TWI334784B - Compositions and methods for suppression of amyloid plaque formation associated with neurodegenerative disorders - Google Patents

Description

九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般而言係關於抑制φ / p f j中松神經系統（CNS)中淨澱 粉狀-β (Αβ)肽產生之方法， 、 且更具體而言係關於使用導蛋 白-1肽治療或預防諸如阿茲洛 J鉍海默氏病之神經退化疾病之方 法0 【先前技術】 阿兹海默氏病（AD)係癡呆之最常見形式，其係漸進性神 經退化疾病，特徵在於A肽在老年斑點中之細胞外沈積、 神經細胞内神經纖維缠結、突觸喪失及認知力降低。人們 廣泛認為，Αβ這-極易形成寡聚物及聚集體之小狀之積聚 係AD發病機理中之主因。Αρρ由包括α、…分㈣之蛋 白酶男切，產生搬粉狀_β (Αρ)肽，其係與阿兹海默氏病有 關之澱粉狀蛋白質斑點之主要組份。 Αβ衍生自跨膜蛋白質Αρρ之蛋白酶剪切。儘管人們已對 之相互作用蛋白質及其衍化有相當多的瞭解，但對於 術及其相關家族成員ApLp i及ApLp2 (殿粉狀前體樣蛋白 質1及2)之生理作用仍知之甚少。人們已主張App係於細胞 黏附及運動性以及突觸傳遞及可塑性中作用。App之選殖 ，特性化顯示’其具有許多使人聯想到膜銷定受體之特 徵。與此理解相一致，App被認為係一單一跨膜G蛋白質 偶合受體。儘管已證明數種分子可與App結合，例如膠肩 蛋白（I型及IV型）、硫酸乙醯肝素蛋白聚糖、層黏連蛋白及 峨月曰醯肌醇蛋白聚糖），然而，迄今尚未出現作為引發A?? J20248.doc ::信號轉導之主要配體之明確候選物質。這至少部分係 為仍未完全瞭解由App介導之信號轉導。 因此^需識別與APP、结合並調介App信號料及繼 之刀子。本發明符合該需要’且提供相關優點。 【發明内容】 ‘‘ 、本發明提供—種藉由向個體施用量之導蛋白]多肽 降低或抑制與阿茲海默氏病有關之淨β-澱粉狀肽產生及 澱粉狀蛋白質斑點生成之方法，宜 產生及 。 土取心刁凌具中該導蛋白-1多肽包含 =。」之ΑΡΡ蛋白質結合及b)抑制Αβ肽產生之胺基酸 列。導蛋白]多肽具有足以使導蛋白]多肽與Αρρ蛋白 專一性結合之胺基酸序列。導蛋白-1多肽可藉由改變盥 二信號途徑有關之細胞内蛋白質之定位、蛋白質·蛋白質 結合或酶促活性而模擬導蛋白]介導之信號轉導。本發 :亦提供—種藉由向個體施用-定量之導蛋白-1治療劑以 之方t抑制與阿4海默氏病有關之澡粉狀蛋白質斑點生成 ^ /、中°玄導蛋白_ 1治療劑包含可a)與天然之APP蛋 裊、° δ及b)抑制AP肽產生之胺基酸序列。 【實施方式】 本發明部分係基於以下發現’即導蛋白-1係ΑΡΡ之配 體，其调介APP>ft ^# . ° ~傳v ’且其顯著抑制活體内淨β澱粉 狀（Αβ)肽之產生。且_而^ 一版而吕’本發明提供與Αβ肽競爭與 ΑΡΡ之結合並影響 知響Αβ肽產生之蛋白_丨多肽及其功能片段。 此外’由於本發明莫 之導蛋白-1多肽及其功能片段直接與Αβ 肽相互作用，妨_甘 故，、可衫響Αβ肽之寡聚合及清除。 120248.doc /0^ 模型ΐ::揭不，導蛋白-1⑴活體内降低來自阿兹海默氏 立作用，（m)展不出神經營養效應。 在-實施例中，本發明提供一種藉由向個體施用—定量 =導蛋白多肽來降低或抑制與阿兹海默氏病有關之^殿 粕狀肽產生及澱粉狀蛋白質斑點生成之方法，纟中該導蛋 白-1多a包含可_天然之ΑΡΡ蛋白質結合及b)抑制_ 產生之胺基酸序列。 儘g本發明之闡述主要參照阿茲海默氏病，但任何與P 殿㈣蛋白質斑點形成或AP肽產生有關之神經退化疾病皆 係涵蓋本文所揭示組合物及方法之療法之候選治療疾病。 另外，已知與阿兹海默氏病部分相同而存在與阿兹海默氏 病有關之症狀之疾病’例如路易氏體癡呆 dementia)，可用由本發明提供之治療方法加以診治。路易 氏體指腦部神經細胞内之異常結構’據估算，高達概之 阿兹海默氏病患者於新大腦皮層中具有路易氏體。大腦澱 粉樣血管病（CAA)指卜澱粉狀蛋白質沈積於大腦皮層及軟 腦膜之小及中型動脈（並且不太常見地，靜脈）之中層及外 膜中。其係殿粉衫自質沈積於腦部+之任一疾病之構成 要素’並且其不與全身性澱粉樣變性相關。 導蛋白包含一類參與軸突導向之在結構上相關之分泌分 子°轴突根據於其生長錐上表現之導蛋白受體 (Hedgecock等人，199〇, Neuron 4:61_85; Serafmi等人，1994,

Cell 78:409-424; Colamarino^ Tessier Lavigne, (1995) Cell 120248.doc 1334784 81:621-629; Winberg等人’ 1998，見上文），或在細胞信號 轉導機理中之差異（Bashaw 及 Goodman, 1999，Cell 97:917- 926)而將導蛋白視為吸引劑或排斥劑。 導蛋白-1已於雞（Serafini等人，1994，見上文）、小鼠 (Serafini等人 ’ 1996, Cell 87:1001-1014)、非洲蟾蜍（Xenopus) (de la Terre等人 ’ 1997，Neuron 19:1211-1224)、斑馬魚 (Lauderdale荨人 ’ 1997 Mo. Cell Neurosci. 9:293-313; Strahle等 人 ’ 1997，Mech. Dev. 62:147-160)及人類（Meyerhardt 等 人，1999，Cell Growth Differ，10:35-42)中確認；導蛋白 j 已於雞（Serafini等人，1994，見上文）確認；導蛋白_3已於 人類（NTN2L，Van Raay 等人，1997，Genomics 41:279-282) 及小鼠（Wang 等人，1999，J. Neurosci 19:4938-4947)中確 認。導蛋白1、2及3皆在結構上與層黏連蛋白γ鏈之短臂相 關’並且含有層黏連蛋白VI結構域及三個類似於層黏連蛋 白V結構域之表皮生長因子樣（egf樣）重複單元（ν_ 1、γ-2 及V-3);其亦含有稱為"結構域c"之帶正電之與肝素結合 之C端結構域（Serafini等人，1994，見上文；Keino-Masu， 1996，Cell 87:175-185)。人類導蛋白·ι胺基酸序列業内習 知（參見’例如 Serafini 等人，Cell 87 (6): 1001-1014 (1996))且可自例如多種公共數據庫中之任一數據庫獲得， 該等數據庫包括全基因組數據庫，例如彼等由美國國家衛 生署（the National Institutes of Health (NIH))之國家生物技 術信息中心（The National Center for Bi〇techn〇1〇gy Information (NCBI))運作之數據庫。舉例而言，導蛋白」 120248.doc •10- 1334784 胺基酸序列及相應之核酸序列可自GenBank以登記號 NM—004822 (mRNA)及NP_004813(2006年 11 月 17 日）獲得。 線蟲（C. e/eg ⑽·5)(ιιηο6)(Η6(1§ε(：οο1ζ等人，1990，見上 文）、果罐（Drosophila) (NetA/B)(Winberg等人，1998，Cell 93 :58 1-59 1)及小鼠（導蛋白-l)(Skarnes等人，1995，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:6592-6596; Serafini等人，1996， 見上文）中之導蛋白基因中之突變可於軸突導向中產生缺 陷，影響末梢及連合生長。活體外研究顯示，導蛋白_丨可 於膠原蛋白凝膠内遠距離起作用，導致脊髓軸突之生長； 表明化學吸引係導蛋白之作用機制（Kennedy等人，1994, Cell 78:425_435)。如本文所述’ Αβ肽可抑制導蛋白依賴 性神經突生長，並起抗神經生長素作用。 在小鼠及雞中，編碼該等導蛋白之RNA轉錄體廣泛分佈 於整個生物體中（Wang等人，1999，J. Neurosci. 19:4938-4947)。導蛋白rna主要存在於胚胎肌肉及肺支氣管中； 轉錄體亦存在於四肢及食道之濃縮間充質中。然而，已報 導’導蛋白主要廣泛位於CNS中。導蛋白_丨突出表現於正 在發育之脊髓中，表現於底板及腹側腦室區（Serafini等 人，1996，見上文；Wang等人，1999，見上文；〜心吐 1999, Mech· Dev. 83:65-75)。導蛋白_2於整個脊髓中及於 背根神經節中表現，但不於底板中表現（Wang等人， 1999，見上文）。導蛋白_3更侷限地表現於背根神經節及腹 側脊髓之運動柱中（Wang等人，1999，見上文； 1999，見上文）。 ’ 120248.doc 1334784 本文所用術語"導蛋白-1多肽"指包含足以賦予一或多種 以下活性的導蛋白-1之胺基酸序列一部分之多肽：1)與天 然之APP蛋白質結合；2)顯著抑制Αβ 1-40以及Αβ 1-42之 產生；3)與Αβ肽相互作用；4)調介ΑΡΡ信號傳導及5)。在 Αβ肽範圍中之術語產生包含可能由生成率降低、降低增加 或二者導致之Αβ肽之減少。導蛋白-1多肽可實質與對應於 例如以Genbank登記號ΝΡ_004813 (2006年11月17日）存儲

之胺基酸序列之人類多肽相同。該導蛋白序列可於

Genbank repository中獲取，Genbank repository 可於 URL 地 址 ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed 中找到。

習知蛋白質之序列信息可自多種習知來源獲得，包括，例 如用戶創建的、公共的或私有的數據庫、訂閱來源及線上 A /、戍私有來源。s亥術s吾意欲包括不實質影響本發明導蛋 白-1多肽之結構或活性之輕微修飾中所示之胺基酸序列之 保守胺基酸取代。另外，多種分子可附著至導蛋白_丨多肽 及其功能片段’舉例而t ’該等分子包括其他多肽、碳水 化合物、脂質、可檢測標記物及細胞毒性或細胞生長抑制 劑。此等修飾包括於該術語之定義内。 丰文所用術語，，分離的"當用來指本發明多月大時，意欲指 ，多肽呈相對不含通常與細胞、組織或粗製劑中之核酸^ 夕肽相關之材料之形式。因此，本 一 ,, e之分離的多肽已盥 -或夕種其他組份分開並呈通常在自然界中不存; 式。通常’分離的多肽將呈實質純淨形式，但亦可 純之製劑’例如富含該多肽之製劑 罟已去除某些通常 120248.doc 1334784 伴隨該分子之材料或組份。 本文所用術6吾多肽"意欲指兩個或多個共價結合在一起 之胺基酸。本發明之多肽包括具有數百個或更多胺基酸殘 ， I之多肽’包括具有約640個胺基酸之全長導蛋白_ •發明多肽亦包括導蛋白-!之功能片段。通常’2或多個胺 &酸殘基之間的共價鍵為醯胺鍵。然而，胺基酸可通過熟 習肽及化學領域者所熟知的各種其他方法連接在—起。因 • &，術語多肽意欲包括整體或部分地含有位於胺基酸、胺 基酸類似物及模擬物間之非醯胺鍵的分子。類似地，該術 π亦包括％狀多肽及其他構象上受限制之結構。 纟文所用術語，•胺基酸"意指天^或非㈣的胺基酸及胺 基酸類似物和模擬物。天然胺基酸包括蛋白質生物合㈣ 間使用之糊叫胺基酸及其他胺基酸，例如心經基捕胺 酸、經基離胺酸、鎖鏈胺素、異鎖鍵胺素、高半胱胺酸、 瓜胺酸及鳥胺酸。非天然胺基酸包括（例如）(d)_胺基酸、 # 正亮胺酸、正綠胺酸、對氟代苯丙胺酸、乙硫胺酸及諸如 ' 胺基S欠類似物包括天然及非天然胺基酸之修飾形 , f °该類修倚形式可包括（例如）取代或置換胺基酸上的化 團及部分或使胺基酸衍生。胺基酸模擬物包括(例如） ”介此4寺f生（例如電荷及電荷空間分佈特性）類似於對照胺 基醆之有機結構。舉例而言，模擬帶正電荷之胺基酸側鏈 2有機結構同樣含有位於類似分子空間中之正電荷部分並 以、有與參考側鏈相同之運動性。模擬物亦包括受限結構， 以便维持胺基酸或胺基酸官能基之最佳空間分佈及電荷相 i20248.doc *13- 1334784 互作用。 熟習此項技術者知道或可確定什麼樣的結構構成功能上 相S之私:基類似物及胺基酸模擬物。可發現，胺基酸類 似物及模擬物之具體實例闡述於例如尺〇13^^及VeUacci〇,

The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology，編輯 Gross 及

Meinhofer ’ 第 5 冊，341 頁，Academic Press 公司，New York，New York (1983) ’其整個内容以引用方式併入本文 中。其他貫例包括全烧基化胺基酸，尤其全曱基化胺基 酸。參見，例如Combinatorial Chemistry，編輯Wilson及 Czarnik’ 第 11 章，235 頁，John Wiley & Sons公司，New

York，New York (1997)，整本書之内容以引用方式併入本 文中。另外一些實例包括其醯胺部分（且，因此，所得肽 之醯胺主鏈）已由例如糖環、類固醇、苯并二氮呼或碳環 替換之胺基酸。參見例如Burger's Medicinal Chemistry and

Drug Discovery，編輯Manfred E. Wolff，第 15 章，619-620 頁 ’John Wiley & Sons 公司，New York，New York (1995).’整本書之内容以引用方式併入本文中。合成肽、 多肽、擬肽物質及多肽之方法業内習知（參見，例如，美 國專利第 5,420，109號；M. Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (苐 1 版及第 2次修訂版），Springer-Ver]ag，New York，New York (1984 & 1993)，參見第 7章；Stewart及 Young, Solid Phase Peptide Synthesis (第 2 版），Pierce Chemical公司 ’ Rockf〇rd，Illinois (1984)，其各自以引用 方式併入本文中）。 120248.doc -14· 1334784 本發明另外提供本發明導蛋白_丨多肽之功能片段。該等 功月b片·^又包括導蛋白-1胺基酸序列之至少約1 〇個連續胺基 酸，展示出與完整導蛋白-1多肽實質相同之功能。導蛋白_ 1多肽功能片段之具體實例包括SEq ID NO: 1之胺基酸殘 基25至60 ; SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基375至44〇 ; SEq ID NO: 1之胺基酸殘基425至460 ;及seq ID NO: 1之C端50個 胺基酸殘基。導蛋白-1多肽包含足以達成導蛋白_丨多肽與 APP蛋白質之專一性結合之胺基酸序列。 導蛋白-1多肽或其功能片段藉由改變與App信號途徑有 關之細胞内蛋白質之位置、蛋白質_蛋白質結合及/或酶促 活性可模擬導蛋白_丨介導之信號轉導。對應於該等序列之 導蛋白-1多肽將展示出與完整導蛋白q多肽實質相同之活 性。此等功能片段包括例如對應於Seq id NO: 1之胺基酸 殘基25至60 ; SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基375至440; SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基425至46〇;及犯卩id NO: 1之C端 50個胺基酸殘基之導蛋白·i片段。導蛋白^多肽之功能片 段包含足以達成導蛋白_丨多肽與App蛋白質之專一性結合 之胺基酸序列。 本發明涵蓋這樣的—些導蛋白_丨多肽及其功能片段，彼 等與參考導蛋白-1序列相比具有實質相同之胺基酸序列並 因此員示相▲程度、量或範圍之序列同一性，並因此展示 完全可識別為或稱為衍生自參考導蛋白_丨多肽或其功能片 段或與之相關之特性。舉例而言，具有實質與導蛋白q多 月大（包括其功能片段）相同之胺基酸序列之胺基酸序列指展 120248.doc -15 - 示出完全已知為或可識別為 性’從而屬於如本文所定義導1導蛋白-1極為相關之特 其之輕微修飾形式，只自-1多肽之類別。包括對 列。 纟專可識別為如上文所定義序 本發明亦提供編碼目標遙 可係導蛋白表現載體之1多狀之核酸’該等核酸 之重組細胞、用於功能研=且可納入用於表現及筛選

疾病之功效）之轉基因動n统 # 一，ίΐ# π θ # /、有所揭不V蛋白cDNA ^ /序列之料雜父探針及複製/擴增引物。目標㈣ 破为離，意指其包含連接至不同於其汰 連接者之核苷酸之序列，並 木 上與之 亚廹吊構成以給定百分數存在之 總核酸之至少約0.5重量％，較佳較少約2重量％，並且更 佳至少約5重量％。純核酸約成以給定百分數存在之總核 酸之至少約50重量％，較佳至少約9〇重量％，並且更佳至 少⑽重量％。目標核酸可用於多種應用中，包括用作可 轉譯轉錄體、雜交探針、PCR引物、治療性核酸等，·用於 檢測導蛋白-i基因轉錄體之存在，例如等位基因專一性寡 核苷酸(ASO)探針用於識別臨床及實驗室試樣中之野生型 及突變導蛋自·！等位基因’用於檢測或擴增編碼導蛋白】 之核酸，及用於基因治療應用，例如能調介App信號傳導 及抑制Αβ肽形成之寡核苷酸。 本發明亦提供識別能模擬或調介導蛋白-1多肽功能之藥 理學試劑或試劑先導化合物之有效方法。可使用多種篩選 法，例如，可使用細胞基分析法來監測導蛋白_丨功能並且 120248.doc 16 1334784 可使用活體外結合分析法來識別並監測導蛋白_丨專一性結 合。較佳方法適合於先導化合物之天然及合成化學庫^ 動、成本有效的高能量篩選。所識別試劑可於醫藥工業中 用於動物及人類試驗；舉例而言，該等試劑可於活體外及 活體内分析中經衍生並重新筛選，以優化活性並最小化毒 性來用於醫藥開發。

所揭示導蛋U肽可用於調介App信號轉導並抑制^ 肽之原位或活體内生成。對於活體内應用，將該等組合物 添加至滯留之生理液例如血液或滑液中。對於CNS施用， 現有多種技術可用於促進治療劑穿過血腦屏障，包括藉由 手術或注射破冑、可瞬時打開⑽血管内皮細豸間之黏附 接觸之藥物以及可促進穿過此等細胞之遷移之化合物。導 蛋白_1多肽亦可藉由直接注射或輸注施用，局部施用，氣 管鼻内施用’例如經由氣溶膠，眼内施用，或於植入體内/ 之上施用，例如纖維例如膠原蛋白、滲透幫浦、包含經適 宜轉化細胞之移植物，以。—種具體施用方法涉及用治 療蛋白質塗覆、包埋或衍生纖維例如朦原蛋白纖維 '蛋白 質聚合物等。其他有用方法闡述於⑽。等人]价娜士獻 Research 22:83_91 (1989)以及〇加及了心細心㈣ 10:1912-1921 (1990) 〇 白-1多肽之施用使用 本文所用術語”有效量”當結合導蛋 時意欲指在由本發明導蛋白]多肽針對之臨床症狀、生理 ㈣或生物化學活性方面達成有益改變所需的此-分子之 量牛例而。有效里係足以降低與部狀積聚有關之斑點 120248.doc 1334784 生成進展之程度、量或速率之量。達成在治療上有效所需 導蛋白-1多肽之劑量將取決於（舉例而言）待治療症狀之嚴 重程度、施用途徑及形式、所施用分子之效力及生物活性 半哀期、個體之重量及狀況以及先前或併行治療。

—熟習此項技術者使用本文所提供之教義及指導說明可確 $對於該方法之特定應用而言認為是有纟劑量的適宜用 里。舉例而言’該量可自活體外或活體内分析或使用相關 或不同治療分子或治療方案之臨床試驗結果推斷出。所需 劑夏將隨具體治療及隨期望治療之持續時間而有所變化； 然而，預期在約1〇微克與約！毫克/公斤體重/日之劑量將用 於冶療。特別有利較以如本文所論述儲積或長時間持續 形式施用此-物質。治療有效量通常係當物質於生理上可 接受組合物中施用時，足以達成自約〇1微克/毫升至約_ 微克/毫升較仏自約1 · 〇微克/毫升至約$ 〇微克/毫升、更 佳至少約2微克/毫升且通常5至〗〇微克/毫升之血漿濃度之 量。治療抗體可根據此技術領域中之常規以比例上適宜之 ®施用。可包括其他添加劑’例如穩定劑、殺菌劑劑，彼 等將以習用量存在。熟習此項技術者將瞭解，可在整個治 療期間對患者之狀況進行監測’並且所投予導蛋白·i多肽 之量可據此做出相應調整。 用於實施本發明方法之物質可由熟習此項技術者以適合 於所治療疾病；發炎速率或量；個體之重量、性別、年齡 及健康狀況；具體化合物之生物化學性質、生物活性、生 物利用率及副作用之方式及量；及以與併行治療方案相容 120248.doc -18- 1334784 習知可靠動物模型 白質肽產生及澱粉 嚴重程度之適宜量 之方式調配及施用。自具體疾病之業内 可推斷出用於降低人類中與P澱粉狀蛋 狀蛋白質斑點生成有關之神經退化疾病 治療物質之劑量必須根據該物質之結 及調配物。應瞭解， 合親和力加以調整，以便展示出顯著更高結合親和力之物 質相比具有更低結合親和力之物f之劑量可以更低劑量施 用0

物質之全部量可作為單-劑量施用或藉由輸注於相對短 時間上施用’ 4可以多份劑量於更長時間上施用。此等考 慮因素將取決於多個情況特定性因素，例如，舉例而言， 疾病種類之特徵係為急性發作還是為逐漸或慢性惡化。對 於受慢性惡化（舉例而t，與神經炎症性疾病例如M s有關） 影響之個體，該物質可於慢釋放基質中施用，該慢釋放基 質可植入以達成全身性遞送或在靶組織之位置處。用於治 療化合物之受控釋放之預期基質在業内眾所周知，並且包 括諸如DepoFoamTM、生物聚合物、微幫浦等材料。 本發明之導蛋白_ 1多肽及其功能片段可藉由任一數量之 業内習知途徑施用至個體，包括，例如全身性施用，例如 經靜脈内或動脈内。可使用熟習此項技術者習知之調配方 法將治療物質以分離的或實質純多肽及多肽片段形式提供 於醫藥上可接受調配物中。該等調配物可藉由標準途徑施 用，包括，例如局部 '經皮、腹膜内、顱内、腦室内、大 :内、陰道内、子宮内、經口、經直腸、.或非經腸(例如 靜脈内、脊柱内、鞘内、皮下或肌内）途徑。另外，在本 120248.doc 19 發月方法中施用之治療性經純化多肽及多肽片段可納入生 物可IV解聚合&巾，以彡成持續釋纟’用& $低特徵為p 澱粉狀蛋白質肽產生及澱粉狀蛋白質斑點生成之慢性神麫 退化疾病之嚴重程度。生物可降解聚合物及其應用闡述於 例如 Brem等人，j. Neurosurg. 74:441-446 (1991)’ In 用方式併入本文中。 ' 本發明導蛋白_1多肽及功能片段亦可與醫藥上可接受介 貝起以溶液或懸浮液形式施用。此一醫藥上可接受介質 可包括例如無菌水性溶劑’例如磷酸納緩衝液、磷酸緩衝 皿溶液、生理鹽水或林格溶液（Ringer's solution)或其他生 里緩衝鹽水，或其他溶劑或媒劑，例如乙二醇、甘油、、、由 或可注射有機酯。醫藥上可接受介質可另外含有起例如穩 定該中和劑、增加其溶解性或增大其吸收作用之生理上可 接党化合物。該些生理上可接受化合物包括，舉例而言， 奴水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，例 如抗壞血酸或谷胱甘肽；受體介導之滲透劑，其可用於增 加對血腦屏障之滲透性；鼇合劑，例如EDTA ,其可破壞 微生物膜，二價金屬離子，例如鈣或鎂；低分子量蛋白 質；脂質或脂質體；或其他穩定劑或賦形劑。熟習此項技 術者可理解，醫藥上可接受載劑之選擇取決於本發明導蛋 白-· 1多肽或功能月段之施用途徑以及其具體物理及化學特 性。 適於以非經腸方式投予的調配物包括無菌注射水溶液及 非水溶液’例如上述醫藥上可接受的介質。該等溶液可進 120248.doc 1334784 / έ有（例如）緩衝劑、抑菌劑及可使該調配物與預期接 . :者之血液等滲之溶質。其他調配物包括(例如)無菌水懸 • 彳液及非水懸浮液，其可包含懸浮劑及增_。該等調配 &可裝人單位劑s或多次劑量容器（例如，密封的安瓶及 :1璃瓶）中，並可在;束乾條件下貯#，其要求（例如）在使 * 用則一刻加入無菌液體載劑。臨時配製的注射溶液及懸浮 液可由上述類型的無菌粉劑、顆粒及片劑製備。 • 繁於13殿粉狀蛋白質斑點形成於中枢神經系統（CNS)中之 事實，可理解能穿越血腦屏障之調配物係用於施用本發明 導蛋白多肽及功能片段之特別佳實施例。在較佳實施例 中’暫時破壞血腦屏障，在破壞之同時或相對同時施用導 蛋白-1多肽。 為有利於穿越血腦屏障，可增強該化合物之親脂性之調 配物尤其理想。舉例而言’可使中和劑併入脂質體中 (Gregoriadis，Lip〇some Techn〇1〇gy，】至 ΙΠ冊第 2版（crc # Press，Boca Raton FL (1993))。脂質體由磷脂或其他脂質 , '组成’不具有毒性，在生理上可接受並且係製備及施用相 ' 對容易之可代謝載劑。 ’ I發明方法中施用之治療物質亦可製備成奈米顆粒。已 證明使肽化合物吸附於奈米顆粒表面上可有效地將狀藥物 遞送至CNS (參見 Kreuter等人，Brain Research 674:171_174 (1995))。例不性奈米顆粒係表面上吸附有待在本發明方法 中施用之治療物質並然後用聚山梨醇酯8〇塗佈之聚氰基丙 烯酸丁酯之膠質聚合物顆粒。 120248.doc •21 - 1334784 可如美國專利第5,752,5 15號中所述，將本發明導蛋白q 多肽及功能片段影像引導超音遞送，使之穿過血腦屏障， 到達大腦中之選定位置。簡言之，為使治療物質穿過血腦 屏障’乾定大腦中之選定位置並使用超音來誘發可藉由在 彼位置處之中枢神經系統（CNS)組織及/或液體中成像檢測 到之變化。使所選位置附近之大腦之至少一部分成像，例 如經由磁共振成像（MRI)，以確認變化之位置。在本發明 方法中施用入患者血流中之治療物質可藉由施加超音遞送 至確定位置，施加超音可打開彼位置處之血腦屏障，並且 從而誘發該物質之吸收。 另外’可使用稱為受體介導之滲透劑（RMP)之多肽來增 加諸如治療或診斷物質之分子之血腦屏障滲透性，如美國 專利第5,268，164號、第5,506,206號及第5,686,416號中所 述。該等受體介導之滲透劑可與期望目的地係大腦之腦脊 液室之分子經靜脈内共同施用至受主，舉例而言，用來治 療神經退化疾病。該等滲透劑多肽或其構型類似物能夠使 /台療物質參透血腦屏障並到達其輕目的地。 在導蛋白-1多肽偶聯至第二多肽之實施例中，該第二肽 或蛋白質可係治療劑或可係能由吸收劑介導或受體介導胞 轉穿過個體之血腦屏障之肽。在另一實施例中，該導蛋 白-1多肽經由人造LDL顆粒施用，該人造LDL顆粒包含外 4祕月曰單層及實心脂質核’其中該外部磷脂單層包含至少 載月曰蛋白並且該實心脂質核含有該導蛋白_丨多肽。在另 貝施例中，該導蛋白_1多肽結合至包含與載脂蛋白E偶 120248.doc *22- /δ4 二或、、·° 口之親水性蛋白質之奈米顆粒，或與抗糖皮質激素 2物以足以增加個體血腦屏障之滲透性之量共同施用。在 其他實施例中，該導蛋白-1多肽在化學上經修飾以增強跨 膜轉運，舉例而言’藉由使脂肪酸共價連接至導蛋白q多 狀或糖基化該導蛋白_丨多肽。 在當前之阿茲海默氏病治療方法中，通常將一種以上之 化。物知用至個體來治療該疾病之相同或不同方面。類似 〜療物負有利地可與第二治療化合物一起調配，該第 二治療化合物係例如消炎化合物、免疫抑制化合物或任何 其他處理該疾病之相同或不同方面之化合物。此等化合物 包括，舉例而言，膽鹼醋酶抑制劑，例如Razadyne® (先 前稱為 Reminyl®)(加蘭他敏（galantamine))、Εχεΐ〇η⑧⑼ 凡斯的明（rivastigmine))、Aricept@ (杜尼匹次邛㈡⑴） 及c〇gne_ (他克林（tacrine))，N甲基d_天冬胺酸 (NMDA)拮抗劑例如Namenda⑧（美滿町；及 經施用來控制AD之行為症狀例如失眠、激動、精神激 動、精神錯亂、焦慮及抑制等之藥物。另外之藥物可與導 蛋白-1多肽或其功能片段共同施用，治療與阿兹海默氏病 之早期有關之輕度認知障礙（MCI)，例如，杜尼匹次 (Aricept)。熟習此項技術者能夠自無數業内習知用於臨^ 治療AD及其症狀之藥物及化合物中選擇出另外的候選試 劑來與本發明多肽共同施用’彼等包括，舉例而言，維他 命E及C ;非類固醇消炎藥（NSAID);抗氧化劑，銀杏 (Ginkgo bH〇ba)及雌激素。本發明之預期方法包括單獨施 120248.doc •23· ^34784 用在本發明方法中有用之治療物質或使之與此等其他化合 物組合或順次施用。或者，组合療法可由融合蛋白質構 ^，其中本發明之治療性導蛋白]多肽連接至異源蛋白 質。在導蛋白-1多肽偶聯至第二多肽之實施例中，該第二 狀或蛋白質可係治錢或可係能由吸㈣介導或受體介導 胞轉穿過個體之血腦屏障之肽。

可有效地降低或抑制Αβ肽產生或澱粉狀蛋白質斑點生成 =本發明導蛋白-1多肽或其功能片段亦可用於增強記憶功 月b尤其疋老年人之记憶功能。可向個體施用此等藥劑並 分析記憶能力提高之情況。本發明導蛋白]多肽或其功能 片段可藉由例如上述者之習知方法施用。

在另-實施例中’本發明提供基於Ap肽與導蛋白之腦 部濃度診斷'展現或預測阿兹海默氏病之存在或進展之方 法。因此，本發明提供用於選擇治療患有阿兹海默氏病之 個體之方法，包括診斷方法、預卿成阿兹海默氏病之增 加之風險之方法、選擇治療個體之方法、預測或監測個^ 之治療響應之方法、測定個體中之治療功效之方法及確定 個體之n之方法。該等方法係基於測定八卩肽與導蛋白·1 =腦部濃度比率並使該比率與標準加以比較。較高Α隊與 導蛋白-1之比率預示導蛋白]對Αβ肽產生之抑制降低。 示非另外限定’否則本文所用科技術語具有與熟習本發 明所涉及技術者通常所瞭解含義相同之含義。通常，細胞 培養、感染程序、分子生物學方法等係業内常用方法。此 等標準技術可見參考手冊中，例如（簡，驗_ 120248.doc -24 - 1334784 .ning-A Lab〇rat〇ry Manual，c〇ld h‘

Lab〇rai〇rieS)及 AUS汕ei 等人（1994, Curreni Pr〇t〇c仏 u

Molecular Biology，Wiley，New Y〇rk)。 本說明書中提到的所有出版物及專利申請案均以引用的 方式併入本文中，其併入程度如同明確地及單獨地指出將 每一個別出版物或專利申請案以引用方式併入。儘管出於 清楚理解之目的已圖解及舉例方式在—定程度上對前述發 明加以詳細闡述，但熟習此項技術者借助本發明之教示可 容易地明瞭，可對其實施一定之改變及修飾，此並不背離 隨附申請專利範圍之精神及範圍。應瞭解，基本不影響本 發明各實施例之活性之修飾形式亦包括在本文所提供的本 發明之界定範圍内。因此，下列實例意欲舉例說明本發明 而非對其加以限制。

實例I 導蛋白-1作為APP之配體之功能 本實例闡明，向藥性及存活分子導蛋白q起孤兒受體 APP之配體作用，並與Αβ肽直接作用。 細胞、轉染程序、以及純化及重組蛋白質： 使用 lipofectamine試劑（Invitrogen)對 ΗΕΚ293Τ (人類胚 胎腎）或B 1 03 (神經母細胞瘤）細胞實施瞬時轉染。自El 6 5 胚胎獲得原代大腦皮層神經細胞並於補充有B27之

Neurobasal培養基（invitrogen，Carlsbad, CA)中培養 3 天。 於塗覆後並且每24小時添加重組導蛋白-1 (Apotech公 司）。自產生導蛋白-1之293-EBNA細胞純化c - my c標記之 120248.doc -25· 1334784 導蛋白-1，此係按照Serafini等人，Cell 78:409-424 (1994)。如先前所述 Tanikawa等人，Nat. Cell. Biol. 5:216-223 (2003)產生GST-導蛋白-1。bFGF來自ABcam。重組 APP、Αβ1-42 (及 Αβ1-17)及 DCC-EC-Fc 分別購自 Sigma Aldrich, Anaspec 及 R&D Systems。重組APLP2 外結構域經 由Flagagarose親和純化使用穩定表現ecto-APLP2-Flag之 HEK293細胞之上清液獲得。 質粒構築體：

全長 APP695 (pcDNA3-APP)、導蛋白-1 (pGNETl-myc)、導 蛋白-2 (pGNET2-myc)、導蛋白 G1 (pcDNA4-Gl-導蛋白）、 導蛋白-1 之結構域 V 及 VI (pCEP4-netV-VI)、APPC100 (pcINeo-C100) ' APLP1 (pcINeo-APLPl) ' APLP2 (pcDNA3-APLP2)及Disabled 1 (pcDNA3-DABl)表現構築體先前有闡 述（Lu 等人，Nat. Med. 6:397-404 (2000)，Lu 等人，Ann. Neurol. 54:78 1-789 (2003)，Galvan等人，J. Neurochem. 82:283-294 (2002)，SeraHni等人，Cell 78:409-424 (1994)， Keino-Masu 等人，Cell 87:175-185 (1996)及 Homayouni 等 人，J. Neurosci, 19:7507-7515 (1999))。APP613-695藉由 PCR使用pcINeo-ClOO作為PCR模板及以下引物：5匕 CACCATGTTGGTGTTCTTTGCAGA-3,及 5，-CTAGTTCTGCATC TGCTCAAA-31 獲得並插入 pcDNA3.1TOPOd (Invitrogen) 中。PG5E1B-Iuc (Gal4 報導之構築體）、pMst (Gal4)、 pMst-APP (APP-Gal4)、pMst-APP* (APP之突變形式，不 能結合Fe65)先前有闡述，Cao及Sudhof，Science 293:115-120 120248.doc -26- 1334784 (2001)。TrkC (pCDNA3-TrkC-HA)藉由向 pCDNA3 載體中插入 由S. Meakey友好提供之pCMX-Trkc質粒獲得之大鼠TrkC 編碼序列獲得。用於HEK293細胞之穩定轉染之APLP2外 細胞域表現構築體藉由經由quikchange (Stratagene)程序使 用pcDNA-APLP2作為模板及以下引物：5'-GAGGACTT CAGTCTGTAGAGTAGCAGTGCTCTC-31 及 5'GAGAGCACTGCT ACTCTACAGACTGAAGTCCTC-3,添加終止密碼子獲得。 EL1SA結合分析 於室溫下用濃度為2.5微克/毫升（分別為2.5、0.18、0.07 微克/毫升）之APP之分泌形式（分別為APLP2、Αβ、Αβί-17)塗覆 96孔板（Immnunoplate Maxisorp，Nunc)過夜。於37 °C下用於PBS中之5% FCS封阻1小時後，洗滌各孔（0.05% Tween20於 PBS 中），隨後用導蛋白-1 (Human Net 1-FlagM2, Apotech)或bFGF以0.225 nM至60 nM間之濃度於37°C下培 養1小時（0.05% FCS於PBS中）。洗滌4次後，用抗FlagM2 (Sigma-Aldrich)或抗bFGF抗體於封阻緩衝液中於37°C下培 養30分鐘，隨後實施另一洗滌步驟。於37 °C下將偶合至 HRP之抗小鼠抗體（Jackson ImmunoResearch公司）以0.8微 克/毫升之濃度添加並持續1小時。於490奈米之波長下使 用 Victor station (Wallac)量測比色強度。 西方點潰分析及免疫沉澱： 如 Mehlen等人，Nature 395:801-804 (1998)所述實施西 方點潰分析，其使用APP (C-端表位：Sigma-Aldrich; N-端 表位：Sigma-Aldrich)、Αβ (biosource)、DAB-1 (Exalpha 120248.doc -27- 1334784

Biologicals)、Fe65 (Upstate)、Flag M2 (Sigma-Aldrich)、 GST (Sigma-Aldrich) ' c-myc (Sigma-Aldrich) ' P75-NGFR (abeam)、TrkC (Santa-Cruz)或導蛋白-1 抗小鼠單株（R&D Systems)抗體。如先前所述Forcet等人，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 98:3416-3421 (2001)實施自 HEK293及 B 1 03 之共免疫沉澱。使用由Miltenyi Bio tech開發之微珠粒系統 實施自原代培養物之共免疫沉澱。 連合及大腦皮層軸突生長： 如先前所述（Serafini 等人，Cell 78:409-424 (1994)， Forcet等人，Nature 417:443-447 (2002) and Corset等人， Nature 407:747-7 5 0 (2000))培養來自E13大鼠胚胎之背部脊 髓外植體。為研究大腦皮層轴突生長，使用APP突變小 鼠。APP突變小鼠在C5 7BL6、129SvEv及129 Ola之混合背 景中並先前有闡述（Heber等人，J. Neurosci.20:7951-7963 (2000))。對源自相同雜交Αρρ+ΛχΑΡΡ+厂之£135小鼠胚胎 實施進一步解剖’同時憑經驗實施基因型分型。自頭骨切 除大腦，並去除軟膜。自各大腦皮層半球之後半部切割跨 越大腦皮層壁厚度之大腦皮層組織之小片（約4〇〇微米χ7〇〇 微米）。使外植體轉移入膠原蛋白中。於聚合後，用補充 有10。/。滅活馬血清（Invitrogen)之F12-DMEM以及盤尼西林/ 鏈黴素覆蓋凝膠，並於存在或不存在導蛋白丨下於^/。c〇2 氣氛中於37 C下培養20小時。連合及大腦皮層軸突皆用抗 (3-微管蛋白抗體（Babco)染色。如先前所述（c〇rset等人， Nature 407:747-750 (2000))實施軸突長度之定量。 120248.doc -28- 1334784 簡言之，量測各外植體之知办土 把之軸犬束之總長度並依據自用純 導蛋白-1培養之外植體獲得之值 ± , i τ <值‘準化。在為大腦皮層輛 突之情況中並且因為在不存在道 个仔在導蛋白-1時檢測到一定之大 腦皮層軸突生長，在標準化前白夂 千1G則自各條件撤消此基生長。 對神經細胞之原代培養物之共焦分析：

使神經細胞之原代培養物於4% PFA中固定並分別用不 同-級抗ft(5A3/1G7、抗導蛋白64或抗血清z (R1155))並 隨後用Alexa568-及/或Alexa48_聯抗小鼠及/或抗兔二級 抗體染色。利用鐳射掃描共焦顯微鏡（Nik〇n pcM 2〇〇〇) 使用100X物鏡及2.7數位變焦採集影像之堆棧（z步長=〇 25 毫米），使用 SimPlePCI 軟體（c〇mpix Inc，Lake ο·%。， OR)收集並於運行Bitplane，s Advanced匕叫丨吨軟體包之 SGI Octane R12電腦上處·理。 器官型培養及Αβ釋放測定： PDAPP(J20)小鼠先前有述，Galvan 等人，Pr〇c NaU Acad. Sci. USA 103:7130-71354 (2006)。自 P1 轉基因及非 轉基因同胞仔之全腦切割250微米冠狀腦部切片，以建立 器S型培養物。於在Opti-MEM (Invitrogen)中之0.5¾ D-葡 萄糖、25%胎牛血清、25%漢克氏（Hank)緩衝鹽溶液中培 養組織。於塗覆後立即並每24小時向該培養基中添加重組 導蛋白-1、NGF或IGF-1。3天後，使用專一性ELISA分析 (Biosource, Camarillo，CA)在培養基中定量 Αβ1-40 及 Αβί- 42。為於較低導蛋白-1濃度之背景下量測Αβ，使轉基因 PDAPP(J2〇)小鼠與導蛋白_i +/-小鼠雜交。導蛋白」突變 120248.doc -29- 1334784 小鼠先前有闡述，Serafini等人，Cell 87:1001-1014 (1996) 及 Forcet 等人，Nature 417:443-447 (2002)。使用專一性上 述ELISA分析來分析具有適當基因型（PDAPP-導蛋白-1 +/-及PDAPP-導蛋白-1 +/+)之小鼠之Αβ水平。 因此，ΑΡΡ及導蛋白-1共表現於ΗΕΚ293Τ細胞中，並且 如圖1Α及Β所示，ΑΡΡ與導蛋白-1 一起共免疫沉澱。簡言 之，用myc標記之導蛋白-1及/或ΑΡΡ及/或TrkC瞬時轉染 HEK293T細胞。利用條件培養基（組lb)或細胞裂解物（組la 及1 c)來實施免疫沉殿，使用抗c-myc抗體（對於導蛋白而 言）（組la及lb)、抗N端APP抗體（組lc)或抗TrkC抗體（組 1 Ο。使免疫沉澱經受聚丙烯醯胺凝膠電泳，轉移，並用 引發之抗N端APP(組la及lb)或導蛋白-1 (組lc)之抗體探 測。當APP而非導蛋白-1牵出時，APP與導蛋白-1間之共 免疫沉澱亦逆向發生（圖1 c)。作為負性對照，另一跨膜受 體TrkC未能與導蛋白-1 一起共免疫沉澱（圖lc)。 用或不用導蛋白-1表現構築體轉染HEK293T細胞，並且 於c-myc (導蛋白-1)牽出後，使用抗C端APP抗體揭示内源 性APP (圖1D)。不僅異位表現APP (圖la-c)而且内源性 APP亦可於HEK293T中用導蛋白-1免疫沉澱（圖id)。由於 該等免疫沉澱於其中APP及導蛋白_ 1於非生理環境中表現 之細胞中實施’故藉由首先用共焦顯微術分析内源性APP 是否與内源性表現之導蛋白-1共位來研究來自E1 6.5小鼠 胚胎之原代大腦皮層神經細胞中推定之APP/導蛋白-1相互 作用。圖1E顯示5A3/1G7 (APP細胞外結構域）與導蛋白-! 120248.doc •30· 1334784 在原代大腦皮層神經細胞之生長錐中之共位。 簡言之’使來自DBA/2J胚胎之神經細胞之原代培養物 於4% PFA中固定並分別用5A3/1G7及抗導蛋白染色64或用 小鼠及兔IgG隨後Alexa568-及Alexa488-偶聯抗小鼠及抗兔 二級抗體染色。利用鐳射掃描共焦顯微鏡（Nikon PCM-2000)使用100X物鏡及2.7數位變焦採集影像之堆棧（z步長 =25 毫米），使用 SimplePCI軟體（Compix Inc.，Lake Oswego, OR)收集並於運行Bitplane’s Advanced Imaging軟體包之 SGI Octane R12電腦上處理。使用c〇l〇c算法於lmaris Bitplane中實施共位分析。使用共位區域（c)内之通道A(綠 色）與通道B(紅色）之Pearson相關係數作為共位程度之量度 36。所示各組：Netl (導蛋白-1) ; APP ;合併；Coloc (共 位通道）；IgG's (小鼠及兔IgG)。 為獲得圖F及G中所示結果’收集來自E16.5小鼠胚胎之 大腦皮層並使之半離散’使細胞裂解物經受免疫沉澱，免 疫沉澱使用用於牽出之抗APP (C-端或N-端）、抗TrkC或抗 P75NTR抗體（圖1F)或抗導蛋白-1 (抗小鼠導蛋白·丨：抗 mNetl)、抗bFGF抗體或各自的不相關igG (圖1G)。然後使 用APP、P75ntr或TrkC抗體（圖1F)或導蛋白-1或bFGF抗體 (圖1G)實施免疫印跡。用myc標記之導蛋白-1、導蛋白-2 或△(：導蛋白-1 (net (v，VI))、導蛋白G1及APP、Flag標記之 APLP1或APLP2瞬時轉染HEK293T細胞（圖1H至I)。利用細 胞裂解物來實施免疫沉澱’其使用抗c_myc抗體（對於導蛋 白）（圖 II)或 FlagM2 抗體（對於 APLP1 及 APLP2)(圖 1H)。 120248.doc -31 · 1334784 在圖1組a至d、h及i中，上部之組顯示於牵出前之蛋白 質之表現’而下部之組係於牵出後。在組If及g中，所有 組皆顯示於牽出後蛋白質之表現（組lj)，添加150奈克重組 αΑΡΡ ’以增加1毫升反應緩衝液中純化c—myc-標記之導蛋 白-1之漠度。實施導蛋白-1牵出（使用抗c-myc)，於西方點 潰分析後使用抗APP抗體及NIH影像軟體定量用導蛋白」 牵出之αΑΡΡ之濃度。用DCC-EC實施類似之分析。底部 組··由西方點潰分析顯示之otAPP及DCC-EC之輸入。 如上所述開發Elisa分析來測定KdAPP/導蛋白。將2.5微 克/毫升αΑΡΡ蛋白質塗佈於96孔板中並添加不同之導蛋白_ 1濃度。使用SAPP/bFGF對或APLP2/導蛋白-1對實施類似 之實驗。藉由量測光密度（強度）於組Ik中顯示相互作用之 定量。由模擬之Scatchardl圖表得到Kd測定（結合/估算之未 結合=f (結合））。 如圖1E中顯示，APP與導蛋白-1共位，尤其在生長錐 中。使用用於牽出之抗導蛋白·1或抗APP抗體之内源性蛋 白質之共免疫沉澱顯示，導蛋白-1與APP在發育期大腦皮 層中相互作用’而在相同之位置，導蛋白_1不與p75ntr或 TrkC相互作用（圖1F)，並且APP不與bFGF(圖1G)相互作 用’ bFGF係具有導蛋白丨5之許多特性之分子。因此， 在發育期大腦中’内源性導蛋白-1專一性地與内源性App 相互作用。 為進一步分析是否導蛋白-1相互作用僅限於App，亦於 HEK293T細胞中使用表位標記之APLP1及APLP2實施共免 120248.doc -32- 1334784 疫沉澱研究，發現導蛋白_丨與前者共免疫沉澱，而未觀察 到與後者有此相互作用（圖1 h)。此外，除導蛋白_丨外，亦 發現導蛋白-2與APP相互作用，而未檢測到APP與更趨異 之導蛋白分子即導蛋白G1間有相互作用（圖π)。 由於導蛋白及ΑΡΡ皆係肝素結合蛋白質16，故評定缺 失結構域C之導蛋白_丨突變體（其含有主要的肝素結合結構 域，但不具有導蛋白_丨功能1〇)保持與Αρρ之相互作用。如 圖II中所示，此突變導蛋白確實保持與Αρρ相互作用之 能力。 為排除導蛋白_ 1與ΑΡΡ間間接相互作用之可能性，藉由 使用重組導蛋白-1或bFGF對重組αΑΡΡ、DCC或ApLp2外結 構域貫施免疫沉澱及ELISA分析來評價直接活體外相互作 用。如圖1 j-k中所示，免疫印跡法及ELISA*析揭示App 與導蛋白-1間有專一性相互作用，而bFGF/App及導蛋白_ 1/APLP2未顯示專一性結合。導蛋白^對八外之親和力與 其對DCC之親和力在相同之數量級上（估算之KdApp/導蛋 白為6 nM，而已知KdDCC/導蛋白^為⑺nM 1〇)。合起 來，該等數據表明，導蛋白―丨與八冲以類似於其與DCC之 先前所述生理相互作用類似之親和力相互作用。 為界疋APP-導蛋白_1相互作用所需之App結構域，用導 蛋白-1牽出羧基端cioo蛋白質（圖2B)，羧基端cl〇〇蛋白質 由APP之β-分泌酶剪切獲得（參見圖”。與在活體外αΑρρ蛋 白質與導蛋白互作用之發現（圖】ΜΚ)合起來看，該 等觀察結果表示’ ΑΡΡ之結合區域位於β-剪切位點與α-剪 120248.doc -33- 1334784 之間。與此假設一致，該區域自α-剪切位點至β_剪 切之缺失破壞Cl00與導蛋白]之推定相互作用（圖孔）。因 此，導蛋白-1與APP之Αβ結構域中包含之區域相互作用。 為向此結構提供進一步之證據，於不存在過量八0下使用導 蛋白-1對αΑΡΡ實施活體外牵出。如圖2c中所示，Αβ之存 在完全抑制使用導蛋白-1之αΑΡΡ牵出。 a圖2a顯示ΑΡΡ之圖示。於存在或不存在導蛋白_丨表現構 築體之情況下用C100 (ApP597_695K^App6i3 695表現構 築體共轉染HEK293T細胞。使用用於牵出之抗_c_myc (對 於導蛋白_1)及激發之用於免疫印跡之抗App之c端結構域 之抗體貫施免疫沉澱（圖2b)。圖2c類似於圖ij，但存在（或 不存在）大量過量之Αβ (150奈克）。顯著地，在存在Ap 下，αΑΡΡ未能使用導蛋白牽出。 上述結果顯示，ΑΡΡ與導蛋白-1相互作用，Αρρ對應於 Α β肽之胺基端部分之區域足以達成此相互作用。為確認 Αβ肽本身足以達成與導蛋白q之相互作用，並且為測試此 可能性，對導蛋白-1與Αβ之共免疫沉澱加以分析。如圖3 a 中所示’重組導蛋白-1以濃度依賴方式與Αβ肽相互作用。 令人感興趣的是，不僅Αβ而且Αβ之更小片段Αβ ι_ΐ7即Αβ 之前17個胺基酸（較全長Αβ毒性小之肽）亦與導蛋白_丨相互 作用’雖然親和力降低（KdAp/導*6.^22 nM'KdApMMB^JO nM)。由於發現Αβ及Αβ1·17與導蛋白_丨相互作用，故接下 來可分析Αβ或Αβ1-17是否可干擾導蛋白_丨功能。已確認導 蛋白-1係促進連合軸突生長之分子。在有或無純化導蛋白- 120248.doc .34· 丄 ”4/84 \之情況下，使來自E13大鼠胚胎之背部脊髓於膠原蛋白凝 膠中生長16至18小時。如先前所示8，17，導蛋白_丨之存在 促進軸突生長（圖3b)。 然而，添加Αβ或Αβ1-17極大地降低導蛋白q誘發之軸突 伸展（P < 0·_1)(圖）。當導蛋白小原係由來自底板之外植 體k 一天然導蛋白_丨來源提供時獲得類似之結果（未圖 示）。此效應並不簡單地表示對軸突生長之一般抑制（例如 由Αβ f性導致），而是對導蛋白_丨信號傳導具有專一性， 此乃因非導蛋白依賴性連合軸突生長（當脊髓外植體生長 4〇小時時觀察到）8 18不受Αβ影響（圖3b，總軸突長度/外植 體（平均士SEM)，無 Αβ: 607±126 微米（n=12)，有 657±12?微米（n=8))。因此，導蛋白_丨不僅與App而且亦與 Αβ相互作用，並且可溶性Αβ由此可影響導蛋白_丨功能。 用/辰度不斷增加GST-導蛋白-1於1毫升反應緩衝液中培 養150奈克Αβ。使用抗_A{3專一性抗體實施牽出，使用抗 GST抗體藉由西方點潰分析檢測導蛋白_丨。則丨以分析如上 所述實施並顯示於圖1Kt。使〇 18微克/毫升Ap或〇 〇7微 克/毫升Αβ1·17蛋白質塗覆於96孔板中並添加不同導蛋白」 濃度（圖3A)。藉由量測光密度（強度）於圖3中顯示相互作用 之定置。為獲得圊3b中所示結果，於膠原蛋白凝膠中培養 E13背部脊髓外植體18小時或4〇小時（4〇匕幼，其中或者無 導蛋白-1源（-)，或者有純化導蛋白-1 (Net-p)。外植體或未 經處理（-)、用15微克/毫升Αβ或Αρι_17處理。顯示定量結 果。對於每一測試條件，自4個不同實驗定量之外植體之 120248.doc •35· 1334784 總數在24至3 6間變化。值以平均土SEM顯示。比例尺 ：200 微米。

實例II 導蛋白-1介導APP信號傳導 本實例顯示導蛋白4調介App信號傳導並抑制Αβ肽之淨 產生。 將ΗΕΚ293Τ細胞用ΑΡΡ及dah-表現構築體瞬時共轉 染，並進一步於存在（或不存在）導蛋白丨下培養。使用抗 DAB-1抗體實施牵出，並且使用N端抗App抗體於此牵出 中檢測APP (圖4A)。 將B1 03細胞用APP瞬時轉染並進一步在存在或（不存在） 導蛋白-1下培養。使用抗_Fe65抗體對内源性以65實施免疫 沉澱，並使用N端抗APP抗體來於該牵出内檢測APP(圖 4B)。在圖4A及圖4B中’上部組代表牽出前之app及DAB-1 (或Fe65) ’下部組係在免疫沉澱中檢測到之App。 用比率為1:1之APP-Gal4或APP*-Gal4與Gal4 -勞光素酶 報導子（pG5ElB-luc)構築體共轉染HEK293T細胞。於轉染 24小時及48小時後向培養物中添加3〇〇奈克/毫升導蛋白] (或bFGF) ’收集細胞並且使用proniega之亮度量測分析及 Victor生物站（Perkin-Elmer)對細胞裂解物實施螢光素酶活 性評價。繪示直方圖。指示標準偏差（n=5)。 對於圖4D中所示結果，每24小時用添加至培養基中之媒 劑（PBS)或用300奈克/毫升導蛋白-1處理來自E16.5 hAPP轉 基因胚胎（PDAPP(J20)於C57BL/6J背景中）中之原代神經細 120248.doc -36· 1334784 胞培養物並持續3天，此於塗覆後15天開始。將培養物固 定，用RNAse處理並用1:1000稀釋度之對Αρρ之^端結構域 具專一性之抗體（胺基酸649_664，抗血清I(RU55) 37)染 色，隨後用Alexa488偶聯驢抗兔IgG (Invitrogen)染色並用 T0T0-3對比染色，以顯現DNA。用鐳射掃描共焦顯微鏡 (Nikon PCM_2000)以6〇〇χ放大分辨率採集影像之堆棧卜步 長-250奈米）並用 SimplePCI (Compix公司，Sewickley，ΡΑ) 軟體收集。對於各條件，選擇其中可清楚地區分單個細胞 之5個分開之域（避免神經細胞體之團塊）。顯示各條件下獲 得之域之代表性最大強度投射影像。 使用Zeiss 510 LSM影像分析軟體之Histogram模塊測定 各條件下之代表性整個核内抗免疫反應性強度分佈（上部 組’綠色描記線遍佈於影像上）。下部組，將強度繪示為 距離之函數。 對於圖4F及圖4G，將單個核（對照，n=53 ;導蛋白」， n=5 1)之單個體積（9x9x6微米）自共焦影像之堆棧剪切下來 並分別使用 Imaris Isosurface算法（Imaris Bitplane，Zurich，

Switzerland)分析。圖扑顯示對照及導蛋白_丨處理之神經細 胞核之堆棧之最大強度投射。顯示代表影像。圖4G顯示神 經細胞核中抗I免疫反應性體素之數量。在已用導蛋白_ i處 理之神經細胞之核中觀察到APP C端免疫反應性體素顯著 增加（p <0.05，不成對Student氏t檢驗）。 已證明適配子蛋白質DAB-1與APP之細胞内結構域相互 作用（Trommsdorff等人，J Biol Chem 273: 33556 (1998))。 120248.doc -37- 1334784 如圖4A中所示，導蛋白-i增強DAB-1至APP之募集（圖 4A)。類似地，已證明適配子蛋白質Fe65可與APP之細胞 内結構域相互作用並為APP與細胞骨架之偶合提供作用機 制（Ando等人，j Biol Chem 276: 40353 (2001))。 亦證明Fe65負責APP細胞内結構域（AICD)依賴性基因轉 錄。確實，據證明，在Fe65之存在下，APP之細胞内結構 域遷移至核中並經由TIP60之需要引發專一性基因組之 APP依賴性轉錄（Cao及 Sudhof，Science 293:1 15 (2001); Kimberly等人，J Biol Chem 276: 40288 (2001); Cao 及 Sudhof，J Biol Chem 279: 24601 (2004))。圖4B顯示，在 APP轉染B103細胞中，當添加導蛋白-丨時主要觀察到Fe65 與APP之相互作用。根據所提出之模型，以65與App之此 導蛋白-1依賴性增強之相互作用應使AICD活性增加。為檢 測這一點’使用先前開發之精巧反式激活分析，其中Gal4 之DNA結合結構域融合至APP，並且使用Gal4依賴性報導 子質粒檢測反式激活。 如圖4c中所示，導蛋白-1觸發HEK293T中之App依賴性 基因反式激活’而bFGF對Gal4依賴性粮導子無作用。當 APP在Fe65結合位點處突變時，此導蛋白]依賴性、App 依賴性反式激活廢止。為進一步研究導蛋白_丨對八1(：1)之影 響，於自表現載有瑞典及印度家族性阿茲海默氏病（AD)突 變25之人類APP小基因之PDAPP小鼠£16 5胚胎獲得之原代 大腦皮層神經細胞中分析AICD。由於aicda核位置係 AICD依賴性反式激活中之重要（雖然不是不可缺少的）的事 120248.doc -38- 1334784 件23 ’故對導蛋白-1對APPC端免疫反應性片段易位至 hAPP轉基因大腦皮層神經細胞之核中之作用加以評價。

• 如圖4defg中所示，在導蛋白-1處理之神經細胞之核中APP • C端免疫反應性片段顯著增加。合起來，該等結果表明， -· 導蛋白-1可能對APP信號傳導施加功能上的效應。

• 實例III

導蛋白-1介導之大腦皮層軸突生長需要APP 本實例闡明’在大腦發育期間導蛋白_丨依賴性大腦皮層 •車由突導向需要APP。 如圖5之右上方組中所示自e13.5野生型或APP突變胚胎 切割下大腦皮層外植體並在存在或不存在375奈克/毫升導 蛋白-1下於膠原蛋白中培養。圖5八顯示在不同測試條件下 軸突生長之代表性影像。對於圖5B，每一測試條件下自5 個不同實驗定量之外植體之總數在8至12間變化。所顯示 值為平均士SEM。比例尺：2〇〇微米。使用Kruskall WaUis • 檢驗來比較所有條件Ρ=0·001。亦使用Mann-Whitney檢驗 來比較 +/+ 對 +/_ (P=0 036)以及 +/·對 / (pdO d)。 為進一步展示所述導蛋白_丨在App信號轉導上之效應之 , 活體内相關性’研究APP是否可解釋導蛋白q在神經系統 發育期間作為轴突導向因子之已知功能之一部分。值得注 思的疋，導蛋白]突變小鼠在形成神經系統中展示出極大 之缺陷，此表現型之主要部分已歸因於導蛋白作為其受體 DCC之軸突因子之角色，此乃因dcc突變小鼠在形成神經 糸統中展不出類似缺陷。然而，缺失App之小鼠亦表現出 120248.doc •39· 1334784 類似之神經發育缺陷，其嚴重程度取決於遺傳背景：該等 缺卩〇 i括發月中之胼胝體及其他連合中之異常26。具體而 。APP及導蛋白_丨突變小鼠中之所述胼胝體之類似缺陷 皆可能係由大腦皮層神經細胞之亞群中軸突導向中之缺陷 導致。為評價此可能性，切割下13 5野生型小鼠胚胎大腦 皮層之後半部分區域之外植體並於膠原蛋白凝膠中培養。 在不存在導蛋白-1時，僅觀察到稀疏之生長，而添加導蛋 白-1產生旺盛之生長（圖5) ’證實大腦皮層軸突對導蛋白J 有反應27。然而，當使用來自App _/·突變胚胎之大腦皮層 外植體κ加類似之實驗時，導蛋白_丨之效應顯著降低。因 此‘蛋白_ 1誘發之大腦皮層神經細胞之軸突生長至少部 分由APP介導。與在原代大腦皮層神經細胞中之生長錐水 平處APP與導蛋白」之共位合起來，該等數據證明，App 係導蛋白-1信號傳導受體複合體之一部分並與大腦發育期 間之導蛋白-1之軸突導向活性有關。

實例IV 導蛋白-1與APP之結合抑制Α-β肽生成 本實例闡明，導蛋白-1抑制淨Αβ肽產生。 由於阿茲海默氏病發病機理被認為至少部分係由導致 產生之APP處理介導’故分析導蛋白d對在模擬阿茲海默 氏病之hAPP轉基因小鼠中Αβ肽產生之效應（v〇n R〇tz等 人，J Cell Sci 117:443 5 (2004))。將來自 PDAPP轉基因及 非轉基因同胞仔之腦部切片培養物用媒劑或用導蛋白_丨處 理並藉由ELISA分析對Αβ 1-40及Αβ 1-42之產生予以評 120248.doc •40· 丄 價。如圖。中所示’阿兹海默氏模型轉基因小鼠在Αβ卜 4〇及邱1-42淨產生上較對照小鼠（非轉基因同胞仔）展示出 顯著增加，但添加導蛋白-1可抑制此增加。在補充之活體 内研九中使導蛋白-1半合子小鼠(不可能實現導蛋白缺

失_ΑΡΡ轉基因小鼠雜交，並藉由ELISA分析定量子代 中之大腦Αβ濃度。與野生型小鼠（pDApp_導蛋白⑽相 比，PDAPP轉基因導蛋白]半合子⑽術導蛋白+/·) 在大腦皮層中㈣出降低之導蛋白]水平（圖⑼，插圖）。 Αβ之定量揭示’與野生型小鼠相比，在導蛋白邻合子中 Αβ水平有顯著增加（圖⑼，p<G G27)，因此使導蛋白韻為 Αβ水平之關鍵調節劑之觀點更有說明力。 於存在或不存在導蛋白](9〇奈克/毫升）下培養來自 〔DAPP轉基因小鼠及對照非轉基因同胞仔（NPDAPP)之腦 片於3 5天後收穫上清液並藉由ELISA分析對Αβ14〇 及ΑΡ1_42加以評價。向所有Αβ標樣中添加9〇奈克/毫升導 蛋白-1，以排除導蛋白對於elisa中所用抗體與上其 表位之結合之干擾（圖6Α)。亦添加NGF (25〇奈克/毫升）或 IGF-1 (100奈克/毫升）作為對照並且未對A卩水平產生任何 影響（未圖示） 精由ELISA於5-7月齡PDAPP/導蛋白]+/·或pDApp/導蛋 j鼠中1測導蛋白-1表現（圖6B，插圖）及淨Αβ卜 40產生。®6Β顯示作為在pDApp_導蛋白]+/小鼠中檢測 到之平均Αβ水平與在叩術導蛋白_1+/+小鼠中檢測到之 彼水平間之比率之倍數增加。研究4群類似年齡動物（導蛋 120248.doc -41 - 1334784 白1 +/+及+/-)。研究之小鼠總數為16只。檢驗： . 比較4組中之仏與+/W27)，比較全部動物中之+/_與 +/+ (ρ = 0·0005) 〇 在整個本申請案中於括號内參照了各種出版物。該等出 • 版物之全部揭示内容皆以引用方式併入本申請案中，以更 ' 凡整地闡述本發明所涉及技術之發展動態。 儘管已參照所揭示實施例對本發明予以闡述，但熟習此 φ 項技術者應不難瞭解，所詳細描述之具體實驗僅用於闡述 本發明。應瞭解，可實施各種修飾形式而不背離本發明的 精神。相應地，本發明僅受限於隨附申請專利範圍。 【圖式簡單說明】 圖1導蛋白-1與ΑΡΡ及APLP1相互作用。a_c，用myc標記 之導蛋白-1及/或APP及/或TrkC瞬時轉染HEK293T細胞。 利用條件培養基（b)或細胞裂解物（3及c)來實施免疫沉殿， 使用抗c-myc抗體（對於導蛋白而（a，b)、抗^^端八!^抗體（c) • 或抗TrkC抗體（c)。使免疫沉澱經受聚丙烯醯胺凝膠電泳， 轉移，並用引發之抗N端APP(a及b)或導蛋白-1 (c)之抗體 探測。d，用或不用導蛋白-1表現構築體轉染HEK293T細 - 胞，並且於c-myc (導蛋白-1)牵出後，使用抗c端APP抗體 揭示内源性APP。e ’ 5A3/1G7 (APP細胞外結構域）與導蛋 白-1在原代大腦皮層神經細胞之生長錐中之共位。使來自 DBA/2J胚胎之神經細胞之原代培養物於40/。PFA中固定並 分別用5A3/1G7及抗導蛋白染色64或用小鼠及兔IgG隨後用 Alexa5 68-及Alexa48 8-偶聯抗小鼠及抗兔二級抗體染色。 120248.doc -42- 1334784 利於雷射掃描共焦顯微鏡（Nik〇n PCM-2000)使用100X物 鏡及2.7數位變焦採集影像之堆棧（2步長=〇25毫米），使用 SimplePCI 軟體（Compix lnc.，Lake Oswego, OR)收集並於 運行 Bitplane’s Advanced Imaging 軟體包之 SGI Octane R12 電腦上處理。使用Coloc算法於Imaris Bitplane中實施共位 分析。使用共位區域（c)内之通道A(綠色）與通道B(紅色）之 Pearson相關係數作為共位程度之量度36。所示各組：Netl (導蛋白-1) ; APP ;合併；Coloc (共位通道）；lgG，s (小鼠 及兔IgG)。f-g，收集來自E16.5小鼠胚胎之大腦皮層並使 之半離散’使細胞裂解物經受免疫沉澱，免疫沉澱使用用 於牵出之抗APP (C-端或N-端）、抗TrkC或抗p75NTR抗體 (f)或抗導蛋白-1 (抗小鼠導蛋白-1 :抗mNetl)、抗bFGF抗 體或各自的不相關IgG (圖1G)。然後使用APP、p75ntr或 TrkC抗體（f)或導蛋白_丨或bFGF抗體（g)實施免疫印跡。h_ 1 ’用myc標記之導蛋白_ι、導蛋白_2或Δ(：：導蛋白_1(net (V，VI)) ' 導蛋白 G1 及 APP、Flag標記之 APLP1 或 APLP2 瞬 時轉染HEK293T細胞。利用細胞裂解物來實施免疫沉澱， 其使用抗c-myc抗體（對於導蛋白）(i)或FiagM2抗體（對於 APLP1及APLP2)(h)。在a-d、h、i中，上部之組顯示牽出 前之蛋白質之表現，而下部之組係於牵出後。在g中， 所有組皆顯示牽出後蛋白質之表現〇)，添加15〇奈克重組 αΑΡΡ ’以增加1毫升反應緩衝液中純化c-myc標記之導蛋 白-1之濃度。實施導蛋白-1牽出（使用抗c_myc)，於西方點 潰分析後使用抗APP抗體及NIH影像軟體定量用導蛋白] 120248.doc -43 - 1334784 牽出之αΑΡΡ之濃度。用DCC-EC實施類似之分析。底部 組：由西方點潰分析顯示之αΑΡΡ及DCC-EC之輸入。k， 研製Elisa分析來測定KdAPP/導蛋白。將2.5微克/毫升αΑΡΡ 蛋白質塗佈於96孔板中並添加不同之導蛋白_丨濃度。使用 SAPP/bFGF對或APLP2/導蛋白-1對實施類似之實驗。這裏 藉由量測光密度（強度）指示相互作用之定量。由模擬之 Scatchardl圖表得到Kd測定（結合/估算之未結合=f(結 合））。 圖2 APP之導蛋白結合結構域位於App之ab區域内。a， APP之示圖。b’於存在或不存在導蛋白_丨表現構築體之情 況下用C100 (APP597-695)或APP613-695-表現構築體共轉 染HEK293T細胞。使用用於牵出之抗_c_myc (對於導蛋白_ 1)及激發之用於免疫印跡之抗APP之C端結構域之抗體實 施免疫沉澱。c，類似於圖lj，但存在（或不存在）大量過量 之Αβ (150奈克）。可注意到’在存在Αβ下，αΑΡΡ未能使用 導蛋白-1牽出。 圖3 Αβ與導蛋白-1相互作用並抑制導蛋白_丨功能。&，導 蛋白-1與Αβ —起免疫沉澱。用濃度不斷增加之〇ST導蛋 白-1於1毫升反應緩衝液中培養15〇奈克Αβ。使用抗_Αβ專 一性抗體實施牽出，使用抗GST抗體藉由西方點潰分析檢 測導蛋白-1。如圖ik中實施Elisa分析。使0 18微克/毫升 Αβ或0.07微克/毫升Αβ1-17蛋白質塗覆於96孔板中並添加 不同導蛋白-1濃度。這裏藉由量測光密度（強度）指示相互 作用之定量。b，於膠原蛋白凝膠中培養Ε13背部脊髓外植 120248.doc -44 - 1334784 體18小時或40小時（4〇 hrs)，其中或者無導蛋白-1源（_)， 或者有純化導蛋白-1 (Net-p)。外植體或未經處理（_)、用 1 5微克/毫升Αβ或Αβ1-1 7處理。顯示定量結果。對於每一 測試條件，自4個不同實驗定量之外植體之總數在24至36 間變化。所顯示值為平均土 SEM。比例尺：200微米。 圖4導蛋白-1經由ΑΡΡ傳導信號。a，將ΗΕΚ293Τ細胞用 APP及DAB-1表現構築體瞬時共轉染，並於存在（或不存 在）導蛋白-1下進一步培養。使用抗DAB-1抗體實施牵出， 並且於此牽出中使用N端抗APP抗體檢測APP。b，用APP 瞬時轉染B103細胞並進一步在存在（或不存在）導蛋白^下 培養。使用抗Fe65抗體來免疫沉澱内源性Fe65，並使用Ν 端抗ΑΡΡ抗體來檢測牽出内之ΑΡΡ。在a-b中，上部組代表 牽出前之APP及DAB-1 (或Fe65)，下部組係在免疫沉澱中 檢測到之APP。c，用比率為1:1之APP-Gal4或APP*-Gal4與 Gal4-螢光素酶報導子（pG5E1B_luc)構築體共轉染 HEK293T細胞。於轉染24小時及48小時後向培養物中添加 3〇〇奈克/毫升導蛋白-i(或bFGF)，收集細胞並且使用 Promega之壳度量測分析及victor生物站（Perkin-Almer)對 細胞裂解物實施螢光素酶活性評價。繪示直方圖。指示標 準偏差（n=5)。d，每24小時用添加至培養基中之媒劑（p]3s) 或3 00奈克/毫升導蛋白_1處理來自£16.5}1八1^轉基因胚胎 (PDAPP(J2〇)於C57BL/6J背景中）中之原代神經細胞培養物 並持續3天，此於塗覆後丨5天開始。將培養物固定，用 RNAse處理並用1:1〇〇〇稀釋度之對App之c端結構域具專一 120248.doc •45- 1334784 性之抗體（胺基酸649-664，抗血清i (RU55) 37)染色，隨 後用Alexa488偶聯驢抗兔IgG (Invitr〇gen)染色並用τ〇τ〇 3 對比染色，以顯現DNA。用鐳射掃描共焦顯微鏡（Nik〇n PCM-2000)以600X放大分辨率採集影像之堆棧&步長=25〇 奈米）並用 SimplePCI (Compix公司，Sewickley，pA)軟體收 集。對於各條件，選擇其中可清楚地區分單個細胞之5個 分開之域（避免神經細胞體之團塊）。顯示各條件下獲得之 域之代表性最大強度投射影像。e，使用Zeiss 5i〇 LsM* 像分析軟體之Histogram模塊測定各條件下之代表性整個 核内抗免疫反應性強度分佈（上部組，綠色描記線遍佈於 影像上）。下部組，將強度繪示為距離之函數。f&g，將單 個核（對，n-53 ,導蛋白]，n=5 ”之單個體積（9χ9χ6微 米）自共焦影像之堆棧剪切下來並分別使用Imads Is〇surface 算法（Imaris BitPlane，Zurich，Switzedand)分析。f，對照

及導蛋白-1處i里之神經細胞核之堆擾之最大強度投射。顯 不代表影像。g，神經細胞核中抗〗免疫反應性體素之數 里在已用導蛋白-1處理之神經細胞之核中觀察到APP C 编免疫反應性體素顯著增加（p<0 05，不成對Studentst檢 驗）。 圖5導蛋白-1介導之大腦皮層轴突生長需要App。如右上 方組中所不自幻3.5野生型或App突變胚胎切割下大腦皮層 外植體並在存在或不存在375奈克/毫升導蛋白]下於膠原 蛋白中培養。a 不在丨同測試條件下韩突生長之代表 性〜像。b，對於每一測試條件，自5個不同實驗定量之外 120248.doc •46· 1334784 植體之總數在8至1 2間變化。所顯示值為平均土SEM。比例 尺：200微米。使用Kruskall-Wallis檢驗來比較所有條件 p = 0.001。亦使用Mann-Whitney檢驗來比較+/+與+/-(p = 0.036)以及+/-與-/-(p<10-4)。 圖6導蛋白1抑制淨Αβ肽產生。a，於存在或不存在導蛋 白-1 (90奈克/毫升）下培養來自PDAPP轉基因小鼠及對照非 轉基因同胞仔 （NPDAPP)之腦部切片。於3-5天後收穫上 清液並藉由ELISA分析對Αβ卜40及Αβ卜42加以評價。向所 有Αβ標樣中添加90奈克/毫升導蛋白-1，以排除導蛋白-1 對於ELISA中所用抗體與Αβ上之其表位之結合之干擾。亦 添加NGF (250奈克/毫升）或IGF-1 (100奈克/毫升）作為對照 並且未對Αβ水平產生任何影響（未圖示）。b，藉由ELISA於 5-7月齡PDAPP/導蛋白-1+/-或PDAPP/導蛋白-1+/+小鼠中 量測導蛋白-1表現（插圖）及淨Αβ1-40產生。以在PDAPP-導 蛋白-1+/-小鼠中檢測到之平均Αβ水平與在PDAPP-導蛋白-1+/+小鼠中檢測到之彼水平間之比率形式顯示倍數增加。 研究4群類似年齡動物（導蛋白-1 +/+及+/-)。研究之小鼠總 數為16只。ANOVA檢驗：比較4組中之+/-與+/+ (p<0.027)，比較全部動物中之+/-與+/+ (p=0.0005)。 圖7在組（A)中顯示人類導蛋白-1之胺基酸序列（SEQ ID NO: 1)並且在組（B)中顯示人類導蛋白-1之mRNA序列。 120248.doc -47 -

Claims (1)

1334784 第096113221號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(99年1 〇月） 十、申請專利範圍： 1. 一種導蛋白-1多狀於製造用1於降i或抑制^阿兹海默氏 - 病有關之淨β·澱粉狀肽產生及澱粉狀蛋白質斑點生成之 * 藥物之用$，其中該導蛋白-1多肽包含可a)與天然之 APP蛋白質結合及b)抑制A(3肽產生之胺基酸序列。 2. 如請求们之用途，其中該胺基酸序列足以使該導蛋白·丄 多肽與該APP蛋白質專一性結合。 3. 如π求項丨之用途，其中該導蛋白_丨多肽可藉由改變與 APP信號途徑有關之細胞内蛋白質之局部化、蛋白質-蛋 白質結合及/或酶促活性而模擬導蛋白_丨介導之信號轉 導。 I 4· h請求項i之用途，其中該藥物進一步包含人造咖顆 粒，该人造LDL顆粒包含外部磷脂單層及實心脂質核， 其中該外部稱脂單層包含至少一載脂蛋白，且該實心脂 質核含有該導蛋白_丨多肽。 5. i吻求項丨之用途，其中該導蛋白_i多肽與奈米顆粒結 合，3亥奈米顆粒包含與載脂蛋白E偶合或結合之親水性 蛋白質。 6. 2。月求項1之用途，其中該導蛋白_1多肽與抗糖皮質激素 藥物以足以增加個體之血腦屏障之滲透性之量共同施 用。 如明求項1之用途，其中該導蛋白-1多肽與第二多肽偶 ^其中s亥第二狀或蛋白質能由吸收介導或受體介導胞 轉穿過個體之血腦屏障。 120248-991006.doc 1334784 8.如請求们之用途，其中該導蛋白 強跨膜轉運。 夕肽經化學修飾以增 9·如請求項8之用途，其中該化學修錦勺人 與脂肪酸之共價連接，或該導蛋白導蛋白-1多肽 1〇.如請求項1之用途，其中該藥物係作夕為H糖^化。 病之方案之一部分。 /α療阿心海默氏 U. 一種導蛋白-1治療劑於製造用於降低或抑制與阿兹海¥、 氏病有關之殿粉狀蛋白質斑點生成之藥物之用⑨复·.、大 該導蛋白-1治療劑包含可a)與天然之ΑΡΡ蛋白質結合= 抑制Αβ肽產生之胺基酸序列。 ） 120248-991006.doc