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KR102000383B1 - 만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 포스포-6-만노스로의 가수분해 - Google Patents

만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 포스포-6-만노스로의 가수분해 Download PDF

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KR102000383B1
KR102000383B1 KR1020177028666A KR20177028666A KR102000383B1 KR 102000383 B1 KR102000383 B1 KR 102000383B1 KR 1020177028666 A KR1020177028666 A KR 1020177028666A KR 20177028666 A KR20177028666 A KR 20177028666A KR 102000383 B1 KR102000383 B1 KR 102000383B1
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한 카렐 리마우트
캐슬린 카밀라 텔레스포르 알리다 마리아 피엔스
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유니버시테이트 젠트
브이아이비 브이지더블유
옥시레인 유케이 리미티드
브리제 유니버시타이트 브루셀
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Abstract

올리고당에서의 만노스-6-인산 잔기(mannose-6-phosphate residue)의 캡핑제거 (uncapping)에 유용한 방법 및 유전적으로 조작된 세포(genetically engineered cells )를 본원에서 기재하였다.

Description

만노스-1-포스포-6-만노스 결합의 포스포-6-만노스로의 가수분해 {HYDROLYSIS OF MANNOSE-1-PHOSPHO-6-MANNOSE LINKAGE TO PHOSPHO-6-MANNOSE}
관련 출원에 대한 전후 참조(CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS)
본 출원서(application)는 2009년 9월 29일에 출원된 미국 출원 번호(U.S. Application Serial) No. 61/246,847 에 대한 우선권(priority)을 주장한다. 상기 우선된 출원서(the prior application)의 내용은 이의 전체가 참고문헌으로서 포함된다.
본 발명은 당단백질(glycoproteins)에서의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해 방법, 및 특히 당단백질에서의 포스포-6-만노스 잔기의 캡을 제거하기 위해(to uncap the phospho-6-mannose residues on the glycoprotein), 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해하기 위해 만노시다제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
고성능의 발현 시스템(High performance expression systems)은 성장(development) 하에 현재 대부분의 생물약제학적 약품(biopharmaceuticals)[예를 들어, 재조합 단백질(recombinant proteins)]을 생산하기 위해 필요하다. 이러한 생물약제학적 약품 중의 많은 것들의 생물학적 활성도는 이들의 번역 후 변형(post-translational modification)[예를 들어, 인산화반응(phosphorylation) 또는 글리코실화반응(glycosylation)]에 의존한다. 효모-기반 발현 시스템(yeast-based expression system)은 미생물 유기체(microbial organism)의 유전적인 조작(genetic manipulation) 및 발효의 편이성(ease)과 단백질의 분비 및 변형을 위한 능력을 겸비하고 있다. 그러나, 효모 세포에서 생산된 재조합 당단백질은 주로 이종의 고-만노스(heterogeneous high-mannose) 및 하이퍼-만노스 글리칸 구조(hyper-mannose glycan structures)를 나타내고, 이는 단백질의 기능(protein function), 하류 공정(downstream processing), 및 특히 당단백질이 생물학적으로 중요한 역할을 하는, 후속의 치료상의 용도(subsequent therapeutic use)에 해로울 수 있다.
미국 출원 번호 No. 12/062,469 는 이의 전체가 참고문헌으로서 포함된다.
본 발명은 적어도 그 일부에서, 당단백질에서의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 만노시다제의 발견(discovery)에 근거한다. 예를 들어, 만노시다제는 캡핑이 제거된 말단 만노스-6-인산 잔기(uncapped terminal mannose-6-phosphate residues)를 포함하는 당단백질을 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 당단백질을 수득하는 생체 외(In vitro) 및 생체 내(in vivo) 방법은 본원에 기재되어 있다. 유전적으로 조작된 세포(Genetically engineered cells)는 캡핑이 제거된 말단 만노스-6-인산 잔기를 갖는 타겟 분자(target molecules)를 생산하기 위한 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 문서는 올리고당(oligosaccharide)에서 만노스-6-인산 잔기의 캡핑을 제거하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 갖는 올리고당을 제공하는 단계; 및 만노스-1-포스포-6-만노스 결합(mannose-1-phospho-6-mannose linkage)을 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제(mannosidase)와 상기 올리고당을 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉 단계는 정제된 만노시다제(purified mannosidase), 재조합 만노시다제(recombinant mannosidase), 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 세포 용해액(cell lysate), 또는 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 균류 세포(fungal cell)를 사용하여 실행할 수 있다. 만노시다제는 타겟팅 신호(targeting sequence)를 포함할 수 있다. 올리고당은 단백질[예를 들어, 균류 유기체(fungal organism)에서 발현된 인간 단백질(human protein)]에 부착될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 문서는 말단 포스포-6-만노스 잔기(terminal phospho-6-mannose residues)를 갖는 타겟 단백질(target protein)을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는(encoding) 핵산을 포함하기 위해 유전적으로 조작된 균류 세포를 제공하는 단계; 및 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 세포 내로 도입시키는(introducing) 단계를 포함하고, 여기에서 상기 세포는 말단 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 타겟 단백질을 생산한다.
본 문서는 균류 유기체(fungal organism)에서 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질을 생산하기 위한 방법을 또한 특징으로 한다. 상기 방법은, 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하기 위해 유전적으로 조작된, 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 균류 세포를 제공하는 단계; 및 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 균류 세포는 만노실 인산화반응(mannosyl phosphorylation)을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 포함할 수 있고/포함할 수 있거나, OCH1 활성도(OCH1 activity)가 결핍되게 유전적으로 조작될 수 있다.
본 문서는, 말단 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 생산하기 위해 유전적으로 조작된 분리된 균류 세포(isolated fungal cell)를 또한 특징으로 한다. 상기 균류 세포는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 여기에서 균류 세포에서 만노시다제의 발현(expression)은 말단 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 생산한다. 상기 균류 세포는 타겟 당단백질 단백질(target glycoprotein protein)을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 문서는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta), 또는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포의 실질적인 순수 배양물(substantially pure culture)로서, 이들 중 상당수는 말단 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 생산하기 위해 유전적으로 조작되었고, 상기 세포는 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 포스포-6-만노스로 가수분해시킬 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 균류 유기체(fungal organism)는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)일 수 있다. 균류 유기체는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 메탄올자화효모(methylotrophic yeast)일 수 있다. 균류 유기체는, 사상 균류(filamentous fungus)[예를 들어, 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투수(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플래브스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigates), 아스페르길루스 글라우크스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오라자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소예(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 및 아스페르길루스 베르시컬러(Aspergillus versicolor)로 이루어진 군으로부터 선택된 사상 균류]일 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 상기 단백질은, 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있다. 상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소[예를 들어, 산성 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase) 또는 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase)와 같은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder, LSD)과 관련된 리소좀 효소]일 수 있다. 상기 LSD는 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
Figure 112017097690755-pat00001
)을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)일 수 있다. 예를 들어, LSD 는 폼피병(Pompe disease) 또는 파브리병(Fabry's disease)일 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 상기 만노시다제에 대해서, 아미노산 곁사슬(amino acid side chains)에서의 원자의 삼차원의 단백질 좌표(three dimensional protein coordinates)는 도 33 에서의 등가의 원자(equivalent atoms)의 좌표의 1.5 Å 편차(deviation) 내의 범위에 들어가는 최소의 촉매 중심(minimal catalytic center)에 위치한다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 에 나타낸 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 50 에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일성(identity)[예를 들어, 적어도 95 % 또는 98 % 동일성]을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 만노시다제는 하기를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다: (i) GVGXXGXGG 모티프(motif), 이 식에서, X 는 Gly, Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 이다; (ii) VRXE 모티프, 이 식에서, X 는 Pro 외의 모든 아미노산이다; (iii) X1YQGX2 모티프, 이 식에서 X1 은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr 또는 Met 이고, X2 는 Thr, Ser, 또는 Asn 이다; 또는 (iv) GDXGN 모티프, 이 식에서 X 는 Pro 외의 모든 아미노산일 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 상기 만노시다제는 C. 셀룰란스(C. cellulans), 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 또는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 만노시다제일 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드[예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S.세레비시아(S. cerevisiae), 오가테아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(C. albicans) 폴리펩티드와 같은 MNN4 폴리펩티드]를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있고 및/또는 OCH1 활성도가 결핍되게 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드는 P. 파스토리스 PN01 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 기재된 실시형태 중 하나에서, 상기 만노시다제는, 세포내 구간(intracellular compartment)에 상기 만노시다제를 타겟시키기 위해 분비 신호(secretion signal) 및/또는 타겟팅 신호(targeting signal)를 포함할 수 있다. 타겟 단백질 및 만노시다제는 공동 분비될(co-secreted) 수 있다.
본 문서는 말단 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 분리된 당단백질을 특징으로 하고, 여기에서 상기 단백질은 본원에 기재된 방법으로 생산되었다.
또 다른 양상에서, 본 문서는 당단백질을 포함하는 조성물을 특징으로 하고, 여기에서 당단백질에서의 N-글리칸(N-glycans)의 적어도 47 % 는 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는다. 예를 들어, 당단백질에서의 N-글리칸(N-glycans)의 적어도 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 또는 90 % 는 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는다.
본 문서는, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14 에 나타낸 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence), 또는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, 또는 SEQ ID NO:20 와 적어도 90 % 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산(isolated nucleic acid)을 또한 특징으로 한다. 본 문서는 앞에 언급한 핵산에 실시가능하게 연결된 프로모터(promoter operably linked to such a nucleic acid)를 포함하는 벡터를 또한 특징으로 하고, 여기에서 핵산은 만노시다제를 코드화한다. 핵산은 세포내 구간에 만노시다제를 타겟시키기 위해 분비 신호(secretion signal) 또는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 포함할 수 있다.
별도로 나타내지 않았다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이러한 본 발명에 속하는 본 분야에서의 통상적인 기술 중의 하나로 보통 이해된 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본원이 기재된 이러한 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질은 본 발명의 실행(practice) 또는 테스트에 사용될 수 있긴 하지만, 대표적인 방법 및 물질은 하기에 기재되어 있다. 모든 출판물(publications), 특허 출원서(patent applications), 특허(patents), Genbank® 수납 번호(Accession Nos) , 및 본원에서 언급된 그 밖의 참고문헌은 이들의 전체가 참고문헌으로서 포함된다. 상충되는 경우에(In case of conflict), 정의(definitions)를 포함하는 본 특허 출원서가 조절할 것이다(control). 상기 물질, 방법 및 예는 설명적일 뿐, 이로 제한하려는 의도는 아니다.
본 발명의 그 밖의 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 분명할 것이다.
도 1 은 pYLTmAX 및 pYLTmAXMnn4 구조물(constructs)의 도식도(schematic)이다.
도 2 는, MTLY60△och1[Mnn4 의 1 야생형 복제물(wild type copy)], MTLY60△och1 + Hp4dMnn4(1WT + Mnn4 의 여분의 복제물) 및 MTLY60△och1 + Hp4dMnn4 + TEFMnn4의 당 분석(sugar analysis)을 나타내는 일렉트로페로그램 (electroferograms)의 시리즈(series)이다. P 는 단일인산화된 피크(monophosphorylated peak)를 나타내고, PP 는 이인산화된 피크(diphosphorylated peak)를 나타내고, Man8 은 Man8GlcNAc2 피크를 나타낸다.
도 3 은, 포유동물 및 효모 글리칸 인산화반응 경로(mammalian and yeast glycan phosphorylation pathways)의 도식도이다. 포유동물의 글리칸 인산화반응 경로는 Man8GlcNAc2 글리칸에 GlcNAc-인산전달효소(phosphotransferase)에 의해 촉진된(catalyzed) 포스포-GlcNAc를 첨가한 다음에, 언커버링 효소(uncovering enzyme)에 의해 인산염(phosphate)을 노출시키기 위해 GlcNAc의 디캡핑(decapping)을 포함한다. 이와 대조적으로, 효모 글리칸 인산화반응은 Man8GlcNAc2 글리칸에 포스포-만노스의 첨가를 포함하지만, 어떠한 내생 효소(endogenous enzyme)는 인산염을 노출시키기 위해 만노스의 캡을 제거하기(uncap) 위해 제시되지 않았다.
도 4 는 C. 셀룰란스(C. cellulans) 배지로부터의 상청액(supernatants)과 함께 상이한 시간 프레임(different time frames)[7 hrs, 8 hrs, 또는 밤새(overnight, ON)] 동안 처리된 스트레인(strain) MTLY60△och1 + Hp4dMnn4 + TEFMnn4 으로부터 유도된 N-글리칸을 나타낸 일렉트로페로그램의 시리즈이다.
도 5 는 포스파타아제(CIP) 배양 없이 및 포스파타아제(phosphatase)와 함께 C. 셀룰란스 상청액(SN)으로 처리된 MNN4 과잉발현된 스트레인(overexpressing strain)으로부터 유도된 N-글리칸을 나타내는 일렉트로페로그램의 시리즈이다.
도 6 은 나타낸 MW 에서의 용리액 일부(elution fractions)의 흡광 단위(absorbance units)의 그래프이다. 각각의 용리액 일부는 ~ 500 μl 이다.
도 7 은, 실리카-기초 겔 여과(silica-based gel filtration)[각각의 분획(each fraction)의 250 μl 은 침전된(precipitated) DOC/TCA 이다]로부터의 용리액 일부(elution fractions)의 전기영동법(electrophoresis) 후의 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 나타낸 것이다. 박스표시된 밴드(boxed band)는 질량 분광분석기(tandem mass spectrometry)(MS/MS)를 사용한 펩티드 질량 지문분석(peptide mass fingerprinting) 및 드 노보 시퀀싱(de novo sequencing)에 적합하다.
도 8A 는 CcMan1[즉, C. 셀룰란스로부터의 만노시다제 후보물질(candidate) 1]을 코드화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:6)[콘틱(contig) 1003 에서]이고, 이는 MS/MS 드 노보 시퀀싱에서 확인되었다. 도 8B 는 신호 서열을 포함하는[볼드체(in bold)], CcMan 1 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:7)이다. 신호 서열 없는 CcMan 1 폴리펩티드의 예측된 분자량은 92.6 kDa 이다.
도 9A 는 CcMan2 를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:8)(콘틱 774에서)이고, 도 9B 는 신호 서열(signal sequence)(볼드체)을 갖는 CcMan2의 아미노산 서열(SEQ ID NO:9)이다. 신호 서열 없는 CcMan2 폴리펩티드의 예측된 분자량은 121.6 kDa 이다.
도 10A 는 CcMan3 을 코드화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:10)(콘틱 774에서)이고, 도 10B 는 신호 서열(볼드체)을 갖는 CcMan3 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:11)이다. 신호 서열 없는 CcMan3 폴리펩티드의 예측된 분자량은 116 kDa 이다.
도 11A 는 CcMan4 를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:12)(콘틱 1237에서)이고, 도 11B 는 신호 서열(볼드체)을 갖는 CcMan4 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:13)이다. 신호 서열 없는 CcMan4 폴리펩티드의 예측된 분자량은 184 kDa 이다.
도 12A 는 CcMan5 를 코드화하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:14)(콘틱 896에서)이다. 도 12B 는 신호 서열(볼드체)을 갖는 CcMan5 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:15)이고, 도 12C 는 신호서열이 없는 CcMan5 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:50)이다. 신호 서열 없는 CcMan5 폴리펩티드의 예측된 분자량은 173 kDa 이다.
도 13 은, N-말단에 태그된(tagged)(pYLPNtCcMan1-5) 또는 C-말단에 태그된(pYLPCtCcMan1-5), 야로위아 리폴리티카(pYLPSecCcMan1-5)에서의 분비된 단백질로서, 야로위아 리폴리티카의 분비경로(secretory pathway)에 타겟된(targeted) 단백질로서, E. coli (pET25-Man)의 주변 세포질(periplasm)에서의 CcMan1-5 의 발현을 위한 발현 플라스미드(expression plasmid)의 예를 포함한다.
도 14 는, E. coli 에서의 발현에 적합한(optimized) 코돈인 CcMan1의 뉴클레오티드 서열이다(SEQ ID NO:16).
도 15 는, E. coli 에서의 발현에 적합한 코돈인 CcMan2의 뉴클레오티드 서열이다(SEQ ID NO:17).
도 16 은, E. coli 에서의 발현에 적합한 코돈인 CcMan3의 뉴클레오티드 서열이다(SEQ ID NO:18).
도 17 는, E. coli 에서의 발현에 적합한 코돈인 CcMan4의 뉴클레오티드 서열이다(SEQ ID NO:19).
도 18 는, E. coli 에서의 발현에 적합한 코돈인 CcMan5의 뉴클레오티드 서열이다(SEQ ID NO:20).
도 19 는, pLSAH36 및 pLSH36 벡터의 도식도 및 벡터 내로 C. 셀룰란스 유전자를 도입하기 위한 클로닝 전략(cloning strategy)이다.
도 20 은, E. coli 세포를 발현시키는 CcMan4 및 CcMan5의 주변세포질의 분획(periplasmic fraction)의 분석을 나타낸 일렉트로페로그램의 시리즈이다. 분석은 DNA 시퀀서-지원된, 형광단-지원된 탄수화물 전기영동(DNA sequencer-assisted, fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, DSA-FACE)을 사용하여 실행하였다. 첫 번째 및 두 번째 패널(panel)은 각각 RNaseB로부터의 덱스트란 레더(dextran ladder) 및 당을 나타낸다. 세 번째 패널은, 모노 만노인산화된(mono mannophosphorylated) Man8GlcNAc2 피크(peak)에 해당하는 "P", 더블 모노만노인산화된(double mannophosphorylated) Man8GlcNAc2 피크에 해당하는 "PP", 및 Man8GlcNAc2 에 해당하는 "Man8" 을 갖는 처리되지 않은 Mnn4 당이다. 패널 4 내지 9 는 차후에 송아지 장내의 포스파타제(calf intestinal phosphatase, CIP) 소화(digest)시키거나 시키지 않은, 나타낸 주변 세포질(indicated periplasm)과 함께 배양시킨 Mnn4 글리칸으로 수득된 결과이다.
도 21 은, Zhu et al., Nat. Chem. Biol., 6(2):125-32. Epub 2009 Dec 27 (2010)에 기재된 Bt3990(744 AA) 및 Bt2199(739 AA)과 함께 CcMan4(1759 AA) 및 CcMan5(1650 AA)의 도식적인 평면도(schematic alignment)이다.
도 22 는, E. coli 세포의 발현으로부터 수득된 CcMan4 및 CcMan5 효소의 분석을 나타낸 일렉트로페로그램의 시리즈이다. 분석은 기질(substrate)로서의 글리칸(MNN4 글리칸 또는 MNN4 당을 나타냄)을 유도하는(derived) MNN4 과잉발현된 스트레인을 사용한 DSA-FACE 를 사용하여 실행하였다. 첫 번째 패널은 덱스트란 레더를 나타내고, 두 번째 패널은 처리되지 않은 Mnn4 당을 나타낸다. 세 번째 내지 여섯 번째 패널에서, CcMan4domain 주변 세포질 분획(periplasmic fraction)과 함께 배양시킨 당은 유도되지 않았고, IPTG 와 함께 18 ℃에서 밤새 유도시켰고, CcMan5domain 주변 세포질 분획은 유도되지 않았고, IPTC 와 함께 18 ℃ 에서 밤새 유도시켰다. 마지막 패널은 RNaseB 로부터의 당을 나타낸다.
도 23 은, N-말단 β-샌드위치 도메인(잔기 8-271: 회백색), α-나선형 링커(α-helical linker)(잔기 272-290; 흑색) 및 (αα)6 바렐 도메인(barrel domain)(잔기 291-771; 암회색)으로 이루어진 CcMan51-774. CcMan51-744 을 나타낸 리본(ribbon)이다. 촉매의 Ca2+ 는 구체(sphere)로서 나타내었다.
도 24 는, 막대기 표시(stick representation)에 나타낸 기질 결합 부위(substrate binding site)를 선으로 그은(lining) 곁사슬을 갖는 CcMan51-774 단백질 백본(backbone)을 나타낸 리본(ribbon)이다. 탄소, 산소 및 질소 원자는 각각 회백색, 희색 및 암회색으로 나타내었다. 촉매 중심(catalytic center)에서의 Ca2+ 이온 및 물 W1, W2, W3 및 W4 는 구체로서 나타내었다.
도 25 는, 막대기로 나타낸 만노스-1-포스포-6-만노스의 모델이 되는 위치(modeled position) 및 기질 결합 부위를 선으로 그은 곁사슬을 갖는 CcMan51-774 단백질 백본(backbone)을 나타낸 리본이다. 탄소, 산소 및 질소 원자는 각각 회백색, 희색 및 암회색으로 나타내었다. 촉매 중심(catalytic center)에서의 Ca2+ 이온 및 물 W1, W2, W3 및 W4 는 구체로서 나타내었다[비교를 위해, 기질 02 및 03 히드록실 기로 치환될 수 있는 W2 및 W3 의 위치를 여전히 나타냄]. 황색, 적색 및 흑색의 점선(dashed line)은 Ca2+ 를 갖는 배위 결합(coordination bond), 제안된 친핵성 물(proposed nucleophilic water)(W4)을 갖는 H-결합(H-bonds) 및 각각 -1 부위 만노스(site mannose) 및 포스페이트(phosphate)를 갖는 H-결합을 나타낸다. -1 부위 만노스는 이의 바닥 상태의 의자 입체형태(ground state chair conformation)를 모델로 한다. 촉매 작용 동안에, 이의 02 히드록실은 적도 좌표면(equatorial coordination plane)에서, W2 에 대해 나타낸 보다 가까운 위치를 점령할 수 있고, 이로 인하여 만노스 -1 고리(ring)에서의 반의자 형태(half-chair conformation)에 대한 뒤틀림(distortion)을 유도하고, C1 탄소[화살표(arrow)]에서의 친핵성 물(W4)의 라인 공격(line attack)을 가능하게 한다.
도 26A 는, 볼드체에서의 lip2 pre 서열 및 밑줄쳐진 Myc His 태그(tag)를 갖는 α-갈락토시다아제A(GalactosidaseA)를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 최적화된 Y. 리폴리티카 코돈이다(SEQ ID NO:22). 도 26B 는, 볼드체에서의 lip2 pre 서열 밑줄쳐진 Myc His 태그(tag)를 갖는 I-갈락토시다아제A(GalactosidaseA)의 아미노산 서열이다(SEQ ID NO:23).
도 27A 는, 볼드체에서의 lip2 pre 서열을 갖는 인간 알파 갈락토시다아제(GAA)의 뉴클레오티드 서열이 최적화된 코돈이다(SEQ ID NO:24). 도 27B 는, 볼드체에서의 lip2 pre 서열을 갖는 인간 GAA의 아미노산 서열이고(SEQ ID NO:25), 여기에서 * 는 종결 코돈(stop codon)을 나타낸다.
도 28 은, huGAA 의 클로닝에 사용된 Y. 리폴리티카 발현 벡터(expression vector)의 도식도이다.
도 29 는, E. coli 세포의 주변 세포질 분획으로부터 유도된 CcMan5 와 함께 huGAA의 처리의 분석을 나타낸 일렉트로페로그램의 시리즈이다. 분석은 DSA-FACE를 사용하여 실행하였다.
도 30 은, CcMan5의 최소의 촉매 중심(minimal catalytic center)을 나타낸 것이다. SEQ ID NO:50 에서의 등가의 잔기(equivalent residues)의 넘버링(numbering)은 괄호에 나타내었다. 1: Q (Q536); 2: N/D-E/Q (N588-Q589); 3: D/E (D355); 4: R (R405); 5: D/E-X-D/E (D660-X-D662); 6: G-G (G71-G72); 및 7: T/S/G (T626).
도 31 은, MUSCLE(MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)을 사용한 CcMan5 의 아미노산 서열[SEQ ID NO:50, 신호 펩티드가 없는 SEQ ID NO:15 에 나타낸 아미노산 서열] 및 이의 동족체(homologs) 중의 10의 배열(alignment)이다. NP_630514 스트렙토마이세스(Streptomyces), SEQ ID NO:26; ZP_02866543 클로스트리디움(Clostridium), SEQ ID NO:27; NP_812442 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:28; YP_003584502 주농왕기아(Zunongwangia), SEQ ID NO:29; YP_003120664 키티노파가(Chitinophaga), SEQ ID NO:30; AAK22560 카울로박터(Caulobacter), SEQ ID NO:31; ACL94075 카울로박터(Caulobacter) , SEQ ID NO:32; ACT03290 패니바실러스(Paenibacillus), SEQ ID NO:33; ACU59240 키티노파가(Chitinophaga), SEQ ID NO:34; ACU05553 페도박터(Pedobacter), SEQ ID NO:35.
도 32 는, MUSCLE을 사용한 CcMan5의 아미노산 서열(SEQ ID NO:50) 및 이의 동족체 중의 19 의 배열이다. 스트렙토마이세스(Streptomyces) NP_630514, SEQ ID NO:26; 스트렙토마이세스(Streptomyces) ZP_02866543, SEQ ID NO:36, ZP_06527366 스트렙토마이세스(Streptomyces), SEQ ID NO:37; YP_003013376 패니바실러스(Paenibacillus), SEQ ID NO:38; NP_812442 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:28; ZP_04848482 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:39; ZP_03677957 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:40; YP_003584502 주농왕기아(Zunongwangia), SEQ ID NO:29; ZP_01061975 레이우엔훅키엘라(Leeuwenhoekiella), SEQ ID NO:41; ZP_07083984 스핀고박테리움(Sphingobacterium), SEQ ID NO:42; YP_003120664 키티노파가(Chitinophaga) , SEQ ID NO:30; ZP_01885202 페도박터(Pedobacter), SEQ ID NO:43; ZP_02866543 클로스트리디움(Clostridium), SEQ ID NO:27; XP_367221 마그나포르테(Magnaporthe), SEQ ID NO:44; ZP_07042437 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:45; ZP_05759807 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:46; ZP_05287524 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:47; ZP_06076108 박테로이데스(Bacteroides), SEQ ID NO:48; YP_001302992 파라박테로이데스(Parabacteroides), SEQ ID NO:49.
도 33 은, CcMan51-774 의 활성 부위(active site)를 둘러싸는 잔기의 구조적인 좌표(structural coordinates)를 포함한다.
도 34 는, PDB entry 2xsg에서의 비대칭의 유닛(asymmetric unit)에서의 두 가지의 CcMan51-774 분자의 촉매의 Ca2+ 원자 및 단백질 C 알파 원자를 포함하고, 단백질의 전체적인 접힌 부분(fold)을 나타낸다.
일반적으로, 본 문서는 캡핑이 제거된(uncapped) 포스포-6-만노스 잔기(M6P) 잔기를 갖는 타겟 분자(target molecules)(예를 들어, 타겟 단백질)를 생산하도록 당단백질에서의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해하기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 본원에 기재된 방법 및 물질은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders, LSDs)을 갖는 환자를 치료하기 위한 제제를 생산하는데 특히 유용하고, 유전적인 대사 질환(hereditary metabolic disorders)의 다양한 군은, 이들의 분해를 포함하는 이화작용 효소(catabolic enzymes)의 손상된 활성도 때문에 리소좀에서의 저장 생산물(storage products)의 축적에 의해 특징지어진다. 저장 생산물의 증가(build-up)는 세포의 역기능(cell dysfunction) 및 점진적인 임상적인 징후(progressive clinical manifestations)로 이어진다. 투여된 효소가 질병에 걸린 세포의 리소좀을 타겟될(targeted) 수 있는 경우에, 이화작용 효소에서의 결핍증(Deficiencies)은 효소 보충 요법(enzyme replacement therapy)에 의해 고쳐질 수 있다. 리소좀 효소(Lysosomal enzymes)는 일반적으로, 소포체(endoplasmic reticulum)에서 합성되고, 골지(Golgi)에서의 분비 경로(secretory pathway)를 통해 수송된 다음에 리소좀에 채용되는(recruited) 당단백질이다. 리소좀 효소가 리소좀에 전달되는 하나의 방식은 양이온-의존(cation-dependent, CD) 만노스 6-인산 수용체(mannose 6-phosphate receptor, MPR)를 통한다. M6P 말단 글리칸(terminal glycans)은 분비 경로로부터의 리소좀 효소의 분류(sorting)를 중재하고, 리소좀에 효소를 수송하는 두 가지의 MPRs 에 의한 후기골지망(trans-Golgi network, TGN)에서 인지된다. 본원에서 기재된 방법 및 물질을 사용하여, 미생물의 기저 생산 공정(microbial based production process)은 캡핑이 제거된(uncapped) M6P 글리칸을 갖는 치료상의 단백질(therapeutic proteins)을 수득하는데 사용될 수 있고, 이는 동일한 M6P 의존 경로(M6P dependent pathway)를 이용하여 리소좀으로 수송할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 물질은 LSDs 와 같은 대사성 질환의 치료를 위한 당단백질을 제조하는데 유용하다.
만노시다제(Mannosidases)
본 문서는 올리고당에서 말단의 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 만노시다제 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산 뿐만 아니라 올리고당에서의 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 분리된 만노시다제를 제공한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 서로 교체가능하게 사용되었고, 핵산 유사체(nucleic acid analogs)를 포함하는 cDNA, 게놈의(genomic) DNA, 합성(synthetic) DNA, 및 DNA (또는 RNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 모든 삼차원 구조(three-dimensional structure)를 가질 수 있다. 핵산은 2중 가닥(double-stranded) 또는 단일 가닥(single-stranded)[즉, 센스 가닥(sense strand) 또는 안티센스 가닥(antisense strand)]일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 이로 제한되지 않는 예는 유전자(genes), 유전자 단편(gene fragments), 엑손(exons), 인트론(introns), 전령(messenger) RNA(mRNA), 운반(transfer) RNA, 리보솜(ribosomal) RNA, siRNA, 마이크로(micro)-RNA, 리보자임(ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 가지형 폴리뉴클레오티드(branched polynucleotides), 플라스미드(plasmids), 벡터(vectors), 어떠한 서열 중 분리된(isolated) DNA, 어떠한 서열 중 분리된 RNA, 핵산 프로브(nucleic acid probes), 및 프라이머(primers), 뿐만 아니라 핵산 유사체(analogs)를 포함한다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 서로 교차가능하게 사용되고, 길이 또는 번역후 변형(post-translational modification)과 상관없이 아미노산의 어떠한 펩티드-결합 사슬(peptide-linked chain)을 의미한다. 일반적으로, 표본(preparation)에서의 전체 단백질의 적어도 60 중량%, 예를 들어 샘플에서의 전체 단백질의 60 % 를 구성하였을 때, 본원에서 기재된 폴리펩티드[예를 들어, 만노시다제 또는 캡핑이 제거된(uncapped) M6P 잔기를 갖는 타겟 단백질]는 분리된다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 표본(preparation)에서의 전체 단백질의 적어도 75 중량%, 적어도 90 중량% 또는 적어도 99 중량% 로 이루어져 있다.
"분리된 핵산(isolated nucleic acid)"은, 자연적으로 발생된 게놈(naturally-occurring genome)(예를 들어, 효모 게놈)에서의 핵산의 한쪽 또는 양쪽 면(one or both sides)의 측면에 배치된(flank) 핵산을 포함하는, 자연적으로 발생된 게놈에 나타낸 그 밖의 핵산 분자로부터 분리된 핵산을 나타낸다. 이러한 자연적으로 발생되지 않은 핵산은 자연에서 발견되지 않고, 자연적으로 발생된 게놈에서의 근접한 서열(contiguous sequences)을 직접적으로 갖지 않기 때문에, 핵산에 대해서 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "분리된(isolated)"은 어떠한 자연적으로 발생되지 않는(non-naturally-occurring) 핵산 서열을 또한 포함한다.
분리된 핵산은, 예를 들어 자연적으로 발생한 게놈에서의 DNA 분자가 제거되거나 부재한 측면(flanking)의 바로 옆에서 발견된 일반적으로 발견된 핵산 서열 중의 하나가 제공된 DNA 분자일 수 있다(An isolated nucleic acid can be, for example, a DNA molecule, provided one of the nucleic acid sequences normally found immediately flanking that DNA molecule in a naturally-occurring genome is removed or absent). 따라서, 분리된 핵산은, 벡터, 자체적인 복제 플라스미드(autonomously replicating plasmid), 바이러스[예를 들어, 모든 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus), 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)] 또는 원핵 생물(prokaryote) 또는 진핵 생물(eukaryote)의 게놈 DNA 내로 포함되는 DNA 뿐만 아니라 그 밖의 서열과는 관계없는(independent of) 분리된 분자(separate molecule)[예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 PCR 또는 제한 효소 처리(restriction endonuclease treatment)에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편(genomic DNA fragment)]로서 존재하는 DNA 분자를 제한없이 포함한다. 게다가, 분리된 핵산은 잡종(hybrid) 또는 융합 핵산(fusion nucleic acid)의 일부인 DNA 분자와 같은 조작된 핵산(engineered nucleic acid)을 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리(genomic libraries), 또는 게놈 DNA 제한효소 분해(genomic DNA restriction digest)를 포함하는 겔 슬라이스(gel slices) 내의 수백 내지 수백만의 다른 핵산 중에 존재하는 핵산은 분리된 핵산으로 간주되지 않는다.
핵산 및 특정한 숙주 세포와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "외인성(exogenous)"은 자연에서 발견된 바와 같은 특정한 세포에서 발생되지 않는(특정한 세포로부터 획득될 수 없는) 어떠한 핵산을 나타낸다. 따라서, 자연적으로 발생되지 않는 핵산(non-naturally-occurring nucleic acid)은 숙주 세포 내로 일단(once) 도입된 숙주 세포에 대해서 외인성일 수 있는 것으로 간주된다. 자연적으로 발생되지 않는 핵산은, 핵산이 전체로서 자연에서 존재하지 않는다면 자연에서 발견된 핵산 서열 또는 핵산 서열의 단편을 포함할 수 있음을 주의해야 한다. 예를 들어, 발현 벡터 내의 게놈 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는 핵산이고, 따라서 전체로서(게놈 DNA 뿐만 아니라 벡터 DNA) 핵산 분자가 자연에 존재하지 않기 때문에, 숙주 세포 내로 일단 도입된 숙주 세포에 대해서 외인성이다. 따라서, 어떠한 벡터, 자체적으로 복제하는 플라스미드, 또는 전체로서 자연에 존재하지 않는 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노 바이러스 또는 헤르페스 바이러스)가 자연적으로 발생하지 않는 핵산일 것으로 간주된다. PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리(restriction endonuclease treatment)에 의해 생산된 게놈 DNA 단편 뿐만 아니라 cDNA 는, 이들이 자연에서 분리된 분자로서 발견되지 않기 때문에 자연적으로 발생하지 않는 핵산일 것으로 간주된다는 결과가 된다. 또한, 배열(arrangement)에서의 프로모터 서열(promoter sequence) 및 폴리펩티드-코드화하는 서열(polypeptide-encoding sequence)[예를 들어, cDNA 또는 게놈의 DNA]을 포함하는, 자연에서 발견되지 않는 어떠한 핵산은 자연적으로 발생하지 않는 핵산인 결과가 된다. 자연적으로 발생된 핵산은 특정한 세포에 대해서 외인성일 수 있다. 예를 들어, 염색체가 효모의 세포 내로 일단 도입된다면, 효소 x 의 세포로부터 분리된 전체의 염색체가 효모 y의 세포에 대하여 외인성 핵산이다.
만노시다제를 코드화하는 핵산은, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 14 에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 70 % 의 서열 동일성(sequence identity)(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 의 서열 동일성)을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본원에 기재된 핵산은, SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 50 에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70 % (예를 들어, 적어도 75, 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100 %)의 동일성을 갖는 만노시다제 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 예를 들어, 핵산은, SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:50, 또는 이의 부분(portion)에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90 % (예를 들어, 적어도 95 % 또는 98 %)동일성을 갖는 만노시다제를 코드화할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 SEQ ID NO: 50의 아미노산 잔기 1 내지 774 와 적어도 90 % 동일성을 갖는 만노시다제를 코드화할 수 있다. 특정한 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, or SEQ ID NO:50 에 나타낸 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성(percent identity)은 하기와 같이 결정된다. 첫째로, 아미노산 서열은 BLASTP 버전(version) 2.0.14 를 포함하는 BLASTZ의 독립형 버전(stand-alone version)으로부터의 BLAST 2 Sequences(Bl2seq) 프로그램을 사용하여 나란히 하였다(aligned). BLASTZ의 이러한 독립형 버전은 Fish & Richardson's 웹사이트(예를 들어, www.fr.com/blast/) 또는 the U.S. government's National Center for Biotechnology Information 웹사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 획득할 수 있다. Bl2seq 프로그램을 사용하는 방법을 설명하는 지시(Instructions)는 BLASTZ 를 수반하는 리드미 파일(readme file)에서 발견될 수 있다. Bl2seq 는 BLASTP 알고리즘(algorithm)을 사용한 두 개의 아미노산 서열 사이를 비교하여 수행한다. 두 개의 아미노산 서열을 비교하기 위해, Bl2seq 의 옵션(options)은 하기에 나타내었다: -i 는 비교될 첫 번째 아미노산 서열을 포함하는 파일로 설정된다(예를 들어, C:\seq1.txt) ; -j 는 비교될 두 번째 아미노산 서열을 포함하는 파일로 설정된다(예를 들어, C:\seq2.txt) ; -p 는 blastp 로 설정된다 ; -o 는 어떠한 원하는 파일 이름이다(예를 들어, C:\output.txt); 및 모든 다른 옵션은 이들의 디폴트 설정(default setting)에 둔다. 예를 들어, 하기의 명령어(command)는 두 개의 아미노산 서열 사이 비교를 포함하는 출력 파일(output file)을 발생시키기 위해 사용될 수 있다: C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt. 만약 두 개의 비교된 서열이 상동 관계(homology)를 공유한다면, 그때 지정된 출력 파일(designated output file)은 정렬된 서열(aligned)로서의 상동(homology)의 이러한 영역(those regions)을 나타낼 것이다. 만약 두 개의 비교된 서열이 상동 관계를 공유하지 않는다면, 그때 지정된 출력 파일은 정렬된 서열을 나타내지 않을 것이다. 유사한 절차는 blastn이 사용된 경우를 제외하고는 핵산 서열에 대해서 다음일 수 있다(Similar procedures can be following for nucleic acid sequences except that blastn is used).
정렬하자마자, 매치된 수(the number of matches)는 동일한 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에 나타낸 위치(positions)의 수를 집계하여 결정된다. 퍼센트 동일성(percent identity)은, 매치된 수를 전장(full-length)의 만노시다제 폴리펩티드 아미노산 서열의 길이(length)로 나눈 다음에 결과적인 수치를 100과 곱하여 결정된다. 예를 들어, SEQ ID NO:7 에 나타낸 서열과 함께 정렬하였을 때 700 매치(matches)를 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7 에 나타낸 서열과 77.8 퍼센트 동일성을 갖는다(즉, 700 ÷ 900 × 100 = 77.8).
퍼센트 동일성 수치는 소수점 1 자리에서 반올림함을 명심할 필요가 있다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14 는 반올림 내려 78.1이고, 반면에 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19 는 반올림 올려 78.2이다. 길이 값(length value)은 항상 정수(integer)임을 또한 명심할 필요가 있다.
많은 핵산은 특정한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드화할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 유전학적인 코드(genetic code)의 퇴보(degeneracy)는 본 분야에서 알려져 있다; 즉, 많은 아미노산에 대해서, 아미노산에 대한 코돈(codons)으로서 제공되는 하나의 뉴클레오티드 삼중자(one nucleotide triplet)가 있다. 예를 들어, 주어진 만노시다제 폴리펩티드에 대한 코딩 서열(coding sequence)에서의 코돈은, 그러한 종에 대한 적절한 코돈 바이어스 테이블(codon bias tables)을 사용하여, 특정한 종(particular species)[예를 들어, 박테리아(bacteria) 또는 균류(fungus)]에서의 최적의 발현을 수득할 수 있도록 변형될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, 또는 SEQ ID NO:14 에 나타낸 핵산은 도 14 내지 18 에 나타낸 바와 같은 E. coli 발현에 대해서 최적화된 코돈일 수 있다(SEQ ID NOs:16-20 을 참고하라).
혼성화(Hybridization)는 두 개의 핵산 서열 사이의 상동성(homology)을 평가하기 위해 또한 사용될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체(variant)는 표준 혼성화 기술(standard hybridization techniques)에 따른 혼성화 프로브(hybridization probe)로서 사용될 수 있다. 테스트 근원(test source)으로부터의 DNA 또는 RNA 에 대한 관심 프로브(probe of interest)(예를 들어, CcMan5 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 프로브)의 혼성화는 테스트 근원에서 프로브에 해당하는 DNA 또는 RNA(예를 들어, CcMan5 뉴클레오티드 서열)의 존재의 표시이다. 혼성화 조건은 본 분야에서 숙련자에게 알려져 있고, 이는 Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991 에 현재의 프로토콜에서 발견할 수 있다. 중간의 혼성화 조건(Moderate hybridization conditions)은 30 ℃에서 2X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화한 다음에 50 ℃ 에서 1 X SSC, 0.1% SDS 에서의 세척(wash)과 동등한 것으로 나타났다. 매우 엄격한 조건(Highly stringent conditions)은 45 ℃에서의 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨(SSC)에서의 혼성화한 다음에 65 ℃에서의 0.2 X SSC, 0.1% SDS 에서의 세척과 동등한 것으로 나타났다.
올리고당에서 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 만노시다제 폴리펩티드는 C. 셀룰란스(SEQ ID NO:50 의 잔기 1 내지 774, CcMan51-774 로서 또한 나타냄)로부터의 만노시다제의 일부에 대한 본원에서 기재된 삼차원 구조(three dimensional structure)에 기초하여 또한 나타낼 수 있다. 삼차원 구조는, 예를 들어 CcMan51-774 결정의 X선 회절(X-ray diffraction)에 의해 결정될 수 있다. CcMan51-774의 구조적인 좌표(Structural coordinates)[예를 들어, CcMan51-774의 좌표를 Protein Data Bank(PDB ID No. 2xs하의 PDB 에서의 월드와이드웹(world wide web))에 맡겼고, CcMan5의 촉매 중심(catalytic center)에 대한 좌표를 도 33 에 나타내거나, 또는 PDB entry 2xsg에서의 비대칭의 유닛(asymmetric unit)에서의 두 개의 CcMan51-774 분자의 단백질 C 알파 원자 및 촉매 Ca2+ 원자에 대한 좌표를 도 34 에 나타내었다]는, 올리고당에서의 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 만노시다제의 삼차원 구조의 특성 뿐만 아니라, 말단 포스포-6-만노스를 생산하기 위해 Man-P-Man 을 가수분해하기 위한 이의 능력을 부여하고, 기질로서의 만노스-6-포스페이트-알파, 1-만노스(mannose-6-phosphate-alpha,1-mannose)[이후로 Man-P-Man로서 나타냄]의 수용(acceptance)을 포함하는 만노시다제의 영역(regions)의 시각화(visualization), 확인(identification) 및 특성을 이로 제한하지 않고 포함하는 수많은 응용에 유용하다. "구조적인 좌표(Structural coordinates)"는 분자 또는 분자로 된 복합체에서의 그 밖의 원자에 대한 원자의 공간 관계(atom's spatial relationship)에 해당하는 데카르트좌표(Cartesian coordinates)이다. 구조적인 좌표는 X선 결정학 기술 또는 NMR 기술을 사용하여 수득할 수 있거나, 또는 분자 교체 기술(replacement) 또는 상동성 모델링(homology modeling)을 사용하여 유도될 수 있다. 다양한 소프트웨어 프로그램(software programs)은 분자 또는 분자의 복합체의 삼차원의 표시(representation)를 수득하기 위한 구조적인 좌표의 세트의 그래픽의 표시(graphical representation)를 가능하게 한다. 본원에 기재된 구조의 구조적인 좌표는, 전도(inversion) 또는 정수 더하기(integer additions) 또는 빼기(subtractions)와 같은 수학적인 처리(mathematical manipulation)에 의한 도 33 또는 도 34 에 제공된 원본의 세트(original set)로부터 변형될 수 있다. 이와 같이(As such), 본 발명의 구조적인 좌표가 상대적임을 인식할 수 있고, 도 33 또는 도 34 의 실질적인 x, y, z 좌표에 의해 결코 명확하게 제한되지 않는다.
실시예 8 에 나타낸 바와 같이, CcMan51-774의 구조는 두 개의 도메인, α-나선형 링커(α-helical linker)(SEQ ID NO:50의 잔기 272 내지 290)를 통해 연결된 N-말단 β-샌드위치 도메인(N-terminal β-sandwich domain)(SEQ ID NO:50의 잔기 8 내지 271) 및 C-말단 (αα)6 바렐(barrel) 도메인(SEQ ID NO:50의 잔기 291 내지 2771)으로 이루어져 있다. 두 개의 도메인 사이의 공유 영역(interface)는, 보존된(conserved) 촉매의 Ca2+ 이온을 포함하는 쉘로우 캐비티(shallow cavity)를 구체화하고, -1 기질 결합 부위(substrate binding site)[Davies et al., Biochem. J. 321:557-9 (1997)에 기재된 바와 같은 명명법(nomenclature)]를 구체화한다. SEQ ID NO: 50 의 잔기 22, 25, 71, 72, 195, 196, 354, 405, 535, 536, 588, 589, 626, 658, 660, 및 662 는 기질 결합 부위를 형성한다.
CcMan51-774 의 삼차원 구조는, PDB ID No. 2xs의 구조적인 좌표, 또는 도 33 에 나타낸 발췌(extract)를 이용하는, CcMan51-774 의 활성 부위(active site)를 둘러싸는(surrounding) 잔기, 또는 도 34 에 나타낸 발췌를 포함하는, PDB entry 2xsg 에서 비대칭의 유닛에서의 두 개의 CcMan51-774 분자의 단백질 C 알파 원자 및 촉매 Ca2+ 원자를 포함하고, 단백질의 전체적인 접힌 부분(fold)를 기재한, 이의 부분 또는 이의 모두를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, CcMan51-774 의 삼차원의 구조는, 2Å 보다 많지 않은 상기 아미노산의 보존된 백본 원자(conserved backbone atoms)로부터의 ± 평균 평방근편차(root mean square deviation), PDB ID No. 2xs에 따른 아미노산 잔기 7 내지 771의 구조적인 좌표에 의해 특징지어 질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CcMan51-774 의 삼차원 구조는, 2Å 보다 많지 않은(예를 들어, 1.5Å, 1.0Å, 또는 0.5Å 보다 많지 않은) 상기 아미노산의 보존된 백본 원자(conserved backbone atoms)로부터의 ± 평균 평방근편차(root mean square deviation), PDB ID No. 2xs에 따른 아미노산의 완전한 구조적인 좌표를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "평균 평방근편차(root mean square deviation)"는 평균으로부터의 편차의 제곱의 산술평균의 제곱근이고(the square root of the arithmetic mean of the squares of the deviations from the mean), 이는 본원에서 기재된 구조적인 좌표로부터의 편차(deviation) 또는 변화(variation)를 표현하는 방법이다. 본원의 사실은 평균 평방근편차 내의 동일한 구조적인 좌표를 야기하는 언급된 아미노산 잔기의 보존적인 치환(conservative substitutions)을 포함하는 모든 실시형태를 포함한다.
본원에서 제공된 구조적인 좌표는 만노시다제 폴리펩티드의 삼차원 구조를 나타내는데에 사용될 수 있다. 이러한 구조로부터, 예를 들어, 기질 결합 부위(substrate binding sites)는, 컴퓨터를 사용하여 시각화할 수 있고, 확인할 수 있고, 분자의 표면 주고, 표면 전하, 입체의 배열(steric arrangement), 반응성 아미노산, 소수성(hydrophobicity) 또는 친수성(hydrophilicity) 등의 영역의 존재를 기초로 특징지을 수 있다.
도 33, 도 34, 또는 PDB ID No. 2xs 에 나타낸 바와 같은 본원에서 기재된 구조에 대해 발생된 구조적인 좌표를 사용하기 위해서, 관련 있는 좌표(relevant coordinates)는 삼차원 모양(dimensional shape) 또는 그래픽 표시(graphical representation)로서 나타낼 수 있거나, 또는 전환시킬 수 있다. 구조적인 좌표의 세트로부터 분자 또는 이의 일부의 삼차원의 그래픽 표시를 생성가능한 소프트웨어 프로그램을 상업적으로 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 소프트웨어 프로그램의 예는 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는다: GRID (Oxford University, Oxford, UK) ; MCSS (Molecular Simulations, San Diego, CA); AUTODOCK (Scripps Research Institute, La Jolla, CA); DOCK (University of California, San Francisco, CA); Flo99 (Thistlesoft, Morris Township, NJ); Ludi (Molecular Simulations, San Diego, CA); QUANTA (Molecular Simulations, San Diego, CA); Insight (Molecular Simulations, San Diego, CA); SYBYL (TRIPOS, Inc., St. Louis. MO); 및 LEAPFROG (TRIPOS, Inc., St. Louis, MO).
본원에서 기재된 구조적인 좌표는, 분자 또는 분자 복합체의 알려지지 않은 삼차원의 구조를 결정하기 위해 표준 상동성 모델링 기술(standard homology modeling techniques)과 함께 사용될 수 있다. 상동성 모델링은, 하나 또는 그 이상의 관련된 단백질 분자, 분자 복합체 또는 이의 일부의 구조적인 좌표를 사용한 알려지지 않은 구조의 모델을 구성하는 것을 포함한다. 상동성 모델링은 단백질의 공통 또는 상동의 부분(common or homologous portions)을 맞춤으로써 처리할 수 있고, 이의 삼차원 구조는, 명확하게 본원의 도 33 및 도 34 에 제공된 관련된[즉, 상동의(homologous)] 구조적인 좌표를 사용하여, 알려진 분자에서의 상동의 구조적인 요인의 삼차원 구조를 해결될 것이다. 상동성은, 아미노산 서열 동일성, 상동성 2차 구조 요소(homologous secondary structure elements), 및/또는 상동성 제3의 접힘(homologous tertiary folds)을 사용하여 결정될 수 있다. 상동성 모델링은, 해결된 관련된 구조의 아미노산에 의해 아미노산(또는 그 밖의 성분)의 교체(replacement)와 함께 삼차원 구조의 모두 또는 재조립된 부분(rebuilding part)을 포함할 수 있다. 이에 따라서, 알려지지 않은 분자의 삼차원 구조는 본원에 기재된 CcMan51-774 의 삼차원 구조를 사용하여 생성될 수 있고, 본원에 잘 알려진 기술을 사용하여 개량할 수 있다(refined).
본원에 기재된 삼차원 구조에 근거하여, 치환(substitutions)은, 이들의 선택성(selectivity)을 개선하거나 또는 변경시키기 위해 CcMan51-774 또는 그 밖의 만노시다제의 몇몇의 원자 또는 사이드 기(side groups)를 만들 수 있다. 예를 들어, CcMan5 는 위치 536 및 588 에서의 비-산성 잔기(non-acidic residue)를 포함하고, 이는 만노시다제가 Man-P-Man 기질에서의 아노머 산소(anomeric oxygen)에 인산염 결합(phosphate linkage)을 허용하는(tolerate) 것을 가능하게 한다. 이와 마찬가지로, 그 밖의 만노시다제에서의 이에 상응하는 잔기는, Man-P-Man 기질을 수용하기 위해(accept) 만노시다제의 능력을 증가시키도록 비-산성 잔기로 변경될 수 있다.
본원에서 사용하기에 적절한 그 밖의 만노시다제 폴리펩티드 후보물질은 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 정렬(alignments)의 분석으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 데이터베이스(database)에서의 의문(query)을 실행하는 것은 만노시다제 폴리펩티드의 상동성 및/또는 오솔로그(orthologs)을 확인할 수 있다. 서열 분석은 알려진 만노시다제 아미노산 서열을 사용한 불필요하지 않는 데이터베이스(nonredundant databases)의 BLAST, 상호간의(Reciprocal) BLAST, 또는 PSI-BLAST 분석을 포함할 수 있다. 40 % 이상의 서열 동일성을 갖는 데이터베이스에서의 이러한 폴리펩티드는 만노시다제 폴리펩티드로서의 적합성(suitability)을 위한 추가적인 평가를 위한 후보물질로서 확인할 수 있다. 아미노산 서열의 유사성(similarity)은, 하나의 소수성 잔기를 다른 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 잔기로의 치환과 같은, 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)을 가능하게 한다. 만약 원한다면, 이러한 후보물질의 수동 조사(manual inspection)는 추가적으로 평가될 수 있는 후부물질의 수를 줄이기 위해 실행될 수 있다. 수동 조사는, 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 만노시다제에 존재하는 것으로 혐의를 받는 도메인, 예를 들어 하나 또는 그 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 보존된 도메인 또는 기능적인 영역[예를 들어, 기질 결합 캐비티(substrate binding cavity)]을 갖는 것으로 나타낸 이러한 후보물질을 선별하여 수행될 수 있다. 이러한 도메인은 글리신-리치 모티프(glycine-rich motif) GVGXXGXGG를 포함할 수 있고, 여기에서 X 는 Gly, Ser, Thr, Val, Ala, Cys 또는 Gln [또는 작은 곁사슬(small side chain)을 갖는 그 밖의 아미노산]이다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 69 내지 77 에서 발견되었다. 이러한 영역은 효소의 활성 부위에서의 -1 만노스 및 포스페이트-결합 서브 사이트(phosphate-binding subsite)에 대한 필수적인 수소 결합을 제공하는 루프(loop)를 만든다.
보전된 모티프의 또 다른 예는 VRXE 모티프를 포함하고, 여기에서 Arg (R)은 -1 고리(ring) 및 가능한 +1 고리에 수소 결합을 생성하고, Glu (E)은, 아마도 이러한 모티프의 모양을 형성하면서 이러한 R 잔기에 대한 염다리(salt bridge)에 있고; 및 X 는 Trp 또는 Pro 를 제외한 20 개의 아미노산 중 하나이다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 404 내지 407 에서 발견된다.
적절한 모티프는 또한 X1 YQGX2 모티프일 수 있고, 여기에서 X1 는 Leu, Ile, Val Ala, Phe, Tyr 또는 Met 일 수 있고, X2 는 Thr, Ser 또는 Asn 일 수 있다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 534 내지 538 에서 발견된다. E 가 올리고당에서의 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해하는 능력을 갖지 않는 만노시다제에 존재하기 때문에, 이러한 모티프에서의 Gln(Q)는 중요하다. 이러한 모티프에서의 Tyr (Y)는 또한 +1 사이트 형성에 중요한 것으로 예상된다.
게다가, SEQ ID NO:50 의 잔기 22, 25, 71, 72, 195, 196, 354, 405, 535, 536, 588, 589, 626, 658, 660, 및 662 에 나타낸 영역은 CcMan5 의 기질 결합 캐비티(substrate binding cavity)를 형성한다. 최소한의 필요조건으로서, G71, G72, D355, R405, Q536, N588, Q589, T626, D660, D662 는 촉매 중심을 형성하고, 여기에서 N588, Q589 및 D660 은 촉매 Ca2+ 이온을 조정하는 것(coordinating)을 포함하고, D662 및 D660 은 친핵성 물(nucleophilic water)을 활성화시키는 것을 포함하고, Q536 은 전이 상태(transition state)동안 아노머 산소(anomeric oxygen)를 안정화시키고, G71, G71, D355, R405 및 T626 은 -1 사이트에서의 기질 결합을 포함한다. 이러한 최소의 촉매 중심을 나타내는 도 30 을 참고하라. 이와 같이, 아미노산 곁사슬에서의 원자의 삼차원 단백질 좌표가 도 33 에서의 등가의 원자(equivalent atoms)의 좌표의 1.5 Å 편차(deviation) 내의 범위에 들어가는 최소의 촉매중심(minimal catalytic center)(예를 들어, 도 30에 나타냄)에 위치하는 경우에, 만노시다제는 말단 만노스-1-포스포-6-만노스 결합을 가수분해할 수 있는 후보물질 만노시다제로서 선별될 수 있다.
보존된 모티프는 또한 단백질의 N-말단 도메인에 GDXGN 모티프일 수 있고, 여기에서 X 는 P 를 제외한 모든 아미노산 일 수 있다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 21 내지 25 에서 발견되고, 도 24 에 나타낸 바와 같은 효소의 기질 결합 포켓(substrate binding pocket)의 일부를 형성한다. 특히, D 및 N의 곁사슬은 기질 결합 캐비티와 라인을 형성하고(line), 이는 +1 만노스에 결합하는 대체가능한 서브포켓(alternative subpocket)을 형성할 수 있다.
실시예 14 에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드 서열의 데이터베이스에서의 의문(query)의 실행(performing)은, 하기의 유기체에서의 CcMan5 의 상동성을 확인하였다: 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)[GenBank 수납 번호Accession No. NP_630514], 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)(GenBank 수납 번호 ZP_05522540); 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)(GenBank 수납 번호 ZP_06527366); 클로스트리디움 스피로포르메(Clostridium spiroforme)(GenBank 수납 번호 ZP_02866543), 박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)(GenBank 수납 번호 NP_812442), 주농왕기아 프로푼다(Zunongwangia profunda)(GenBank 수납 번호 YP_003584502); 키티노파가 피넨시스(Chitinophaga pinensis)(GenBank 수납 번호 YP_003120664); 페니바실러스 sp(Paenibacillus sp)(GenBank 수납 번호 YP_003013376); 박테로이데스 sp(Bacteroides sp.)(GenBank 수납 번호 ZP_04848482); 박테로이데스 셀룰로실리티쿠스(Bacteroides cellulosilyticus) (GenBank 수납 번호 ZP_03677957); 레이우엔훅키엘라 블란데니시스(Leeuwenhoekiella blandensis)(GenBank 수납 번호 ZP_01061975); 스핀고박테리움 스피리티보럼(Sphingobacterium spiritivorum)(GenBank 수납 번호 ZP_07083984); 및 페도박터 sp.(Pedobacter sp.)(GenBank 수납 번호 ZP_01885202). 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)로부터의 만노시다제는, 상기의 모티프에서 뿐만 아니라 삼차원 구조의 많은 루프에서 유사하다(BLASTP 에 의해 765 배열된 잔기 상에서의 501 동일성을 갖는, CcMan5 GH92 도메인과 66 % 의 서열 동일성).
만노시다제 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산 분자는 표준 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. PCR 은 전체 게놈의(total genomic) DNA 또는 전체 세포의(total cellular) RNA 로부터의 서열을 포함하는, RAN 뿐만 아니라 DNA 로부터의 특정한 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심 영역의 끝(beyond) 또는 그 이상(beyond)으로부터의 서열 정보는, 증폭시킬 주형(template)의 반대 가닥(opposite strands)에 대한 서열에서 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primers)를 설계하는데 사용되었다. 부위-특이적 뉴클레오티드 서열 변형(site-specific nucleotide sequence modifications)에 의해 또한 가능한 다양한 PCR 전략(strategies)은 주형 핵산 내로 도입될(introduced) 수 있다. 분리된 핵산은 또한, 단일 핵산 분자[포스포라미디트 기술(phosphoramidite technology)을 사용한 3' 에서 5' 방향으로의 자동화된 DNA 합성을 사용함] 또는 올리고뉴클레오티드의 시리즈(series)로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 긴 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 그 이상의 한 쌍(pairs)(예를 들어, >100 뉴클레오티드)은, 올리고뉴클레오티드 쌍(pair)이 풀렸을 때(anneal) 듀플렉스(duplex)가 형성되는 것과 같이 상보성(complementarity)의 짧은 세그먼트(short segment)(예를 들어, 약 15 뉴클레오티드)를 포함하는 각각의 쌍을 갖는, 원하는 서열을 포함하면서 합성할 수 있다. DNA 중합효소는, 벡터 내로 연결시킬(ligated) 수 있는, 뉴클레오티드 쌍 당 단일, 이중-가닥 핵산 분자(single, double-stranded nucleic acid molecule per oligonucleotide pair)를 야기하는, 올리고뉴클레오티드를 연장시키는데 사용된다. 본 발명의 분리된 핵산은 예를 들어 자연적으로 발생하는 DNA 의 돌연변이유발에 의해 또한 수득될 수 있다.
본 문서는, 본원에 기재된 만노시다제의 (i) 생물학적으로 유효한 변이체(biologically active variants) 및 (ii) 이의 생물학적으로 유효한 단편 또는 생물학적으로 유효한 변이체를 또한 제공한다. 만노시다제의 생물학적으로 유효한 변이체는 SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 15, 또는 50 에 나타낸 서열에 관하여 첨가(additions), 결실(deletions) 또는 치환을 포함할 수 있다. 치환을 갖는 단백질은 50 보다 많지 않은(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50 보다 많지 않은) 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)을 일반적으로 가질 수 있을 것이다. 보존적 치환은 하나의 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로의 치환이다. 보존적 치환은 하기의 군 내의 치환을 포함한다: 발린(valine), 알라닌(alanine) 및 글리신(glycine); 류신(leucine), 발린(valine), 및 이소류신(isoleucine); 아스파르산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid); 아스파라진(asparagine) 및 글루타민(glutamine); 세린(serine), 시스테인(cysteine), 및 트레오닌(threonine); 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine); 및 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine). 무극성(non-polar) 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성(polar neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진(asparagine) 및 글루타민을 포함한다. 양전하를 띄는(positively charged) [염기(basic)] 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하를 띄는 (산성의) 아미노산은 아르파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)을 포함한다. 상기에 언급된 극성, 염기 또는 산성 그룹의 하나의 멤버(member)가 동일한 그룹의 또 다른 멤버로의 어떠한 치환은 보존적 치환(conservative substitution)으로 여길 수 있다. 대조적으로, 비-보존적 치환(non-conservative substitution)은 하나의 아미노산을 다른 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 도 31 및 32 에 나타낸 서열 배열은 생산될 수 있는 수많은 아미노산 치환의 예를 제공한다.
결실 변이체(Deletion variants)는 (둘 또는 그 이상의 아미노산의) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 세그먼트(segments) 또는 근접하지 않은(non-contiguous) 단일 아미노산이 결실될 수 있다.
첨가[첨가 변이체(addition variants)]는 하기를 포함하는 융합 단백질(fusion proteins)을 포함한다: (a) SEQ ID NOs: 7, 9, 11, 13, 또는 15, 또는 이의 단편에 나타낸 만노시다제; 및 (b) 내부의(internal) 또는 말단 (C 또는 N)의 무관한(irrelevant) 또는 이종의(heterologous) 아미노산 서열. 이러한 융합 단백질의 문맥(context)에서, 용어 "이종의 아미노산 서열(heterologous amino acid sequences)"은 (a) 이외의 아미노산 서열을 나타낸다. 이종의 서열은, 예를 들어 재조합 단백질[예를 들어, FLAG, 폴리히스티딘(polyhistidine)(예를 들어 헥사히스티딘(hexahistidine), 헤마글루타닌(hemagluttanin, HA), 글루타티온 S-전달효소(glutathione-S-transferase, GST), 또는 말토스-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)]의 정제에 사용된 서열일 수 있다. 이종의 서열은 또한, 진단의 또는 발견될 수 있는 마커(diagnostic or detectable markers), 예를 들어 루시페라이제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 또는 클로람페니콜아세틸전달효소(chloramphenicol acetyl transferase, CAT)로서 유용한 단백질일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 또 다른 단백질로부터의 신호 서열을 포함한다. 특정 숙주 세포(예를 들어, 효모 숙주 세포)에서의, 발현 및/또는 타겟 단백질의 발현 및/또는 분비는 이종의 신호 서열의 사용을 통해 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 융합 단백질은 운반체(carrier)(예를 들어, KLH) 예를 들어 항체 생성을 위한 면역 반응을 이끌어내는데에 유용한) 또는 소포체(endoplasmic reticulum) 또는 골지체 보유 신호(Golgi apparatus retention signals)를 포함할 수 있다. 이종의 서열은 다양한 길이일 수 있고, 몇몇의 경우에 이종의 서열은, 이종의 서열에 부착된 전장의 타겟 단백질보다 더 긴 서열일 수 있다.
만노시다제의 생물학적으로 유효한 단편 또는 생물학적으로 유효한 변이체는, 야생형, 전장, 숙성된 단백질(wild-type, full-length, mature protein)의 만노시다제 활성도[예를 들어, M6P 잔기의 캡핑이 제거됨(uncapping)]의 적어도 40 % (예를 들어, 적어도 50 %; 60 %; 70 %; 75 %; 80 %; 85 %; 90 %; 95 %; 97 %; 98 %; 99 %; 99.5 %, 또는 100 % 또는 보다 많은)를 갖는다. 예를 들어, 만노시다제의 생물학적으로 유효한 단편은 SEQ ID NO:50 의 잔기 1 내지 774 를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 만노시다제는 캡핑이 제거된(Uncapping) 말단 포스포-6-만노스(M6P) 잔기를 갖는 분자(예를 들어, 타겟 단백질)을 생산하는데 사용될 수 있다. 방법은 생체외 또는 생체 내에서 실행될 수 있다.
캡핑이 제거된 M6P 잔기의 생체외 방법
본원에 기재된 만노시다제는 올리고당에서의 말단 M6P 잔기의 캡을 제거하도록(to uncap terminal M6P residues on oligosaccharides) 생체외에서 재조합적으로 생산될 수 있고, 사용될 수 있다. 재조합적으로 만노시다제를 생산하기 위해, 벡터는, 만노시다제 폴리펩티드를 코드화하는 핵산에 실시가능하게 연결된 프로모트를 포함하는 것을 사용한다. 본원에서 사용된 바와 같은, "프로모터"는 유전자가 전사될 수 있은 DNA 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 중합효소에 의해 인지된 다음에 전사(transcription)를 개시한다. 따라서, RNA 중합효소의 DNA 서열에 직접적으로 결합하거나 또는 유입(recruitment)에 포함된 DNA 서열을 포함한다. 프로모터 서열은 "인핸서 영역(enhancer regions)"을 또한 포함하고, 이는 유전자 군(gene-cluster)에서 유전자의 전사 수준을 증진시키기 위해[이름이 여기서 유래함], 단백질[즉, 전사 인자(transcription factors)의 세트와 같은, 작용 전달 인자(trans-acting factors)]과 함께 결합될 수 있는 DNA의 하나 또는 그 이상의 영역이다. 일반적으로 코딩 영역(coding region)의 5' 말단에 있는 인핸서(enhancer)는 프로모터 서열로부터 또한 분리될 수 있고, 즉, 유전자의 인트론 영역(intronic region) 또는 유전자의 코딩 영역(coding region)의 3' 일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "실시가능하게 연결된(operably linked)"은, 발현 조절 서열(expression control sequences)이 관심 코딩 서열(coding sequence)의 발현을 효율적으로 조절하기 위해, 유전적 구조(genetic construct)(예를 들어 벡터) 내로 포함됨을 의미한다.
발현 벡터는, 코드화된(encoded) 폴리펩티드의 발현을 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있고[예를 들어, 형질전환(transformation) 또는 트랜스펙션(transfection)], 그 다음에 정제될 수 있다. 만노시다제 폴리펩티드의 소규모 또는 대규모 생산(small or large scale production)을 위해 사용될 수 있는 발현 시스템(Expression systems)은, 재조합 박테리오파지(recombinant bacteriophage) DNA, 플라스미드 DNA 또는 핵산 분자를 포함하는 코스미드(cosmid) DNA 발현 벡터로 형질전환된(transformed) 박테리아와 같은 박테리아(예를 들어, E. coli)와 같은 미생물, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 균류 발현 벡터(recombinant fungal expression vectors)로 형질전환된 균류(fungal)[예를 들어, S. 세레비시아(S. cerevisiae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 또는 아스페르길루스(Aspergillus)]를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 유용한 발현 시스템은, 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터로 전파된(infected)[예를 들어, 배큘로 바이러스(baculovirus)] 곤충 세포 시스템, 및 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터[예를 들어, 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus)]로 전파되거나(infected) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어 Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(plant cell systems)을 또한 포함한다. 만노시다제 폴리펩티드는 포유동물 발현 시스템을 사용하여 또한 생산될 수 있고, 이는, 본원에서 기재된 핵산과 함께, 포유동물 세포의 게놈(genome)[예를 들어, 메탈로치오네인 프로모터(metallothionein promoter)] 또는 포유동물 바이러스(mammalian viruses)[예를 들어, 아데노바이러스 후발 프로모터(adenovirus late promoter) 및 사이토메가로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter)]로부터 유도된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물(recombinant expression constructs)을 포함하는(harboring) 세포[예를 들어, COS 세포, 중국 햄프서 난소 세포주(Chinese hamster ovary cells), HeLa 세포, 인간 배아 콩팥 293 세포(human embryonic kidney 293 cells) 및 3T3 L1 세포와 같은 불멸화된 세포주(immortalized cell lines)]를 포함한다.
일반적으로, 재조합 만노시다제 폴리펩티드는, 단백질의 정제를 지원하도록 FLAG, 폴리히스티딘(예를 들어, 헥사히스티딘), 헤마글루타닌(HA), 글루타티온 S-전달효소(GST), 또는 말토스-결합 단백질(MBP)과 같은 이종의 아미노산 서열로 태그를 붙였다(tagged). 정제된 단백질에 대한 그 밖의 방법은, 이온 교환(ion exchange), 소수성(hydrophobic) 및 역상(reverse phase), 사이즈 배제(size exclusion), 친화도(affinity), 소수성 전하-도입 크로미토그래피(hydrophobic charge-induction chromatography)와 같은 크로마토그래피 기술 및 이와 같은 것(예를 들어, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton and Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998)을 참고하라)을 포함한다.
생체외 캡핑이 제거된(uncapped) 말단 M6P 잔기를 갖는 분자를 생산하기 위해, 만노스-1-포스포-6 만노스 결합을 포함하는 타겟 분자는, 재조합적으로 생산된 만노시다제를 포함하는 세포 용해액(cell lysate) 또는 정제된 만노시다제와 함께 적절한 조건 하에서 접촉된다. 세포 용해액은 균류 세포, 식물 세포 또는 동물 세포를 포함하는 어떠한 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 동물 세포의 한정되지 않는 예는 선충(nematode), 곤충(insect), 식물(plant), 새(bird), 파충률(reptile), 및 마우스(mouse), 랫(rat), 토끼, 햄스터, 모래쥐(gerbil), 개, 고양이, 염소, 돼지, 소, 말, 고래(whale), 원숭이, 또는 인간과 같은 포유동물을 포함한다. 정제된 만노시다제 또는 세포 용해액과 타겟 분자(예를 들어, 올리고당 또는 당단백질)를 접촉할 때, 만노시다제는 만노스-1-포스포-6 만노스 결합을 가수분해하고, 하나 또는 그 이상의 캡핑이 제거된 말단 M6P 잔기를 갖는 타겟 분자를 생산한다. 실시예 2 에 기재된 방법은, 말단 M6P 잔기가 캡이 제거되는지를(uncapped) 측정하기 위해 사용될 수 있다. 만노시다제에 의한 공정 다음에, 캡핑이 제거된 말단 M6P 잔기를 갖는 타겟 분자를 분리할 수 있다.
용해액(lysate)에서의 만노시다제 활성도의 온전함(integrity ) 또는 활성도의 보전된 세포 용해액을 수득하기 위한 적절한 방법은, 세포 용해액에서의 N-글리코실화 활성도(N-glycosylation activities)에서의 변화를 최소화하거나 보존하는 적절한 완충용액(buffers) 및/또는 뉴클레아제(nuclease), 프로테아제(protease) 및 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitors)를 포함하는 저해제(inhibitors)의 사용을 포함한다. 이러한 저해제는, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)와 같은 킬레이터(chelator), 에틸렌 글리콜 비스(P-아미노에틸 에테르) N,N,N1,Nl-테트라아세트산(ethylene glycol bis(P-aminoethyl ether) N,N,N1,Nl-tetraacetic acid, EGTA), 페닐메틸술포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)와 같은 프로테아제 저해제(protease inhibitors), 아프로티닌(aprotinin), 류펩틴(leupeptin), 안티팬(antipain) 등, 및 포스페이트와 같은 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitors), 플루오린화나트륨(sodium fluoride), 바나듐산염(vanadate) 등을 포함한다. 효소적 활성도를 포함하는 용해액(lysates)을 수득하기 위한 적절한 완충용액 및 조건은, 예를 들어 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999)에 기재되어 있다.
세포 용해액은, 적절히, 물질(substances)의 간섭(interfering)의 존재를 제거하거나 또는 최소화하기 위해 추가적으로 처리할 수 있다. 만약 원한다면, 세포 용해액은, 초원심세포분획법(subcellular fractionation) 및 이온 교환(ion exchange), 소수성(hydrophobic) 및 역상(reverse phase), 사이즈 배제(size exclusion), 친화도(affinity), 소수성 전하-도입 크로미토그래피(hydrophobic charge-induction chromatography)와 같은 크로마토그래피 기술 등을 포함하는 본 분야의 숙련자에서 알려진 다양한 방법으로 분류될(fractionated) 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 세포 용해액은, 전체 세포의 세포소기관(whole cellular organelles)이 온전하고 및/또는 기능적으로 잔존하는데에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 용해액은 하나 또는 그 이상의 온전한 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum), 온전한 활면소포체(smooth endoplasmic reticulum) 또는 온전한 골지체(Golgi apparatus)를 포함할 수 있다. 온전한 세포의 세포 소기관을 포함하는 용해액을 제조하기 위한 적절한 방법 및 세포소기관의 기능성을 테스트하기 위한 적절한 방법은, 예를 들어 Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach et al. (1991) J. Cell Biol. 114(2):219-229; and Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273에 기재되어 있다.
본원에 기재된 바와 같은 타겟 분자는, 균류 기원(fungal origin)의 세포에서 발현되었을 때, 만노스-1-포스포-6 만노스 결합을 포함하는 어떠한 분자, 또는 말단 만노스-1-포스포-6 만노스 결합을 포함하는 어떠한 분자를 나타낸다. 적절한 타겟 단백질은, 파상풍톡소이드(tetanus toxoid) 또는 디프테리아 톡소이드(diptheria toxoid)와 같은 병원체 단백질(pathogen proteins); 사이트메가로바이러스(CMV) 당단백질 B, H 및 gCIII, 인간 면역 결핍 바이러스 1(human immunodeficiency virus 1, HIV-1) 외막 당단백질(envelope glycoproteins), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 외막 당단백질, 단순헤르페스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 외막 당단백질, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus, EBV) 외막 당단백질, 수두대상포진 바이러스(varicella-zoster virus, VZV) 외막 당단백질, 인체유두종 바이러스(human papilloma virus, HPV) 외막 당단백질, 인플루엔자바이러스 당단백질(Influenza virus glycoproteins), 및 간염 패밀리 표면 항원(Hepatitis family surface antigen)과 같은 바이러스성 표면 단백질(viral surface proteins); 리소좀 단백질(lysosomal proteins)[예를 들어, 산성 알파 글리코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다제(alpha galatosidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 셀레브로시다제(cerebrosidase), 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)]; 인슐린; 글루카곤(glucagons) ; 성장 인자(growth factors) ; 사이토카인(cytokines) ; 케모카인(chemokines); 및 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 성장 인자는, 예를 들어 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like growth factor, IGF), 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 과립구-집락 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), 과림대식세포-집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor, NGF); 뉴로트로핀(Neurotrophin), 혈소판-유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 에리스로포에틴(Erythropoietin, EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), 미오스타틴(Myostatin) (GDF-8), 성장 분화 인자-9(Growth Differentiation factor-9, GDF9), 염기성 섬유모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF 또는 FGF2), 표피 성장 인자(Epidermal growth factor, EGF), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor, HGF)를 포함한다. 사이토카인은, 예를 들어 IL-1 내지 IL-33 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, 또는 IL-15)과 같은 인터류킨(interleukins)을 포함한다. 케모카인은, 예를 들어 I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1γ, 이오탁신(Eotaxin), MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, 루코탁신-1(Leukotactin-1), LEC, NCC-4, TARC, PARC, 또는 이오탁신-2(Eotaxin-2)를 포함한다. 또한 종양 당단백질[예를 들어, 종양-관련 항원(tumor-associated antigens)]은, 예를 들어 발암배아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 인간 무친(human mucins), HER-2/neu, 및 전립선-특이 항원(prostate-specific antigen, PSA)을 포함한다[Henderson and Finn, Advances in Immunology, 62, pp. 217-56 (1996)].
몇몇 실시형태에서, 타겟 단백질은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder)과 관련된 하나일 수 있고, 타겟 단백질은, 예를 들어 산성 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다아제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다아제(beta-D-galactosidase), 베타-갈락토시다아제(beta-glucosidase), 베타-헥소사미니다아제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만노시다제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다아제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타아제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타아제A(arylsulfatase A), 알파-N-아세틸갈락토사미니다아제(alpha-N-acetylgalactosaminidase), 아스파르틸글루코사미니다아제(aspartylglucosaminidase), 인두로네이트-2-술파타아제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니드-N-아세틸전달효소(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다아제(beta-D-glucoronidase), 히알루로니다아제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴라미니다아제(alpha-neuraminidase), 인산전달효소(phosphotransferase), 산성 리파아제(acid lipase), 산성 세라미다아제(acid ceramidase), 스핑고마이엘리나제(sphingomyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카텝신 K(cathepsin K), 및 지단백질지방분해효소(lipoprotein lipase)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 타겟 단백질은 융합 단백질이고, 타겟 단백질은 그 밖의 폴리펩티드 서열에 융합되거나, 또는 중합체, 운반체(carrier), 아쥬반트(adjuvant), 면역독소(immunotoxin) 또는 측정가능한[예를 들어, 형광성(fluorescent), 발광성(luminescent) 또는 방사성(radioactive)] 일부(detectable moiety)에 융합된다. 예를 들어, 표적 단백질은, 소 단백질의 분자량을 증가시키기 위해 및/또는 순환 체류 시간(circulation residence time)을 증가시키기 위해, 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체에 합쳐질 수 있다.
캡핑이 제거된 M6P 잔기의 생체내 방법
본원에서 기재된 유전적으로 조작된 세포는 캡핑이 제거된(uncapped) M6P 잔기를 포함하는 타겟 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 기저 방법(cell based method)은, 만노시다아제를 코드화하는 핵산, 타겟 분자를 코드화하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 조작된 균류 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있고, 여기에서 세포는 캡핑이 제거된 말단 M6P 잔기를 포함하는 타겟 분자를 생산한다. 몇몇 실시형태에서, 만노시다제 및 타겟 분자를 코드화하는 핵산은, 만노시다제 및 타겟 분자가 공동-분비되는(co-secreted) 것과 같은 분비 신호(secretion sequence)를 포함한다.
본원에 기재된 유전적으로 조작된 세포는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 캡핑이 제거된(uncapped) 말단 M6P 잔기를 갖는 하나 또는 그 이상의 타겟 분자를 생산하는데 유용하다. 캡핑이 제거된 M6P 잔기의 생체 내 생산에 적절한 세포는, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 메탄올자화효모(methylotrophic yeast)[칸디다, 한세눌라, 오가테아, 피치아 또는 토룰롭시스(Torulopsis) 속(genus)의 메탄올자화효모]를 포함하는, 균류 기원(fungal origin), 또는 아스페르길루스, 트리코데르마(Trichoderma), 네우로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium), 또는 크라이소스포리움(Chrysosporium) 속(genus)의 곰팡이(filamentous fungi)를 포함할 수 있다. 대표적인 균종(fungal species)은 하기를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다: 피치아 아노말라(Pichia anomala), 피치아 보비스(Pichia bovis), 피치아 카나데니시스(Pichia canadensis), 피치아 카르소니(Pichia carsonii), 피치아 파리노스(Pichia farinose), 피치아 페르멘탄스(Pichia fermentans), 피치아 플룩숨(Pichia fluxuum), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 칸디다 발리다(Candida valida), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 아스칼라라피다룸(Candida ascalaphidarum), 칸디다 암피시아(Candida amphixiae), 칸디다 안타르티카(Candida Antarctica), 칸디다 아틀란티카(Candida atlantica), 칸디다 아트모스피리카(Candida atmosphaerica), 칸디다 블라테(Candida blattae), 칸디다 카르포릴라(Candida carpophila), 칸디다 세람비시다룸(Candida cerambycidarum), 칸디다 차울리오데스(Candida chauliodes), 칸디다 코릴달리스(Candida corydalis), 칸디다 도세이(Candida dosseyi), 칸디다 두블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 에르가텐시스(Candida ergatensis), 칸디다 프록투스(Candida fructus), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 페르멘타티(Candida fermentati), 칸디다 퀄리어몬디(Candida guilliermondii), 칸디다 헤물로니(Candida haemulonii), 칸디다 인섹타멘스(Candida insectamens), 칸디다 인섹토룸(Candida insectorum), 칸디다 인터메디아(Candida intermedia), 칸디다 제프레시(Candida jeffresii), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 루시타니에(Candida lusitaniae), 칸디다 릭소소필라(Candida lyxosophila), 칸디다 말토사(Candida maltosa), 칸디다 멤브라니파시엔스(Candida membranifaciens), 칸디다 밀레리(Candida milleri), 칸디다 오레오필라(Candida oleophila), 칸디다 오레고넨시스(Candida oregonensis), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 퀘르시트루사(Candida quercitrusa), 칸디다 쉬하테(Candida shehatea), 칸디다 테모칠레(Candida temnochilae), 칸디다 테누이스(Candida tenuis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 트수치예(Candida tsuchiyae), 칸디다 시놀라보란티움(Candida sinolaborantium), 칸디다 소예(Candida sojae), 칸디다 비스와나티(Candida viswanathii), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 실베스트리스(Pichia silvestris), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 콘다티(Pichia chodati), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 멤브라네파시엔스(Pichia menbranaefaciens), 피치아 미누스큘(Pichia minuscule), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 프세우도폴리모르파(Pichia pseudopolymorpha), 피치아 퀘르쿰(Pichia quercuum), 피치아 로베르트시(Pichia robertsii), 피치아 사이토이(Pichia saitoi), 피치아 실베스트리시(Pichia silvestrisi), 피치아 스트라스부르겐시스(Pichia strasburgensis), 피치아 테리콜라(Pichia terricola), 피치아 반리지(Pichia vanriji), 프슈도지마 안타르시티카(Pseudozyma Antarctica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로미세스 몸드쉬루쿠스(Saccharomyces momdshuricus), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로마이세스 체발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 델브뤠키(Saccharomyces delbrueckii), 사카로마이세스 에구구우스(Saccharomyces exiguous), 사카로마이세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로마이세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 마르시아누스(Saccharomyces marxianus), 사카로마이세스 멜리스(Saccharomyces mellis), 사카로마이세스 로세(Saccharomyces rosei), 사카로마이세스 로우실(Saccharomyces rouxii), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스 웰리아누스(Saccharomyces willianus), 사카로마이코데스 루드윌기(Saccharomycodes ludwigii), 사카로마이코프시스 카프술라리스(Saccharomycopsis capsularis), 사카로마이코프시스 피블리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 사카로마이코프시스 피블리게라(Saccharomycopsis fibuligera), 엔도마이세스 호르데이(Endomyces hordei), 엔도마이코프시스 포불리게라(Endomycopsis fobuligera). 사투리니스포라 사이토이(Saturnispora saitoi), 스키조사키로마이세스 옥토스포러스(Schizosaccharomyces octosporus), 스키조사키로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로마이세스 다이렌시스(Saccharomyces dairensis), 토룰라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 페르멘타티(Torulaspora fermentati), 사카로마이세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 토룰라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포랄 로세이(Torulaspora rosei), 사카로마이세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토룰라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로마이세스 로세이(Saccharomyces rosei), 토루라스포라 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 토루라스포라 델부루에키(Saccharomyces delbrueckii), 토룰라스포랄 델부루에키(Torulaspora delbrueckii), 사카로마에스 델부루에키(Saccharomyces delbrueckii), 자이고사카로마이세스 몬골리쿠스(Zygosaccharomyces mongolicus), 도룰라스포라 글로보사(Dorulaspora globosa), 데바르요마이세스 글로보수스(Debaryomyces globosus), 토룰로프시스 글로보사(Torulopsis globosa), 트리콘스포론 쿠타네움(Trichosporon cutaneum), 트리고노프시스 바르아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리오프시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리오프시스 사투르누스(Williopsis saturnus), 자이고사카로마이세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 자이고사카로마이세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 데바르마이세스 디스포루아(Debaryomyces disporua). 사카로마이세스 비스포라스(Saccharomyces bisporas), 자이고사카로마이세스 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bayanus), 사카로마이세스 비스포루스(Saccharomyces bisporus), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 쉐발리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 델브릭키(accharomyces delbrueckii), 사카로마이세스 페르멘타티(Saccharomyces fermentati), 사카로마이세스 프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로마이세스 루드웨기(Saccharomycodes ludwigii), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈완니오마이세스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 토룰라스포라 델브릭키이(Torulaspora delbrueckii), 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis), 윌리오프시스 칼리포르니카(Williopsis californica), 윌리오프시스 사투루누스(Williopsis saturnus), 자이고사카로마이세스 비스포루스(Zygosaccharomyces bisporus), 자이고사카로마이세스 멜리스(Zygosaccharomyces mellis), 또는 자이고사카로마이세스 로우시(Zygosaccharomyces rouxii). 대표적인 곰팡이는 아스페르길루스의 다양한 종, 아스페르길루스 카시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 글라우쿠스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오라자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트리쿠투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소자에(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 또는 아스페르길루스 베르시컬러(Aspergillus versicolor)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본원에서 특정된 바와 같은 유전공학(genetic engineering)에 앞서, 이러한 세포는 다양한 상업적인 출처(commercial sources) 및 예를 들어, American Type Culture Collection (Rockville, MD)와 같은 연구 자원 시설(commercial sources)로부터 수득할 수 있다. 타겟 분자는 본원에 기재된 타겟 단백질 중의 어떠한 것과 같은 단백질을 포함한다(상기를 참고하라).
세포의 유전공학은, 하기와 같은 하나 또는 그 이상의 유전적인 변형(genetic modifications), 만노시다제를 코드화하는 외인성(exogenous) 핵산을 포함할 수 있다: (i) 외부 사슬 연장(Outer CHain elongation, OCH1) 단백질을 코드화하는 내생 유전자(endogenous gene)의 삭제; (ii) 만노스 잔기의 인산화반응을 증가시키기 위한 만노실 인산화반응[예를 들어, 야로위와 리폴리티카, S. 세레비시아, 오가테아 미뉴타, 피치아 파스토리스 또는 C. 알비칸스로부터의 MNN4 폴리펩티드, P. 파스토리스로부터의 PNO1 폴리펩티드]을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 재조합 핵산의 도입(introduction); (iii) OCH1 단백질의 기능적인 발현을 간섭하는 RNA 분자의 도입 또는 발현; (iv) N-글리코실화 활성도(N-glycosylation activity)를 갖는 야생형 [예를 들어, 내생(endogenous) 또는 외인성(exogenous)] 단백질[예를 들어, N-글리코실화 활성도를 갖는 단백질을 발현시키는]을 코드화하는 재조합 핵산의 도입; (v) 상기에 기재된 타겟 분자를 코드화하는 재조합 핵산의 도입; (v) 이들의 코드화된 단백질의 발현을 변경시키도록, N-글리코실화 활성도를 갖는 단백질을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자의 프로모터 또는 인핸서 요소(promoter or enhancer elements)를 변경시킴. RNA 분자는, 예를 들어 작은-간섭 RNA(small-interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA), 안티-센스 RNA, 또는 미크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 유전공학은, 첨가[예를 들어, 이종의 서열(heterologous sequence)], 삭제 또는 치환[예를 들어, 점 돌연변이(point mutations)와 같은 돌연변이; 보존적 또는 비-보존적 돌연변이(conservative or non-conservative mutations)]를 갖는 단백질을 생산하기 위한 N-글리코실화 활성도를 갖는 단백질을 코드화하는 내인성 유전자의 변경을 또한 포함한다. 돌연변이는 특별하게 도입될 수 있거나[예를 들어, 부위 특이적 변이(site-directed mutagenesis) 또는 상동재조합], 또는 무작위로 도입될 수 있다[예를 들어, 세포를, 예를 들어 Newman and Ferro-Novick (1987) J. Cell Biol. 105(4):1587에 기재된 바와 같이 화학적으로 돌연변이를 일으킬 수 있다].
본원에 기재된 유전적인 변형(Genetic modifications)은 하나 또는 그 이상의, (i) 유전적으로 변형된 세포에서의 하나 또는 그 이상의 활성도(activities)에서의 증가, (ii) 유전적으로 변형된 세포에서의 하나 또는 그 이상의 활성도에서의 감소, 또는 (iii) 유전적으로 변형된 세포에서의 하나 또는 그 이상의 활성도의 위치(localization) 또는 세포 내의 분포(intracellular distribution)에서의 변화를 야기할 수 있다. 특정한 활성도[예를 들어, 만노실 인산화반응(mannosyl phosphorylation)의 촉진]의 양에서의 증가는, 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 단백질의 과잉발현(overexpressing), 내인성 유전자(endogenous gene)의 복제 수(copy number)에서의 증가[예를 들어, 유전자 복제(gene duplication)], 유전자에 의해 코드화된 단백질의 발현에서의 증가를 자극하는 내인성 유전자의 프로모터(promoter) 또는 인핸서(enhancer)에서의 변경(alteration) 때문일 수 있음을 인지할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 특정한 활성도에서의 감소는, 돌연변이의 형태의 과잉발현[예를 들어, 우성 음성 형태(dominant negative form)], 특정한 활성도를 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 간섭 RNA 분자(interfering RNA molecules)의 도입(introduction) 또는 발현, 또는 특정한 활성도를 갖는 단백질을 코드하는 하나 또는 그 이상의 내인성 유전자의 삭제 때문일 수 있다.
상동 재조합(homologous recombination)에 의한 유전자를 방해하도록(disrupt), "유전자 대체(gene replacement)" 벡터는 선별가능한 마커 유전자(selectable marker gene)를 포함하는 이러한 방식으로 구성될 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는, 상동 재조합을 조정하도록(mediate) 충분한 길이의 유전자의 일부에, 5' 및 3' 둘 다에 실시가능하게 연결될 수 있다. 선별가능한 마커는, URA3, LEU2 및 HIS3 유전자를 포함하는, 숙주 세포 영양요구성(host cell auxotrophy)을 보충하거나 항생물질 내성(antibiotic resistance)을 제공하는 많은 유전자 중의 하나일 수 있다. 그 밖의 적절한 선택가능한 마커는, 효모 세포에 클로람페니콜 내성(chloramphenicol resistance)을 부여하는 CAT 유전자, 또는 β-갈락토시다아제의 발현 때문에 블루 콜로니(blue colonies)를 야기하는 lacZ 유전자를 포함한다. 유전자 대체 벡터(gene replacement vector)의 선으로 된(Linearized) DNA 단편은, 그리고 난 다음에 본 분야에서 잘 알려진 방법을 사용한 세포 내로 도입된다(하기를 참고하라). 게놈 내로의 선으로 된 단편(linear fragments)의 통합(Integration) 및 유전자의 분열(disruption)은 선별 마커(selection marker)를 기초로 결정될 수 있고, 예를 들어 서전블롯 분석(Southern blot analysis)에 의해 확인도리 수 있다. 선별가능한 마커는, 예를 들어 Cre-loxP 시스템에 의해 숙주 세포의 게놈으로부터 제거될 수 있다(하기를 참고하라).
그 대신에, 유전자 대체 벡터는, 일부가 어떠한 내인성 유전자 프로모터 서열이 전혀 없고, 유전자의 코딩 서열이 없거나, 유전자의 코딩 서열의 불활성 단편(inactive fragment)을 코드화하는, 방해되도록 유전자의 일부를 포함하는 이러한 방식으로 구성될 수 있다. "불활성 단편(inactive fragment)"은, 유전자의 전장(full-length) 코딩 서열(coding sequence)로부터 생산된 단백질의 활성도의, 예를 들어 약 10 % 미만[예를 들어, 9 % 미만, 8 % 미만, 7 % 미만, 6 % 미만, 5 % 미만, 4 % 미만, 3 % 미만, 2 % 미만, 1 % 미만, 0 %]을 갖는 단백질을 코드화하는 유전자의 단편이다. 유전자의 이러한 일부는, 어떤 알려진 프로모터 서열도 유전자 서열에 실시가능하게 연결되지 않지만, 종결 코돈(stop codon) 및 전사 종결 서열(transcription termination sequence)은 유전자 서열의 일부에 실시가능하게 연결되는 이러한 방식으로 벡터에 삽입된다. 이러한 벡터는, 유전자 서열의 일부에서 나중에 선으로 만들 수 있고, 세포 내로 형질전환된다(transformed). 단일 상동 재조합(single homologous recombination)을 거쳐, 이러한 선형화된 벡터(this linearized vector)는 그리고 난 다음에 유전자의 내인성 대응물(endogenous counterpart)에 통합된다.
발현 벡터는 독립적이거나(autonomous) 또는 통합될 수 있다. 재조합 핵산(예를 들어, 하나의 코드화된 만노시다제)은, 플라스미드, 파지(phage), 전이인자(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 입자(virus particle)와 같은 발현 벡터의 형태에 세포 내로 도입될 수 있다. 재조합 핵산은 염색체 외적으로(extrachromosomally) 유지될 수 있거나 또는, 효모 세포의 염색체의 DNA 내로 통합될 수 있다. 발현 벡터는, 원하는 핵산으로 형질전환된 이러한 세포의 삭제 및/또는 선택을 가능하도록, 선택된 조건 하에서 세포의 생존능력(cell viability)을 위해 요구되는 단백질[예를 들어, 우라실 생합성(uracil biosynthesis)에 필요한 효소를 코드화하는 URA3, 또는 트립토판 생합성에 필요한 효소를 코드화하는 TRP1]을 코드화하는 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, U.S. Pat. No. 4,704,362를 참고하라). 발현 벡터는 독립적인 복제 서열(autonomous replication sequence, ARS)을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. No. 4,837,148 은 피치아 파스토리스에서 플라스미드를 유지하기 위한 적절한 수단(suitable means)을 제공하는 독립적인 복제 서열을 기재하였다.
통합 벡터(Integrative vectors)는, 예를 들어 U.S. Pat. No. 4,882,279 에 기재되어 있다. 통합 벡터는, 적어도 첫 번째로 삽입가능한 DNA 단편, 선별가능한 마커 유전자 및 두 번째로 삽입가능한 DNA 단편의 연속적으로 배열된 서열을 일반적으로 포함한다. 첫 번째 및 두 번째 삽입가능한 DNA 단편은, 길이에 있어서 각각 약 200(예를 들어, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 또는 약 1000 또는 그 이상) 뉴클레오티드이고, 형질전환될 수 있는 종의 게놈의(genomic) DNA 의 일부에 대해 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 발현을 위한 관심 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, N-글리코실화 활성도를 갖는 단백질을 코드화하는 유전자)은, 마커 유전자의 전 또는 후이든 첫 번째 및 두 번째 삽입가능한 DNA 단편 사이의 이러한 벡터 내에 삽입된다. 통합 벡터를, 숙주 세포 게놈 내로 관심 뉴클레오티드 서열의 통합을 가능하도록 효모 형질전환 전에 선형화시킬 수 있다.
발현 벡터는, 효모[예를 들어,야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), P. 파스토리스, 또는 그 밖의 적절한 균종(fungal species)]의 조절 하에서 재조합 핵산을 특징으로 삼을 수 있고, 이는 이들이 균류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 효모 프로모터는, 예를 들어 ADC1, TPI1, ADH2, hp4d, POX, 및 Gal10 프로모터[예를 들어, Guarente et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(23):7410 을 참고하라]를 포함한다. 추가적으로 적절한 프로모터는, 예를 들어 Zhu and Zhang (1999) Bioinformatics 15(7-8):608-611 및 U.S. Patent No. 6,265,185 에 기재되어 있다.
프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)[조건부의(conditional)]일 수 있다. 구성적 프로모터(constitutive promoter)는, 이의 발현이 표준 배양 조건 하에서 일정할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 유도성 프로모터(inducible promoter)는 하나 또는 그 이상의 유도 단서(induction cues)에 반응하는 프로모터이다. 예를 들어, 유도성 프로모터는, 화학적으로 조절된 프로모터[예를 들어, 이의 전사 활성도(transcriptional activity)가 알코올, 테트라시이클린(tetracycline), 스테로이드, 금속 또는 그 밖의 소분자와 같은 화학적 유도성 제제(chemical inducing agent)의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 프로모터], 또는 물리적으로 조절된 프로모터[예를 들어, 이의 전사 활성도가 빛 또는 높거나 낮은 온도와 같은 물리적인 유도인자(physical inducer)의 존재 또는 부재에 의해 조절되는 프로모터]일 수 있다. 유도가능한 프로모터는 또한, 이들 자체가 화학적 또는 물리적 단서에 의해 직접적으로 조절되는 하나 또는 그 이상의 전사 인자에 의해 간접적으로 조절될 수 있다.
그 밖의 유전적으로 조작된 변형물(other genetically engineered modifications)은 또한 조건적일 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 유전자는, 예를 들어 Cre-loxP 시스템과 같은 부위-특이적 DNA 재조합 효소(recombinase)를 사용하여 조건부로 삭제될 수 있다[예를 들어, Gossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36:153-173 and U.S. Application Publication No. 20060014264를 참고하라].
재조합 핵산은, 스페로플라스트 기술(spheroplast technique) 또는 전체-세포 염화리튬 효모 형질전환 방법(whole-cell lithium chloride yeast transformation method)과 같은 다양한 방법을 사용하여 본원에 기재된 세포 내로 도입시킬 수 있다. 세포 내로의 플라스미드 또는 선형의 핵산 벡터의 형질전환에 유용한 그 밖의 방법은, 각각 이의 전체가 참고문헌으로 본원에 포함되는, 예를 들어 U.S. Patent No. 4,929,555; Hinnen et al. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163; U.S. Patent No. 4,879,231; 및 Sreekrishna et al. (1987) Gene 59:115 에 기재되었다. 일렉트로포레이션(Electroporation) 및 PEG1000 전체 세포 형질전환 방법은, Cregg and Russel, Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols, Chapter 3, Humana Press, Totowa, N.J., pp. 27-39 (1998)에 기재된 바와 같이 또한 사용될 수 있다.
형질전환된 균류 세포는, 요구된 생화학적 생산물의 부재[세포의 영양요구성(cell's auxotrophy) 때문에]에서 형질전환 후에 영양 요구성 세포를 배양, 새로운 표현형의 선별(selection) 및 검출(detection), 또는 형질전환체(transformant)에 포함된 내성 유전자(resistance gene)의 부재 하에서 효모에 대해 유독성의 항생 물질(antibiotic)의 존재 하에서의 배양을 포함하지만 이로 제한되지 않는 적절한 기술을 사용하여 선택될 수 있다. 형질전환체는, 게놈 내로 발현 카세트(expression cassette)의 통합에 의해 선별될 수 있고/있거나 확인될 수 있고, 이는, 예를 들어 서전 블롯(Southern blot) 또는 PCR 분석에 의해 평가될 수 있다.
관심 타겟 세포 내로 백터의 도입 전에, 벡터를, 상기에 나타낸 바와 같이, Escherichia coli (E. coli)와 같은 세균 세포(bacterial cells)에서 성장시킬 수 예를 들어, 증폭됨)있다. 벡터 DNA 는, 세균의 환경(bacterial milieu)으로부터의 벡터 DNA 의 정제를 야기하는, 본 분야에서 알려진 방법의 하나에 의해 세균 세포로부터 분리될 수 있다. 정제된 벡터 DNA 는, E. coli 단백질이 표유동물 세포에 유독할 수 있기 때문에, 어떠한 E. coli 단백질이 플라스미드 DNA 제조에 존재하지 않음을 보장하도록, 페놀, 클로로포름 및 에테르과 함께 광범위하게 추출될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 유전적으로 조작된 균류 세포는, OCH1 유전자 또는 이의 유전자 생산물(예를 들어 mRNA 또는 단백질)이 결핍되고, OCH1 활성도에 있어서 결핍된다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 조작된 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현시킨다[예를 들어, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), S. 세레비시아, 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 C. 알비칸스(C. albicans)로부터의 MNN4 폴리펩티드, 또는 P.파스토리스(P. pastoris)로부터의 PN01 폴리펩티드]. 예를 들어, 균류 세포는 Y. 리폴리티카(Genbank® 수납 번호: XM_503217, Genolevures Ref: YALI0D24101g)로부터의 MNN4 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 유전적으로 조작된 세포는 OCH1 활성도가 결핍되고, 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현시킨다.
M6P 잔기의 캡핑이 제거된 후에, 타겟 분자는 분리될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 타겟 분자는 효모 세포 내에 유지되고, 세포 용해액 상에 방출된다. 몇몇 실시형태에서, 타겟 분자는, 세포로부터의 분자의 분비를 유도하는, 코딩 서열(coding sequence)[고유의 외인성 핵산 또는 발현 벡터 내로 조작됨(either native to the exogenous nucleic acid or engineered into the expression vector)]에 의해 제공된 메커니즘(mechanism)을 통해 배양 배지 내로 분비된다. 세포 용해액 또는 배양 배지에서의 캡핑이 제거된 타겟 분자의 존재는, 분자의 존재를 감지하기 위해 다양한 표준 프로토콜에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 변경된 타겟 분자가 단백질일 경우에, 이러한 프로토콜은, 변경된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 이 자체)에 대한 특정한 항체와 함께 면역블러팅(immunoblotting) 또는 방사성 면역침강법(radioimmunoprecipitation), 변경된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 이 자체)에 특이적인 리간드(ligand)의 결합, 또는 변경된 타겟 단백질(또는 타겟 단백질 이 자체)의 특이적인 효소 활성도에 대한 테스트를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 기재된 방법을 사용하여 생산된 타겟 분자에서, 당단백질에서의 적어도 47 %(예를 들어, 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90 %)의 N-글리칸은 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는다. 말단 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 N-글리칸의 퍼센트는 DSA-FACE 일렉트로페로그램(electropherograms)에서의 피크 영역(peak areas)으로부터 추정될 수 있다. 실시예 13 을 참고하라.
몇몇 실시형태에서, 분리한 후에, 캡핑이 제거된 타겟 분자는, 이종의 일부(heterologous moiety), 예를 들어 효소적인 또는 화학적인 수단을 사용하여 부착될 수 있다. "이종의 일부(heterologous moiety)"는 변경된 타겟 분자에 연결된[예를 들어, 공유결합으로(covalently) 또는 비-공유결합으로(non-covalently)]는 어떠한 구성성분(constituent)을 나타내고, 구성성분(constituent)은, 변경된 타겟 분자에 원래 존재하는 구성성분과는 다르다. 이종의 일부는, 예를 들어 중합체, 운반체(carriers), 아쥬반트(adjuvants), 항체독소(immunotoxins), 또는 검출가능한[예를 들어, 형광성(fluorescent), 발광성(luminescent) 또는 방사성(radioactive)] 일부를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 추가적인 N-글리칸은 변경된 타겟 분자에 첨가될 수 있다.
타겟 분자의 글리코실화 반응을 검출하기 위한 방법은, DNA 염기서열 분석기-지원된[DNA sequencer-assisted, DSA)], 형광단-지원된 탄수화물 전기영동법[fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE)] 또는 표면-증감 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량 분석법[Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF MS]을 포함한다. 예를 들어, 당단백질이 변형된 다음에, 예를 들어 막에서 고정화(immobilization)시키는, DSA-FACE 를 사용할 수 있다. 당단백질이 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 또는 J-메르캅토에탄올(J-mercaptoethanol)과 같은 적절한 환원 제제(reducing agent)와 함께 환원될 수 있다. 단백질의 술프히드릴기(sulfhydryl groups)가 요오드아세트산(iodoacetic acid)과 같은 산을 사용하여 카르복실화될 수 있다. 그 다음에, N-글리칸은 N-글리코시다아제 F(N-glycosidase F)와 같은 효소를 사용하여 단백질로부터 방출될 수 있다. N-글리칸은 임의적으로 재구성될 수 있고, 환원-아미노화 반응(reductive amination)에 의해 유도체를 합성시킬 수 있다(derivatized). 유도체 합성된 N-글리칸은 그리고 난 다음에 농축될 수 있다. N-글리칸 분석에 적절한 기기 장치(Instrumentation)는, 예를 들어 ABI PRISM® 377 DNA 염기서열 분석기(Applied Biosystems)를 포함한다. 데이터 분석은, 예를 들어 GENESCAN® 3.1 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 실행될 수 있다. 임의적으로, 분리된 만노단백질(mannoproteins)은 이들의 N-글리칸 상황을 확인하기 위해 하나 또는 그 이상의 효소로 추가적으로 처리될 수 있다. N-글리칸 분석의 추가적인 방법은, 예를 들어, 질량분석법(예를 들어, MALDI-TOF-MS), 일반적인 상(normal phase), 역상에서의 고성능액체크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography, HPLC), 이온교환 크로마토그래피[예를 들어, 글리칸이 표지되지 않은 경우, 펄스 전류 검출(pulsed amperometric detection)과 함께, 및 글리칸이 적절하게 표지된 경우, UV 흡광도(absorbance) 또는 형광(fluorescence)과 함께]를 포함한다. 또한 Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11(4):275-281 and Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564 를 참고하라.
조작된 세포(Engineered Cells)의 배양
본 문서는 또한 본원에 기재된 유전적으로 조작된 세포 중의 하나의 실질적인 순수 배양물(substantially pure culture)을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유전적으로 조작된 세포의 "실질적인 순수 배양물"은, 배양물에서 생존가능한 세포(viable cells)의 전체 수의 약 40 % 미만(즉, 약 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 미만; 또는 더 적게)이 유전적으로 조작된 세포, 예를 들어, 박테리아의(bacterial), 균류(효모를 포함)의, 마이코플라스마(mycoplasmal) 또는 원생동물 세포 외의 생존 가능한 세포인, 이러한 세포의 배양물이다. 이러한 문맥에서의 용어 "약(about)"은, 관련된 퍼센트는 특정한 퍼센트 이상 또는 이하의 특정한 백분률의 15 % 퍼센트일 수 있음을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 약 20 % 는 17 % 내지 23 % 일 수 있다. 유전적으로 조작된 세포의 이러한 배양물은 세포 및 성장, 저장 또는 수송배지(transport medium)를 포함한다. 배지는 액체, 반고체(semi-solid)[예를 들어, 젤리와 같은 배지(gelatinous media)], 또는 동결된 것일 수 있다. 배양물은, 액체 또는 반고체 배지에서 성장한 세포, 또는 동결 저장 또는 수송 배지(frozen storage or transport medium)를 포함하는, 저장 또는 수송 배지에 저장되거나 또는 수송된 배지에서 성장한 세포를 포함한다. 배양물은 배양 용기(culture vessel) 또는 저장 용기(storage vessel) 또는 기질(substrate)[예를 들어, 배양 접시(culture dish), 플라스크, 또는 튜브(tube) 또는 저장 유리병(storage vial) 또는 튜브]에 있다.
본원에 기재된 유전적으로 조작된 세포는, 예를 들어 동결된 세포 현탁액(frozen cell suspensions)으로서, 예를 들어 글리세롤 또는 당과 같은 동해방지제(cryoprotectant)를 포함하는 완충용액에, 동결건조된 세포(lyophilized cells)로서, 저장될 수 있다. 선택적으로, 이들은 예를 들어, 유동층 건조(fluidized bed drying) 또는 분무 건조(spray drying), 또는 그 밖의 적절한 건조 방법 중 하나로 수득된, 예를 들어 건조된 세포 표본(dried cell preparations)으로서 저장될 수 있다.
대사 질환(Metabolic Disorders)
캡핑이 제거된 말단 M6P 잔기를 갖는 분자는 다양한 대사 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 대사 질환은 개별적인 인간(또는 동물) 세포 내에 에너지의 생산에 영향을 미치는 것 중의 하나이다. 몇몇의 대사 질환은 식단, 독소, 감염(infections)의 결과로서 획득될 수 있지라도, 대부분의 대사 질환은 유전적이다. 유전적인 대사 질환은 선천성 대사이상(inborn errors of metabolism)으로서 또한 알려졌다. 일반적으로, 유전적 대사 질환은 세포의 대사 과정에서의 몇몇의 단계에 필수적인 효소가 결핍되거나 또는 적절하지 않게 구성되어 야기되는 유전적 결함(genetic defects)에 의해 초래된다. 대사 질환의 가장 큰 클래스(the largest classes)는, 탄수화물 대사(carbohydrate metabolism)의 질환, 아미노산 대사의 질환, 유기산 대사의 질환[유기 산뇨증(organic acidurias)], 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사(fatty acid oxidation and mitochondrial metabolism)의 질환, 포르피린 대사의 질환(disorders of porphyrin metabolism), 푸린 또는 피리미딘 대사의 질환, 스테로이드 대사의 질환, 미토콘드리아 작용의 질환(disorders of mitochondrial function), 페르옥시좀 작용의 질환(disorders of peroxisomal function), 및 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorders, LSDs)이다.
캡핑이 제거된 말단 M6P 잔기를 갖는 하나 또는 그 이상의 분자(또는 동일한 약제학적 조성물)의 투여를 통해 치료될 수 있는 대사 질환의 예는, 유전성 혈액색소침착증(hereditary hemochromatosis), 안피부백피증(oculocutaneous albinism), 단백질 C 결핍증(protein C deficiency), 제1형 유전적 혈관부종(type I hereditary angioedema), 선천적인 백당분해효소 결핍증(congenital sucrase-isomaltase deficiency), 크리글러-나자르 제2형(Crigler-Najjar type II), 라론 증후군(Laron syndrome), 유전성 미엘로페옥시다제(hereditary Myeloperoxidase), 일차 감상선 기능 저하증(primary hypothyroidism), 선천적 긴 QT 증후군(congenital long QT syndrome), 트롭신 결합 글로블린 결핍증(tyroxine binding globulin deficiency), 가족성 과콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia), 가족성 카일로마이크론혈증(familial chylomicronemia), 알베타-리포프로테이네마(abeta-lipoproteinema), 낮은 플라즈마 리포단백질 A 수준(low plasma lipoprotein A levels), 간 장애(liver injury)를 갖는 유전적 폐기종(hereditary emphysema), 선천성 갑상샘기능저하증(congenital hypothyroidism), 골형성부전증(osteogenesis imperfecta), 유전성 저섬유소원혈증(hereditary hypofibrinogenemia), 알파-1 안티키모트립신 결핍증(alpha-1antichymotrypsin deficiency), 신성요붕증(nephrogenic diabetes insipidus), 신경하수체 당뇨 요붕증(neurohypophyseal diabetes insipidus), 아데노신탈아미노화효소 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 펠리쩨우스-메르쯔바하 병(Pelizaeus Merzbacher disease), 폰빌레브란트병 제IIA형(von Willebrand disease type IIA), 복합 인자 V 및 VIII 결핍증(combined factors V and VIII deficiency), 선천 척추뼈끝 형성이상(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda), 맥락막 결여(choroideremia), I 세포 질병(I cell disease), 거식증(Batten disease), 모세혈관확장성 운동실조증(ataxia telangiectasias), ADPKD-상염색체 우성다낭성 신질환(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease), 미세융모 포접 질병(microvillus inclusion disease), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 로웬의 안뇌신증후군(oculocerebro-renal syndrome of Lowe), 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 베어림프구 증후군(Bare lymphocyte syndrome), 탄지에르질환(Tangier disease), 가족성 간내 담즙정체증(familial intrahepatic cholestasis), X-연관 부신백질이영양증(X-linked adreno-leukodystrophy), 스콧 증후군(Scott syndrome), 헤르만스키-푸드락증후군 제1형 및 제2형(Hermansky-Pudlak syndrome types 1 and 2), 젤웨거증후군(Zellweger syndrome), 점상연골 이형성증(rhizomelic chondrodysplasia puncta), 상염색체 열성 일차성 고수산뇨증(autosomal recessive primary hyperoxaluria), 무어 트라네베르그 증후군(Mohr Tranebjaerg syndrome), 척추성 근위측증(spinal and bullar muscular atrophy), 일차성 섬모의 디스키네시아(primary ciliary diskenesia)[카르타게너 증후군(Kartagener's syndrome)], 말단비대증 및 거인증(giantism and acromegaly), 유즙 분비증(galactorrhea), 에디슨 병(Addison's disease), 부신성 웅성화(adrenal virilism), 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 케토애시도시스(ketoacidosis), 일차 또는 이차성 알도스테론증(primary or secondary aldosteronism), 밀러 디커 증후군(Miller Dieker syndrome), 활뇌증(lissencephaly), 운동 신경 질환(motor neuron disease), 우셔 증후군(Usher's syndrome), 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 옵티즈 증후군(Optiz syndrome), 헌팅턴병(Huntington's disease), 유전성 췌장염(hereditary pancreatitis), 항-인산화지질 증후군(anti-phospholipid syndrome), 중복성 결합 조직 질환(overlap connective tissue disease), 쇼그렌 증후군(
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), 강직인간증후군(stiff-man syndrome), 브루가다증후군(Brugada syndrome), 핀란드 유형의 선천적인 신증후군(congenital nephritic syndrome of the Finnish type), 듀빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), X-연관 하이포스포스파테미아(X-linked hypophosphosphatemia), 펜드레드 증후군(Pendred syndrome), 유아기의 저혈당증(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy), 유전성 구상적혈구증(hereditary spherocytosis), 선천성철분대사이상증(aceruloplasminemia), 영아기의 신경 세로이드 리포푸신증(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 가연골무형성증 및 골단이형성증(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal), 스타가르트-유사 근육 영양실조(Stargardt-like macular dystrophy), X-연관 샤리코-마리-듀스 병(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease), 상염색체 우성 망막색소변성증(autosomal dominant retinitis pigmentosa), 울콧-랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 쿠싱병(Cushing's disease), 지대근이영양증(limb-girdle muscular dystrophy), 뮤코다당체침착증 제IV형(mucoploy-saccharidosis type IV), 피니시의 유전성 가족성 아밀로이드증(hereditary familial amyloidosis of Finish), 아데손 질환(Anderson disease), 육종(sarcoma), 만성 골수-단핵구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia), 심근증(cardiomyopathy), 안면 성기형성 장애(faciogenital dysplasia), 토르시온 질병(Torsion disease), 헌팅턴 및 유전성 실조증(Huntington and spinocerebellar ataxias), 유전성 하이퍼호모시테이네미아(hereditary hyperhomosyteinemia), 말초신경병증(polyneuropathy), 말초운동신경 질환(lower motor neuron disease), 색소성 망막염(pigmented retinitis), 다발성 관절염(seronegative polyarthritis), 간질성 폐섬유증(interstitial pulmonary fibrosis), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 베게너 육종종증(Wegner's granulomatosis), 프레오테이누리아(preoteinuria), CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If, CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc, CDG-IId, 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 다발성 뼈돌출증(multiple exostoses), 그리셀리 증후군(Griscelli syndrome)(제1형 또는 제2형), 또는 X-연관 비-특이적인 정신지체(non-specific mental retardation)을 포함할 수 있다. 게다가, 대사 질환은 이로 제한되지 않지만, 하기와 같은 리소좀 축적 질환을 또한 포함할 수 있다: 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease)(제A형, 제B형, 제C형), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis)(제Ⅰ형, 제Ⅱ형, 제Ⅲ형), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
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)을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia).
대사 질환의 증후(Symptoms)는 수많고 다양하고, 하나 또는 그 이상의, 예를 들어, 빈혈(anemia), 피로(fatigue), 쉽게 힘듬(bruising easily), 저혈소판(low blood platelets), 간 비대(liver enlargement), 비장 거대(spleen enlargement), 골격 약화(skeletal weakening), 폐손상(lung impairment), 감염(infections) [예를 들어, 흉부 감염(chest infections) 또는 폐렴], 신장 손상(kidney impairment), 점진적인 뇌 손상(progressive brain damage), 발작(seizures), 추가적인 두꺼운 태반(extra thick meconium), 기침(coughing), 천명(wheezing), 과량의 침 또는 점액 생성(excess saliva or mucous production), 짧은 호흡(shortness of breath), 복통(abdominal pain), 폐쇄성 창자 또는 내장(occluded bowel or gut), 생식력 문제(fertility problems), 코에서의 폴립(polyps in the nose), 손톱/발톱 및 피부의 곤봉지(clubbing of the finger/toe nails and skin), 손 또는 발의 통증(pain in the hands or feet), 혈관각화종(angiokeratoma), 감소된 땀(decreased perspiration), 각막 및 렌티큘라의 불투명함(corneal and lenticular opacities), 백내장(cataracts), 승모판 탈줄증 및/또는 역류(mitral valve prolapse and/or regurgitation), 심장비대(cardiomegaly), 온도 비내성(temperature intolerance), 걷기의 어려움(difficulty walking), 연하의 어려움(difficulty swallowing), 점진적인 시력 손상(progressive vision loss), 점진적인 청력 손상(progressive hearing loss), 저혈압(hypotonia), 대설증(macroglossia), 반사소실(areflexia), 하부 요통(lower back pain), 수면 무호흡(sleep apnea), 기좌호흡(orthopnea), 졸림(somnolence), 척추전만증(lordosis), 또는 척추측만증(scoliosis)을 포함한다. 결합이 있거나 또는 부재한 단백질의 다양한 유형 및 결과적으로 생성된 질병의 표현형[예를 들어, 대사 질환의 징후적인 표시(symptomatic presentation)] 때문에, 주어진 질환은 특정한 질환에 대해 오직 증후의 특성을 일반적으로 나타낸 것으로 이해할 수 있다. 예를 들어, 파브리병을 가진 환자는, 이로 제한되지 않지만, 온도 과민증(temperature intolerance), 각막의 휠링(corneal whirling), 통증(pain), 피부 발진(skin rashes), 구역(nausea) 또는 설사(dirarrhea)와 같은 상기에 언급한 증상의 특정한 부분집합(subset)을 나타낼 수 있다. 고셔 증후군을 갖는 환자는 비종(splenomegaly), 간경변(cirrhosis), 경련(convulsions), 고긴장(hypertonia), 무호흡(apnea), 골다공증(osteoporosis), 또는 피부 변색(skin discoloration)으로 나타낼 수 있다.
본원에서 기재된 하나 또는 그 이상의 캡핑이 제거된 분자의 투여 뿐만 아니라, 대사 질환은 적절한 영양분 및 비타민[예를 들어, 보조인자 치료(cofactor therapy)], 물리적인 치료 및 통증 치료(medication)로 또한 치료될 수 있다.
주어진 대사 질환의 특정한 성질에 따라서, 환자는 나이를 불문하고 이러한 증후가 나타날 수 있다. 많은 경우에, 증후는 어린 시절(childhood) 또는 성년기 초반(early adulthood)에 나타난다. 예를 들어, 피브리병의 증후는 젊었을 때, 예를 들어 10 살 또는 11 살에 나타날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "점진적인 대사 질환의 위험에 처한(at risk of developing a metabolic disorder)" 피검자(subject)는, 질환이 진행되기 위한 소인, 즉, 하기와 같은 효소에서의 돌연변이의 결과로서 대사 질환이 진행되기 위한 유전(predisposition)의 소인(genetic predisposition)을 갖는 피검자이다: 산성 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase), 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다아제(beta-D-galactosidase), 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase), 베타-헥소사미니다아제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만노시다제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다아제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타아제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타아제 A(arylsulfatase A), 알파-N-아세틸갈락토사미다아제(alpha-N-acteylgalactosaminidase), 아스파르틸글루코사미니다아제(aspartylglucosaminidase), 인두로네이트-2-술파타아제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니데-N-아세틸트랜스퍼라아제(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다아제(beta-D-glucoronidase), 히알루론다아제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴로미니다아제(alpha-neurominidase), 포스포트랜스퍼라아제(phosphotransferase), 산성 리파아제(acid lipase), 산성 세라미다이제(acid ceramidase), 스피노그미엘리나아제(sphinogmyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카텝신 K(cathepsin K), 또는 지단백질지방분해효소(lipoprotein lipase). 명확하게, "점진적인 대사 질환의 위험에 처한(at risk of developing a metabolic disorder)" 피검자(subject)는, 관심 종(species of interest) 내의 모든 피검자는 아니다.
"질환을 갖는 것으로 혐의를 갖는(suspected of having a disorder)" 피검자는 본원에 기재된 바와 같은 대사 질환의 하나 또는 그 이상의 징후를 갖는 사람이다.
치료의 약제학적 조성물 및 방법
캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 타겟 분자는, 치료학적으로 유요한 양의 분자 및 하나 또는 그 이상의 아쥬반트, 부형제(excipients), 담체(carriers) 및/또는 희석제(diluents)를 포함하는 약제학적 조성물 내로 포함될 수 있다. 허용가능한 희석제, 담체 및 부형제는 일반적으로, 수용자의 항상성(recipient's homeostasis)[예를 들어, 전해질 균형(electrolyte balance)]에 분리하게 영향을 미치지 않는다. 허용가능한 담체는, 생체에 적합한, 불활성(inert) 또는 생체흡수가능한 염(bioabsorbable salts), 완충화제(buffering agents), 올리고(oligo)- 또는 다당류, 중합체, 점성-증진제(viscosity-improving agents), 보존제 등을 포함한다. 하나의 대표적인 담체는 생리 식염수(physiologic saline)(0.15 M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 또 다른 대표적인 담체는 50 mM 의 인산나트롬, 100 mM 의 염화나트륨이다. 약제학적 조성물의 제형 및 투여를 위한 기술에서의 추가적인 사항은 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)에서 발견할 수 있다. 추가적인 활성 성분은 조성물 내에 포함될수 있다.
캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 전신 또는 국소(systemic or local)일 수 있다. 약제학적 조성물은, 비경구 및/또는 비경구외(non-parenteral) 투여와 같이 제형화될(formulated) 수 있다. 특정한 투여 양상(Specific administration modalities)은 피하의(subcutaneous), 정맥주사의(intravenous), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 피부를 통한(transdermal), 척추 강내(intrathecal), 경구(oral), 직장의(rectal), 구강의(buccal), 국부의(topical), 코의(nasal), 눈의(ophthalmic), 관절 내의(intra-articular), 동맥 내의(intra-arterial), 지주막 아래의(sub-arachnoid), 기관지의(bronchial), 림프액의(lymphatic), 질의(vaginal), 및 자궁 내의(intra-uterine) 투여를 포함한다.
투여는, 약제학적 조성물의 한 회분(bolus)의 주기적인 주사제일 수 있거나, 또는 외부[예를 들어, IV 백(bag)] 또는 내부[예를 들어, 생체침식성 임플란트(bioerodable implant), 생체 인공 장기(bioartificial organ), 또는 주입된 변경된 N-글리코실화 분자 생산 세포의 콜로니(colony of implanted altered N-glycosylation molecule production cells)]인 저장소(reservoir)로부터의 정맥내(intravenous) 또는 복강내(intraperitoneal) 투여에 의해 연속 또는 반복될 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,407,957, 5,798,113, 및 5,800,828 를 참고하라. 약제학적 조성물의 투여는 하기와 같은 적절한 수송 수단을 사용하여 수행될 수 있다: 펌프(pump)(예를 들어, Annals of Pharmacotherapy, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)를 참고하라 ; 마이크로캡슐화(microencapsulation)(예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,352,883; 4,353,888; 및 5,084,350를 참고하라); 지속적인 방출 중합체 임플란트(continuous release polymer implants)(예를 들어, Sabel, U.S. Pat. No. 4,883,666를 참고하라); 매크로캡슐화(macroencapsulation)(예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 및 4,968,733 및 published PCT patent applications WO92/19195, WO 95/05452를 참고하라); 주사(injection), either 피하의(subcutaneously), 정맥 내(intravenously), 동맥 내(intra-arterially), 근육 내(intramuscularly), 또는 그 밖의 적절한 위치에 ; 또는 경구 투여, 캡슐, 액체, 정제( tablet), 알약(pill), 또는 지속적인 방출 제형(prolonged release formulation).
비경구적인 수송 시스템(parenteral delivery systems)의 예는, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자(ethylene-vinyl acetate copolymer particles), 삼투 펌프(osmotic pumps), 주입가능한 주입 시스템(implantable infusion systems), 펌프 수송(pump delivery), 캡슐화된 세포 수송(encapsulated cell delivery), 리포솜의 수송(liposomal delivery), 바늘-전달된 주사(needle-delivered injection), 바늘을 제외한 주사(needle-less injection), 분무기(nebulizer), 에어로졸(aerosolizer), 일렉트로포레이션(electroporation), 및 경피투여 패치(transdermal patch)를 포함한다.
비경구 투여에 적절한 제형은 일반적으로, 바람직하게 수용자의 혈액과 등장인, 변경된 N-글루코실화 분자(altered N-glycosylation molecule)의 멸균된 수용액(sterile aqueous preparation)[예를 들어, 생리 식염수(physiological saline solution)]을 포함한다. 제형은 단일-투여(unit-dose) 또는 다중-투여 형태로 나타낼 수 있다.
경구 투여에 적절한 제형은, 각각 변경된 N-글루코실화 분자의 예정된 양(predetermined amount)을 포함하는, 캡슐, 카시에(cachets), 정제 또는 로젠지(lozenges) ; 또는 시럽(syrup), 엘릭시르(elixir), 또는 물약(draught)과 같은 수성의 액체 또는 비-수성의 액체에서의 현탁액과 같은 별개의 단위(discrete units)로서 나타낼 수 있다.
국소 투여(topical administration)에 적절한 캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 분자는, 예를 들어 크림(cream), 스프레이(spray), 폼(foam), 겔(gel), 연고(ointment), 고약(salve), 또는 건조 루브(dry rub)로서 포유동물(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 건조 루브는 또한 투여 부위(site of administration)에서 다시 수화될(rehydrated) 수 있다. 이러한 분자는 붕대(bandage), 거즈(gauze), 또는 패치(patch) 내[예를 들어, 스며들게(soaked into)하고 건조시킴]에 직접적으로 스며들게 할 수 있고, 그리고 난 다음에 국소적으로 적용할 수 있다. 이러한 분자는 또한, 국소 투여를 위한 붕대, 거즈 또는 패치에 반액체(semi-liquid), 겔화(gelled) 또는 완전한 액체 상태로 유지시킬 수 있다(예를 들어, U.S. Patent No. 4,307,717을 참고하라).
약제학적 조성물의 치료학적 유효량(Therapeutically effective amounts)을, 본 분야의 기술 중의 하나로 확인할 수 있는 투여량 처방(dosage regimen)에서 이를 필요로 하는 피검자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 온몸에(systemically) 투여 당(per dose), 피검자의 몸무게당 0.01 ㎍/kg 내지 10,000 ㎍/kg의 투여량으로, 피검자에게 조성물을 투여할 수 있다. 또 다른 예에서, 투여량은, 투여 당 피검자의 몸무게 당 1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg 이다. 또 다른 예에서, 투여량은, 투여당 피검자의 몸무게 당 1 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg, 예를 들어 투여당 피검자의 몸무게 당 1 ㎍/kg 내지 10 ㎍/kg 이다.
치료학적 효율(therapeutic efficacy)이 최적이 되도록, 캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 분자는, 상이한 투여 치료 계획(different dosing regimens)에서 첫 번째로 투여될 수 있다. 단위 투여 및 치료 계획은, 예를 들어 포유동물의 종(pecies of mammal), 이의 면역 상태(immune status), 포유동물의 몸무게를 포함하는 요인에 의존한다. 일반적으로, 조직에서의 이러한 분자의 수준을, 예를 들어 주어진 치료 계획의 효율성을 결정하기 위해, 임상적인 테스트 절차(clinical testing procedure)의 일부로서 적절한 스크리닝 검정(screening assays)을 사용하여 모니터할 수 있다.
캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 분자에 대한 투여 횟수는, 의료의 전문가(예를 들어, 의사나 간호사)의 임상적인 판단 및 기술 내에 있다. 일반적으로, 투여 치료 계획은 최적의 투여 파라미터(optimal administration parameters)를 설정할 수 있는 임상적인 시도(clinical trials)에 의해 설정된다. 그러나, 전문가는, 피검자의 나이, 건강, 몸무게, 성별 및 의학적인 상태에 따라 이러한 투여 치료계획은 다양할 수 있다. 투여량의 횟수는 치료가 예방적(prophylactic) 또는 치료학적(therapeutic) 인지에 따라서 다양할 수 있다.
이러한 분자 또는 약제학적 조성물의 독성(Toxicity) 및 치료학적 효과(therapeutic efficacy)는, 예를 들어 세포 배양액 또는 실험 동물(experimental animals)에서의 공지된 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 이러한 절차는, 예를 들어, LD50[50 % 의 개체군에게 치명적인 투여량 (dose lethal to 50% of the population)] 및 ED50[50 %의 개체군에서의 치료학적 유효한 투여량(dose therapeutically effective in 50% of the population)]를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수(therapeutic index)이고, 이는 비율 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 높은 치료학적 지수(high therapeutic indices)를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 약제학적 조성물이 사용될 수 있는 반면에, 주의(care)는, 정상 세포[예를 들어, 비-타겟 세포(non-target cells)]에 대한 잠재적인 손상을 최소화하기 위해 영향을 받은 조직(affected tissue)의 부위(site)에 이러한 화합물을 타겟하는(targets) 전달 시스템(delivery system)을 설계하기 위한 조치를 취해야 하고, 이로 인해 부작용을 줄일 수 있다.
세포의 배양 검정( cell culture assays) 및 동물 연구(animal studies)로부터 획득된 데이터는 적절한 피검자(예를 들어, 인간 환자)에 사용하기 위한 투여량의 범위를 공식화하는데에 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 투여량은, 독성이 적거나 없는 ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentrations)의 범위 내에 일반적으로 놓인다. 투여량은 사용된 제형(dosage form) 및 이용된 투여의 경로에 따라 이러한 범위 내에 다양할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 약제학적 조성물에 대해서[예를 들어, 피검자에서의 대사 질환을 치료하기 위해], 치료학적 유효량은 세포 배양 검정으로부터 처음에 평가될 수 있다. 투여량은, 세포 배양에서의 결정된 바와 같은 IC50 [즉, 징후의 최대한의 저해의 반(half-maximal inhibition)을 실행하는 약제학적 조성물의 농도]을 포함하는 순환 플라즈마 농도 범위(circulating plasma concentration range)를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서의 유효한 투여량을 보다 정확하게 측정하기 위해 사용될 수 있다. 플라즈마(plasma )에서의 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)에서 측정될 수 있다.
본원에서 나타낸 바와 같이, 캡핑이 제거된 M6P 잔기를 갖는 분자의 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 처리된 피검자(treated subject)에게 의학상으로 원하는 결과[예를 들어, 대사 질환의 하나 또는 그 이상의 징후의 개선(amelioration )]를 생산할 수 있는 분자의 양이다. 치료학적으로 유효량(즉, 유효한 투여량)은 피검자 또는 샘플 무게의 킬로그램 당 화합물의 밀리그램(milligram) 또는 마이크로그램(microgram)의 양[예를 들어, 킬로그램당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 500 밀리그램, 킬로그램당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 5 밀리그램, 킬로그램당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램당 약 50 마이크로 그램]을 포함할 수 있다.
피검자는, 어떠한 동물, 예를 들어 인간(예를 들어, 인간 환자) 또는 비-인간 영장류(non-human primate)[예를 들어, 침팬치, 개코원숭이(baboon), 또는 원숭이], 마우스, 랫, 토끼, 기니피그(guinea pig), 게르빌루스쥐(gerbil), 햄스터(hamster), 말, 가축의 종류(type)(예를 들어, 소, 돼지, 양, 또는 염소), 개, 고양이 또는 고래(whale)일 수 있다.
본원에 기재된 분자 또는 이의 약제학적 조성물은, 다른 치료, 예를 들어 대사 질환(예를 들어, 리소좀 축적 질환)의 치료를 갖는 병용요법(combination therapy)으로서 피검자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 병용요법은, 대사 질환(예를 들어, 리소좀 축적 질환)이 진행될, (또는 대사 질환을 갖는 혐의를 가질) 위험이 있거나 또는 이를 갖는 피검자에게 치료학적 이익을 제공하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 제제를 피검자(예를 들어, 인간 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 화합물 또는 약제학적 조성물 및 하나 또는 그 이상의 추가적인 제제를 동사에 투여될 수 있다. 선택적으로, 분자는 첫 번째로 투여될 수 있고, 하나 또는 그 이상의 부가적인 제제는 두 번째로 투여될 수 있고, 또는 반대로 투여될 수 있다.
이전의 치료(previous)가 특히 독성이 있다면[예를 들어, 현저한 부작용 프로파일(side-effect profiles)을 갖는 대사 질환를 위한 치료], 본원에 기재된 분자의 투여는, 독성은 없지만 동일하거나 또는 개선된 치료 이익이 주어진 충분한 수준으로, 이전의 치료(previously therapy)의 양을 상쇄(offset) 및/또는 줄이는데 사용될 수 있음을 인지할 수 있는 것이다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 어떠한 것은, 투여를 위한 지시(instructions)를 함께 갖는 용기(container), 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser)를 포함할 수 있다.
하기의 내용은 본 발명의 실행의 예이다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되지 않는다.
[실시예]
[실시예 1]
인산화된 N-글리칸(phosphorylated N-glycans)의 보다 높은 정도(higher degree)를 갖는 야로위아 리폴리티카의 조성(Creation)
Y. 리폴리티카에서의 글리칸의 인산화반응을 상향조절하기(upregulate) 위해, 스트레인 MTLY60 을 MNN4 유전자의 2 개의 여분의 복제물과 함께, 분리된 발현 벡터(separate expression vector)에서 각각을 형절전환시켰다. MNN4 유전자는 효모에서의 글리칸 인산화반응을 증가시키는데 포함되었다. 도 1 은 TEF 프로모터의 조절 하에서 MNN4 오픈 리딩 프레임(MNN4 open reading frame)을 포함하는, pYLTmAXMnn4 을 생산하기 위해 MNN4 유전자가 클로닝된 pYLTmAX 플라즈마의 도식도를 포함한다. 스트레인은, MNN4 유전자의 두 개의 여분의 복제물, hp4d 프로모터의 조절 하의 하나 및 TEF1 프로모터의 조절 하의 하나를 포함하는 것으로 만들어졌다. N-글리칸은, 스트레인 MTLY60Doch1[MNN4의 1 야생형 카피(1 wild type copy)], 스트레인 MTLY60Doch1+Hp4dMNN4[MNN4의 1WT +1 여분의 카피(1WT +1 extra copy of MNN4)] 및 스트레인 MTLY60Doch1+Hp4dMNN4+TEFMNN4 [ Mnn4의 1WT + 2 여분의 카피(1WT +2 extra copies of Mnn4)]로부터 제조되었고, DNA 염기서열 분석기-지원된[DNA sequencer-assisted, DSA)], 형광단-지원된 탄수화물 전기영동법[fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE)]로 검정하였다. Callewaert et al., Glycobiology 11(4):275-281 (2001)를 참고하라. 도 2 에서의 결과를 기초로 하여, 모노 인산화된 피크(mono phosphorylated peak)는 1 여분의 카피를 갖는 스트레인에서 상향조절되었고(upregulated), 더블 인산화의 피크(peak of double phosphorylation)가 나타남을 추정할 수 있다. 2 여분의 카피를 갖는 스트레인에서, 더블 인산화된 피크(double phosphorylated peak)는 보다 높았고, 중립의 Man8GlcNAc2 당의 피크는 보다 낮았다.
[실시예 2]
균류 기원(fungal origin)의 인산화된 글리칸에 나타난 캡핑된(capping) 만 노스의 캡핑을 제거할 수 있는 만노시다제의 확인
효모 및 곰팡이(filamentous fungi)에 의한 당의 인산화반응은, 만노스-포스포-만노스 디-에스테르 결합(mannose-phospho-mannose di-ester linkage)을 야기한다(도 3). 인산염이 모노-에스테르 결합에 있는 구조를 수득하기 위해, 만노시다제는, 높은 만노스 글리칸 구조의 만노스의 6 위치에 부착된 인산염을 남기는(leaving), 만노스-포스페이트 결합(mannose-phosphate linkage)을 가수분해할 수 있음을 요구한다. Chiba et al., Glycobiology, 12(12):821-8 (2002)는, Cellulomonas 종으로부터의 만노시다제가 만노스의 캡핑을 제거할 수 있음을 나타내었다. 그러나, Chiba et al. 오직 부분적으로 만노시다제 단백질을 정제하였고, 단백질을 코드화하는 유전자를 확인할 수 없었다.
셀로로시미크로비움 셀룰란스(Cellulosimicrobium cellulans)[또한 오엘스코비아 잔티네올리티카(Oerskovia xanthineolytica) 및 아르스로박터 루테우스(Arthrobacter luteus)로서 알려짐] 분리물(isolate)을 LMG 박테리아 수집물(collection)로부터 수득하였고, 만노시다제 활성도의 생산에 대해서 테스트하였다. 배지에서 만노시다제를 분비하게 하기 위해, 박테리아를 30 ℃ 로 배지를 포함하는 만난(mannan) 성장시켰다. 박테리아성 상청액(Bacterial supernatants)(SN)을 배양물로부터 수득하였고, 실시예1 에 기재된 MNN4 과잉발현된 스트레인(overexpressing strain)으로부터 유도된 분리된 N-글리칸과 함께 SN 을 배양하여 원하는 만노시다제 활성도를 테스트하였다. 배양 후에, 글리칸을 DSA-FACE 로 검정하였다(도 4).
SN 으로 처리한 후에, 글리칸은 추가적인 전하(charge)를 얻었고, 전기장(electric field)에서 보다 빨리 이동하였고, 일렉트로페로그램(electroferogram)의 좌측편(left hand side)으로 이동하였다. 만약 이러한 빠른-러닝 구조물(fast-running structures)이 실제로 포스포모노에스테르-치환된 높은 만노스 글리칸(phosphomonoester-substituted high mannose glycans)이라면, 이들은 동일한 위치에서 러닝한(running) 중성의 산물(neutral products)보다 크기에서 보다 클 것이다. 포스파타아제(phosphatase)로 이러한 글리칸의 처리는 보다 천천히 움직이는(run) 중성의 올리고당을 야기할 것이다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 송아지 장내 포스파타제(calf intestine phosphatase, CIP)로 처리는, 포스파타제가 말단이고, 만노스의 캡핑이 제거됨을 증명하는, 보다 낮은 전기영동이동도(lower electrophoretic mobility)를 나타내는 피크(peaks)를 결과로서 나타내었다.
[실시예 3]
만노시다제의 부분적인 정제 및 추가적인 확인
만노시다제를 정제하기 위해, C. 셀룰란스을 1 L의 배지 B (Bagiyan et al., Eur. J. Biochem. 249(1):286-92 (1997))또는 배지 A (Chiba et al., 2002, supra)에서 성장시켰다. 표 1 을 참고하라. 그 후에, 배지를 40 % 및 80 %의 황산암모늄(ammonium sulphate)으로 침전시키고(precipitated), 샘플을 SDS-PAGE 로 분석하였다. 황산암모늄 분획을 1 mM CaCl2 을 갖는 20mM Na-인산 완충용액(phosphate buffer) pH 6.5 에 반하여(against) 투석한 다음에, MNN4 과잉발현된 스트레인(실시예 1)으로부터 유도된 올리고당에서 활성도에 대해서 테스트하였다.
[표 1]
Figure 112017097690755-pat00004
둘 다의 배양 조건(cultivation conditions)은 캡핑을 제거하는 활성도(uncapping activity)의 생성을 결과로 나타낸다. 배지 B 로부터 유도된 40 %의 황산암모늄 분획(fractions)만이 활성도를 나타낸 반면에, 배지 A 상청액의 모든 분획은 활성도를 나타내었다.
배지 A 배양으로부터 유도된 40 % 의 황산암모늄 샘플은 실리카-기저 겔 여과 컬럼(silica-based gel filtration column) 상에서 추가적으로 정제되었다(도 6). 이는 약 670 kDa 의 숄더(shoulder)를 갖는 피크를 결과로 나타내었다.
인산염의 캡핑이 제거된 활성도를 테스트하기 위해, 모든 용리 분획(elution fractions)을, [하기의 CIP-소화(digest)와 함께 또는 없이] MNN4 과잉발현된 야로위아 리폴리티카 스트레인(실시예 1에 기재됨)으로부터 유도된 올리고당과 함께 배양하였다. 캡핑 제거(decapping) 및 만노시다제의 활성도는 샘플의 모두에서 관찰되었다. 샘플을 SDS-PAGE 에서 또한 분석하였고(도 7), 이는 단지 하나의 단백질 밴드(protein band)가 아닌 여러 가지의 단백질 밴드를 나타내었다. 몇몇의 밴드는 겔(gel)로부터 절단되었고(cut out), 이들 서열의 일부를 질량 분석법(Mass Spectrometry)을 사용한 드 노보 펩티드 시퀀싱(de novo peptide sequencing)에 의해 분석하였다.
드 노보 시퀀싱은 몇몇의 펩티드 서열을 결과로 나타내었고, 이는 BLAST를 사용하여 불필요하지 않는 데이터베이스(non redundant database)에서 상기 서열에 대해서 비교하였다. 하기의 단백질에 대해 상동을 갖는 펩티드를 확인하였다: 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase), 가상 단백질(hypothetical protein), 추정상의 알파-1,2 만노시다제(putative alpha-1,2 mannosidase)(표 2에 나타낸 확인된 펩티드)[마그네토스피릴룸(Magnetospirillum)으로부터의 만노시다제와 상동], 및 아미노펩티다아제 Y(aminopeptidase Y). 포스포디에스테라아제는 가능한 후보물질이지만, 6 개의 펩티드 중의 2 개만이 히트(hit)를 주었다. 만노시다제는 또한 2 개의 상이한 만노시다제에 대한 3/5 및 5/5 히트를 갖는 후보물질(candidate)이다.
[표 2]
Figure 112017097690755-pat00005
[실시예 4]
전체 게놈 시퀀싱(whole genome sequencing)을 기초로 한 원하는 서열을 갖 는 만노시다제의 확인
*원하는 활성도에 대해 코딩하는 만노시다제 유전자를 확인하기 위해, C. 셀룰란스의 게놈을 Titanium 454 sequencing (Eurofins MWG Operon)을 사용하여 서열화하였다(sequenced). 높은 GC 함량 때문에, 시퀀싱(sequencing)이 오직 부분적(1.96 Mbases)이고, 낮은 품질[오직 낮은 평균 콘틱 크기(low average contig size)]을 나타내었다. 에멀젼 PCR(emulsion PCR, emPCR) 동안에 루프 형성을 야기하는 게놈의 높은 GC 함량은 삭제 및 매우 짧은 서열을 결과로 나타내었다.
이러한 문제는, Roche에 의한 베타 테스트(beta testing)를 가능하게 만들 수 있는 emPCR에 대한 새로운 시퀀싱 화학(new sequencing chemistry )을 사용하여 극복하였다. 이는 보다 개선된 서열(4.7 Mbases)을 제공하였고, 글리코실 히드롤라제 패밀리 92(glycosyl hydrolase family 92)에 속하는 5 만노시다제 유전자의 확인을 가능하게 하였고, 실시예3 에 기재된 펩티드로부터의 서열에 해당하는 이들 중 하나(CcMan1, SEQ ID NO:6)를 수득하였다. 패밀리 38 및 47 로부터 어떠한 만노시다제가 발견되지 않았다. 각각의 CcMan1-CcMan4 의 개시 코돈(start codon)은 MetaGeneAnnotator(metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/metagene/ 에서의 월드와이드 웹을 참고하라 )에 의해 예측되었고, 알려진 유전자와 함께 Blast 결과를 비교하였다. CcMan5의 개시 코돈은, 이는 서열로부터의 누락(missing) 때문에 예측될 수 없었다. 각각의 유전자의 신호 서열은 두 가지 방법[뉴럴 네트워크(neural networks) 및 히덴 마르코프 모델(hidden markov models)]으로 신호 P (cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 에서의 월드와이드웹을 참고하라)로 예측되었다.
도 8 내지 12는, C. 셀룰란스로부터의 5 만노시다제 유전자의 뉴클레오티드 및 코드화된 아미노산 서열을 포함한다.
[실시예 5]
캡핑이 제거된(decapping) 생체외 또는 생체내 만노스의 이형 발 현(Heterologous expression)
만노시다제에 의한 효모 유형 인산화반응(yeast type phosphorylation)의 캡핑 제거(decapping)를 가능하게 하기 위해, 이는 치료학적 용도의 단백질이 발현되는 상이한 숙주(different host) 또는 동일한 균류 숙주(same fungal host)에서 이종으로(heterologously) 발현되어야 한다. 후자의 경우에, 이는 공동 분비될(co-secreted) 수 있거나 또는 세포내 구간[예를 들어, 골지체 또는 소포체(endoplasmic reticulum)]에 타겟될(targeted) 수 있다. 이는 발현 벡터에서 프로모터 다음에 실시가능하게 연결된 유전자[타겟 숙주에 대해 최적화된 코돈 또는 아님(be it codon optimised for the target host or not)]를 클로닝(cloning)하여 실행할 수 있다. 만노시다제는, 쉬운 검출 및 정제를 가능하게 하는 에피토프 태그(epitope tag)와 함께 태그될 수 있거나, 이와 같이 발현될 수 있다. 세균 세포(bacterial cell)의 주변세포질(periplasm)에 분비될 수 있거나 또는 세포 내에 발현될 수 있다. 균류 숙주(fungal host)에서의 발현의 경우에, 상기 서열은 세포내 구간 또는 둘 다에 상기 단백질을 타겟하기 타겟팅 신호(targeting signal) 또는 분비신호(secretion signal)를 포함할 수 있다. 표 3 은 균류 유기체(fungal organisms)에서 발현을 위한 분비 및 타겟팅 신호의 목록을 포함한다. 이러한 발현 벡터의 예는 도 13 에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112017097690755-pat00006
CcMan1-Man5 유전자는 E. coli 에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 코돈 최적화된 서열(codon optimized sequences)에 대한 도 14 내지 18 을 참고하라. 표 4 는 각각의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열의 길이 및 신호 서열이 없는 각각의 폴리펩티드의 예측된 분자량을 포함한다.
[표 4]
Figure 112017097690755-pat00007
[실시예 6]
C. 셀룰란스 글리코실 히드롤라제(Glycosyl Hydrolase, GH) 패밀리 92 효소 의 클로닝 및 활성도
CcMan1-CcMan5 코돈 최적화된 핵산(codon optimized nucleic acids)을, 주변 세포질 발현을 위해, Spy 신호 서열을 포함하는 E. coli 벡터 pLSH36 , 및/또는 DsbA 신호 서열을 포함하는 pLSAH36 내로 클로닝하였다. pLSH36 및 pLSAH36 둘 다는 폴리히스티딘 태그(polyhistidine tag) 및 쥣과 카스파아제-3 사이트(murine caspase-3 site)를 갖는 코드화된 폴리펩티드를 결과적으로 나타내고, 이는 정제하는 동안에 His6-tag의 제거에 사용될 수 있다. 도 19 는, C. 셀룰란스 GH92 유전자를 벡터 내로 도입하기 위한 클로닝 전략 및pLSH36 및 pLSAH36 벡터의 도식도를 포함한다. 클로닝 후에, 상이한 만노시다제를 E. coli BL21 + pICa2 발현 스트레인 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 스트레인은, 0.5 내지 1 의 광밀도(optical density)로 성장시켰고, 1 mM의 이소프로필 β-D-1-티오칼록토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)와 유도되었다. 상이한 세포 분획물(cell fractions)[배지, 주변세포질, 가용성 및 불용성 분획물(soluble and insoluble fraction)]을 분리하였고, 항-His 6 항체와 함께 SDS PAGE 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 분석하였다. CcMan1, CcMan2, 및 CcMan3에 대해서, 발현은 모든 분획물에서 발견되었다. CcMan4 및 CcMan5에 대해서, 발현은 가용성 분획물에서 가장 높았지만, 몇몇 발현은 그 밖의 분획물에서 발견되었다.
CcMan1-CcMan5 단백질의 활성도를 측정하기 위해, 활성도 테스트를, Chiba et al., 2002, supra 에 나타낸 바와 같이 메틸움벨리페릴 알파 만노시드(methylumbelliferyl alpha mannoside, MUM)을 사용하여 수행하였다. CcMan1 및 CcMan2 에 대해서, 배지 및 주변 세포질 샘플은 MUM을 약하게 가수분해하였지만, CcMan3 및 CcMan5 는 MUM 을 가수분해할 수 없었다. CcMan4 의 가용성 분획물은, CcMan4 가 α1,2-만노시다제 활성도를 갖는 유일한 만노시다제임을 나타내는, 가장 높은 형광성 신호(highest fluorescent signal)를 제공한다.
5의 상이한 C. 셀룰란스 만노시다제의 모든 배지 및 주변 세포질의 샘플은, 이들이 당을 분해할 수 있고, 만노스-6-인산염(mannose-6-phosphate)의 만노스의 캡핑을 제거(uncap) 할 수 있는지를 보기 위해서, 실시예 1의 MNN4 과잉발현되는 스트레인으로부터 유도된 당(본원에서 MNN4 당으로서 본원에서 언급됨)에서 또한 테스트되었다. 당을 밤새 배양시켰고, DNA 시퀀서-지원된, 형광단-지원된 탄수화물 전기영동(DNA sequencer-assisted, fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, DSA-FACE)에 의해 분석하였다. 배지 샘플의 당 프로파일(sugar profiles)은, 일렉트로페로그램에서의 무관한 피크(irrelevant peaks)를 결과로서 나타낸 배지 프리젠테이션(medium presentation)에서의 형광성 분자(fluorophoric molecules) 때문에 분석할 수 없다. CcMan1, CcMan2 및 CcMan3 의 주변세포질의 당 프로파일은 분해(degradation) 및 캡핑 제거를 나타내지 않았고, CcMan4 은 분해를 나타내었고, CcMan5 는 캡핑 제거 활성도를 나타내었다(도 20). 캡핑이 제거된 당에서의 CIP-소화(digest)는 중성의 Man8 로 이동한 탈인산화된 피크(dephosphorylated peaks)로서의 CcMan5의 캡핑 제거된 활성도를 확인해주었다.
유효한 만노시다제 CcMan4 및 CcMan5 는 Bt3990 (744 AA) 및 Bt2199 (739 AA), 알려진 구조를 갖는 패밀리 92 만노시다제와 함께 배열되었다[Zhu et al., Nat. Chem. Biol., 6(2):125-32. Epub 2009 Dec 27 (2010)를 참고하라]. 도 21 을 참고하라. CcMan4 및 CcMan5 의 첫 번째 부분만이 Bt3990 및 Bt2199 과 배열되었기 때문에, 이들이 큰 단백질이기 때문에, 이는 각각의 단백질을 별도로 첫 번째 도메인을 클로닝하고, 활성도를 테스트하기로 결정하였다. CcMan4domain (1-3357 bp, 즉, SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1-3357) and CcMan5domain (1-2322 bp, 즉, SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 1-2322)을 pLSAH36 E. coli 발현 벡터 내로 클로닝하였다. pLSAH36 클로닝 벡터의 도식도에 대한 도 19를 참고하라. 발현 벡터를 E. coli BL21 + pICa2 발현 스트레인 내로 형질전환시키고, 이를 0.5 내지 1 의 OD 로 성장시키고, 1 mM IPTG 와 함께 유도시켰다. 상이한 세포 분획물(cell fractions)[배지, 주변세포질, 가용성 및 불용성 분획물(soluble and insoluble fraction)]을 분리하였고, 항-His 6 항체와 함께 SDS PAGE 및 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 분석하였다. 발현은 모든 4 세포 분획물에서 발견되었다.
도메인의 활성도는 Mnn4 당에서 테스트하였다. 여기에, 각각의 CcMan4domain 및 CcMan5domain 의 주변세포질 분획물을 Mnn4 당의 존재 하에서 배양하였고(도 22), DSA-FACE로 분석하였다. 이러한 실험은, 분해를 발견할 수 없기 때문에, CcMan4domain 은 이의 만노시다제 활성도를 상실함을 나타내었다[도 22, 패널(panel) 4]. 이와 대조적으로, CcMan5domain 은 이의 캡핑이 제거된 활성도를 유지하였다(도 6, 패널 5).
[실시예 7]
CcMan5 및 이의 패밀리 92 상동 도메인(homologous domain)의 생산 및 정제
재조합 CCman5 도메인(SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1-4995) 및 CCMan5 도메인(SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1-2322)은, 발현 벡터 pLSAHCcMan5 및 pLSAHCcMan5domain 로 형질전환시킨 E. coli 스트레인 BL21codon + pICA2 에서 발현되었다. 발현을 λpL-프로모터(λpL-promotor)의 조절 하에서 IPTG 에 의해 유도되었다(WO 98/48025 및 WO 04/074488를 참고하라). pLSAH의 설명(description)에 대한 실시예 6 및 도 19 를 참고하라. 형질전환된 박테리아를, 암피실린(100 ㎍/ml) 및 1 % 글리세롤로 보충된 LB 배지가 제공된 20 리터의 발효조(fermenter)에서 1/100 접종(inoculation) 전에, 암피실린(100 ㎍/ml) 및 카나마이신(50 ㎍/ml)로 보충된 Luria Bertani(LB) 배지에서 28 ℃로 밤새 성장시켰다. 처음의 교반 및 공기 흐름(airflow)은 각각 200 rpm 및 1.5 l/min이고, 30 % 로 pO2 를 유지되도록 자동적으로 조종되었다. 온도를 28 ℃로 유지시켰다. 세포를 A600 nm = 1.0의 광밀도(optical density)로 성장시키고, 20 ℃ 에서 이동시키고, 발현은 1 mM IPTG 의 첨가로 밤새 유도되었다. 세포를 재취한 다음에 -20 ℃ 로 동결시켰다. 해동(thawing) 후에, 세포를, 50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM PMSF 및 10 ㎍/ml DNaseI 에서 3 ml/g 의 농도로 서서히 재현탁시켰다(resuspended). 주변세포질 분획물(periplasmic fraction)을 4 ℃로 1 h 동안 세포 현탁액(cell suspension)을 교반시켜 제조하였고, 30 min 동안 18,000 x g 로 원심분리하여 분리하였다. 모든 단계를 4 ℃에서 처리하였다. 투명한 상청액을 20 ml Ni-Sepharose 6 FF column (GE Healthcare)에 적용시키고, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 0.1 % CHAPS 와 함께 평형을 유지시켰다. 컬럼을, 동일한 완충용액에서 50 mM의 이미다졸과 함께 추가의 세척 단계 후에, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4, 20 mM NaCl, 400 mM 이미다졸, 0.1 % CHAPS 와 용리시켰다(eluted). 용리 분획물(elution fraction)을 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 % CHAPS 와 1/10으로 희석시키고, 오염물질(contaminant)을 제거하기 위해 14 ml Source 15Q column (GE Healthcare)에 로딩시켰다(loaded). 평형(equilibration) 후에, 관심 단백질을, 20 mM 트리스, 0.1 % CHAPS 에 0 내지 1 M 의 10 컬럼 부피(column volumes)의 NaCl 상에서 선형 구배(linear gradient)로 용리시켰다. 분획물을 포함하는 CcMan5 및 CcMan5 도메인을, 러닝 용액(running solution)으로서의 PBS 와 함께 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade 에 추가적으로 주입시켰다. 수득한 분획물을 항-His6 항체와 함께 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 분석하였다. 마지막으로, 농도를 BCA 검정(Pierce)을 사용하여 측정하였다. 전장 CcMan5 단백질에 대한 정제된 수득물은 5.7 mg이고, CcMan5 패밀리 92 도메인에 대해서, 이들의 20 L 발효물(fermentations)로부터 이는 110 mg 이었고, 이는 패밀리 92 도메인만이 생산될 수 있고, 보다 높은 수득률로 정제될 수 있음을 나타낸다. 정제된 CcMan5 도메인의 활성도를, 실시예 6 에 나타낸 바와 같은 Mnn4 분리된 당에서 테스트하였다. 캡핑이 제거된 당 프로파일을 수득하였다.
[실시예 8]
CcMan 5 도메인의 구조
CcMan51-774 [SEQ ID NO:20의 뉴클레오티드 1 내지 2322에 의해 코드화된, SEQ ID NO:50의 잔기 1 내지 774; 이의 자연 발생적인 선도 서열이 제거된 후(after removal its natural leader sequence)의 성숙 단백질(mature protein)에 상응함]는, DsbA 선도 서열(leader sequence) 후에 N-말단 6xHis tag에서 시작해서 그 다음에 9 아미노산 링커(VGPGSDEVD, SEQ ID NO:21)를 갖는 융합단백질로서 E. coli BL21 (DE3) 주변 세포질에 발현되었다. 세포를, 28 ℃ 에서 100 ㎍/ml 의 카나마이신 및 100 ㎍/ml 의 암피실린을 포함하는 M9 배지에서 배양하였다. 0.4 의 OD600 에서, CcMan51-774 발현은 1mM IPTG 의 첨가에 의해 유도되었고, 배양물을 18 ℃ 로 밤새 추가적으로 성장시켰다. 밤새 배양(overnight culture)으로부터의 세포를 원심분리에 의해 채취하였고, 세척하고, 스페로플라스크(spheroplast)를 만들기 위해, 20　mM Tris/HCl pH　8.0, 20% 수크로스, 5 mM EDTA, 및 0.1 mg/ml 라이소자임(lysozyme)을 포함하는 완충용액과 함께 4 ℃에서 20 min 동안 배양하였다. 주변 세포질 단백질을 20 min 동안 20,000 xg 로 원심분리에 의해 스페로플라스크로부터 분리하였다. CcMan51-774 를, 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)[HisTrap HP, GE Healthcare, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl를 포함하는 완충용액 하에서 로딩(loading), 및 400 mM 까지의 이미다졸 구배(imidazole gradient up)를 사용하여 용리시킴], 이온 교환 크로마토그래피[HiTrap Q FF, GE Healthcare, 완충용액: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 40 mM NaCl 및 1 M 까지의 NaCl 구배], 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)[HiTrap Phenyl HP, GE Healthcare, 로딩 완충용액(loading buffer): 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM NaCl, 1 M (NH4)2SO4 및 0 mM 까지의 (NH4)2SO4 구배를 사용하여 용리시킴]로 주변 세포질 추출물로부터 정제하였다.
정제된 CcMan51-774 를 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM NaCl에서 130 mg/ml로 농축시키고, 접시-모양의 결정(plate-like crystals)(0.2x0.07x0.01 mm3)을, 0.2 M Na fluoride, 0.1 M Bis-Tris propane pH 7.5 and 20% PEG 3350 을 포함하는 결정화 용액(crystallization solution)을 사용하여 수증기 발산(vapor diffusion)에 의해 성장시켰다. 결정을, 10%(v/v) 글리세롤로 보충된 결정화 용액(crystallization solution)을 포함하는 냉동보존 용액(crystallization solution) 내로 간단하게 이동시켰다. 단일 결정 회절 데이타를 Swiss Light Source에서의 PXIII 빔라인(SLS, Villigen, Swiss) 및 European Synchrotron Radiation Facility에서의 빔라인(beamline) BM30A(ESRF, Grenoble, France)에서 수집하였다. CcMan51-774 의 구조를, Au L-III 흡수단(absorption edge)에 대응하는, 11.958 keV에서의 SAD 실험으로부터의 실험 단계(experimental phases)의 추정(calculation)에 대한 KAuCl4-흠뻑 젖은(soaked) 결정을 사용하여 해결하였다. 도 33 은, 촉매 중심(catalytic center)의 구조적인 좌표(structural coordinates)를 포함한다. 실험단계로부터의 만들어진 CcMan5 모델(model)은, 각각 19.3 및 23.9 % 의 최종의 R- 및 유리R-인자(final R- and freeR-factor)에 대한 천연의 결정(native crystal)으로 수집된 2Å 해상도 데이터(resolution data)에 대비한 최우추정법(maximum likelihood methods)에 의해 개선되었다. 최종의 모델은, 분자당 11.513 단백질 원소(protein atoms), 860 용매 원소(solvent atoms), 2 Ca2+ 이온 및 1 비스-트리스-프로판(bis-tris-propane) 및 글리세롤 분자를 포함하는, 비대칭 유닛(asymmetric unit)당 2 CcMan51-774 분자(잔기 8 내지 771)를 포함한다.
서열 유사성(sequence similarity)을 기초로, CcMan5 는 글리코실 히드롤라아제의 패밀리 92 (family 92 of glycosyl hydrolases, GH92)의 부류에 속하고, 이는 엑소-액팅 알파-만노시다제(exo-acting alpha-mannosidases)로서 나타낸다. α1을 갖는 2 GH92 패밀리 멤버 , 2-만노시다제 활성도에 대한 X-선 구조가 가능하였다: Bt3990 및 Bt2199[각각, PDB 접근 코드(access codes ) 2WVX 및 2WVY]. 전체적인 폴딩(overall fold)을 여기에서 해결된 CcMan51-774 구조로부터의 볼 수 있었고, PDB entry 2xsg 로서 두었고, 각각 Cα원자와 매치된 624 및 621 상에서의 1.99 Å 및 2.12 Å의 r.m.s.d (근평균 표준 편차, root mean standard deviation) 수치를 갖는 Bt3990 및 Bt2199 둘 다에서 나타낸 것에 대응한다. CcMan51-774는 α-나선형 링커(α-helical linker)(잔기 272 내지 290)를 통해 연결된, N-말단 β-샌드위치 도메인(잔기 8 내지 271) 및 C-말단 (αα)6 배럴 도메인(잔기 291 내지 771)인, 두 개의 도메인으로 구성되어 있다. 둘 다의 도메인 사이의 인터페이스(interface)는, 보존된 촉매 Ca2+ 이온을 포함하는 스웰로 캐비티(shallow cavity)를 구체화하고, -1 기질 결합 부위(-1 substrate binding site)[명명법: Davies et al., Biochem. J. 321:557-9 (1997)] 및 촉매 중심(catalytic center)을 구체화한다(도 23 및 24).
GH92 패밀리 글리코실 히드롤라제는, 방출된 만노스에서의 아노머 입체배치(anomeric configuration)의 역위(inversion)를 유도하는, 단일 변위 매커니즘(single displacement mechanism)을 통해 글리코시드 결합 가수분해(glycosidic bond hydrolysis)를 촉매하는 Ca2+-의존적인 알파-만노시다제이다(Zhu et. al., 2010, supra). CcMan51-774 에서, 촉매 Ca2+는, 등가의 좌표 평면(equatorial coordination plane)에 놓여진, Asn 588의 카르보닐 산소(carbonyl oxygen), 각각의 Glu589 및 Asp662 의 카르복실 산소, 및 세 가지의 물 원자(W1, W2, W3 -도 23을 참고하라)을 통해 팔면체적으로 편성되었다(octahedrally coordinated). 추가적인 물 분자(W4)는 촉매 중심에 가까운 것으로 나타났고, 보존된 쌍(conserved pair) Asp 660 및 Asp 662 의 카르복실기에 결합한다. 촉매 Ca2+ 를 둘러싸는 기질 결합 캐비티(substrate binding cavity)는 잔기 Asn 588, Gln 589, Thr 626, Thr 658, Asp 22, Asn 25, Gly 71, Gly 72, Phe 195, Tyr 196, Arg 405, Trp 354, Tyr 535, 및 Gln536에 의해 줄이 형성된다(lined)(도 23).
CcMan5 는, 기질로서 만노스-알파-1-포스포-6-만노스 (Man-P-Man)를 받아들이고 알파-1,2-, 알파-1,3-, 알파-1,4- 또는 알파-1,6-만노시다제 활성도가 결여되는 이의 독특한 능력 때문에 GH92 패밀리에서 그 밖의 알파-만노시다제와는 구분된다. 이러한 독특한 기질 특이성이 생기게 하는 CcMan5 활성 부위(active site)에서의 식별할 수 있는 잔기에서의 통찰력을 얻기 위해서, Man-P-Man을 비대칭 유닛(the asymmetric unit)의 분자 B 의 CcMan51-774 활성 부위 내로 설계하였다(도 25). -1 만노스의 위치(Positioning)는 Bt3990 에서 관찰된 그로스 결합 입체배치(gross binding conformation)를 기초로하고, 아포 활성 부위(apo active site)에 나타난 두 개의 물 분자(W2 및 W3) 및 글리세롤 분자의 위치에 의해 안내되었다. 이러한 방식에서, -1 만노스의 O2, O3, O4 및 O6 히드록실기는, 각각 물 분자 W2, W3 및 글리세롤 분자의 01 및 03 히드록실기에 대해 관찰된 이러한 것들에 대한 동등한 위치를 차지한다. 따라서, 만노스 -1 02 및 03 히드록실기는 actohedral Ca2+ 배위권(coordination sphere)의 적도면에 위치한다. 03 은 Asp 355 카르복실기에 대한 추가적인 수소결합을 형성한다. 후자는, Arg 405 구아니디듐기(guanidinium group)의 H-결합 거리(H-bonding distance) 내로 또한 오는, O4 히드록실에 대한 H-결합을 추가적으로 제공한다. 06 히드록실 및 05 산소는 Gly 71 아미드를 갖는 H-결합을 포함할 수 있다. 모델링(modeling)에 대해서, -1 만노스는 이의 바닥상태 의자 입체배치에서 유지시켰다. Bt3990 에 대해 관찰된 바와 같이, Ca2+ 와 이상적인 배위(idealized coordination) 내로 오기 위한 02 히드록실기의 위치는, 반 의자 입체배치에 대한 당 고리의 뒤틀림(distortion)을 유도할 수 있다(도 25 를 참고하라). 촉매 동안에 당 고리의 뒤틀림(distortion)이, 02 히드록실과 함께 친핵체(nucleophile)의 유입(incoming)의 1,2-이축방향 상호작용(1,2-diaxial interaction)을 끊기 위해, α-만노시다제에서의 아세틸 중심(acetal)에서의 친핵성 치환(nucleophilic substitution)을 필요로 함은 일반적인 용인되는 내용이다(Vocadlo et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 12:539-55 (2008)). -1 부위에서의 기질 결합에 대한 수득된 모델은, 물 분자 W4가 아세탈 탄소(acetal carbon)에서의 라인 어택(line attack)에서 친핵체(nucleophile)로서 작용하기 위한 좋은 위치에 놓임을 추가적으로 나타낸다. W4 는, GH92 효소를 도처에 보존된 Asp 660 및 Asp 662 의 카르복실기와 H-결합 상호작용(H-bond interaction)에 있고, 친핵체(nucleophile)의 활성화를 위한 염기 촉매(base catalyst(s))를 형성하도록 제한되었다. 따라서, -1 부위에 결합하는 모델된 기질 결합 및 촉매 잔기 및 친핵체의 위치는, 방출된 만노스에서의 아노머 중심(anomeric center)의 역위와 함께 친핵성 치환(nucleophilic substitution)에 기계론적인 요구(mechanistic requirements)와 일관된다. 상기에 기재된 바와 같이, CcMan5 는 Man-P-Man 을 결합시키고, 가수분해하기 위한 능력에 의해 이 자체로 구별된다. CcMan5 활성 부위에 결합하는 Man-P-Man 에 대해 수득된 모델은 이러한 관점에 대한 이유를 제공한다. 알려진 GH92 패밀리 멤버에서, 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 형성하는 아노머 산소는 보존된 글루탐산 잔기(Bt3990에서의 Glu 533)의 카르복실기와 정진기 상호작용(electrostatic interaction)에 있다. 글루탐산 잔기는, 아노머 산소를 결합시키고, 탈리기(leaving group)에 양성자를 부가함으로써 전이 중간물질을 안정화시키는, 촉매 산으로서 역할을 하는 것으로 나타났다(Zhu et. al., 2010, supra). CcMan5에서, Bt3990 Glu 533에 대한 등가의 잔기는 글루타민으로 돌연변이되고, 이는 양성자 공여체(proton donor)로서 작용할 수 없고 따라서 만노바이오시드(mannobioside)의 가수분해를 위한 CcMan5 에서의 기능의 손실(loss-of-function)을 설명한다. 그러나, Man-P-Man 기질에서 아노머 산소(anomeric oxygen)에 결합한 인산염은 보다 강한 탈리기를 구성하고, 이는, CcMan5 같은 효소들이 Man-P-Man 기질에 대한 촉매 활성도(catalytic activity)를 왜 유지하는지를 설명하면서, 아노머 산소에 양성자를 가하는 것을 산 촉매에게 요구하지 않는다. 촉매산(catalytic acid)의 치환과 수반되는, Bt3990에서의 Glu 585의 등가물은 CcMan5 에서 Thr (Thr 626)로 교체된다. Bt3990 에서, Glu 585 는 Glu 533와 상호작용하고, 후자의 pKa 를 조절하고/조절하거나 2-연결된 만노시다제에서의 탈리기(leaving group)를 결합하는 역할을 하는 것으로 제안되었다(Zhu et. al., 2010, supra).
Gln 536 and Thr 626 쌍에서의 비-산성 잔기(non-acidic residues)로의 돌연변이가 결합 부위에서의 음전기의 정전기 전위(electrostatic potential)의 일부를 완화시키고, 이로 인하여 Man-P-Man 기질에서의 아노머 산소에 대한 인산염 결합을 용인(tolerating)시키는 것 같다. CcMan5 에서, 모델된 인산염 결합 부위(도 25 에서의 P)는 Gly 72의 아미드(amide) 및 Thr 626 에 의해 형성되고, 이들 둘 다는 인산염에서의 비-글리코시드 산소(non-glycosidic oxygens)에 대한 H-결합을 제공할 수 있는 것 같다.
마지막으로, CcMan51-774 활성 부위에서의 Man-p-Man의 모델된 결합을 기초로 하여, 환원된 말단 만노스는, 두 개의 티로신 잔기, Tyr 535 및 Tyr 196의 인근에 오고, 후자의 잔기가 +1 만노스 결합 부위의 일부를 형성함을 암시한다. 둘 다의 잔기는, 글리칸 트리(glycan tree)의 환원된 말단(reducing end)에서의 글리칸과 추가적인 상호작용을 포함할 수 있는, 쉘로우 클레프트(shallow cleft)의 가장자리에 놓인다.
[실시예 9]
Y. 리폴리티카 에서의 α갈락토시다제의 발현
pre 및 pro 서열 없이, 인간 α-갈락토시다제 A 를 코드화하는 핵산을, Y. 리폴리티카에 대한 코돈 최적화(codon optimization) 및 Myc-His 태그(Myc-His tag)의 첨가로 합성하였다. 획득된 서열은 lip2 유전자의 pre 서열(pre sequence) 후의 프레임 내에 클론되었다(cloned). 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열(codon optimized nucleotide sequence)의 뉴클레오티드 서열은 도 26A 에 나타내었고; 아미노산 서열 (SEQ ID NO:23)은 도 26 B 에 나타내었다.
2 여분의 복제물(2 extra copies)의 MNN4 및 하나의 복제물의 α-갈락토시다제A 를 갖는 Y.리폴리티카 MTLY60 는 Ni-NTA 컬럼 상에서 정제시키기 위해 보다 큰 배양물에서 유도되었다. 따라서, 이들을 YTG 에서 성장시키고, 48 시간 동안 2 x 225 ml [2L 쉐이크 플라스크(shake flask)]에서의 올레산 배지(oleic acid medium)에서 유도되었다. 배양물을 원심분리 시킨 다음에, 0.22 ㎛ 필터(filter) 상에서 배지를 여과시켰다. 여과된 배지를, Ni-세파로오스(sepharose) 6 FF 상에서 정제하기 전에 비-단백질 교란 오염물질(non-protein disturbing contaminants)을 제거하기 위해, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸에 대한 세파덱스(sephadex) G25 XK50/100 컬럼(GE Healthcare)에서 탈염시켰다. 탈염된 단백질 분획물을 4.3 ml Ni-세파로스 6 FF 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하고(loaded), 20 mM NaH2PO4 pH 7.4, 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸로 평형시키고, 동일한 완충용액에서 50 mM 이미다졸로 세척하고, 20 mM NaH2PO4 pH 7.4, 20 mM NaCl, 400 mM 이미다졸로 용리시켰다. Ni-세파로스 컬럼 뒤에 샘플 3-10 및 36-49 를 항-His6 항체를 사용하여, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에서 분석하였다. 샘플 40 및 41 에서 쿠마씨(coomassie)에 나타난 약 50 kDa 및 65 kDA 의 단백질 밴드(protein band)는, SDS-PAGE 겔의 쿠마씨 블루 염색(Coomassie blue staining)으로 나타났다. 웨스턴 블로트에서, 50 kDa의 밴드만이 검출되었고, 아마도 α-갈락토시다제 A 이다. 정제된 α-갈락토시다제 A의 추정된 수득률(estimated yield)은 100-125 ㎍/L 배양 배지이다.
정제된 샘플은 재조합 α-갈락토시다제A 에서의 당의 유형을 결정하는데 사용되었다. 당을 용액에서 제거하고, 그 뒤에 APTS 로 라벨하였다(labelled). 겔 여과에 의해 샘플을 청소한(cleaning) 후에, 당을 DSA-FACE 로 분석하였다. 예상된 당, 모노 만노인산화된(mono mannophosphorylated) Man8GlcNAc2 피크(peak)(P) 및 더블 만노인산화된(double mannophosphorylated) Man8GlcNAc2 피크(PP)가 주요한 피크로서 나타났다.
[실시예 10]
Y. 리폴리카 에서의 인간 알파 글루코시다아제(glucosidase)의 발현
Y. 리폴리카 스트레인 OXYYl589 는, 세 개의 복제물의 인간 알파 글루코시다아제[산성 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase)(GAA) 또는 산성 말타아제(acid maltase) EC3.2.1.3] 및 두 개의 복제물의 Y. 리폴리카 MNN4 유전자를 포함하는 것으로 구성되었다. 스트레인 OXYl589 의 유전자형은 하기와 같다 :
MatA, leu2-958, ura3-302, xpr2-322,
gut2-744, ade2-844
POX2-Lip2pre-huGAA:URA3Ex::zeta
POX2-Lip2pre-huGAA:LEU2Ex::zeta
POX2-Lip2pre-hGM-CSF:GUTEx::zeta
YlMNN4-POX2-hp4d-YLMNN4　:ADE2::PT targeted
모든 형질전환은 상이한 선별적인 마커(different selective markers)에 대한 변형(modifications)을 갖는 잘 확립된 프로토콜에 따라 실행되었다. 모든 경우에(별도로 기술되어 있지 않다면), huGAA 통합 단편(integration fragment)은, 발현 플라스미드로부터의 카나마이신 저항 유전자(kanamycin resistance gene)를 제거하기 위해 NotI 제한효소 절단(restriction digestion)에 의해 수득되었다. 결과적으로 생성된 단편은, 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 모두 분리한 다음에, 정확한 huGAA 단편의 Qiagen 컬럼 정제하였다. Y. 리포리티카 발현 벡터 내로 human GAA (huGAA)를 첫 번째 클로닝하고, Y. 리포리티카 MNN4 탠덤 발현 벡터(tandem expression vector)를 구성하여 스트레인 OXYYl589 를 구성하였다. 그리고 난 다음에 세 번의 안정된 통합하는 형질전환(Three stable integrative transformations)을 최종의 huGAA 생산 스트레인 OXYY1589을 수득하기 위해 실시하였다.
Y. 리폴리카 코돈 최적화된 huGAA 발현 벡터( Y. lipolytica codon optimized huGAA expression vector): 110 kDA 인간 GAA(huGAA) 전구체를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하였고, 코돈은 Y. 리폴리카 발현에 최적화되었다. 합성의 구성물(synthetic construct)에서, pre- 및 pro-huGAA 신호 펩티드는, 단백질이 아미노산 57 에서 시작되는 것과 같이 제거되었다. 발현 벡터에 클로닝하기 위해, huGAA의 합성 ORF(도 27 A)는, 5' 말단 내지 3' 말단의 Y.리폴리카 LIP2 신호 서열(pre) 다음에, 두 개의 Xxx-Ala 절단 부위(cleavage sites)의 코딩 서열에서의 프레임(frame)에 융합시키고, BamHI 및 AvrII 제한 부위의 측면에 배치되었다(flanked). 구조물을 유도될 수 있는(inducible) POX2 프로모터의 조절 하에 두었다. 융합 구조물(fusion construct)의 완전한 아미노산 서열(complete amino acid sequence)을 도 27B 에 나타내었다.
발현 벡터의 일반적인 도식을 도 28 에 나타내었다. 세균성의 일부는 플라스미드 pHSS6 로부터 유도되었고, 세균성 복제의 기원(origin of replication)(ori) 및 카나마이신에 대한 내성(KanR)을 부여하는 카나마이신-내성 유전자(kanamycin-resistant gene)를 포함한다. 통합 카세트(integration cassette)는 a) 야로위아 리폴리티카에 대한 형질전환을 위한 선별 마커(selection marker)(URA3; LEU2; GUT2), b) 프로모터로 구성된 발현 카세트(expression cassette), c) 신호 서열을 갖는 프레임에서의 huGAA 를 삽입하는 다중 클로닝 사이트(multiple cloning site, MCS), 및 d) LIP2 유전자의 종결자(terminator)를 포함한다. 통합 카세트는 Y. 리폴리티카 게놈 내로 안정된 비-상동성 통합(stable non-homologous integration)을 위한 제타 서열(zeta sequences) 옆에 배치되었다. 두 개의 NotI 제한효소 절단 부위(restriction sites)는 형질전환 전에 발현 카세트(expression cassette)의 분리를 가능하게 한다. 각각 URA3, LEU2 및 GUT2 형질전환 마커(transformation markers)를 포함하는 플라스미드 pRAN034, pRAN036 및 OXYP183 는, 각각 huGAA 발현 벡터 pRAN058, pRAN059 및 pRAN060를 생성하는데 사용되었다.
탬덤 YlMNN4 발현 벡터 : YlMNN4 유전자는 유도성 pPOX2 프로모터 및 (세미)구성요소[(semi)constitutive]인 hp4d 프로모터의 조절 하에서 클론되었다. YlMNN4의 이러한 두 가지의 발현 카세트는, 게놈의 ADE2 유전자 자리(locus) 및 선별 마커로서의 ADE2 유전자 내로 타겟된 통합(targeted integration)에 대한 ADE2 유전자의 플랭킹 영역(flanking regions)(PT)을 포함하는 탬덤 구조물로서의 하나의 벡터 내에 서브클론되었다(subcloned).
중간물질(Intermediate) 스트레인 OXYY1569: 첫 번째 형질전환은, 중간의 재조합 스트레인 OXYY1569 를 생산하기 위해 URA3 및 LEU2 마커를 사용한 pRAN058 및 pRAN059 벡터로부터 정제된 발현 카세트의 공동-형질전환(co-transformation)이다. OXYY1569 는 스트레인 GO14 의 게놈에 임의적으로 통합된 pPOX2 프로모터의 조절 하의 huGAA 의 두 가지의 발현 구성물(two expression constructs)을 운반한다(carries).
OXYY1569 는 하기와 같이 선택되었다. 게놈 DNA 의 PCR 스크리닝(screening)을, Y. 리폴리티카의 게놈 내로 이질적인(foreign) huGAA DNA 의 통합을 확인하기 위해 실행하였다. 프라이머(Primers)는 huGAA 뉴클레오티드 서열로부터의 2552 bp 의 단편을 증폭시키기 위해 설계하였다. 게놈 DNA 의 서전 블롯 분석(Southern blot analysis)을, 적어도 2 복제물의 huGAA DNA 의 통합을 확인하기 위해 실행하였다. 특히, OXYY1569 클론으로부터의 게놈 DNA 를 Hind III 와 함께 절단하였고(digest), huGAA DIG 표지된 특정한 프로브(huGAA DIG labeled specific probe)와 함께 조사하였다(probed).
높은 수준의 huGAA 를 분비하는 클론을 선별하기 위해서, PCR 스크리닝 및 서전 블롯(Southern blot)에서 양성으로 식별된 몇몇의 임의적으로 선택된 클론을, 표준 절차에 따라 POX2 유도된 조건(inducing conditions) 하에서 진탕 플라스크(shake flasks)에서 성장시켰다. 모든 경우에, 배양 성청액을 72 h 후의-유도물(72h post-induction)을 수집하였고, 표준 웨스턴 블롯 및 효소 활성도 검정 분석으로 스크린하였다(screened). OXYY1569에서의 우세한 구조물(predominant structure)로서 나타낸 OXYY1569의 N-글리칸 분석은 Man8GlcNAc2 이다.
중간물질(intermediate) 스트레인 OXYYl584: 재조합 스트레인 OXYYl569 를, OXYYl584를 생산하기 위한 이의 게놈 내로 Y.리폴리티카 MNN4 유전자의 두 개의 복제물을 통합시키기 위해서 형질전환시켰다. 형질전환을, 플라스미드 OXYP1479B로부터 삭제된(excised) SacII/XmaI 유도된 발현 카세트(SacII/XmaI derived expression cassette)와 함께 실행하였다. 발현 카세트를, Y.리폴리티카 게놈의 ADE2 유전자 자리(locus) 내로의 통합을 타겟하도록 설계하였다. 재조합 스트레인은, 증가된 인산화반응(increased phosphorylation)에 대하여 스트레인 작용(behavior)을 평가하기 위해, 서던 블로팅(Southern blotting) 및 글리칸 분석 후에 선별되었다. 몇몇의 임의적으로 선택된 형질전환체의 게놈 DNA 는 SpeI 절단된 것이고(digested), MNN4 특정한 DIG 표지된 프로브(labeled probe)로 조사하였다. Y. 리폴리티카 게놈의 ADE2 유전자 자리 내로 MNN4 발현 카세트의 정확하게 타겟된 통합(Correct targeted integration)은 4207bp 및 5683bp 밴드를 제공해야한다. 서든 블롯 양성 클론(Southern blot positive clones)을, 표준 진탕 플라스크 절차(standard shake flask procedure)에서 성장시켰다. 분비된 단백질의 N-글리칸 분석을, 중간물질 클론(intermediate clone) OXYY1584 를 선별하기 위해 실행하였다. 모 스트레인(parent stain) OXXY1569과 비교하여, MNN4 과잉-발현 후의 우세한 구조(predominant structures)는 Man8GlcNAc2(PMan)1 및 Man8GlcNAc2 (PMan)2 이다.
생산 스트레인 OXYYl589 : 최종의 독립 영양 생산 스트레인(final prototrophic production strain) OXYY1589 를 생산하기 위해, huGAA의 세 번째 복제물을 재조합 OXYY1584 스트레인의 게놈 내로 통합되었다. 형질전환을 pRAN069 부터의 Not I 절단된 발현 카세트(excised expression cassette)로 실행하였다. 형질전환을, huGAA 의 추가적인 복제물의 존재를 위한 gDNA 에서의 PCR로 첫 번째 스크린하였다(screened). huGAA 생산을 평가하기 위해, 임의적으로 선별된 PCR 양성 클론(arbitrary selected PCR positive clones)을 표준 진탕 플라스크 배양(standard shake flask cultivation) 후에 발현에 대해서 추가적으로 분석하였다. 가장 높은 수준의 huGAA (OXYY1589)이 발현된 클론을, 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis) 및 효소적 활성도 검정(enzymatic activity assay) 후에 선택하였다. MP-M8 N-글리칸 및 MP2-M8에 대한 M8의 전환 수준(conversion levels)을 추가적인 huGAA 발현 카세트의 존재에 의해 영향을 미치치 않는다.
[실시예 11]
스트레인 OXYY1589의 패드 배치(Fed Batch Cultivation)
스트레인 OXYY1589로부터의 huGAA를 생산하기 위해(실시예 10), 패드 배치 공정(fed batch process )을, 6 내지 8 리터의 작업량(working volume)을 갖는 10 L 교반된 탱크를 사용하여 확립하였다(established). 상기 공정은 두 가지의 단계로 나뉘었다:
1) 바이오매스( biomass) 형성을 위한 글루코스에서의 배치 성장(Batch growth);
2) 제한된 올레산 공급(limited oleic acid feed)의 도움으로 유도(induction)에 의한 생산물의 형성.
일반적으로, 배치 단계(batch phase)는 약 20 시간(h)이고, 생산 단계는 대략 72 시간이다. 공정의 끝에서, 배양액(culture broth)을 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 상청액을 GAA 의 정제를 위한 출발 물질(starting material)로서 사용하였다(실시예 12를 참고하라).
하기의 파라미터를 발효 동안에 조절하였다. 에어레이션(Aeration)을 1.5 vvm air[분 당 부피당 부피(volume per volume per minute)]의 상수값(constant value)에서 유지시켰다. 용해된 산소(Dissolved oxygen, DO)를 30 % 로 초기에 유지시켰다. 교반(stirring)을 DO 수준에 따라 600 내지 1200 rpm 으로 증가시켰다. 최대 1200 rpm 에 도달하였을 때, 이러한 속도를 일정하게 유지시켰고, DO-세트포인트(setpoint)를 10 % 로 설정하였다. 10% DO 를 유지시키기 위해, 산소는 50 % 의 최대 백분률로 반응기(reactor) 내에 섞었다(spiked). 거품발생(Foam evolution)을 폼 프로브(foam probe)로 관리하였다. 거품 검출(foam detection)의 경우에, 거품 억제제를 바이오리액터(bioreactor)에 첨가하였다. pH 는, pH 6.8 의 상수값을 유지시키기 위해 14% (v/v) 암모니아 (염기) 또는 10 % 인산(phosphoric acid)을 첨가하여 조절하였다. 온도를 전체 공정을 거쳐 28 ℃로 일정하게 유지시켰다.
바이오매스를 600 nm(OD600)의 광밀도(optical density) 측정에 의해 모니터하였다. 샘플을, 분광 광도계(spectrophotometer)의 직선 범위(linear range)에서의 수치를 수득하기 위해, 2-1000 배로 희석시켰다. 생산물 형성을 웨스턴 블롯 분석 및 특정한 효소 활성도 테스트로 측정하였다.
[실시예 12]
재조합 huGAA(rhGAA)의 정제
배양 후의 상청액(실시예 11 을 참고하라)을 심층 여과(depth filtration)를 통해 명확하게 하였다. 결과적으로 생성된 물질을 TFF 를 통해 20 번 농축시킨 다음에, 10kDa MWCO 막(Millipore)에서의 20 mM 인산나트륨 pH 6 및 100 mM NaCl에 대항하여 초여과되었다(diafiltere).
rhGAA 의 정제를, 1 M 의 농도까지 황산암모늄(ammonium sulphate)을 첨가하면서 시작하였다. 원심분리 후에, 상청액을 XK16/40 컬럼을 가진 Toyopearl-Phenyl 650M (Tosoh Biosciences)에 로딩시켰다(loaded). 1 에서 0 M 까지의 황산 암모늄의 선형 구배(linear gradient)를 용리액(elution)에 적용시켰다. rhGAA 를 포함하는 이러한 분획물을 모은 다음에, 10 mM BIS-TRIS pH 6 내로 완충용액 교환(buffer exchange)을 하였다. 0 에서 1 M 까지의 NaCl 의 선형 염 구배(linear salt gradient)를 사용한 소스 30Q packed Tricorn 10/50 또는 XK25/20 컬럼(GE Healthcare) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 추가적인 정제를 수행하였다. 그리고 난 다음에 결과적으로 생성된 GAA-함유 분획물을, 200 mM NaCl 및 50 mM 염화 나트륨 pH 6 으로 예비-평형시킨(pre-equilibrated), 최종의 Hiload 16/60 superdex 200 겔 여과 컬럼(GE Healthcare) 상에 로딩시키기 전에, 농축시켰다. 분획물을, 특정한 활성도를 기초로 선택하였고, 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE 겔에서 정제시킨 다음에, 5 내지 10 mg/ml 의 최종 농도로 농축시켰다. 단백질 농도를, 10 kDa 의 MWCO 와 함께 15 ml 의 Amicon Ultra centrifugal devices (Millipore)에서 측정하였다.
rhGAA에 대해 질적인 스크리닝(qualitative screening)을 위한 반응을, 10 또는 5 ㎕의 용리 분획물(elution fraction)에 대한 10:1 또는 20:1의 부피 비율로, 0.35 mM 4-MUG, 0.1% BSA 및 100 mM 아세트산 나트륨 pH 4 으로 이루어진 반응 완충용액을 첨가하여 시작하였다. 모든 반응을 96-웰 플랫-보텀 마이크로타이터 플레이트(flat-bottom microtiter plates)에서 실시하였다. 37 ℃에서 30 분 내지 1 시간의 배양기간(incubation period) 후에, 동등한 부피의 100 mM 글리신 pH 11을 반응을 정지시키기 위해 첨가하였고, 형광성 반응 생산물 4-메틸움벨리페론(fluorogenic reaction product 4-methylumbelliferone)의 방출을 UV-선 하에서 관찰하였다. 특정한 활성도(Specific activities)(units/mg 단백질)를, 황색의 p-니트로페놀레이트 반응 생산물의 효소적 방출을 측정하는, 합성 기질(Specific activities) p-니트로페닐-α-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, PNPG)와 함께 비색 검정(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. 반응물을, 마이크로타이터플레이트(microtiterplate)의 반응 웰(reaction wells)에서 10 ㎕ 의 효소 용액 및 90 ㎕ 의 기질 반응 완충용액(substrate reaction buffer)[150mM 시트레이트-포스페이트 완충용액 pH 4 에서의 2 mM PNPG, 1% BSA]을 혼합하여 시작하였고, 그 후에 37 ℃에서 배양시켰다. 1 내지 2 시간 후에, 동일한 부피의 정지 완충용액(stop buffer), 10 % 탄산나트륨 pH 12 를, 반응물을 퀀칭시키고, 이의 이온화된 상태에서의 방출된 p-니트로페놀(PNP)를 가져오기 위해(bring) 첨가하였다. 백그라운드-수정된 흡광도(Background-corrected absorbances) 및 p-니트로페놀레이트 표준(p-nitrophenolate standards)을 405 nm 의 파장에서 측정하였고, 특정한 활성도를 계산하였다, 단백질 농도를 BCA 방법(bicinchoninic acid method)으로 측정하였다. 하나의 유닛(unit)은, 시트레이트-포스페이트 완충용액 pH 4.0 에서의 2 mM 의 최종의 기질 농도에서의 37 ℃에서의 min 당 1 nmol의 PNPG 를 1 nmol PNP 및 D-글루코스로의 전환(conversion)을 촉매하는 효소의 양을 나타낸다.
[실시예 13]
보다 높은 정도의 인산화된 N-글리칸을 갖는 Y. 리폴리티카 에서 발현된 당단 백질에서의 이종 발현된 CcMan5 의 포스페이트 캡핑제거 활성도(Phosphate uncapping activity)
huGAA는, 보다 높은 정도의 인산화된 N-글리칸 구조를 갖는 당단백질을 수득하기 위해, Y.리폴리티카 스트레인 OXYYl589 에서 발현되었다(실시예 10 을 참고하라). huGAA 를 실시예 12에 기재된 바와 같이 정제하였다.
CcMan5 (70 ㎍/ml의 농도로 각각 1 및 5 ㎕)를, 2 mM CaCl2 와 함께 100 mM HEPES 완충용액에서의 4 ㎍ huGAA의 용액에 첨가하였다. 20 ㎕ 의 반응 혼합물을 실온으로 밤새 배양하였다. Laroy W. et al., Nature Protocols, 1: 397-405 (2006)에 기재된 바와 같이, N-글리칸을 PNGaseF 와 함께 방출시키고, APTS 로 표지시킨 다음에, DSA-FACE 에서 분석하였다. CcMan5 처리의 전 및 후(before and after)에 N-글리칸 프로파일을 도 29 에 나타내었다. 정제된 huGAA 로부터 방출된 N-글리칸 혼합물은 주로 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc2 로 이루어져 있다(도 29, 패널 B). ManP-Man8GlcNAc2 보다 더 빠르게 움직이는 피크를 ManP-Man7GlcNAc2에 배치되었다. Man8GlcNAc2 및 Man7GlcNAc2 의 매우 최소한의 양만이 나타났다. CcMan5와 함께 huGAA 의 배양 후에, 각각의 ManP-Man8GlcNAc2 및 (ManP)2-Man8GlcNAc의 P-Man8GlcNAc2 및 P2-Man8GlcNAc2 의 전환이 관찰되었다(도 29, 패널 C 및 D). P-Man8GlcNAc2 및 P2-Man8GlcNAc2 사이의 러닝(running) 일렉트로페로그램에서의 피크는, 포스포디에스테르- 및 포스포모노에스테르- 결합(phosphodiester- and a phosphomonoester-linkage)을 갖는 부분적으로 캡핑되지 않은 비-인산화된(bi-phosphorylated) (ManP)2-Man8GlcNAc2 와 일치한다((MP)-M8-P, 도 29 에서의 패널 C 및 D). 이러한 생산물은, 보다 높은 농도의 CcMan5 또는 보다 긴 배양 시간을 사용하였을 때, 완전하게 캡핑이 제거된 P2-Man8GlcNAc2 로 추가적으로 가수분해되었다.
인산화된 N-글리칸 대 중성의(neutral) N-글리칸의 백분율을, DSA-FACE 일렉트로페로그램에서의 피크 영역을 측정으로부터 평가되었다(도 29). 곡선 아래의 영역과 관련된 도면은 CcMan5 처리 전(패널 B) 및 후(패널 D)에서의 huGAA 에 나타난 상이한 N-글리칸에 대해서 나타내었다. huGAA(패널 B)에서, (ManP)2-Man8GlcNAc2 (11597), ManP-Man6GlcNAc2 (1261), ManP-Man7GlcNAc2 (5901), ManP-Man8GlcNAc2 (15576), Man6GlcNAc2 (680), Man7GlcNAc2 (1716), Man8GlcNAc2 (1572) 을 나타내었다. 재조합 huGAA에서 대략 90 % 의 N-글리칸을 구조(structures)를 포함하는 만노스-인산염(mannose-phosphate)으로 구성되었다.
재조합 huGAA 와 CcMan5 (패널 D)의 밤새 처리한 후에, P2-Man8GlcNAc2 (16182), (ManP)P-Man8GlcNAc2 (1997), P-Man7GlcNAc2 (8254), P-Man8GlcNAc2 (17893), ManP-Man6GlcNAc2 (500), ManP-Man7GlcNAc2 (2495), ManP-Man8GlcNAc2 (1326), Man6GlcNAc2 (1097), Man7GlcNAc2 (2143), Man8GlcNAc2 (1599)를 나타내었다. huGAA 로부터 방출된 N-글리칸은 83 % 의 캡핑이 제거되지 않은 인산화된 구조로 구성되어 있고, 8 % 는 여전히 만노스-인산염 캡핑되어(mannose-phosphate capped) 있었고, 9 % 중성의 N-글리칸을 나타내었다. 캡핑이 제거된 인산화된 구조물의 백분율은, 높은 농도의 CcMan5 또는 보다 긴 배양 시간일 때 증가될 수 있다.
[실시예 14]
캡핑 제거 활성도(Uncapping Activity)를 갖을 가능성이 있는 상동체(Homologs)의 확인
동일하게 예측된 촉매 부위 토폴로지(topology) 및 기능성(functionality)을 갖는 다른 GH92 패밀리 멤버(GH92 family members)를 확인하기 위해, 월드와이드 웹 cazy.org/GH92_all.html 으로부터 획득된, 큐레이트된(curated) GH92 패밀리 멤버를 분석하였고, NCBI 에서의 Non Redundant Protein Sequences database 에서의 CcMan5 도메인 서열로 Blastp 검색을 통해 수득된 상위 500개의 히트(hits)를 수득하였다. 그 다음에, 이러한 392개의 서열을, 다중 서열 정렬 패키지 MUSCLE(multiple sequence alignment package MUSCLE)(MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)에 대한 입력(input)으로서 사용하였고, 이는 '계통발생론의(phylogenetic)' 거리(distance)[관련된 가장 가까운 것(closest related)부터 관련된 가장 먼 것(furthest related)까지]의 순으로 서열을 또한 평가하였다.
Cazy 데이터베이스로부터의 큐레이트된 GH92 패밀리 멤버를 기초로, 모든 GH92 단백질 서열(392) 및 CcMan5 도메인 서열의 MUSCLE 정렬을 CcMan5의 가장 가까운 상동으로서 하기를 확인하였다 :
스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)CAA18915 (GenBank Accession No. NP_630514)
클로스트리디움 스피로포르메(Clostridium spiroforme)(GenBank Accession No. ZP_02866543)
박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) AAO78636 (GenBank Accession No. NP_812442)
주농왕기아 프로푼다(Zunongwangia profunda) ADF52306 (GenBank Accession No. YP_003584502)
키티노파가 피넨시스(Chitinophaga pinensis) ACU58463 (GenBank Accession No. YP_003120664).
이러한 서열 및 그 다음의 5 개의 가장 가까운 상동체의 서열을 도 31 에 정렬하였다.
500 개의 기록한 blastp 단백질 히트 대 CcMan5 도메인의 MUSCLE 정렬을 기초로, CcMan5 의 가장 가까운 동족체(homologs)로 간주되는 것을 하기에 나타내었다:
스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)(GenBank Accession No. NP_630514)
스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)(GenBank Accession No. ZP_05522540)
스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)(GenBank Accession No. ZP_06527366)
페니바실러스 sp(Paenibacillus sp)(GenBank Accession No. YP_003013376)
박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron)(GenBank Accession No. NP_812442)
박테로이데스 sp.(Bacteroides sp.)(GenBank Accession No. ZP_04848482)
박테로이데스 셀룰로실티구스(Bacteroides cellulosilyticus)(GenBank Accession No. ZP_03677957)
주농왕기아 프로푼다(Zunongwangia profunda)(GenBank Accession No. YP_003584502)
레이우엔훅키엘라 블란덴시스(Leeuwenhoekiella blandensis)(GenBank Accession No. ZP_01061975)
스핀고박테리움 스피리티보룸(Sphingobacterium spiritivorum)(GenBank Accession No. ZP_07083984)
키티노파가 피넨시스(Chitinophaga pinensis)(GenBank Accession No. YP_003120664)
페도박터 sp.(Pedobacter sp.)(GenBank Accession No. ZP_01885202)
클로스트리디움 스피로포르메(Clostridium spiroforme)(GenBank Accession No. ZP_02866543).
이러한 것들 및 5 개의 다음의-베스트 동족체의 정렬을 도 32 에서 발견할 수 있다. 주석을 단(annotated)GH92 데이터베이스로부터의 모든 5 개의 베스트 히트(best hits)는 전제적인 서열 데이터베이스에서의 Blast 검색으로부터의 이러한 13 개의 베스트 히트를 또한 발견하였다.
도 31 에 최고의 5 개의 히트 및 도 32 에 최고의 13 개의 히트는 하기의 세 개의 모티프를 유일하게 공유하고, Zhu et. al., 2010, supra 에 보고된 알파-1,2-만노시다제 GH92 패밀리 멤버의 구조와 상이한 실시예 8의 결정 구조(crystal structure)에서 나타내었다.
1) 글리신-리치 모티프(glycine-rich motif) GVGxxGxGG, 각각의 X 는 G, S, T, V, A, C 또는 Q (작은 곁사슬)이고, CcMan5 도메인의 결정 구조 잔기의 넘버링: 69-77(with each X being G, S, T, V, A, C or Q (small side chains), numbering of crystal structure residues of CcMan5 domain: 69-77). 이러한 영역은, 효소의 활성 부위에서 -1 및 포스페이트--결합 서브사이트(phosphate--binding subsite)에 필수적인 수소 결합을 제공하는 루프(loop)를 형성한다.
2) VRxE 모티프. R 은 -1 고리 및 가능한 +1 고리에 수소 결합을 형성한다. E 는, 아미도 이러한 모티프를 형성하는, 이러한 R 잔기에 대한 염 다리(salt bridge)에 있다. x 는 가장 가까운 관련된 서브패밀리(the closest-related subfamily)[CcMan 5 에 대한 상위 3 의 상동체(top 3 homologs to CcMan5)]에서의 W 이거나, P 를 제외한 모든 20 개의 아미노산 중의 하나 일 수 있다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 404 내지 407 에서 발견되었다.
3) LYQGT 모티프, 만노시다제에서 E 인 Q 를 포함하고 및 이는 +1 사이트 형성에 중요한 Y535 를 포함한다[containing the Q which is an E in the mannosidases (proton donor), and which contains Y535, which is important for the +1 site formation]. 몇몇의 서열에서, L은 A 또는 Y 이고, 이는 또는 I, V, A, F 또는 M 일 것으로 합리적으로 예측될 수 있고, 이들 중의 몇몇에서, T 는 N 이고, S를 용인할(tolerate) 것으로 예측될 수 있다. 두 개의 카울로박터(Caulobacter) 서열은 Q 대신에 E 를 갖고, 따라서 이는 인산화된 글리칸에 작용하지 않을 것으로 예측될 것이다(would thus be predicted not to work on phosphorylated glycans).
4) GDXGN 모티프. D 및 N 은 기질 결합 캐비티(substrate binding cavity)의 일부를 형성하고, + 만노스레 결합하기 위한 대체가능한 서브포켓(alternative subpocket)을 형성할 수 있다. X 는 P 외의 어떠한 아미노산일 수 있다. 이러한 모티프는 SEQ ID NO:50 의 잔기 21 내지 25 에서 발견되었다.
구조(structure)를 기초로 한 상기의 생물정보학 워크플로우(bioinformatics workflow) 및 모티프 검색(motif search)에 기초해, CcMan 5 에 대한 동일한 기질 특이성, 즉 Man-6-Pi-Man 구조의 캡핑을 제거할 수 있는 특이성을 갖는 좋은 후보물질인 이러한 희귀한 패밀리 멤버(those rare family members)를 위한, 비-중복 단백질 서열 데이터베이스(non-redundant proteins sequence database)(현재 1220 서열 이상을 포함)에 나타낸 GH92 서열을 걸러내는(filter) 것이 가능하다. 특히, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)으로부터의 3 개의 서열은, 상기의 모티프 뿐만 아니라 구조의 많은 루프(loops)에서 CcMan5 와 유사하다.
CcMan5 및 이의 가장 가까운 상동체(homologs)의 독특한 서열 요소를 기초로 한 Hidden Markov Models 을 갖는 검색은, 이러한 모든 요소를 포함하는 더 이상의 추가적인 GH92 서열을 나타내지 않았고, 이는 이러한 GH92 멤버가 수렴 진화(convergent evolution)를 통해 이러한 요소를 획득할 수 없음을 강하게 나타낸다[이들은, 다중 서열 정렬에서 상위-나열되지 않은 것들이다(these are the ones that would not be top-ranked in multiple-sequence alignments)].
[실시예 15]
박테로이데스 테타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron) 으로부터의 GH92 글리코시다아제에서의 인산염 캡핑 제거 활성도(phosphate uncapping activity)의 존재
박테로이데스 테타이오타오미크론으로부터의의 23 의 패밀리 GH92 α-만노시다제의 효소적 분석(enzymatic analysis)은 Zhu, Y. et al, 2010, supra 에 보고되어 있다. 몇몇의 변이체(variants )가 매우 낮은 활성도를 나타낼 지라도, α1,2-, α1,4-, α1,3- 또는 α1,6-만노시다제 활성도를 갖는 효소는 효소의 이러한 그룹에서 나타난다. 두 개의 α-1,2 만노시다제(Bt3990 및 Bt2199)의 삼차원 구조(three-dimensional structure)는 중요한 아미노산 잔기의 확인을 가능하게 하고, 이는 α-1,2 만노시다제 활성도에 대한 중요한 모티프, 즉 Bt3990 에서의 His584-Glu585 및 Trp99 인 것처럼 보인다. B. 테타이오타오미크론으로부터의 세 개의 GH92 효소, Bt3530 (Genbank nr AAO78636.1), Bt3965 (Genbank nr AAO79070.1) 및 Bt3994 (Genbank nr AAO79099.1)의 인산화된 N-글리칸(실시예 1 에 나타낸 MNN4 당)에서의 활성도를 테스트하였다. 이러한 효소는 낮은 α1,4-만노시다제 활성도를 나타내었고,His-Glu 및 Pro-Trp 모티프가 결여되어 있다.
Bt3530, Bt3965 및 Bt3994를 E.coli 에서 발현되었고, Zhu et al, 2010, supra 에 기재된 바와 같이 정제하였다. 샘플(0.1 mg/ml의 농도에서의 1 ㎕ 효소)을, 실온에서 오버나이트 검정(overnight assay)에서 2 mM CaCl2 와 함께 10 mM HEPES 완충용액 pH 7.0 에 용해시킨 7 ml APTS-표지된 MNN4 당과 함께 배양하였다. CcMan5 를 갖는 대조 검정(control assay)이 포함되었다. 말단 인산염(terminal phosphate)의 존재를 확인하기 위해, 반응 혼합물을 CIP 와 함께 배양하였다. Man8GlcNAc2 (M8) 및 모노인산화된(monophosphorylated) ManP-Man8GlcNAc2 (MP-M8)를 포함하는 N-글리칸 제조물(preparation)을 기질로서 사용하였다. Bt3530, Bt3965 및 Bt3994에 대한 어떠한 캡핑이 제거되는 활성도(uncapping activity)도 상기의 검정 조건 하에서 검출되지 않았다. 피크에서의 전기영동의 이동성(electrophoretic mobility)에서의 어떠한 시프트(shift)도 CcMan5 대조 반응(control reaction)[빠른 러닝(fast running) P-M8 피크의 출현(appearance)], 다음에 CIP 처리[P-M8 의 사라짐(disappearance)]와 비교하여 관찰되지 않았다.
추가적인 실험에서,1 ㎕ 의 효소, 즉 각각의 Bt3530 (0.1 mg/ml), Bt3965 (4.75 mg/ml) 및 Bt3994 (1.37 mg/ml)를 실온에서 60 시간 동안 pH 7.0 (2 mM CaCl2 을 갖는 10 mM HEPES 완충용액 pH 7.0)및 pH 5.0 에서의 MNN4 N-글리칸(2 mM CaCl2 을 갖는 10 mM 아세트산 암모늄 pH 5.0 )과 함께 배양하였다. 매우 작은 α1,2-만노시다제 활성도가, 작은 Man5GlcNAc2 (M5) 피크가 일렉트로페로그램에서 나타남으로써, pH 7.0 에서 Bt3530 에서 관찰되었다. 반면에 pH 5.0 에서, 어떠한 α1,2-만노시다제 활성도도 나타나지 않았지만, 일렉트로페로그램의 좌측편(left hand side)에서 빠른 러닝 피크(fast running peak)가 나타났다. 이러한 피크는 P-Man8GlcNAc2 (P-M8)로서 동일한 전기영동 이동성(electrophoretic mobility)을 갖고, 말단 인산염은 CIP 와 함께 배양한 후에 가수분해되었다. CcMan5 (Bt3530으로서 동일한 농도로 사용됨)는 pH 7.0 으로 실온에서 20 시간 배양하면서 완전하게 캡핑이 제거된 ManP-Man8GlcNAc2이다; 따라서, Bt3530 의 관찰된 활성도는 상당히 낮다. 정제한 후에, Bt3530 샘플은, 300 mM NaCl와 함께 20 mM TRIS 완충용액, pH 8.0 에서 저장했을 때, 서서히 침전되었다. 따라서, Bt3530 단백질의 불안정성(instability)은 사용된 검정 조건 하에서 활성도에 영향을 줄 가능성이 있다. 40 배 더 높은 농도에서 사용된 Bt3965 는 pH 7.0 (패널 G 및 H) 및 pH 5.0 (패널 I 및 J)에서 Bt3530 와 동일한 결과를 나타내었다. 어떠한 활성도도 동일한 반응 조건 하에서 Bt3994 와 함께 관찰되지 않았다(패널 K 에서 N 까지).
이러한 실험으로부터, 인산염 캠핑이 제거된 활성도는 MNN4 당에서 테스트된 세 개의 B. 테타이오타오미크론 GH 92 효소 중의 2 개만이 최소한의 사이드 활성도(minor side activity)임을 결론으로 내릴 수 있다.
그 밖의 실시형태
본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기재하긴 하였지면, 상기에 나타낸 상세한 설명은 본 발명을 설명하기 위한 의도이며, 이로 본 발명의 범위를 한정하지 않으며, 이는 청구의 범위의 범위에 의해 분명히 나타내었다. 그 밖의 측면, 장점 및 변형물은 하기의 청구의 범위의 범위 내에 있다.
청구하는 사항
[청구사항 1]
다음의 단계를 포함하는, 올리고당(oligosaccharide)에서의 만노스-6-인산 잔기(mannose-6-phosphate residue)의 캡핑제거(uncapping) 방법:
a) 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기(mannose-1-phospho-6-mannose residue)를 갖는 상기 올리고당을 제공하는 단계; 및
b) 상기 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해시킬 수 있는 만노시다제(mannosidase)와 상기 올리고당을 접촉시키는 단계(여기에서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92(glycosyl hydrolase family 92)의 멤버(member)이다).
[청구사항 2]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는 SEQ ID NO:50의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO:50와 적어도 70 % 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
[청구사항 3]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않는 것인(the mannosidase does not contain a catalytic acid residue capable of protonating the anomeric oxygen), 방법.
[청구사항 4]
제3항에 있어서,
박테로이데스 테타이오타오미크론 알파-1,2-만노시다제 Bt3990의 글루탐산 잔기 Glu 533에 대응하는 만노시다제의 잔기는 비-산성 잔기인 것인, 방법.
[청구사항 5]
제4항에 있어서,
박테로이데스 테타이오타오미크론 알파-1,2-만노시다제 Bt3990의 글루탐산 잔기 Glu 533에 대응하는 만노시다제의 잔기는, 글루타민 또는 아스파라긴 잔기인 것인, 방법.
[청구사항 6]
제5항에 있어서,
박테로이데스 테타이오타오미크론 알파-1,2-만노시다제 Bt3990의 글루탐산 잔기 Glu 533에 대응하는 만노시다제의 잔기는 글루타민 잔기이고, 상기 글루타민 잔기는 X1YQGX2 모티프에 함유되고, 이 식에서 X1 은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr 또는 Met이고, X2 는 Thr, Ser, 또는 Asn 인 것인, 방법.
[청구사항 7]
제3항에 있어서,
박테로이데스 테타이오타오미크론 알파-1,2-만노시다제 Bt3990의 글루탐산 잔기 Glu 585에 대응하는 만노시다제의 잔기는 비-산성 잔기인 것인, 방법.
[청구사항 8]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는, SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 90 % 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
[청구사항 9]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는, SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
[청구사항 10]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는, SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 98 % 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
[청구사항 11]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는 SEQ ID NO:50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO:50 을 포함하는 방법.
[청구사항 12]
제11항에 있어서,
상기 만노시다제는 SEQ ID NO:50 의 잔기 1 내지 774의 N-말단 또는 SEQ ID NO:50의 N-말단의 SEQ ID NO:15 의 잔기 1 내지 15 를 추가적으로 포함하는 방법.
[청구사항 13]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제에 대해서, 아미노산 곁사슬(amino acid side chains)에서의 원자의 삼차원의 단백질 좌표(three dimensional protein coordinates)는, 도 33 에서의 등가의 원자(equivalent atoms)의 좌표의 1.5 Å 편차(deviation) 내의 범위에 들어가는 최소의 촉매 중심(minimal catalytic center)에 위치하는 방법.
[청구사항 14]
제1항에 있어서,
상기 만노시다제는 하기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법:
(ⅰ) GVGXXGXGG 모티프(motif)(이 식에서, X 는 Gly, Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 이다);
(ⅱ) VRXE 모티프(이 식에서, X 는 Pro 외의 모든 아미노산이다);
(ⅲ) X1YQGX2 모티프(이 식에서, X1 은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr 또는 Met 이고, X2 은 Thr, Ser, 또는 Asn 이다); 또는
(ⅳ) GDXGN(이 식에서, X 는 Pro 외의 모든 아미노산일 수 있다).
[청구사항 15]
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉 단계(contacting step)는 정제된 만노시다제(purified mannosidase), 재조합 만노시다제(recombinant mannosidase), 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 세포 용해액(cell lysate), 또는 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 균류 세포(fungal cell)를 사용하여 실행하는 방법.
[청구사항 16]
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고당은 단백질에 부착된(attached) 방법.
[청구사항 17]
제16항에 있어서,
상기 단백질은 균류 유기체(fungal organism)에서 발현된 인간 단백질(human protein)인 방법.
[청구사항 18]
제17항에 있어서,
상기 균류 유기체는 야로위아 리폴리티카 ( Yarrowia lipolytica ) 또는 아르술라 아데니니보란스 ( Arxula adeninivorans )인 방법.
[청구사항 19]
제17항에 있어서,
상기 균류 유기체는 메탄올자화효모(methylotrophic yeast)인 방법.
[청구사항 20]
제19항에 있어서,
상기 메탄올자화효모는 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris ), 피치아 메탄올리카 (Pichia methanolica ), 오가테아 미뉴타 ( Oogataea minuta) 또는 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha )인 방법.
[청구사항 21]
제17항에 있어서,
상기 균류 유기체는 사상 균류(filamentous fungus)인 방법.
[청구사항 22]
제21항에 있어서,
상기 사상 균류는 아스페르길루스 카에시엘루스 ( Aspergillus caesiellus ), 아스페르길루스 칸디두스 ( Aspergillus candidus ), 아스페르길루스 카르네우스 (Aspergillus carneus ), 아스페르길루스 클라바투수 ( Aspergillus clavatus ), 아스페르길루스 데플렉투스 ( Aspergillus deflectus ), 아스페르길루스 플래브스 (Aspergillus flavus ), 아스페르길루스 푸미가투스 ( Aspergillus fumigates), 아스페르길루스 글라우크스 ( Aspergillus glaucus ), 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans ), 아스페르길루스 니게르 ( Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스 ( Aspergillus ochraceus ), 아스페르길루스 오라자에 (Aspergillus oryzae ), 아스페르길루스 파라시티커스 ( Aspergillus parasiticus ), 아스페르길루스 페니실로이데스 ( Aspergillus penicilloides ), 아스페르길루스 레스트릭투스 (Aspergillus restrictus ), 아스페르길루스 소예 ( Aspergillus sojae ), 아스페르길루스 시도위 ( Aspergillus sydowi ), 아스페르길루스 타마리 ( Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스 ( Aspergillus terreus ), 아스페르길루스 우스투스 (Aspergillus ustus ), 및 아스페르길루스 베르시컬러 ( Aspergillus versicolor )로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
[청구사항 23]
제16항에 있어서,
상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 방법.
[청구사항 24]
제23항에 있어서,
상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소(lysosomal enzyme)인 방법.
[청구사항 25]
제24항에 있어서,
상기 리소좀 효소는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder, LSD)과 관련된 방법.
[청구사항 26]
제25항에 있어서,
상기 LSD 는 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
Figure 112017097690755-pat00008
)을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 방법.
[청구사항 27]
제25항에 있어서,
상기 LSD 는 폼피병(Pompe disease) 또는 파브리병(Fabry's disease)인 방법.
[청구사항 28]
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 만노시다제는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 포함하는 방법.
[청구사항 29]
다음의 단계를 포함하는, 캡핑이 제거된(uncapped) 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질(target protein)을 생산하는 방법:
만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는(encoding) 핵산을 포함하고 발현되도록(express) 유전적으로 조작된 균류 세포를 제공하는 단계(여기에서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이다); 및
타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 상기 세포 내로 도입하는(introducing) 단계(여기에서, 상기 세포는 상기 타겟 단백질을 생산하고, 타겟 단백질 상의 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기는 세포에서 발현된 상기 발현된 만노시다제에 의해 포스포-6-만노스 잔기로 전환된다).
[청구사항 30]
제29항에 있어서,
상기 만노시다제는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
[청구사항 31]
제29항에 있어서,
상기 균류 세포는 만노실 인산화반응(mannosyl phosphorylation)을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 방법.
[청구사항 32]
제29항에 있어서,
상기 균류 세포는 OCH1 활성도(OCH1 activity)가 결핍되도록(deficient) 유전적으로 조작된 방법.
[청구사항 33]
제29항에 있어서,
상기 만노시다제는 C. 셀룰란스 (C. cellulans ), 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor ), 또는 스트렙토마이세스 리비단스 ( Streptomyces lividans) 만노시다제인 방법.
[청구사항 34]
다음의 단계를 포함하는, 균류 유기체에서 캡핑이 제거된(uncapped) 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질을 생산하는 방법:
a) 만노스-1-포스포-6-만노스를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고 발현되도록 유전적으로 조작된 균류 세포를 제공하는 단계(여기에서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이고, 상기 균류 세포는 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하고, 타겟(target) 상의 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기는 세포에서 발현된 상기 발현된 만노시다제에 의해 포스포-6-만노스 잔기로 전환된다); 및
b) 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 상기 타겟 단백질을 분리하는 단계.
[청구사항 35]
제34항에 있어서,
상기 만노시다제는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 방법.
[청구사항 36]
제34항에 있어서,
상기 타겟 단백질 및 상기 만노시다제는 세포에 의해 분비되는 방법.
[청구사항 37]
캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질(glycoproteins)을 생산하도록 유전적으로 조작된 분리된 균류 세포(isolated fungal cell)로서, 상기 균류 세포는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 상기 균류 세포에서의 상기 만노시다제의 발현(expression)은 상기 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 결과적으로 생산하고, 여기에서 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92 의 멤버인, 균류 세포.
[청구사항 38]
제37항에 있어서,
상기 만노시다제는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 것인, 균류 세포.
[청구사항 39]
제37항에 있어서,
상기 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 균류 세포.
[청구사항 40]
제37항에 있어서,
상기 균류 세포는 OCH1[외부 사슬 연장(Outer CHain elongation)] 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된 균류 세포.
[청구사항 41]
제37항에 있어서,
상기 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하고, 여기에서 상기 균류 세포는 OCH1 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된 균류 세포.
[청구사항 42]
제37항에 있어서,
상기 균류 세포는 당단백질인 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 균류 세포.
[청구사항 43]
제42항에 있어서,
상기 타겟 단백질은 인간 단백질인 균류 세포.
[청구사항 44]
제42항에 있어서,
상기 타겟 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 균류 세포.
[청구사항 45]
제44항에 있어서,
상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인 균류 세포.
[청구사항 46]
제45항에 있어서,
상기 리소좀 효소는 산성의 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase) 또는 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase)인 균류 세포.
[청구사항 47]
제42항에 있어서,
상기 타겟 단백질은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder, LSD)과 관련된 단백질인 균류 세포.
[청구사항 48]
제47항에 있어서,
상기 LSD 는 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
Figure 112017097690755-pat00009
)을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 균류 세포.
[청구사항 49]
제37항에 있어서,
상기 균류 세포(fungal cell)는 야로위아 리폴리티카 ( Yarrowia lipolytica ) 또는 아르술라 아데니니보란스 ( Arxula adeninivorans ) 세포인 균류 세포.
[청구사항 50]
제39항에 있어서,
만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 상기 폴리펩티드는 MNN4 폴리펩티드인 균류 세포.
[청구사항 51]
제50항에 있어서,
상기 MNN4 폴리펩티드는 야로위아 리폴리티카 , S. 세레비시아 (S. cerevisiae), 오가테아 미누타 ( Ogataea minuta ), 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스 (C. albicans ) 폴리펩티드인 균류 세포.
[청구사항 52]
제39항에 있어서,
만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 상기 폴리펩티드는 P. 파스토리스 PN01 폴리펩티드인 균류 세포.
[청구사항 53]
제37항에 있어서,
상기 만노시다제는 C. 셀룰란스 (C. cellulans ), 스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor ), 또는 스트렙토마이세스 리비단스 ( Streptomyces lividans) 만노시다제인 균류 세포.
[청구사항 54]
제37항에 있어서,
상기 만노시다제는 분비 신호(secretion signal)를 포함하는 균류 세포.
[청구사항 55]
제37항에 있어서,
상기 만노시다제는 세포내 구간(intracellular compartment)에 상기 만노시다제를 타겟하기 위한(target) 타겟팅 신호(targeting signal)를 포함하는 균류 세포.
[청구사항 56]
제37항에 있어서,
상기 만노시다제는 분비 신호 및 세포내 구간에 상기 만노시다제를 타겟하기 위한 타겟팅 신호를 포함하는 균류 세포.
[청구사항 57]
야로위아 리폴리티카 ( Yarrowia lipolytica ), 피키아 파스토리스 ( Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha ), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans ), 피치아 메탄올리카 ( Pichia methanolica ), 오가테아 미뉴타 ( Oogataea minuta), 또는 아스페르길루스 니게르 ( Aspergillus niger) 세포의 실질적인 순수 배양물(pure culture)로서, 이들 중 상당수는 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 생산하도록 유전적으로 조작되고, 상기 세포는 만노스-1-포스포-6-만노스를 포스포-6-만노스로 가수분해시킬 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 여기에서 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92 의 멤버인, 배양물.
[청구사항 58]
제57항에 있어서,
상기 만노시다제는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인, 배양물.
[청구사항 59]
제57항에 있어서,
상기 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 배양물.
[청구사항 60]
제57항에 있어서,
상기 세포는 OCH1 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된 배양물.
[청구사항 61]
분리된 당단백질로서,
상기 당단백질에서 적어도 47 %의 N-글리칸은 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하고, 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 상기 적어도 47 % N-글리칸은, P2-Man8GlcNAc2, (ManP)P-Man8GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, 및 PMan8GlcNAc2 로부터 선택된 것인, 분리된 당단백질.
[청구사항 62]
제61항에 있어서,
상기 당단백질에서 적어도 50 %의 N-글리칸은, 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하고, 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 상기 적어도 50 % N-글리칸은 P2-Man8GlcNAc2, (ManP)P-Man8GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, 및 PMan8GlcNAc2로부터 선택된 것인, 분리된 당단백질.
[청구사항 63]
제61항에 있어서,
상기 당단백질에서 적어도 75 %의 N-글리칸은, 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하고, 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 상기 적어도 75 % N-글리칸은 P2-Man8GlcNAc2, (ManP)P-Man8GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, 및 PMan8GlcNAc2로부터 선택된 것인, 분리된 당단백질.
[청구사항 64]
제61항에 있어서,
상기 당단백질에서 적어도 90 %의 N-글리칸은, 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하고, 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 상기 적어도 90 % N-글리칸은 P2-Man8GlcNAc2, (ManP)P-Man8GlcNAc2, P-Man7GlcNAc2, 및 PMan8GlcNAc2로부터 선택된 것인, 분리된 당단백질.
[청구사항 65]
만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제 폴리펩티드로서,
상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버인 것인, 만노시다제 폴리펩티드.
[청구사항 66]
제65항에 있어서,
상기 만노시다제는 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은 것인, 만노시다제 폴리펩티드.
[청구사항 67]
하기를 포함하는 핵산:
(a) 제65항의 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(b) (a)에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 상보체(complement of the nucleotide sequence).
[청구사항 68]
제67항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:50의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO:50 을 코드화하는 핵산.
[청구사항 69]
제67항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 46 내지 2322 또는 SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 46 내지 4995 를 포함하는 핵산.
[청구사항 70]
제69항에 있어서,
SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 46 내지 2322의 5' 또는 SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 46 내지 4995의 5'의 SEQ ID NO:14의 뉴클레오티드 1 내지 45를 더 포함하는 핵산.
[청구사항 71]
제67항 내지 제70항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
[청구사항 72]
제71항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
[청구사항 73]
제72항의 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
<110> MUHANN Patent & Law Firm <120> Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose <130> APC-2012-0161-DIV <150> US 61/246,847 <151> 2009-09-29 <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Ser Ala Tyr Gln Ser Phe Thr Thr Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Val Trp Gly Phe Ser His Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Val Glu Gly Gly Trp Leu Pro Arg 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Thr Gln Gly Asn Asn Phe Ala Leu Leu Leu Pro Glu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Asp Val His Ala Glu Leu Thr Ala Met Ala Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 2700 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cellulosimicrobium cellulans <400> 6 atgagacgac cacgactcgc cctgctcgcc 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Cellulosimicrobium cellulans <400> 15 Ala Leu Ala Val Val Gly Leu Ala Pro Ala Thr Ala Ala Ser Ala Ala 1 5 10 15 Pro Glu Pro Pro Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Leu Val Asp Val Phe Val 20 25 30 Gly Thr Glu Gly Asp Phe Gly Asn Asp Met Pro Ala Ala Gln Ala Pro 35 40 45 Asn Gly Leu Ala Lys Val Asn Pro Arg Thr Thr Pro Gly Arg Asn Asn 50 55 60 Thr Gly Tyr Asp Tyr Ala Gln Ser Lys Ile Ser Gly Phe Thr His Thr 65 70 75 80 Asn Leu Asp Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu Val 85 90 95 Val Pro Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Arg Pro Gly Thr Gly Thr Tyr 100 105 110 Ala His Pro Phe Ser His Asp Asp Glu Asp Ala Gly Pro Gly Phe Tyr 115 120 125 Ser Val Gly Leu Gly Asn Val Ala Gly Thr Asp Gly Ala Ile Thr Gly 130 135 140 Ala Pro Gly Thr Ile Glu Ala Glu Val Ala Ala Ala Thr Arg Ser Gly 145 150 155 160 Val His Arg Tyr Ala Phe Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Leu Val Val 165 170 175 Asp Leu Glu Thr Asn Asn Thr Ser Arg Arg Ser Ser Ser Val Gln Val 180 185 190 Glu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Ser Gly Gln Val Thr 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gttatgttgc aggtagcacc 660 accagtgaag ttgccggtgg taataatggt gcagttgccg tttttgatac caccaccgat 720 cgtgatgttg aagttagcgt tggtgttagc tttgttagcg ttgatggtgc acgtgcaaat 780 cgtgaagccg aagcaaccga tgaaggtggt caggttgcat ttgataccgt tcgtgaagaa 840 gcacgcgacg cctggaatgc agaactgggt cgtgcagcaa ttgatgcatc tccggatcag 900 cgtcgtatct tttataccca gctgtataaa accctgctga gcccgaccat tggttctgat 960 gttgatggtc gttatcgtgg tatggatctg gaagttcatc aggcagatgg ctgggattat 1020 tatcagaact ttagcctgtg ggatacctat cgtacccagg caaccctgca tgcactgctg 1080 ctgccggaac gtgcacagga tattgttcgt agcatgtatc agcatcgtgt tgaaggtggt 1140 tggctgcctc gttggtctct gggtgcactg gaaaccaata tcatggcagg cgatccggtt 1200 accccgtggc tggcagaaaa ttttgcactg ggcaccgttc cggatgatat tgcagatgaa 1260 ctgtgggatt atctggttga aaatgcaacc accacccctc cggatgatgt tgccagcgtt 1320 ggtcgtcgta gcaccgaatt ttatgccgaa catggtcatg ttccgtttta tccggaaaac 1380 gaaggtggcc tgggtggtca gtttgaagaa tatcgtcatg gtggtagcgc aaccctggaa 1440 ctggcactgg cagatgcaag cctgggtgcc gcagcagaac gtaccggtcg 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accgcctgca 2340 ccggttgaag tggaagcaag cgcacgttgt ctgggtggtc gtgcatttgt tgcagttcgt 2400 gcaaccagca ccgcagatgc accggtggat gttacactga ccacaccgtt tggtgaacgt 2460 accgttcgtc atgttcagcc tggtcgtagc gcatatcaga gctttaccac ccgtaccacc 2520 tctgttgaag caggcaccgc aaccgttacc gttgttgcag cagatggcac cacctcaacc 2580 gttgatgcag catatgaagc actggcatgt ggttaataa 2619 <210> 17 <211> 3483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 17 gcaggcaccg aagcagcaac cggttctgat gcagcagcag ttgatggtcc gctggttgat 60 tatgtgaatc cgtttattgg caccaaagat gatggtaata cctatccggg tgcagcagtt 120 ccgtttggta tggttcagct gtctccggat aatggtcata atgtgggcta tgattatgat 180 cgtaccagcg ttcgtggttt tagcctggtt catctgagcg gtgttggttg tggtctgggt 240 ggtccgctgc cgacactgcc gaccaccggt gcaattacca gcaccgatta tggtcagtat 300 gcactgggtt ttagccatga tgatgaagaa gcatctccgg gttattatcg tgttggtctg 360 caggcacctg caggaaccat tgaagcagaa ctgaccgcaa ccgaacgtac cggtgttcag 420 cgttatacct ttccggcaac cgcacaggca aatgttctgc tgaatgcagg tcaggcactg 480 aatcgtgtta ccgaatctga tgttcgtgtt gttgatgatc gtaccgttga aacccgtatt 540 accgtgcgtg gtttttgtca ggataccgaa ccgcagacca tttggacccg taccaccttt 600 gatcgtccgt ttgttgcaca tggcacctgg gatggtcagg ttgttaccgc aggcgcagat 660 gcagcaagcg gtggtgaagg tcgtcgtggt gcatatgtta cctttgatac aaccggtggt 720 gatctggatg ttgaagcagt taccgcaatg agctatgttg gtgcagatgg tgcagcagca 780 aatctggcag cagaagcagg cacctttgac gcagttcatg atgcagcacg tagcgcatgg 840 gaagaacgtc tgggtctggt tcgtgttgca cagggtgatc cggatgatct gcgtaccttt 900 tatagcagcc tgtatcgtag ctttctggca ccgaatgttg gttctgatgt ggatggtcgt 960 tatcgtggtt gggatcagga agttcacgca gcagaaccgg attttaccta ttatcagaat 1020 tatagcctgt gggataccta tcgtacccaa cagcaactgc tgtatctgct ggcaccggat 1080 gaaagcgcag atatggcact gagcctggtt cgtcagggtc agcagggtgg ttggctgcct 1140 cgttggggtt atggtacagt ggaaaccaat attatgaccg gtgatccggc aaccccgttt 1200 ctggttagcg catggcgtca gggtctgctg gcaggtcatg aagaagaagc atacgcagtc 1260 ctgcgtgaaa atgcagatgg tgttcctccg gcagatagcc cgtttaatgg tcgtgcagcc 1320 aatgttgaat atctgcgtga tggttttgtt ccgcatgaac cggcacgtag cggtaaaccg 1380 ggtgattatg atctgcagca tggtgcaagc gcaaccatgg aatatgcact ggcagatgca 1440 atgctgagca ccatggcacg tggtctgggt catgatgaag atgcagatcg ttatgcagcc 1500 cgtggtcaga gctatcgtaa tgtttttgat ccgcgtaccg gtaattttcg tgcacgtaat 1560 gccgatggtt tttttgttgg tgatgcagat ccggcacatt ctgatggttt tcatgaaggc 1620 accgcagttc agtatcagtg gctggttccg caggatgttc cgggtctgtt tgatctgatg 1680 ggtggcaccg atgcagccgt tgatcgtctg gatgcatttt ttgcctatga tgaactggtt 1740 gcagatcctc cgcatgttgc aagcgaagtt tgggttaatg gcacctatga ttattatggc 1800 tgggaaacct ataatccgaa taatgaaccg aatctgcatg caccgtatgt ttatctgtgg 1860 accggtcagc cgtggaaaac caccgatgtt gttcgtgcag caagcaccct gtttaccgat 1920 ggtccggatg gtgttaccgg taatgatgat ctgggcacca tgagcgcatg gcatgttctg 1980 agcagcattg gtgtttatcc gattgttccg ggtgccgatc tgtggggtct gaccacaccg 2040 ctgtttgatg atgttaccat taccctggac ccggaagttt ttggtcgtga tagcctgcgt 2100 ctgaccgcag atggtgtggc accggatacc cattataccc agagcgttag cctgggtggt 2160 gaaccgctgg atcgtgcatg ggttacaggt gatgaactga ccgctgcagg caccctggat 2220 gttaccgttg gcaccgaacc gagcgcatgg gcaaccgatc cggcagcatc accgggtgca 2280 gttgttccgg ctgatggcac cgttgaacgt ctgtttgttg gtgcaacacc gcgtcagccg 2340 gttctggcac cgggtggtcg taccgaagtt gcagttcagg ttgttgccca gggtgcaggc 2400 acctctagcg gcaccctgga agtgacctct gatggtgcag ttaccgccac caccgatctg 2460 gcagaatgga ccgcagaatc tgatggtctg cctgccaccg ttgaaggaac cgttaccatt 2520 gaagctccgg cagatgccga accgggtctg cataccgttc gtctggttgt tcgtgatgca 2580 gccggtacag aagcagttcg cgaagttagc gttgttgtta gcggtgaaag ctggattgca 2640 gatgcctttg ataatgtggg tattggtgat gccggtgcag caaatgcaaa tctggatggt 2700 agcggtgcct atctgctgcg tgatctgctg gccgatctgg gtgcagttca gggtctggaa 2760 ctgaccgttc cgggtactga tctgacctat accctgggtg caccgcgtgc tggtgcaccg 2820 gataatgttg cagccagcgg tgaagttctg gaagttccgg aacatctgcg tagcgcacgt 2880 catctgagcg ttgtgggcac cagcacccat ggtacacatg gtggtggtct ggttctgggt 2940 tttgccgatg gtagcagcca gaccgttgat gttcgtctga gcgattggtg taccggttct 3000 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Asn Lys 690 695 700 Tyr Val 705 <210> 48 <211> 691 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bacteroides sp. <400> 48 Met Ala Ser Ser Cys Val Tyr Ser Pro Pro Lys Glu Pro Val Asp Tyr 1 5 10 15 Val Asn Pro Asn Ile Gly Thr Ile Gly His Leu Leu Val Ala Thr Ala 20 25 30 Ser Met Val Gln Leu Pro His Gly Met Val Gln Ile Gly Gln Asn Pro 35 40 45 Tyr Pro Pro Leu Ala Asp Arg Tyr Leu Ala Asp Arg Ile Ser Gly Phe 50 55 60 Ser Val Arg Ala Leu Pro Lys Tyr Thr Thr Lys Pro Phe Ser Trp Ile 65 70 75 80 Met Ala Thr Thr Gly Ala Pro Arg Ile Asn Pro Asn Asp Tyr Ala Ser 85 90 95 Gly Phe Asp His Asp Phe Glu Lys Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Trp Ile 100 105 110 Leu Leu Glu Asp Tyr Asp Ile Glu Ala Ala Met Thr Val Thr Gln His 115 120 125 Ser Ser Phe Tyr Lys Phe Lys Tyr Pro Lys Ser Ser Glu Ser Asn Ile 130 135 140 Leu Met Asn Asn Asn Gln Cys Val Arg Val Val Gly Asn Asn Cys Ile 145 150 155 160 Glu Ser Val Glu Ala Val Asp Ser Thr Gln Thr Ala Tyr Tyr Tyr Ala 165 170 175 Ile Phe Ser Lys Pro Phe Arg Ser Tyr Val Thr Trp Lys Asp Ser Leu 180 185 190 Ile Ser Gln Asp Val Lys Gln Glu Gly Leu Asp Ile Gly Ala Leu Val 195 200 205 Thr Phe Asp Thr Ser Gln Asp Glu Glu Ile Met Val Lys Ile Gly Val 210 215 220 Ser Phe Ile Asp Met Glu Gln Ala Lys Arg Asn Leu Glu Met Glu Ile 225 230 235 240 Pro Ala Trp Asp Phe Asp Lys Val Lys Asn Asp Gly Arg Glu Ile Trp 245 250 255 Asn Asn Ala Leu Gly Lys Ile Lys Ile Glu Gly Gly Thr Asp Lys Gln 260 265 270 Lys Thr Ile Phe Tyr Ser Ala Leu Tyr Arg Val Met Leu Gly Ser Gln 275 280 285 Thr Leu Asp Arg Ser Glu Tyr Gly Arg Tyr Tyr Ser Arg Leu Asp Lys 290 295 300 Gln Val His Asp Thr Glu Gly His Ala Phe Tyr Gln Val Gly Ser Asn 305 310 315 320 Trp Gly Ser His His Ser Leu Phe Pro Leu Val Leu Leu Leu Glu Pro 325 330 335 Glu Ile Gln Asn Asp Ile Met Arg Ser Tyr Ile Arg Met Gln Asp Glu 340 345 350 Gly Asp Trp Leu Val Asn Ser Gly Gly Tyr Arg Asn Met Ile Gly Arg 355 360 365 His Glu Val Ala Thr Ile Thr Asp Thr Tyr Met Lys Gly Phe Arg Asp 370 375 380 Phe Asp Ile Glu Lys Ala Tyr Glu Ala Met Lys Arg Asn Ser Lys Glu 385 390 395 400 Ala Thr Met Leu Ser Arg His Ile Gly Lys Asp Trp Arg Leu Asn Glu 405 410 415 Leu Asp Lys Val Tyr Leu Glu Lys Gly Phe Tyr Pro Ala Lys Pro Ser 420 425 430 Asp Gln Pro Glu Trp Val Lys Glu Val Gly Phe Gly Arg Gln Ser Val 435 440 445 Ala Leu Thr Leu Glu Asn Cys Tyr Asp Asp Trp Cys Met Ser Ile Leu 450 455 460 Ala Lys Glu Leu Gly Lys Glu Asp Asp Tyr Gln Tyr Tyr Leu Asn Arg 465 470 475 480 Ala Tyr Asn Tyr Arg Asn Val Phe Asp Ser Lys Ser Gly Phe Met Arg 485 490 495 Pro Lys Thr Ala Asp Gly Lys Trp Ile Glu Pro Phe Asp Pro Ile Trp 500 505 510 Ser Gly Gly Gln Gly Gly Arg Asp Phe Tyr Thr Glu Asn Asn Gly Trp 515 520 525 Asn Tyr Thr Trp Tyr Val Leu His Asp Pro Gln Gly Leu Ile Asn Leu 530 535 540 Met Gly Gly Gln Glu Pro Phe Val Ala Lys Leu Gln Gln Met Phe Glu 545 550 555 560 Thr Asn Val Pro Leu Tyr Lys Lys Tyr Asp Phe Leu Lys Gln Tyr Pro 565 570 575 Asp Met Thr Gly Trp Ile Gly Met Tyr Ser His Gly Asn Glu Ile Thr 580 585 590 Trp His Ile Pro Tyr Leu Tyr Asn Tyr Ala Gly Lys Pro Trp Met Thr 595 600 605 Gln Arg Arg Ile Arg Gln Ile Leu Asp Leu Trp Tyr Gly Asp Gly Pro 610 615 620 Leu Gly Phe Cys Gly Asp Glu Asp Tyr Gly Glu Met Ser Ser Trp Tyr 625 630 635 640 Ile Leu Ser Ala Met Gly Phe Tyr Thr Val Ala Pro Gly Arg Pro Val 645 650 655 Tyr Asp Ile Gly Ser Pro Leu Phe Glu Lys Ser Thr Ile Asp Ile Gly 660 665 670 Asp Gly Lys Lys Phe Thr Ile Glu Cys Arg Asn Ile Ser Thr Gln Asn 675 680 685 Lys Tyr Ile 690 <210> 49 <211> 706 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Parabacteroides distasonis <400> 49 Met Lys Thr Lys Leu Lys Thr Ser Met Ala Leu Leu Ala Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Trp Val Ser Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Ser Pro Ser Ala Met 20 25 30 Asp Pro Val Asp Tyr Val Asn Pro Tyr Met Gly Asn Ile Ser His Leu 35 40 45 Leu Val Pro Thr Phe Pro Thr Val His Leu Pro Asn Ser Met Leu Arg 50 55 60 Val Tyr Pro Glu Arg Ala Asp Phe Thr Gly Asp Arg Leu Gly Gly Leu 65 70 75 80 Pro Ile Ile Val Thr Asn His Arg Glu Arg Ser Ala Phe Asn Leu Cys 85 90 95 Pro Tyr Gln Gly Asp Glu Ser Gly Leu Arg Pro Val Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Tyr Asp Arg Glu Lys Ile Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Val Tyr Leu Asp 115 120 125 Asn Glu Glu Ile Asp Val Asp Phe Ala Pro Ser His Gln Ser Ala Val 130 135 140 Tyr Ser Leu Thr Phe Glu Lys Glu Gly Pro Ala Tyr Leu Val Phe Asn 145 150 155 160 Ser Arg Asn Gly Gln Leu Gln Val Asn Gly Asn Ala Val Ser Gly Tyr 165 170 175 Gln Tyr Ile Asp Lys Lys Thr Lys Val Phe Leu Tyr Ala Glu Thr Asn 180 185 190 Gln Lys Pro Val Lys Ala Gly Val Leu Ser Asn Gly Ser Val Asn Tyr 195 200 205 Asn Glu Thr Ser Val Glu Gly Ile Asn Ala Ala Ile Ala Leu Ser Phe 210 215 220 Gly Glu Asp Val Lys Lys Leu Gly Val Arg Tyr Gly Ile Ser Phe Ile 225 230 235 240 Ser Glu Glu Gln Ala Lys Lys Asn Leu Glu Arg Glu Ile Ala Ala Tyr 245 250 255 Asp Val Asp Val Val Ala Lys Ile Ala Arg Asn Asp Trp Asn Asp Ala 260 265 270 Leu Gly Lys Ile Gln Val Gln Gly Gly Thr Lys Asp Glu Lys Thr Val 275 280 285 Phe Tyr Thr Ser Leu Tyr Arg Cys Tyr Glu Arg Pro Ile Asn Leu Ser 290 295 300 Glu Asp Gly His Tyr Tyr Ser Ala Phe Asp Gly Lys Ile His Glu Asp 305 310 315 320 Gly Gly Arg Ser Phe Tyr Thr Asp Asp Trp Ile Trp Asp Thr Tyr Arg 325 330 335 Ala Thr His Pro Leu Arg Val Leu Ile Asp Asn Glu Arg Glu Asn Asp 340 345 350 Ile Ile Asn Ser Tyr Leu Leu Met Ala Glu Gln Met Gly Thr Asp Trp 355 360 365 Met Pro Thr Phe Pro Glu Val Thr Gly Asp Thr Arg Arg Met Asn Ser 370 375 380 Asn His Ala Val Ala Thr Val Ile Asp Ala Tyr Arg Lys Gly Leu Arg 385 390 395 400 Gly Phe Glu Leu Glu Lys Ala Tyr Ile Ala Cys Lys Lys Gly Ile Glu 405 410 415 Glu Lys Thr Leu Ile Pro Trp Ser Ala Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp 420 425 430 Asp Phe Tyr Lys Glu His Gly Tyr Ile Pro Ala Leu Arg Pro Gly Glu 435 440 445 Lys Glu Thr Val Pro Asn Val Ser Ile Trp Glu Lys Arg Gln Pro Ile 450 455 460 Ala Val Thr Leu Gly Thr Ser Tyr Asp Glu Trp Cys Leu Ser Gln Ile 465 470 475 480 Ala Gln Glu Leu Gly Lys Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Leu Arg Arg 485 490 495 Ser Tyr Asn Phe Asn Thr Pro Leu Gly Met Ser Lys Trp Gln Phe Tyr 500 505 510 Ser Thr Leu Pro Asp His Thr Gly Asn Val Gly Met Phe Ser Met Ala 515 520 525 Asn Glu Pro Ser Leu His Ile Pro Tyr Leu Tyr Asn Tyr Ala Gly Lys 530 535 540 Pro Trp Met Thr Gln Lys Arg Ile Arg Thr Leu Leu Asn Gln Trp Phe 545 550 555 560 Arg Asn Asp Leu Met Gly Val Tyr Arg Asn Val Phe Asn Pro Glu Thr 565 570 575 Gly Phe Phe His Pro Lys Asp Lys Asp Gly Lys Phe Ile Tyr Pro Leu 580 585 590 Asp Tyr Arg Tyr Asp Gly Gly Leu Gly Ala Arg Asp Tyr Tyr Asp Glu 595 600 605 Asn Asn Gly Tyr Ile Tyr Arg Trp Asp Val Gln His Asn Ile Gly Asp 610 615 620 Leu Ile Ser Leu Ile Gly Gly Asn Glu Ala Phe Thr Ser Ala Leu Asp 625 630 635 640 Ser Met Pro Gly Asp Glu Asp Gly Gly Gly Met Ser Ala Phe Val Val 645 650 655 Phe Ser Gln Met Gly Phe Tyr Pro Val Thr Pro Gly Ser Pro Thr Tyr 660 665 670 Asn Ile Gly Ser Pro Met Phe Thr Asp Val Lys Val Asp Met Gly Asn 675 680 685 Gly Asn Thr Phe Glu Ile Arg Ala Asn Asn Ala Ser Asp Glu Asn Lys 690 695 700 Tyr Val 705 <210> 50 <211> 1650 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Cellulosimicrobium cellulans <400> 50 Ala Pro Glu Pro Pro Ser Ala Asp Tyr Ala Ser Leu Val Asp Val Phe 1 5 10 15 Val Gly Thr Glu Gly Asp Phe Gly Asn Asp Met Pro Ala Ala Gln Ala 20 25 30 Pro Asn Gly Leu Ala Lys Val Asn Pro Arg Thr Thr Pro Gly Arg Asn 35 40 45 Asn Thr Gly Tyr Asp Tyr Ala Gln Ser Lys Ile Ser Gly Phe Thr His 50 55 60 Thr Asn Leu Asp Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Leu Leu 65 70 75 80 Val Val Pro Thr Ser Gly Ser Tyr Thr Ala Arg Pro Gly Thr Gly Thr 85 90 95 Tyr Ala His Pro Phe Ser His Asp Asp Glu Asp Ala Gly Pro Gly Phe 100 105 110 Tyr Ser Val Gly Leu Gly Asn Val Ala Gly Thr Asp Gly Ala Ile Thr 115 120 125 Gly Ala Pro Gly Thr Ile Glu Ala Glu Val Ala Ala Ala Thr Arg Ser 130 135 140 Gly Val His Arg Tyr Ala Phe Pro Ala Gly Ser Thr Pro Ser Leu Val 145 150 155 160 Val Asp Leu Glu Thr Asn Asn Thr Ser Arg Arg Ser Ser Ser Val Gln 165 170 175 Val Glu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Ser Gly Gln Val Thr 180 185 190 Gly Tyr Phe Tyr Asn Ala Ala Tyr Thr Leu Tyr Tyr Thr Ala Arg Thr 195 200 205 Leu Gln Pro Ala Thr Val Gln Thr Trp Gly Asp Asp Asp Arg Leu Val 210 215 220 Asp Ala Thr Ala Gln Asp Gly Val Asp Thr Gly Ala Ile Leu Thr Phe 225 230 235 240 Asp Pro Ala Asp Ala Gly Glu Ile Gly Leu Gln Val Thr Leu Ser Pro 245 250 255 Val Ser Val Glu Gln Ala Arg Ile Asp Gln Gln Val Glu Leu Gly Asp 260 265 270 Leu Ser Phe Asp Ala Ile Arg Asp Arg Thr Arg Ala Glu Trp Asn Ala 275 280 285 Thr Leu Gly Arg Val Ala Ile Asp Ala Ser Thr Ala Thr Asp Pro Thr 290 295 300 Gly Glu Leu Gln Arg Leu Phe Tyr Thr His Leu Tyr Arg Met Phe Ala 305 310 315 320 Met Pro Met Asn Ala Thr Ser Thr Ser Gly Thr Tyr Arg Gly Val Asp 325 330 335 Gly Ala Val His Ala Ala Gln Gly Phe Thr Tyr Tyr Asp Ser Trp Ala 340 345 350 Thr Trp Asp Asp Phe Arg Lys Phe Ser Val Ile Ala Tyr Ile Asp Pro 355 360 365 Ala Leu Tyr Arg Asp Met Val Gln Ser Leu Val Tyr Leu Phe Ala Asp 370 375 380 Ala Glu Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Leu Gly Gly Phe Val His Ser 385 390 395 400 Val Pro Thr Val Arg Trp Glu Arg Ser Ser Val Val Val Ala Asp Ala 405 410 415 Ile Ala Lys Gly Phe Asp Gly Phe Asp Arg Leu Asp Glu Ala Tyr Pro 420 425 430 Ala Leu Gln Arg Leu Val Gly Gln Tyr Ser Ala Asp Glu Leu Arg Arg 435 440 445 Gly Tyr Val Ala Gly Asn Pro Gly Ala Ser Val Gln Arg Gly Tyr Asp 450 455 460 Gln Tyr Gly Leu Ser Val Ile Ala Asp Glu Leu Gly Leu Thr Glu Glu 465 470 475 480 Ala Glu Thr Leu Arg Glu Gln Ala Ser Trp Pro Ile Glu Lys Leu Thr 485 490 495 Lys Pro Gly Ala Trp Thr Ala Ala Asp Gly Thr Gln Val Gly Leu Leu 500 505 510 Thr Pro Arg Ala Ala Asp Gly Ser Trp Gln Ser Ala Asp His Ala Lys 515 520 525 Phe Glu Ala Ala Gly Leu Tyr Gln Gly Thr Leu Trp Gln Tyr His Trp 530 535 540 Tyr Asp Ala Tyr Asp Met Asp Ala Leu Val Glu Ala Met Gly Gly His 545 550 555 560 Glu Ala Ala Arg Leu Gly Met Arg His Met Phe Gly Glu His Ala Pro 565 570 575 Asp Asp Gly Lys Ala Met Leu His Ser Asn Ala Asn Glu Ile Asp Leu 580 585 590 Gln Ala Pro Tyr Leu Phe Asn Tyr Thr Gly Glu Pro Ser Leu Thr Gln 595 600 605 Lys Trp Ala Arg Ala Ile Tyr Thr Lys Glu Thr Trp Asn Arg Tyr Ile 610 615 620 Ala Thr Gly Ser Ser Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gly Glu Phe Thr 625 630 635 640 Pro Pro Leu Lys Thr Lys Val Tyr Arg Leu Asp Pro Arg Gly Met Leu 645 650 655 Pro Thr Met Asp Asn Asp Ala Gly Thr Met Ser Thr Met Phe Val Ala 660 665 670 Ala Ala Val Gly Leu Phe Pro Val Thr Ala Gly Ser Ser Gln Phe Gln 675 680 685 Val Gly Ser Pro Phe Phe Asp Ser Thr Thr Ile Thr Tyr Asp Asp Gly 690 695 700 Ser Ala Phe Thr Val Thr Ala Asp Gly Val Ser Glu Asp Ala Phe Tyr 705 710 715 720 Val Gln Ser Ala Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Gly Asn Thr Trp Val 725 730 735 Asp Tyr Ala Thr Val Val Gly Gly Ala Asp Leu Ala Phe Arg Met Gly 740 745 750 Glu Gln Pro Ser Asp Trp Gly Thr Asp Thr Ala Pro Ala Phe Ser Met 755 760 765 Ser Thr Ala Thr Asp Glu Pro Ala Glu Gly Pro Arg Val Ser Ala Glu 770 775 780 Pro Thr Thr Val Gln Thr Gly Asp Gly Gly Ala Leu Asp Ala Thr Val 785 790 795 800 Thr Leu Thr Leu Asp Gly Ala Arg Leu Ala Ala Pro Ala Gly Thr Asp 805 810 815 Leu Val Thr Ser Gly Ala Ala Ser Val Val Gly Leu Pro Asp Gly Val 820 825 830 Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Ser Pro Thr Ala Leu Thr Val Ser Leu 835 840 845 Thr Gly Thr Ala Ser Ala Asp Ala Arg Phe Phe Val His Leu Arg Asp 850 855 860 Ala Ala Leu Ala Asp Gly Val Ala Ala Ala Ser Leu Gln Gly Gln Gly 865 870 875 880 Val Ser Val Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ser Val Ala Ser Ala Glu Arg 885 890 895 Asp Ala Leu Ala Ala Leu Val Asp Asp Ala Val Leu Val Arg His Gly 900 905 910 Asn Tyr Ser Ser Val Thr Phe Asp Arg Phe Ser Thr Ala Leu Thr Lys 915 920 925 Ala Gln Glu Ala Leu Gly Asp Glu Ala Ala Thr Ser Ile Ala Leu Arg 930 935 940 Phe Ala Ala Asp Arg Leu Gly Ala Ala Ala Asp Ala Leu Asp Leu Thr 945 950 955 960 Gly Gly Gly Tyr Arg Thr Leu Glu Ala Glu Gln Ser Glu Ala Trp Ser 965 970 975 Gly Gly Glu Leu Lys Asn Glu Ala Asn Ser Ser Ser Gly Asn Leu Gly 980 985 990 Gly Val Arg Ser Gly Ser Trp Val Gln Tyr Arg Asp Met Thr Phe Glu 995 1000 1005 Thr Ala Ala Gly Asp Thr Pro Pro Arg Phe Leu Thr Val Arg Tyr Asp 1010 1015 1020 Thr Ser Phe Ala Pro Thr Asp Thr Pro Ser Thr Val Arg Val His Ala 1025 1030 1035 1040 Gly Asp Val Ser Gly Pro Val Val Ala Thr Val Asp Leu Lys Gly Thr 1045 1050 1055 Ser Gly Trp Gly Lys Tyr Thr Glu Val Thr Ala Glu Leu Gly Asp Val 1060 1065 1070 Gln Ala Leu Val Asp Ala Gln Val Val Thr Phe Glu Leu Leu Ala Pro 1075 1080 1085 Ser Gly Arg Ser Trp Val Gly Asn Phe Asp Trp Phe Arg Phe Ser Ala 1090 1095 1100 Glu Asp Pro Ala Ala Pro Gly Gln Pro Gly Glu Ser Pro Thr Val Thr 1105 1110 1115 1120 Ile Glu Ala Glu Asp Trp Thr Ala Ser Ser Gly Arg Gly Leu Lys Lys 1125 1130 1135 Glu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val Thr Asn Val Gly Gly Thr 1140 1145 1150 Ala Asp Gly Asp Trp Ile Ala Tyr Gly Glu Val Asp Leu Gly Glu Leu 1155 1160 1165 Pro Leu Gly Glu Leu Ser Val His Tyr Val His Asn Ser Asn Arg Ser 1170 1175 1180 Gly Asn Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Pro Ala 1185 1190 1195 1200 Asn Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro Leu Pro Thr Thr Gly Ser 1205 1210 1215 Ser Trp Thr Ala Asp Gly Thr Ala Thr Val Val Leu Pro Glu Thr Val 1220 1225 1230 Gln Gly Thr His Glu Val Phe Val Arg Leu Ser Thr Glu Pro Tyr Ala 1235 1240 1245 Asp His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser Leu Thr Phe Ala Pro Gly 1250 1255 1260 Gly Pro Thr Ser Val Val Val Glu Ser Glu Ala Trp Thr Ser Asn Ser 1265 1270 1275 1280 Gly Arg Gly Leu Lys Asn Glu Ser Ser Thr Trp Thr Ser Gly Pro Val 1285 1290 1295 Thr Asn Val Gly Gly Thr Ala Asp Gly Asp Trp Leu Ala Tyr Gly Glu 1300 1305 1310 Ile Asp Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asp Gln Leu Ser Val His Tyr Val 1315 1320 1325 His Asn Ser Asn Arg Ser Gly Arg Asn Ser Ala Leu Ser Val Tyr Leu 1330 1335 1340 Asp Ala Phe Asp Pro Ala Asn Pro Gly Glu Pro Phe Val Thr Val Pro 1345 1350 1355 1360 Leu Ala Asn Thr Gly Ser Ser Trp Thr Thr Asp Gly Thr Ala Val Val 1365 1370 1375 Asp Leu Pro Ser Thr Val Arg Gly Lys His Gln Val Trp Val Arg Leu 1380 1385 1390 Ser Thr Glu Ala Tyr Ala Asp His Pro Tyr Val Ala Asn Leu Asp Ser 1395 1400 1405 Met Arg Phe Phe Thr Asp Ala Tyr Asp Val Glu Val Pro Pro Thr Asp 1410 1415 1420 Thr Ala Ala Leu Ala Ala Val Val Asp Ala Ala Gly Thr Pro Glu Ala 1425 1430 1435 1440 Glu Ile Ala Arg Tyr Gly Arg Ile Asp Ala Arg Val Phe Thr Arg Glu 1445 1450 1455 Leu Ala Ala Ala Arg Ser Val Leu Ala Asp Ala Gly Ala Thr Gln Ala 1460 1465 1470 Gln Ala Asp Glu Arg Ala Arg Arg Leu Gly Leu Ala Thr Asp Gln Leu 1475 1480 1485 Val Pro Ala Glu Arg Arg Arg Leu Glu Asn Leu Val Ala Ser Ala Glu 1490 1495 1500 Ala Leu Thr Asp Glu Gly Tyr Ser Pro Glu Ser Trp Gln Ala Phe Arg 1505 1510 1515 1520 Thr Ala Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu Asp Asp Ala Ala Ala Ser 1525 1530 1535 Asp Glu Ala Leu His Asp Ala Arg Leu Ala Leu Gln Gly Ala Val Asp 1540 1545 1550 Ala Leu Glu Glu Pro Ala Asp Val Val Leu Val Glu Val Glu Val Ser 1555 1560 1565 Pro Arg Cys Leu Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ala Val Arg Ala Val Asn 1570 1575 1580 Val Ser Asp Ala Ala Val Asp Val Glu Leu Ala Ser Ser Leu Gly Thr 1585 1590 1595 1600 Arg Ser Phe Val Gly Val Ala Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gln Ser Phe 1605 1610 1615 Ala Ala Arg Ser Ala Thr Gly Asp Leu Asp Val Thr Val Thr Ala Thr 1620 1625 1630 Gly Ala Asp Gly Thr Gln Thr Val Glu Gln Val Val Thr Val Pro Ser 1635 1640 1645 Cys Ser 1650 <210> 51 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Thr, or Cys <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Thr, or Cys <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Thr, or Cys <400> 51 Val Arg Xaa Glu 1 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Any amino acid except Pro <400> 52 Val Arg Xaa Glu 1 <210> 53 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa = Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr, or Met <400> 53 Val Arg Xaa Glu 1 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa = Any amino acid except Pro <400> 54 Gly Asp Xaa Gly Asn 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa = Gly, Ser, Thr, Val, Ala, Cys, or Gln <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa = Gly, Ser, Thr, Val, Ala, Cys, or Gln <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa = Gly, Ser, Thr, Val, Ala, Cys, or Gln <400> 55 Gly Val Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gly Gly 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 6xHis tag <400> 56 His His His His His His 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 57 Leu Tyr Gln Gly Thr 1 5 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 58 Asp Glu Val Asp 1

Claims (84)

  1. 올리고당(oligosaccharide)에서의 만노스-6-인산 잔기(mannose-6-phosphate residue)의 캡핑제거(uncapping) 방법으로서, 상기 방법은
    a) 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기(mannose-1-phospho-6-mannose residue)를 갖는 올리고당을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해시킬 수 있는 만노시다제(mannosidase)와 상기 올리고당을 접촉시키는 단계로서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92(glycosyl hydrolase family 92)의 멤버(member)이고, 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않으며, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 단계를 포함하는, 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 만노시다제는, SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 98% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 만노시다제는 하기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법:
    (ⅰ) GVGXXGXGG 모티프(motif)(이 식에서, X 는 Gly, Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 이다);
    (ⅱ) VRXE 모티프(이 식에서, X 는 Pro 외의 모든 아미노산이다);
    (ⅲ) X1YQGX2 모티프(이 식에서, X1 은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr 또는 Met 이고, X2 은 Thr, Ser, 또는 Asn 이다); 또는
    (ⅳ) GDXGN(이 식에서, X 는 Pro 외의 임의의 아미노산일 수 있다).
  14. 제1항, 제12 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉 단계(contacting step)는 정제된 만노시다제(purified mannosidase), 재조합 만노시다제(recombinant mannosidase), 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 세포 용해액(cell lysate), 또는 상기 재조합 만노시다제를 포함하는 균류 세포(fungal cell)를 사용하여 실행하는 방법.
  15. 제1항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고당은 단백질에 부착된(attached) 것인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 단백질은 균류 유기체(fungal organism)에서 발현된 인간 단백질(human protein)인 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 균류 유기체는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans)인 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 균류 유기체는 메탄올자화효모(methylotrophic yeast)인 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 메탄올자화효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 균류 유기체는 사상 균류(filamentous fungus)인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 사상 균류는 아스페르길루스 카에시엘루스(Aspergillus caesiellus), 아스페르길루스 칸디두스(Aspergillus candidus), 아스페르길루스 카르네우스(Aspergillus carneus), 아스페르길루스 클라바투수(Aspergillus clavatus), 아스페르길루스 데플렉투스(Aspergillus deflectus), 아스페르길루스 플래브스(Aspergillus flavus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigates), 아스페르길루스 글라우크스(Aspergillus glaucus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스페르길루스 오라자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 파라시티커스(Aspergillus parasiticus), 아스페르길루스 페니실로이데스(Aspergillus penicilloides), 아스페르길루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus), 아스페르길루스 소예(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 시도위(Aspergillus sydowi), 아스페르길루스 타마리(Aspergillus tamari), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 우스투스(Aspergillus ustus), 및 아스페르길루스 베르시컬러(Aspergillus versicolor)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소(lysosomal enzyme)인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 리소좀 효소는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder, LSD)과 관련된 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 LSD 는 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
    Figure 112018109662018-pat00118
    )을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 LSD 는 폼피병(Pompe disease) 또는 파브리병(Fabry's disease)인 방법.
  27. 제1항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 만노시다제는 타겟팅 서열(targeting sequence)을 포함하는 방법.
  28. 캡핑이 제거된(uncapped) 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질(target protein)을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는(encoding) 핵산을 포함하고 발현되도록(express) 유전적으로 조작된 균류 세포를 제공하는 단계로서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이고, 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않으며, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 단계; 및
    타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 상기 세포 내로 도입하는(introducing) 단계로서, 상기 세포는 상기 타겟 단백질을 생산하고, 타겟 단백질 상의 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기는 세포에서 발현된 상기 발현된 만노시다제에 의해 포스포-6-만노스 잔기로 전환된 것인, 단계;를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 만노시다제는 제12항 또는 제13항에 기재된 것인, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 균류 세포는 OCH1[외부 사슬 연장(Outer Chain elongation)] 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된 것인, 방법.
  32. 제28항에 있어서, 상기 만노시다제는 C. 셀룰란스(C. cellulans) 만노시다제인, 방법.
  33. 다음의 단계를 포함하는, 균류 유기체에서 캡핑이 제거된(uncapped) 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 타겟 단백질을 생산하는 방법:
    a) 만노스-1-포스포-6-만노스를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고 발현되도록 유전적으로 조작된 균류 세포를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이고 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않으며, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않으며, 상기 균류 세포는 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는데, 이때 상기 타겟 단백질 상의 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기는 세포에서 발현된 상기 발현된 만노시다제에 의해 포스포-6-만노스 잔기로 전환되어 있는 것인, 단계; 및
    b) 상기 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 갖는 상기 타겟 단백질을 분리하는 단계.
  34. 제33항에 있어서, 상기 만노시다제는 제12항 또는 제13항에 기재된 것인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 타겟 단백질과 만노시다제는 상기 세포에 의해 분비되는 것인, 방법.
  36. 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질(glycoproteins)을 생산하도록 유전적으로 조작된 분리된 균류 세포(isolated fungal cell)로서, 상기 균류 세포는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 상기 균류 세포에서의 상기 만노시다제의 발현(expression)은 상기 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 결과적으로 생산하고, 여기서 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이고 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않으며, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 분리된 균류 세포.
  37. 제36항에 있어서, 상기 만노시다제는 제12항 또는 제13항에 기재된 것과 같은 것인, 분리된 균류 세포.
  38. 제36항에 있어서, 상기 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는, 분리된 균류 세포.
  39. 제36항에 있어서, 상기 균류 세포는 OCH1[외부 사슬 연장(Outer CHain elongation)] 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된, 분리된 균류 세포.
  40. 제36항에 있어서, 상기 균류 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하고, 여기서 상기 균류 세포는 OCH1 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된, 분리된 균류 세포.
  41. 제36항에 있어서,
    상기 균류 세포는 당단백질인 타겟 단백질을 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는, 분리된 균류 세포.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 타겟 단백질은 인간 단백질인, 분리된 균류 세포.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 타겟 단백질은 병원체 단백질(pathogen protein), 리소좀 단백질(lysosomal protein), 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 항체 또는 이의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment), 또는 융합 단백질(fusion protein)인, 분리된 균류 세포.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 리소좀 단백질은 리소좀 효소인, 분리된 균류 세포.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 리소좀 효소는 산성의 알파 글루코시다아제(acid alpha glucosidase) 또는 알파 갈락토시다아제(alpha galactosidase)인, 분리된 균류 세포.
  46. 제41항에 있어서,
    상기 타겟 단백질은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disorder, LSD)과 관련된 단백질인, 분리된 균류 세포.
  47. 제46항에 있어서,
    상기 LSD 는 파브리병(Fabry's disease), 점액다당류증 Ⅰ(mucopolysaccharidosis I), 파버 질병(Farber disease), 고셰병(Gaucher disease), GM1-강글리오시드증(GM1-gangliosidosis), 테이-샥스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성제 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 샤이에 질병(Scheie disease), 헌터 질병(Hunter disease), 산필립포 질병(Sanfilippo disease), 모르키오병(Morquio disease), 마로토-라미 질병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다아제 결핍증 (hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코스아민뇨증 (aspartylglucosaminuria), 푸코시드축적증(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러 병(Schindler disease), 사이알산축적증 유형 1(sialidosis type 1), 폼피병(Pompe disease), 피크노디소토시스(Pycnodysostosis), 세로이드 리포푸신증(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 축적 질병(cholesterol ester storage disease), 월만병(Wolman disease), 다종 술파타아제 결손증(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 뮤코리피드증(mucolipidosis), 시스틴축적증(cystinosis), 시알산 축적 질병(sialic acid storage disorder), 마리네스코-쉐글렌 증후군(
    Figure 112018109662018-pat00119
    )을 갖는 킬로미크론 보유 질병(chylomicron retention disease), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디아크-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease), 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)인, 분리된 균류 세포.
  48. 제36항에 있어서, 상기 균류 세포(fungal cell)는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 세포인, 분리된 균류 세포.
  49. 제38항에 있어서, 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 상기 폴리펩티드는 MNN4 폴리펩티드인, 분리된 균류 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 MNN4 폴리펩티드는 야로위아 리폴리티카, S.세레비시아(S. cerevisiae), 오가테아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 C. 알비칸스(C. albicans) 폴리펩티드인, 분리된 균류 세포.
  51. 제38항에 있어서, 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 상기 폴리펩티드는 P. 파스토리스 PN01 폴리펩티드인, 분리된 균류 세포.
  52. 제36항에 있어서, 상기 만노시다제는 C. 셀룰란스(C. cellulans) 만노시다제인, 분리된 균류 세포.
  53. 제36항에 있어서, 상기 만노시다제는 분비 신호(secretion signal)를 포함하는, 분리된 균류 세포.
  54. 제36항에 있어서, 상기 만노시다제는 세포내 구간(intracellular compartment)에 상기 만노시다제를 타겟하기 위한(target) 타겟팅 신호(targeting signal)를 포함하는, 분리된 균류 세포.
  55. 제36항에 있어서, 상기 만노시다제는 분비 신호 및 세포내 구간에 상기 만노시다제를 타겟하기 위한 타겟팅 신호를 포함하는, 분리된 균류 세포.
  56. 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 피치아 메탄올리카(Pichia methanolica), 오가테아 미뉴타(Oogataea minuta), 또는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 세포의 실질적인 순수 배양물(pure culture)로서, 이들 중 상당수는 캡핑이 제거된 포스포-6-만노스 잔기를 포함하는 당단백질을 생산하도록 유전적으로 조작되고, 상기 세포는 만노스-1-포스포-6-만노스를 포스포-6-만노스로 가수분해시킬 수 있는 만노시다제를 코드화하는 핵산을 포함하고, 여기서 상기 만노시다제는 글리코실 히드롤라제 패밀리 92의 멤버이고 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않으며, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 단, 상기 만노시다제는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 배양물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 만노시다제는 제12항 또는 제13항에 기재된 바와 같은 것인, 배양물.
  58. 제56항에 있어서, 상기 세포는 만노실 인산화반응을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산을 추가적으로 포함하는 배양물.
  59. 제56항에 있어서, 상기 세포는 OCH1 활성도가 결핍되도록 유전적으로 조작된 배양물.
  60. 삭제
  61. SEQ ID NO: 50 또는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 만노스-1-포스포-6-만노스 잔기를 포스포-6-만노스로 가수분해할 수 있고, 아노머 산소에 양성자를 가할 수 있는 촉매산 잔기를 함유하지 않는 것이며, 단 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 을 포함하지는 않는 것인, 폴리펩티드.
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 제61항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50 과 적어도 98% 동일성(identity)을 갖는 것인, 폴리펩티드.
  66. 제61항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50을 포함하고, 추가로 SEQ ID NO: 50 의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO: 50의 N-말단에 SEQ ID NO: 15 의 잔기 1 내지 15를 포함하는 것인, 폴리펩티드.
  67. 제61항, 제65항 및 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드:
    (ⅰ) GVGXXGXGG 모티프(motif)(이 식에서, X 는 Gly, Ala, Ser, Thr, 또는 Cys 이다);
    (ⅱ) VRXE 모티프(이 식에서, X 는 Pro 외의 모든 아미노산이다);
    (ⅲ) X1YQGX2 모티프(이 식에서, X1 은 Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr 또는 Met 이고, X2 은 Thr, Ser, 또는 Asn 이다); 또는
    (ⅳ) GDXGN(이 식에서, X 는 Pro 외의 임의의 아미노산일 수 있다).
  68. 핵산으로서, 상기 핵산은,
    (a) 제61항, 제65항 및 제66항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (b) (a)에 기재된 뉴클레오티드 서열의 상보체(complement of the nucleotide sequence)를 포함하고, 단, 상기 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:50의 잔기 1 내지 774 또는 SEQ ID NO:50 을 코드화하지는 않는 것인, 핵산.
  69. 제68항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터로서, 상기 핵산은 (a)에 기재된 것을 포함하는, 발현 벡터.
  70. 제69항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  71. 제70항의 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
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  76. 삭제
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