1262947 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種病毒之檢驗技術，詳言之，係有關一 種以即時聚合酶連鎖反應定量病毒之檢驗技術。 【先前技術】 台灣地區是B型肝炎病毒的高盛行區，於4〇歲以上的台灣 健康人口中’ B型肝炎病毒的感染率將近有15至20%，目前 約有三百萬人為B型肝炎帶原者，佔國人十大死亡原因首位 之肝細胞癌及第六位之慢性肝炎及肝硬化，皆與B型肝炎病 毋感染相關。B型肝炎病毒會在宿主的肝細胞内複製，並釋 出表面抗原（HBsAg)、e抗原（HBeAg)以及含有DNA的完整 病毒顆粒到血液中。 現今臨床上B型肝炎帶原者之診斷是藉鑑定血清HBsAg 是否呈陽性反應而決定；如為慢性持續的感染，通常血清 DNA或HBeAg亦呈陽性反應；如在緩解的階段，則血清DNA 或HBeAg則呈陰性反應，此種血清學的變化會同時伴隨著 肝組織以及肝功能的改善；再者，可藉由偵測血清中是否 有B型肝炎病毒的DNA，以評估病毒是否處於活躍的複製 期，然而於肝炎的治療過程令，因為肝炎患者並無明顯的 臨床症狀，亦必須依賴人體血液中肝炎病毒濃度之偵測， 做為臨床診斷的依據。 綜上所述’偵測血中病毒濃度於診型肝炎或追蹤抗病 毒藥物之效果而言，乃十分重要。 目前’B型肝炎病毒量的測定方法，包括各研究單位自創 96645.doc 1262947 的競爭性核酸聚合酶連鎖反應及即時偵測聚合酶連鎖反 應’與商品化的Amplicormonitor(R〇cheTM Diagnostics，巴 賽爾’瑞士）、Branched-chain DNA(Bayer™ Diagnostics， 艾莫利威爾，美國）及NASBA (〇rganon TeknikaTM，博克斯 特爾，荷蘭）等方法。然而上述商品具有下述缺點··（丨）操作 耗時，步驟繁瑣；（2)檢測之線性範圍不佳；（3)無樣品内部 品管。 職是之故，發展一操作容易、靈敏度高、可靠性高之b 型肝炎檢測技術乃為業界所需。 【發明内容】 發明概述 本發明之一目的在於提供-種用於定量B型肝炎病毒之 引子，其可放大B型肝炎病毒DNA，該引子係選自由下列引 子及其變異體所組成之群:具有如序列辨識編號嘀示序列 之一上游引子、具有如序列辨識編號3所示序列之—上游引 子、具有如序列辨識編號4所示序列之-上游引子、具有如 序列辨識編號2所示序列之一 /、 心„ , J之下游引子、具有如序列辨識編 唬5所不序列之一下游引早 子及具有如序列辨識編號ό所示序 列之一下游引子。 本發明之另一目的在於裎极 隹於k仏一種用於定量β型肝炎病毒 之套組，其包含如上述之引子。 本發明之又一目的扃於植 在於如I、一種定量Β型肝炎病毒方 法，其係使用上述引子推广 子進仃即時聚合酶連鎖反應。 發明詳細說明 96645.doc 1262947 本發明係關於一種用於定量B型肝炎病毒之引子，其可應 用於各式即時聚合酶連鎖反應，並藉以定量b型肝炎病毒。 根據本發明之引子可放大B型肝炎病毒圓八，該引子丙:選 自由下列引子及其變異體所組成之群：具有如序列辨識編 號1所：序列之-上游引子、具有如序列辨識編號3所示序 列之一上游引子、具有如序列辨識編號4所示序列之一上游 引子、具有如序列辨識編號2所示序列之一下游引子、具有 如序列辨識編號5所示序列之一下游引子及具有如序列辨 識編號6所示序列之一下游引子。較佳地，根據本發明之引 子係形成下列引子對： (a) 具有如序列辨識編號1所示序列之一上游引子及具 有如序列辨識編號2所示序列之一下游引子· (b) 具有如序列辨識編號3所示序列之一上游引子及具 有如序列辨識編號5所示序列之一下游引子；及 (c) 具有如序列辨識編號4所示序列之一上游引子及具 有如序列辨識編號6所示序列之一下游引子。 本文中所言之「聚合酶連鎖反應」包含四個步驟··（1)使 1模板進行變性’以形成兩單股；⑺使兩引子分別與步驟 (1)之兩股進行黏附（annealing) ; (3)以DNA聚合酶延伸該等 引子，及（4)取得兩雙股之DNA。重複上述之諸等步驟，而 :特定之DNA片段即可獲得擴增。「即時聚合酶連鎖反應」 二為利用螢光偵測。「聚合酶連鎖反應」之發生以進行定 人並可彳欠而推知參與反應之模板量。目前發展之即時聚 口酶連鎖反應是在一個封閉式的反應管中，除了聚合酶連 96645.doc 1262947 鎖反應所而的引子與驗基外，—併將螢光訊號加人反應管 中再配&儀為逐週期摘測，便可達到同時擴增且同 時傾測訊號之功能。故即時聚合酶連鎖反應具有擴增完成 可直接定量及不需後處理之優點，不僅省時省力，更可避 免後處理所&成之，亏染。同時亦因逐週期紀錄的η·榮光 訊號，同時描繪出基因複製時之完整圖形，故具有較好之 靈敏度與再現性。本發明之試劑濃度線性範圍可達⑻至1〇8 複本數，為現行方法中最大者。 變異體」乙詞係指可取代本發明引子 而仍可放大同一特定片段序列之引子 中 本文中所言之「 之募核芽酸分子， 溫度越低；反言之，如引子與欲放大之模板間之序列變異 因聚合酶連鎖反應本身之特性，引子與欲放大之模板間之 序列即便存在變異性，仍可藉調節聚合_鎖反應中黏附 步驟之反應溫度而合成特定之DNA片段。舉例言之，如引 子與欲放大之模板間之序列變異性越大，黏附步驟之反應 性越小，則可提高黏附步驟之反應溫度。故於該特定領域 中八般知識之人士根據本發明之揭示，即可根據欲增幅 放大之DNA片段設計不同之引子，任何針對本發明引子之 鹼基置換、加入或縮減，如其仍可與本發明引子放大特定 片段之引子皆為本發明所欲保護之範圍。 根據本發明之引子可應用於纟式即時聚合酶連鎖反應 中，舉例言之，可使用於DNA結合螢光基（DNA-binding flU〇r〇Ph〇reS)、鄰近線性募探針（adjacent linear 〇lig〇pr〇bes)、 5核酸酶寡探針nuclease 〇lig〇pr〇bes)、髮夾式募探針 96645.doc 1262947 (hairpin oligoprobes)及自我螢光擴增子（self-fluorescing amplicons)等系統。 本發明另提供一定量B型肝炎病毒之套組，其包含上述之 引子或引子對。 於本發明之一具體貫施例中’係使用TaqMan®即時聚合 酶連鎖反應系統。該系統係藉著一目標探針以定量聚合酶 連鎖反應產物。該目標探針於5,及3,端各分別具有作為報導 劑及泮滅劑之兩螢光基。該螢光基為報導蛋白質之螢光部 分’通常使用之螢光基為FAM。如目標探針未與模板雜合 時，其位於3’端之淬滅劑螢光基（通常為一長波長顏色，如 紅色）藉著螢光共振能量轉移（Fluorescence Res()nanee Energy Transfer，FRET)而減小5’端之報導劑螢光基（通常為 一短波長顏色，如綠色）之螢光。如目標探針於模板變性而 黏附至單股模板上時’叫聚合酶可一面依模板之序列加上 核苦酸’ -邊自5,端移除目標探針，因而使3ι端之泮滅劑榮 光基與5’端之報導劑分離，而使報導劑可發散其螢光能量， 如聚合酶連鎖反應發生之次數愈多，則有愈多之報導劑螢 光發散，故藉著量測報導劑螢光之量，即可定量聚合酶連 鎖反應之產物。故根據本發明之套組，另包含_目標探針， 該目標探針係可與根據本發明之引子或引子對所^大之B 型肝炎病毒亀片段雜合，且其5，及3，端分別具有_第一報 導劑及一第一泮滅劑。於本發明中所使用之第-報導劑盥 弟-泮滅劑可為習用之螢光基，如使_ 劑。較佳地，當使用⑷引子對時，該目標探針具有如序^ 96645.doc 1262947 辨識編號7或其互補股所示之序列。 =認量測所得之訊號係為反應真實之實驗條件或是操 :乍：差，根據本發明之套組另包含一内部控制機制，其包 二内部控制質體，其具有一插入片段，該插入片段包含 ::與B型肝炎DNA或與人類基因體序列皆無相似性片段 ，由根據本發明之引子或引子對所放大之_肝炎病 毋DNA片段；及一内部控制探針，可與該内部控制質體之 =段雜合，其5,及3,端分別具有一第二報導劑及一第二 =;且該第二報導劑與該第-報導劑不同。於操作時 控制質體與㈣控制探針之即時聚合酶連鎖反應與 樣°°及目標探針同時操作，以便於觀察。於本發明中所使 用之苐一報導劑與第二淬滅劑可為習用之螢光基，如使用 VK：作為弟—報導劑。較佳地，該插人片段具有如序列辨識 編號12或其互補股所示之序列，且該内部控制探針具有如 序列辨識編號10或其互補股所示之序列。 :本發明之另一具體實施例中，係使用雜合探針即時聚 合酶連鎖反應系統。該系統係藉著一定錯探針及—感應探 針以定量聚合酶連鎖反應產物。該感應探針U端具有一施 體螯光、，該定錫探針之5,端具有—受體螢光。施體榮光可由 適田之波長所激♦，並可將能量轉移給受體螢光，而經激 發之受體勞光則可發散出—較長之波長。如定錯探針及咸 應探針未與模板雜合時，於適當波長激發下，可發散出施 體榮先’但由於其未鄰近受體榮光，而無法將能量轉移， 故只可觀察得施體螢光之量。如定錯探針與感應探針於模 96645.doc 10 1262947 板變性而黏附至單股模板上時，施體螢光即可將能量移轉 至受體螢光，故可觀察到受體螢光之量，如聚合酶連鎖反 應發生之次數愈多，製造愈多產物做為模板，則有愈多之 施體螢光轉移至受體螢光，而可觀察到受體螢光發散，故 藉著置測受體螢光之量，即可定量聚合酶連鎖反應之產 物。故根據本發明之套組，其另包含一感應探針及一定錯 探針，該感應探針之3,端具有一第一施體螢光，該定錨探針 之5’端具有一第一受體螢光，且該感應探針與定錨探針可分 別與根據本發明之引子或引子對所放大之B型肝炎病毒 DNA片段雜合，且當該定錨探針與感應探針同時雜合至根 據本發明之引子或引子對所放大之B型肝炎病片段 時，可使第一施體螢光之能量移轉至第一受體螢光。於本 發明中所使用之第一受體螢光與第一施體螢光可為習用之 螢光基，如使用FL作為第一施體螢光，使用[C Red^仂 為第-受體螢光。較佳地，當使用⑻或⑷引子對時， 忒感應探針具有如序列辨識編號8或其互補股所示之 列，且該定錨探針具有如或序列辨識編號9或其互補股所示 頰似地，本具體實施例亦包含 g σ丨炫咧機制，苴勹a α之一内部控制質體及-内部控制定錨探針，龙5•戚= 一第二受體螢光並可與内部控制質體之插人有 當該内部定錨探針與感應探針 又…’且 時’可使第-施體螢光之能量移二 作時將内部控制質體與内部定㈣及感應探::即= 96645.doc 1262947 合酶連鎖反庫盥媒σ 樣叩及疋錨探針及感 便於觀察。較佳祕，姑h 木对I』時知作，以 ^ # 11 i? JL ^部控制定錨探針具有如序列辨識 、，扁油或其互補股所示之序列。 較佳地，根據本發明之套組，其另 作桿準曲絲甘+ &準貝體用以 ，卓曲線’丨中該標準質體具有一外加片段 奴包含由根據本發明^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ Λ 毒dna月卜… 對所放大之_肝炎病 :標準質體之其他部分構築之” 明所屬技術領域t具一般 、’、’、本《 體實施例中該外加& 於—較佳具 所示之序列。 具有如序列辨識編號13或其互補股 ^發明之套組與所有全《型肝炎的核酸序列掏取 證實根據本發明之套組可以辨識現有已知基因型， :免發生因為病毒基因型或類種差異而造成之偽陰 檢測率達到最高。 便 本發明再關於-種用於定量B型肝炎病毒之方法，盆係使 隸據本發明之引子或套組進行即«合酶連鎖反應。 誶言之’當使用TaqMan®即時聚合酶連鎖反應系統時， 根據本發明之方法包含下列步驟： ⑴以不同濃度之標準質體與一目標探針進行雜合反 應，該標準質體具有-外加片段，該外加片段包含由 根據本發明之引子或引子對所放大之B型肝炎病毒 DNA片段，且該目標探針係可與該根據本發明之引子 或引子對所放大之B型肝炎病毒DNA片段雜合，該目 標探針之5，及31端分別具有—第一報導劑〗一第一泮 96645.doc 1262947 滅劑； (II) 里測步驟⑴中以不同濃度之標準質體反應中第一報 導悧之1，以得到一標準質體濃度對第一報導劑量之 標準曲線； (III) 彳乂得衍生自樣品之B型肝炎病毒之;較佳地，樣 品係源自血液，如血清或血漿； (·)、丨子或引子對、目標探針、及步驟（出）中之DM A進 行即時聚合酶連鎖反應； ()里成I步驟（lv)中第一報導劑之強度，並與步驟（ϋ)中所 传之標準曲線比較，以定量樣品中DNA之濃度。 較佳地，根據本發明之方法包含一内部控制步驟，係加 入一内部控制質體與—内部控制探針，並與b型肝炎病毒 臟及目標探針進行步驟（iv)及⑺，並量測第二報導劑之 量Ή貞測得陽性訊號’則代表反應條件成功。 詳言之，當使㈣合探針即時聚合酶連鎖反應系統時， 根據本發明之方法包含下列步驟： ⑴以不同濃度之標準質體與一感應探針及一定錯探針 進行雜合反應；該標準質體具有-外加片段，該外加 片段包含由根據本發明之引子或引子對所放大之β 型肝炎病毒DNA片段；該感應探針之3,端具有一第一 施體螢光，該定錯探針之5，端具有一第一受體營光， 該感應探針與定錯探針可分別與根據本發明之^子 或引子對所放大之3型肝炎病毒而八片段雜合，且合 為疋ί“木針與感應探針同時雜合至根據纟發明之引 96645.doc 1262947 子或引子對所放大之B型肝炎病.DNA片段時，可使 第轭體螢光之能量移轉至第一受體螢光； (11)量測步驟⑴中以不同濃度之標準質體反應中第一受 體螢光之量，以得到一標準質體濃度對受體螢光量之 標準曲線； (Hi)獲得衍生自樣品之B型肝炎病毒之DNA;較佳地，樣 品係源自血液，如血清或血漿； ㈣以根據本發明之引子或引子對、感應探針、定錯探 及乂驟⑴丨）中之DNA進行即時聚合酶連鎖反應； 00量測步驟（iv)中受體螢光之強度，並與步驟⑼中所得 之標準曲線比較，以定量樣品中DNA之濃度。 較佳地’根據本發明之方法包含一内部控制步驟，係加 入-内部控制質體及—内部控制定錨探針，並與B型肝炎 撕二及^錨探針進行步驟㈣及⑺，並量測第二受體營光 之量，如制得陽性域，則代表反應條件成功。 於本發明中，樣品中病毒黯之萃取、即時聚合酵素連 鎖反應以及訊號之分析，係藉由熟習該項技術者所熟知之 方法而達成，較佳的樣品中，病毒DNA之萃取、即時聚合 酵素連鎖反應以及訊號之分析說明於以下的實例中。 兹以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明 僅侷限於此等實例所揭示之内容。 【實施方式】 實例一 ·· B型肝炎DNA之製備 血清檢體保存步驟： 96645.doc -14· 1262947 -使用不含抗旋劑的抽血管採集病人的血液，約丨〇至丨5分 鐘待血液凝固； -以3000 rpm離心10分鐘（室溫兩小時内完成） -吸取上層血清 -分裝50 μί於微量離心管中
-保存於-20°C B 型肝炎 DNA 卒取步驟（viogene®，Blood & Tissue Genomic Mini，GG1002): -取50 pL血清 -加入5 pL蛋白酶K -加入50 pL Ex緩衝液 -震盪5秒再離心5秒 -於60°C加熱20分鐘 -於70°C加熱20分鐘 -震盪5秒再離心5秒 -加入60 gL異丙醇 -震盪5秒再離心5秒 -於70°C加熱20分鐘 -震盪5秒再離心5秒 -吸取全部溶液至新離心管之内管中（内管+外管） -離心1 3，000 rpm 2分鐘 -倒去外層廢液（外管） -加入130 μί清洗緩衝液 -離心1 3，000 rpm 2分鐘 96645.doc -15- 1262947 -倒去外層廢液（外管） 加入1 3 0 pL清洗緩衝液 -離心13,000 rpm 2分鐘 -丟棄外管層並換新外管 -加入50 μί 70°C無菌水 -離心1 3，000 rpm 2分鐘 -置於4°C立即檢測或儲存於_2〇°C 實例二·· TaqMan®即時聚合酶連鎖反應 將B型肝炎DNA 1 pL與已配製好之聚合酶連鎖反應試劑 24 pL放入96孔盤中，再將96孔盤放入ABI® 7900機器中， 利用水解探針（hydrolysis pr〇be)在進行聚合酶連鎖反應複 製的同時，即時偵測螢光值而定量。其步驟詳述如下： 步驟1.取一管標準品（1〇ig隻病毒/微升）或是以圖i所示之 標準質體作10倍序列稀釋（1〇8、1〇6、1〇4、1〇2、1〇1、1〇〇 病毒/微升）；
步驟2·準備試劑及耗材，PCR試劑為ABI TaqMan⑧pcR
Core Reagents Kit，Cat. No. N808-0228 ;取 13.125 |uL無菌 水、3·5 μΐ^ 25 mM MgCl2、2.5 μι A緩衝液、各〇·25 吣 1〇 福 dATP/dUTP/dGTP/dCTP、〇·125 卟酵素、〇·25 μίυΝ(}、i 5 μί 10 μΜ具有如序列辨識編號丨所示序列之上游引子、^ $ pL 10 μΜ具有如序列辨識編號2所示序列之下游引子、〇 $ 1〇 μΜ 5’端具有FAM螢光基且具有如序列辨識編號7所 示序列之目標探針及丨pLDNA混合於96孔反應槽中；一併 以圖2所示内部控制質體及5，端具有VIC螢光基且具有如序 96645.doc 1262947 列辨識編號10之内部控制探針進行内部品管偵測； / 驟 3_ 貼上光學黏附蓋（Optical adhesive cover)Pan ^ 43 U 971蓋上均勻加熱板，放置ABI® 7900機器⑷ 井要朝左上角放置）； 。步驟4.上機，其聚合酶連敍應條件㈣。g 2分鐘，％ C 1〇分鐘’再進行5G個循環之95t 15秒、60。(： i分鐘； H成@取數據資料’取出盤（plate)丟棄關掉機器電 源’再關電腦； V驟6.用經序列稀釋已知濃度的標準品，濃度為⑺8至 又病t /U升，根據標準品得〇值數據可畫出標準曲線，其
、、口果不於圖3 ’且其内部品管摘測圖示於圖4 ;檢體得到Q 值再與標準曲線比對即可得知其濃度，其再現性評估示於 表1 : 曰期 斜率 1 2004/3/23 -3.525 2 2004/4/19 3.607 3 2004/4/22 -3.675 4 2004/4/30 -3.337 5 2004/6/8^ -3.074 平均 -3.443 SD ±0.174 另將本實例之系統與現有市售試劑b_DNA同時偵測“個 檢體，其結果示於圖5 ，兩者相關線性為 R2=0.9472(y=26.116x+70〇〇〇〇)高濃度檢體，為其中b_DNA 只能測出大於5.3X 101G複本數之高濃度檢體，而本實例之 系統則可測出數據，表示其線性範圍優於b-DNA。 實例三：雜合探針即時聚合酶連鎖反應 96645.doc 1262947 將卒取好之B型肝炎DNA 5 和配好之LightCycler®聚 曰轉連鎖反應试劑15 /xL加入玻璃毛細管（Glass capillaries) 中，利用離心混合均勻，放入LightCycler⑧機器進行pcR， 利用雜合探針在聚合酶連鎖反應進行複製的同時，即時偵 測螢光值而定量。 步驟1 ·取一官標準品（丨〇 1 G隻病毒/微升）或是標準質體作 10倍序列稀釋(108、10、104、1〇2、1〇丨、1〇。隻病毒/微升); 步驟2.準備離心轉接器（Centrifuge adapter)、毛細管和試 劑’取6.3 μι無菌水、2.4 卟 25 mM MgCl2、2 〇 吣 1〇 _ 具有如序列辨識編號3所示序列之上游引子、2〇 ι〇 μΜ 具有如序列辨識編號5所示序列之下游引子、〇15叫2〇_ 5’端具有LC Red 640螢光基且具有如序列辨識編號9所示序 列之定錯探針、0.15叫20 μΜ 3,端具FLf光基且具有如序 ，辨識編號8所示序列之感應探針及2叫酵素配製成反應 试劑，一併以含有具有如序列辨識編號12所示序列之内部 控制質體、感應探針及5,端|LCRed7G5螢光基且具有如序 列辨識編號11所示序列之内部控制定㈣針進行内部品管 偵測； 細管放置離心轉接器上依序排 入毛細管，取5 gL稀釋好的標準 列 步驟3.取所需數量的毛 ，取15 /iL配好的試劑加 口口依序加入毛細官，取5/xL的檢體（B型肝炎DNA)接在標 準品之後依序加入毛細管； v驟4.將毛細官蓋上蓋子，經離心则G rpm 3G秒，將毛 細管依序放置轉盤(LC car〇Usel)上，轉盤放入叫抓咖⑧ 96645.doc 1262947 機器； 步驟5·上機，其聚合酶連鎖反應條件為95它1〇分鐘，再 進行50循環95。(： 〇秒、5(rc 1〇秒、72。〇 1〇秒，之後降 溫至4(TC 30秒； 步驟6.完成讀取數據資料，取出轉盤將毛細管丟棄，關 掉機器電源，再關電腦； 步驟7·用經序列稀釋已知濃度的標準品，濃度為1〇8_1〇0 又病I /耄升。根據標準品所得Ct值數據可畫出標準曲線， 其結果示於圖6，且其内部品管偵測圖示於圖7，檢體之α 值再與標準曲線比對即可得知其濃度，其再現性評估示於 表2 : 曰期 ~ 斜率 1 2004/3/18 -3.554 2 2004/3/25 _ -3.564 3 2004/4/1 -3.512 4 2004/4/8 -3.586 5 2004/4/22 -3.513 6 2004/4/29 -3.544 7 2004/5/6 -3.719 8 2004/5/13 -3.615 9 2004/5/20 -3.717 10 2004/5/27 -3.684 平均 -3.601 SD ±0.069 另將本貫例之糸統與現有市售試劑b-DNA同時偵測3 8個 檢體，其結果示於圖8 ，兩者相關線性為 R2=0.8439(y=62.362x+700000)高濃度檢體，b-DNA只能測 出大於5.3 X 1 〇複本數之高濃度檢體，而本實例之系統則 可測出數據，表示其線性範圍優於b-DNA。 96645.doc 1262947 實例四··標準血清與即時聚合酶連鎖反應之對應關係 以世界衛生組織（WHO)訂購之標準血清與根據本發明之 方法定量所得結果之對應關係示於表3，且其換算方程式示 於圖10。 表3 ·· 才示準血清 (IU) 1 ~S數 即時聚合酶連鎖反應 (複本數） 對數 50000 4.69897 6.00E+03 3.778296 12500 4.09691 1.40E+03 Γ 3.147367 3125 3.49485 3.36E+02 2.526339 781.25 2.89279 8.05E+01 1.905634 390.025 2.59176 3.69E+01 1.567497 上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制 本毛月^於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變 化仍不堤背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之 申晴專利範圍所列。 【圖式簡單說明】 圖1為例示本發明之標準質體構築示意圖。 圖2為例不本發明之内部控制質體構築示意圖。 圖為以TaqMan®即時聚合酶連鎖反應之標準曲線圖。 圖:為以丁aqMan®即時聚合酶連鎖反應之内部品管倘測 之I =x TaqMan⑧即時聚合酶連鎖反應系統與市售試劑 之比較結果圖。 … 圖6為以 „ Ρ夺1合_連鎖反應之標準曲線圖。 圖7為以雜合探針卽拄取人^ 圖 。 卩~ t合酶連鎖反應之内部品管偵測 圖8為以雜合探針g 士 可聚合酶連鎖反應系統與市售試劑 96645.doc -20- 1262947 之比較結果圖。 圖9為以TaqMan®即時聚合酶連鎖反應與雜合探針即時 聚合酶連鎖反應系統之比較結果圖。 圖10為標準血清與即時聚合酶連鎖反應之對應關係換算 方程式圖。 96645.doc •21 - 1262947 序列表 <110> 國立成功大學 <120>定量B型肝炎病毒之引子及引子對套組及方法 <130〉無 <160> 13 <170> Patentln version 3.2 <210〉 1 <211〉 22 <212〉DNA <213> 人工序列 <400〉 1 gcaggtcccc tagaagaaga ac <210〉 2 <211> 17 <212〉DNA <213〉人工序列 <400〉 2 cgacgcggcg attgaga <210〉 3 <211> 19 <212〉DNA <213> 人工序列 <400〉 3 gaccaccaaa tgcccctat <210> 4 <211〉 21 <212〉DNA <213> 人工序列 <400> 4 gaccaccaaa tgcccctatc t <210> 5 <211> 22 <212〉DNA <213〉人工序列 96645.doc 221262947 <400> 5 cgagattgag atcttctgcg ac <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 6 ggagattgag atcttctgcg ac <210〉 7 <211> 17 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 7 cctcgcctcg cagacga <210〉 8 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉 變異區 <222> (3)..(3) <223> s>4gic <400〉 8 gasgcaggtc ccctagaaga agaa <210〉 9 <211〉 26 <212〉DNA <213〉人工序列 <220> <221〉 變異區 <222〉（19)..(19) <223> m為 a 或c <220> <221> 變異區 <222〉（22)..(22) <223〉r 為 a或 g <400> 9 tccctcgcct cgcagacgma grtctc 22 17
24
96645.doc -2- 26 1262947 <210〉 10 <211> 17 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 10 ctcttgctga agcttct 17 <210> 11 <211〉 25 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 11 cttgctgaag cttctgacta cgact 25 <210〉 12 <211> 190 <212〉DNA <213> 人工序列 <400〉 12 tttggtgtct ttcggagtgt ggattcgcac tcctcctgct tacagaccac aaaatgcccc 60 tatcttatca acacttccgg aaactgctgt tgttagacga cgaggcaggt cccctagaag 120 aagaactctt gctgaagctt ctgactacga ctaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc 180 tcgggaatct 190 <210〉 13 <211> 190 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 13 tttggtgtct ttcggagtgt ggattcgcac tcctcctgct tacagaccac aaaatgcccc 60 tatcttatca acacttccgg aaactgctgt tgttagacga cgaggcaggt cccctagaag 120 aagaactccc tcgcctcgca gacgaaggtc tcaatcaccg cgtcgcagaa gatctcaatc 180 tcgggaatct 190 96645.doc