TWI303275B

TWI303275B - Devices and methods for biomaterial production

Info

Publication number: TWI303275B
Application number: TW093115170A
Authority: TW
Inventors: Henry Hebel; Sriram Ramakrishnan; Hugo Gonzalez; Jeff Darnell
Original assignee: Advisys Inc
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2004-05-27
Publication date: 2008-11-21
Also published as: CA2567324A1; EP2364769A1; TW200504207A; CA2567324C; EP2364769B1; WO2004108260A2; EP1628749A2; EP1628749B1; WO2004108260A3; US7238522B2; DK1628749T3; DK2364769T3; ES2748130T3; US20050014245A1

Description

l3〇3275 玖、發明說明： [發明所屬之技術領域] 本發明係關於溶解細胞之裝置及可行的方法。本發明亦關於自溶解之細胞中分離及純化細胞成分之方法。本發明特別適合於溶解含有質體之細菌細胞，以及接著製備大量之實質上經純化之質體。所得之質體適合各種用途，包含但非限於基因治療、質體-中介之激素補充或其他療法、 DNA疫苗、或任何其他需要大量經純化之質體之應用。在去五年期間，生物學家越來越關注於質體處理程序之領域。非-病毒領域之出現使得研究人員專注於各種不同產生質體之方法。 [先前技術] 由於質體係大型且複雜之巨分子，並不適合以大量合成方法產生。反而，質體一開始必須於生物系統中製造，

域中為已知且可取得該等方法。

阻礙在於該方法需符合商業上方法之處理步驟係於任以及重要的步驟。於此 I驟主要的決定因素。的以及確實可行的）之之應用。 1303275 已有各種溶解細菌細胞之方法。已知實驗室規模之質體純化方法包含酵素切割（例如利用溶菌酶）、熱處理、屢处機械礙磨、超音波、以干擾劑（chaotropes)處理（例如異硫氰酸胍（guanidinium is〇thi〇cyante))、以及以有機溶背J處理（例如酚）。雖然這些方法可輕易地施行於小規模製備質體，只有少數可成功地用於大規模製備質體。例如壓力處理、機械碾磨、或超音波等方法不易施用於大規模製備質體。再者，Carls〇n等人（1995，们扪〜〃g· 48, 303-3 15)已證實此等物理方法會導致無法接受之質體降解。涉及使用變性劑以及/或有機溶劑之方法施用於大規模製備質體時具有困難，這係因為此等化學物質一般具有毒性、易燃性、以及/或爆炸性。小規模操作與處置此等化學物質時較易管理，但通常在大規模處理時基本上會產生問題。美國專利第6，197,553號揭示一種利用溶菌酶以及熱俾大規模地使細胞溶解之技術。然而，此技術需要小心控制經酵素動力學上處理之細菌細胞之加熱與冷卻俾使細胞溶解。此技術之缺點在於需要使用由動物而來之酵素（溶菌酶）’該酵素昂貴且可能為生物污染的來源。當為了供給人或獸醫之應用而製備所欲之質體或其他細胞成分時’並無法接受使用由動物而來之物質。目前’溶解細菌以純化質體之較佳方法係利用鹼以及清潔劑（detergent)。此技術起源於Birnboim與Doly (1979, •心及“· 7, ι513_1523)。一般係使用經修正之技術’如詳述於 Sambrook 等人之「Mo/ecw/ar C7⑽2 1303275

Laboratory Manual, 2 nd Ed.? Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)第 1.38-1.39 頁，該技術係將細菌細胞懸浮於10毫升之再懸浮溶液，其包含50mM之葡萄糖、25mM之Tris，ρΗ8·0、10mM之EDTA。將懸浮液與20毫升之細胞溶解溶液（包含0.2N之NaOH，1%之十二基硫酸鈉（SDS))混合，以及培養5-10分鐘。培養期間，細胞會溶解且該溶液變得非常黏稠。高pH值使宿主之基因體 DNA與質體DNA兩者皆變性。SDS與細胞蛋白質、脂質、以及膜成分形成複合物，其中某些複合物係與宿主之基因體DNA緊密相連。接著將溶胞產物-混合物以15毫升之冰冷卻的中和/沉澱溶液處理，該溶液包括3M之醋酸鉀，其 pH以醋酸調整為5.5。將此酸化之混合物置於冰上培養5-10 分鐘，俾使質體DNA復性（renature)。此期間，會形成白色絨毛狀的沉澱物。該沉澱物包括十二基硫酸鈉卸（potassium SDS)，其非常難溶於此等條件下。此外，該沉澱物包含宿主之基因體DNA、蛋白質、脂質、以及膜成分，該等物質仍與SDS鍵結。接著利用過濾或離心移除該沉澱物，得到含有所欲質體之澄清的溶胞產物，將該產物進行各種純化程序。此細胞溶解方法較上述方法具有非常顯著之優點。除了提供質體分子有效自細胞釋出外，經由移除大量之宿主蛋白質、脂質、以及基因體DNA，此方法可提供實質上純的質體。由於其他方式較不易將基因體DNA與質體DNA 分離，因此此方法在移除基因體DNA上具有特殊貢獻。此 1303275 "吏該方法成為於實驗室規模下為純化質體而溶解細菌細胞之較佳方法。幸地，此方法在大規模進行時遭遇到顯著的挑戰。首先於小規模實驗下，經由簡單的漩渦攪拌或重複地上下搖晃含有細胞之容器即可輕易地將懸浮之細胞與細胞溶解溶液混合。然而’於大規模實驗時則不可行，因為操作的體積在數十或數百升左右。使用一般混合大體積液體之技術，例如抵次撥拌混合，亦會產生問題，因為有些細胞在開始混合後即溶解，此等細胞會釋出基因體DNA而急遽地增加溶液的黏稠度。黏稠度之增加則顯著地妨礙混合之進行。口第一個挑戰係添加鹼性細胞溶解溶液後，在高pH環境下過度培養，導致質體永久變性，而不利於後續之用途。因此必/頁確保該經溶解之細胞在相當狹窄的時間範圍^ (典型地為5-1〇分鐘）充分地與中和/沉澱溶液混合。已知此步驟之混合必須小心地進行（以及低切變）。若於此步驟進行劇烈混合(以亦即高切變)時，會自該絨毛狀沉澱物釋出大量物質至含有質體之溶液中。此物質包含大量之宿主美因體DNA以及内毒素。這些物質於接下來的純化作用中難以自質體分離。因此，需要充分地混合以沉澱出所有與SDS 結合之雜質以及使所有質體復性，且混合時應儘量溫和。於小規模進行時，此方法可經由料添加中和/w容液並以手動混合技術（例如溫和攪動或上下搖晃該容器）而_易地完成。反之，於大規模進行時難以達到快速但溫和之、、曰 1303275 合。批次模式之低切變攪動或攪拌混合需要相當長的時間俾達成完全混合’其會使質體產生無法接受之高程度的永久變性。較快速之技術（例如高速攪拌混合）可能於含有質體之溶液中產生無法接受之高濃度的基因體DNA以及内毒素。痛又相k必須於非常低切變下混合細胞懸浮與細胞溶解溶液。此點已特別聲明於有關混合含有質體之細菌懸浮與含有驗及清潔劑之細胞溶解溶液之方法中。例如，臂的等人於美國專利第5,837,529號中討論利用鹼或酵素使含有質體之細胞溶解之方法，其主張處理此等溶胞產物時必須非常小心以避免切斷基因·體DNA。同樣地，Nien〇w等人於美國專利第6,395,5 16號中討論以鹼使細胞溶解之問題，其主張於該方法中之任何階段若太過劇烈地混合，可能使基因體DNA斷裂成片，進而實質上污染最終純化之產物。又，Bridenbaugh等人於美國專利申請案第 2002/0198372號中強調需要溫和地混合細胞與細胞溶解溶液。這些考量促使研究人員發展可溫和地混合懸浮細胞與細胞溶解溶液之可行的方式。例如，美國專利第5,837,529 號以及美國專利申請案第2〇〇2/〇198372號各揭示使用固定混合器（static mixers)達到連續性低切變之混合作用，而美國專利第6,395,5 16號揭示使用經設計之容器以控制批次' 模式之混合作用。此等方法具有明顯的缺點。於一方面，盡力使過度之切變最小化細胞溶解溶液。另一方面可此無法完全混合細胞懸浮與使用混合器會限制該方法之靈 1303275 活運用性。如美國專利申請案第2002/0198372號所述，其需要使該固定混合器釔數量以及液體通過元件之流速最適化。此等最適化作用之限制了於限定時間下以最適化固定混合儀器處理物質之量。除非建構且最適化一新的、高容 ΐ之固疋混合儀器，否則便限制了增加處理規模的能力。使用如美國專利第6,395,516號所述之批次混合容器亦具有相應之缺點。熟於此技藝者皆了解其問題在於如何使批次混合容器内之所有區域均可完全混合。再者，需要控制細胞懸浮與細胞溶解溶液之接觸時間，故批次混合容器並不適用。尤其，已知若延長含有質體之細胞暴露於鹼之時間，會形成過量之永久變性的質體，該等質體通常係不具活並非所欲之質體、且接下來其難以自具有生物活性之質體中刀離典型地，欲將此等暴露時間限制於約1 〇分鐘或以Τ。而使用大規模批次混合日寺，則難以或無法達成此限制之暴露時間。於大規模的鹼性細胞溶解（alkalinelysis)作用中，移除該絨毛狀沉澱物又係另-項挑戰。較佳為完全移除該沉搬物以消除該基因ϋ DNA與其他附著在沉殺物上之雜質。同時，不能使該沉殿物受到過度的切變。否則，該沉殿物合釋出大量的基因體DNA、内毒素、以及其他雜質而_ 含有質體之溶液。於實驗室規模下，該沉澱物可藉由簡單的過濾、批次離心、或上述兩者輕易地予以移除。缺而，於大規模下無法進行批次離心。連續性離心亦不適用、於大規模實行，此係因為會使沉殿物受到高切變壓力，進而釋 1303275 平均深處或袋狀過濾器，因出無法接受之程度之雜質。沉澱物容易阻塞平均潘金, 行過濾之可行性存有疑問。由於該凝膠狀、乳酪狀黏稠之，因此對大規模進儘管存有上述挑戰，各各類研究人員已發展出其在鹼細

(non-ionic alkyldimethylphosphine oxide)清潔劑取代 SDS。其主張使用這些清潔劑可對大規模製備醫藥級之質其所主張之改善處並未回應上述體提供某些優點。然而關於規模擴大之問題。

Thatcher等人於美國專利第5,981，735號中揭示謹慎地控制NaOH添加至懸浮之細胞的量，俾確保該pH值係低於實質上造成質體永久變性之pH值之約〇· 1個pH單位。此方法可解決與時間相關所產生之質體永久變性之問題，但需要非常精確地控制pH值，而於大規模進行時精確地控制 pH值係較困難。再者，較佳之pH值需依各質體與宿主細胞之組合先予以決定。最重要地’此方法無法解決關於大量液體之處理與混合之問題。

Wan專人於美國專利第5,837,529號中揭示一種溶解細胞之方法’包括利用固定混合器混合懸浮之細胞與細胞溶解溶液（例如（K2NNaOH、1% SDS)，以及混合經溶解之細胞與沉澱溶液（例如3M醋酸鉀、PH 5.5)。其聲稱固定混合器特別有利於提供具有相對低切變之高度混合作用，且亦 12 1303275

可於過程中維持連續性流動。使用固定混合器之類似方法亦揭示於Bridenbaugh等人之WO 00/05358。此等方法提供某些優點，但仍有缺點。如w〇〇〇/〇5358所示，該方法必須小心控制各階段之固定混合器元件數目以及溶液線流流速（solut1〇nlinear fl〇wrates)兩者。若僅使用少數混合元件或低線流流速，則造成混合不充分以及質體產量不良。若使用過多的元件或高線流流速，則造成過度切變且使基因體DNA釋放至溶液中。這些參數需根據實驗經驗找出最佳值，且為增加該方法之適用規模所作之任何努力需要再次調整元件數目以及流速、限制該方法之適用性以及使該方法穩定而達最佳化以成為一套固定化之用法。

Marquet 等人（1995，们op/mw 8, 26-37)揭示一種起初設計為用於食品卫業之批次混合器之用法。黯啊等人主張此等混合器可於混合時提供低切變速率，使其適用於大規模之含質體細胞之鹼性細胞溶解。然而，於容器中進行

之大量液體之批次混合通常難以使其規模升級，尤其當液體之黏稍度不同時，或當混合時會急遽增加液體之黏铜度時。當結合短暫、時間靈敏性高之培養步料，採用批次此合亦會產生問題。這些所有考量使批次混合法不適用於鹼性細胞溶解法中。儘&先4研究人員之成就，仍顯著地需要一種因此，新穎且經改善之方法俾於大規模下進行鹼性細胞溶解。較佳之方法應可解決下述—系列重要問題，包含：⑴於快速及完全混合細胞m轉溶訂，有效地使細胞溶解且 13 1303275 釋出質體；（2)控制經溶解之細胞於鹼性環境下之培養時間以防止質體永久變性；（3)於快速且溫和地混合鹼性岭胞產物與中和/沉澱溶液下，有效沉澱出視為污染之細胞成分而不會釋出過量之基因體DNA以及内毒素至含有質體之/谷液中’以及（4)有效並小心地移除織毛狀沉澱物，且不會釋出過量之基因體DNA以及内毒素至含有質體之溶液中再者，此較佳之方法可輕易地實行、完整的適用於所有用途’不含由動物衍生之產物以及具經濟效益。亦需要一種經改善之方法以自大規模之微生物細胞溶解產物中純化質體。尤其，該非_病毒基因療法、質體_中介之療法、以及DNA疫苗等新興領域需要可適用於醫藥用途之經純化的質體，其需要量以克或甚至千克計算。因此必屑自含有雜質之原始溶胞產物中純化出質體，該原始溶胞產物中包含殘餘之基因體DNA、RNA、蛋白質、以及内毒素。理想的方法應可提供高產量之實質上純的物質、易適用於大規模生產、涉及最少的處理步驟、以及易於進行且具經濟效盈。應避免使用任何酵素或衍生自動物之產品，因為此等試劑傾向於昂貴且重要地係可能為污染之來源。同樣地，應避免使用醇類及有機溶劑，因為其一般具有毋性、易燃性、爆炸性、以及量多時處理上有困難。此外，應避免使用已知或可能具有毒性、可誘導突變、致癌性、產生畸形、或其他有害之化合物。最後，該理想的方法方法應避免需要使用昂貴的設備，例如大規模或連續性離心機，或階梯產生式層析片（gradient pr〇ducing 1303275 chromatography skids) 〇已嘗試發展各種符合上述理想之質體純化方法。例如，Horn等人於美國專利第5,707,8 12號中揭示一種經過整合之方法，其涉及鹼性細胞溶解法、以；5夕藻土過滤、濃縮以及經由超過濾/遽析程序（ultrafiltration/diafiltfation UF/DF)去鹽、以8%之聚乙二醇（PEG) 8000使質體沉澱一整夜、離心、再懸浮、以2.5M醋酸銨使雜質沉澱、離心、以異丙醇使質體沉澱、離心、再懸浮、於1% PEG 8〇〇〇存在下採用 Q Sepharose™ (Amersham Biosciences Corp·,

Piscataway，NJ)之陰離子交換管柱層析且使用階梯式洗 &、以異丙醇使質體沉殿、離心、再懸浮、以及採用 Sephacryl™ S-1000 (Amersham Biosciences Corp.5 Piscataway，NJ)之凝膠過濾管柱層析。並未說明質體之產篁、品質、以及純度。類似之方法亦揭示於Marquet等人之美國專利第5,5 61，064號中。由於需多次進行質體沉澱及離心之故，此等方法無法輕易地適用於大規模製備質體。此外’為使凝膠過濾管柱層析達到足夠的解析度，一般需要相當大的管柱。於多個步驟中使用異丙醇係此方法之另一項缺點。

Colpan等人之美國專利第5,99〇,3〇1號揭示一種經過整合之方法，其涉及鹼性細胞溶解法、利用離心及過濾之澄清法、以鹽（NaC1)&非離子性清潔劑培養、以Deae管柱層析進行陰離子交換、異丙醇沉澱、離心、以及再懸浮。其揭不所得之質體不含「可發覺之」RNA、基因體DNA、 15 1303275 或内毒素，但是並未說明檢測方法及限制條件。此方法具有眾多實行上之爭議。典型地，DEAE樹脂對質體之接受能力相當低。再者，使用異丙醇沉澱及離心進行產物濃縮與去鹽並不適用於大規模製備質體。

Lee與Sagar之美國專利第6，197,553號揭示一種經過整合之方法，其涉及以溶菌酶分解細胞壁、經由通過流通式熱交換器（flow-through heat exchanger)將細胞懸浮液加熱至約8 0 °C而使細胞溶解、經由離心之澄清法、瀘、析、以 RNase 處理、濾、析、POROS® PI/M (Applied Biosystems， Foster City，C A)之陰離子交換管柱層析且以NaCl進行梯度式洗提、POROS® R2/M之逆相層析且以異丙醇進行梯度式洗提、以及UF/DF。最終產物含有2.9%之基因體DNA、< 1% 之蛋白質、< 1%之RNA、以及内毒素之濃度為每毫克之質體中含有2.8内毒素單位（endotoxin units，EU)。然而，此方法需要使用兩種酵素（溶菌酶及RNase)、梯度式-為主之陰離子交換層析、以及採用異丙醇之梯度式-為主之逆相層析。實質上，這些會產生實行上及/或管理上之爭議。

Bhikhabhai之美國專利第6,410,274號揭示一種方法，其涉及鹼性細胞溶解、過濾、以CaCl2進行RNA與基因體 DNA 之沉澱、離心、過渡、Q Sepharose™ XL (Amersham Biosciences Corp·，Piscataway，NJ)之陰離子交換管柱層析且使用階梯式洗提、以及進一步進行Source™ 1 5Q (Amersham Biosciences Corp·，Piscataway，NJ)之陰離子交換管柱層析且使用階梯式洗提。其指出最終產物含有0.6% 1303275 之基因體DNA (經由PCR檢測）、100%之超螺旋質體（經由陰離子交換高效能液體層析（HPLC)檢測）、以及不含可察覺到之RNA (經由逆相HPLC檢測）、蛋白質（經由Micro BCATM 分析法檢測，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)、或内毒素（經由鱟的變形細胞溶解物（limulus amebocyte lysate，LAL)檢測）。此方法中相繼使用兩次陰離子交換之步驟係明顯地缺乏效率。再者，該方法需依賴管柱層析技術，該技術所採用之硬體設備及樹脂所費不貲。

Bridenbaugh等人提出之WO 00/05358揭示一種方法，其中含有質體之細胞係再懸浮於存有RNase之溶液中。該連續性細胞溶解方法中再懸浮之細胞與鹼性細胞溶解溶液係同時加入至固定混合器中以進行細胞溶解。然後經由第二固定混合器將溶胞產物與醋酸鉀沉澱溶液混合。將經沉澱之溶胞產物送入連續性離心機，俾移除絨毛狀沉澱物，得到澄清之溶胞產物。使該澄清之溶胞產物過濾以移除細小的微粒狀物質以及利用Fractogel® TMAE-650M (Merck KGaA，Darmstadt，Germany)之陰離子交換管柱層析進行純化。然後將陰離子交換析出液通過玻璃及尼龍纖維，其聲稱該步驟有助於移除内毒素及基因體DNA。將經純化之質體濃縮以及利用UF/DF去鹽，且經由過濾進行滅菌。最終之内毒素濃度為16.2 EU/毫克。殘餘之RNA、蛋白質、以及基因體DNA的含量皆分別< 2%、< 0.1%、以及< 1%。此方法明顯的缺點係使用連續性離心，因為其高切變速率與伴隨之過量的基因體DNA會釋放至溶液中，以及此等設備 1303275 成本較高之故。由管理上之觀點，使用RNase係此方法之另一缺點。

Nochumson等人之美國專利申請案第2001/0034435號揭示一種方法，其中於使用固定混合器之連續過程中將含有質體之細胞以鹼以及SDS進行溶解。該溶胞產物經由連續添加中和/沉澱溶液（經由第二組固定混合器）予以中和。將該經中和之溶胞產物置於4°C下6-12小時以沉澱出大多數的RNA。利用離心及/或過濾以移除該絨毛狀沉澱物以及沉澱之RNA，然後使該含有質體之溶液進行Fractogel® TMAE-650S (Merck KGaA，Darmstadt，Germany)之陰離子交換管柱層析。接著洗提出質體且使其通過使用Octyl Sepharose™ 4FF (Amersham Biosciences Corp.5 Piscataway, NJ)之疏水性交互作用管柱層析（hydrophobic interaction chromatography，HIC)。於適當條件下，基因體 DNA、RNA、以及内毒素會與樹脂結合，而質體會通過管柱。HIC後，將產物濃縮以及經由UF/DF去鹽，以及無菌過濾。此申請案中未說明關於產量及純度之詳細資料。然而，樹脂之質體結合能力相當低（於陰離子交換樹脂中為1-3毫克/毫升，以及若於結合模式之HIC中為<1毫克/毫升），且此方法亦需依賴管柱層析。

Varley 等人（1999, Bioseparation 8, 209-217)揭示一種方法，該方法由下列步驟所組成··以RNase處理之最適化驗性細胞溶解、袋狀深層過濾、（bag depth filtration)、延伸管柱之陰離子交換層析（expanded bed anion exchange 1303275 chromatography)、超過濾、以及大小排除層析 exclusion chromatography)。類似之方法係揭示於 Thatcher 等人之美國專利第5,981，735號。這些方法中，應小心地將鹼性細胞溶解期間之pH控制在僅低於該經由經驗決定造成質體永久變性之pH值下。研究人員主張此方法容許延長於鹼裱境下的培養時間，推測可使細胞溶解之效果達到最大以及/或在不傷害質體下使RNA降解。其指出雜質含量為基因體DNA<2% (經由PCR檢測）、〇 2%rna (經由 HPLC檢測）、< 〇· 1%之蛋白f、以及之2 5 eu/毫克内毒素。然而，該方法含有數種非所欲之條件，包含制RNase、袋狀深層過濾、、以管柱為主之陰離子交換、以及大小排除層析。進行該經㈣之㈣細胞溶料，需要小心地決定該適用於宿主、質體以及生長條件之特定組合下理想的pH 值，而使人聯想到此步驟可能並不非常標準化。如上述實例所示，於質體純化作用中管柱層析通常係較佳之元件。陰離子交換層析法亦適用於自某些雜質（例如蛋白質)中分離質體’因為質體’就像所有核酸，帶有高負 :荷：度。因&’許多已知之質體純化方法包含陰離子交 =:::而’陰離子交換層析法較不適於自其他具有體因b何么度之核酸（例如基因體DNA或職)中分離質陰離子交換層析法經常與其他層析步驟結合使用，以達充分純化質體。如上述，這些方法可能包含大^ 排除層析法、逆相層析法、疏水性交互作用、甚至其他陰離子交換声析1 ^ H / 、以及增析，卜其他層析技術亦為已知。例 1303275 如，Wils與Ollivier於WO 97/3 5 002揭示以陶瓷羥基磷灰石（ceramic hydroxyapatite)純化質體之方法。相似之方法揭示於Yamamoto之美國專利第5,843,73 1號中。亦可使用，例如，揭示於Gjerde等人之美國專利第5,986,085號中之離子對或經配對之離子層析法（I〇n -pair or matched ion chromatography)。如上述，亦可使用二氧化矽、玻璃珠、或玻璃纖維，例如，Padhye等人之美國專利第5,8〇8,〇41 號，Woodard等人之美國專利第5,65〇,5〇6號，以及w〇〇dard 專人之美國專利苐5,693,785號。此外，如上述，可使用磁珠（magnetic beads)或磁粒，例如，Reeve 與 R〇bins〇n 之美國專利弟5,665,554號，以及Hawkins之美國專利第 5，898，071號中所揭示者。親和力法亦為已知，其實例為乃與Smith之美國專利第5,591，841號，以及以討的等人之美國專利第5,482,836號中所揭示者。暫且不論經常使用之管柱層析法，此技術中仍有些實質上之限制。通常層析法使用之樹脂價格昂貴，且須小心地將樹脂填充至經特殊設計之管柱設備中。如Rath〇re等人所述（2003, ⑽似1，March，30-40)，使每次填充大規模層析管柱之品質保持一致係重大的挑戰。再 ^關於貝體，傳統的層析樹脂一般所提供之結合能力相當低。例如，Levy 等人（2000, 18, 29卜3〇5) 測試各種市售之陰離子交換樹脂後，發現所有市售之樹脂 $質體結合能力約為5毫克/毫升或以下，多數為2毫克/ 毫升或以下。此外，如質體等大分子主要係藉由擴散作用 20 1303275 一〜合位置接近，但樹脂受限於壓力降（pressure dr〇p)之作用進而造成低生產力、使此步驟費時、成本高以及不切實際。因此’需要發展出一種純化方法，該方法可保留管柱層析之優點同時避免其缺點。膜層析法提供了一種可行之解决方案。應用膜之技術一般實質上可提供較高之結合能力，以及非常咼之流速。而不需要昂貴的大規模管柱設備。此外，可避免與官柱填充相關之困難，以及花費在清洗程序驗證方面之需求。先刖有些研究人員已揭示應用膜之方法來純化質體。例如，Nieuwkerk等人，於美國專利第5,438，128號中揭示利用包含數個經堆疊之微孔性陰離子交換膜以純化核酸 (包含質體）。然而，其方法係使用於相當小規模（數百微克之質體）之純化作用。再者，雖然其聲稱該經純化之質體中不含RNA與蛋白質，但未揭示所提供之方法實質上可排除基因體DNA或内毒素。Demmer與Nussbaumer於美國專利第6,23 5,892號中揭示一種自含有内毒素之溶液中純化核酸（包含質體）之方法，該方法係利用微孔弱鹼性陰離子交換膜。同樣地，Yang等人於WO 01/94573中主張一種關於使用兩種（或多種）不同的膜之方法，其中一種係結合質體以及第二種係結合内毒素。研究人員宣稱由該方法所提供之質體可適用於多種醫藥用途，但並未提出支持此論點之數據。因此’上述所揭示之以膜為主之純化方法皆未證實其 21 1303275 適用於製備於醫藥、獸醫、或農業用途上可接受之實質上醇的質體。因此，需要一種可應用膜之層析分離作用之純化方法，避免使用管柱層析，以及提供實質上純之質體或其他所欲之生物活性分子。 [發明内容] 本發明係關於以經控制之方法使細胞溶解以自含有戶斤欲之細胞成分之液體溶胞產物中有效地分離不溶成分，著以膜層析技術純化所欲之細胞成分。本方法係利用特殊之細胞溶解裝置、離子交換以及視需要使用卡式盒形式 (cartridge form)之疏水性交互作用層析膜、以及超過濾。本方法最適合用於生產質體，但亦可應用於自細胞材料所萃取之任何生物產物。本發明之優點為不使用衍生自動物之產物、有機溶劑、或致癌物質，以及快速且具經濟效益。本方法可用於自大腸桿菌中萃取及純化質體，且提供適用於各種用途之物質，包含醫藥產物之臨床上及商業上之生產。所揭示之方法係使用一種細胞分解裝置，其包含高切變，低滯留-時間混合器以充分混合細胞懸浮液與細胞溶解溶液，利用停留時間使雜質變性，以及使用空氣_注入式氣泡混合器溫和且徹底地混合溶解之細胞與中和/沉搬緩衝液以及使濃縮經沉澱之細胞物質浮起。利用簡單之方法將漂浮之沉澱物下的液體排出或抽吸出來，如此即可輕易地自殘留液體中移除漂浮之經沉澱的細胞物質，接著使所欲之細胞成分自液體（較佳）或沉澱物中純化出來。自細胞群中產生所欲之細胞成分之方法包括，利用所 22 1303275 揭不之細胞溶解法以及分離儀器與方法從細胞群中製備澄清之溶胞產物。所欲之細胞成分係自該澄清之溶胞產物中所、、、屯化出來的’其方法為將該澄清之溶胞產物通過離子交換卡式盒'視需要接著通過疏水性交互作用卡式盒。純化後’進行超過濾/濾析使該實質上經純化之物質濃縮及去鹽。若需要，可將該經純化之物質進行滅菌過濾俾提供無菌、實質上經純化之物質。相較於先前揭示之方法，本發明之方法可提供多種優勢。於一方面，本發明揭示一種經改善之方式以混合細胞懸浮與細胞溶解溶液。無疑地，期望使細胞懸浮與細胞溶解溶液達到完全混合，進而實質上所有細胞皆溶解且釋出所欲之細胞成分至溶胞產物中，接著進行純化。若細胞懸洋與細胞溶解溶液未完全混合，可能造成部份細胞仍維持完整。此將使所欲之細胞成分產量較不理想，增加出產成本以及需要較大生產規模以達成所欲之終產物的產量。本發明認為以低切變混合細胞懸浮與細胞溶解溶液並非必要的，即使係為了以鹼溶解含有質體之細胞之需求。因此’本發明提供一種混合細胞懸浮與細胞溶解溶液之方法，忒方法係利用高切變、低滯留_時間之混合裝置。本方法之高切變特性可確保於實質上完全混合細胞懸浮與細胞溶解溶液。而本方法中之低滯留_時間可避免使經溶解之細胞所釋出之細胞成分受到長時間之高切變作用。於較佳具體貫^例中係以連績流動模式（c〇ntinu〇us fi〇w_through mode)進行混合，其實質上有利於進行大量處理，且特別有 23 1303275 利於控制細胞暴露於細胞溶解溶液下之時間。虚固定混a :同，本發明可提供較大的處理彈性。實質上完、全混合：非依據液體流速，且可容易地調门登/也合裝置之攪動速率。因此，熟於此技藝者應能立即明晻 ▲ 1 Θ瞭可廣範圍地改變於高切變、低滯留·時間混合奘罟π β _ ^下之液體流速。此提供於限定時間内增加物質之處理量實質上里只貝上的自由度而不需更改儀器。

另一方面，本發明冑示一種經改善之方法，該方法係於混口命胞產物與-或多種其他液體，同時避免破壞較敏感之成为。例如’本發明揭示於高切變條件下可將含有質體之細胞與驗性細胞溶解溶液混合，但是接著與經溶解之細胞溶液有關之混合步驟仍必須於低切變條件下進行。尤其，一般係使含有質體之細胞的鹼性溶胞產物與中和及 ^贏/合液混合，同時中和該鹼性以及沉澱各種細胞成分。該中和作用可防止永久變性之質體之形成，而沉澱作用可將大里的基因體DNA、内毒素、蛋白質、脂質、脂多醣類、

細胞壁以及膜成分隔離至絨毛狀固體物質中。已知若於此 v驟進行劇烈或尚切變混合，會使過量之基因體Dn a、内毋素、及其他雜質釋放至含有質體之溶液中。於接續之純化步驟中’此等雜質難以自生物活性質體中分離。因此，進行此步驟時需要利用極溫和、低切變之混合法。同時，此步驟需能達成實質上完全之混合。否則，某部分之質體將於鹼中暴露過長的時間而永久變性。同樣地，若混合不 70王將導致細胞成分無法完全沉殿，於後續之處理上需加倍努力以製備實質上經純化之質體。 24 1303275 &如上述’先前研究人員已利用諸如固定混合或低切變比次混合之技術嘗試解決此等需求。此等技術之缺點係如、所，且易為熟於此技藝者所知悉。本發明揭示利用氣泡。盗來混合溶胞產物與諸如中和/沉殿溶液等液體。本發明亦揭示-種氣泡混合裝置’其可用於實行本發明所揭示之方法。本文所揭示之方法及裝置係利用氣泡使液體混合 :句。同時’某些氣泡會經捕捉至所產生之細胞成分沉澂中。此有利於沉澱物質之漂浮，幫助沉殿物自含有所欲之細胞成分液體中進行後續之分離。此為本發明之顯㈣響優點。另-方面，本發明提供-種經整合之方法，該方法係用於製備含有所欲之細胞成分的澄清化溶胞產物，以及本發明提供用於實行本發明方法之儀器。此方面，將上述分別=不之方法組合成連續性程序，包括：⑴利用高切變、低滯留-時間混合器混合細胞懸浮與細胞溶解溶液;⑺將該經混合之細胞懸浮與細胞溶解溶液通過停留線圈（h〇iding φ )俾提供固定的暴露時間，其足以使細胞實質上完全溶解且使基因體DNA變性；(3)利用氣泡混合器將該經溶解、田I與办液（例如中和/沉澱溶液）混合，因而將氣泡捕捉 1 /儿瓜之細胞成分中；以及（4)將所得之物質收集至沉降槽中。有利地，這些步驟係於連續的程序下進行，可提供操乍者貝夤上的彈性以及容易實行。另一具體實施例中，讓收集於沉降槽之物質停留一段時間而足以使該沉澱之細胞 25 1303275 成分形成漂浮層。此層之形成係受助於由氣泡混合器所引入且經捕捉之氣泡。視需要，可對沉降槽中之物質施加真空俾進一步濃縮該經沉澱之細胞成分以及去除液體中之氣體。雖後’將經沉澱之細胞成分下的液體利用抽吸或排出法取出’而將液體自經沉殿之細胞成分中分離出來。所得之經分離的液體包括澄清之溶胞產物，然後可利用各種方法自該溶胞產物中純化所欲之細胞成分。本發明之優點為自該液體分離絨毛狀經沉澱之細胞成分時不需使用深層過濾或離心。胃另一方面’本發明揭示自溶解之細胞純化所欲之細胞成分之方法。較佳具體實施例中，所欲之細胞成分為質體，以及該細胞為含有質體之細胞。該方法利用離子交換膜進行純化作用’ &需要進行第二次膜純化作用，以移除内毒素及RNA，提供實質上經純化之產物。較佳地，該離子交換係揉用陰離子夺4益游斗、咕 , 卞又換形式。第二次之膜純化作用較佳係採用疏水性交互Η ^ _ /式。可進行其他步驟，例如超過渡/濾、 _ 析以及滅菌過濟，梭腺 _ 應俾將所欲之細胞成分濃縮、去鹽、以及滅卤。本文所揭示丁之方法的優點在於避免使用傳統的管柱層析’該管柱層柄由田曰曰析而使用卬貴之層析樹脂以及管柱設備， :典型地受限於不良之結合能力，以及低液體流速。反之，八：所揭不之利用膜之純化方法可使成本降低、具有高結、力w及南流速等優點’而成為優異之純化方法。本文進一步以生產會哲、只貝上不含基因體DNA、RNA、蛋白質、以及内毒素之質臀姦、體產物為例，說明該純化方法。 26 1303275 於特佳之具體實施例中，結合本發明所述之所有觀點，提供一種經整合之方法，該方法係由細胞製備所欲之實質上、c純化之細胞成分。再者，該細胞較佳為含有質體之、、、田胞，以及所欲之細胞成分較佳為質體。實質上經純化之質體可適用於各種用途，包含，但非限於基因療法、質體-中介之療法、作為人類、獸醫方面之DNA疫苗、或農業用途’或者適用於任何其他需要大量經純化之質體的用途於此方面’將本發明所述之各個觀點的所有優點匯集鲁成完整、經整合之程序，以提供快速、可行、以及經濟之極棱異的方法。避免使用酵素及其他衍生自動物或生物來源之物貝’因此等物質具有致癌性、可誘導有機體突變、或為其他毒性物質。同樣地，亦避免使用潛在上具有易燃性、爆炸性、或毒性之有機溶劑。本發明之一方面係關於自含有質體DNA與基因體 DNA兩者之細胞懸浮中分離出質體DNA之儀器。該儀器之/、體只知例中包括第一槽及第二槽，兩者經由混合器進 _ 行液體交流。該第一槽係用於存放細胞懸浮，以及該第二槽係用於存放細胞溶解溶液。使第一槽之細胞懸浮與第二槽之細胞溶解溶液流入混合器中，形成溶胞產物混合物或溶胞產物液體。該混合器包括高切變、低滯留-時間混合裝置’其滯留時間約等於或小於丨秒。較佳具體實施例中， “匕a裝置包括流通之轉子/定子混合器mixer) 或礼化器（emulsifier)，其線流流速為自約〇1升/分鐘至約 20升/为鐘。該溶胞產物-混合物自混合器流入停留線圈， 27 1303275 經過一段足以溶解該細胞之時間後，形成細胞溶胞產物懸浮液，其中該溶胞產物-混合物於停留線圈内以連續線流之流速停留約2_8分鐘。然後使細胞溶胞產物懸浮液流入氣泡-混合器反應室’將細胞成分自質體DNA中沉澱出來。於氣泡·混合器反應室中，利用氣泡使該細胞溶胞產物懸浮液與來自第三槽之、; 儿丨殿溶液或中和溶液混合，形成混合之氣體懸浮液’ 其包括沉澱物以及渾濁之溶胞產物或含有質體之液體。混合之氣體懸浮液中的沉澱物其密度小於含有質體之液體，此點有助於分離沉澱物與含有質體之液體。自混合之氣體懸浮液中移除沉澱物，得到含有質體DNA之澄清化的溶胞產物’而該沉殿物中含有細胞殘骸以及基因體DNA。較佳具體實施例中，該氣泡混合器-反應室中包括密閉式垂直管柱，其具有頂部、底部、第一邊、以及於接近管柱頂部具有排氣口之第二邊。該氣泡混合器-反應室之第一入口係位於第一邊上且接近管柱底部並與停留線圈相連。該氣泡混合器-反應室之第二入口係位於第一邊對面之第二邊上且接近管柱底部並與第三槽相連，其中該第三槽係用於存放沉澱或中和溶液。該氣泡混合器-反應室之第三入口係接近管柱底部且約位於第一與第二入口的中間，並舆氣體來源相接，該第三入口係用於將氣體引入至氣泡混合器-反應室中。較佳之具體實施例係使用燒結喷佈器 (sintered sparger)，其位於第三入口之密閉式垂直管柱内。該氣泡混合反應室之出口係接近該密閉式垂直管柱之頂 28 1303275 部。該出口係與第四槽相相連，其可使含有質體DNA之經混合之氣體懸浮液自該氣泡混合器-反應室流至第四槽。該第四槽係用於分離經混合之氣體懸浮液中的沉殿物，該經混合之氣體懸浮液内含有質體，以及該第四槽中亦可具有葉輪混合|§ (impeller mixer)充分使液體混合均勻而不擾亂沉澱物。第五槽係用於存放澄清之溶胞產物或澄清之含有液體之質體。然後將該澄清之溶胞產物至少過濾一次。第一過濾器之粒子大小限制為約5-1〇微米而第二過濾器之濾過限制為約0.2微米。雖然可利用重力、壓力、或其混合條件將細胞懸浮液；細胞溶解溶液；沉澱溶液；中和溶液；或混合之氣體懸浮液自任何槽中運送至混合器、停留線圈、或不同槽，但是於較佳具體實施例中係使用幫浦。於更佳之具體實施；

其至J使用一個幫浦’該幫浦之線流流速至少為〇 H 尺/秒。另一特定具體實施例中，係使用具有第一雙又式分支、第二雙又式分支以及出口分支（exitbraneh)之Y連接器 =細胞懸浮液以及細胞溶解溶液進人高切變、低滞留_時間二合裝置前連接彼此。存放細胞懸浮液之第—槽係經由第與該Y-連接器之第一雙又式分支相連以及存放細胞合：液之第二槽係經由第二幫浦與該¥_連接器之第二雙 :式分支相連。該高切變、低滯留-時間混合裝置係鱼Y又 =之出口分支相連，其中該第一及第二幫浦使經接觸液體離開Y-連接器時之線流流速約為〇1至2呎/种。 29 1303275 本發明之另一特定方面係關於自細菌細胞之溶胞產物中實質上分離質體DNA與基因體DNA之方法。該方法包括：將細胞之溶胞產物遞送至反應室；將沉澱液體或中和液體遞送至該反應室；於反應室中使細胞之溶胞產物與沉殿液體或中和液體混合，並利用氣泡形成氣體混合懸浮液’其中該氣體混合懸浮液包括存在於液體部分（亦即渾濁之溶胞產物）之質體DNA以及存在於沉澱物（其密度比液體部分低）中之基因體DNA ;使該沉澱物漂浮於液體部分之頂端；自沉澱物存在下移除該液體部分，形成澄清之溶胞產物’那麼澄清之溶胞產物中的質體DNA實質上係與沉殿物中之基因體DNA分離。於較佳之具體實施例中：該反應室係如上所述之氣泡混合反應室；該細胞溶解溶液中包括鹼、酸、清潔劑、有機溶劑、酵素、干擾劑、或變性劑；該沉澱液體或中和液體中包括醋酸鉀、醋酸銨、或其混合物；以及該氣泡包括壓縮空氣或惰性氣體。此外，進一步將該含有質體DNA之經倒出之液體部分以一或多種純化步驟進行純化，該等純化步驟可選自由離子交換、疏水性交互作用、大小排除法、逆相純化法、内毒素耗盡（end〇t〇xin depletion)、親和性純化法、對二氧化矽、玻璃、或聚合性物質之吸附作用、延伸管柱層析法、混合模式之層析法、置換層析法、羥基磷灰石純化法、選擇性沉澱、二水相純

化法（aqueous two_phase purification)、DNA 縮聚（DNA condensation)、親硫純化法（thi〇philiepurificati〇n)、離子對純化法、金屬螯合純化法、經由硝化纖維過濾、以及超 1303275 過濾所組成之方法。於較佳之特定方面中，自細胞分離質體DNA之方法包括：將含有質體DNA以及基因體DNA之細胞懸浮液與細 · 胞溶解溶液於高·切變·低-滯留-時間-混合_裝置中混合一段時間（稱為第一時間），形成細胞之溶胞產物液體；於停留線圈中培養該細胞之溶胞產物液體一段時間（稱為第二時間）’形成細胞之溶胞產物懸浮液；將細胞之溶胞產物懸浮液遞送至反應室；將沉殿/中和液體遞送至反應室；於該反籲應室中利用氣泡混合該細胞之溶胞產物懸浮液以及沉殿/ 中和液體’形成氣體混合懸浮液，其中該氣體混合懸浮液包括含有質體DNA之渾濁之溶胞產物以及含有基因體 DNA之沉澱物，其中該沉澱物之密度比潭濁之溶胞產物低’使違 >儿殿物漂浮於渾濁之溶胞產物之頂端；自渾濁之溶胞產物中移除該沉澱物，形成澄清之溶胞產物，那麼該貝體DNA實質上係與基因體DNA分離；使該質體DNa自澄清之溶胞產物中沉澱出來；以及將該沉澱之質體DNA再籲懸浮於水溶液中。 [實施方式] 熟於此技藝者可輕易地明白在不悖離本發明之範疇及精神下可對本發明所揭示之内容進行各種取代及修飾。本文中所使用之「一」（“a”或“an”）係指一者或多者。於申請專利範圍中，當與r包括」一詞連接時，「一」（“a，，或an )係指一者或大於一者。本文中所使用之「其他」係指第二者或第二者以上。 31 1303275 本文中所使用之「鹼」係指一種物質，當該物質以足夠量加入水中時可使pH達到8以上。「鹼」一詞包含，但非限於，氫氧化鈉（NaOH)、氫氧化鉀（KOH)、或氫氧化鋰 (LiOH) 〇本文中所使用之「清潔劑」係指任合一種兩性的或界面-活性劑，不論其係中性、陰離子性、陽離子性、或兩性離子性。該清潔劑包含，但非限於，十二基硫酸鈉（SDS)、 Triton® (聚乙二醇第三-辛基苯基醚，Dow Chemical Co.， Midland，MI)、Pluronic® (環氧乙烷/環氧丙烷嵌段共聚物， BASF Corp·，Mount Olive，NJ)、Brij® (聚氧乙烯醚，ici Americas，Bridgewater，NJ)、3_[(3_ 膽固醇基醯銨基丙基）二甲基胺基]·1-丙烧石黃酸 (3_[(3_cholamidopropyl)dimethylammonio]_l-propanesulf〇n ate，CHAPS)、3-[(3-膽固醇基醯銨基丙基）二曱基胺基]_2_ 經基-1-丙烧石黃酸（CHAP SO)、Tween® (聚乙二醇山梨糠醇， ICI Americas，Bridgewater，NJ)、膽酸鹽、十六烧基三甲基銨、N-月桂醯基肌胺酸、Zwittergent® (n_烧基-N，N-二甲基 -3-銨基-1-丙燒石黃酸，Calbiochem，San Diego，CA)等。本文中所使用之「離子交換」係指一種分離技術，其主要係根據所欲之分子或多種分子與適當之離子交換物質間之離子性交互作用。雖然該離子交換物質通常大部分為層析樹脂或膜，但其可為根據離子性交互作用而適用於進行分離之任合物質。離子交換包括陰離子交換、陽離子交換、以及陰離子與陽離子交換兩者之組合。 32 1303275 本文中所使用之「陰離子交換」係指— v 日種分離技術，其主要係根據所欲之分子或多種分子上一或多個負電荷與適§之帶正電荷之陰離子交換物質間之離子性六用。雖然該陰離子交換物質通常大部分為層析樹：：，但其可為根據所述之離子性交互作用而適用於進行八、任合物質。、仃刀離之本文中所使用之「陽離子交換」係指—種分離技術，其主要係根據所欲之分子或多種分子 ^ 或多個正電苻與適當之帶負電荷之陽離子交換物質間之離子性交互作用。雖然該陽離子交換物質通常大部分為層析樹脂或膜，但其可為根據所述之離子性交互㈣而適用於進離任合物質。 ^ 本文中所使用之「疏水性交互作用」以及「HIC」係指 -種分離技術，其主要係根據所欲之： ^ ^ , ^ L ^ 丁4夕種分子與適田之本質上為疏水性或親水性物質間之疏水性交互作用。雖α該本質上為疏水性或親水性 ..^ ^ 初買通吊大部分為層析树知或膜，但其可為根據疏水性交 1 乂立作用而適用於進行分離之任合物質。本文中所使用之「質體」係指任口田不同細胞衍生之核酸本體，其非為宿主細胞主要基文丞囚體之一部份或1片段:本文中所使狀「質體」係以RNA或麵所之壤狀或線狀分子。該「質體」係指單股或雙股分子，且其包含核酸本體，例如病毒或噬菌體。本文中所使用之「基因體dna 」係^來自宿主細胞之 33 1303275 DNA。其包含宿主細胞主要基因體之所有部份或任何部分之DNA分子，不論為線狀或環狀，單股或雙股。本文中所使用之「内毒素」係指脂多醣類物質，其源自格蘭氏陰性菌且對動物產生有害的影變。A 、曰興型地，内毒素可由鱟的變形細胞溶解物分析法測得。本文中所使用之「高切變、低滯留_時間混合器」係相任何可使液體或流體（例如生物液體或流體，包含，尤盆係’質體、細胞懸浮液、細胞溶解溶液、

胜狀、胺基酸、核酸、其他物質、或其混合物）進行短時間高切變 (切變速率至少為·/秒）之裝置，其實質上使液體或流儀中之所有元素以及成分於約1秒或以 1心岈間内完全混合0 本文中所使用之「層析」包含任何涉及分子或多個分子與基質進行交互作用之分離技術。該基質係呈固體或多孔小珠、樹脂、粒子、《、或任何其他適當物質之形式。除非另行說明，否則層析包含流通式以及批次式方法。本=中所使用之:沉殿作用」係指使存在於溶液、懸 =。礼液或類似狀態中之—或多種成分形成固體物質之本文中所使用之「沉澱作六係指任何可引起沉殺作用/二二以及：沉澱溶液」除非另行說明，否則沉资作’飞芯汙液、或其他液體。否則，用溶液亦可提供中本文中所使用之「中釦於m 1下用之PH調整至接近中性之2用」係、指將酸性或驗性物質

'。典型地，中和作用係將pH 34 1303275 調整至約6至約8之範圍。 ^本文中所使用之「中和作用溶液」以及「中和溶液」係任何溶液、懸浮液、或其他液體，當其與酸性或鹼性物貝屍合時可產生中和作用。除非另行說明，否則中和作用溶液亦可提供沉澱作用。本文中所使用之「中和/沉殿溶液」係指任何可提供中和以及沉澱作用兩者之溶液、懸浮液、或其他液體。本文中所使用之「細胞成分」包含源自細胞之任何分子、分子群、或分子之部分。細胞成分之實例包含但非限於崎、RNA、蛋白質、質體、脂質、碳水化合物、單類夕醣類、脂多_類、内毒素、胺基酸、核芽、核脊本文中所使用之「膜」，其與層析或分離方法及材料關，係指任何實質上具有可讓液體通過之多重孔洞或通之連續固體材料。該膜並無限制，包括諸如平片、皺折

摺疊層之幾何形狀’以及管狀或具有交聯孔洞之整塊材 :。相較下’當涉及細胞成分時，「膜」一詞係指所有或份細胞周圍以脂質為主之外層。 θ本文中所使用之「氣泡混合器」係指任何可利用氣混合二或多種未經混合或未完全混合之物質之裝置。本文中所使用之「細胞懸浮液」係指任何包括細胞、、、田胞集合物、或細胞碎片之液體。係指任何包括細胞釋出其内部成分。本文中所使用之「細胞溶胞產物」之物質’其中大部分之細胞已經破壞且 35 1303275 本文中所使用之「細胞溶解溶液」係指任何可使完整之細胞溶解之溶液、懸浮液、乳液、或其他液體。凡本文中所使用之「澄清溶胞產物」係指實質上已去除可見之微粒固體之溶胞產物。 ” 本文中所使用之「巨微粒子」係指直徑大於或約為 ΙΟΟμπι之固體物質。本文中所使用之「微微粒子」係指直徑小於約1〇邮辽之固體物質。

本文中所使用之「超過濾」以及「UF」係指任何可將溶液或懸浮液通過半-透膜之技術，其可將巨分子留在膜上，而使溶劑及小型溶質分子穿過膜。可利用超過濾增加溶液或懸浮液中巨分子之濃度。除非另行說明，否則超過濾一詞包括連續式及批次技術兩者。本文中所使用之「濾析」以及「DF」係指任何一種技術，其中該溶劑及小型溶質分子係存在於該巨分子經由超

過滤移除之溶液或懸浮液中且可以不同之溶劑及溶質分子予以取代。濾析可用於改變pH值、離子強度、鹽的組成、緩衝液的組成、或其他巨分子之溶液或懸浮液的性質。除非另行說明，否則濾析一詞包括連續式及批次技術兩者。本文中所使用之「超過濾/濾析」以及r UF/DF」係指任何可相繼地或同時達成超過濾及濾析兩者之技術或其組合技術。本發明之一方面係關於在經控制之方式下使細胞溶解之方法，俾萃取所欲之細胞成分。該細胞可為任何含有所 36 1303275 欲之細胞成为之細胞。其較佳為微生物細胞。更佳為大腸桿菌細胞。該細胞可由任何方式製造或產生，但較佳為經由發酵培養產生。發酵培養細胞之方法為熟於此技藝者所知悉。可採用本發明方法自細胞萃取任何所欲之細胞成分。該細胞成分較佳為巨分子物質，例如質體或蛋白質。更佳為質體。因此，於一較佳具體實施例中，本發明係關於溶解含有質體之大腸桿菌俾萃取該質體之有利的方法。本發明另一面係關於自細胞之溶胞產物中純化所欲之細胞成分之方法。該細胞之溶胞產物可為任何形式之細胞的溶胞產物，而該細胞含有所欲之細胞成分。再者，該細胞之溶胞產物可由此技藝中所知悉之任何方式而產生。該 /合胞產物較佳包括含有質體之經溶解之細胞。更佳地，該 /合胞產物包括以鹼、清潔劑、或其組合加以溶解之含有質體之細胞。該所欲之細胞成分較佳為質體。第1圖顯示特佳之具體實施例的完整摘要，其結合本發明之所有觀點。第-步，生產及採收所欲之細胞。該細胞車乂佳係由I酵培養生產。可使用任何發酵培養方法，且广、、；此技藝者有旎力可製備出足量所欲之細胞。尤其於較 /、體K施例中，該細胞為含有高複製數之所欲質體之大腸才干菌，以及利用批次或饋料批次技術將該含有質體之細胞I酵培養至高密度。製備此等含有質體之大腸桿菌細胞 =進行此等批次或饋料批次發酵培養之方法皆為熟於此心二者所知悉。可利用任何方式採收培養之細胞，例如離 u或過遽’以形成細胞糊狀物。此等採收方式為熟於此技 37 1303275 藝者所知悉。再者，為熟於此技藝者應明瞭採收之細胞應立即進行處理，或儲存於冷凍或冷藏狀態下以利後續處理。第二步，將細胞溶解，使其内容物，包含所欲之細胞成分，釋出至溶液中。本文中揭示進行此步驟之較佳方法，且詳述如後。第二步，將固體細胞殘骸及經沉澱之細胞成分自澄清之溶胞產物中分離。本文中揭示進行此步驟之較佳方法，且詳述如後。第四步，使含有所欲之細胞成分的溶液進行離子交換層析。較佳係採用以膜為主之方式。而較佳係採用陰離子父換膜層析。本文中揭示進行此步驟之特定方法，且進一步詳述如後。第五步，使得自離子交換層析之經部分純化之物質進行&水性交互作用層析。此較佳係使用以膜為主之方式進仃。進打此步，驟之特定方法進一步詳述如後。於某些具體實施例中，可省略此步驟。、第/、步，使得自疏水性交互作用層析（若進行此步驟）或知自離子又換層析(若省略Hic)之物質進行超過濾及濾析，俾濃縮該所欲之細胞成分，以及自該溶液中移除過量的鹽。超過濾/濾析之使用為熟於此技藝者所知悉，特別係用於生物巨分子例如蛋白質或質體。、第七步，視需要使經濃縮與去鹽之產物進行滅菌過戚、，例如使該產物適用於醫藥用㉟。再者，進行此步驟之方法為熟於此技藝者所知悉。 38 1303275 ^些步驟之結果係得到貫質上經純化之所欲之細胞成分的大量製備物。這些細胞成分較佳為質體。更佳地，其· ’ 實質上不含基因體DNA、RNA、蛋白質、以及内毒素。第2圖係用於進行細胞溶解之儀器的圖解。尤其，該儀益適用於連續性之處理程序，包括使細胞懸浮液與細胞溶解溶液接觸，利用高切變、低滯留_時間之混合器混合該、二接觸之液體’使該溶胞產物-混合物以固定的時間通過停留線圈，該時間實質上足以使細胞完全溶解且使基因體 να隻性而不會使所欲之細胞成分永久變性，利用氣泡混合器將所得之細胞溶胞產物與沉澱溶液混合，以及將所得之物質收集於沉降槽。將含有所欲之生物活性分子之細胞製成適當的懸浮液且載入至槽（第2圖中之201)中。該細胞可懸浮於任何適當的溶液中。該細胞較佳為含有質體之大腸桿菌細胞。該懸净溶液較佳含有適當濃度之緩衝液、適當濃度之螯合劑、或同時έ有上述兩者。更佳地，於ρΗ約為8時，該懸浮溶 _ 液中包括約25mM之Tris以及約i〇mM之Na2EDTA。較佳具體實施例中，該細胞懸浮液係將已知重量之細胞糊懸浮於已知重篁之懸浮緩衝液中而予以製備。較佳地，係將一份之細胞糊再懸浮於約4_10份之緩衝液中，更佳為再懸浮於約6-8份之緩衝液中。所得之細胞懸浮液之光學密度值較佳為約50·80單位。更佳為約單位。將細胞溶解溶液載入至槽（第2圖中之2〇2)中。該細胞溶解溶液中較佳含有-或多種細胞溶解劑，例如驗、酸、 39 1303275 酵素、有機溶劑、清潔劑、干擾劑、變性劑、或一或多種此等試劑之混合物。該細胞溶解溶液中較佳包括驗、清潔劑、或其混合物。適當的鹼包含，但非限於，NaOH、LiOH、或KOH。清潔劑可為非離子性、陽離子性、陰離子性、或兩性離子清潔劑。適當的清潔劑包含，但非限於，SDS、

Triton®、Tween®、Pluronic®、Brij®、及 CHAPS、CHAPSO、膽酸鹽、十六烧基三曱基銨、Ν·月桂醯基肌胺酸、以及 Zwittergent®。此領域之一般技術人員明瞭如何選擇適當的驗或清潔劑。較佳之具體實施例中，該細胞溶解溶液包括 NaOH及SDS。該NaOH的濃度較佳為約〇· 1至約〇·3Ν，以及更佳為約0.2N。該SDS的濃度較佳為約〇·丨％至約5〇/0, 以及更佳為約1 %。利用幫浦（第2圖中之2〇3)分別自槽2〇1與202中抽出細胞懸浮液與細胞溶解溶液，且經由「γ」形連接器（第2 圖中之204)使兩者相接觸。如所示，較佳具體實施例中，利用雙頭幫浦（dual head pump)以相同之流速汲取等量之細胞懸浮液與細胞溶解溶液。然而，熟於此技藝者應了解，若需要，可利用個別的幫浦以不同速率汲取不同體積之細胞懸浮液與細胞溶解溶液。此等變化係包含於本發明之範疇下。較佳具體實施例中，係經由雙頭幫浦以線流流速約〇·1 1叹/秒’权佳為@ 0.2-0·5 口尺/秒同時沒取細胞懸浮液與細胞溶解溶液。該相接觸之液體離開「γ」形連接器時期流速約0.1-2呎/秒，較佳為約ο *」呎/秒。離開Υ」形連接器後，使該相接觸之細胞懸浮液與細 1303275 胞溶解溶液通過高切變、低滯留_時間混合器（第2圖中< 2⑹。該混合器為可提供快速、高切變混合同時將暴露於局切變下之定量液體的滯留時間減至最短之任何裝置。該裝置較佳係以流通模式進行混合（相對為批次模式）。較佳具體實施例中，該混合器係轉子々子混合器或乳化器。熟於此技藝者應明瞭此等各式之高切變、低滯留_時間混合器可自市面上購得。—般，此等混合器係以其於極短時間内使液體進入高切變之微環境下之能力為特徵，血型地，气時間小於或約為。任何此等混合器之使用皆包含於：發明之範鳴下。較佳之具體實施例中，該混合器係如電議 L4R轉子/定子混合器’配有標準之乳化篩（Emuis〇r似⑽) ^ ^ 15] # # (In-line assembly) (Silverson Machines, East L〇ngmead〇W，MA)。此具體實施例中，該轉子較佳之運轉速度為5〇〇_900啊，K圭之速度為700-900 rpm。此等混合器適合處理體積範圍廣泛之細胞懸浮液。例如該⑽型之混合器可處理之液體流速為自約〇1至約2〇升/分鐘。然而，熟於此技藝者應明瞭大規模之混合器實質上可用於處理較大體積之細胞懸浮液。此等應用可輕易地由熟於此$ 藝者以普通實驗驗證完成。利用高切變、低滯留_時間混合器，如本文所提供者，之優點在於實際上瞬間將高切變施用於二或多種液體時，其於極短的滯留時間内可提供優異之混合作用。該滯留時間較佳係低於或約1秒。更佳為，該滞留時間係低於或約 100毫秒。短暫之滞留時間可確保經萃取之細胞成分不會 1303275 因暴露於高切變條件下受到毁壞。另一優點為本文所提供之展a器可輕易地適用於不同的液體流速，以及可調整速度之混合轉子可提供應用上之彈性。因此，此等混合器較具有彈性以及較其他同軸混合器（例如固定混合器）更具效 1。本發明之新發現為，當進行細胞溶解程序時使用此等高切變混合器不會產生傷害，而先前係認為當以鹼及清潔劑溶解含有質體之細胞時易受到切變之影響。接著，使離開該高切變、低滯留-時間混合器之物質通過停留線圈（第2圖中之206)。此線圈之管線長度足以使液體以既定的時間通過該線圈。該線圈之功能為提供細胞與細胞溶解劑充足且一致的接觸時間，俾確保細胞實質上完全溶解。同時，該線圈可確保接觸時間不會太長以免產生不良後果。較佳具體實施例中，該細胞係含有質體之細胞以及該細胞溶解溶液中含有驗’其目的係確保暴露於驗下足夠的時間使細胞實質上完全溶解以及使蛋白質、基因體 DNA、以及其他細胞成分實質上完全變性。然而，亦期望暴路於驗之時間不會太久以免造成大量永久變性之質體。本發明儀器中所提供之停留線圈可控制此接觸時間。該接觸時間較佳為約2至約10分鐘，更佳為約4至约6分鐘。可經由適當組合該線圈之長度、線圈之内徑—a er ID)以及線流流速以提供所欲之接觸時間。熟於此技藝者可選擇出此等參數之適#組合。較佳之具體實施例中’當經溶解之細胞以所欲之速度流過時，停留線圈之長度及m達成所欲之暴露日㈣。該停留線圈之長度 42 1303275 ^為約5G 口尺，内徑約G.625英对。此具體實施例中，該、、、一，解之广胞離開該高切變、低滯留_時間混合器後較佳係、、勺〇·1 7呎/秒之速率通過停留線圈，以提供約5分鐘之接觸時間。離開停留線圈後，經溶解之細胞進入氣泡混合器（第2 圖中之2〇乃。同時，幫浦（第2圖中之209)將槽（第2圖中之208)中之中和/沉澱溶液遞送至氣泡混合器。且同時，將槽（第2圖中之21〇)中之經壓縮之氣體引入該氣泡混合器之底部。當該經溶解之細胞溶液進入該氣泡管柱混合器時，至 >、添加種其他溶液。該溶液可為中和溶液、沉殿溶液、或其組合，亦即中和/沉澱溶液。為了選擇性地沉澱非所欲或所欲之細胞成分，決定溶液的因素係根據總離子濃度、以及所選擇之離子或離子群。典型地係使用醋酸鹽達成此目的。鹽之種類及濃度亦會對所得混合物之最終pH值產生影響。該溶液之pH可經由添加酸，例如醋酸，予以進一步控制。此酸可添加至中和溶液或由氣泡管柱混合器上之另參一接口直接添加至處理程序中，以達成中和及沉澱作用之獨立控制。若需要添加其他藥劑，例如緊實劑（c〇mpaeti〇n agents) ’於某些實例中較佳係先中和該混合物，之後再進行沉澱步驟。某些情形下，較佳係經由計算及實驗程序決定具有適當離子、離子強度、以及最終pH值之單一溶液（中和/沉澱溶液）’其可達成中和經溶解之細胞溶液以及選擇性沉澱某些細胞成分兩者之功能。第3圖顯示氣泡混合器之較佳具體貫施例的詳細圖解。如所示，經溶解之細胞自一 43 1303275 邊（第3圖中之301)進入該混合器的底部，同時中和/沉澱溶液自相對邊（第3圖中之302)進入該混合器的底部。經壓縮之氣體（第3圖中之306)係經由燒結喷佈器引入，其約位於液體流之相遇處（第3圖中之303)。經溶解〜τ f 溶液垂直地向管柱上方流動且由接近管柱頂部（第3圖中之 304)之出口離開。氣泡通過垂直管柱中之液體並用於混合該經溶解之細胞與中和/沉澱溶液。本發明之優點為上升氣泡可產生充分且十分溫和之混合作用，並避免過分破壞敏感性成分，例如基因體DNA或内毒素。當中和/沉澱溶液與細胞溶胞產物混合時，細胞成分開始沉澱。本發明另一優點為有些氣泡會由所得之沉澱物所捕捉，而有助於後續沉澱物自液體部份中分離。於該氣泡混合器之頂部提供2 氣裝置以排出過量氣體（第3圖中之3〇5)。於實施例所提供之具體實施例中，該氣泡混合器具有下列特點：下方低處入口之内徑（ID)為〇 625英吋；燒結噴佈器之高度為1英对，直徑為〇.5英对；管柱中發生混合作用之實際面積其ID為1.3 75英吋以及高度為24英吋；出口之ID為L375英对；以及用於排出過量氣體與任何泡沫之換氣裝置其高度為12英吋，ID為1 375英吋。然而，熟於此技藝者應明瞭較大或較小規模之混合器、或改變'尺寸或幾何之混合器可用於處理不同體積之溶液或具有不同性質之溶液，例如，但非限於’黏度、密度、及其他。熟於此技藝者亦應明瞭可使用各種引入氣泡 ^ 一、、 4乃武。如於非-限制實施例中，可經由在混合器之壁、邊逯、或底部上設計多 44 1303275 噴佈器。此等取代方式可等取代方式係包含於本發個小孔將氣體引入，以替代燒結由热於此技藝者輕易完成，且此明之範疇中。熟於此技藝者可輕易了解本發明所提供之氣泡混合哭有利於使任何所欲之液體與一或多種其他液體混合。所: 之液體的實例包含，但非限於，細胞懸浮液、細胞溶胞產物、以及含有所欲之細胞成分之液體。其他液體之實例包 3仁非限於’緩衝溶液、鹽類溶液、細胞溶解溶液、中和溶液、沉澱溶液、中和/沉澱溶液等。只要提供適合數量之入口，任何種類數量之液體皆可混合。因此，儘管較佳八體實施例為兩個人口，熟於此技藝者可輕易地提供且有三或多個入口之氣泡混合器，以容許混合三或多種液體。 U地jtb等修御係包含於本發明之範缚下。再者，熟於此技藝者應明瞭可輕易改變本文所提供之氣泡混合器的幾何與^汁。再次，此等改變係包含於本發明之範疇下。本文所提供之氣泡混合器特別有利於混合細胞溶胞產物與中和/沉澱溶液而不會使敏感性成分產生過度切變。較佳具體實施例中，該細胞溶胞產物包括以驗、清潔劑、或其混合物溶解之含有質體之細胞，以及該中和/沉澱溶液可中和鹼且使細胞成分（例如蛋白質、膜、内毒素、以及基因. 體DNA)沉殿。該驗較佳為Na〇H，該清潔劑較佳為SDS，以及該中和/沉殿溶液中包括醋酸鉀、醋酸錄、酷酸、或其組合。更佳地，該中和/沉殿溶液中包括未經緩衝之溶液，其含有約1Μ之醋酸鉀以及約7M之醋酸銨。與約為5 45 1303275 時各有約3M之醋酸鉀之傳統中和/沉澱溶液相比，此較佳之中和/沉澱溶液具有至少兩項優點。第一，與鹼性溶胞產物混合後’所得粗溶胞產物之pH約為8。已知延長質體及 ’ ’、他DNA於酸性條件下之培養時間會產生去嗓呤作用，因此本發明之中和/沉殿溶液比酸性之傳統中和/沉殿溶液較佳。第二個優點為本發日月提供之較佳的中和/沉殿溶液可提，較高濃度之酷酸錄，可幫助自粗溶胞產物溶液中沉澱過里之RNA ’而有助於獲得實質上經純化之質體產物。於低溫下可加強此RNA沉澱作用。因此，於較佳具體實施例中，該中和/沉澱溶液係以經冷卻至約2_8〇c之形式提供。該氣 /包此a器以及本文所揭示之相關的混合方法，其獨特的優點為含有質體之細胞的鹼性溶胞產物與中和/沉澱溶液混合時可避免釋出過量之基因體DNA以及内毒素至含有質體之溶液中。另一優點為當氣泡在混合液體時，實質上部分氣泡會由經沉澱之物質所捕捉。這些經捕捉之氣泡可幫助經 >儿版之物質漂浮於溶液中，有助於後續自澄清之溶胞 _ 產物中分離該沉澱物質，進一步詳述如後。熟於此技藝者可利用普通實驗決定溶液流經該氣泡混合器之適當流速。較佳地，經溶解之細胞與中和/沉澱溶液各係以相等之速率約為Hi呎/秒，較佳為各約〇.2-〇·5呎 /秒’流進該氣泡混合器。熟於此技藝者可輕易地決定氣體流經該氣泡混合器之適當速率。較佳地，氣體流動速率至少係約母分鐘流經1公升標準（standard liter per minute， slpm)，較佳為至少約2 sipin。任何適當之氣體皆可使用， 46 1303275 ° 3 但非限於，空氣、氮、氬、二氧化碳等。該氣體較佳為經過濾之壓縮空氧。缺孔然而’於某些應用中，尤其確定任何溶液或溶液令之任何成分對氧敏感時，以使用惰性氣體為佳，例如氮或顏。士楚 ^ 此荨h性氣體之使用係包含於本發明之範疇下。參照第2圖，液態細胞溶胞產物與沉澱之細胞成分之漿液離開該氣泡混合器後經收集於沉降槽(第2圖中之 211)。使該漿液停留於沉降槽一段時間，讓經沉澱之細胞成分實質上完全自液態細胞溶胞產物中分離。較佳地，藉由該氣泡混合器所引入之經捕捉之氣泡的幫助，使該經沉殿之成分浮起。較佳之具體實施例中，可於沉降槽中施加真空。此步驟可部分麼縮該漂浮之絨毛狀沉澱物，有助於後只之刀離作用以及亦可提高後續步驟中澄清化之細胞溶胞產物之回收率。$协里至於另一優點，此步驟施加真空有助於 /合I產物之除軋’其係之後進行純化步驟前需要之處理。較錢，所施加之真空至少約15英对Hg，更佳為至少約 2〇英忖Hg，最佳為至少約25英叶取。較佳具體實施例中，使該聚液於沉降槽中停留約6至約24小時，較佳為約Η 至18小時。於停留期間亦較佳維持真空狀態。該聚液較佳經過冷卻’使其於停留期間之溫度低於約饥，更佳為約 WC ’ W幫助RNA或其他雜f沉澱。於—具體實施例可於停留_溫和地混合該粗細胞溶胞產物，例輪混合器以低rpm進行攪拌，俾提供混合均勾及冷卻= 體而不會擾亂該絨毛狀沉澱物。熟於此技藝者有能力二 47 1303275 擇適合所欲混合條件之適#的設備與操作參數。 ::捧離本發明之精神下，可對第2圖所述之儀器進 :'飾。例如’第2圖所示之槽可為適合容納所示物質之任何形式之容器。適合的容器之實例包含，但非限於，

:棄式或可重複使用之塑膠袋以及塑膠、不錄鋼、或其他製成之硬式器皿。類似地，雖然以使用幫浦輸送較為方便及適當，如所示，但是亦可採用其他方法，、、二 < 非P艮於以重力、壓力、真空、或任何其他裝置輸送液此外，雖然以「γ」形連接器較適用於使細胞懸浮液 =細胞溶解溶液接觸’但亦可採用可將細胞懸浮液與細胞溶解溶液以適當比例遞送至該高切變、低置之任何方法。例如，不欲限制本發明之範嘴，該細^ 子液與細胞溶解溶液可經由獨立的人口分別饋入該高切變、低-滯留時間混合裝置，再者，雖然較佳係使用壓縮氣體罐將氣泡引人至氣泡混合器，但亦可制能提供氣流且

達成所欲之混合作用之任何方法。此等對所述儀器進行之所有修飾皆包含於本發明之範疇下。第4圖係固體/液體分離作用之圖解。帛2圖所示之沉降槽2U相當於第4圖中之槽⑽且係用於容納帶有漂浮之經沉澱之細胞成分之粗細胞溶胞產物溶液。如上述，當使用時係利用真空幫浦（第4圖中之術)施加真空。進行: 體/液體分離作用之前，應小心地釋放對槽所施加之任何真空。然後利用幫浦（第4圖中之4〇3)自豸槽中收集液體的細胞溶胞產物。此時’該液體中包括澄清之溶胞產物，其實 48 1303275 質上不含細胞殘骸以及巨微粒子固體物質。本發明之優點在於該澄清化之溶胞產物係分離自該經沉澱之細胞成分且不需藉助離心作用或巨微粒子過濾技術。此等技術需要昂貴的設備，以及於大規模實行時經常不可行且困難。再者，使該經沉澱之細胞成分進行離心或巨微粒子過濾可能造成過量之基因體DNA、内毒素、或其他成分釋放至該澄清化

之溶胞產物中。這些物質於後續步驟中難以自含有所欲之細胞成分之澄清化溶胞產物中分離，尤其於較佳之實例中所欲之細胞成分係質體。本發明可避免此等非所欲之事件。因此本發明有利於使澄清化之細胞溶胞產物自經沉澱之細胞成分中分離。熟於此技藝者應明瞭各種純化技術皆可施用於由上述方法所提供之澄清化溶胞產物或沉澱之細胞成分。可利用此等純化技術來提供實質上純之所欲之細胞成分製備物。所欲之細胞成分可純化自上述經沉澱之細肊成刀，或純化自該澄清化之溶胞產物。所欲之細胞成分

較佳係純化自該澄清化之溶胞產物。所欲之細胞成分較係存在於該澄清化溶胞產物中之質體。較佳之具體實施中’可採用各種純化程序，不論係獨立或組合式，以提實質上經純化之質體。此等純化程序包含，但非限於，. 子交換、疏水性交互作用、大小排除、逆相純化、内毒耗盡、親和性純化、對二氧化石夕、玻璃、或聚合性物質吸附作用、延伸管柱層析、混合模式之層析、置換層析經基鱗灰石純化、撰渥選擇性，儿澱、二水相純化、DNA縮聚㈣純化 '離子對純化、金屬螯合純化、經由硝化纖維 49 1303275 濾、以及超過濾。熟於此技藝者可經一般實驗對經由本發明之方法所製備之澄清溶胞產物施用任何已知之純化技術。較佳之具體實施例中，所欲之細胞成分係存在於該澄清化之溶胞產物中，該澄清化之溶胞產物易於通過一或多個微粒子過濾器以及收集於停留槽中（第4圖中之406)。較佳地，以連續操作自槽4〇1中取出澄清化之溶胞產物以及進行微粒子過濾。或者，可自槽4〇丨中取出澄清化之溶胞產物以及收集於中間容器。然後以獨立操作進行微粒子過濾。較佳地，該沉降槽4〇1配有視窗玻璃，使操作者可觀察液體以及經沉澱之細胞成分的狀況。以肉眼監測物質自槽中汲出之過程，且當該經沉澱之細胞成分進入管線前停止。此可防止後續之微粒子過濾器之阻塞。較佳係連續使用約一至約三個微粒子過濾器，第一過濾器係移除較大之粒子，以及後續之過濾器係相繼移除較小之粒子。如第4 圖所不’較佳係連續使用兩個過濾器。較佳具體實施例中，該第一過濾器（第4圖中之4G4)係初級過濾器（㈣·⑴㈣， :粒子大小之限制為約5至約10微米’較佳為約ι〇微米。㈣^器（第4圖中之傷）較佳係—種膜過濾器，其遽過例如所：0.2微米。然而，熟於此技藝者應明瞭詳細情形 ^ , α 八祖于大小的限制，皆 Τ參至易地改變。再| 孰蔹情況，“再者热於此技藝者可決定不需要過濾的之組人）可’略第4圖所不之過濾器單元。任何過濾器 …包含不需過滤器之情況，經考量後皆包含於本發 50 1303275 明之範疇下。如前述，可對第4圖所示之儀器進行各種修飾。此等修飾包含，但非限於，改變運送液體之方法、改變施加真空之方法、以及改變用於容納所述物質之容器。所有此等修飾可由熟於此技藝者所推知，且包含於本發明之範疇下。第5圖係說明產物純化作用之流程圖，起始物為經澄清化或過濾之溶胞產物然後得到大量經純化之產物。有利地，該程序完全係以膜之分離作用步驟為主，且避免任何管柱層析。因此，該程序具有高生產力、高液體流動速率、花費低廉、可行、以及可輕易及快速進行。欲進行純化之產物可為任何所欲之細胞成分。其較佳為諸如蛋白質或質體等巨分子。更佳為質體。作為純化過程之起始物之溶胞產物可經由任何適當方法加以產生。該溶胞產物較佳係經由本發明提供之方法及儀器製備而得。然而，熟於此技藝者知曉許多製造細胞溶胞產物之方法，且只需一般實驗即可將本發明之純化過程應用至此等溶胞產物。純化作用之第一步，將該溶胞產物施用至離子交換膜。所欲之細胞成可能與膜結合，而雜質則通過該膜或自該膜上沖掉進而使其與所欲之產物分離。此外，該產物可能通過該膜，而雜質則留在膜上。較佳具體實施例中，該產物係與膜結合。此等實例中，最好確定該溶胞產物具有足夠低的離子強度以使所欲之細胞成分與離子交換膜實質上完全結合。若需要，可利用足量的水或其他低離子強度之溶液將高離子強度之溶胞產物稀釋。洗滌去除結合力弱 51 1303275 之雜質後，自該膜洗提出產物。較佳係利用鹽溶液洗滌該膜而得到洗出;夜。該鹽溶液之強度、濃度、或導電度足以克服產物與膜間之結合力。因此可自該洗出液中回收該產物0 純化作用之第二步，視需要將回收自離子交換膜之部刀、，’里純化之產物施用至疏水性交互作用膜。產物可能與膜結合，而雜質則通過該膜或自該膜上沖掉，或者產物可能通過該膜，而雜質則與膜結合。較佳具體實施例中，產物係通過該膜。得自離子交換膜之洗出液可於通過疏水性交 =作用膜之前進行調整。典型地，此等調整涉及加入所需里之所奴之鹽。較佳為硫酸銨，如所需，其添加量為足以與產物或雜質結合之量。此步驟可於某些應用之過程中省略0

然後使自疏水性交互作用膜回收之經純化的產物進行超過濾/濾析，以濃縮該產物，移除過量的鹽類，以及若需要’改變該稀釋液之組成。進行超過濾/濾析之方法為熟於此技藝者所知悉，且已於生物活性分子(例如蛋白質及質體) 于有年以切向流式過渡（Tangential flow filtration) 車乂佳仁批_人法亦為已知。只要符合所需即可採用此等任可方法右而要無菌產物，可使自超過濾/濾析之阻留物中回收之I /辰縮且去鹽之產物進行滅菌過濾。滅菌過遽之方法為熟於此技藝者所知悉，且可選用此等任何方法。所得之物貝中包括實質上經純化之所欲之細胞成分。該產物可適用於各種用it，包含，但非限於，醫藥、獸#、或農業 52 1303275 上之應用。熟於此技藝者應了解本文所提供之純化作用程序可應用於各種所欲之細胞成分，同時仍保留所述之優點。該程序之詳細内容，包含所使用之膜的較佳性質、以及使用時之較佳條件，係根據所欲產物之性質而定。該產物較佳係質體，以及該溶胞產物係由含有質體之細胞所製備的。更佳地，該含有質體之細胞係以鹼、清潔劑、或其組合予以溶解，以及接著以醋酸鉀、醋酸銨、醋酸、或其組合將該鹼性溶胞產物中和及進行沉澱。該溶胞產物最佳係由本發明提供之方法及儀器所製備。雖然任何離子交換膜皆適用，但以陰離子交換膜為佳。更佳為具有四級胺基之強陰離子交換膜。此等膜之實例包含，但非限於，Musta叫tm Q (Pall Corp.5 East Hills, NY) ^ Sartobind® Q (Sartorius, Goettingen，Germany)、以及 InterceptTM Q (Millip〇re，

Billerica，MA)。類似地，該疏水性交互作用膜為主要係利用疏水性交互作用而與所欲之細胞成分或雜質結合之任何膜。下列為自溶胞產物中純化出質體之較佳具體實施例的烊細說明，該溶胞產物係利用本文所提供之方法及儀器予以製備。然不應以此說明限制本發明之範疇，熟於此技藝者可經由一般實驗將所述之純化方法調整至適合所欲之任何細胞成分。此等調整包含，但非限於，選擇不同的膜；因應平衡、載入、洗滌、或洗提膜選擇不同的溶液條件；選擇不同的流速；等。此等選擇之細節主要係由所欲之細胞成分的性質及特性所支配。所有此等具體實施例皆包含 53 1303275 於本發明之範轉下。其中，李父佳係根據本文所提供之方法及儀器將含有質體之細胞溶解，該離子交換膜純化步驟中包括利用㈣、

MuStang™ Q卡式盒進行純化。較佳將該經澄清化、過濾之溶胞產物的導電度以適量之純水稀釋至小於約85mS/公分。更佳地，該導電度係經調整至約8。_85心公分。稀釋用之純水量較佳為該溶胞產物之15倍。㈣平衡/ 洗滌溶液流通該Pall MustangTM Q卡式盒而調整其性質。較佳地，該Q平衡7洗務溶液中包括約0.67M之NaC卜所有溶液亦可包含緩衝劑、螯合劑、或其組合。較佳地，這些溶液含有約10mMTris以及約㈣之叫樹心且pH 約為8。Q平衡/洗蘇溶液較佳係以每小時約⑽⑽之流床體積（BV/hr)通過該卡式盒。然後將經稀釋之溶胞產物沒出至該卡式盒，較佳之流速係小於約WOOBV/hp更佳為約450-700 BV/hr。之後以q平 V十衡/洗滌緩衝液洗滌該經載入之卡式皿’其流速較佳為約18G_35GBV/hr。較佳為持續地洗條該卡式盒直到直'六Φ札】其机出物於260毫微米（Aw。）之吸收值約回復至基值。質體經含有約之NaC1、1()mM之Tris、㈣之Na2EDTA，且阳約為8之溶液洗提。洗提液之流速較佳為14〇_35〇BV/hr，更佳& ΐ6〇·2ι〇Βν~。較佳地，持續地洗提直到洗出液之A26〇約回復至基值。此外，可憑經驗決定洗提之體積。收集洗出液利用疏水性交互作用進行後續之純化。當根據本發明純化質體時，視需要利用疏水性交互作 54 1303275 用膜進一步純化得自該Pall Mustang™ Q卡式盒之洗出液。該膜較佳為任何類型之「親水性」卡式盒（“hydr()philie，， cartridges，HIC)。以HIC平衡/洗滌溶液流通該卡式盒而調整其性質，該溶液中包括濃的硫酸銨。較佳地，該HIC平衡/洗滌溶液中包括約2.4M之硫酸銨、約i〇mM THs以及約ImM之Na2EDTA，且pH約為8。較佳地，HIC平衡/洗滌溶液之導電度約為240-260 mS/公分，更佳為約245_255 mS/公分。得自該離子交換膜之洗出液較佳以約2倍體積之溶液 (包括約4· 1M之硫酸銨）稀釋以調整其性質。所得經稀釋之洗出物的導電度較佳約24〇-26〇 mS/公分，更佳為約 245-255 mS/公分。將經稀釋之洗出液通過經調整之HIC卡式盒’其流速較佳約100_2〇〇BV/hr。收集流出物，接著進行超過濾/濾析。視需要，以水洗滌HIC卡式盒，以及回收該洗條溶液以分析從產物中移除雜質。

將自該疏水性交互作用膜回收之經純化的產物以超過濾/濾析進行濃縮及去鹽。熟於此技藝者可利用已知之方法進行超過濾/濾析。根據公稱分子量分離（nominal m〇lecular weight cut-off，NMWC〇)選擇超過濾/濾析膜，以將所欲之產物保留於阻留物中，同時使低分子量物質（例如鹽類）通過膜而存於濾過物中。熟於此技藝者可根據所欲產物之大小及性質加上一般實驗即可選擇此等膜。較佳具體實施例中’該產物係約n kb之質體，使用Pall 置進行超過濾/濾析，以及所使用之膜係NMWCO為100 kD 55 1303275 之 Pall OmegaΤΜ懸浮師選膜卡匡（suspended screen membrane cassettes)。該質體較佳濃縮至至少約2·5毫克/ 毫升。於最後緩衝液交換步驟中可使用任何緩衝溶液或滅菌水’且將影響產物之最終pH值及導電度。若需要’可進一步使該經濃縮、去鹽之產物進行滅菌過濾。進行此等操作之各種方法皆為熟於此技藝者所知悉。當該產物為質體時，較佳係以具有〇·22微米濾過之PaU AcroPakTM 200過濾器進行滅菌過濾。所得經純化、濃縮、去鹽、滅菌過渡之質體實質上不含諸如蛋白質、基因體 DNA、RNA、以及内毒素等雜質。殘餘的蛋白質，以二金雞納酸（bicinchoninic acid)分析法（Pierce Bi〇techn〇1〇gy，

Rockford，IL)測定後其較佳係低於約1%(重量比），以及更佳係低於或等於約〇.1%。殘餘的内毒素，以鱟的變形細胞溶解物（LAL)檢測，較佳係每毫克之質體低於約1〇〇内毒素單位（EU/耄克）。更佳為該内毒素係低於約5〇eu/毫克，最佳為低於約20 EU/毫克。殘餘的RNA較佳係低於或約重ϊ比，更佳為低於或約1% (經由瓊脂凝膠電泳或疏水性交互1用HPLC測^)。殘餘的基因體職較佳係低於約 5%重ϊ比’ t佳為低於㉟1%(經由壤脂凝膠電泳或細長孔吸潰分析（slot blot)測定）。 & 於一具體實施例中，本發明包括所有本文所述之方法及儀器，如第！圖所示。熟於此技藝者應明瞭可择加減 =、或取代經選擇之步驟或方法而對本發明進行㈣口。所有此等修飾經考量後皆為本發明之一部份。因此，、一，於一具 56 1303275

體實施例中，本發明提供一種溶解細胞之方法，該方法係利用高切變、低滯留-時間混合裝置使細胞懸浮液與細胞溶解溶液混合。另一具體實施例中，本發明提供利用氣泡混合器使細胞懸浮液、細胞溶胞產物、或含有所欲之細胞成分之液體與一或多種其他液體混合之方法。又一具體實施例中’本發明提供利用氣泡混合器使細胞溶胞產物與沉澱溶液混合，同時將氣泡捕捉於該經沉澱之細胞成分中。又另一具體實施例中，本發明提供一種包括氣泡混合器之裝置’該裝置可用於實行上述方&。㈣，本發明提供溶解細胞之方法，包括利用高切變、低滯留_時間混合裝置使細胞懸浮液與細胞溶解溶液混合，接著利用氣泡混合器使細胞溶胞產物與沉澱溶液混合之組纟。另一具體實施例中，

本心明提供-種自液體溶胞產物中分離經沉澱之細胞成分之方法包括利用氣泡混合器使氣泡經捕捉於該經沉殿之細胞成分中，收集該物質於槽中，使經沉澱之細胞成分形成漂浮層，視需要施加真空以壓縮該經沉澱之成分以及去除疮胞產物中之氣體’以及自經沉澱之成分的下方汲出或抽吸出液體溶胞產物而予以回收。再另一具體實施例中，本發明提供一種自細胞溶胞產物中純化所欲之細胞成分之、、括使該4胞產物通過離子交換膜，視需要通過疏 =交互作用冑’進行超過_析程序，以及視需要進行祐過渡程序。本文中之各具體實施例，以及一或多個實例之任何組合，皆#肖白係包含於本發明之範疇下。 ^月之創新揭不係特別參照本文所述之關於質體製 57 1303275 備之步驟。然而，熟於此技藝者應了解且明白與質體製備相關之此等步驟及方法之使用僅提供本文眾多優點及創新揭示中之-個實例。在不悻離本發明之精神及範嘴下，可對所揭示之方法進行各種非-實質性改變、修飾及取代。本文提供下列實施例以說明所揭示之方法及裝置，以及不應理解為以該等實施例限制本發明之範嘴。 [實施例] 實施例1

將含有質體PAV〇124之大腸桿菌發酵培養到高密度以及藉由離心進行回收。將約4.0公斤（濕重）之細胞糊懸浮於再懸浮溶液（包括25 mM之Tris、10 mM之Na2EDTA、pH 8)，使最終體積約為28升。所得之細胞懸浮液之ο%。。為 65.8。以300毫升/分鐘之速率將此細胞懸浮液汲入至「γ」形連接器之一邊。同時，以300毫升/分鐘之速率將含有〇2N NaOH及1%SDS之細胞溶解溶液汲入至「γ」形連接器之另一邊。使離開「γ」形連接器之組合液體立即通過 Silverson Model L4R轉子/定子混合器，其配有標準之乳化篩（Emulsor screen)以及同軸配件（in_line assembly)。該混合器係以轉子速為765 rpm運轉。使離開轉子/定子混合器之液體通過長5〇呎、内徑為 0 · 6 2 5央寸之k留線圈。總流速約600毫升/分鐘，通過該停留線圈所需之時間約5分鐘，其可使細胞完全溶解。離開停留線圈之細胞溶胞產物進入如第3圖所示之氣泡混合器。同時，以600毫升/分鐘之速率獨立地將冷的（約 58 1303275

4 C)中和/沉澱溶液（包括謹之醋酸鉀以及之醋酸按）没入該氣泡混合器卜該溶胞產物及中和/沉澱溶液垂直地流向混合管柱上方且通過接近頂部之“。當該溶液通過混合管柱時’將壓縮空氣以約2slpm之流速經由燒結喷佈器（設計用於提供穩定的細微氣泡氣流）引入該管柱的底部。未經捕捉之空氣係由管柱頂部排出。至於通過管柱之細胞溶胞產物以及中和/沉澱溶液，則係藉由該上升氣泡之擾動：續地進行混合。此可由白色、絨毛狀沉澱物之形成予以證實，該絨毛狀沉澱物中包括鉀SDS、變性之細胞蛋白夤、盈結合之脂質與細胞壁成分、以及相關之基因體 DNA。將離開該氣泡混合器之經中和沉澱之溶胞產物收集於沉降容器内。

此過私係以連續操作模式進行，直到所有細胞懸浮液均經過溶解、中和以及沉澱，且收集於沉降槽中。溶液的總體積包含28升之細胞懸浮液、5升之清洗該再懸浮槽之再懸浮緩衝液、3 3升之細胞溶解溶液、以及5 6升之中和/ 沉殿溶液，因此總體積約122升。收集後’經由沉降槽週邊之視窗玻璃觀察沉降槽中之物質。藉由經捕捉於該固體内之清楚可見之氣泡的幫助，可看見該絨毛狀沉澱物上升至該液體的表面。對沉降槽施加約28英吋（Hg)之真空，造成某些漂浮沉澱物之壓縮以及去除該液體溶胞產物中之氣體。室溫下使該物質停留於該真空沉降槽中約17小時。然後緩慢地釋放真空以免擾亂該經壓縮之沉澱物。小心地自 59 1303275 槽中將含有質體之澄清溶胞產物經由底部乾淨的配件沒出。經由視窗玻璃以肉眼監視槽中液體及沉澱物之高度，且及時停止沒出液體以確保該沉澱物不會離開槽中。回收約1 06升之澄清溶胞產物。使澄清溶胞產物進行$微米之過滤作用’接著為0·2微米之最終過濾。由於過濾器之阻塞，於過濾過程中會損失一部份的溶胞產物。結果，得到約8 0升之經過濾、之溶胞產物。取出少量物質進行質體濃产分析，其餘經過濾之溶胞產物以約14〇升之純水稀釋，準備進一步純化。藉由陰離子交換HPLC測定該經過濾之溶胞產物（於稀釋前）中質體的濃度為約41微克/毫升，質體總量約為3300毫克。實施例2

將知自貫施例1之經過濾、稀釋之溶胞產物進一步以陰離子交換純化。將260毫升底體積之pall MustangTM Q 卡式盒（260 mL bed volume Pall Mustang™ Q cartridge)以 4 升之Q平衡/洗滌溶液平衡，該Q平衡/洗滌溶液中包括 10mM 之 Tris、ImM 之 Na2EDTA、0.67M 之 NaC卜 pH 8。將實施例1製備之220升的物質以約2-3升/分鐘之速率汲出至Q卡式盒。裝載後，使用平衡緩衝液以約1升/分鐘之速率洗;“該卡式盒直到流出物之八2⑼接近基值。以約8〇〇笔升"刀鐘之速率沒出Q洗提緩衝液將質體自卡式盒中洗出，該洗提緩衝液中包括1 〇mM之Tris、1 mM之Na2EDTA、 1M之NaCl、pH 8。使用線圖紀錄器（价心―心虞测及、、己錄卡式盒之洗出物於毫微米之吸收值。當 1303275 回復至基值時結束洗提。總洗提體積約7.0升以及根據A260 之值總共含有約3900毫克之DNA(假設於1公分路徑長之管中，1毫克/毫升溶液之DNA其A260為1)。進一步將Q洗出液經由疏水性交互作用純化。藉由添加13.9升之4.1M硫酸銨將洗出液之導電度調整至約250 mS/公分。將60毫升底體積之HI C卡式盒（60 mL bed volume HIC cartridge)以約1 ·3升之2.4M硫酸銨平衡，其沒出速率為400毫升/分鐘。然後將經調整之Q洗出液以約200毫升 /分鐘之速率没出通過該HIC卡式盒。經由A26G之測定，該流出物含有約3800毫克之DNA。將部分HIC之流出物質，約2700毫克之DNA，經由超過濾/濾析（UF/DF)進行濃縮及去鹽，其係使用Pall CentramateTM卡匣支架配有四個Pall OmegaTM懸浮篩選膜卡匣，每卡匣之面積為1平方英呎以及其過濾之分子量為 100 kD °回收826毫升之大阻留物，DNA濃度為2.6毫克/ 毫升（由A260測定）。以注射用水（water for injection，WFI) 清洗UF/DF儀器一次，得291毫升，濃度為1.6毫克/毫升之液體。將UF/DF後回收之DNA合併共約2600毫克。將部分之UF/DF物質，約23 00毫克之DNA，通過Pall AcroPak™ 200，0.22微米過濾器進行滅菌過濾。總共回收約893毫升之終產物，DNA濃度為2.5毫克/毫升，共2200 毫克。對終產物進行一系列純度及品質之試驗。殘餘蛋白質之量，以二金雞納酸分析法（BCA)測定，係$0.1%。殘餘 61 1303275 的RNA以&水性交互作用HpLC測定，係以。殘餘的基因體DNA，以瓊脂凝膠電泳測S，係約0.2%。内毒素之量’以鱟的變形細胞溶解物測^，係5Eu/毫克。此等數值較優於先Μ揭示之方法所提供之數值，且指出經由本文揭示之方法所製備之質體可適用於各種用途，包含，但非限於，人或獸醫方面之基因治療、非病毒質體中介療法、以及DNA疫苗之應用。實施例3

將3有質體pAVO 124之大腸桿菌發酵培養到高密度以及藉由離心進行回收。將、約3 8公斤（濕幻之細胞糊懸浮於 1.6升之再4浮;谷液，其〇〇6❶❶為79.4。如實施例1所述，進行細胞溶解、中和/沉澱、以及收集於沉_中。細胞懸浮液與細胞溶解溶液之流速為3〇〇毫升/分鐘，以及中和/ 沉澱溶液之流速為_毫升/分鐘。如前述安裝之川糟則 L4R，其係以轉子速為747rpm運轉。在細胞溶解與中和/ 沉殿作賴’通過該停留線圈所需之時間約5分鐘。屢縮空氣Μ 2 Slpm^速由氣泡混合器引人。總液體體積包含26.6升之細胞懸浮液、5升之清洗該再懸浮槽之再懸浮緩衝液、31.6升之細胞溶解溶液、以及53 2升之中和/沉澱溶液’因此總體積約11 6 · 4升。施加26英时fjg之真約1 8 · 3小時。回收粗 85升之澄清溶胞產質體》農度分析（如下當所有材料收集於沉降槽中時，空，以及將槽冷卻且於2-8 〇c下維持溶胞產物且如前述程序進行過濾，得物。取出少量經過濾之溶胞產物進行 62 1303275 述）以及其餘之溶胞產物以丨35升之純水稀釋，總共得22〇升之澄清化、經過濾、稀釋之溶胞產物。 HPLC分析指出，未稀釋之經過濾之溶胞產物中的質體濃度係約37微克/毫升，因此質體總共約31〇〇毫克。為了進行比較，使用相同之再懸浮、細胞溶解、以及中和/沉澱溶液將少量之相同細胞糊以實驗室規模進行溶解，俾與大規模之細胞溶解相比。所有步驟中皆採用溫和手動之混合方式。以手動混合之溶胞產物中之質體濃度經測量為42微克/毫升，與大規模之溶胞產物中的質體濃度相當。此證實大規模之細胞溶解程序可有效使細胞釋放質體。再者，將這些結果與實施例丨所得之結果相比，證實本發明之再現性以及穩定性。實施例4 進一步將實施例3之澄清化、經過濾、稀釋之溶胞產物利用PallMustangTMQ陰離子交換膜層析進行純化。於消毒及再生後，將260毫升底體積之卡式盒以4升之（^平衡/洗滌溶液平衡，如實施例2 ^實施例3製備之22〇升的物質以2升/分鐘之流速汲出至Q卡式盒。取4升之q平衡 /洗滌溶液以1.2升/分鐘之流速洗滌該卡式盒。然後以6〇〇毫升/分鐘之流速汲出Q洗提溶液將質體自卡式盒中洗提出。利用線圖紀錄器監測及紀錄洗出液於26〇毫微米之吸收值，以及當Aw。回復至基值時終止洗提作用。洗出液之總體積為4.0升，其巾DNA濃度為〇89毫克/毫升（得自八26〇)。總共回收約3600毫克之DNA。 63 1303275 利用超過濾/濾析將該Q洗出液濃縮及去鹽，其係使用 Pall CentramateTM卡匣支架配有四個paU 〇削以糧懸浮篩選膜卡匣，母卡匣之面積為1平方英吸以及其過濾、之分子量為100 kD。回收679.3毫升之大阻留物，DNA濃度為4a 毫克/毫升（得自Am。）。將該UF/DF裝置以WFI洗滌兩次。第一次洗滌得187.8毫升，濃度為17毫克/毫升之液體。第二次洗滌得257.7毫升，濃度為〇·55毫克/毫升之液體。將大阻留物與第一及二次洗滌所得之液體合併，並額外添加179.9毫升之WFI。所得之終產物為1275·5毫升，濃度為2.5毫克/毫升，最後回收32〇〇毫克之質體。終產物之純度分析指出殘餘的蛋白質$〇1%，以及殘餘的基因體DNA約0.1%，相當於實施例2所得之值。rna 及内毒素之量較先前實施例所得者高，分別為6%及142 EU/毫克。此結果證實若可接受較高量之rna及内毒素，則可省略HIC步驟。其進一步證實，為了嚴謹的應用，HIC 步驟對移除殘餘的RNA及内毒素特別有效。實施例5 將自上述實施例得到之樣品進行瓊脂凝膠電泳分析，以進一步確認產物之品質以及相關雜質之量。於瓊脂凝膠上載入過量的質體。該凝膠係設計用於檢測大量質體產物中微量的核酸雜質。於終產物樣品中污染物基因體dn A及 A之位置係非常微弱的寬帶（band)。以肉眼估計此凝膠上雜質所佔之百分比係與利用其他方法定量所得之值一致。 64 1303275 亦於恆量凝膠（constant mass gel)之各欄（lane)中載入合理一致量之超螺旋質體。該凝膠係用於在經萃取之產物的量與質量方面，比較本發明之細胞溶解技術與典型的手動細胞溶解方法。其他攔顯示於該方法中之不同步驟了雜質的移除狀況，以及超螺旋形式增強的情形。由激烈手動操作之細胞溶解法所製備之樣品顯示其中含有大量之污染物基因體DNA以及RNA。比較含有經過濾之溶胞產物之樣品與經由溫和手動細胞溶解法所製備之含有質體之樣品中的雜質含量。顯示進一步經過離子交換層析之含有質體之樣品中的雜質較少，如含有大量藥物之樣品者。此兩組皆證實該方法之一致性。本文提供之具體實施例係用於說明從細胞分離質體 DNA之儀器及方法。熟於此技藝者應了解本發明極適用於達成本發明之目標且得到結果以及本文所述與固有之優點。本文所述之整個儀器、氣泡混合器_反應室、方法、程序以及技術係代表較佳之具體實施例且係作為本發明之 4而非用於限制本發明之範疇。熟於此技藝者可對本發明之内容加以變化以及將其應用於其他方面，此等皆包： ;本發月之精神中或申請專利範圍之界定範疇下。 [圖式簡單說明] 第1圖係本文所述用於分離所欲之細胞成分（例如質體）之步驟流程圖的摘要 ώ 铜要由培養細胞開始至得到大量經純化 t產物。第2圖係本文中用 > ;進仃連續性細胞溶解及中和/沉殺 65 1303275 作用之儀器的圖解。第3圖係本文所揭示之氣泡混合器之圖解。第4圖係固體/液體分離作用之圖解。第5圖係產物純化作用、濃縮/去鹽、以及滅菌過濾之流程圖。 [元件符號] 201 槽 202 槽 203 幫浦 204 「Y」形連接器 205 高切變、低滯留-時間混合器 206 停留線圈 207 氣泡混合器 208 槽 209 幫浦 210 槽 211 沉降槽 301 第一入口 302 第二入口 303 燒結喷佈器 304 出π 305 換氣裝置 3 06 第三入口 401 槽 402 真空幫浦 403 幫浦 404 第一過渡器 405 第二過濾器 406 停留槽 66

Claims

：1303275 公告本. 年 w〜一幼___________ 飞· ——•月日修(更)正本 (2008年7月修正) 拾、申請專利範圍： ™ 1 · 一種以高切變、低滯留-時間混合裝置將細胞溶解之方法，包括：提供含有細胞懸浮液之液體；提供細胞溶解溶液；以及使細胞溶解溶液與含有細胞懸浮液之液體流經該高切變、低滯留-時間混合裝置，其中該滯留-時間小於或等於一秒，其足以使該細胞與細胞溶解溶液接觸而提供細胞溶解作用’因而產生細胞溶胞產物。 2.如申請專利範圍第i項之方法，其中該細胞包含質體。 3_如申请專利範圍第丨項之方法，其中該細胞溶解溶液包括選自由鹼、酸、清潔劑、有機溶劑、酵素、干擾劑 (chaotropes)、變性劑、及其混合物所組成群之細胞溶解劑。 4·如申请專利範圍帛1項之方法，其中該細胞溶解溶液包括鹼、清潔劑、或其組合物。 5·如申請專利範圍帛i項之方法，其中該高切變、低滞留_ 夺門此0 #置係同轴轉子/定子混合器⑻的 mixer) 〇 6 ·如申請專利範圍第 67 1 項之方法，其中該細胞含有質體， Ϊ303275 (2008年7月修正) 该細胞溶解溶液包括鹼、清潔劑、或其組合物，以及該高切後：、低滯留-時間混合裝置係同軸轉子/定子混合器。 7·一種製備含有所欲之細胞成分之澄清細胞溶胞產物之方法，包括：使細胞懸浮液與細胞溶解溶液流經高切變、低滯留-時間混合裝置’以產生經混合之細胞懸浮液與細胞溶解溶液，其中該滞留-時間係小於或等於一秒；將經混合之細胞懸浮液與細胞溶解溶液經由停留線圈輸送至氣泡混合器，其中該輸送係以既定時間進行，而該既定時間足以使細胞實質上完全溶解而不會使所欲之細胞成分永久變性，以產生細胞溶胞產物溶液；使細胞溶胞產物溶液與中和/沉澱溶液流入該氣泡混合裝置，其中氣泡係以足以造成細胞溶胞產物溶液與中和/沉殿溶液實質上混合之速率引嘉疋千Ή八，以屋生合有沉澱之細胞成分之經沉殿之溶胞產物溶液；使該經沉澱之溶胞產物溶液停留一段時間，該時間足以使大部分之經沉澱之細胞成分形成漂浮層丨以及經由將澄清細胞溶胞產物之液體排出或以而將沉殿之細胞成分去除’以回收含有所欲之細胞成分之澄清細胞溶胞產物。 8·如申請專利範圍第7項之方法，苴φ 只 < 乃凌，其中该鬲切變、低滯留時間混合裝置係同軸轉子/定子混合器。 68 Ϊ303275 (2008年7月修正) 9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該氣泡混合裝置包含·· 混合反應室；第一入口，經由此入口將第一液體引入混合反應室中；一或多個其他入口，經由此等入口將其他液體引入混合反應室中；將氣泡引入混合反應室之工具，其中該氣泡係以足以使第一液體與其他液體產生實質上混合之速率引入混合反應室；以及出口，當第一液體與其他液體實質上混合後經由此出口離開混合反應室，其中該第一液體包括懸浮之細胞、經溶解之細胞、或細胞成分，而其他液體包括細胞溶解溶液、中和溶液、沉澱溶液、或其組合。 10. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該細胞懸浮液包含含有質體之細胞。 11 ·如申請專利範圍第7項之方法，其中該細胞溶解溶液包括選自由驗、酸、清潔劑、有機溶劑、酵素、干擾劑、變性劑、及其混合物所組成群之細胞溶解劑。 12.如申請專利範圍第7項之方法，該中和/沉澱溶液包括醋酸钟、醋酸銨、醋酸、或其組合物。 Ϊ303275 (200δ年7月修正) 如申請專利範圍第7項之方法，復包括純化該澄清細胞溶胞產物之步驟以回收所欲之細胞成分。 14.如申請專利範圍第13項之方法#中純化該澄清細胞溶胞產物之步驟包括使該澄清細胞溶胞產物進行一或多個選自由離:交換、疏水性交互作用、大小排除法、逆相純化法、内毒素耗盡、親和性純化法、對二氧化石夕、玻璃、或聚合性物質之吸附作用、延伸管柱層析法、混合模式之層析法、置換層析法、羥基磷灰石純化法、選擇性沉澱、二水相純化法、DNA縮聚、親硫純化法、離子對純化法、金屬螯合純化法、經由确化纖維過渡、以及超過渡所組成群之純化步驟。 15^申請專利範圍第14項之方法，丨中該純化步驟係離子交換以及其中該離子交換係陰離子交換。 16.如申請專利範圍第15項之方法，其中該陰離子交換係使用膜。 Η.如申請專利範圍第13項之方法，其中純化該澄清細胞溶胞產物包括：使該澄清細胞溶胞產物通過離子交換膜；以及使該澄清細胞溶胞產物通過疏水性交互作用膜。 1303275 (2008年7月修正) 18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中所欲之細胞成分係質體。 19. 一種製備含有所欲之細胞成分之澄清細胞溶胞產物之方法，包括：使細胞懸浮液與細胞溶解溶液流經高切變、低滯留-時間混合裝置，以產生經混合之細胞懸浮液與細胞溶解溶液，其中該滯留-時間係小於或等於一秒；將經混合之細胞懸浮液與細胞溶解溶液經由停留線圈輸送至氣泡混合器，其中該輸送係以既定時間進行，而該既定時間足以使細胞實質上完全溶解而不會使所欲之細胞成分永久變性，以產生細胞溶胞產物溶液；使細胞溶胞產物溶液與中和/沉澱溶液流入該氣泡混合裝置，其中氣泡係以足以造成細胞溶胞產物溶液與中和/沉澱溶液實質上混合之速率引入，以產生含有沉澱之細胞成分之經沉澱之溶胞產物溶液；使該經沉澱之溶胞產物溶液停留一段時間，該時間足以使大部分之經沉澱之細胞成分形成漂浮層；對該經沉澱之溶胞產物溶液施加真空以產生經沉澱之細胞成分與澄清細胞溶胞產物之混合物；以及經由將澄清細胞溶胞產物之液體排出或汲出而將沉澱之細胞成分去除，以回收含有所欲之細胞成分之澄清細胞溶胞產物。 < S ) 71 .1303275 (2008年7月修正) 20.如申請專利範圍第19項之方法，其中該高切變、低滯留-時間混合裝置係同軸轉子/定子混合器。 21·如申請專利範圍第19項之方法，其中該氣泡混合裝置係申請專利範圍第9項所述之氣泡混合裝置。 22·如申請專利範圍第19項之方法，其中該細胞懸浮液包含含有質體之細胞。 23 ·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中該細胞溶解溶液包括選自由鹼、酸、清潔劑、有機溶劑、酵素、干擾劑、變性劑、及其混合物所組成群之細胞溶解劑。 24·如申凊專利範圍第19項之方法，該中和/沉澱溶液包括醋酸鉀、醋酸銨、醋酸、或其組合物。 25.^申請專利範圍第19項之方法，復包括純化該澄清細胞溶胞產物之步驟以回收所欲之細胞成分。 …請專利範圍第19項之方法，其中純化該澄清細胞洛胞產物之步驟包括使該澄清細胞溶胞產物遝6 士雜工一从吧订或多個父換、疏水性交互作用、大小排除法、逆相· 化法、内毒素耗盡、親和性純化法、對二氧化矽、破螭、: 1303275 (2008年7月修正)

或聚合性物質」層析法、置換> 二水相純化法金屬螯合純化;；群之純化步驟。其中該純化步驟係離 27·如申凊專利範圍第26項之方法子父換以及其中該離子交換係陰離子交換。 28·如申請專利範圍第27項之方法，其中該陰離子交換係使用膜。 29.如申請專利範圍第25項之方法，其中純化該澄清細胞溶胞產物包括：使該澄清細胞溶胞產物通過離子交換膜；以及使該澄清細胞溶胞產物通過疏水性交互作用膜。 3 0.如申請專利範圍第25項之方法，其中所欲之細胞成分係質體DNA 〇 3 1. —種可將所欲之細胞成分自細胞中分離之儀器，包括： (a) 第一槽，其係與混合器相連’其中該第一槽係用於存放含有所欲之細胞成分之細胞懸浮液； (b) 第二槽，其係與混合器相連’其中該第二槽係用於存 1303275 (2008年7月修正) · 放細胞溶解溶液； (d) 停留線圈，其係與混合器相連；以及 (e) 氣泡_混合器反應室’其具有頂部及底部且具有： ⑴第一入口，其係與停留線圈相連； (u)第二入口，其係與第三槽相連，其中該第三槽係用於存放沉澱溶液、中和溶液、或其混合物· (iii) 第三入口，其係與氣體源頭相連， (iv) 排氣口；以及 (V)出口，其係與第四槽相連，其中該第四槽係用於自鲁液體細胞溶胞產物中分離經沉澱之細胞成分；其中，該混合器係高-切變、低-滯留_時間混合裝置，其中該滯留-時間係小於或等於一秒；使第—槽中具有質體DNA之細胞懸浮液流入該混合器；使第二槽中之細胞溶解溶液流入該混合器；使混合器中之溶胞產物_混合物流入停留線圈；使停留線圈中之溶胞產物-混合物流入氣泡_混合器反應室；使第三槽中之沉澱溶液、中和溶液、或其混合物流入氣泡-混合器反應室；以及使含有所欲之細胞成分之懸浮液自氣泡-混合器反應室流入第四槽。 32·如申請專利範圍第31項之儀器，s包括；第一幫浦，其係用於將含有所欲之細胞成分之細胞懸浮液自第一槽輸至b a器弟—幫、浦，其係用於將細胞溶解溶液自第二槽輸送至混合器；第三幫浦，其係用於將沉殺溶液、中和 74 < S ) 1303275 汾、、（2008年7月修正) 、或其混合物自第三槽輸送至氣泡.混合器反應室。二二申凊專利範圍第32項之儀器，其中該第-幫浦與第縣、係組合成雙頭幫浦，使含有所欲之細胞成分之細胞 ^予液與細胞溶解溶液可同時以Q 線流及出至混合器。

复申°月專利辄圍第32項之儀器，復包括；Y-形連接器 ::有第-雙叉式分支、第二雙又式分支以及出口分支 °亥第-槽係經由第-幫浦肖Y，連接器之第一雙叉刀支相連，忒第二槽係經由第二幫浦與γ_形連接器之第雙又式分支相連；以及該混合器係與¥_形連接器之出口支相連，其中該第一及第二幫浦可使該相接觸之液體以 0.2-2呎/秒之線流流速離開γ_形連接器。 35·如申請專利範圍第31項之儀器，其中重力、壓力、真空或其混合條件，係用於：將含有所欲之細胞成分之細胞懸浮液自第一槽輸送至古亥混合器； ^ 將細胞/谷解溶液自第二槽輸送至該混合器，·以及將沉澱溶液、中和溶液、或其混合物自第三槽輸送至兮氣泡-混合器反應室。 36·如申請專利範圍第31項之儀器，其中該氣泡_混合器反 75 1303275 (2008年7月修正) 應室包括：密閉式垂直管柱，該管桎之頂部具有排氣口；進入該氣泡-混合斋反應至之第一入口，其係位於密閉式垂直管柱之第一邊上且接近管柱底部之處；進入該氣泡-混合器反應室之第二入口，其係位於第二邊接近底部之處且為第一入口之對側；進入該氣泡-混合器反應室之第三入口，其係位於接近底部之處且位於第一入口與第二入口之中間；以及離開該氣泡混合反應室之出口，其接近密閉式垂直管柱之頂部。 3 7·如申請專利範圍第36項之儀器，其中該第三入口復包括位於密閉式垂直管柱内之燒結喷佈器。 3 8·如申請專利範圍第3 1項之儀器，其中該混合器包括一裝置，該裝置係以流動模式進行混合並具有轉子/定子混合器或乳化器（emulsiHer)，且其線流流速為自〇·丨升/分鐘至 2 〇升/分鐘。 3 9 ·如申請專利範圍第3 1項之儀器’其中，於固定線流流速下，該溶胞產物·混合物進入該氣泡-混合器反應室前，該停留線圈管線之長度及直徑足以使該溶胞產物_混合物在離開該混合器後於停留線圈中具有2至8分鐘之接觸時間。 76 1303275 (2008年7月修正) 4〇·如申請專利範圍第3 1項之儀器，其中該第四槽復包括葉輪展合器（impeller mixer)其足以提供混合均勻之液體而不擾亂絨毛狀沉澱物。 4 I如申請專利範圍第31項之儀器，復包括與第四槽相連之真空幫浦。 42·如申請專利範圍第31項之儀器，復包括：第三幫浦，其係與第四槽相連；第一過濾器，其係與第三幫浦相連；第二過濾器，其係與第一過濾器相連；以及第五槽，其係用於存放澄清溶胞產物。 43·如申請專利範圍第42項之儀器，其中該第一過濾器之粒子大小限制為5_丨〇微米以及第二過濾器之濾過限制為 0.2微米。 44·如申請專利範圍第31項之儀器，其中所欲之細胞成分包括質體DNA。 45 · —種自細胞中分離.質體DNA之方法，包括： (a)於高-切變、低-滯留-時間-渑合_裝置中將含有質體 DNA之細胞懸浮液與細胞溶解溶液混合一段第一時間，以 1303275 (2008年7月修正) 形成細胞溶胞產物液體； (b) 於停留線圈中培養該細胞溶胞產物液體一段第二時間，以形成細胞溶胞產物懸浮液； (c) 將細胞溶胞產物懸浮液遞送至反應室； (d) 將沉澱液體、中和溶液、或其組合物遞送至反應室； (e) 於反應室中利用氣泡將細胞溶胞產物懸浮液與該沉澱溶液:中和溶液、或其組合物進行混合，以形成經氣泡^ 合之懸淨液，其中該經氣泡混合之懸浮液包括未澄清化之洛胞產物以及沉澱物且該未澄清化之溶胞產物中含有質體 DNA，❿該細胞碎片係存在於沉殿物中，i其中該沉殿物之密度小於該未澄清化之溶胞產物； (0使該沉澱物漂浮於未澄清化之溶胞產物的頂部； (g) 自該沉澱物移出該未澄清化之溶胞產物，形成澄清溶胞產物，因而實質上使質體DNA與細胞碎片分離； (h) 自澄清溶胞產物中沉澱質體DNA，形成沉澱之質體 ;以及 ω將該沉澱之質體DNA再懸浮於水溶液中；其中該第日守間係等於或小於1秒；以及該第二時間係2至8分鐘之範圍。 46.如申請專利範圍第45項之方法，復包括：將該澄清溶胞產物以過濾器過濾，其中該過濾器之粒子大 > 限制為0.2微米至丄〇微米之範圍。 78 13〇3275 (2008年7月修正) 47.如申請專利範圍第45項之方法復包括·· 以一或多個純化步驟純化該澄清溶胞產物，該純化步驟 ^選自由離子交換、疏水性交互作用、大小排除法、逆相砘化法、内毒素耗盡、親和性純化法、對二氧化矽、玻璃、或聚合性物質之吸附作用、延伸管柱層析法、混合模式之層析法、置換層析法、隸磷灰石純化法、選擇性沉殿、 X相、、、屯化法、DNA縮聚、親硫純化法、離子對純化法、金屬螯合純化法、經由硝化纖維過濾、以及超過濾所組群者。十如申明專利車巳圍帛45項之方法，其中該細胞溶解溶液復包括選自由鹼、酸、清潔劑、有機溶劑、酵素、干擾劑、及變性劑所組成群之細胞溶解劑。 49·如申請專利範圍和溶液係醋酸鉀、第45項之方法，其中該沉澱溶液或酉皆酸銨、或其混合物之溶液。中其中該氣泡係壓縮空 5〇·如申請專利範圍第45項之方法氣或惰性氣體。 5 I如申請專利範第一入口接口第一入口接口圍第45項之方法，其中該反應室包括： ’用於分配第一液體進入該反應室； ’用於分配第二液體進入該反應室；以及 79 1303275 (2008年7月修正) 第三入口接口，用於分配混合氣體進入該反應室；排氣口；以及出口接口，用於分配經氣體混合之懸浮液離開反應室。 52. 如申請專利範園第51項之方法，其中該反應室包括：密閉式垂直管枉，接近該管柱之頂部具有排氣口；進入該反應室之第一入口接口，其係位於密閉式垂直管柱之第一邊上且接近管柱底部之處；進入該反應室之第二入口接口，其係位於第二邊接近底部之處且為第一入口接口之對侧；進入該反應室之第三入口，其係位於接近底部之處且位於第一入口接口與第二入口接口之中間；以及離開反應室之出口接口，其接近密閉式垂直管柱之頂部。 53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該第三入口接口復包括位於密閉式垂直管柱内之燒結喷佈器。 54. 如申請專利範圍第49項之方法，其中大於90%重量比之細胞碎片係存在於沉澱物中。 55·如申請專利範圍第49項之方法，其中大於99%重量比之細胞碎片係存在於沉澱物中。