TWI245800B - Endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene - Google Patents

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1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印則衣 五、發明說明（i ) 技術範疇 本發明係關於内_/? -N-乙醯基葡萄糖胺:y：酶基因。更詳細 言之，該基因係關於來自白黴菌屬之基因。再者，本發明 係關於含有該基因之重組質體，藉該質體轉形之生物，使 用該轉形體製造新穎内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺苷酶之方法。 背景技術 糖蛋白質廣泛存在於動植物之組織、眞核微生物之細胞 膜及細胞壁等。 近年來已.明白糖蛋白質之糖鏈在細胞之分化及癌化以及 細胞間之辨識等機構上扮演重要的角色，爲了解此等機構 ，現正進行有關糖鏈之構造及機能之研究。關於達成該目 的之手段，則係從糖蛋白質切出糖鏈之時或鑑定糖鏈之構 造之時，使用各種糖苷酶。其中，内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺 苷酶作用於糖蛋白質中之天冬醯胺結合型糖鏈（N-結合型 糖鏈，N型糖鏈）上，而有將存在於糖鏈中之乙醯基酮二糖 部分切斷及使糖鏈游離之作用。 内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶由於能將糖蛋白質之糖鏈部 分自蛋白質部分游離出，所以被認爲在糖蛋白質糖鏈之構 造及功能之解析上相當重要。 天冬醯胺結合型糖鏈按其構造被分類爲高甘露糖型（甘露 聚糖型糖鏈）、雜糖型及複合型。 已知之内--N-乙醯基葡萄糖胺甞酶例如有Endo Η (A丄. Tarentino and R Maley，J. Biol. Chem·，249，811 (1974))、Endo F (K. Takegawa，et al.，Eur. J. Biochem·，202，175 (1991))及EndoA -4- (請先閱讀背面之注意事項

『本頁) -laj -線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x 297公釐） 1245800

五、發明說明（3 ) 標準品。在該場合，先前使用黴菌菌體之育種法可 合 :素之生產性。但是，先前之育種法主要限於採用： 紫外線或變異謗發劑得到之變異株之方法，而要單離△二 的變異株有困難。再者，在藉先前方法育種之場合，：： 奶4形質轉變者相當多。更且，由於黴_般生成各種各 j蛋白質分解酵素，所以就生產以糖轉變爲目的之酵素而 言，不是好的生產者。爲除去此等問題，不得不實行多俨 精製㈣’以致-方面作業繁雜，—方面酵素的產量少。又 舉例Έ*之，培養白黴菌屬微生物（爲毛黴之一種）之場合， 縱使從該培養上清液進行酵素之精製，也無法除去蛋:酶 之混入，而且由於該菌體之酵素生產力低，所以要大量調 製有困難，亦即實用上的價値低。 基於上述，爲大量生產内乙醯基葡萄糖胺菩酶，期 望取得該酵素之基因，以遺傳工程學的方法生產該酵素。 再者，若能取得該基因，則可期待用蛋白工程之技術製得 耐熱性及耐ρΗ性提高以及能使反應速度增加之酵素。然而 雖然嘗試進行該基因之選殖，但至目前爲止尚無其之報告。 發明之目的 本發明之目的爲提供内-卢-斗乙醯基葡萄糖胺菩酶，内· Α -Ν-乙酿基葡萄糖胺苷酶基因，含有該基因之重組載體， έ有〉重、、且载骨豆之轉形體以及内_卢乙酿基葡萄糖胺替 之製法。 本發明者們爲解決上述課題反覆精心研究，結果根據來 自冬季白黴菌之内-/? -Ν-乙醯基葡萄糖胺钻酶之部分胺基酸 本紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格⑽x 297公爱） (請先閱讀背面之注音？事項本頁)

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五、發明說明（4 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列之資料，從自該酵素之生產菌—冬季白黴菌調製而得 之cDNA庫成功取得编碼該酵素之基因，且成功地在酵母中 表現，而完成本發明。 亦即本發明提供下列（a)或（b)之重組蛋白質： (a) 含有序列編號3所示之胺基酸序列之蛋白質，以及 (b )含有序列编號3所示之胺基酸序列中至少一個胺基酸被 刪除、置換、插入或附加而得之胺基酸序列，且具有内 - - N -乙醯基葡萄糖胺:y：酶活性之蛋白質。 又，本發明提供一種編碼下列（a)或（b)之蛋白質之内_ N-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因： Ο)含有序列編號3所示之胺基酸序列之蛋白質，以及 (b) 含有序列編號3所示之胺基酸序列中至少一個胺基酸被 刪除、置換、插入或附加而得之胺基酸序列，且具有内 -/? -N-乙醯基葡萄糖胺:y：酶活性之蛋白質； 以及含有在嚴苛條件下能與該基因雜交且編碼具内-0 -N-乙 醯基葡萄糖胺甞酶活性之蛋白質之DNA之基因。 又，本發明提供一種含有下列（c)或（d)之DNA之基因： (c )由序列編號2所示之鹼基序列組成之〇ΝΑ ; (d)在嚴苛條件下能與由序列編號2所示之鹼基序列組成之 DNA維父’且編碼有内-卢乙酿基葡萄糖胺:y：酶活性 之蛋白質之DNA。 上述基因例如爲來自白黴菌屬之微生物（例如冬季白黴菌)。 又’本發明提供一種含有前述基因之重組載體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁)

. -線· 1245800 A7 B7 "................ ......... ..................... 五、發明說明（5 ) 又，本發明提供一種含有前述載體之轉形體。 再者’本發明提供一種内-冷-N-乙醯基葡萄糖胺苷酶之製 法’其特徵爲培養前述轉形體，然後從所得培養物收取内 • /3 乙醯基葡萄糖胺苷酶。 下文將詳細説明本發明。 本發明之特徵爲培養生產内乙醯基葡萄糖胺甞酶之 菌，從所得培養物精製内-Ν-乙醯基葡萄糖胺:y：酶後，從 忒酵素之邵分胺基酸序列設計簡併探針，藉著進行pCR選 殖編碼該酵素之基因，再者，自生產内Μ_Ν_乙醯基葡萄糖 胺芬酶之菌之cDNA庫選殖編碼該酵素之基因。又，本發明 足特徵爲將被選殖之基因插入載體中以得到重組載體，同 時將涊重組載體導入宿主細胞中，以得到轉形體。再者， 本發明4特徵爲藉著培養上述轉形體，大量生產内-卢乙 醯基葡萄糖胺苷酶。 卜生產内-yS-N-乙醯基葡萄糖胺苷酶之菌之培養 生產内/? -N-乙醯基葡萄糖胺铝酶之菌爲屬於白黴菌屬之 菌恤’較佳爲冬季白黴菌，更佳爲被寄存於工業技術研究 院f命工學技術研究所（茨城縣付場市東1段1-3號）之冬季 白黴菌（寄存編號爲FERM Bp_4991)。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 ^養此等菌株 < 培養基之組成，以採用通常微生物培養 所用者爲佳。 ^做爲碳源者例如爲葡萄糖n甘露糖、半乳糖、麥 牙糖、可洛性澱粉、糊精等糖質，做爲氮源者，例如有酵 母萃取物、胰化康。做爲無機鹽者，除了含有上述氮源之 • 8 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 五、發明說明（6 ) =鹽之外：可以使用鋼鹽、卸鹽，鹽、鎂鹽、磷酸鹽 寺I頮，視場合也可添加維生素類等。 培養係將培養基用通常的方法滅菌，接種菌株後，在 20 30 C及pH 5〜7下間歇振搖2〜4日，或進行通氣檀掉培養。 在本發月中，於溫度爲25〜3(rc，阳爲6，用半乳糖做爲 碳源，用酵母萃取物及姨化腺做爲氮源，碳源及氮源之濃 度皆爲2〜3% ’碳源與氮源之比爲2:3及於良好通氣條件下 坨養3 4曰爲更佳。在此等培養條件下培養之場合，酵素 t生產量增大，與公知之方法[s Kad〇waki，d &，a扣c Βκ>1· Chem·，54, 97 (1990);葡萄糖〇·5〇/。，酵母萃取物1%，脒 1 % ]相較，得到約1 〇倍之酵素生產力。 又，在本發明中，培養微生物之時爲確保通氣條件，以 使用發酵罐爲較佳。 2 ·内-卢乙醯基葡萄糖胺甞酶之精製 上述菌株生產之内j-N-乙醯基葡萄糖胺:y：酶爲以保持下 述活性爲特徵者。亦即其之特徵爲具有作用在糖蛋白質中 (結合型糖鏈上及切斷該糖鏈中之二乙醯基酮二糖部分而 游離糖鍵之活性。 内乙醯基葡萄糖胺甞酶之精製可藉組合公知之分離 及精製方法而進行。例如，利用溶解性差異之方法諸如鹽 澱法及溶媒沉殿法；利用分子量差異之方法，諸如透析 法、限外過濾法、凝膠過濾法及SDS-聚丙晞酸系電泳法； 利用電％差異之方法，諸如離子交換層析法；利用疏水性 差異之方法，諸如疏水層析及逆向層析；以及利用等電點 9 - 本紙張K度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）

1' 裝--- 請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· -丨線」 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 .、發明說明（7 ) 差異之方法，諸如等電點電泳等。 在本發明中，如^述生用改良公知方法（s以加福此以 ^^gric· Biol· Chem·，54, 97 (199〇)而^ 多段精製步驟可以高效率精製内乙㈣葡萄糖胺菩酶 ，而得到足以提供取得基因所需之胺基酸序列之充分量之 =白貝。所得 < 酵素，根據酵素精製之結果以及後述基因 解析之結果，發現分子量爲約85，_，由單_基因產物構成 ，又經由基因轉譯後之限定分解發現其由至少2個以上含有 ^子量約60,000及1土〇〇〇之胜肽之亞單元構成。 口 ^ .新禎内乙醯基葡萄糖胺答酶基因之選殖 已知得自冬季白黴菌之内乙醯基葡萄糖胺芬酶至少 由2個以上的胜肽構成。 一般而言，在單離編碼某一特定蛋白質之基因之場合， 先決定蛋白質之部分胺基酸序列，然後用此等簡併密碼子 組成〈混合寡核菩酸做爲探針，可自基因庫單離得目標基 又在本發明中，藉著如此實施之PCR取得部分片段 後^此等片段做爲探針’可自基因庫單離得目標基因。 但疋，内_々-N-乙醯基葡萄糖胺茫酶由於爲由二種以上之 亞單元組成之雜寡聚物分子，所以各個亞單元有可能各被 :異的基因獨立編碼。再者，縱使…·乙醯基葡萄糖胺2可能由-個基因編碼，但编碼二個亞單元之領域在構 以基因中死竟係何種位置關係等亦不明白。 一：疋本發明者們決定二亞單元之部分胺基酸序列，繼而 精取得部分片段後，以該片段做爲探針成功地選殖 (請先閱讀背面之注意事項本頁)

·- -丨線· -10 ‘纸張尺度適财關家標準（CNS)A4職（210^7公爱） 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8 ) cDNA，並解析該基因之構造，藉此現已明白該二亞單元被 同^一基因編碼。 本發明之基因，例如，如下述被選殖。 (1)内- A -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶之選殖 在本發明中，含有編碼新穎内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶 之基因之DNA片段之具體例，例如有圖2所示之限制酵素圖 譜所表示之DNA片段。該片段，以從白黴菌屬之菌體，較 佳冬季白黴菌，更佳被寄存於工業技術研究院生命工學技 術研究所之冬季白黴菌（寄存編號爲FERM BP-4991)調製得 之mRNA爲模板，可用遺傳工程之方法從cdNA庫單離得到 (參照分子選殖：實驗室手册（Sambrook、Maniatis et al·，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)等記載之方法）。 mRNA之調製可藉通常之方法進行。例如，培養爲mRNA 供給源之冬季白黴菌之後，用市售之套組（ISOGEN(曰本公 司）處理而得到全RNA，然後用市售之精製套組[mRNA純化 套組（法瑪西亞生物技術公司）]進行精製。又，調製mRNA 時，爲抑制mRNA之分解，以縮短培養時間爲較佳。 用如此得到之mRNA爲模板，使用寡dT引子及反錄酵素 合成單鏈cDNA後，從該單鏈CDNA合成雙鏈cDNA。將得到 之雙鏈cDNA組合入適當的選殖載體以製作重組載體。使用 得到之重組載體轉形大腸菌，用四環素耐性及胺苄青微素 爲指標選擇轉形體，藉此得到cDNA庫。 所以，大腸菌之轉形能夠遵從Hanahan之方法（Hanahan，D. :J. Mol· Biol· 166:557-580(1983))等進行。又，用質體做爲 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

内本頁) - -1線· 1245800 A7 B7 五、發明說明（9 ) 載體之場合，必須含有四環素、胺芊青黴素等藥劑耐性基 因。又，也可以使用質體以外之選殖載體，例如λ -噬菌體 等。 從如上述所得之轉形體，選擇（篩選）有目標DNA之菌株 。做爲篩選方法者，例如爲合成與内乙醯基葡萄糖胺 甞酶之胺基酸序列對應之有意義引子及反義引子，以及用 此等引子進行聚合梅連鎖反應（PCR)之方法。做爲模板DNA 者，例如可使用染色體組DNA或藉反錄反應從上述mRNA合 成之cDNA ;做爲引子者，例如有意義鏈可使用根據胺基酸 序列 ：PSLQLQPDDK(序列編號4)合成之5’-CARTTRCARCCNGAYGAYAA- 3 ’（序歹ij 編號 5 )，以及根據胺 基酸序列：SYRNPEIYPTDQNIK(序列編號6)合成之5’-CCHACNGAYCARAAYATYAA- 3 ’（序歹丨J 編號 7) 〇 又，反義鏈 可以使用根據胺基酸序列：SYRNPEIYPTDQNIK(序列编號 6 )合成之 3 ’ - GGDTGNCTRGT YTTRTARTT- 5 ’（序歹丨J 編號 8 )以 及根據胺基酸序列：GQRFNHRESHD VETEI (序列編號9 )合 成之 3 ’ - TTYCCDGTYGCDAARTTRGT- 5 ’（序歹丨J 编號 1 0 ) 〇 不 過，在本發明中並非限於此等引子。 藉著將如此得到之DNA增幅片段用3 2P、3 5 S或生物素等 標識以做爲探針，使此等探針與將轉形體之cDNA庫變性固 定之硝基纖維素濾器雜交，以及檢索得到之陽性株而篩選。 (2 )鹼基序列之決定 進行所得純系中驗基序列之決定。驗基序列之決定雖可 藉著瑪其薩姆·吉爾巴德之化學修飾法或二去氧法等公知 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項 裝--- 本頁) · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 五、發明說明（10) 方法進行’但通常用自動驗基序列決定器（例如PERKIN-ELMER公司製之377A DNA定序器等）進行序列之決定。 内-卢-N-乙酿基葡萄糖胺与:酶基因之全序列被示於序列編 號1中。其中，做爲本發明基因之較佳具體例者，例如爲序 列編號1所示鹼基序列中從第7 1號至第2305號之鹼基序列（ 序列編號2 )。又’本發明之基因，除了爲包含編碼序列編 號3所示之胺基酸序列（或含有下述其等價序列之胺基酸序 列）之驗基序列者外’亦爲包含僅是在簡併密碼子上不同但 編碼同一多胜肽之簡併異性體者。 又，编碼含有等價序列之胺基酸序列之鹼基序列可利用 部位特異性突變謗發法而調製。亦即藉著Kunkel法或缺口 雙倍體法等公知方法或按照此等方法之方法，例如藉部位 特異性突變謗發法導入變異用之套組（例如突變體-K (塔克 拉公司製）或突變體G (塔克拉公司製））等，或者使用塔克拉 公司之LA PCR試管内突變謗發系列套組而導入變異。 再者，内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因，除了包含序列 編號1或2所不之驗基序列組成之DNA外，也包含可與該 DNA在嚴苛條件下雜交且編碼具有内-0 乙醯基葡萄糖胺 甞酶活性之蛋白質之DNA。做爲嚴苛條件者，例如所謂鈉 濃度爲50〜300 mM (以150 mM爲較佳）及溫度爲50〜68°C ( 以65°C爲較佳）之條件。 一旦’内--N-乙醒基葡萄糖胺嘗酶基因之驗基序列（序 列編號1 )已確立，由於具該鹼基序列之7 1號至2 3 0 5號序列 之D N A片段（開放讀碼區）之鹼基序列已定，所以其後可藉 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 --- 本頁) 訂. 維濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（Μ ) 著化學合成’或者藉著使用該開放讀碼區（序列編號2 )之5， 及3’終端之鹼基序列[例如5、atgccttcactt CAATTGCAACC- 3 ’（序列編號 1 !)及 5，_ CTAGTTTAATGAC AAATCTATGC-3 ’（序列編號12)]做爲引子且以染色體組 DNA做爲模板進行PCR，或者藉著使用具内-a -N-乙醯基 葡萄糖胺苷酶基因之鹼基序列之DNA片段做爲探針進行雜 交，可以得到内-0 -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因。 又’含有本發明基因之質體pZL- Endo(參照下述實例3 )於 1999年5月20日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號爲 CCRC 940251。 在本發明中，做爲重組新穎内·Ν_乙醯基葡萄糖胺甞酶 之較佳具體例者，例如有序列編號3所示之胺基酸序列或含 有其之等價序列之多胜肽。在本文中，「等價序列」係指 在序列編號3所示之胺基酸序列中，至少一個胺基酸被插入 、置換或刪除或被附加至兩終端，且依然保持有上述新穎 内_N-乙醯基葡萄糖胺甞酶活性之序列。在該等價序列中 所謂「保持新穎内j -N-乙醯基葡萄糖胺：y：酶活性」係指在 利用該活性之實際使用場合中，與含有序列編號3所示之全 邵序列之多胜肽在同一條件下，維持大約同樣利用程度之 活性者。如此之等價序列，本技藝人士若參照序列編號3所 示之胺基酸序列，將可毫無困難地選擇或製造。舉例言之 ，序列編號3所示之胺基酸序列中至少一個（較佳1〜1 〇個， 更佳1〜5個）胺基酸被刪除，或者序列编號3所示之胺基酸 序列中至少一個（較佳1〜1 〇個，更佳1〜5個）胺基酸被附加 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（C1\TS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項 --- 本頁： · -丨線- A7 1245800 B7__ 五、發明說明（12) 或插入，又或者序列編號3所示之胺基酸序列中至少一個（ 較佳1〜1 0個，更佳1〜5個）胺基酸被其他胺基酸置換。所 以，含有序列編號3所示之胺基酸序列中2至744號所示之胺 基酸序列之多胜肽（序列編號3所示之胺基酸序列中缺失第一 個胺基酸甲硫胺酸者）可也被包含在本發明之蛋白質之中。 從本發明之部分胺基酸序列分析以及基因構造解析可知 前驅體多胜肽至少在序列編號3所示之胺基酸序列之51〇號（ 組胺酸）及627號（天冬醯胺）之胺基酸C端側可被切斷，由此 當可明白天然體會生成2個以上亞單元。 2·重組載體及轉形體之製作 本發明係提供含本發明基因之D NA分子，特別是表現載 體。該DNA分子係藉由將編碼本發明之新穎内_N_乙醯基 葡萄糖胺苷酶之DNA片斷轉殖於載體分子上而得到。因此 ，若將編碼本發明之新穎内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺嘗酶之基 因片斷，在宿主細胞内以能夠複製，同時該基因能夠表現 之狀態以DNA分子特別是表現載體之形態，進行宿主細胞 的轉形，則可以在宿主細胞上生產本發明之新穎内_N_乙 醯基葡萄糖酶。 由本發明得到之DNA分子係根據前述之分子選殖：實驗 室手册$己載之方法進行。 (1 )重組载體之製備 在本發明中被利用之載體，於考量所用宿主細胞之種類 下’適宜從病毒、質體、宇宙體載體等選擇。 冬丨。之，信主細胞爲大肪囷之場合，可用嗤菌體手之 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝--------訂---------線I 1^·九- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -15- 1245800 A/ B7 五、發明說明（13) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 噬菌體，pBR 系（pBR322、pBR325 等）及 pUC 系（pUC118、 pUC119等）質體；宿主細胞爲枯草样菌之場合，可用PUB系 質體（pUBllO等）；宿主細胞爲酵母之場合，可用YEp、YCp 系之載體（例如YEpl3、YEp24、YCp5〇等），或後述實例所 用之pG- 3 - Not。再者，也可以使用反錄病毒或牛痘病毒等 動物病毒、及棒狀病毒等昆蟲病毒載體。 關於將本發明基因插入載體之點，採用首先將經精製之 DNA用適當的限制酵素切斷，然後將其插入適當載體DNA 之限制酵素部位或多選殖部位而連結至載體之方法等。 本發明之基因，必須以能使該基因之機能發揮之方式組 合入該載體。所以，本發明之載體以含有轉形體之選擇標 記爲較佳，可以使用藥劑耐性標記或營養要求標記基因做 爲選擇標記。 再者，做爲本發明之表現載體之DNA分子，較佳爲含有 表現新穎内-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因所必需之DNA序 列，例如啓動子、轉錄開始信號、核糖體結合部位、轉譯 停止信號、轉錄終結信號等轉錄調節信號及轉譯調節信號 等者。 (2 )轉形體之製作 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之轉形體，藉將本發明之重組載體以能使目標基 因表現之方式導入宿主中而得到。此處做爲宿主者，若爲 能表現本發明基因者則無特殊限制。舉例言之，宿主例如 爲屬於大腸桿菌（E. coli)等埃希氏桿菌屬、枯草桿菌 (Bacillus subtilis)等桿菌屬、惡臭假單胞菌（Pseudomonas -16- 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1245800 A/ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（14) putida)等假單胞菌屬之細菌，或者爲啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母（Schizo-saccharomyces pombe)、波帝尼氏酵母（Candida boidinii)及巴 斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)等酵母菌。 做爲宿主細胞者，除了大腸菌、枯草菌及酵母以外，例 如可爲COS細胞、CHO細胞等動物細胞，或是Sf9、Sf21等昆 蟲細胞。 以大腸菌等細菌做爲宿主之場合，本發明之重組載體， 爲了在細菌中與自律複製同時進行複製，較佳由啓動子、 核糖體結合部位、本發明之基因及轉錄終結信號構成。再 者，亦宜含有控制啓動子之基因。 做爲大腸菌者，例如有大腸菌K12、DH1、DH5a、JM109 等；做爲枯草菌者，例如有枯草样菌MI 114、207-2 1等。 已知在枯草菌中，存在能將蛋白質分泌至菌體外之菌株。 再者，亦已知幾乎不會分泌蛋白梅之菌株，以使用此等菌 株做爲宿主爲較佳。 做爲促進子者，當然爲被含於插入片段且在宿主中具有 機能之啓動子，例如在大腸菌中可使用乳糖操作子（lac)及 色胺酸操作子（trp)等啓動子。 關於將重組載體導入細菌之方法，若爲將DNA導入細菌 之方法則沒有特殊限定。例如使用#5離子之方法[Cohen， S.N. et al. :Proc· Natl. Acad. Sci·，USA，69:2110-2114 (1972)]及 電穿孔方法等。 用酵母做爲宿主之場合，例如可以使用啤酒酵母、粟酒 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

N本頁) . -線. 1245800 A7B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（15 ) 裂殖酵母及產蛋白假絲酵母等。在該場合，做爲啓動子者 若爲能在酵母中表現者，將無特殊限定，例如可以使用醇 去氫酶基因（ADH)、酸性磷酸酶基因（PHO)、半乳糖基因 (GAL)及甘油醛-3-磷酸去氫酶基因（GADPH)等之啓動子， 熱震盪蛋白質啓動子，MF α 1啓動子，PGK啓動子，GAP 啓動子以及A0X1啓動子等。 關於將重組載體導入酵母之方法，若爲將DNA導入酵母 之方法則無特殊限定，例如可以使用電穿孔法[Becker， D.M. et al. :Methods. Enzymol·，194:182-187 (1990)]，原生質 球法[Hinnen，A. et al· :Proc. Natl. Acad· Sci·，USA，75: 1929_ 1933 (1978)]，乙酸鋰法[Itoh，H. :J· Bacteriol.，153:163-168 (1983)]等。 以動物細胞做爲宿主之場合，可以使用猿猴COS- 7、Vero 、中國倉鼠-卵巢細胞（CHO細胞）、小鼠L細胞、家鼠GH3 、人類FL細胞等。做爲啓動子者，可以使用SR π啓動子、 SV40啓動子、LTR啓動子、CMV啓動子等。再者，亦可以 使用人類部位巨病毒之初期基因啓動子等。 關於將重組載體導入動物細胞中之方法，例如有電穿孔 法、嶙酸#5法及脂染法（lipofection)等。 以昆蟲細胞做爲宿主之場合，可以使用Sf 9細胞及Sf21細 胞等。 關於將重組載體導入昆蟲細胞中之方法，例如可以使用 磷酸鈣法、脂染法及電穿孔法等。 4 .本發明之蛋白質之生產 -18- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本頁) 訂·- 丨線· 1245800 A7 B7 五、發明說明（ 16 本發明之蛋白質爲含有本發明基因編碼之胺基酸序列者 ，或者爲含有將前述變異導入該胺基酸序列中之至少一個 胺基酸而待之胺基酸序列，且具有内_卢_n_乙醯基葡萄糖 胺菩酶活性者。 本發明之蛋白質，藉著培養上述轉形體以及從其培養物 收取而得到。所謂「培養物」意指培養上清液，或者培養 細胞、培養菌體，或者細胞或菌體之破碎物中之任一者。 培養本發明轉形體之方法係依照培養宿i通常所用之方 法進行。 以大腸菌或酵母菌等微生物做爲宿主所得之轉形體，在 培養時採用之培養基爲含有能夠資助微生物生長之碳源、 氮源及無機鹽類等且能有效率地培養轉形體之培養基， 可爲天然培養基及合成培養基中之任一者。 做馬碳源者，可以使用葡萄糖、半乳糖、薦糖、殿粉 碟水化合物’乙酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。 做爲氮源者，可以使用氨、氯化铵、硫酸按、乙酸銨 料銨等無機酸或有機酸之銨鹽或者其他含氮化合物之 ，還可使用蛋白腺、肉萃取物、玉米浸潰液等。口 做爲無機物者，可以使用磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、 其 等 外 (請先閱讀背面Μ注意事項 丨---- 本 ί -丨線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 璘 =等硫酸鎂'氯化鈉、硫酸亞鐵、疏酸每、硫酸銅 =養通常在震i培養或通錢拌培養等喜氣條件下_人進'12〜72小時。培養期間中，PH値保持4〜7.5。pH值 4凋整用無機或有機酸，或者鹼性溶液進行。 破 於 表紙張尺關冢鮮（CNS)A4職（210 X 2_97公爱）_ 19- 1245800

五、發明說明（17) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 培養中如有需要，也可以將安比西林或四環素等抗生物 質添加至培養基中。 在被以謗導性促進子做爲促進子之表現載體轉形之微生 物之培養場合，如需要可以將謗導劑添加至培養基中。舉 例T之，在培養被採用Lac啓動子之表現載體轉形之微生物 之時，可以在培養基中添加異丙基_ 0 硫代半乳糖苷 (IPTG)等；又在培養被採用trp啓動子之表現載體轉形之微 生物時’也可以在培養基中添加4丨噪乙酸（ZAA)等。 以動物細胞爲宿主所得之轉形體在培養時所用之培養基 ，可以採用一般使用之RPMI 1640培養基、DMEM培養基， 或在此等培養基中添加牛胎兒血清等所得之培養基等。 培養通常在5%C〇2存在下，於3 7乂進行2〜1〇日。培養中 如有需要，也可以將卡那黴素（Kanamycin)及青黴素等抗生 物質添加至培養基中。 培養後本發明之蛋白質在菌體内或細胞内生產之場合， 藉著將菌體或細胞打碎可以萃取出本發明之蛋白質。再者 ’本發明之蛋白質在菌體外或細胞外生產之場合，培養液 照原樣使用，並藉離心等除去菌體或細胞。 重組之新穎内-/3 -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶之精製，可藉適 ‘組合公知之分雖及精製方法而進行。例如可以使用利用 落解性差異之方法諸如鹽沉澱法及溶媒沉澱法；利用分子 量差異之方法，諸如透析法、限外過濾法、凝膠過濾法及 SDS_聚丙烯酸系電泳法·，利用電荷差異之方法，諸如離子 交換層析法；利用疏水性差異之方法，諸如疏水層析及逆 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公g ) (請先閱讀背面之注意事項Η 裝--- ρ寫本頁} ·- --線· 1245800

流速·· Ο · 5毫升/分鐘 檢出器：螢光檢出器 活性芩足義爲在上述藉HpLC測定之條件下，將在^分鐘 ^月間内生成1微莫耳天冬醯胺醯基乙醯基葡萄糖胺之酵素量 足義爲1單位。 [實例2]冬季白黴菌之培養 在500毫升容俎口燒瓶中裝入1〇〇毫升培養基（半乳糖2%， 酵母萃取物3%)，接種斜面培養3〜5分之1株份量之冬季白 黴菌孢子，並於28°C培養2日。爲調，抽吸過濾該 培養液並使用分離得之菌體。 再者，關於酵素之調製，培養上述之培養液後，移換至 裝有2公升培養基之3公升容量之發酵罐中，於28r、回轉 數300〜400 rpm，通氣量爲2公升/分鐘之條件下培養4曰。 [實例3]新穎内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶之精製 將實例2所得之培養液4公升份（3公升容量發酵罐培養二 次乙份量）抽吸過濾以分離菌體，以藉限外過濾（以分子量 13000切分）而濃縮至200亳升者做爲粗酵素液。令該粗酵素 液通過以含5 mM EDTA之1〇 mM磷酸鉀緩衝液（ρΗ 7 0)平衡 I離子交換層析管柱（法瑪西亞公司，q Sephar〇se FF, 5〇〇毫 升）。管柱用相同的緩衝液洗淨，繼而用9 〇 〇毫升之 0M〜0.3M食鹽水線性梯度溶離内j 乙醯基葡萄糖胺苷酶 。在含活性物質之落離邵份中添加試藥，以使最終濃度爲 含1 Μ硫酸銨及5 mM EDTA之50 mM磷酸鉀（ρΗ 7·0)，然後將 其通過以相同緩衝液平衡之疏水層析管柱（柬索公司，苯基 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁)

--線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 五、發明說明（21 ) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -TOYOPEARL 650S 200毫升）。將該管柱用相同緩衝液洗淨 ，繼而用含ImM EDTA之硫酸按600毫升，以1M〜0M之線性 梯度溶離内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶。 將所得之溶離液用限外過濾膜（分子量切分點13000)濃縮 至5毫升，繼而用含0.15M食鹽及ImMEDTA之10mM磷酸钾 緩衝液（pH 7.0)洗淨及脱鹽。繼而將其載入用相同緩衝液平 衡化之凝膠過濾層析管柱（法瑪西亞公司，Sephacryl S300)中，以及用相同緩衝液溶離出内-A -N-乙醯基葡萄糖 胺苷酶。 將有活性溶離部分用限外過濾膜（分子量切分點13000)濃 縮，繼而用含1 mM EDTA之10 mM磷酸鉀緩衝液（pH 7.0)洗 淨及脱鹽。繼而通過以相同緩衝液平衡之羥基磷灰石層析 管柱（東索公司，TSK-凝膠HA 1000)。將該管柱用相同緩衝 液洗淨，繼而用含ImM EDTA之磷酸鉀（pH 7.0)3 0毫升， 以0M〜0.3M之線性梯度溶離内- A -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將活性溶離部分用限外過濾膜（分子量切分點13000)濃縮 ，繼而用以亞胺二乙酸將pH調製成7.1之25 mM Bis-Tris緩衝 液洗淨及脱鹽。接著通過以相同緩衝液平衡之等電點層析 管柱（法瑪西亞公司MonoP)。將該管柱用相同緩衝液洗淨， 繼而用以50毫升亞胺二乙酸將pH調製成3.9之1 0%多緩衝 液-74(法瑪西亞公司）溶離内-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶。 將活性溶離部分用限外過濾膜（分子量切分點13000)濃縮 ，繼而用含1 mM EDTA之10 mM磷酸鉀緩衝液（pH 7.0)洗淨 及脱鹽。繼而通過以相同緩衝液平衡之離子交換層析管柱（ - 24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（22) 法瑪西亞公司MonoQ)。將該管柱用相同緩衝液洗淨，繼而 用30ml之0M〜0.3M食鹽之線性梯度溶離内_/? -N-乙醯基葡 萄糖胺苷酶。 將活性溶離部分用限外過濾膜（分子量切分點13000)濃縮 ，繼而用含1 mM EDTA之50 mM騎酸4甲緩衝液（pH 7.0)洗淨 及脱鹽，然後從中進行酵素取樣。又，各管柱層析用法瑪 西亞公司之FPLC進行。 蛋白質質量用生物實驗室公司之蛋白質含量測定套組測 定或藉吸光度（280 nm)測定。蛋白質之分子量及等電點藉 SDS-PAGE (15-25%梯度）、凝膠過濾層析及IEF-PAGE等測 定。 從藉Native-SDSPAGE、IEF-SDSPAGE之2次元電泳以及 上述層析中各溶離部分之活性之SDS-PAGE分析之結果， 可在SDS- PAGE上至少檢出60 kDa(被稱爲p60)及14 kDa (pl4) 之帶（圖1)。 [實例4 ]新穎内-Θ -Ν-乙醯基葡萄糖胺甞酶之部分胺基酸 序列之決定 部分胺基酸序列分析藉岩松（生化學63、139〜143( 1991)) 之方法進行。將精製酵素懸浮於電泳用緩衝液[1 〇 %甘油， 2. 5%SDS，2% 2-硫醇基乙醇，62 mM Tris鹽酸緩衝液（pH 6.8)]中，然後供SDS聚丙烯醯胺電泳。電泳後，藉電吸潰 將該酵素從凝膠轉錄至10 cm X 7 cm之PVDF膜[(ProBlot)， 應用生物系統公司]。電吸潰裝置可以使用Salutoblot IIs型（ 薩爾區史公司），並於160 mA進行1小時電吸潰。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

本頁) . -1線· 1245800 A7 B7 五、發明說明（23 ) 轉錄後，切取被酵素轉錄之部分之膜，將其一部份用直 接氣相蛋白質定序器分析，並決定N終端胺基酸序列。再 者’殘餘之膜浸潰於約300微升之還原用緩衝液（8M胍鹽酸 ’ 0.5M Tris鹽酸緩衝液（pH 8.5)，0.3% EDTA，2% 乙腈）， 加入1毫克之二硫酥糖醇（DTT)，於氬氣及25°C下進行還原 1小時。在其中加入3.0毫克單碘乙酸溶於1 〇微升之〇·5ν氫 氧化鈉溶液者，並於遮光下攪拌20分鐘。取出PVDF膜並用 2 %乙腈充分洗淨後，浸於含〇·5〇/ο聚乙烯四氫吡咯啶_ 4 〇之 100 mM乙酸中並靜置30分鐘。之後，用水充分洗淨pvdf 膜，將切成1 mm四方之膜浸於消化用緩衝液[8 %乙腈、9〇 mM Tris鹽酸緩衝液（pH 9.0)]中，然後加入1微微莫耳無色 細菌蛋白酶（和光純藥），以及於室溫消化1 5小時。該消化 物藉用 C 1 8 管柱（和光純藥 Wakosil AR II C18 300A2.0 X 150 mm)進行逆相高速液體層析（日立L62〇〇)而分離，對於各亞 單元得到7種胜肽片段。 使用A溶媒（0.05%三氟乙酸）或B溶媒（含0.02%三氟乙酸之 2 -丙醇/乙腈7 ·· 3)做爲胜肽之溶出溶媒；至於溶出，若用b 溶媒則係以2〜50%之直線濃度梯度及〇·25毫升/分鐘之流速 /谷出4 0分鐘而進行。 對於從新穎内-/? 乙醯基葡萄糖胺苷酶候補蛋白質得到 之胜肽片段進行胺基酸序列分析。將來自P 6 〇之片段命名 爲P60-AP，以及將來自pH之片段命名爲pl4-AP。得到之胜 肽片段中胺基酸序列之決定試驗，藉著使用氣相蛋白質定 序器PPSO- 1 0型（島津製作所），並依照其手册以自動愛德 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) --------訂---------線 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 五、發明說明（24 ) 曼（Edman)分解法進行。所得到之部分胺基酸序列被記載於 表1中。 表 1内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺嘗酶候補蛋白質 之部分胺基酸序列 p60 p60-AP-5 PSLQLQPDDK (序列編號17) p60-AP-6 (K)SYRNPEIYPtDQNIK (序列编號18) p60-AP-8 (K)FNVSSVALQPRVK (序列编號19) p60-AP-9 (K)MDRLFLCGgKS (序列編號20) p60-AP-ll (K)GQRFNHREShDVETEI (序列编號21) pl4 pl4-AP-l mal plllt (K)EGYISSSGSIDLSLN 編號22) 在表1記載之胺基酸序列中，以小寫英文念#主—、π. # 穴人子母表TFt胺基 酸意味胺基酸序列中不確定的胺基酸。 部分胺基酸序列所用之無色細菌蛋白梅I，由於特異性切 斷離胺酸殘基之瘦基側’所以在下列序列中於N終端側記 載以括派書寫之K(離胺酸）。p60-AP-5，由於已判明n終端 胺基酸序列，所以除去括弧書寫之Κ (離胺酸）。 對於ρ60及1 4之無色細菌蛋白酶消化物，用C18管柱（把备 科學Inertsil ODS-3 0.5 x 40mm)進行逆相高速液體層析（日: L6200)，該C18管柱並與質量分析機（PE Sciex Ap^m)連^ 以同時進行質量分析。分析結果被示於表2中。 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項v %--- p寫本頁)

I .線%; 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 Δ7 八/ Β7 五、發明說明（25 ) 表 2 60kDa胜肽（p60)及 14kDa胜肽（pl4)之 Lys- C 消化物LC/MS解析結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 p60 實測値 理論値 誤差 對應序列 序列編號 AP-1: 950.50 950.47 +0.03 (K)NIQGNNYK 23 AP-2: 1160.50 1160.56 -0.06 (K)YSDYPPPPPK 24 AP-3: 733.25 733.41 -0.16 (K)LSDASK 25 AP-4: 1838.50 1837.91 +0.59 (K)SYRNPEIYPTDQNIK 18 AP-5: 1141.00 1140.59 +0.41 ()PSLQLQPDDK.............p60 N終端 17 1157.50 1556.75 +0.75 (K)NTDGIFLNYWWK 26 AP-6: 1774.75 1774.94 -0.19 (K)GB*SLRYIYRTLLMK 27 AP-7: 701.50 701.39 _0.11 (K)LTVAB*H.....................p60 C 終端 28 1544.50 1543.79 +0.71 (K)PQLLLTHDMAGGYK 29 1621.00 1620.73 +0.27 (K)SMNELRDWTPDEK 30 AP-8: 1444.75 1444.83 -0.08 (K)FNVSSVALQPRVK 19 AP-9: 945.75 945.58 +0.17 (K)LAPVSFALK 31 2655.00 2655.33 -0.33 (K)GQRFNHRESHDVETEISIPLYK 32 AP-10: 2206.75 2206.11 +0.64 (K)rrSSLDB*DHGAFLGGTSLEK 33 AP-11: 2335.00 2335.16 -0.16 (K)NELFFKNTDGIFLNYWWK 34 pl4 實測値 理論値 誤差 對應序列 序列編號 AP-1: 888.75 888.45 +0.30 (K)IVIEAVNK 35 AP-2: 1392.50 1392.76 -0.26 ()SSRnQDLFWK..............pl4 N終端 36 AP-3: 1541.50 1541.73 -0.23 (K)EGYISSSGSIDLSLN......pl4 C終端 22 1608.50 1608.84 -0.34 (K)TDSSRnQDLFWK 37 *B表示半胱胺酸、羧甲基。 -28- (請先閱讀背面之注意事項

本頁) . -線- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（26) 在表2中，已知質量（M + H + )實測値爲701.5 0之片段約相 當於P60-AP-7之分子量，實測値爲1541.5 0之片段約相當於 pl4-AP_3之分子量，以及其C終端之胺基酸不爲K(離胺酸） 。用無色細菌蛋白酶消化所得之片段，基於該酵素之受質 特異性，亞單元本身之C終端片段以外之片段中C終端胺基 酸殘基由K(離胺酸）構成，所以可推定上述胜肽片段爲p6〇 及pl4亞單元之C終端片段。 已決定之p60及pl4之部分胺基酸序列，用蛋白質資料庫 BLASTP進行類似性檢索，結果顯示所得序列爲新穎者。由 於以上結果，用p60及pl4做爲内_/? -N-乙醯基葡萄糖胺甞酶 候補，進行基因選殖。 [實例5 ]冬季白黴菌株cDNA庫之製作 首先從實例2所得之菌體5公克，用ISOGEN(曰本公司）萃 取出全部RNA。用mRNA純化套組（法瑪西亞生物技術公司） 從萃取出之全部RNA精製mRNA。使用供cDNA合成及；I選 殖套組（GIBCO BRL)用之 Superscript ΤΜλ 系統，從mRNA 合 成cDNA，粘接Sal接頭後，粘接至λ ZipLox TMSal I-Not I Arms (GIBCO BRL)。使用Gigapack III金包裝萃取物（史崔 特基因公司）進行包裝，而完成使大腸菌Y1090株感染之 cDNA庫。 [實例6 ]新穎内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺苷酶之選殖 依照部分胺基酸序列p60- AP- 5、p60- AP- 6及p60- AP- 1 1設 計PCR引子。以下列出此等序列。所用記號均係根據 IUPAC-IUB。 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) m

言 Γ 1245800 A7 B7 五、發明說明（ 27 ) ρ60-ΑΡ-5 p60-AP-5F 5’ CARTTRCARCCNGAYGAYAA 3, (有意義引子）（序列編號5) p60-AP-6 p60-AP-6F 5’ CCHACNGAYCARAAYATYAA 3, (有意義引子）（序列編號7) p60-AP-6R 3’ GGDTGNCTRGTYTTRTARTT 5’ (反義引子）（序列編號8 ) p60-AP-ll P60-AP-11R 3’ TTYCCDGTYGCDAARTTRGT 5, (反義引子）（序列編號10) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 藉驗法從冬季白黴菌培養菌體調製染色體組DNA，進行 染色體組PCR(94°C 30秒，55°C 1分鐘，72。(： 1分鐘，30 個循環），以及確認特異性增幅之帶。對於p6〇，用p6〇_ AP-

5F與 p60-AP-llR之引子之組合，用 p6〇_AP-5F 與 p60-AP-6R 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 之引子之組合以及用P60-AP-6F與p60-AP-llR之引子之組 合’分別得到1 · 7kb，1 · 5kb及0 · 2kb之PCR片段。該等片段 ，用PCR- Script選殖套組（史崔特基因公司）次選殖入pCR_ Script Amp。藉著用限制酵素消化之解析推定p6〇_ Ap_5F與 p60-AP_llR之增幅片段包含p6〇_Ap_5F與p6〇_Ap_6R之增幅片 段以及P60-AP-6F與P60-AP-11R之增幅片段，所以用應用生 物系統公司之PRISM即時反應套組及同一公司之pRISM 377 DNA定序器決定p60-AP- 5F與p60-AP- UR之增幅片段之鹼基 序列。基因解析用日立公司之軟體工程DNASIS等進行。 -30- 本紙張尺度_中關家標準（CNS)A4規格⑵。χ 297公爱） 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（28 ) 結果，p60-AP-5F與p60-AP- 11R之增幅片段包含已被決定 之其他部分胺基酸序列。由於已判明該DNA片段爲p 6 0基 因之一部份，因而進一步根據p C R增幅片段之内側之序列 重新做成DNA引子，然後以實例5所得之mRNA做爲模型， 用Access RT-PCR系統（普羅美加公司）進行RT- PCR(條件與 染色體組PCR相同）。重新做成之DNA引子之序列如下述。 P60-AP-5NF 5, CACTTAAGTCTATGAATGAG 3’ (有意義引子）（序列編號1 3 ) P60-AP-6NR 3’ CGATAGCTTTAGGTCTCTAA 5’ (反義引子）（序列編號I4)。 結果，約1.2 kb之片段被增幅。決定被增幅之片段之驗基 序列，由於得到不含内含子（intron)之片段，所以用該片段 做爲探針進行cDNA之選殖。該探針用Megaprime DNA標記 系統（阿默夏姆公司）以a-32p dCTP (110 TBq / mmol)進行標 I己。 藉溶菌斑雜交從實例5所得之cDNA庫取得全長基因。結 果，從2 0萬個溶菌斑得到5個陽性純系。其中4個純系係經 2次篩選而得到之單一溶菌斑。再者將從溶菌斑得到之嗤菌 體液感染大腸菌DH10B，以及從噬菌體回收來自pZLl之質 體。對於此等純系進行限制酵素解析。對於含有最長上游 領域之純系進行鹼基序列之解析。又將該質體命名爲pZL-Endo(圖 2 ) 〇 決定被插入約2.3 kb之Sal I-Not I片段之鹼基序列。亦即， 將被細分化之片段次選殖入pBluescript II KS+(史崔特基因公 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項Η 裝___ Ρ寫本頁) . —線. 1245800 a7 B7 五、發明說明（29 ) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 司）或pUCl 18(寶酒製造公司）中，然後藉著使用外核酸酶III 及曼古賓核酸酶製作連讀缺失變異體，而製作出具有種種 變異缺失之質體，然後用DNA定序器決定2370bp構成之Sal I-Not I片段之序列（圖3〜4，序列編號1)。 進行被預想之構造基因之領域之解析，得知存在編碼 7 4 4個胺基酸組成之胺基酸序列（推定分子量85kDa)之開放 譯碼區（圖5〜7，序列編號2 )。已知其之胺基酸序列包含已 決定之p60及pl4之部分胺基酸序列之全部。由於構成p6〇-AP-5之N-終端側之胺基酸非爲離胺酸而爲甲硫胺酸，所以 確認編碼該甲硫胺酸之ATG爲轉譯之起始密碼子。因而， 可明白本發明酵素之N終端爲脯胺酸。 另一方面，如同質量分析之結果，已明白pl4-AP-3爲本發 明基因所編碼之蛋白質之C終端。再者，合併質量分析之 結果，推定pl4之N終端之至少一種爲序列編號2所示之胺 基酸序列之628號之絲胺酸。 從上述者可以明白本發明之基因在5，領域編碼p6〇以及在 j領域編碼pl4。由於沒有發現來自胺基酸序列之n終端信 號序列’所以本發明之酵素被認爲是細胞内之蛋白質，不 過由於在圖1中存在複數帶，所以認爲本發明之酵素受到蛋 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 白質分解酵素之作用，蛋白質分解酵素之作用被認爲係菌 體溶菌之原因。 [實例7 ]内-a -乙醯基葡萄糖胺謀酶基因之表現載體之 構築 在本實例中，構築含有内-/? 乙醯基葡萄糖胺：y：酶基因 -32- 本纸張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245800 A7 B7 五、發明說明（30 ) 以及GAPDH基因啓動子及PGK終結子，且補入TRP1基因之 、供插入啤酒酵母用之表現載體。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 爲了得到編碼實例3中所確認之744胺基酸之譯碼區，依 據與在兩端附加Not I部位之N終端之胺基酸序列以及C終 端之胺基酸序列對應之DNA序列合成引子，以及用PZL-Endo做爲模板進行PCR，而得到增幅片段。有意義引子序 列及反義引子序列被記載於下。

Endo-Not-F(有意義引子） 5，GGGGCGGCCGCTTTTATTTTACATAAATATGCCTTCACTTC 35 (序列编號1 5 )

Endo-Not-R (反義引子） 5，CCCGCGGCCGCCTAGTTTAATGACAAATCTATGCTACC 3， (序列編號1 6 ) 被增幅之片段藉瓊脂糖凝膠電泳分離後，用Prep-A-Gene DNA純化系統（Bio- Rad)回收及精製。再者，將該片段用Not I消化後，精製，插入pBluescript II KS+之Not I，而製作 pBlue-Endo-Not 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由於新穎之内-/? -N-乙醯基葡萄糖胺：y：酶基因爲來自黴之 基因，所以認爲宜在酵母中表現，而製作以表現載體？〇· 3( Methods in Enzymology Vol. 194 p.389)爲基礎，含有啤酒 酵母之甘油醛-3-磷酸-去氫酶（GAPDH)基因之啓動子、3 -磷酸甘油酸激酶（PGK)基因終結子及色胺酸合成基因TPR1 基因，且以trp 1基因爲選擇標記之供啤酒酵母用之表現質 體。將pG-3用BamH I消化，藉克雷勞處理使終端平滑，附 -33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（31) 加Not I接頭而製作pG-3-Not。 將前述之pBlue-Endo-Not用Not I消化，藉瓊脂糖凝膠電泳 分離精製約2.3 kb之插入片段，將其插入pG-3-Not之Not I部 位，而構築成pGEndo-SC(圖8)。 [實例8 ]新穎内--N-乙醯基葡萄糖胺甞酶在啤酒酵母中之 表現 用啤酒酵母YPH 500株（史崔特基因公司）之pep4基因破壞 株做爲宿主。關於pep4基因破壞株，藉Sikorski，R.S.及 Hieter, P.之方法（Genetics 122 卷 19-27 (1989)做成。用 10 微克 之pGEndo- SC轉形上述株。轉形藉乙酸麵法（參照 WO/9 5/32289號）進行，然後將轉形體在不含色胺酸之培養 平皿（酵母氮鹼基0.67%，酪蛋白胺基酸0.5%及葡萄糖1 %) 中選擇。 對於得到之轉形體，在菌體内進行新穎内- /5-N-乙醯基葡 萄糖胺苷酶之活性確認。將在5毫升之YPD培養基（含酵母 萃取物1%，多蛋白腺2%及葡萄糖2%)中，於30°C培養2日 之菌，於1500公克及4 °C進行5分鐘離心，以將培養上清液 與菌體分離，然後將菌體用蒸餾水洗淨。在菌體中加入50 mM麟酸钾缓衝液（pH 6.0)與5 mM EDTA之混合液100微升以 使之懸浮。然後加入5 0毫克之玻璃珠，激烈攪拌後離心， 並以上清液做爲細胞萃取液。 活性測定係用DNS- GP做爲受質，而以TLC或HPLC進行。 用TLC之結果被示於圖9中。如同與自冬季白黴菌培養上清 液精製之酵素反應而得之樣品，得到與丹醢化天冬驢胺醯 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項

N本頁) 訂： -線- 12458〇〇

五、發明說明（33 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 產業上之利用可能性 藉著本發明，可以提供内_々_N_乙醯基葡萄糖胺甞酶，内 / -N-乙醯基葡萄糖胺茌酶基因，含有該基因之重組載體， 各有孩重組載體之轉形體以及内· 0 乙醯基葡萄糖胺茹酶 之製法。 將含有本發明基因之載體導入宿主，藉著使基因表現能 夠有效率地大量生產内_0_沁乙醯基葡萄糖胺甞酶。 本發明之酵素’在進行糖鏈之分析、解析及糖鏈改變方 面爲產業上重要的酵素，藉著本發明得到之轉形體能大量 生產孩酵素，對於使用此等酵素之產業界貢獻卓著。 序列表 序列編號·· 1 序列之長度：2369 序列之類型：核酸 鏈數··二條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：由mRNA反錄之cDNA 起源 生物名：冬季白黴菌（Mucor hiemalis) 菌種名： 序列 -36- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） • , I------ (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) . .線· 1245800 A7 B7 五、發明說明（34 ) . (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) GTCGACCCAC GCGTCCGGGG ACGCGTGGGC GGACGCGTGG GCGGACGCGT GGGTTTTATT 60 TTACATAAAT ATGCCTTCAC TTCAATTGCA ACCTGATGAC AAACTAGCAC CTGTTTCTTT 120 TGCACTTAAG TCTATGAATG AGTTGAGGGA CTGGACGCCA GACGAAAAGA TAAAGTTTAA 180 CGTTTCAAGC GTGGCACTAC AGCCTCGTGT GAAAAACGCC CTGAAACCTC AATTATTGTT 240 AACTCATGAT ATGGCAGGAG GATATAAAGA AGATAAAAAT ATTCAAGGAA ACAATTATAA 300 AGACATTTAT AACATTCAAT ATTGGCATTT AGCTGATACT TTTGTATATT TCTCTCATGA 360 GCGAGTTAGC ATTCCTCCAG TCAATTGGAC AAATGCTTGT CATAGAAATG GTGTAAAGTG 420 TTTAGGTACT TTTTTAGTAG AAGGAAATAA CCAAATGCAT GAAATGGAAG CCTTGCTTCA 480 CGGTCCACCT TTACTTAATA ACACTGACGA CCCTATGAGA TTATGGAGTC CGTATTATGC 540 AGACCAATTA GTTGCTATTG CTAAACACTA TGGTTTTGAT GGCTGGTTGT TCAATATTGA 600 ATGCGAATTC TTTCCTTTTC CTACAAATCC AAAATTCAAA GCTGAAGAGT TGGCAAAGTT 660 TCTACACTAT TTTAAGGAAA AATTGCATAA CGAAATACCT GGATCTCAAC TCATTTGGTA 720 CGACAGCATG ACAAATGAAG GAGAAATCCA CTGGCAGAAC CAGCTCACAT GGAAAAATGA 780 GTTATTTTTT AAAAACACGG ATGGTAiTTT TTTGAATTAT TGGTGGAAAA AAGAATACCC 840 TGAAATGGCG CGTAGAGTAG CTGAAGGAAT AGGTAGATCA GGTTTAGAAG TTTATTTTGG 900 TACAGATGTA TGGGGAAGGC ATACTTATGG TGGCGGTGGT TTCAAATCAT ATAAGGGTGT 960 AAAAACTGCC TACTCTGCAA TGACATCTTC TGCATTATTT GGTATGGCAT GGACATACGA 1020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GCATTTCGAA AAGTCTGAAT TTGAAAAGAT GGATCGTTTG TTTTGGTGTG GTGGTAAATA 1080 CTCTGACTAT CCTCCCCCAC CTCCTAAAAA CCCAGATGAC GAAAAAGAAG TAGAAAGCGA 1140 TGATAGTGAA GATGAGCTCA TGTACGGACA CAAGAAAGGT ATTGCTGACA CGGTAGAATC 1200 TATTCCTGTA CCAGGAACAG ATTGGTTTGT TACCAATTTT GATAGGGGGT TTGGAAATAG 1260 GTTTTATTAT AGAGGAAAGA GATTACTTTC TCAGCCTTGG TCCCATTTAT CGCATCAAGC 1320 TATTCTCCCC AATAAAAGCT ATCGAAATCC AGAGATTTAT CCCACTGATC AAAACATTAA 1380 AATCACTAGT TCTCTCGATT GCGATCATGG AGCTTTTCTT GGTGGAACCT CGCTTATTAT 1440 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） A7 1245800 B7___ 五、發明說明（35 )

CAAAGGCCAA CGTTTCAATC ATAGAGAATC GCATGATGTT GAAACTGAAA TTAGTATACC TCTGTATAAG CTTTCATTAG ATGCTAGTAA AGGATGCTCA TTGCGTTATA TTTATAGAAC TTTGTTGATG AAAGATGTAA AGTTGACAGT AGCATGTCAC TTTTCGTTAA AAACAAACGA CTCAGTTAAT TTCTTCAAGG TATGGCAGCC AGATGAAAAT TTCTCTTTTG AATATGATGA TGGAATGAGA GCCACTGTTA CAACTGAAAA TTCTACCGAA AGCAGATGCT TTTTATTACG TACAACAGAA GAAGATACAG GAGAAAATGA TTGGATAACA AAAACTATTA ATGTGCCTGC TGTTCCAGAA GGAAGTCAAT TATACATTAC AAGACTTGAA GTGAGCGTAG TATTAGATAC AGCTGGTTTA GTAGGTCTTG TTAATCAAGT TATTGCTTGC TTGGGATATA TTAGCATCAT ACCAACTATA AATTCTGGAA TAAAAACAGA TTCATCACGC ATTATTCAGG ATCTCTTTTG GAAAGATCAG AAATATACCA AAATCGGAAA AGAAAGTTTA GACGACATAG CTCAAGAAGA AGTTCATAGA TATTATGGAA CATTGAACTG GGAAAACACA GCAAATGTAG TAAACGCTTG GGAGGAAATA GATTACTACA ACGTTTTTTA CAAAGAAAGT GACGACTCTG CAACTCGCAT CTTTTTAGGA ACAGCATTCT GTAATCAATT TCGTGTATCT GGTTTAGATA TTATTTTATC TAAGCTACCA AAGATAGTTA TTGAAGCTGT TAACAAAGAA GGATACATCT CTTCAAGTGG TAGCATAGAT TTGTCATTAA ACTAGGACTT CAAATAAAAT ATTATGATAA AGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG GGCGGCCGC (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2369 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列編號：2 序列之長度：2235 序列之類型··核酸 鏈數：二條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：由mRNA反錄之cDNA 起源 -38- S張尺度適用中國國家標準(C1NTS)A4規格（210 x 297公釐)~ 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（36 ) 生物名：冬季白黴菌（Mucor hiemalis) 菌種名： 序列之特徵 表示特徵之記號：CDS 存在位置：1..2235 序列 ATG CCT TCA CTT CAA TTG CAA CCT GAT GAC AAA CTA GCA CCT GTT TCT Met Pro Ser Leu Gin Leu Glij Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 15 10 15 TTT GCA CTT AAG TCT ATG AAT GAG TTG AGG GAC TGG ACG CCA GAC GAA Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30 AAG ATA AAG TTT AAC GTT TCA AGC GTG GCA CTA CAG CCT CGT GTG AAA Lys lie Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45 AAC GCC CTG AAA CCT CAA TTA TTG TTA ACT CAT GAT ATG GCA GGA GGA Asn Ala Leu Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 TAT AAA GAA GAT AAA AAT ATT CAA GGA AAC AAT TAT AAA GAC ATT TAT Tyr Lys Glu Asp Lys Asn lie Gin Gly Asn Asn Tyr Lys Asp lie Tyr 65 70 75 80 AAC ATT CAA TAT TGG CAT TTA GCT GAT ACT TTT GTA TAT TTC TCT CAT Asn He Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95 GAG CGA GTT* AGC ATT CCT CCA GTC AAT TGG ACA AAT GCT TGT CAT AGA Glu Arg Val Ser lie Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110 -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 48 6 9 24 ----,---------裝·-- (請先閱讀背面之注意事項ym寫本頁) . i線- 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（37 ) AAT GGT GTA AAG TGT TTA GGT ACT TTT TTA GTA GAA GGA AAT AAC CAA 384 Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gin 115 120 125 ATG CAT GAA ATG GAA GCC TTG CTT CAC GGT CCA CCT TTA CTT AAT AAC 432 Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 ACT GAC GAC CCT ATG AGA TTA TGG AGT CCG TAT TAT GCA GAC CAA TTA 480 Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Leu 145 150 155 160 GTT GCT ATT GCT AAA CAC TAT GGT TTT GAT GGC TGG TTG TTC AAT ATT 528 Val Ala He Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn He 165 170 175 GAA TGC GAA TTC TTT CCT TTT CCT ACA AAT CCA AAA TTC AAA GCT GAA 576 Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro i'hr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190 GAG TTG GCA AAG TTT CTA CAC TAT TTT AAG GAA AAA TTG CAT AAC GAA 624 Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 ATA CCT GGA TCT CAA CTC ATT TGG TAC GAC AGC ATG ACA AAT GAA GGA 672 He Pro Gly Ser Gin Leu He Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 GAA ATC CAC TGG CAG AAC CAG CTC ACA TGG AAA AAT GAG TTA TTT TTT 720 Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 AAA AAC ACG GAT GGT ATT TTT TTG AAT TAT TGG TGG AAA AAA GAA TAC 768 Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255 CCT GAA ATG GCG CGT AGA GTA'GCT GAA GGA ATA GGT AGA TCA GGT TTA 816 Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly lie Gly Arg Ser Gly Leu -/1 〇 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項ΛΙϋ寫本頁) 裝 · --線- 1245800 A7 B7 五、發明說明（38) 260 265 270 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) GAA GTT TAT TTT GGT ACA GAT GTA TGG GGA AGG CAT ACT TAT GGT GGC 864

Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 GGT GGT TTC AAA TCA TAT AAG GGT GTA AAA ACT GCC TAC TCT GCA ATG 912

Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 ACA TCT TCT GCA TTA TTT GGT ATG GCA TGG ACA TAC GAG CAT TTC GAA 960

Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 AAG TCT GAA ΓΤΤ GAA AAG ATG GAT CGT TTG TTT TGG TGT GGT GGT AAA 1008

Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335 TAC TCT GAC TAT CCT CCC CCA CCT CCT AAA AAC CCA GAT GAC GAA AAA 1056

Tvr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Aso Glu Lys * · .- . 340 345 350 GAA GTA GAA AGC GAT GAT AGT GAA GAT GAG CTC ATG TAC GGA CAC AAG 1104

Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 355 360 365 AAA GGT ATT GCT GAC ACG GTA GAA TCT ATT CCT GTA CCA GGA ACA GAT 1152

Lys Gly He Ala Asp Thr Val Glu Ser lie Pro Val Pro Gly Thr Asp 經濟部智慧財產局員工消費合作社印裂 370 375 380 TGG TTT GTT ACC AAT TTT GAT AGG GGG TTT GGA AAT AGG TTT TAT TAT 1200

Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr 385 390 395 400 AGA GGA AAG AGA TTA CTT TCT CAG CCT TGG TCC CAT TTA TCG CAT CAA 1248

Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin 405 410 415 GCT ATT CTC CCC AAT AAA AGC TAT CGA AAT CCA GAG ATT TAT CCC ACT 1296 -41 - 本纸ft μ K S 家標！（CNS)A]規格（210 X 公髮） 1245800 A7 B7 五、發明說明（39)

Ala lie Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu He Tyr Pro Thr 420 425 430 (請先閱讀背面之注意事項In'寫本頁) GAT CAA AAC ATT AAA ATC ACT AGT TCT CTC GAT TGC GAT CAT GGA GCT 1344

Asp Gin Asn lie Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala 435 440 445 TTT CTT GGT GGA ACC TCG CTT ATT ATC AAA GGC CAA CGT TTC AAT CAT 1392

Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu He lie Lys Gly Gin Arg Phe Asn His 450 455 460 AGA GAA TCG CAT GAT GTT GAA ACT GAA ATT AGT ATA CCT CTG TAT AAG 1440

Arg Glu Ser His Asp V?.l Glu Thr Glu He Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 CTT TCA TTA GAT GCT AGT AAA GGA TGC TCA TTG CGT TAT ATT TAT AGA 1488

Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg 485 490 495 ACT TTG TTu ATG AAA GAT GTA AAG TTG ACA GTA GCA TGT CAC TTT TCG 1536

Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 TTA AAA ACA AAC GAC TCA GTT AAT TTC TTC AAG GTA TGG CAG CCA GAT 1584

Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525 GAA AAT TTC TCT TTT GAA TAT GAT GAT GGA ATG AGA GCC ACT GTT ACA 1632

經脣部智慧財產局員工消費合作社印U

Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 ACT GAA AAT TCT ACC GAA AGC AGA TGC TTT TTA TTA CGT ACA ACA GAA 1680

Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 GAA GAT ACA GGA GAA AAT GAT TGG ATA ACA AAA ACT ATT AAT GTG CCT 1728

Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp He Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 575 -42 - 本 ΐ a S 家標進規格（210 ) 1245800 A； B7 五、發明說明（40) GCT GTT CCA GAA GGA AGT CAA TTA TAC ATT ACA AGA CTT GAA GTG AGC 1776

Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leii Glu Val Ser (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) ‘ 580 585 590 GTA GTA TTA GAT ACA GCT GGT TTA GTA GGT CTT GTT AAT CAA GTT ATT 1824

Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 GCT TGC TTG GGA TAT ATT AGC ATC ATA CCA ACT ATA AAT TCT GGA ATA 1872

Ala Cys Leu Gly Tyr lie Ser lie lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620 AAA ACA GAT TCA TCA CGC ATT ATT CAG GAT CTC TTT TGG AAA GAT CAG 1920 Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gin 625 630 635 640 :'AA TAT ACC AAA ATC GGA AAA GAA AGT TTA GAC GAC AT.； GCT CAA GAA 1968

Lys Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650.. 655 GAA GTT CAT AGA TAT TAT GGA ACA TTG AAC TGG GAA AAC ACA CCA AAT 2016

Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670 GTA GTA AAC GCT TGG GAG GAA ATA GAT TAC TAC AAC GTT TTT TAC AAA 2064

Val Val Asn Ala Trp Glu Glu lie Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 GAA AGT GAC GAC TCT GCA ACT CGC ATC TTT TTA GGA ACA GCA TTC TGT 2112 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg lie Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 AAT CAA TTT CGT GTA TCT GGT TTA GAT ATT ATT TTA TCT AAG CTA CCA 2160

Asn Gin Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp lie lie Leu Ser Lys Leu Pro 705 710 715 720 AAG ATA GTT ATT GAA GCT GTT AAC AAA GAA GGA TAC ATC TCT TCA AGT 2208

Lys He Val lie Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr He Ser Ser Ser -43- 1245800 A： B7 725 730 735 GGT AGC ATA GAT TTG TCA TTA AAC TAG 2235 Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 五、發明說明（41) 序列编號·· 3 序列之長度：744 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：蛋白質 序列

Met Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 1 5 10 15

Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30

Lys lie Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45

Asn Ala Leu Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60

Tyr Lys Glu Asp Lys Asn lie Gin Gly Asn Asn Tyr Lys Asp He Tyr 65 70 75 80

Asn lie Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95

Glu Arg Val Ser lie Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110

Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gin 115 120 125

Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 -44- 本家標準規格公复） ----：----_------裝--- (請先閱讀背面之注咅心事項HI寫本頁) · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 B7 五、發明說明（42 )

Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Leu 145 150 155 160

Yal Ala He Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn lie 165 170 175

Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190

Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205

He Pro Gly Ser Gin Leu He Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220

Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240

Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe lev Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255

Piv. Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Cly lie Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270

Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285

Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300

Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320

Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335

Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350

Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys ' 355 360 365

Lys Gly lie Ala Asp Thr Val Glu Ser lie Pro Val Pro Gly Thr Asp -45- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 五、發明說明（43) 370 375 380

Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項Hi寫本頁) 385 390 395 400

Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin 405 410 415

Ala lie Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr 420 425 430

Asp Gin Asn lie Lys He Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala 435 440 445

Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu lie lie Lys Gly Gin Ar^; Phe Asn His 450 455 460

Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu lie Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480

Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg 485 490 495

Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510

Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525

Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540

Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 545 550 555 560

Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp lie Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 575

Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 气

Val Val Leu Asp Thr Ala Gly、Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 -46- 本纸家標準（CNSM1規格f ) 1245800 Λ7 B7 五、發明說明（44) (請先閱讀背面之注意事項寫本I·)

Ala Cys Leu Gly Tyr He Ser He lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620

Lys Thr Asp Ser Ser Arg He He Gin Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gin 625 630 635 640

Lys Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650 655

Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670

Val Val Asn Ala Trp Glu Glu He Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 - 680 685

Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg lie Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 • 、.备 · <

Asn Gin Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp lie lie Leu Ser Lys Leu Flo 705 710 715 720

Lys lie Val lie Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr lie Ser Ser Ser 725 730 735

Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列編號：4 序列之長度：1〇 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鍵狀 -47- 本纸s .々0四家標準（CNS)A-l規格（210 X 297公) 1245800 A7 B7 五、發明說明（45) 序列之種類··胜肽 序列

Pro Ser Len Gin Len Gin Pro Asp Asp Lys 1 5 10 序列編號：5 序列之長度·· 2 0 序列之類型：核酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 CARTTRCARC CNGAYGAYAA 20 序列編號：6 序列之長度：15 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr Asp Gin Asn lie Lys 1 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --------^----裝--- (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) 序列編號：7 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鍵狀 -48- 本家標進丨規格（2U丨X29；·公釐） 1245800 Α7 Β7 五、發明說明（46) 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 CCHACNGAYC ARAAYATYAA 20 序列編號：8 序列之長度·· 2 0 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 TTRATRTTYT GRTCNGTDGG 20 序列編號：9 序列之長度：1 6 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Gly Gin Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu lie 15 10 15 序列編號：1 0 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 鍵數：一條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 -49- ----,----^------裝 (請先閱讀背面之注意事項m 寫本頁) . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（47) 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 TGRTTRAADC GYTGDCCYTT 20 序列編號：1 1 序列之長度：2 3 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀；直鍵狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 ATGCCTTCAC TTCAATTGCA ACC 23 序列編號：1 2 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 CTAGTTTAAT GACAAATCTA TGC 23 序列編號：13 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 -50- ---------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) · •線， 本口 因 S 家標退（CNSM1 規格（21G >. ) 1245800 A7 B7 五、發明說明（48) 序列之種類··其他核酸（合成DNA) 序列 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) CACTTAAGTC TATGAATGAG 20 序列編號：1 4 序列之長度：2 0 序列之類型：核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 AATCTCTGGA TTTCGATAGC 20 序列編號：15 序列之長度：4 1 序列之類型··核酸 鏈數：一條鏈 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：其他核酸（合成DNA) 序列 GGGGCGGCCG CTTTTATTTT ACATAAATAT GCCTTCACTT C 41 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列編號：16 序列之長度：3 8 序列之類型：核酸 鍵數：^條缝 拓樸形狀：直鏈狀 -51 - 本纸fc Hi丄V闷困家標進（CNSM-l規格（m! X 公t) 1245800 A7 B7 五、發明說明（49) 序列之種類··其他核酸（合成DNA) 序列 ---------------裝--- (請先閱讀背面之注咅？事項寫本頁) CCCGCGGCCG CCTAGTTTAA TGACAAATCT ATGCTACC 38 序列編號：17 序列之長度：1 〇 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys 1 5 10 序列編號：18 序列之長度：1 6 序列之類型；胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr Asp Gin Asn lie Lys 1 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 序列編號：19 序列之長度：16 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 -52- 1245800 A7 B7 五、發明說明（50) 序列

Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 1 5 10 序列編號·· 2 0 序列之長度：13 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類··胜肽 序列之特徵 存在位置：2 其他資料：Xaa=Met或Ser 序列

Lys Xaa Asp Arg Leu Phe Leu Cys Gly Gly Lys 1 5 10 序列编號：2 1 序列之長度：17 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列之特徵 存在位置：2 其他資料：Xaa=Gly或Met 序列之特徵 存在位置：3 -53- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝---- 訂---------, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印，¾ 五、發明說明（51) 其他資料：Xaa=Gln或Ala 序列之特徵 存在位置：4 其他資料：Xaa=Arg或Leu 序列之特徵 存在位置：6 其他資料：Xaa=Asn或Pro 序列之特徵 存在位置：8 其他資料：Xaa= Arg或Leu 序列之特徵 存在位置：9 其他資料：Xaa=Glu或Leu 序列之特徵 存在位置：1 0 其他資料：Xaa=Ser或Leu 序列之特徵 存在位置：1 1 其他資料：Xaa=His或Thr Lys Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Glu Thr Glu 1 5 10 15 lie 序列編號·· 2 2 序列之長度：1 6 -54- • I n —4 n I I ϋ H ϋ I ϋ I · I I (請先閱讀背面之注咅心事項寫本頁) 訂： 1245800 A7 B7 五、發明說明（52) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Glu Gly Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 1 5 10 15 序列編號：23 序列之長度：9 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Asn lie Gin Gly Asn Asn Tyr Lys 1 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印¾ 序列編號：2 4 序列之長度：1 1 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys 1 5 10 序列編號：2 5 序列之長度：8 -55- 本βϋ .ϋ:; @家標準（CNS)A；[規格（」10 497公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1245800 _B7_ 五、發明說明（53) 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys 1 5 序列編號：2 6 序列之長度：1 3 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類··胜肽 序列

Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys 1 5 10 序列編號：2 7 序列之長度：15 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列之特徵 存在位置：3 其他資料：羧甲基 序列 -56- 本呷中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----,----_------裝—— (請先閱讀背面之注意事項HI冩本頁) 訂. 1245800 A7 B7 五、發明說明（54)

Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg Thr Leu Leu Met Lys 1 5 10 15 (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) 序列編號：2 8 序列之長度·· 7 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：胜肽 序列之特徵 存在位置：6 其他資料：羧甲基 序列

Lys Leu Thr Val Ala Cys His 1 5 序列編號：2 9 序列之長度：15 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀；直鍵狀 序列之種類：胜肽 序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly Tyr Lys 1 5 10 15 序列編號·· 3 0 序列之長度：1 4 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 -57- 本纸張又复適丐中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1245800 — A/ B7 五、發明說明（55) 序列之種類：胜肽 序列 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

Lys Ser Met Asn Gin Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu Lys 1 5 10 序列編號：3 1 序列之長度：ίο 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Leu Ala Pro Val Ser Phe Ala Leu Lys 1 5 10 序列編號：3 2 序列之長度：2 3 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印s

Lys Gly Gin Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu 15 10 15 lie Ser He Pro Leu Tyr Lys 20 序列编號^ 3 3 序列之長度：2 2 -58- 1245800 A： B7 五、發明說明（56) (請先閱讀背面之注咅？事項Hi寫本頁) 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：胜肽 序列之特徵 存在位置：8 其他資料··羧甲基 序列

Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala Phe Leu Gly Gly 15 10 15

Thr Ser Leu lie lie Lys 20 序列編號：3 4 序列之長度：1 9 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 序列之種類：胜肽 序列

Lys Asn Glu Leu Phe Phe Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr 1 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Trp Trp Lys 序列編號：3 5 序列之長度：9 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鏈狀 -59- 本At义二ϋ Vhbi家標退(CNSMi規格（」u) x 公坌） 1245800 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A： B7_ 五、發明說明（57) 序列之種類：胜肽 序列 Lys lie Val lie Glu Ala Val Asn Lys 1 5 序列編號：3 6 序列之長度：1 1 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直鍵狀 序列之種類：胜肽 序列 Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys 1 5 10 序列編號：3 7 序列之長度：1 4 序列之類型：胺基酸 拓樸形狀：直键狀 序列之種類：胜肽 序列 Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys 1 5 10 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· -60- 本 At、： 3 家標進（CNSM1 規格 UK) 公s )

Claims (1)

1245餐版刪89號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(94年8月） A8 B8 C8 D8 # 8· 11¾:正 年月δ,二云補无 六、申請專利範圍n、t 1. 一種蛋白質，其為下列（a)、（b)或（c) ·· (a) 含有序列編號3所示之胺基酸序列之蛋白質； (b) 由序列編號3所示之胺基酸序列去除第1個Met而得 胺基酸序列所組成之蛋白質； (c) 含有序列編號3所示之胺基酸序列中1至10個胺基酸 被刪除、取代、插入或添加而得之胺基酸序列、且 具有内-石-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶活性之蛋白質； 序列編號· 3 Met Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30 Lys He Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45 Asn Ala Leu Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 Tyr Lys Glu Asp Lys Asn lie Gin Gly Asn Asn Tyr Lys Asp He Tyr 65 70 75 80 Asn He Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95 Glu Arg Val Ser He Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110 Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gin 115 120 125 Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 58316-940811.DOC · 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1245800 as B8 C8 D8 六、申請專利範園 Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Leu 145 150 155 160 Val Ala lie Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn He 165 170 175 Glu- Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190 Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 lie Pro Gly Ser Gin Leu lie Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 Lys. Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr * 245 250 255 Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly lie Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335 Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350 Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 58316-940811.DOC -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 355 360 365 Lys Gly lie Ala Asp Thr Val Glu Ser lie Pro Val Pro Gly Thr Asp 370 375 380 Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr 385 390 395 400 Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin -- 405 410 415 Ala lie Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr 420 425 430 Asp Gin Asn lie Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala 435 440 445 Phe Leu Gly Gly Thr Ser leu lie lie Lys Gly Gin Arg Phe Asn His 450 455 460 Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu lie Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 Leu* Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg 485 490 495 Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525 Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 58316-940811.DOC - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1245800 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp lie Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 - 575 Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 Ala Cys Leu Gly Tyr lie Ser lie lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620 Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe 丁卬 Lys Asp Gin 625 630 635 640 Lys- Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650 655 Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670 Val Val Asn Ala Trp Glu Glu lie Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg lie Phe Leu •Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 Asn Gin Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp lie lie Leu Ser Lys Leu Pro 705 710 715 720 Lys lie Val lie Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr lie Ser Ser Ser 725 730 735 Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 o 58316-940811.DOC -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1245800 A8 B8 C8 ___ D8 六、申請專利範圍 2. 一種内- A-n -乙醯基葡萄糖胺嘗酶，其特徵為具有下 列物理化學性質： (a) 以離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、羥基 磷灰石層析及等電點層析加以純化而得者； (b) 具有產生轉糖基反應之能力； (c) 分子量為85kDa ;及 (d) 由序列編號3所示之胺基酸序列所組成；由序列編 號3所示之胺基酸序列去除第1個Met而得胺基酸序 列所組成，或由序列編號3所示之胺基酸序列中1至 10個胺基酸被刪除、取代、插入或添加而得之胺基 酸序列所組成； 序列編號：3 Met Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 15 10 15 Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30 Lys lie Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45 Asn Ala Leu Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 Tyr Lys Glu Asp Lys Asn He Gin Gly Asn Asn Tyr Lys Asp lie Tyr 65 70 75 80 Asn He Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95 58316-940811.DOC . 5 . 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1245800 B8 C8 D8 六、申請專利範 圍 Glu Arg Val Ser He Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110 Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gin 115 120 125 Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Leu 145 150 155 160 Val Ala He Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn lie 165 170 175 Glir Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190 Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 lie Pro Gly Ser Gin Leu lie Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 Lys. Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255 Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly lie Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 58316-940811.DOC -6 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 8 8 8 8 A BCD 1245800 六、申請專利範圍 Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335 Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350 Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 355 360 365 Lys Gly lie Ala Asp Thr Val Glu Ser lie Pro Val Pro Gly Thr Asp 370 375 380 Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr 385 390 395 400 Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin 405 410 415 Ala He Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu He Tyr Pro Thr 420 425 430 Asp Gin Asn lie Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala 435 440 445 Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu lie lie Lys Gly Gin Arg Phe Asn His 450 455 460 Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu lie Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg 485 490 495 58316-940811.DOC 1245800 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525 Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp lie Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 575 Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 Ala Cys Leu Gly Tyr lie Ser lie lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620 Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gin 625 630 635 640 Lys- Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650 655 Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670 Val Val Asn Ala Trp Glu Glu lie Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg lie Phe Leu •Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 58316-940811.DOC - 8- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1245800 A8 B8 C8 ___ OS 六、申請專利範圍 Asn Gin Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp He lie Leu Ser Lys Leu Pro 705 710 715 720 Lys He Val lie Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr He Ser Ser Ser 725 730 735 Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 o 3 · —種基因’其係編碼如申請專利範圍第1項之蛋白質。 4 · 一種基因，其係編碼如申請專利範圍第2項之内_ -N- 乙醯基葡萄糖胺誓酶。 5. —種基因，其包含下列（a)或（b)之DNA : (a) 由序列編號2所示之驗基序列所組成之DN A ; (b) 與由序列編號2所示之鹼基序列所組成之DNA在嚴 苛條件下（鈉濃度為50至300mM，溫度為50至68°C )下雜交且編碼具有内-卢-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶 活性之蛋白質之DNA ; 序列編號：2 ATG CCT TCA CTT CAA TTG CAA CCT GAT GAC AAA CTA GCA CCT GTT TCT 48 Met Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 15 10 15 TTT GCA CTT AAG TCT ATG AAT GAG TTG AGG GAC TGG ACG CCA GAC GAA 96 Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30 AAG ATA AAG TTT AAC GTT TCA AGC GTG GCA CTA CAG CCT CGT GTG AAA 144 Lys lie Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45 58316-940811.DOC - 9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 AAC GCC CTG AAA CCT CAA TTA TTG TTA ACT CAT GAT ATG GCA GGA GGA Asn Ala Leu Lys Pro Gin Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 TAT AAA GAA GAT AAA AAT ATT CAA GGA AAC AAT TAT AAA GAC ATT TAT Tyr Lys Glu Asp Lys Asn lie Gin Gly Asn Asn Tyr Lys Asp lie Tyr 65 70 75 80 AAC ATT CAA TAT TGG CAT TTA GCT GAT ACT TTT GTA TAT TTC TCT CAT Asn lie Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95 GAG CGA GTT AGC ATT CCT CCA GTC AAT TGG ACA AAT GCT TGT CAT AGA Glu Arg Val Ser lie Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110 AAT GGT GTA AAG TGT TTA GGT ACT TTT TTA GTA GAA GGA AAT AAC CAA Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gin 115 120 125 ATG CAT GAA ATG GAA GCC TTG CTT CAC GGT CCA CCT TTA CTT AAT AAC Met -His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 ACT GAC GAC CCT ATG AGA TTA TGG AGT CCG TAT TAT GCA GAC CAA TTA Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Leu 145 150 155 160 GTT GCT ATT GCT AAA CAC TAT GGT 丁丁丁 GAT GGC TGG TTG TTC AAT ATT Val Ala lie Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn He 165 170 175 58316-940811.DOC - 10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 192 240 288 336 384 432 480 528 8 8 8 8 A B CD 1245800 六、申請專利範圍 GAA TGC GAA TTC TTT CCT TTT CCT ACA AAT CCA AAA TTC AAA GCT GAA Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190 GAG TTG GCA AAG TTT CTA CAC TAT TTT AAG GAA AAA TTG CAT AAC GAA Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 ATA CCT GGA TCT CAA CTC ATT TGG TAC GAC AGC ATG ACA AAT GAA GGA lie Pro Gly Ser Gin Leu lie Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 GAA ATC CAC TGG CAG AAC CAG CTC ACA TGG AAA AAT GAG TTA TTT TTT Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 AAA AAC ACG GAT GGT ATT TTT TTG AAT TAT TGG TGG AAA AAA GAA TAC Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255 CCT GAA ATG GCG CGT AGA GTA GCT GAA GGA ATA GGT AGA TCA GGT TTA Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly lie Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270 GAA GTT TAT TTT GGT ACA GAT GTA TGG GGA AGG CAT ACT TAT GGT GGC Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 GGT-GGT TTC AAA TCA TAT AAG GGT GTA AAA ACT GCC TAC TCT GCA ATG Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 58316-940811.DOC _ 11 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1245800 as B8 C8 D8 7T、 申請專利祀圍 ACA 丁 CT TCT GCA TTA TTT GGT ATG GCA TGG ACA TAC GAG CAT TTC GAA 960 Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr 'Tyr Glu His Phe 丨Glu 305 310 315 320 AAG TCT GAA TTT GAA AAG ATG GAT CGT TTG TTT TGG TGT GGT GGT AAA 1008 Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335 TAC TCT GAC TAT CCT CCC CCA CCT CCT AAA AAC CCA GAT GAC GAA AAA 1056 Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350 GAA GTA GAA AGC GAT GAT AGT GAA GAT GAG CTC ATG TAC GGA CAC AAG 1104 Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 355 360 365 AAA GGT ATT GCT GAC ACG GTA GAA TCT ATT CCT GTA CCA GGA ACA | GAT 1152 Lys Gly lie Ala Asp Thr Val Glu Ser He Pro Val Pro Gly Thr Asp 370 375 380 TGG TTT GTT ACC AAT TTT GAT AGG GGG TTT GGA AAT AGG TTT 丨 TAT . TAT 1200 Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr 385 390 395 400 AGA GGA AAG AGA TTA CTT TCT CAG CCT TGG TCC CAT TTA TCG < CAT ( ：AA 1248 Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin 405 410 415 GCT ATT CTC CCC AAT AAA AGC TAT CGA AAT CCA GAG ATT TAT ( ：CC ACT 1296 Ala lie Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr 420 425 430 58316-940811.DOC -12· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1245800 B8 C8 D8 *申請專利耗圍 GAT CAA AAC ATT AAA ATC ACT AGT TCT CTC GAT TGC GAT CAT GGA GCT 1344 Asp Gin Asn lie Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala - 435 440 445 TTT CTT GGT GGA ACC TCG CTT ATT ATC AAA GGC CAA CGT TTC AAT CAT 1392 Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu lie lie Lys Gly Gin Arg Phe Asn His 450 455 460 AGA GAA TCG CAT GAT GTT GAA ACT GAA ATT AGT ATA CCT CTG TAT AAG 1440 Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu He Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 CTT TCA TTA GAT GCT AGT AAA GGA TGC TCA TTG CGT TAT ATT TAT AGA 1488 Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr He Tyr Arg 485 490 495 ACT TTG TTG ATG AAA GAT GTA AAG TTG ACA GTA GCA TGT CAC TTT TCG 1536 Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 TTA AAA ACA AAC GAC TCA GTT AAT TTC TTC AAG GTA TGG CAG CCA GAT 1584 Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525 GAA AAT TTC TCT TTT GAA TAT GAT GAT GGA ATG AGA GCC ACT GTT ACA 1632 Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 ACT GAA AAT TCT ACC GAA AGC AGA TGC TTT TTA TTA CGT ACA ACA GAA 1680 Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 GAA GAT ACA GGA GAA AAT GAT TGG ATA ACA AAA ACT ATT AAT GTG CCT 1728 Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp lie Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 575 58316-940811.DOC -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）. 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 GCT GTT CCA GAA GGA AGT CAA TTA TAC ATT ACA AGA CTT GAA GTG AGC Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 GTA GTA TTA GAT ACA GCT GGT TTA GTA GGT CTT GTT AAT CAA GTT ATT Val'Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 GCT TGC TTG GGA TAT ATT AGC ATC ATA CCA ACT ATA AAT TCT GGA ATA Ala Cys Leu Gly Tyr lie Ser lie lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620 AAA ACA GAT TCA TCA CGC ATT ATT CAG GAT CTC TTT TGG AAA GAT CAG Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gin 625 630 635 640 AAA TAT ACC AAA ATC GGA AAA GAA AGT TTA GAC GAC ATA GCT CAA GAA Lys Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650 655 GAA GTT CAT AGA TAT TAT GGA ACA TTG AAC TGG GAA AAC ACA GCA AAT Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670 GTA GTA AAC GCT TGG GAG GAA ATA GAT TAC TAC AAC GTT TTT TAC AAA Val Val Asn Ala Trp Glu Glu lie Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 GAA AGT GAC GAC TCT GCA ACT CGC ATC TTT TTA GGA ACA GCA TTC TGT Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg lie Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 58316-940811.DOC - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1776 1824 1872 1920 1968 2016 2064 2112 A8 B8 C8 D«

AAT CAA TTT CGT GTA TCT GGT TTA GAT ATT ATT TTA TCT AAG CTA CCA 2160 Asn Gin Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp lie lie Leu Ser Lys Leu Pro 705 710 715 720 AAG ATA GTT ATT GAA GCT GTT AAC AAA GAA GGA TAC ATC TCT TCA AGT 2208 Lys lie Val lie Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr lie Ser Ser Ser 1245800 725 730 735 GGT AGC ATA GAT TTG TCA TTA AAC TAG 2235 Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 一種基因’其係編碼包含下表所示之胺基酸序列之蛋白 質之内- /S-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因，或與該内-乙醯基葡萄糖胺甞酶基因在嚴苛條件下（鈉濃度為5〇至 300mM，溫度為50至68°C)下雜交且編碼具有内-石-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶活性之蛋白質者： Met Pro Ser Leu Gia Leu Gin Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 1 5 10 I5 Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 3〇 Lys He Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 35 40 45 Asn Ala Leu Lys Pro Gin Lea Lea Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 Tyr Lys Giu Asp Lys Asn lie Gin Gly Asn Asa Tyr Lys Asp lie Tyr 65 70 75 80 Asa lie Gin Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 gg Glu Arg Vai Ser lie Pro Pro Val Asn Trp Thr Asa Ala Cys His Arg 100 105 lin ° -15- 58316-940811.DOC 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Asn Gly Yal Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asa Asn Gin 115 120 125 Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gin Lea 145 150 155 160 Val Ala He Ala Lys His Tyr Gly Ptie Asp Giy Trp Leu Phe Asq lie 165 170 175 Glu Cys Giu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Giu 180 185 190 Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 .lie Pro Gly Ser Gin Leu lie Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 Glu lie His Trp Gin Asn Gin Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 Lys Asn Thr Asp Gly lie Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255 Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly lie Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Yal Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly-Lys 325 330 335 Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350 Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 355 360 365 Lys Gly lie Ala Asp Thr Val Glu Ser lie Pro Val Pro Gly Thr Asp 370 375 380 Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr' Tyr 385 390 395 400 58316-940811.DOC - 16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）. 1245800 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gin Pro Trp Ser His Leu Ser His Gin 405 410 415 Ala lie Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu lie Tyr Pro Thr 420 425 430 Asp Gin Asn lie Lys lie Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala • 435 440 445 Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu lie lie Lys Gly Gin Arg Phe Asn His 450 455 460 Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu lie Ser lie Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr lie Tyr Arg 485 490 495 Thr Leu Lea Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gin Pro Asp 515 520 525 Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 Thr Giu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp lie Thr Lys Thr lie Asn Val Pro 565 570 575 Ala Val Pro Glu Gly Ser Gin Leu Tyr lie Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gin Val lie 595 600 605 Ala Cys Leu Gly Tyr lie Ser lie lie Pro Thr lie Asn Ser Gly lie 610 615 620 Lys Thr Asp Ser Ser Arg lie lie Gin Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gin 625 630 635 640 Lys Tyr Thr Lys lie Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp lie Ala Gin Glu 645 650 655 Glu Val His Arg T.yr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala^Asn 660 665 670 Val Val Asn Ala Trp Glu Glu lie Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 58316-940811.DOC - 17 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1245800 A8 B8 C8

Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Ar? tu T 690 6^r He Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys Asn Gin Phe Arg Yal Ser Gly Leu Asd n T1 700 705 了 1Q U ASP Ue ^ Leu Ser Lys Leu Pro Lys lie Yal lie Glu Ala Val Asn ίνς n r 720 725 " LyS GluGlyTyrIle Ser Ser Ser 735 Gly Ser lie Asp Leu Ser Leu Asn 740 7.根據申請專利範圍第3至6項Φ权成、甘π 只〒任一項之基因，其中該 基因來自屬於白黴菌屬（Muc〇r)之微生物。 8·根據申請專利範圍第7項之基因，其中該屬於白黴菌屬 之微生物為冬季白黴菌（Muc〇r hiemaHs)。 9 · 一種重組載體，其係含有如申請專利範圍第3至8項中 任一項之基因。 ' 1 0 · —種轉形體，其係含有如申請專利範圍第9項之重組載 體。 1 1 · 一種酶之製造方法，其特徵為培養如申請專利範圍第 1 0項之轉形體，然後從所得培養物收取具有内-/3 -N-乙醯基葡萄糖胺：y：酶活性之酶。 1 2. —種内-石-N-乙醯基葡萄糖胺甞酶，其特徵為具有下列 物理化學性質： (a) 以離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析、羥基 磷灰石層析及等電點層析加以純化而得者； (b) 具有產生轉糖基反應之能力， (c) 分子量為85kDa ;及 (d) 胺基酸序列係包含序列編號17至22之序列·· 18- 58316-940811.DOC 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 序列編號：1 7 Pro Ser Leu Gin Leu Gin Pro Asp Asp Lys 1 5 10 序列編號：1 8 Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu He Tyr Pro Thr Asp Gin Asn He Lys 1 5 l〇 15 序列編號·· 1 9 Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gin Pro Arg Val Lys 1 5 10 序列編號：2 0 存在位置：2 其他資料：Xaa=Met or Ser Lys Xaa Asp Arg Leu Phe Leu Cys Gly Gly Lys 1 5 10 序列編號：2 1 存在位置：2 其他資料·· Xaa=Gly 〇r Met 存在位置：3 其他資料：Xaa=Gln or Ala 58316-940811.DOC - 19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210χ 297公釐） 1245800 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 存在位置： 4 其他資料： Xaa=Arg or Leu 存在位置： 6 其他資料： Xaa=Asn or Pro 存在位置： 8 其他資料： Xaa=Arg or Leu 存在位置： 9 其他資料： Xaa=Glu or Leu 存在位置： 10 其他資料： Xaa=Ser or Leu 存在位置： 11 其他資料： Xaa=His or Thr Lys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa His 1 5 lie- 序列編號： 22 10 15 Lys Glu Gly Tyr lie Ser Ser Ser Gly Ser He Asp Leu Ser Leu Asn 10 15 58316-940811.DOC 20 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)