CN114426581B

CN114426581B - 一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN114426581B
Application number: CN202210011886.4A
Authority: CN
Inventors: 闫亚平; 郝文斌; 穆瑜; 张亚剑; 王璐; 刘龙月; 李科
Original assignee: Shaanxi Mybiotech Co ltd
Current assignee: Shaanxi Mybiotech Co ltd
Priority date: 2022-01-07
Filing date: 2022-01-07
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2042-01-07
Also published as: CN114426581A

Abstract

本发明涉及一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明所述单克隆抗体12D11包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，所述重链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。本发明所述烯醇化酶单克隆抗体特异性好、效价高、纯度高，能够特异性检测ENO1、ENO2和ENO3。

Description

一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

烯醇化酶(enolase)是生物体内糖酵解过程中的关键酶，在脊椎动物中，烯醇化酶存在3种同功酶:α，β，γ。α-enolase(ENO1)又称为非神经元烯醇化酶(non-neuralenolase，NNE)，在许多组织均存在；β-enolase(ENO3)又称为肌肉特异性烯醇化酶(muscle-specificenolase，MSE)、骨胳肌enolase(skeletalmuscleenolase)，几乎仅见于肌肉组织；γ-enolase(ENO2)又称为神经元烯醇化酶(neuraleno-lase)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificeno-lase，NSE)，主要存在于神经元和神经内分泌组织。Enolase的活性形式均为二聚体，即由两个亚基组成，目前已知有5种形式的组合:αα，ββ，γγ，αβ，αγ。

α-enolase(ENO1)是一种多功能蛋白，除了作为糖酵解反应的限速酶外，还参与细胞的其他生物学活动。细胞的生命活动时刻需要能量的供给，α-enolase正是通过调节细胞的产能过程，维持细胞ATP水平，保证细胞的存活及其生理功能的执行。α-enolase作为一种能量代谢过程中重要的酶，其表达水平和活性也发生适应性变化，以满足细胞不同状态下的需求。另外，α-enolase作为一种自身抗原，既是胞浆酶，又可表达于肾脏、血管等组织及一些细胞如内皮细胞膜或与细胞表面结合。α-enolase发生氨基甲酰鸟氨酸化，并刺激机体产生特异性自身抗体，从而引发类风湿性关节炎的慢性炎症反应。自身免疫性视网膜病变患者体内存在抗α-enolase抗体，此外，α-enolase也存在于人呼吸道上皮细胞中，作为自身抗原诱导自身免疫反应，造成呼吸道上皮细胞损伤，诱发气道炎症反应。另外，α-enolase作为一种致免疫性的肿瘤相关抗原，与肺癌等的预后差和肿瘤的恶性度高相关，这些均提示α-enolase可能作为预测肿瘤进展程度的一个生物学标志物。

烯醇化酶2(ENO2)，又称神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)，NSE主要存在于神经元和神经内分泌细胞的胞质。神经元特异性烯醇化酶是一种普遍存在于生物体细胞质中能敏感反映神经元损伤的神经系统特异糖酵解酶。

NSE最早是作为小细胞肺癌的肿瘤标记物，但近年来越来越多的研究结果表明NSE可作为各类神经元损伤的特异性标志。在脑血管病，尤其在脑出血方面，越来越受到人们的重视。测定NSE在脑出血的诊断，判断疾病严重程度，估计预后和指导治疗等方面具有重要意义。

在脑损伤性疾病中，神经细胞中的NSE透过血脑屏障释放入脑脊液及血液中，引起血清及脑脊液中NSE水平升高，不同程度及不同性质的脑损伤NSE释放的量及速度亦不相同，且在广泛的脑损伤和越来越严重的继发性脑损伤患者中NSE持续升高，因此，其水平不仅能反映原发性脑损伤的程度，而且能反映继发性脑损伤的进展。检测血清NSE水平可为颅脑损伤和脑出血等脑血管性疾病诊断及预后判断提供一种新的手段。NSE作为神经重症监护的长期预后生物标志物和治疗指标具有极好的潜力。

肌肉特异性烯醇化酶β-enolase(ENO3)，是一种鉴别肌肉损伤的marker。

血清烯醇化酶及肌肉特异性烯醇化酶是诊断急性心肌梗死(AMI)的特异酶。在血清学研究中常常需要检测烯醇化酶的总量以及总活力，研究表明血清烯醇化酶总活力及其肌肉特异性烯醇化酶具有升高时间早和持续时间长的特点，它不仅有助于AMI的早期诊断，亦有助于就诊时间较晚的AMI诊断，时间序列动态观察此酶活力有助于了解AMI的病程演变。

因此，检测烯醇化酶对疾病诊断和预后判断具有非常重要的指导意义。

但传统的杂交瘤细胞不易保存，时间过长会出现细胞状态变差，甚至难以复苏，产生抗体量降低，并且抗体的序列未知，无法对抗体做更深入的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明所述烯醇化酶单克隆抗体特异性好、效价高、纯度高，能够特异性检测ENO1、ENO2和ENO3。

本发明提供了一种抗人烯醇化酶的单克隆抗体12D11，所述单克隆抗体12D11包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示，所述重链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。

优选的是，所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选的是，所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11的表达载体。

优选的是，所述表达载体的骨架载体包括pFUSE-CHIg-mG1和pFUSE2ss-CLIg-mk。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11的细胞。

优选的是，所述细胞的类型包括真核细胞，所述真核细胞包括293T细胞或CHO细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11的制备方法，包括以下步骤：将单克隆抗体12D11的重链和轻链序列克隆到表达载体上，转染细胞，表达得到单克隆抗体12D11。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11在制备特异性检测烯醇化酶的试剂盒中的应用。

优选的是，所述烯醇化酶包括非神经元烯醇化酶、肌肉特异性烯醇化酶和神经元特异性烯醇化酶。

本发明提供了一种烯醇化酶单克隆抗体。本发明所述烯醇化酶单克隆抗体特异性好、效价高、纯度高，能够特异性识别ENO1、ENO2和ENO3三种抗原。通过所述单克隆抗体重链、轻链可变区的序列，还能获得重组抗体表达载体和细胞。本发明得到的单克隆抗体载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；也方便对抗体做一系列的改造，更深入的研究，更广泛的应用。用本发明制备方法获得的单克隆抗体可用于烯醇化酶抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。

附图说明

图1为本发明提供的免疫小鼠抗体效价测定结果；

图2为本发明提供的单克隆抗体电泳结果；

图3为本发明提供的单克隆抗体亚型鉴定结果；

图4为本发明提供的Western Blot验证单克隆抗体特异性结果；

图5为本发明提供的免疫荧光验证单克隆抗体作用效果；

图6为本发明提供的ELISA验证单克隆抗体作用效果；

图7为本发明提供的免疫荧光验证重组单克隆抗体在细胞内的表达情况。

具体实施方式

本发明提供了一种抗人烯醇化酶的单克隆抗体12D11，所述单克隆抗体12D11包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示(CDR1：Arg-Ser-Ser-Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Tyr(SEQ ID NO.1)；CDR2：Arg-Met-Ser-Asn-Leu-Ala-Ser(SEQ ID NO.2)；CDR3：Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr(SEQ ID NO.3))，所述重链的可变区的3个互补决定区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示(CDR1：Ser-Tyr-Asn-Met-His(SEQ ID NO.4)；CDR2：Ala-Ile-Ser-Pro-Gly-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Phe-Asn-Gln-Lys-Phe-Arg-Gly(SEQ ID NO.5)；CDR3：Trp-Gly-Leu-Phe-Gly-Glu-Ala-Trp-Phe-Ala-Tyr(SEQ ID NO.6))。本发明所述抗体是通过进行ENO2基因合成、蛋白表达及纯化、免疫小鼠、单克隆抗体效价测定、骨髓瘤细胞的准备、脾细胞的制备、细胞融合、ELISA检测阳性杂交瘤细胞、单克隆抗体的制备、抗体亚型分类鉴定和单克隆抗体序列测序等操作获得的。本发明所述抗体对人烯醇化酶有很好的特异性和高效价，纯度高，能够实现ENO1、ENO2和ENO3的高效检测。

在本发明中，所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明中，所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11的表达载体。在本发明中，所述表达载体的骨架载体优选包括pFUSE-CHIg-mG1和pFUSE2ss-CLIg-mk(均购自于invivogen公司)。在本发明中，pFUSE-CHIg-mG1用于重链表达载体的构建，pFUSE2ss-CLIg-mk用于轻链表达载体的构建。本发明对表达载体的构建方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的表达载体构建方法即可。

本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体12D11的细胞。在本发明中，所述细胞优选利用上述表达载体转染获得。在本发明中，所述细胞的类型优选包括真核细胞，所述真核细胞优选包括293T细胞或CHO细胞。

在本发明中，所述烯醇化酶包括非神经元烯醇化酶、肌肉特异性烯醇化酶和神经元特异性烯醇化酶。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

ENO2蛋白制备

步骤一、ENO2原核表达载体构建

1.从GenBank序列数据库中查得ENO2基因序列(SEQ ID NO.11)，序列号为NM_001975.3，合成该基因序列到pET-32a载体上，再将目的基因ENO2连接到pGEX 4t-1载体中。ENO2合成到pET-32a载体上，记为ENO2-32a，选用的酶切位点是NdeI、NotI；ENO2连接到pGEX4t-1载体上，记为ENO2-4t-1，选用的酶切位点是EcoRI和NotI；

2.设计好引物，PCR扩增出目的条带；

3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，分别将目的片段和载体用相应的限制性内切酶酶切，回收；

4.将目的片段和载体用同源重组酶连接，50℃连接15min；

5.将连接产物转化至TOP10感受态细胞，37℃培养箱过夜培养；

6.挑取单克隆至相应抗性的LB培养基，37℃摇床过夜培养；

7.提取质粒，测序，比对结果。

实验结果，ENO2原核表达载体构建成功，用于后续ENO2抗原的制备以及包被ELISA板检测ENO2抗体所需蛋白的制备。

步骤二、ENO2蛋白表达及纯化

1.将构建好的质粒ENO2-32a和ENO2-4t-1转入大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞中；

2.挑取单克隆接于LB培养基中，37℃摇菌至OD值0.5-1，加IPTG诱导，16℃过夜表达；

3.收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，pET-30a表达的ENO2蛋白利用Ni柱亲和层析纯化，纯化的蛋白记为ENO2-his；pGEX 4t-1表达的ENO2纯化的蛋白记为ENO2-GST，用GST柱纯化，纯化后的蛋白经过透析、浓缩，得到高浓度的ENO2-his蛋白作为抗原备用，ENO2-GST蛋白用于包被ELISA板检测ENO2抗体。

实施例2

杂交瘤细胞的获得

步骤一、ENO2抗原免疫小鼠

1.将40ug纯化好的ENO2-his抗原与完全氟氏佐剂1:1混合；

2.取5只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，左侧后小腿肌肉注射100ul(40ug抗原)混合好的抗原；三周后进行第二次免疫，40ug抗原与不完全氟氏佐剂1:1混合，右侧后小腿肌肉注射100ul(40ug抗原)混合好的抗原；

步骤二、ELISA检测小鼠产生抗体的情况

第二次免疫后再过三周采集鼠尾血，离心收集血清，ELISA检测小鼠产生抗体的情况，具体步骤如下:

1.用纯化好的ENO2-GST蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被，包被液：25mL碳酸盐缓冲液pH 9.6(Na2CO30.03975 g，NaHCO30.07325g，KH2PO40.00625 g)；

2.PBST洗3次，每次3min，每次拍干；

3.2％BSA满孔封闭，37℃孵育1h；

4.PBST洗3次，每次3min，每次拍干；

5.将血清用稀释液进行倍比稀释，按1：4万、1：8万、1：16万、1：32万、1：64万、1:128万、1:256万、1:512万稀释，100ul每孔加入板中，37℃孵育1h，用PBST洗涤3次，每次3min，每次拍干；

6.羊抗鼠IgG-HRP 1:5000稀释，37℃孵育30min。

7.PBST洗涤3次，拍干后，TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。结果见图1和表1，相对于没有免疫的正常小鼠，33号小鼠抗体效价1024万以上，44号小鼠抗体效价500万以上(33号和44号为5只小鼠中其中两只的编号)。根据上述结果可知，33号小鼠和44号小鼠抗体效价都很高，都可以用于后续的实验。

表1免疫小鼠抗体效价测定

步骤三、细胞融合

1.骨髓瘤细胞的准备

复苏SP2/0细胞，用15％胎牛血清DMEM培养液传代培养一周。融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞。

2.脾细胞的制备

取免疫效果好的33号小鼠和44号小鼠，摘除眼球采血分离血清，并颈脱位将小鼠致死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，固定好小鼠，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，置于细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；500g离心5min，洗涤细胞3次，弃掉上清液，细胞沉淀用无血清DMEM培养液悬浮，计数备用。

3.细胞融合

在超净台内准备好37℃水浴锅，将SP2/0细胞和脾细胞按1:10比例加入50ml离心管中，混匀。500g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在90s内慢慢滴入预温至37℃的45％PEG1450溶液1mL；并不断地轻轻摇晃离心管；整个过程离心管都在37℃水浴中。

然后向细胞混合物中逐渐加入DMEM培养基，第一分钟逐滴滴入lmL，第二分钟加2mL，第3min加3mL，第4min加4mL，第5min加5mL，37℃水浴中边加边摇晃。然后37℃孵育15min，500g离心5min，去掉上清。

加入5ml含有HAT的DMEM培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，最后补加含有HAT的DMED培养基至100mL左右。分装于已铺巨噬细胞的96孔细胞培养板中，100uL/孔，然后将培养板置37℃，5％CO₂培养箱培养。

步骤三、ELISA检测阳性杂交瘤细胞

1.用pGEX4t-1载体表达的ENO2(ENO2-GST)蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被。

2.观察杂交瘤细胞的生长情况，七天后待其细胞培养上清变黄时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测抗体。

3.根据ELISA结果，选取OD值高的克隆，高于阴性对照两倍以上，铺96孔板，进行第一次亚克隆筛选。

4.七到十天后再进行ELISA检测抗体，选取OD值高的克隆，铺96孔板，进行第二次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞；

5.培养七到十天后再进行ELISA检测抗体，选取OD值高的克隆，铺96孔板，进行第三次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞。选取OD值高的几个克隆，进行进一步的验证(ELISA检测抗体)。最终筛选出1个可以识别ENO1、ENO2、ENO3三种抗原的阳性克隆细胞，命名为：12D11。

实施例3

腹水制备单克隆抗体及单克隆抗体纯化

步骤一、腹水制备单克隆抗体

1.注射300ul腹水佐剂至12周龄Balb/c小鼠腹腔。

2.两周后将杂交瘤细胞培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1×10⁶个/100ul，接种100ul杂交瘤细胞到已注射腹水佐剂的小鼠腹腔。

3.7-10天后收集腹水。

步骤二、单克隆抗体纯化

1.腹水用PBS pH7.4稀释，离心取上清，用protein G亲和层析进行纯化。

2.平衡：用0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化柱子；

3.上柱：将稀释后的腹水上清缓慢过柱，保证抗体更好的结合在protein G柱子上；

4.洗涤：再用平衡缓冲液洗涤柱子；

5.洗脱：用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合在柱子上的抗体，并加入1MTris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

分别取纯化后的单克隆抗体和对照血清进行SDS-PAGE电泳，结果如图2，可清晰的看到抗体的重链和轻链。

实施例4

单克隆抗体分型鉴定

1.用pGEX 4t-1载体表达的ENO2包被ELISA板，100ng/孔，过夜包被。

2.用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，用2％BSA满孔封闭1小时；

3.加杂交瘤细胞上清100ul，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次；

4.孵育HRP标记的二抗(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgGkappa chain)，37℃孵育30min。

5.PBST洗涤3次，TMB显色，450nm测得吸光值。

实验结果如图3和表2，12D11单克隆抗体重链为IgG1，轻链为κ。

表2单克隆抗体分型鉴定

实施例5

单克隆抗体序列测定

1.用培养好的杂交瘤细胞提取RNA，反转录得到cDNA；

2.用5’RACE方法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；

3.将扩增出的片段连接到pEASY-Blunt载体上，提取质粒，测序；抗体测序结果见附录4；

4.使用Kabat方法标记出抗体氨基酸序列的CDR区。

实施例6

单克隆抗体应用效果

1.Western验证单克隆抗体的特异性

1)将ENO2 C末端加上flag标签，连接到真核表达载体pcDNA3.1上；

2)将构建好的ENO2flag-pcDNA3.1和空载体对照pcDNA3.1转染至10cm细胞培养皿；

3)48h后，收集细胞，超声破碎，15000rpm离心20min收集上清蛋白。

4)取50ul蛋白上清，加10ul 6×protein Loading，100℃金属浴煮10min；

5)准备好SDS-PAGE胶，煮好的蛋白上样20ul，120V电压至蓝色loading跑至胶底部；

6)转PVDF膜后用5％脱脂奶粉封闭2h；

7)孵育杂交瘤细胞上清2h，TBST洗涤3次，HRP标记的二抗孵育1h；

8)TBST洗涤3次，ECL显色曝光。结果如图4所示：ENO2 mab是购买的商业化的抗体，作为阳性对照，正常鼠血作阴性对照。单克隆抗体12D11能够识别ENO2抗原，在293T细胞和人血清中均具有较高的特异性。

2.免疫荧光验证单克隆抗体的作用效果

1)构建载体

将ENO2(ENO2flag)、ENO2前半段(ENO21flag)、ENO2后半段(ENO22flag)分别构建在真核表达载体pcDNA3.1上，大提质粒备用；

2)将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；

3)转染ENO2flag、ENO21flag、ENO22flag至上述准备好的293T细胞；

4)转染细胞48h后，弃掉培养液后用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；

5)分别用免疫小鼠眼球血、阳性杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水孵育上述片子，室温1h；

6)PBST洗涤3次，AlexaFluor 594标记的二抗孵育30min；

7)PBST洗涤3次，显微镜观察结果。

实验结果见图5，免疫荧光结果显示12D11单克隆抗体可以识别ENO2抗原。

3.ELISA验证单克隆抗体的作用效果

1)构建载体

将ENO1(SEQ ID NO.12)、ENO3(SEQ ID NO.13)分别构建在pGEX4t-1

载体上；ENO1序列号为NM_001428.5，ENO3序列号为NM_001374524.1；

2)构建好的质粒转化至BL21(DE3)表达感受态，摇菌，ITPG诱导表达；

3)收集菌体，超声破碎后离心，收集上清，过GST柱纯化；

4)得到的ENO1、ENO3蛋白记为ENO1-GST、ENO3-GST，将蛋白透析、浓缩，测得蛋白浓度；

5)将ENO1-GST、ENO2-GST、ENO3-GST包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被；

6)用PBST洗涤包被好的ELISA板3次，再用2％BSA满板封闭1小时；

7)用PBST洗涤3次，每次拍干；

8)加杂交瘤细胞上清100ul，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每次拍干；

9)孵育HRP标记的二抗，37℃孵育30min。

10)用PBST洗涤3次，每次拍干；

11)TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。

实验结果见表3和图6，12D11单克隆抗体可以识别ENO1、ENO2、ENO3三种抗原，可应用于烯醇化酶任意一种同功酶的检测。

表3 ELISA验证单克隆抗体的作用效果

实施例7

重组12D11单克隆抗体及其作用效果

步骤一、抗体表达载体构建

1.将测序确定的抗体重链和轻链可变区分别连接到抗体表达载体

pFUSE-CHIg-mG1、pFUSE2ss-CLIg-mk上，记为12D11mG1、12D11mk。

2.测序正确后大量提取质粒，用于细胞转染制备抗体。

步骤二、ELISA验证重组单克隆抗体的作用效果

1.将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293T细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱过夜培养；

2.细胞转染：将构建好的重组抗体表达质粒12D11mG1、12D11mk、

12D11mG1+12D11mk、mG1+mk转入上述准备好的293T细胞，mG1+mk为空载体对照，37℃、5％CO₂培养48h。

3.将纯化的ENO2蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃过夜包被；

4.用2％BSA37℃满板封闭1小时，PBST洗涤3次；

5.收集上述培养好的细胞上清，离心取上清，加100ul到包被好的ELISA板孔里，杂交瘤细胞上清作为阳性对照，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每次拍干；

6.孵育HRP标记的抗重链二抗IgG、抗轻链二抗IgG Kappa chain，37℃孵育30min。

7.用PBST洗涤3次，每次拍干；

8.TMB显色10min，2M H₂SO₄终止，450nm测得吸光值。

实验结果见表4，单独转染重组12D11抗体重链12D11mG1和轻链12D11mk，细胞上清未能检测出信号；共同转染重链12D11mG1和轻链12D11mk，细胞上清检测出抗ENO2抗体。12D11单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别ENO2蛋白，具有生物学活性。经验证该重组单克隆抗体还可以识别ENO1(表5)、ENO3(表6)蛋白。

表4 ELISA验证重组12D11单克隆抗体(识别ENO2)作用效果

表5 ELISA验证重组12D11单克隆抗体(识别ENO1)作用效果

表6 ELISA验证重组12D11单克隆抗体(识别ENO3)作用效果

步骤三、免疫荧光验证重组单克隆抗体在细胞内的表达情况

1.将步骤二中的细胞用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；

2.分别用AlexaFluor 594标记的抗重链二抗IgG、抗轻链二抗IgG Kappa chain孵育上述制备好的片子，室温30min；

3.PBST洗涤3次，AlexaFluor 594标记的二抗孵育30min；

4.PBST洗涤3次，显微镜观察结果。

实验结果如图7所示，重链12D11mG1和轻链12D11mk在293T细胞内均能表达，共同转染后，表达信号强于单独转染；结合上述ELISA结果，重组12D11单克隆抗体在293T细胞中成功表达，并且成功分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别ENO1、ENO2、ENO3蛋白，具有生物学活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 陕西脉元生物科技有限公司

<120> 一种烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ile Ser Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn Gln Lys Phe Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Gly Leu Phe Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120

atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 240

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 300

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca 360

ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 396

<210> 8

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60

gtgcaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggttacac atttaccagt tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct 180

ggacagggcc tggaatggat tggagctatt tctccaggaa atggtgatac ttccttcaat 240

cagaagttca gaggcaaggc cacattgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cagctcagca gcctgacatc tgcagactct gcggtctatt actgtgcaag atggggatta 360

ttcggggagg cctggtttgc ttattggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 417

<210> 9

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 10

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Ser Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Phe Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Leu Phe Gly Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 11

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtccatag agaagatctg ggcccgggag atcctggact cccgcgggaa ccccacagtg 60

gaggtggatc tctatactgc caaaggtctt ttccgggctg cagtgcccag tggagcctct 120

acgggcatct atgaggccct ggagctgagg gatggagaca aacagcgtta cttaggcaaa 180

ggtgtcctga aggcagtgga ccacatcaac tccaccatcg cgccagccct catcagctca 240

ggtctctctg tggtggagca agagaaactg gacaacctga tgctggagtt ggatgggact 300

gagaacaaat ccaagtttgg ggccaatgcc atcctgggtg tgtctctggc cgtgtgtaag 360

gcaggggcag ctgagcggga actgcccctg tatcgccaca ttgctcagct ggccgggaac 420

tcagacctca tcctgcctgt gccggccttc aacgtgatca atggtggctc tcatgctggc 480

aacaagctgg ccatgcagga gttcatgatc ctcccagtgg gagctgagag ctttcgggat 540

gccatgcgac taggtgcaga ggtctaccat acactcaagg gagtcatcaa ggacaaatac 600

ggcaaggatg ccaccaatgt gggggatgaa ggtggctttg cccccaatat cctggagaac 660

agtgaagcct tggagctggt gaaggaagcc atcgacaagg ctggctacac ggaaaagatc 720

gttattggca tggatgttgc tgcctcagag ttttatcgtg atggcaaata tgacttggac 780

ttcaagtctc ccactgatcc ttcccgatac atcactgggg accagctggg ggcactctac 840

caggactttg tcagggacta tcctgtggtc tccattgagg acccatttga ccaggatgat 900

tgggctgcct ggtccaagtt cacagccaat gtagggatcc agattgtggg tgatgacctg 960

acagtgacca acccaaaacg tattgagcgg gcagtggaag aaaaggcctg caactgtctg 1020

ctgctcaagg tcaaccagat cggctcggtc actgaagcca tccaagcgtg caagctggcc 1080

caggagaatg gctggggggt catggtgagt catcgctcag gagagactga ggacacattc 1140

attgctgacc tggtggtggg gctgtgcaca ggccagatca agactggtgc cccgtgccgt 1200

tctgaacgtc tggctaaata caaccagctc atgagaattg aggaagagct gggggatgaa 1260

gctcgctttg ccggacataa cttccgtaat cccagtgtgc tgtga 1305

<210> 12

<211> 1305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtctattc tcaagatcca tgccagggag atctttgact ctcgcgggaa tcccactgtt 60

gaggttgatc tcttcacctc aaaaggtctc ttcagagctg ctgtgcccag tggtgcttca 120

actggtatct atgaggccct agagctccgg gacaatgata agactcgcta tatggggaag 180

ggtgtctcaa aggctgttga gcacatcaat aaaactattg cgcctgccct ggttagcaag 240

aaactgaacg tcacagaaca agagaagatt gacaaactga tgatcgagat ggatggaaca 300

gaaaataaat ctaagtttgg tgcgaacgcc attctggggg tgtcccttgc cgtctgcaaa 360

gctggtgccg ttgagaaggg ggtccccctg taccgccaca tcgctgactt ggctggcaac 420

tctgaagtca tcctgccagt cccggcgttc aatgtcatca atggcggttc tcatgctggc 480

aacaagctgg ccatgcagga gttcatgatc ctcccagtcg gtgcagcaaa cttcagggaa 540

gccatgcgca ttggagcaga ggtttaccac aacctgaaga atgtcatcaa ggagaaatat 600

gggaaagatg ccaccaatgt gggggatgaa ggcgggtttg ctcccaacat cctggagaat 660

aaagaaggcc tggagctgct gaagactgct attgggaaag ctggctacac tgataaggtg 720

gtcatcggca tggacgtagc ggcctccgag ttcttcaggt ctgggaagta tgacctggac 780

ttcaagtctc ccgatgaccc cagcaggtac atctcgcctg accagctggc tgacctgtac 840

aagtccttca tcaaggacta cccagtggtg tctatcgaag atccctttga ccaggatgac 900

tggggagctt ggcagaagtt cacagccagt gcaggaatcc aggtagtggg ggatgatctc 960

acagtgacca acccaaagag gatcgccaag gccgtgaacg agaagtcctg caactgcctc 1020

ctgctcaaag tcaaccagat tggctccgtg accgagtctc ttcaggcgtg caagctggcc 1080

caggccaatg gttggggcgt catggtgtct catcgttcgg gggagactga agataccttc 1140

atcgctgacc tggttgtggg gctgtgcact gggcagatca agactggtgc cccttgccga 1200

tctgagcgct tggccaagta caaccagctc ctcagaattg aagaggagct gggcagcaag 1260

gctaagtttg ccggcaggaa cttcagaaac cccttggcca agtaa 1305

<210> 13

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggccgtta tgaggaccct aagagccatg gccatgcaga aaatctttgc ccgggaaatc 60

ttggactcca ggggcaaccc cacggtggag gtggacctgc acacggccaa gggccgattc 120

cgagcagctg tgcccagtgg ggcttccacg ggtatctatg aggctctgga actaagagac 180

ggagacaaag gccgctacct ggggaaagga gtcctgaagg ctgtggagaa catcaacaat 240

actctgggcc ctgctctgct gcaaaagaaa ctaagcgttg tggatcaaga aaaagttgac 300

aaatttatga ttgagctaga tgggaccgag aataagtcca agtttggggc caatgccatc 360

ctgggcgtgt ccttggccgt gtgtaaggcg ggagcagctg agaagggggt ccccctgtac 420

cgccacatcg cagatctcgc tgggaaccct gacctcatac tcccagtgcc agccttcaat 480

gtgatcaacg ggggctccca tgctggaaac aagctggcca tgcaggagtt catgattctg 540

cctgtgggag ccagctcctt caaggaagcc atgcgcattg gcgccgaggt ctaccaccac 600

ctcaaggggg tcatcaaggc caagtatggg aaggatgcca ccaatgtggg tgatgaaggt 660

ggcttcgcac ccaacatcct ggagaacaat gaggccctgg agctgctgaa gacggccatc 720

caggcggctg gttacccaga caaggtggtg atcggcatgg atgtggcagc atctgagttc 780

tatcgcaatg ggaagtacga tcttgacttc aagtcgcctg atgatcccgc acggcacatc 840

actggggaga agctcggaga gctgtataag agctttatca agaactatcc tgtggtctcc 900

atcgaagacc cctttgacca ggatgactgg gccacttgga cctccttcct ctcgggggtg 960

aacatccaga ttgtggggga tgacttgaca gtcaccaacc ccaagaggat tgcccaggcc 1020

gttgagaaga aggcctgcaa ctgtctgctg ctgaaggtca accagatcgg ctcggtgacc 1080

gaatcgatcc aggcgtgcaa actggctcag tctaatggct ggggggtgat ggtgagccac 1140

cgctctgggg agactgagga cacattcatt gctgaccttg tggtggggct ctgcacagga 1200

cagatcaaga ctggcgcccc ctgccgctcg gagcgtctgg ccaaatacaa ccaactcatg 1260

aggatcgagg aggctcttgg ggacaaggca atctttgctg gacgcaagtt ccgtaacccg 1320

aaggccaagt ga 1332

Claims

1.一种抗人烯醇化酶的单克隆抗体12D11，其特征在于，所述单克隆抗体12D11包括轻链和重链，所述轻链属于kappa，所述重链属于IgG1，所述轻链的可变区的3个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1～3所示，所述重链的可变区的3个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4～6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体12D11，其特征在于，所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体12D11，其特征在于，编码所述单克隆抗体12D11的轻链的可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，编码所述单克隆抗体12D11的重链的可变区的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。

4.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体12D11的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的骨架载体包括pFUSE-CHIg-mG1和pFUSE2ss-CLIg-mk。

6.过表达权利要求1～3任一项所述单克隆抗体12D11的细胞。

7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为真核细胞。

8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述真核细胞为293T细胞或CHO细胞。

9.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体12D11的制备方法，包括以下步骤：将单克隆抗体12D11的重链和轻链序列克隆到表达载体上，转染细胞，表达得到单克隆抗体12D11。

10.权利要求1～3任一项所述单克隆抗体12D11在制备特异性检测烯醇化酶的试剂盒中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述烯醇化酶包括神经元特异性烯醇化酶。

12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述烯醇化酶包括非神经元烯醇化酶。

13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述烯醇化酶包括肌肉特异性烯醇化酶。