對雞華氏囊組織中的B淋巴細胞(lymphocyte)進行破壞，使該組識受到損傷而導致雞隻免疫能力降低(Fahey等人，J.Gen.Virol. 70：1473－1481,1989)，因此其他感染性疾病趁機感染產生，如新城病(Newcastle disease,ND)及馬立克病(Marek’s disease,MD)，造成養雞業嚴重的經濟損失(Wyeth與Cullen，1978，如前述)。受到傳染性華氏囊病毒感染後雞隻會有下痢、精神不振、羽毛鬆散、色澤不佳、食慾不良、體重減輕等病徵，且其病毒增殖主要在華氏囊中，因此受病毒感染的華氏囊經常會有發炎腫大甚至出血的現象。以目前防治傳染性華氏囊病毒的方法而言，一般除了給予非病原性病毒株(avirulent strain)來免疫雞隻外，亦可藉由死毒或馴化活毒病毒株來免疫母雞，再以其所產生的抗體來保護小雞，但活毒疫苗仍然可能破壞華氏囊細胞而降低免疫反應進而造成反效果(Macreadie等人，Vaccine 8：549－552,1990)。

傳染性華氏囊病病毒的基因組包含兩段雙股RNA片段，分別是大片段A(segment A)和較小片段B(segment B)，其中片段A含有兩個開放讀碼區(open reading frame,ORF)，當中較大的ORF A1(約3.4 kb)會轉譯出分子量約110 kDa的多蛋白(polypotein)，經截切後產生各自獨立的pVP2蛋白(52 kDa)、VP3蛋白(32 kDa)及VP4蛋白(28 kDa)(Hudson等人，Nucleic Acids Res 14：5001－5012,1986)。小股片段稱為segment B，長度為2.9 kb，可轉譯出一個約90 kDa的蛋白產物VP1。VP1是雙股RNA－依賴性RNA polymerase(Morgan等人，Virology 163：240－242,1988)，與VP3蛋白結合形成VP1－VP3複合體，協助VP1蛋白加入所組裝的病毒顆粒，在病毒的複製過程扮演重要角色(Maraver等人，J.Virol. 77：2459－2468,2003)。

pVP2是VP2的前驅物，經過適當的蛋白裂解過程，成為分子量約42 kDa的VP2，即是成熟的VP2(VP2－441)蛋白，在整個病毒組成中又以VP2蛋白含量約佔51%最多，為傳染性華氏囊病毒主要結構蛋白之一，也是主要的宿主保護性抗原，可以誘發宿主產生具病毒中和能力的抗體(netralizing antibody)保護雞隻(Becht等人，J.Gen.Virol. 69：631－640, 1988；Azad等人，Vaccine 9：715－722,1991；及Wang等人，Biotechnol Bioeng 67：104－111,2000)。根據過去幾年的研究結果指出IBDV的中和抗體決定位可分為二種，第一種為結構依賴型的；第二種為非結構依賴型的，其中第一種結構依賴型的在之前的研究亦利用過單株抗體及噬菌體表現法(phage display)，在VP2蛋白的高度變異區胺基酸位置206－350，找到與構形相關的(conformational dependent)抗原決定位(Cui等人，J Virol Methods 114：109－12,2003；Heine等人，J.Gen.Virol. 72：1835－43,1991；Yamaguchi等人，Arch Virol 141：1493－507,1996)。第二種非結構依賴型的也在VP2找出兩段序列分別是胺基酸位置197－209及329－337，是具有中和能力的線性抗原決定位(linear epitope)，並沒有特殊的立體空間構形，其中197－207是在高度變異區的N端，並與胺基酸206－305形成的結構依賴型的抗原決定位重疊了4－6個胺基酸(Wang等人，Viral Immunol 18：549－57,2005)。

本發明首先利用點突變對VP2－441次病毒顆粒上之His－249與His－253進行取代，並探究其對於VP2次病毒顆粒之組裝及免疫原性的影響。本發明揭示，His249與His253的點突變並不影響次病毒顆粒的形成，且可增進原始VP2次病毒顆粒之免疫原性，並對於雞隻都有100%的保護效果，故可有效應用於雞傳染性華氏囊病病毒之診斷及疫苗防治。

本發明目的及優點將部分描述於下，或可由描述中顯而易見。

本發明之一目的為，提供一種雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白質變體，其位於成熟的VP2(VP2－441)蛋白胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成其他胺基酸，其中該VP2蛋白質變體仍保持可組裝成次病毒顆粒(Subviral Particle,SVP)的能力。於一項具體態樣中，該位於胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成丙胺酸。

本發明另一目的為，提供用於偵測雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)抗體存在之診斷試劑，其包含雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白質變體H249A、H253A或H249.253A，及偵測用緩衝劑與次級抗體(抗－雞血清抗體)。

根據本發明之又一目的，係關於一種用於保護雞隻對抗雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)之疫苗，其包含位於成熟雞傳染性華氏囊病病毒VP2(VP2－441)蛋白胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成其他胺基酸的VP2蛋白質變體，及獸醫學上可接受之佐劑或賦形劑。於一項具體態樣中，該VP2 蛋白質變體係選自H249A、H253A及H249.253A其中一者。

本發明的其他特性將在下面詳細揭示具體實施例觀察後變得顯而易見。

本發明將詳細描述特殊的具體實施例。這些具體實施例經由發明解釋提供，並非意欲用以限制本發明。在發明的範圍及精神內，本發明存在傾向於包括這些及其他變更及變動。

實施例 實施例1. VP2－441之點突變蛋白於昆蟲桿狀病毒系統表現

將本實驗室所構築已含有編碼VP2－441定點突變蛋白之DNA的大腸桿菌表現質體TOPO－VP2－441 H249A、TOPO－VP2－441 H253A和TOPO－VP2－441 H249.253A(彼等係利用由台灣傳統株p3009中構築好部份VP2基因於pCRT7/CT－TOPO質體上的TOPO－1323當做PCR的模板，設計具有部分序列重疊的正反向引子，並在欲突變之胺基酸位置的核甘酸序列置換成側鏈不具官能基、不帶任何正負電荷且較不影響蛋白質摺疊的丙胺酸(Alanine)來置換胺基酸位置249以及253上的組胺酸(Histidine)而得)，及桿狀病毒轉移質體pBlueBac4(購自Invitrogen公司)以限制酵素NheI 與EcoRI 切割後，以TAE瓊酯凝膠電泳進行割膠回收目標基因(target gene)及桿狀病毒轉移質體pBlueBac4骨架，經PCR clean－up kit(Genemark Technology Co.,Ltd.,Taiwan)分別純化回收，並加入T4 DNA ligase(Promega)等，於16℃進行接合作用(ligation)。與桿狀病毒DNA共同轉染(co－transfection)細胞Sf －9 ，進行同源重組交換(homologous recombination)得到重組桿狀病毒，經病毒溶斑試驗(plaque assay)取得各種突變重組桿狀病毒H249A、H253A和H249.253A。之後將重組病毒以MOI 10感染表現量較高的Hi5細胞，當細胞存活率在65－75%時收取感染後的細胞沈澱物(cell pellet)破細胞離心取可溶性蛋白先進行12.5% SDS－聚丙烯胺凝膠電泳再以考馬斯亮藍染色，確定重組蛋白是否有正確表現，結果可於12.5% SDS－聚丙烯胺凝膠上看到各個點突變之蛋白確實與未突變之VP2－441蛋白大小相符合(如圖1所示)，由圖1粗估突變蛋白之產量比未突變之VP2－441蛋白高出兩倍以上。

接著以蔗糖梯度離，心分離法(Sucrose gradient centrifugation)純化，浮力密度約為1.19 g/cm³ ，而各個點突變之蛋白以上述方式純化分析後所得到之浮力密度均相同，因此可確定重組蛋白並未因點突變而導致其物理特性改變。而且，將其於穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，JEOL JEM 1200EX－2,日本)下觀察，可觀察到粒徑約23~25 nm的次病毒顆粒(結果參見圖2)。

由此等結果表示，經點突變後之VP2重組蛋白不論在蛋白分子量大小，或是物理特性以及顯微觀察等方面，都與未經突變之野生型VP2－441蛋白的物性分析結果相同，且亦證明不論是H249或H253的點突變，都不影響以昆蟲桿狀病毒表現之VP2次病毒顆粒自行組裝的能力。

實施例2. VP2重組蛋白質變體與單株抗體之吸附分析

為證實VP2蛋白之胺基酸H249與H253這兩個位置的突變，會導致次病毒顆粒的免疫原性(immunogenicity)改變，於是利用不具中和性的單株抗體一號(Mab SVP－1)，以及具中和性的單株抗體四號(Mab SVP－4)(單株抗－VP2抗體是以昆蟲桿狀病毒表現系統表現之IBDV VP2－441重組蛋白作為抗原，委由濁水溪生物科技公司(台灣，桃園)以融合瘤細胞(hybridoma cell)經篩選後得到數個不同的單株抗體，而本實驗所使用的是其中的Mab SVP－1、Mab SVP－4)與重組蛋白進行酵素連結免疫分析法(ELISA)。將純化定量後之重組蛋白加入96孔盤中(EIA/RIA strip plate,Costar)，每個孔洞加入0.5 nM，再加入200 μl碳酸鹽－碳酸氫鹽緩衝液(1.56 mM Na₂ CO₃ ,1.36 mM NaHCO₃ ,pH 9.6)，於4℃作用16小時進行蛋白吸附反應。之後以5%的脫脂牛奶在37℃進行封阻(blocking)1小時，接著以PBS－T(0.1% Tween 20 in PBS)清洗3次，之後每個孔洞分別加入100 μl一級抗體(稀釋倍數從4000x~128000x，一級抗體分別為單株抗體一號及四號)於4℃反應2小時之後，同樣以PBS－T清洗3次，再加入200 μl的二級抗體(稀釋倍數5000x，二級抗體山羊抗－小鼠Conjugated Horseradish Peroxidase，Jackson)於4℃反應2小時後，同樣以PBS－T清洗3次，隨即每孔加入100 μl的ABTS(ABTSPeroxidase Substrate,KPL,USA)呈色劑反應10分鐘後，以酵素免疫分析儀(Dynex Technologies,Chantilly,Virginia,USA)讀取OD 405 nm之吸光值。

由圖3之結果顯示，不論胺基酸H249或H253位置突變成丙胺酸(Ala)經由單株抗體一號以及四號所辨認出來的訊號都比未突變的VP2－441被辨認的訊號高，在單株抗體一號的部份高出約2倍，而單株抗體四號的部份則高出約1.4倍。由於此實驗結果顯示不論具中和性的單株抗體或不具中和性的單株抗體對於H249或H253點突變的重組蛋白之結合力都比未突變的VP2－441高，因此推論H249或H253點突變的重組蛋白具有比野生型VP2－441更能誘發雞隻產生中和性抗體之能力，且具有更靈敏偵測抗－IBDV VP2抗體之能力，可有效用於檢測雞血清中抗－IBDV抗體之存在。

實施例3. 重組次病毒顆粒之免疫原性分析

為進一步證實H249和H253點突變的次病毒顆粒能誘發雞隻產生具保護力的中和性抗體，並且比未突變的VP2－441次病毒顆粒更能誘發雞隻產生中和性抗體之能力，遂取定量後的VP2－441、VP2－441－H249A、VP2－441－H253A、VP2－441－H249.253A作為免疫抗原，並以施打緩衝溶液PBS作為陰性對照組，將二週齡的無特定病原(specific pathogen free,SPF)的幼雞，每隻幼雞施打10克的VP2抗原，經過四週的免疫，評估所施打之重組蛋白誘發雞隻產生特定抗VP2之抗體力價(VP2－specific antibody)，評估方法是以AC－ELISA(antigen capture ELISA)測定免疫雞隻血液中產生可辨識VP2次病毒顆粒的特異性抗體。先於96孔盤上吸附經純化後的次病毒顆粒(VP2－441 SVP)，每個孔洞0.1 μg，於4℃作用8小時，再加入5%脫脂牛奶於4℃下反應60分鐘，之後以PBS－T緩衝溶液清洗5次，再加入經兩倍系列稀釋的血清，於4℃下反應4小時，後以PBS－T清洗5次。加入稀釋5000倍的HRP－conjugated goat anti－chicken IgG(H＋L)，於4℃下反應4小時，之後以PBS－T清洗5次。最後每個孔洞加入100 μl的ABTS(ABTSPeroxidase Substrate,KPL,USA)呈色劑反應10分鐘後，以酵素免疫分析儀(Dynex Technologies,Chantilly,Virginia,USA)讀取OD 405 nm之吸光值。血清中之VP2－specific IgG力價的決定，視各系列稀釋的血清樣品反應呈色後，於405 nm下所讀取的吸收值，取最接近背景吸收值且高於背景吸光值0.1單位，該血清稀釋倍數的倒數即為該血清之VP2－specific IgG力價。其中背景組是不吸附次病毒顆粒。

根據圖4的AC－ELISA結果顯示，免疫前(preimmune)無特定病原幼雞血液中的VP2抗體平均效價為6，施打次病毒顆粒VP2－441、VP2－441－H249A、VP2－441－H253A及VP2－441－H249.253A從免疫後第一週至第四週的VP2抗體平均力價(mean titers)均有隨著免疫週數的增加而逐漸升高的趨勢，由免疫後第四週之血清可測得免疫VP2－441之平均力價為3200，VP2－441－H249A之平均力價為2987，VP2－441－H253A之平均力價為10240，VP2－441－H249.253A之平均力價為3840。而施打緩衝溶液PBS，其VP2抗體平均力價為90。由AC－ELISA的結果可發現除了VP2－441－H253A外其他點突變之次病毒顆粒所免疫之雞隻，血清中之VP2特異性抗體力價均與未突變之VP2－441力價相近，而VP2－441－H253A之力價則分別比VP2－441高3.2倍；比VP2－441－H249A高3.4倍；比VP2－441－H249.253A高2.7倍。

為進一步確定VP2次病毒顆粒之特異性抗體對雞隻的保護力，本實驗以中和抗體試驗(neutralization assay)測定免疫雞隻血液中的中和抗體力價(neutralization antibody titer)。將免疫雞隻後每週所收集的血清，先於56℃不活化30分鐘。取生長培養液加至96孔組織培養盤中，每個孔洞加25 μl，再加入25 μl經不活化處理的血清與GM培養基混合進行2倍序列稀釋，連續稀釋至4096倍稀釋度。之後再將50 μl 200TCID₅₀ (tissue cell infection dose)的IBDV病毒液(P3009 strain)加至每個孔洞，於37℃中作用1小時，使血清與IBDV作用，最後每個孔洞再加入50 μl(2 x 10⁴ cell/well)雞胚胎纖維母細胞，置於39℃培養72小時，期間持續觀察是否有細胞病變(cytopathic effect)發生。感染後72小時，除去上清液加入結晶紫(crystal violet)染色，如細胞存活則可被染劑染色，藉此法判讀血清中將病毒中和的血清抗體力價，維持細胞存活之最高血清稀釋倍數即為中和抗體力價。結果列示於圖5。

結果顯示，免疫後第二週到第四週，施打VP2－441、VP2－441－H249A、VP2－441－H253A及VP2－441－H249.253A抗原所得到的血清中，其中和抗體力價有隨時間逐漸升高的趨勢。相反地，施打PBS的對照組，中和抗體力價低於2。由上述結果推測VP2持異性抗體的增加與中和抗體力價應該具有相關性。且於第四週免疫VP2－441－H249A之中和抗體力價約1792，VP2－441H253A約3072，VP2－441約1536而VP2－441－H249.253A約為2048，其中VP2－441H253A比VP2－441高約2倍。由上述兩項分析結果顯示，VP2－441－H253A所免疫之雞隻可以產生之VP2特異性抗體與中和抗體力價均較VP2－441高。

在免疫四週後，我們進行雞隻攻毒試驗，每隻雞以100 LD₅₀ 之vvIBDV病毒劑量進行口服感染雞隻，每天觀察雞隻病徵和死亡率，感染3天後取雞隻華氏囊進行分析，評估攻毒後雞隻的臨床症狀及華氏囊中病毒之增殖情況(結果參見圖6)。首先施打VP2－441、VP2－441－H249A、VP2－441－H253A及VP2－441－H249.253A的四組雞隻，攻毒後並沒有出現感染症狀且無雞隻死亡，華氏囊中亦沒有偵測到病毒(如圖6所示)，保護力達100%。但是施打PBS的對照組則有2隻雞在感染後第三天死亡，而另一隻則出現精神沈鬱、食慾差、羽毛失去光澤且豎立、排出黃白色帶綠色的下痢便，及無法站立、不斷哀鳴、嗜眠等重大病徵，並且在華氏囊中偵測到病毒的抗原，顯示施打的PBS無法誘發有效抗體，達到保護雞隻的效果。

由前述之結果綜合推論，His249與His253的點突變並不影響次病毒顆粒的形成，且在免疫原性方面，His249與His253的點突變會導致與單株抗體一號及四號的吸附能力變高；以及H253A可誘導雞隻產生較其他點突變蛋白或原始VP2－441蛋白高的中和性抗體力價；而且不論是突變His249或His253的VP2－441蛋白免疫後，對於雞隻都有100%的保護效果，故可有效應用於雞傳染性華氏囊病病毒之診斷及疫苗防治方面。

圖1列示重組VP2蛋白變體於昆蟲細胞之表現。重組病毒感染昆蟲細胞Hi－5後收取細胞沈澱物，利用超音波震盪器破細胞，經由離心後取上清液(lysate)稀釋100倍後，1和2分別是各取20 μl及30 μl進行12.5% SDS－聚丙烯胺凝膠電泳再以考馬斯亮藍(Coomassie blue)進行染色。

圖2係以穿透式電子顯微鏡觀察次病毒顆粒的結果。將蔗糖超高速離心(Sucrose gradient centrifugation)純化的蛋白以100 kDa濃縮膜濃縮後，將樣品滴於銅網上並以2%醋酸鈾負染色，利用穿透式電子顯微鏡(JEOLJEM 1200 EX－2)觀察，圖A為VP2－441；圖B為H249A；圖C為H253A；圖D為H249.253A。由圖可觀察到外觀呈現正二十面體的次病毒顆粒結構，粒徑大小約為23~25 nm左右，比例尺為50 nm。

圖3列示重組蛋白與單株抗體之吸附分析。以不具中和性的單株抗體一號以及具中和性的單株抗體四號與未進行點突變的VP2－441蛋白及點突變後的重組蛋白進行吸附實驗，BSA為負對照組。圖A為利用不同稀釋倍數之單株抗體一號進行吸附；圖B為利用不同稀釋倍數之單株抗體四號進行吸附；圖C為一號抗體與四號抗體稀釋16000倍的實驗組。

圖4列示雞隻免疫各種VP2－441蛋白後產生之抗體反應。每個組分別為免疫VP2－441次病毒顆粒或VP2－441點突變後之次病毒顆粒，以及負對照組為免疫PBS。血清樣品為免疫前以及免疫後每週採集之血清，共採四週。VP2特異性抗體力價測定為次病毒顆粒(VP2－441)抗原吸附於96孔盤上，再利用ELISA方式測定。

圖5列示雞隻免疫各種VP2－441蛋白後產生之中和性抗體反應。每個組分別為免疫VP2－441次病毒顆粒或VP2－441點突變後之次病毒顆粒，以及負對照組為免疫PBS。血清樣品為免疫前以及免疫後每週採集之血清，共採四週。中和性抗體力價之判定為血清序列稀釋後加入IBDV P3009反應1小時後再加入DF－1細胞感染69小時後，DF－1細胞未出現細胞性病變效應(CPE)之最高稀釋倍數。

圖6為利用西方墨點法分析攻毒後的華氏囊液中IBDV病毒之存在。由左到右分別是marker以及Lane 1為VP2－441 internal marker；Lane 2為vvIBDV病毒；Lane 3為不施打抗原僅注射PBS；Lane 4為施打VP2－441為抗原；Lane 5為施打H249A為抗原；Lane 6為施打H253A為抗原；Lane 7為施打H249.253A為抗原。所用的一級抗體是多株抗體α－VP2 CNC，次級抗體為AP－conjugate goat anti－rabbit抗體。

<110> 國立中興大學

<120> 雞傳染性華氏囊病(IBD)之ELISA診斷套組及其使用方法

<160> 1

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 傳染性華氏囊病病毒

<400> 1

Claims

一種雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白質變體，其位於成熟的VP2(VP2-441)蛋白胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成其他胺基酸，其中該VP2蛋白質變體仍保持可組裝成次病毒顆粒(SVP)的能力，其中該成熟的VP2(VP2-441)蛋白之胺基酸序列係如SEQ NO.1所示。
根據申請專利範圍第1項之VP2蛋白質變體，其中該位於胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成丙胺酸。
根據申請專利範圍第2項之VP2蛋白質變體，其係選自突變蛋白VP2-H253A、VP2-H249A及VP2-H249.253A。
一種用於偵測雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)抗體存在之診斷試劑，其包含雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白質變體H249A、H253A或H249.253A，及偵測用緩衝劑與次級抗體(抗-雞血清抗體)，其中該VP2(VP2-441)蛋白之胺基酸序列係如SEQ NO.1所示。
根據申請專利範圍第4項之診斷試劑，其中該VP2蛋白質變體係選自突變蛋白VP2-H253A、VP2-H249A及/或VP2-H249.253A。
一種用於保護雞隻對抗雞傳染性華氏囊病病毒(IBDV)之疫苗，其包含位於成熟雞傳染性華氏囊病病毒VP2蛋白胺基酸位置249及/或253之組胺酸被置換成其他胺基酸的VP2蛋白質變體，及獸醫學上可接受之佐劑或賦形劑，其中該成熟雞傳染性華氏囊病病毒VP2(VP2-441)蛋白之胺基酸序列係如SEQ NO.1所示。
根據申請專利範圍第6項之疫苗，其中位於該VP2蛋白質變體中之胺基酸位置249及/或253之組胺酸為丙胺酸。
根據申請專利範圍第6之疫苗，其中該VP2蛋白質變體係VP2-H249A、VP2-H253A或VP2-H249.253A。