TWI304443B - Alpha-enolase specific antibody and method of use - Google Patents

Description

1304443 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種藉由測定癌症細胞中α-烯醇酶 (alpha-enolase)的含量來監測癌症發展的方法，或者是有關 於一種藉由測定血清中α-烯醇酶特異性抗體的含量來偵測 癌症存在與否和惡化程度的方法。此外，本發明亦是有關 於一種藉由誘導抗-α-烯醇酶的免疫反應來抑制腫瘤生長 的方法。

【先前技術】 確認與腫瘤相關且具有免疫性的分子，不僅是了解這 些分子在腫瘤分子免疫學上扮演何種角色的關鍵步驟，更 有助於腫瘤治療與臨床預後上的應用。惡性胸膜積水 (malignant pleural effusion)通常是因為淋巴球和腫瘤細胞 的浸潤所造成，因此被認為是一處腫瘤細胞生長的局部微 環境（local microenvironment)。有些與肺腫瘤相關的免疫複 合物（Andrews，B.S·，Arora，N.S·，Shadforth，M.F·，Goldberg， S.K·，and Davis，J.S.t. 1981. The role of immune complexes in the pathogenesis of pleural effusions. Am Rev Respir Dis 124:115-120· ; Zeng，C.Q·，Alpert，L.C·，and Alpert，E· 1992· Characterization of a lung cancer-associated auto-antigen. Int J Cancer 52:523-529. ； Gorsky, Y.9 Weiss, I.? and Sulitzeanu，D. 1977. Complexes of breast-cancer-associated antigen (s) and corresponding antibodies in pleural effusions 1304443

from a patients with breast cancer. Isr J Med Sci 13:844-847.) 或自體抗體，例如抗-p53抗體（Lai，C丄.，Tsai，C.M·，Tsai， T.T·，Kuo, Β·Ι·，Chang，Κ·Τ·，Fu，H.T·，Perng，R.P·，and Chen， J.Y. 1998. Presence of serum anti-p53 antibodies is associated with pleural effusion and poor prognosis in lung cancer patients. Clin Cancer Res 4:3025-3030.)、抗-核抗體 (antinuclear antibody)(Wang，D_Y.，Yang，P.C.，Yu，W.L·， Kuo, S.H.? and Hsu? N.Y. 2000. Serial antinuclear antibodies titer in pleural and pericardial fluid. Eur Respir J 15:1106-1110.)及抗-L-Myc 抗體（Yamamoto, A.，Shimizu，E·， Sumitomo, K·，Shinohara，A.，Namikawa，0·，Uehara，H·，and Sone，S. 1997. L-Myc overexpression and detection of auto-antibodies against L-Myc in both the serum and pleural effusion from a patient with non-small cell lung cancer. Intern Med 36:724-727·)，被發現出現在積水液中，而且與 不良的癌症預後有關。一些與肺腫瘤相關的抗原也在惡性 積水（malignant effusion)中被發現，例如細胞角蛋白19片 斷（cytokeratine 19 fragments)、神經元特異性烯醇酶 (EN02)、鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen)( Miedouge, M.，Rouzaud，P·，Salama，G·，Pujazon， M.C.? Vincent, C.5 Mauduyt, M.A.? Reyre, J.5 Carles, P.5 and Serre，G. 1999. Evaluation of seven tumour markers in pleural fluid for the diagnosis of malignant effusions. Br J Cancer 81:1059-1065.)及可溶性 HLA-I(Amirghofran，Z.， 1304443

Sheikhi，Α·Κ·，Kumar，P.V·，and Saberi Firouzi，M. 2002. Soluble HLA class I molecules in malignant pleural and peritoneal effusions and its possible role on NK and LAK cytotoxicity. J Cancer Res Clin Oncol 128:443-448. Epub 2002 Aug 2009·)等等。因此，將有更多具有潛力之與腫瘤 相關抗原和自體抗體等待著被發現。 【發明内容】 本發明是有關於一種監測癌症發展的方法，包括測定 癌症細胞中α-烯醇酶的含量，其中α-烯醇酶含量的增加與 癌症的惡化有關。在另一個實施例中，α-烯醇酶的含量係 藉由計算α-烯醇酶特異性抗體與α-烯醇酶的結合數值來測 得0 本發明也提供一種製備α-烯醇酶特異性抗體的方法， 包括利用含有序列編5虎：1及序列編號:2的引體（primers)或 其退化性變異體（degenerate variants)，以獲得選殖用 (cloning)之互補去氧核糖核酸（cdnA)，並藉由表現（express) 該互補去氧核糖核酸而得到重組蛋白（rec〇mbinant protein)，然後以該重組蛋白來製備多株抗體或單株抗體。 本發明更提供一種偵測癌症惡化的方法，包括測定血 清樣本中心浠醇酶特異性抗體的含量，並以低量的烯醇 酶特異性抗體，來判斷癌症的存在和惡化。 進一步地，本發明提供一種抑制腫瘤生長的方法，包 括誘導抗-α-烯醇酶免疫反應的步驟。 1304443 本^月附加的目的和優點將部分透過以下說明書的敘 乂提出纟餘部分或顯而易見者可由說明書内容中獲得， 或可於本t明的實施過程巾獲得。透過本說明書所描述說 月之技術要素及其組合，尤其是中請專利範圍所詳述者， 將可了解本發明的目的和優點。 一應了解者，不論是上述或以下的詳細敘述，皆僅是示 範矛解釋’並非用以限制本發明的保護範圍。 【實施方式】 一、實施例說明·· (一）、名詞定義： 本祝明書所使用的「單離（isolated)」一詞，其意指將 物質自其原本存在的環境中移出。例如，被發現自然存在 於活的動物身上的多核普酸（P〇lynucle〇tide)或多肽 (polypeptide)並未被單離，但相同的多核苷酸或多肽若被分 離而脫離其原本存在的自然環境，則為單離。此單離的多 核苷酸可以是載體（vector)的一部分，並且（或者）此單離的 多核苷酸或單離的多肽亦可以是組成物的一部分，只要該 載體或該組成物非屬於該單離的多核苷酸和該單離的多肽 原本存在之自然環境即可。 本說明書所使用的「抗體（antibody)」一詞，其意依其 一般定義，並且及於自體抗體、單株抗體和多株抗體，以 及其等抗體之片斷。本發明的抗體可以是嵌合的 (chimeric)、人類化的（humanized)或人類的（human)。 1304443 本說明書所使用的「自體抗體（autoantibody)」一詞， 其意指對抗自己抗原的抗體。例如生物體的免疫系統受到 自身正常且具有抗原性的内生性身體組成物的誘導而產生 對抗生物體自身之該身體組成物的抗體。 本說明書所使用的「單株抗體（monoclonal antibody)」 一詞，其意指由融合瘤（hybridoma)所產生之具有化學及免 疫學上同質性（homologous)的抗體，該融合瘤係淋巴球與特 殊的骨聽瘤細胞經細胞融合而形成，請參照A Laboratory Manual，Harlowe and Lane，eds” Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)。 本說明書所使用的「多株抗體（polyclonal antibody)」 一詞，其意指在對相同抗原的免疫反應下所形成之一個以 上的抗原合成漿細胞（B淋巴球）之無性繁殖系所產生的抗 體。該些抗體通常由業經抗原免疫的動物身體所製造。 本說明書所使用的「α-烯醇酶特異性抗體（a-enolase specific antibody)」一詞，其意指對人類ENO1有高度專一 性的抗體，而非對人類EN02及EN03。 本說明書所使用的「退化性變異體（degenerative variants)」一詞，其意指任何可能的核酸序列或其之仍保有 一 α-烯醇酶PCR引體功能的變異序列，該核酸序列在按照 標準遺傳密碼直接轉譯後可提供一與參考核酸序列所轉譯 出之氨基酸序列相同的氨基酸序列。 本說明書所使用的「積水（effusions or effusion)」一詞， 其意指液體滲出至體腔或組織。例如，胸膜積水（pleural 1304443 effusion)及結節狀胸膜積水（tuberculous pleural effusion) 〇 本說明書所使用的「引體（primer)」一詞，其意指一多 核苷酸鏈，其可在DNA聚合酶作用下於鏈端加入去氧核糖 核苷酸。 本說明書所使用的「重組DNA (recombinant DNA)」一 詞，其意指一 DNA，其係由許多相互異質（heterologous)的 組成部位或序列排列組成，其排列組成的方式並不會發生 在自然界中。更具體地說，在自然界中並不會發現與該DNA 之該組成部位相同之連續核苷酸序列，至少會有排列順 序、方向或間隔的不同。此外，本說明說所提及之標準的 DNA重組及分子無性選殖（molecular cloning)技術係所屬 技術領域習知之技術，詳細的參考資料請參照Sambrook et al. Molecular Cloning ·· A laboratory Manual 及 Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, 1989. A “recombinant protein”。 至於所謂之「重組蛋白」，則係指 利用重組DNA所產生的蛋白質。 本說明書所使用的「低量（low level)」一詞，其意指病 患身上之α -烯醇酶特異性抗體的含量在統計學上顯著低於 健康人，Ρ值< 〇·〇1。 本說明書所使用的「病患（patient)」一詞，其意指哺乳 動物，包含但不限於人類、靈長類、馴養的哺乳動物及實 驗室的哺乳動物等等。 (二）、肺癌之自體抗原/自體抗體 —α -稀醇酶. 本發明利用純化的肺癌積水自體抗體當作探針 10 1304443 (probe)，在肺癌病患的惡性積水中偵測到一腫瘤相關抗 原，p48抗原。藉由生化純化步驟（biochemical enrichment procedures)及質譜測定的分析，確認了該p48抗原為人類 的〇6_烯醇酶（EN01)。 烯醇酶在最早的研究裡，被認為是與糖解代謝 (glycolytic metabolism)相關的酵素，但近來累積的證據卻 顯示，烯醇酶乃為一多功能的蛋白質（Kim，J.W·，and Dang， C.V. 2005. Multifaceted roles of glycolytic enzymes. Trends Biochem Sci 30:142_150·)。研究發現，在哺乳動物 細胞中，烯醇酶存在著三種異構形式，分別標示為α-烯醇 酶（ΕΝ01)、β-烯醇酶（ΕΝ03)及γ-烯醇酶（ΕΝ02)。這三種烯 醇酶異構物的表現，係藉由組織特異性（tissue-specific)的方 式來進行調控。其中α-烯醇酶廣泛地存在於多種組織中， 而β -烯醇酶及γ _烯醇酶則僅分別被發現在神經元（或神經内 分泌組織）及肌肉組織中（Pancholi，V· 2001 · Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases. Cell Mol Life Sci 58:902-920.)。這些烯醇酶異構物會形成異二元體 (heterodimer)或同二元體（homodimer)，而在 解（glycolysis) 過程中催化鱗酸甘油酯（phosphoglycerate)轉變成填酸烯醇 丙酮酸（phosphoenolpyruvate) 〇 除醣解作用的功能，近來更在細胞表面上發現α-烯醇 酶的存在，功能係作為血纖維蛋白溶酶原的一種受體 (Redlitz，A·，Fowler，B.J·，Plow，E.F·，and Miles，L.A. 1995. The role of an enolase-related molecule in plasminogen 11 1304443 binding to cells. Eur J Biochem 227:407-415·)，其意味著細 胞表面上的α-烯醇酶可能在組織侵入（tissue invasion)與細 胞轉移上扮演某種角色。在缺氧（hypoxia)的狀態下，α-烯 醇酶是許多被上調控（Up-regUlated)的壓力蛋白（stress protein)之一，推測其功用係經由提高無氧代謝（anaerobic metabolism)來保護細胞的生存（jiang，β·Η·，Agani，F·， Passaniti，A.，and Semenza，G.L· 1997. V-SRC induces expression of hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) and transcription of genes encoding vascular endothelial growth factor and enolase 1: involvement of HIF-1 in tumor progression. Cancer Res 57:5328-5335·)。利用可選擇的轉譯 起始密碼子（translation start codon)，α-烯醇酶的轉錄本 (transcript)可被轉譯成分子量為37KDa的ΜΒΡ蛋白，該蛋 白位於細胞核中，並且被認為會和c-myc P2啟動子 (promoter)結合，使c-myc基因無法被轉譯而造成細胞生長 受阻（Ray，R_B·，and Steele，R. 1997· Separate domains of MBP-1 involved in c-myc promoter binding and growth suppressive activity· Gene 186:175-180·)。 已經有研究報告指出，對抗烯醇酶之高力價的自體抗 體和多種不同的全身性或器官特異性的自體免疫疾病有關 (Gitlits，V.M·，Toh，B.H·，and Sentry，J.W. 2001. Disease association, origin, and clinical relevance of autoantibodies to the glycolytic enzyme enolase. J Investig Med 49:138-145.)。在這些自體免疫疾病中，a-浠醇酶特異性自 12

1304443 體抗體被發現於罹患腎臟病、病毒性肝炎及全身性紅斑性 狼瘡等等疾病的病患身上。雖然γ-烯醇酶已經被證明是一些 腫瘤的產物（Gomm，S.A·，Keevil，B.G·，Thatcher，Ν·， Hasleton, P.S., and Swindell, R.S. 1988. The value of tumour markers in lung cancer. Br J Cancer 58:797-804·)，但就本發 明人所知，在此之前，α_烯醇酶的自體抗體尚未在癌症病 患的身上被報導。最近一篇研究認為α-烯醇酶可能是人類 口腔鱗狀癌細胞的抗原性標的（antigenic target)( Miyazaki， A·，Sato，N·，Takahashi，S·，Sasaki，A·，Kohama，G·， Yamaguchi，A·，Yagihashi，A.，and Kikuchi，K. 1997· Cytotoxicity of histocompatibility leukocyte antigen-DR8-restricted CD4 killer T cells against human autologous squamous cell carcinoma. Jpn J Cancer Res 88:191-197. ; Sato, N·，Nabeta，Y·，Kondo，H.，Sahara，H·， Hirohashi，Y·，Kashiwagi，K·，Kanaseki，T·，Sato，Y·，Rong， S·，Hirai，I·，et al. 2000. Human CD8 and CD4 T cell epitopes of epithelial cancer antigens. Cancer Chemother Pharmacol 46:S86-90·)，並可被自體的CD4+T細胞所辨識。因此a-烯 醇酶特異性體液免疫（humoral immunity)可能和疾病的惡化 有關。目前為止，和癌症有關的視網膜病變（retinopathy)是 惟一發現和α-烯醇酶自體抗體有關的臨床案例，然而關於 其腫瘤免疫力的提升及如何造成視覺症狀的機制並不清 楚。一般而言，腫瘤細胞的大量生長或不正常的基因表現 (Chen，Υ.Τ. 2000. Cancer vaccine: identification of human 13 1304443 tumor antigens by SEREX. Cancer J 6:S208-217·)，被相信是 誘導該自體免疫疾病之自體抗原的重要產生來源。在本發 明的研究中，則在癌症病患中確認了 α-稀醇酶之自體抗體 的存在。 在本發明的研究中進一步提出了一種製備α-烯醇酶特 異性抗體的方法。此方法包括利用含有序列編號：1及序列 編號：2的引體或其退化性變異體以獲得無性繁殖系用之互 補去氧核糖核酸，並藉由表現該互補去氧核糖核酸而得到 重組蛋白，然後以該重組蛋白來製備多株或單株抗體。 此外，更從癌症病患的積水中單離出專一性對抗人類 α-烯醇酶的自體抗體。 (三）、利用α-烯醇酶以監測癌症發展： 雖然已在一些種類的癌症上觀察到α-烯醇酶基因調控 的改變，但其表現的程度則相當爭議。在一些高度致腫瘤 性（tumorigenic)或轉移性（metastatic)的細胞株（cell line) 中，α-烯醇酶在基因層次的上調控現象可發現於第二型肺 泡細胞（alveolar type II pneumocyte)( Peebles，Κ.Α·，Duncan， M.W·，Ruch，R.J·，and Malkinson，A.M. 2003. Proteomic analysis of a neoplastic mouse lung epithelial cell line whose tumorigenicity has been abrogated by transfection with the gap junction structural gene for connexin 43， Gjal. Carcinogenesis 24:65 1-657·)、小細胞肺癌（Zhang，L·，Cilley， R-E·，and Chinoy，M.R. 2000· Suppression subtractive hybridization to identify gene expressions in variant and 14 1304443

classic small cell lung cancer cell lines. J Surg Res 93:108-119·)，以及頭頸癌細胞（Wu，W·, Tang，X·，Hu，W·， Lotan，R·，Hong，W.K·，and Mao，L. 2002. Identification and validation of metastasis-associated proteins in head and neck cancer cell lines by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Clin Exp Metastasis. 19:3 19-326.) o 相似地，先前一些在乳癌的研究報告中所做的酵素活性測 量研究，其結論亦可歸納得出α-烯醇酶可能參與了癌症病 情之進程（Hennipman，A·，Smits，J·，van Oirschot，B·，van Houwelingen，J.C·，Rijksen，G·，Neyt，J.P·，Van Unnik，J.A·， and Staal, G.E. Glycolytic enzymes in breast cancer, benign breast disease and normal breast tissue.25 1-263.) 〇 近來，在 一個利用基因晶片及ESTs資料庫的生物資訊學研究中顯 示，24種各類癌腫瘤中，有18種會過度表現EN01 (Altenberg, B.5 and Greulich, K.O. 2004. Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes. Genomics 84:1014-1020·) o 活化醣解酵素的基因對於癌症細胞能適應缺氧的微 環境是很關鍵的。在缺氧的情況下，許多基因經由缺氧誘 導性轉錄因子（hypoxia_inducible transcription factor)的活 化（Semenza，G.L” Jiang，B.H·，Leung，S.W·，Passantino，R·， Concordet，J.P·，Maire，P·，and Giallongo，A. 1996. Hypoxia response elements in the aldolase A，enolase 1，and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding 15

1304443 sites for hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 271:32529-32537·)而被上調控，a-烯醇酶是其中之一。最近 一些資料顯示，致癌性AKT及Myc能直接活化醣解作用， 而EN01則是Myc所調控的標的基因之一（Kim，J.W·，Zeller， K.I·，Wang，Y·，Jegga，A.G·，Aronow, B.J·，O’Donnell, Κ·Α·， and Dang, C.V. 2004. Evaluation of myc E-box phylogenetic footprints in glycolytic genes by chromatin immunoprecipitation assays. Mol Cell Biol 24:5923-5936·) o 在一些癌症上可以發現a-烯醇酶的基因調控的喪失，常與 癌症的惡化有著高度的相關性（Peebles，K.A·，Duncan， M.W., Ruch? R.J.? and Malkinson, A.M. 2003. Proteomic analysis of a neoplastic mouse lung epithelial cell line whose tumorigenicity has been abrogated by transfection with the gap junction structural gene for connexin 43， Gjal. Carcinogenesis 24:651 -657. ; Zhang, L·，Cilley，R.E·，and Chinoy, M.R. 2000. Suppression subtractive hybridization to identify gene expressions in variant and classic small cell lung cancer cell lines. J Surg Res 93:108-119. ； Altenberg, B., and Greulich， K.O. 2004. Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes. Genomics 84:1014-1020·)。上述的研究成果回應了 Holland (Holland， J.P·，Labieniec，L·，Swimmer，C·，and Holland，M.J. 1983· Homologous nucleotide sequences at the 5f termini of messenger RNAs synthesized from the yeast enolase and 16 1304443 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene families. The primary structure of a third yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene. J Biol Chem 258:5291-5299.)和 Giallongo (Giallongo，A·, Feo，S·， Moore，R_，Croce，C.M·，and Showe，L.C. 1986. Molecular cloning and nucleotide sequence of a full-length cDNA for human alpha-enolase. Proc Natl Acad Sci USA 83:6741-6745.)早期的觀察，顯示出a-烯醇酶會在指數生長 期的細胞上表現增加，但在細胞生長靜止期卻只有非常很 低的表現。 然而，在最近的一個針對a-烯醇酶表現情況與臨床結 果的關係研究中，卻呈現相當不一樣的結論。該研究利用 9C12單株抗體，發現在帶有非小細胞肺癌的病患身上 (Chang, Y.S., Wu5 W.5 Walsh, G.? Hong, W.K.5 and Mao, L. 2003. Enolase-alpha is frequently down-regulated in non-small cell lung cancer and predicts aggressive biological behavior· Clin Cancer Res 9:3641-3644.)，其 a-烯醇酶的表 現是被向下調控（down_regulation)。9C12單株抗體最早係 由Redlitz的實驗室所研發出來的（Redlitz，A·，Fowler，B.J·， Plow，E.F.，and Miles，L.A. 1995. The role of an enolase-related molecule in plasminogen binding to cells. Eur J Biochem 227:407-415.)，可以分別辨識 U937 細胞溶 解物（lysates)中的54kKDa及48KDa蛋白，以及人類大腦的 純化α-稀醇酶蛋白，意味著上述實驗中，除了α-烯醇酶蛋 17 1304443 白外，存在有另外的α-烯醇酶相關分子（ERM)。此外，雖然 9C12單株抗體在前述報告中並不會和兔子的β_烯醇酶有交 叉反應（cross reaction)，但是否對丫_烯醇酶有專一性（特異性） 則尚未有確認的研究發表。事實上，神經元特異性的稀醇 丫·烯醇酶，也被證實存在肺組織中，例如在上述的研 九中，γ-烯醇酶也存在於CA920的腫瘤細胞株中。因此， 本發明人相信，利用個別稀醇酶異構物的特異性抗體，去 刀辨各種烯醇酶異構物在疾病的致病機轉中所扮演的角色 是一個重要關鍵。 本务明證貫在肺癌病患的癌細胞中α_浠醇酶的表現有 上凋控的情形，並且進一步提供一種監測癌症發展的方 法，包括測定癌症細胞中心烯醇酶的含量，其中α_烯醇酶 含量的增加與癌症的惡化有關。具體而言，在監測癌症的 t展時癌症越末期之病患，其癌細胞中α-浠醇酶的含量 越咼再者，在癌症早期之病患，若其細胞中α-烯醇酶的 含ϊ越咼’則手術後癌症越有可能復發。 在另一個實施例中，α-烯醇酶的含量係藉由計算α烯醇 酶特異性抗體與α-烯醇酶的結合數值來測得。其中α_烯醇 酶特異性抗體係利用含有烯醇酶cDNA的載體去轉染 (transfect)大腸桿菌（Escherichiacoli)，並純化其所製造之重組…烯 醇酶，用以注射動物，以誘導該動物產生免疫反應而製造 獲得。該α-烯醇酶cDNA是由含有序列編號：丨及序列編號:2 的引體或其退化性變異體所獲得。另外，該α_烯醇酶特異 性抗體可以是單株抗體或多株抗體。 1304443 在另一個實施例中，在監測癌症的發展時，α-烯醇酶 的含量可以利用西方墨點法、表面染色法、流式細胞分析 術（flow cytometry analysis)、免疫組織化學法、定量反轉錄 酶-PCR (quantitative reverse transcriptase-PCR)、微陣列分 析（microarray analysis)或是其他所屬技術領域具有通常知 識者所知道之適合的方法來測得。 本發明也提供一種藉由測定癌症病患樣本中α-烯醇酶 特異性抗體的含量來偵測癌症的存在和惡化程度的方法， 其中低量的α-烯醇酶特異性抗體可用以判斷癌症的存在和 惡化。該樣本可以是血清樣本或者是胸膜積水樣本。而所 謂低量α-烯醇酶特異性抗體係指α-烯醇酶特異性抗體的含 量在統計學上顯著低於健康人（Ρ值< 〇·〇1)時的抗體含 量。α-浠醇酶特異性抗體的含量可以利用夾心酵素結合免 疫吸附法、西方墨點法或是其他所屬技術領域具有通常知 識者所知道之適合的方法來測得。 此外，監測癌症的發展時所使用的癌症可以是非小細 胞肺癌，也可以是選擇自腺癌（adenocarcinoma)、鱗狀細胞 癌及大細胞癌（large cell carcinoma)的非小細胞肺癌。 (四）、α-烯醇酶的功能： 一般的觀點認為，醣解酵素的過度表現，例如心浠醇 酶，可能會促進癌症細胞的無氧醣解作用，並且和疾病的 惡化高度相關（Gatenby，R.A·，and Gillies，R.J· 2004· Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nat Rev Cancer 4:891-899.)。在本發明中，藉由獲得對人類a-烯醇酶具有高 19 1304443 度專一性但不會和其他烯醇酶異構物產生交叉反應的兔子 的抗血清，證實了 α-烯醇酶在積水腫瘤細胞和肺癌組織檢 體的腫瘤部分中有顯著的過度表現。巧合地，α-烯醇酶的 分佈也被發現在腫瘤的細胞表面。再者，本發明人亦在免 疫組織化學的研究中，測出α-烯醇酶的表現程度與臨床的 結果有相當密切的關聯。 本發明人相信α-烯醇酶在免疫調控上扮演特定角色。 癌症病患體内之所以有較低量的對抗α-烯醇酶的體液免疫 反應，可能可以歸因於在癌症形成後，因癌細胞過度表現α-烯醇酶，產生免疫抑制作用。其中免疫抑制作用的產生則 有助於癌症細胞的轉移。一般而言，初級腫瘤（primary tumor) 生長過程中其内部細胞缺乏足夠營養及氧氣供應，因而導 致腫瘤壞死（tumor necrosis)。壞死的腫瘤細胞在壞死之前 過度表現α-烯醇酶並釋放出來，而這些α-烯醇酶可能被抗 原呈獻細胞（antigen-presenting cell)呈獻給Τ淋巴球。此類 可辨識α-烯醇酶並將其視為免疫性抗原的自體CD4+T淋巴 球，最近也被發現於罹患口腔鱗狀細胞癌的病患身上（Sato, N·，Nabeta，Y·，Kondo，H·，Sahara，H·，Hirohashi, Y.， Kashiwagi，K·，Kanaseki，T·，Sato，Y·，Rong，S” Hirai，I·，et al. 2000. Human CD8 and CD4 T cell epitopes of epithelial cancer antigens. Cancer Chemother Pharmacol 46:S86-90.) o 過去一些腫瘤相關的抗原，被發現會在許多種類的癌 症中被過度表現，但這些抗原後來也被證明在腫瘤免疫的 調控上具有功能。這些抗原包括吲哚胺-2,3-二氧化酶 20

1304443 (indoleamine-253-dioxygenase, IDO) ( Muller, A.J·， Duhadaway，J.B·，Donover，P.S·，Sutanto-Ward, E·，and Prendergast， G.C. 2005. Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase，an immunoregulatory target of the cancer suppression gene Binl, potentiates cancer chemotherapy. Nat Med 11:312-319. Epub 2005 Feb 2013.) > B7-H1 (Dong, H.? Strome，S.E·，Salomao, D.R_，Tamura，H.，Hirano，F·，Flies， D.B·，Roche，P.C·，Lu，J·，Zhu，G·，Tamada，K_，et al· 2002· Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat Med 8:793-800. Epub 2002 Jun 2024·)及 RCAS1 (Nakashima，M·，Sonoda，K·， and Watanabe，T. 1999. Inhibition of cell growth and induction of apoptotic cell death by the human tumor-associated antigen RCAS1. Nat Med 5:938_942.)。以 B7-H1為例，除了在罹患包括肺癌或其他不同癌症的病患 身上，發現約80-90 %的病患有過度表現的情形外，B7-H1 還有促使腫瘤特異性毒殺T細胞（tumor-specific cytotoxic T cell)凋亡（apoptosis)的功能，進而導致腫瘤細胞的惡化及轉 移。然而，B7-H1的自體抗體僅在罹患自體免疫疾病的病 患身上發現，但尚未有在任何癌症病患身上發現的報告 (Dong，H.，Strome，S.E·，Matteson，E.L·，Moder，K.G·，Flies， D.B·，Zhu, G.，Tamura，H·，Driscoll，C.L·，and Chen，L. 2003. Costimulating aberrant T cell responses by B7-H1 autoantibodies in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 21 1304443 111:363-370·) ° 與B7-H1的情況相似，依據我們初步的研究（部分資料 未顯示），α-烯醇酶不僅在肺癌（約95 %)，而且包括乳癌（大 於90 %)、腸癌（約40 %)及卵巢癌（約30 %)上都有過度表現 的情形。然而，在比較α-烯醇酶自體抗體出現在肺癌病患 的胸膜積水中的發生率（7.4 % : 54個病患中有3個）與出 現在罹患非癌症相關之疾病的病患中的發生率（54.8 %: 31 個病患中有17個）時，發現α-烯醇酶自體抗體出現在肺癌 病患的胸膜積水中的發生率極低。因此，α-浠醇酶在腫瘤 免疫的調控上可能扮演一個重要的角色。 α_烯醇酶除了在醣解作用上的功能已經被完整確定 外，也有研究報告指出，其尚參與了 一些其他的細胞生理 反應，例如轉錄的調控或細胞的侵入等。一些研究已經確 認了 p37KDa 之 Myc 啟動子結合蛋白-l(promoter-binding protein-1，MBP-1)，其為α-烯醇酶的一種轉譯的變異型 (translation variant)。ΜΒΡ· 1 係藉由和 Myc Ρ2 啟動子的結 合，以作為Myc中介（mediated)之基因轉錄的抑制因子 (suppressor) (Ray，R·，and Miller，D.M. 1991. Cloning and characterization of a human c-myc promoter-binding protein. Mol Cell Biol 11:2154-2161.)，其且被相信係透過與細胞核 組織蛋白去乙醯酶（nuclear histone deacetylase)的交互作用 來操控其功能（Ghosh，Α·Κ.，Steele，R·，and Ray，R.B. 1999. MBP-1 physically associates with histone deacetylase for transcriptional repression. Biochem Biophys Res Commun 22 1304443 260:405-409.)。ΜΒΡ-l 在細胞及腫瘤模型（tumor model)的 表現誘使細胞死亡及生長抑制（Ray，R.B·，Steele，R·，Seftor， E·，and Hendrix，M. 1995. Human breast carcinoma cells transfected with the gene encoding a c-myc promoter-binding protein (MBP-1) inhibits tumors in nude mice. Cancer Res 55:3747-3751.)。然而，儘管MBP-1和ENOl的編碼序列有 95 %的相似度，但利用我們的α-烯醇酶抗血清，在積水腫 瘤和控制組細胞的西方墨點法分析中，卻未偵測到任何可 能的ρ37蛋白質。而在免疫組織化學染色法的分析中，發 現一些腫瘤細胞（少於5 %)的細胞核呈現陽性反應，因此進 一步研究ΕΝ01是否在細胞核内扮演一些功能性的角色， 將是釐清α-烯醇酶與ΜΒΡ-1在細胞功能上之差異的另一個 重要課題。α-烯醇酶另一個被假定的細胞功能是作為血纖 維溶酶原的受體，並且被認為在組織侵入上可能扮演一些 角色（1^<1出乙，八.，？0\¥161：，8丄，？1〇\¥，丑.？.，&11(1]^/[1168，[.八· 1995. The role of an enolase-related molecule in plasminogen binding to cells. Eur J Biochem 227:407-415·) o (五）、腫瘤生長之抑制： 本發明描述了一個藉由誘導抗-α-烯醇酶的免疫反 應，來達到抑制腫瘤生長的方法。其係憑藉給予病患α-烯 醇酶抗原，以誘導抗-α-烯醇酶的免疫反應。而將產生高力 價α-稀醇酶抗血清之病患與未產生抗血清之病患作比較， 可以發現前者在腫瘤的大小上相對較小。 在參考本說明書已揭露的敘述說明下，本發明的其他 23 1304443 I施例對於所屬技術領域之通常知識者是顯而易見的。本 成明書及其所舉出的實施例只是示範說明而已，關於發明 精神及其保護範圍t視後附之巾請專利範圍所界定者為 準。 … …本發明内容關於技術或科學上的用詞’除了本發明業 已疋義者外，其他字詞的意義依本發明所屬技術領域之通 常知識者的一般認知為定。 關於數值的範圍，除了本發明業已明確指定者外，包 含介於較高界限值與較低界限值間的任何中間值 (intervening value) ’且料間值的單位可標示到至少為較 低界限值單位的十分之—。再者，本發明包含任何其他指 定的中間值。此外，除了明確地排除於指定值外，本發明 也包含含有較高界限值、較低界限值或兩者的數值範圍。 再者，說明書及附加的申請專利範圍中對於表示成 刀反應條件、百分比、多胜肽長度及多核苷酸長度等等 數量之所有的數值，除了本發明業已明確指定者外，皆可 在其數值前以「約」字作修飾。因此，說明書及附加的申 請專利範圍中所提出的數值參數乃為近似值，在達到本發 明想要的特性下，可以有些差異。而每一個數值參數的解 釋，在使用四捨五入時，至少應解釋到揭露數值之有效數 子r、、、:其並非试圖對申請專利範圍之均等論解釋做限制。 雖然在說明書的實施例中所提出的數值參數盡可能地精 確仁無卿如何，貫驗本身在測量上仍有其固有的誤差。 以下將以貫施例來進一走說明本發明。而這些實施例 24 1304443 只是用來說明本發明並且揭露本發明某些實施例上的各種 有直的特性。因此，以下的實施例不應被解釋為本發明的 限制。 ^一、貫施例： 本發明的實施所利用的技術包括常見的細胞生物技 術、細胞培養技術、抗體技術以及遺傳工程技術。該等技 術皆為所屬技術領域常用的技術，並且在文獻中有詳細的 描述。 以下的實施例說明了 α-烯醇酶特異性抗體在監測不同 癌症發展時期的應用及開發。 (一）、實施例1 : 一般方法 1、惡性胸膜積水及樣本的處理： 在國家衛生研究院人體試驗委員會（IRB)的許可下，自 54個罹患不同肺癌亞型之病患身上收集惡性胸膜積水。這 54個病患中’ 4個患有小細胞癌、45個患有腺癌，另外5 個則患有鱗狀細胞癌。此外，也自23個罹患非癌症相關疾 病的病患身上收集胸膜積水。這23個病患中，12個罹患肺 炎、5個惟患結核病，另外5個則罹患心臟疾病。在使用胸 腔穿刺法（thoracocentesis)收集到胸膜積水後，在兩個小時 内’迅速將該胸膜積水置於離心機中，並在轉速300xg下 離心10分鐘’以使胸膜積水中的細胞沉澱。再利用先前研 究報告（Chen，Y.M·，Tsai，C.M·，Whang-Peng，J·, and Perng， R.P. 2002. Double signal stimulation was required for full recovery of the autologous tumor-killing effect of 25 1304443 effusion-associated lymphocytes. Chest 122:1421-1427·)所 敘述之搭配Ficoll-Plaque Plus Percoll的連續梯度離心法 (serial gradient centrifugation)，將沉澱物中的腫瘤細胞與 積水相關的淋巴球分開，以得到富有腫瘤細胞部份 (tumor-cell enriched fractions)。最後利用細胞檢查的方法 (cytological examinations)估算腫瘤細胞所佔的百分比。 2、 抗體的純化： 利用硫酸銨沉澱法（ammonium sulfate precipitation)， 可以將胸膜積水中的免疫球蛋白部分純化出來。首先，在1 體積的積水液中滴入0.66體積冰的飽和硫酸銨溶液，在4 °C下持續混合1小時，然後置於離心機中，在4 °C下以轉 速lOOOOxg離心10分鐘。將離心得到的沉澱物溶解在0.1 體積的蒸餾水中，然後在磷酸鹽緩衝液（含有1〇 %的甘油） 中連續進行兩個晚上的透析。 3、 免疫轉印法： 免疫轉印法是利用西方墨點法來分析抗體和蛋白質結 合的方法。進行西方墨點法時，欲分析的細胞必須先溶解。 然後將50 pg的細胞溶解物蛋白質在10 %的SDS-PAGE電 泳中分離。利用抗-ρ48、α-稀醇酶、β-烯醇酶、γ-烯醇酶、 GADPH或β麵肌動蛋白的抗體來偵測對抗之蛋白質的存 在，而其所形成的免疫複合物（immunocomplex)則利用 SuperSignal enhanced chemiluminescence(Pierce5 Rockford, IL)的方法來顯像。 (二）、實施例2 :利用癌症積水抗體來辨識p48抗原 26 1304443 為了偵測胸膜積水中存在的體液免疫，一開始乃利用 純化的積水自體抗體對肺積水腫瘤細胞的細胞溶解產物進 行西方墨點法的分析，以篩選能被自體抗體所辨識的腫瘤 蛋白抗原，而分析的結果顯示，p48抗原可被CA926(帶有 肺腺癌的病患）積水自體抗體所辨識。以細胞檢查的方法估 算上述利用連續梯度離心法所得到之腫瘤細胞純度，得到 的數值約為70-90 %。然後以54個癌症病患的細胞溶解產 物及純化的積水抗體，來進行西方墨點法分析。西方墨點 法分析的結果顯示，在這些病患中，病患CA926的自體抗 體可專一性地辨識腫瘤細胞中一個p48的主要蛋白質帶。 利用預先以L89(來自於病患NHRI-L89之肺腺癌細胞 株）細胞溶解產物吸附的CA926積水抗體，進行競爭實驗 (competition experiment)，其結果確認了相同的p48抗原也 出現在L89細胞溶解產物中。首先，利用前述之連續梯度 離心法，從帶有肺腺癌病患的胸膜積水中分離出CA926腫 瘤細胞。再利用硫酸銨分離法（ammonium sulfate fractionation)進行CA926及L89細胞中p48抗原的純化。 然後取30 pg的CA926和L89細胞的純化p48抗原，分別 以CA926抗體和經過L89細胞溶解產物吸附的CA926抗 體，進行電泳及免疫偵測，並以三磷酸甘油醛去氫酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehygrogenase，GADPH)作為 蛋白質加入量的控制組。上述的免疫反應係於一培養歧管 (incubation manifold)(Hoefer)中進行。參照第 1 圖[分子量 標記物（molecular weight markers)係以Kd為單位標示於左 27 1304443 邊]’可以發現CA926抗體會和CA926及L89細胞溶解產 物中的P48結合，而預先以L89細胞溶解產物吸附的CA926 抗體則不會和CA926細胞溶解產物中的P48結合，所以確 定CA926抗體會和該預先吸附的L89細胞溶解產物中的 p48結合。因此，在本發明中乃利用L89細胞株作為p48 抗原純化的來源。 (三）、實施例3 : p48抗原之純化及確認 1、P48抗原之確認： 經由DEAE陰離子管柱、硫酸銨以及長程SDS-PAGE 等分離步驟將P48抗原純化出來後，進一步利用下列的方 法步驟來確認其係為α_稀醇酶。首先，將L89細胞，以細 胞溶解緩衝液進行細胞溶解。該細胞溶解緩衝液係由20 mM Tris-HCl (ΡΗ8.0)、150 mM NaCl 及 0.5 % ΝΡ-40 等溶液 所組成，並且含有蛋白分解酵素抑制混合物（protease inhibitor cocktail)(Calbiochem，La Jolla，CA)。接著取約 45 mg細胞的溶解液進行透析，並經離心的預清理（pre-cleared) 後，以 HiTrap DEAE 管柱（Amershan Biosciences，Uppsala， Sweden)進行分離。該HiTrap DEAE管柱分離使用的緩衝 液係20 mM Tris-HCl溶液（PH7.0)，並且在流壓為lml/min 下，藉由提高NaCl的濃度由〇到ι·〇 μ來進行洗提 (elution)。收集未結合（UB)的細胞溶解產物部分、洗出（w) 的細胞溶解產物部分以及每一個經分離的洗出液（elutant) 部分（F1-F7)後，將其置於磷酸鹽緩衝液中進行透析，然後 以CA928積水抗體作為探針，進行西方墨點法的分析，以 28 1304443 測定每一個部分的p48抗原含量。 在不同的硫酸銨飽和程度（0到80 %)下，以硫酸銨分離 法（Ueyama，H·，Sasaki，I·，Shimomura，K.，and Suganuma，M. 1995. Specific protein interacting with a tumor promoter, debromoaplysiatoxin， in bovine serum is alpha 1-acid glycoprotein. J Cancer Res Clin Oncol. 121:211-218.)進行 p48的豐富化（大約2.5 mg)，並從每一個透析部分取50 gg， 以CA926抗體來進行免疫偵測。

從被硫酸銨分離法豐富化的細胞溶解產物中取100 pg 進行10 % SDS-PAGE電泳，並分別以快速銀染色法（quick silver staining)(Nesterenko, M.V·，Tilley，M·，and Upton，S.J. 1994. A simple modification of Blum’s silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J Biochem Biophys Methods 28:239-242.)，與西方墨點 法（使用CA926抗體）來偵測比對。 將經銀染色處理之膠體上假定的p48蛋白帶割下來， 並以胰蛋白酶（trypsin)進行水解（Gharahdaghi，F·，Weinberg， C.R·，Meagher，D.A·，Imai，B.S·，and Mische，S.M. 1999· Mass spectrometric identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel: a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity. Electrophoresis 20:601-605·) 〇 然後由 Babraham Bioscience Technologies， Inc (Cambridge，UK)禾J 用 API Q-Star ESI-Quadrupole-TOF 進行胜肽質量圖譜分析（peptide mass profile analysis)。再如

29 1304443 先前的研究（Perkins，D.N·，Pappin，D.J·，Creasy，D.M·，and Cottrell，J.S. 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567.)所示，將所得到的胜肽 質量以Moscot搜尋（Moscot search)，透過蛋白質初級序列 資料庫的比對來進行確認。 參照第2圖所示，其結果顯示用以分離細胞溶解產物 的DEAE管柱，有效地吸附94.6 %左右的雜質蛋白，而將 p48排出管柱，顯示未結合（UB)及洗出（W)的部分含有 p48。接著藉增加冰硫酸銨飽和度的方法，將該未結合（UB) 及洗出（W)的部分進一步分離純化。其結果顯示，抗原主要 集中在冰硫酸銨的飽和度為60-80 %部分。再將該純化部分 進行電泳並同時以銀染色法及西方墨點法（使用CA926抗 體）來偵測比對，將相對應具免疫活性的蛋白質（p48)帶割下 來進行質譜測定分析。參照第3A圖所示，經胰蛋白酶水解 的p48蛋白質帶，可以得到MALDI-MS圖譜，而將其中六 個隨機選取的胜肽進行序列分析，確定p48抗原為人類α-稀醇酶（ΕΝ01 ; 2-phospho-D-glycerate hydrolase ； non-neuronal enolase)。P48 之 mass_fit 分析的 MOWSE 分 數為3.24e+〇〇6。上述胜狀與蛋白質資料庫中oc-稀醇酶的序 列比對結果列示於第3 A圖下方。 2、p48抗原同一性的確認： 進一步的研究係利用重組α-烯醇酶蛋白（參見實施例4 的說明）來確認α-烯醇酶為CA926抗體的結合標的。將編碼 1304443 α-烯醇酶的基因自L89細胞中選殖出來，並接上麵胺基硫 S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST)標籤序列。該 GST 標籤序列係為蛋白質純化之用，並於之後藉凝血酶 (thrombin)的酵素水解來除去。接著各取1 pg的GST標籤 蛋白及α-烯醇酶重組蛋白（GST-EN01)，在以（或不以）凝血 酶（ΤΒ)的處理下，分別以GST抗體及CA926抗體（標示於 第3Β圖下方），進行西方墨點法。其結果如第3Β圖所示， CA926抗體專一性地與α-稀醇酶及其接合蛋白（fusion)結 合，但不與GST標籤序列結合，顯示α-烯醇酶為CA926腫 瘤細胞的抗原性標的。 (四）、實施例4 ·· CA926抗體之異構物特異性辨識 到目前為止，在哺乳動物細胞中，僅知道有三種浠醇 酶異構物的存在，即α-烯醇酶（ΕΝ01)、β-烯醇酶（ΕΝ03)及γ-烯醇酶（ΕΝ02)。這三種烯醇酶異構物在蛋白質序列上擁有 大約84 %的同一性。因此，本發明乃進行CA926和L89 腫瘤細胞中烯醇酶異構物的測定。 參照第 4Α 圖，於利用異構物特異性引體 (isoform-specific primers)所進行的 RT-PCR 分析結果中顯 示，CA926細胞表現α-烯醇酶及γ-烯醇酶，但不表現EN03 ; 而L89細胞則主要表現ENOl。上述RT-PCR的分析，係以 β-肌動蛋白基因（β-actin gene)作為内部控制（internal control) 〇 為了測定CA926抗體對異構物的辨識特異性，乃使用 各異構物之重組烯醇酶蛋白來偵測與CA926抗體的結合。 31 1304443 首先，利用RT-PCR分別自人類心臟（Strategene, La Jolla， CA)及CA926 cDNA池（pools)中選殖出人類β-烯醇酶及γ-烯 醇酶基因。上述基因選殖所使用的異構物特異性引體描述 於下：γ-烯醇酶的前置引體（forward primer)為 5、ATTGAATTCTTCCATAGAGAAGATCTGGGCCCGG-GA GAT-3，（序列編號：3);而γ-烯醇酶的反置引體（reverse primer) 為 5，-ATTGAATTCTCACAGCACACTGGGATTACGGAAG-3’ (序列編號：4) ; β-烯醇酶的前置引體為 5，-AGGG-AATTCTGCCATGCAGAAAATCTTTGC-3’（序列 編號：5)， 而 β-烯醇酶的反置引體為 5，-ATTGAATTCTCACTT-GGCCTTCGGGTT-3’（序列編號： 6)。接著將得到的片段以 EcoRI水解後選殖入 pBlueScript-myc載體，並如先前研究所述（Shih，N.Y·，Li， J.，Karpitskii，V·，Nguyen, A·，Dustin，M.L·，Kanagawa，0·， Miner，J_H·，and Shaw，A.S. 1999. Congenital nephrotic syndrome in mice lacking CD2-associated protein. Science 286:312-315.)，藉T7牛痘病毒的感染將該載體送入HeLa 細胞中，並使之大量表現，以製造myc-γ-浠醇酶及myc-β-烯醇酶。此外，為了產生重組α-烯醇酶蛋白，乃利用RT-PCR 將α-烯醇酶基因自NHRI-L89細胞中選殖出來，其所使用的 基因特異性引體（gene-specific primers)描述如下：前置引體 為 5，-GGTGGAATTCTATCTATTCTCAAGATCCAT-GCC-3, (序列編號：1)， 而反置引體為 32 1304443 5 -ACTCCATGGITACTTGGCCAAGGGGTTTCT-3’（序列編 號· 2)，並以上述之方式製造myc_a_烯醇酶。另外，將上 述RT-PCR產生之α-烯醇酶基因片段以Ec〇RI&价〇1水解 後，選殖入pGEX-KG載體，並使其在大腸桿菌中大量表 現，以產生與GST標籤序列接合的重組蛋白（gst_en〇i)。 然後以麵胺基硫glutathione固定化親合性色層分析法 (glutathione-immobilized affinity chromatography)(Sigma5

St· Louis)進行蛋白質的純化。 如第4A圖所示，其結果顯示CA926抗體對…烯醇酶 -致性地表現出高度的專一性，但對β _烯醇酶及γ _烯醇酶則 否。而利用純化的重組蛋白為標的進行西方墨點法，㈣ 定病患之α-烯醇酶特異性積水抗體的發生率時，如第丨丨圖 所示，其中Α組及Β組分別代表54個癌症病患及^個^ 癌症病患的實驗結果，發現α_稀醇酶積水自體抗體出現在 癌病患中的發生率（54個病患中有3個）遠低於罹患非癌症 相關之疾病的病患（31個病患中有17個），顯示心烯醇酶中 介的免疫調節可能發生在大部分的癌症病患身上。上述第 U圖中八組所標示的*係表示在財驗中_到的微弱免 疫活性。 (五）、實施例5: α-烯醇酶在肺腫瘤細胞及組織中的大量表 現 文 本發明利用&烯醇酶抗血清免疫轉印法、α-烯醇酶表 面染色法及免疫組織化學染色法等實驗方法，來則$ 醇酶在腫瘤細胞中是否有不正常的表現。上述實驗::：株 33 1304443 人類肺癌初級細胞作為實驗組，以正常人類支氣管表皮細 胞（normal human bronchial epithelial cells ·· NHBE)及小氣 道表皮細胞（small airway epithelial : SAEC)作為控制組。從 西方墨點法和免疫組織化學分析的結果中，強有力地指出 烯醇酶在肺癌中表現的提昇，是普遍存在的現象。 1、α-稀醇酶抗血清之免疫轉印實驗： (1)、基因選殖及抗血清的製備： α-烯醇酶、β-烯醇酶及γ-烯醇酶基因的選殖及其重組蛋 白的製造已於實施例4中說明。而α-烯醇酶特異性的兔抗 血清則是由台灣的Kelowna Inc.公司利用上述的重組 GST-α-烯醇酶蛋白所製備得到。為了避免交叉反應，該抗 血清尚以固定化GST-樹脂及表現GST標籤蛋白的大腸桿菌 溶解產物進行處理，以除去GST特異性抗體及其他干擾抗 體。 利用西方墨點法及免疫沉澱法（immunoprecipitation)， 可以檢測兔抗血清對於烯醇酶個別異構物的專一性。首 先，參照第4B圖上方所標示，將HeLa細胞以分別表現有 myc·標定的α-烯醇酶（myoENOl)、有myc-標定的γ-烯醇酶 (myc-EN02)、有myc-標定的β-烯醇酶（myc-EN03)及有 myc-標定的空載體（myc-Tag)等載體進行轉染 (transfection)。接著參照第4B圖左方所標示’個別取30 pg 之上述的轉染細胞溶解產物，並將其以10 %的SDS-PAGE 電泳分離，然後以CA926積水抗體或其他的抗血清作為探 針。而在免疫沉澱法（IP)的實驗中，個別70 Pg之上述稀醇 34 1304443 酶異構物的轉染細胞溶解產物， ^ J Ua_烯醇酶抗血清進行雜 =，然後以G蛋白珠（Protein_G beads)㈣咖，⑽㈤， 仃沉澱後，並使用對my,定蛋白有特異性的抗體為探 針，其中HeLa之内生性α_婦醇酶係標示在帛4_的右方。 如第4Β圖所不，其貫驗結果顯示本發明所製備之抗血清明 顯專一地辨識α-烯醇酶。 (2)、〇c -稀醇每表現程度的測量： 為了測定α-稀醇酶的表現程度，乃自54個帶有肺癌的 病患中遥出17個，以及自31個罹患非癌症相關疾病的病 患中選出6個，針對該共23個病患的積水進行檢查（該23 個病患的積水内具有足夠量的癌細胞或其他細胞），並以購 自Cambrex (Walkersville，MD)，在正確培養條件下，繼代 數為2之正常支氣管/氣管初級表皮細胞（NHBE)及小氣道 初級表皮細胞（SAEC)為控制組。各取30 pg之上述細胞的 細胞溶解產物，並溶解於1〇 %的SDS-PAGE，然後以EN01 抗血清進行免疫轉印分析。如第5A圖所示，其結果顯示相 較於NHBE、SAEC及來自於選自3 1個罹患非癌症相關疾 病的病患中之6個病患的肺積水細胞，CA926、L89及來自 於選自54個帶有肺癌的病患中之17個病患（14個患腺癌、 1個患磷狀細胞癌、2個患小細胞肺癌）的積水癌細胞中… 烯醇酶均有顯著的過度表現現象。第5A圖中的WI38為肺 胚胎表皮表皮細胞株（lung embryonic epithelial cell line) 〇 2、α-烯醇酶表面染色法及流式細胞分析術： (1)、細胞： 35 1304443 積水初級腫瘤細胞株（CA926)係來自於一位56歲患有 肺腺癌的女性病人。在實驗室裡以細胞培養液進行繼代培 養，並以繼代數為2之細胞作為本發明實驗之用。該CA926 之細胞培養液的製備係在DMEM中加入10 %的胎牛血清 (FBS) (Hyclone，Logan，UT)、1 mM 的丙酮酸鈉（Introgen， Grand Island，NY)、0.1 mM 的非必須氨基酸（Sigma-Aldrich， St. Louis)、2 mM的麩醯胺酸、50pg/ ml的鏈黴素及500 U/ml的盤尼西林。另外，NHRI-L89細胞株則是來自於一 位 36 歲患有第 IV 期肺腺癌（cytokeritin (+ )/calretinin (—)) 的女性病患的積水腫瘤細胞。該細胞培養在RPMI1640培 養液中，並在培養液中加入5 %的胎牛血清、2 mM麵醢胺 酸及抗生素，使用繼代數至少40為實驗之用。 (2)、表面染色法及流式細胞分析術： 進行流式細胞分析術時，先將分離自癌症或非癌症相 關的積水液的細胞培養在ALC-4 (Masuda，N·，Fukuoka，M·， Takada， M·， Kudoh, S·， and Kusunoki， Y. 1991. Establishment and characterization of 20 human non-small cell lung cancer cell lines in a serum-free defined medium (ACL-4)· Chest 100:429-438·)及 RPMI-1640 培養液（1:1)中 一個繼代或兩個繼代。接著將完整的細胞分別以α-烯醇酶 抗體（1:300稀釋）及無抗體染色處理，並以結合Cy2(Jackson Lab)的山羊抗兔血清來顯像。然後在FACScan流式細胞儀 (Becton Dickinson)上進行分析。 如第5B圖所示，由L89 ' CA926以及兩種控制組細 36 1304443 胞（肺初級細胞：NHBE及SAEC)的完整細胞表面染色結果 顯示，僅L89和CA926呈現陽性反應。由於在上述免疫 轉印實驗中顯示有α-烯醇酶過度表現現象的細胞，於α-烯 醇酶表面染色的結果上亦呈現陽性反應，因而支持了前述 認為α-烯醇酶在癌症轉移上扮演某種角色的推論（Redlitz， A·，Fowler，B.J·，Plow，E.F·，and Miles，L.A. 1995. The role of an enolase-related molecule in plasminogen binding to cells. Eur J Biochem 227:407-415·) o 2、免疫組織化學分析： (1) 、組織樣本準備及病患的臨床特性描述： 經石臘處理組織的禮得係經過醫院的倫理委員會認 可。經福馬林固定化及石臘包埋的組織係由80個帶有非小 細胞肺癌（NSCLC)的病患上取得，其中40個患有鱗狀細胞 癌（SCC)、3 1個患有腺癌（AD)、4個患有腺鱗狀細胞癌 (adenosquamous cell carcinoma)以及5個患有大細胞癌。腫 瘤細胞組織學的定性係根據WHO的分類，而疾病的期數則 是藉腫瘤大小及淋巴節轉移與否（node metastasis)來判斷。 沒有病患接受過輔助性或新輔助性化學治療。外科手術則 於西元2000年1月至2001年12月於台中榮民總醫院進行 並有完整的追蹤。 (2) 、免疫組織化學（IHC)分析： 為了測定α-烯醇酶在肺腫瘤中的表現，乃在80個病患 的樣本上進行免疫組織化學分析，並採用通常的分析方 法。簡單地說，組織切片（約4 um厚）放置於塗上聚離胺

37 1304443 酸的玻片上，經風乾及脫臘處理。接著置於含有0.3 5 %過 氧化氳的50%甲醇中約30分鐘，以中止内生性過氧化酶 的活性。將切片再脫水，並以磷酸鹽緩衝液（PBS)清洗，再 與α-浠醇酶抗血清（1:2000稀釋）進行衅養（incubation)。此 外，藉由以免疫前血清（pre-immunized serum)、抗-GST標 籤蛋白之抗血清或預先以1 mg的膜固定化GST-EN01抗 原（1:2000稀釋）吸附的α-烯醇酶抗血清，處理相同樣本所 得到的染色切片，亦可用來檢測α-烯醇酶抗血清的專一 性。在上述的切片與生物素化二級抗體（biotinylated secondary antibody)作用之後，以3,3-二氨聯苯胺溶液（Dako, Carpinteria CA)處理切片，再使用 ABC複合物（ABC complex)來顯像，並且以蘇木素（hematoxylin)進行相對染色 (counter-stained)。染色組織切片係在放大100倍（第6圖的 a-e)及200倍（第6圖中d-f的插入方框）的情況下進行觀 察，scale bar 為 100 μπι 長。 在本實驗中，80個樣本中有76個樣本清楚地顯現陽性 免疫染色，並在該76個樣本的所有腫瘤部分（參照第6圖 的a、e)及控制組腫瘤切片（參照第6圖中的f)中呈現出強 烈的細胞質染色結果；此外，在一些腫瘤細胞上亦清楚地 偵測到細胞膜或細胞核的染色。另外一方面，鄰近腫瘤的 基質組織（stroma tissue)，以及位在腫瘤遠端或在控制組切 片内看起來正常的肺泡表皮細胞，皆呈現很低的基礎染色 (參照第6圖f中的插入方框）。尤其在靠近腫瘤部分的肺泡 細胞，不是在細胞質或細胞核就是在細胞膜上呈現出增強 38 1304443 的陽性免疫染色（參照第6圖d中插入方框内的箭頭）。第6 圖中的b及c係分別使用預先以膜固定化GST-EN01抗原 (1:2000稀釋）吸附的α-烯醇酶抗血清及抗-GST標籤蛋白 之抗血清之兩組控制組。結論是，在腫瘤組織内或近腫瘤 的組織内可以觀察到心稀醇酶抗血清的陽性免疫染色增 加0 (六）、實施例6 : α-烯醇酶表現的上調控與臨床結果 1、α -稀醇酶表現的定量與統計分析： 為了瞭解α-烯醇酶上調控的表現與病患臨床結果間的 關係，乃利用 Pearson’s chi-squared test進行分析。病患 的特性和臨床病理學的參數全部包括在本實驗中。本實驗 含括80位罹患NSCLC的病患，並且進行60個月的術後 追縱，而全部病患數後追蹤期間的中間值是29·5個月。 積水細胞中α_烯醇酶的染色觀察是在放大倍數200倍 下，以快速計分法（Quick score method) (Barnes，D.M·， Harris，W.H·，Smith, Ρ·, Millis, R.R·，and Rubens，R.D· 1996· Immunohistochemical determination of oestrogen receptor: comparison of different methods of assessment of staining and correlation with clinical outcome of breast cancer patients· Br J Cancer 74:1445-1451·)，進行半定量法分析， 並且由兩位病理學家以盲式（blinded manner)獨立進行。遇 有衝突的計分（Conflicting scores)，則在顯微鏡觀察下討論 後（discussion microscope)決定。正常的肺細胞切片及控制 組切片都在本實驗的範圍内。總之，此快速計分法考慮到 39 1304443 腫瘤内α-烯醇酶免疫活性的強度和分布。其中就強度分數 而言，以0、1、2及3來分別表示陰性的、微弱的、中等 的及強烈的染色結果；就分布的分數而言，呈現陽性染色 反應的腫瘤比率依下列分數定之：0 % = 0、1-25 % = 1、 26-50 % =2、 51-75 % = 3 ^ 及 76-100 % = 4。結合上述 得到之陽性染色反應者的強度分數及分布分數，最後給予 一個範圍從0到7的快速計分。另外，在存活分析方面， 乃進行存活（overall survival，OS)及無癌症存活 (progression-free survival，PFS)的統計分析。其中 OS計算 的期間是從手術日起到死亡日；而PFS計算的期間是從手 術曰起到癌症復發日或死亡日。存活且無癌症復發之病患 其OS及PFS為最後追縱曰，利用chi-square test來估算α-烯醇酶表現與第1表中之類別變數（categorical variables)間 的關係。至於OS及PFS與α-烯醇酶表現程度（快速計分< 5 or — 5)間的關聯性則以Kaplan-Meier method來分析。此 外，尚以log-rank test來分析成對存活率間的差異性。P值 <0.05則可認為其差異有統計上的意義。 2、α-烯醇酶表現與癌症發展的關係： 在上述80個病患中，有30個病患死於肺癌，並且OS 的中位數為10個月（從2個月到42個月）；有45個病患經 歷疾病的復發。利用 Quick score method (Rhodes，Α·，Jasani， B·，Barnes，D.M·，Bobrow，L.G·，and Miller，K.D. 2000. Reliability of immunohistochemical demonstration of oestrogen receptors in routine practice: interlaboratory 1304443 variance in the sensitivity of detection andevaluation of scoring SyStems_ j clin Path〇1 53:125_13〇)進行…烯醇酶表 現If况（ < 或—5)的半定量分析，其結果顯示年齡、性別、 抽煙習慣或者組織學上的次類別並未對…烯醇酶表現情況 k成統计上的差異（第1表）。相對地，腫瘤的期數及復發則 與EN01表現程度有南度的相關。癌症第hi期（93 %)或復 t (89 /〇)的病患，其烯醇酶的表現乃明顯高於癌症第"η 期（71 %)或無復發（66 %)的病患（Ρ值分別為〇 〇18與 0.012)。再者，如第7圖所示，利用c〇x，s叫⑽analysis 的分析結果顯示，腫瘤高度表現心烯醇酶（快速計分$5)與 車乂差的的OS及PFS有南度相關，並有統計上的意義（p值 分別為0.0027與0_0035)(在第7圖中，針對肺癌病患en〇i 表現卩快料分- 5表示。p值的決定則是依照 1吩咖k test)。㈤日夺，在相同的分析方法下，肺癌病患α· 烯_表現程度和NSCLC的腫義數之相關性，也顯示出 與〇S及PFS有相同的趨勢（資料未顯示）。這些分析資料進 —步指出’ENCM的過度表現與臨床結果有高度相關，'並且 可以用來當作臨床預後的指標。 變數 快速計分 第1表 ENOl表現 ，(%)分數 <5(%)分數 <5(%) 8〇 ⑽） 17(21) 63(79) 41 1304443 中間年齡（年) <65 29(36) 6(21) 23(79) >65 51(64) 11(22) 40(78) 0.926 性別 男 69(86) 15(22) 54(78) 女 11(14) 2(18) 9(82) 0.789 抽煙習慣 Μ 25(31) 8(32) 17(68) 有 55(69) 15(27) 40(73) 0.665 組織學分類 鱗狀細胞癌 40(50) 8(20) 32(80) 非鄰狀細胞癌 40(50) 9(22) 31(78) 0.785 腺癌 31(39) 6(19) 25(81) 非腺癌 49(61) 11(22) 38(78) 0.742 癌症期數 I + II 51(64) 15(29) 36(71) III 29(36) 2(7) 27(93) 0.018* 復發 Μ j \\\ 35(44) 12(34) 23(66) 有 45(56) 5(11) 40(89) 0.012* *表示有統計上的顯著差異（P値<〇.〇5) (七）、實施例7 :非小細胞肺癌病患血清中有較低量的α·烯 醇酶特異性抗體 利用夾心酵素結合免疫吸附法（sandwich ELISA assay) 來個別地測定正常人、罹患非癌症相關疾病之病患及罹患 非小細胞肺癌之病患等血清中α-烯醇酶特異性抗體的高 低。首先，在ELISA盤上每一個孔洞底覆蓋GST特異性抗 42 1304443 體，然後在ELISA盤每一個孔洞中加入〇 2 純化的 ^ α稀醇_重組蛋白，使GST-α-稀醇酶重組蛋白固定化 於其上。以a-烯醇酶特異性抗血清作為標準品，用以建立… 稀醇酶特異性抗體含量標準曲線。至於待測血清則係取自 於5個正常人、21個罹患非癌症相關疾病之病患及35罹患 非小細胞肺癌之病患（包括腺癌、鱗狀細胞癌及大細胞癌）。 接著將這些血清樣本以1:10的稀釋後進行EUSA實驗，其 中用結合HRP之山羊的抗·人類IgG來偵測血清樣本中 EN01抗體，並以HRp的受質（ABST)進行反應，在〇d_ 下測得吸光值，用以顯示a_烯醇酶特異性抗體的含量。參 第8圖，其結果顯示，非小細胞肺癌病患血清中…烯醇 酶特異性抗體的含量，在統計上顯著低於正常人及非癌症 相關疾病病患（P值< 〇.〇 1)。 (八）、實施例8:誘導產生抗-a_烯醇酶體液免疫反應 (humoral immune response)可以抑制腫瘤的生長 利用誘導老鼠產生抗烯醇酶的體液免疫反應以測 定該體液免疫對腫瘤生長的影響。首先，將肝 癌細胞以皮下的方式注射到BalB/c老鼠身上。兩個星期後 (從接種肝癌細胞日算起第14天），再分別給予老鼠佐劑 CpG 1826 (50 pg)混合 mouse_h〇m〇1〇g GST-EN〇1 (mEN〇i) 抗原（20 pg)或者是佐劑CpG 1826 (50吨）混合GST蛋 白（20 gg)之疫苗（腹腔内注射），以誘導產生抗烯醇酶免 疫反應，並在第28天及第35天以相同混合物進行免疫反 應的補強注射。每週測量經免疫處理之老鼠的腫瘤大小（第 43 1304443 9圖），並且取1 pg的純化的mENOl抗原當作標靶蛋白進 行西方墨點法，以分析α-烯醇酶抗血清的含量（第10圖）。 在老鼠接受最後一次免疫補強注射後一星期進行採血，得 到的結果顯示，6隻老鼠接受mENOl抗原注射後，其中3 隻在血清中產生高量mENOl抗血清的老鼠（_)(1:3000稀 釋，在10秒内偵測到1 pg的mENOl抗原），其腫瘤小於 另外3隻同樣接受mENOl抗原注射，但未在血清中測得 mENOl抗血清的老鼠（□)以及6隻接受GST蛋白注射而並 未產生mENOl抗血清的老鼠（△)。 【圖式簡單說明】 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例 能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： 第1圖係繪示一免疫轉印法（immunoblotting)的分析結 果。其結果顯示，在CA926和L89腫瘤細胞中，p48抗原 是CA926積水抗體（effusion antibody)主要的免疫活性標 的。 第2圖係繪示一 p48自體抗原純化有關的步驟。 第3A圖係繪示一 p48蛋白的質譜測定分析（mass spectrometry analysis)結果。其結果確認ρ48為人類的α-烯 醇酶。 第3Β圖係繪示一西方墨點法的分析結果。其結果顯 示，CA926抗體能專一性地辨識α-烯醇酶(ENOl)及其融合蛋 白0

44 1304443 第4A圖係繪示一反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR)的分 析結果。其結果顯示，CA926表現α-烯醇酶（EN01)及其異 構（isoform)蛋白γ-烯醇酶（ΕΝ02)，而L89則顯著表現α-烯 醇酶（ENOl)。 第4Β圖係繪示一西方墨點法的分析結果。其結果顯 示，CA926抗體對烯醇酶的異構蛋白α-烯醇酶（ΕΝ01)具有 專一性。 第5Α圖係繪示一使用α-烯醇酶（ΕΝ01)抗血清 (antiserum)之免疫轉印法的分析結果。其結果顯示，α-烯醇 酶在癌症病患的肺腫瘤細胞中過度表現。 第5Β圖係繪示一使用或不使用α-烯醇酶抗血清之表 面染色法（surface staining)的分析結果。其結果顯示’在使 用α-稀醇酶抗血清的情形下，L89和CA926的細胞表面均 可測到α-烯醇酶存在。 第 6 圖係繪示一免疫組織化學染色法 (immunohistochemical staining)的分析結果。其結果顯示， 在肺腫瘤組織及控制組組織中，僅腫瘤組織的α-烯醇酶表 現呈現增加的情形。 第1圖係繪示一卡本一麥爾分析（Kaplan-Meier analysis)的分析結果。其結果顯示，腫瘤α-稀醇酶的表現程 度越高，癌症病患之存活（overall survival: OS)及無癌症存 活（progression-free survivals : PFS)期間越短。 第8圖係繪示一夾心酵素結合免疫吸附法（sandwich ELISA)的分析結果。其結果顯示在非小細胞肺癌（non-small 45 1304443 cell lung cancer)病患的血清中有較低量的α-烯醇酶（enou 抗體。 第9圖係繪示一給予或不給予α-烯醇酶（ENOl)抗原之 老鼠腫瘤大小的量測結果。其結果顯示，給予…烯醇酶抗 原且已產生可測得之α_烯醇酶抗體的老鼠，其腫瘤大小最 小〇 第10圖係繪示一西方墨點法的分析結果。其結果顯 不’ α-稀醇酶（ΕΝ〇1)抗體存在於3隻免疫注射後的老鼠血 清中。 第11圖係繪示一於癌症病患或非癌症病患血清的西方 土點去刀析結果。其結果顯示，在癌症病患的血清中存在 車父低量的〜烯醇酶（ΕΝ01)抗體。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

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十、申請專利範圍： EZj 曰修(更)正替換頁as. ι·一種監測非小細胞肺癌發展之方法，包含測定非小 細胞肺癌細胞内之α-烯醇酶的含量，其中該…烯醇酶的含 量增加與該非小細胞肺癌的惡化有關。 2.如中#專利範圍帛i項所述之監測非小細胞肺癌發 展之方法’其中該α_烯醇酶的含量在非小細胞肺癌越末期 時越高。 3 ·如U利|&圍第i項所述之監測非小細胞肺癌發 展之方法，其中該α-烯醇酶的含量越高，貝⑽小細胞肺 癌越容易復發。 4.如申請專利範圍第1項、第2項或第3項所述之監 # ，則非小細胞肺癌發展之方法，其中該a.烯醇酶的含量係藉 由計量該CC-烯醇酶與…烯醇酶特異性抗體結合的多寡來決 定。 5.如申請專㈣圍第4項所述之監測非小細胞肺癌發 展之方法，其中該OC-烯醇酶特異性抗體係於一重組蛋白所 誘導的免疫反應中產生，而兮I知疋A α Α ^ 0 王而5亥重組蛋白係以含有序列編 就· 1及序列編號：2的引體所值5丨从Λ 旧Ή篮所付到的cDNA，經表現該cDNA 所得到。 1304443 公告本 |的年更)正替換頁 、6·如申請專利範圍第1項、第2項或第3項所述之監 測非小細胞肺癌發展之方法，其中該〜烯醇酶含量的測定 方去係選自於西方墨點法、表面染色法、流式細胞測量術、 免疫組織法、定量反轉錄酶_PCR及微陣列分析。 7·如申請專利範圍第1項所述之監測非小細胞肺癌發 展之方法，其中該非小細胞肺癌係選自腺癌、鱗狀細胞癌 及大細胞癌所組成的族群。 8·如申請專利範圍第1項所述之監測非小細胞肺癌發 展之方法，其中該非小細胞肺癌係腺癌。 9_ 一種偵測癌症之方法，包含測定樣本中之心烯醇酶 特異性抗體的含量，其中低量的該〜烯醇酶特異性抗體可 用以判斷癌症的存在和惡化。 10. 如申請專利範圍第9項所述之偵測癌症的方法， 其中該樣本係血清樣本或肺膜積水樣本。 11. 如申請專利範圍第9項所述之偵測癌症的方法， 其中該癌症係非小細胞肺癌。 12.如申請專利範圍第U項所述之偵測癌症之方 1304443 公告本

法，其中該非小細胞肺癌係選自腺癌、鱗狀細胞癌及大細 胞癌。 13 ·如申請專利範圍第11項所述之 貞測癌症之方 法，其中該非小細胞肺癌係腺癌。 14. 一種誘導抗-α-烯醇酶之免疫反應的醫藥組合物， 其包括α-烯醇酶抗原或α-烯醇酶特異性抗體。