TWI243853B - Glucuronofucan sulfate - Google Patents

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1243853 A7 B7 五、發明説明（1 ) 技術範疇 本發明係關於一種可被用於生產能將褐藻類所含多種硫 酸化多糖分解之酵素之新穎微生物，於糖鏈工學範疇中可 被用於分解硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之酵素，該酵素之 製造方法，使該酵素活性化之各種因子，可做爲糖鏈工學 用試藥之脱乙醯化且脱葡糖醛酸化之硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，以及彼等之製造 方法。 背景技術 褐藻類中含有各種硫酸化多糖。舉例而言，已知有①只 由岩藻糖與硫酸基形成之硫酸化岩藻糖、②含有葡糖醛 酸、甘露糖、岩藻糖及硫酸基之硫酸化葡糖醛酸化岩藻甘 露聚糖，例如W097/26896公報中記載之含有岩藻糖硫酸之 多糖-U(構成糖及其莫耳比爲岩藻糖··甘露糖··半乳糖： 葡糖醛酸：硫酸基=約1 0 ·_ 7 : 4 : 5 ·· 2 0，以下稱爲U -岩 藻依聚糖（fucoidan))、③從岩藻糖及半乳糖形成之硫酸化 岩藻半乳聚糖，例如PCT/JP00/00965號説明書中記載之硫 酸化岩藻半乳聚糖（構成糖及其莫耳比爲岩藻糖··半乳糖 =1 : 1〜6，以下稱爲G-岩藻依聚糖）等之含有硫酸化岩藻 糖之多糖。 此等多糖總稱爲岩藻依聚糖或岩藻多糖，其構造多隨著 其來源之海藻而異。例如，已知從海芭麻塔藻、眞昆布、 沖繩海蘊藻、海蘊藻或裙帶菜雌株分別萃取之硫酸化多糖 具有不同之構造。更且，此等含有硫酸化岩藻糖之多糖， -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A7 B7 1243853 五、發明説明（3 ) 因此，期望使用已鑑定出之單離菌生產硫酸化多糖分解 酵素，或從一種菌株生產若干種硫酸化多糖分解酵素。 再者，最近在關於沖繩海蘊藻之硫酸化多糖研究中，報 導該多糖會抑制引起胃潰瘍之微生物幽門螺旋桿菌在胃黏 膜之定著，該多糖與纖維芽細胞增殖因子之複合體可做爲 纖維芽細胞增殖促進劑，以及口服該多糖可預防細菌及病 毒等引起之感染症等。因此，關於沖繩海蘊藻之生理活性 及有關從沖繩海蘊藻而來硫酸化多糖之化學結構正在研究 中。例如，對於該多糖有2個報告，一個爲Glycoconjugate Journal，第16卷，19-26頁（1999)中記載之硫酸化葡糖趁 酸化岩藻聚糖，其中岩藻糖：葡糖趁酸：硫酸基：乙酿基 之莫耳比爲6.1 : 1.0 : 2.9 : 1，分子量爲約56,000 ;另一 個爲應用糖質科學第43卷，143 - 148頁（1996)中記载之硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，其中岩藻糖··葡糖醛酸：木 糖：硫酸基：乙醯基之莫耳比爲3〜4 : 〇.8〜1.2 : 0·1〜0.3 : 0.8〜1.2 ·· 0.5〜1，分子量爲約50萬〜60萬。然 而，藉由當今之物理化學分析，只不過判定其之平均構 造〇 再者’爲了醫藥品之開發，必須得到能保持構造均一之 寡聚糖，但要從來自例如沖繩海蘊藻之硫酸化多糖獲得構 造保持均一之寡聚糖甚爲困難。 由於以上所述，所以亟求能分解來自多種褐藻類之硫酸 化多糖之微生物，特異性分解來自沖繩海蘊藻之硫酸化多 糖（亦即硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖）之酵素，以及以酵素 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明 化葡糖醛酸化岩藻聚糖及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖， 而將乙醯基加水分解，使醋酸游離，其之最佳p Η爲約 6〜9.1之範圍，最佳溫度在約2 3〜4 5 之範圍内。 本發明之第2發明，係關於一種“ _ d -葡糖嘗酸酶，其特 徵爲具有下列物理化學性質：該酵素作用於脱乙醯化硫酸 化葡糖酸化岩藻聚糖及脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 暴聚糖’而將α-D -葡糖膝酸基鍵結加水分解，使d -葡糖 搭酸游離’其之最佳pH爲約5·8〜7 8之範圍，最佳溫度在 約1 4〜2 9 °C之範圍。 本發明之第3發明，係關於一種内_ q _ L _岩藻糖答酶，其 特徵爲具有下列物理化學性質。該酵素作用於脫乙醯化硫 酸化葡糖遂酸化岩藻聚糖及脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩 溧暴聚糖’而將α-L -岩藻糖基内向式加水分解，生成在 還原性末端具有L-岩藻糖之寡聚糖，其之最佳pH爲約 4.5〜7.5之範圍，最佳溫度在約23〜4 2 t之範圍内。 本發明之第1〜第3發明中，岩藻依聚糖脱乙醯酶、a-D-葡糖苷酸酶及内- α- L-岩藻糖甞酶，可藉由培養具有該酵 素生產能力之微生物，再從其培養物取得該酵素而製造。 本發明之第4發明，係關於脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖之製造方法，其特徵爲使本發明第1發明之岩藻依 聚糖脱乙醯酶作用於硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，以取得 除去至少1分子以上乙醯基之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖。 在本發明之第4發明中，脱乙醯化可在氯化鈉、鈣鹽及/ -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

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1243853 A7 B7 五、發明説明（6 ) 或蛋白質共存下進行。 本發明之第5發明，係關於一種脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖或其鹽，其係藉由本發明第4發明之方法得 到0 本發明之第6發明，係關於一種脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之製造方法，其特徵爲使本發明 第2發明之a - D -葡糖苷酸酶作用於脱乙醯化硫酸化葡糖醛 酸化岩、藻聚糖，以取得除去至少1分子以上葡糖酸酸殘基 之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 在本發明之第6發明中，脱葡糖醛酸化可在氯化鈉、鈣鹽 及/或蛋白質共存下進行。 本發明之第7發明，係關於一種脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖或其鹽，其係藉由本發明第6發 明之方法得到。 本發明之第8發明，係關於一種硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡 聚糖之製造方法，其特徵爲使岩藻依聚糖脱乙醯酶、泛-D -葡糖甞酸酶、及内-a - L -岩藻糖茹酶作用於硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖而取得硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。在 此場合，可使岩藻依聚糖脱乙醯酶、π-D -葡糖甞酸酶及 内- 岩藻糖甞酶同時作用，亦可將岩藻依聚糖脱乙醯 酶、a - D -葡糖甞酸酶及内-a - L -岩藻糖茹酶依順序作 用。 本發明之第9發明，係關於一種硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡 聚糖之製造方法，其特徵爲使π-D -葡糖甞酸酶及内- α- -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐)

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1243853 A7 _____ B7_______ 五、發明説明（7 ) L -岩藻糖苷酶作用於經鹼處理之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖而取得硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。在該場 合’可使a _D -葡糖甞酸酶及内-a - L-岩藻糖甞酶同時作 用’再者，亦可使α-D -葡糖甞酸酶作用後，再使内-以-L -石藻糖菩酶作用。 在本發明之第8及第9發明中，可在氯化鈉、鈣鹽及/或蛋 白質共存下進行。 本發明之第1 〇發明，係關於一種硫酸化葡糖醛酸化岩藥 寡聚糖或其鹽，其係藉由本發明第8〜第9發明之方法得 到。 本發明之第1 1發明，係關於一種具有從下列通式（I)〜 (111)選出之化學結構之糖化合物··

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-10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210X297公f) 1243853 A7 B7 五、發明説明（8 )

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（

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2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝· •訂· 1243853 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（11 ) (式中，R爲Η，S03H或CH3CO ;以及η爲0以上之整數）。 本發明之第1 2發明，係關於一種硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖或其鹽，其特徵爲具有下列物理化學性質：該硫酸化 多糖含有作爲構成糖之岩藻糖及葡糖醛酸，其莫耳比爲 3 5〜44 : 1 0，例如以下列通式（VIII)表示之硫酸化糖做爲 構成糖之必需成分者： -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（12

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（14 ) 圖7表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖i _ (工）之1 H_NMR光譜圖。 圖8表示藉本發明得到之硫酸化葡糖路酸化岩藻寡聚糖i _ (1)之13C-NMR光譜圖。 圖9表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖i _ (1 )之質量分析光譜（質譜）圖。 圖1 0表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1 _(2)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖1 1表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 iO)之1 H_NMR光譜圖。 圖1 2表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1-(3)之 I3c-NMR 光譜圖。 圖1 3表示藉本發明得到之硫酸化葡糖趁酸化岩藻寡聚糖 1 一（3)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖1 4表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1-(4)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖1 5表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1-（5)之1H-NMR光譜圖。 圖1 6表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1-(5)之13〇NMR光譜圖。 圖1 7表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 h(5)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖1 8表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1_(6)之質量分析光譜（質譜）圖。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（15 ) 圖1 9表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1-(7)之1 H-NMR光譜圖。 圖2 0表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 1- (7)之 13C_NMR 光譜圖。 圖2 1表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 ^(7)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖2 2表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 ^(8)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖2 3表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 2- (3)之1H-NMR光譜圖。 圖2 4表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 2-(3)之 13C-NMR 光譜圖。 圖2 5表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 2-(3)之質量分析光譜（質譜）圖。 圖2 6表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 2-(5)之1H-NMR光譜圖。 圖2 7表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 2- (5)之 13C-NMR 光譜圖。 圖2 8表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖低 分子化物，即寡聚糖2-(5)，之質量分析光譜（質譜）圖。 圖2 9表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 3- (3)之1H-NMR光譜圖。 圖3 0表示藉本發明得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 J - (J )之 C-NMR光譜圖。 -18- 本紙張尺度適財S國冢標準(CNS) A4規格(；297公爱)

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之細菌 以下所列 其細菌學上之性質如 a .形態上之性質 本菌爲直徑1.2〜1.6 # m之球菌 孢子之有無··無 革蘭氏染色性：陰性 b ·生理上之性質 (1)繁殖溫度··在25°C繁殖 (2 )對氧氣之喜好度：好氣性 (3 )觸酶：陽性 (4 )氧化酶：陰性 (5 )鹽類需要性： 於〇%食鹽培養基之繁殖：陰性 於1%食鹽培養基之繁殖：陰性 於海水培養基之繁殖：陽性 (6 ) g昆系：甲基莕g晃7 (7)菌體内DNA之GC含量·· 52% (8 ) 〇 F測試··不生成酸 (9) 群落之色調：不生成具特徵之群落色素 (10) 運動性：陰性 ' (1 1 )滑走性：陰性 (12)鞭毛：無 本菌株若根據伯捷氏鑑定細菌學手册（Bergey,s Manuai 〇f

Determinatlve Bacteri。丨〇gy)第9卷Π"4)記載之基本分類 法’可被歸類爲第4類（格蘭氏陰性好氣性捍菌及菌）。然而 -21 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1243853 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（22 ) (式中，R爲 Η，S03H 或 CH3CO)。 再者，上述硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之分子量、糖組 成及硫酸基含量，隨者該硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖原料 之收穫期、該原料之乾燥方法、該原料之保存方法、硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖萃取時之加熱條件、或p Η條件等而 不同。例如有硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖被酸加水分解之 情況。因此，本説明書中記載之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖之分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基含量，不過爲 其之一例，依據該硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之萃取處理 條件，可輕易地使其分子量、分子量分布、糖組成或硫酸 基含量改變。舉例而言，若藉由pH6.0、95°C、2小時之萃 取方法從沖繩海蘊藻萃取，可得到顯示上述分子量與糖組 成之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。亦即，藉由調節調製時 之諸條件，可調製出任意分子量、分子量分布、糖組成或 硫酸基含量之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。例如，上述硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之主要構成糖，雖平均每4個岩 藻糖大約含有2個硫酸基之殘基，但一般而言於糖上進行 酯結合之硫酸基化學性不安定，容易因酸、鹼或熱而被切 斷。舉例而言，若在酸性或鹼性條件下進行加熱處理，其 硫酸含量或乙醯基含量將減少。亦即，意圖對硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖進行脱硫酸或脱乙醯處理係可能的。再 者，脱硫酸或脱乙醯時，若調整酸與鹼之種類與濃度、加 熱處理時之溫度與時間，亦可調整切斷硫酸基及乙醯基之 量。雖無特別限定，但舉例而言，藉由約0.5〜1 N氫氧化鈉 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（23 ) 溶液於2 5 °C處理2 4小時得到之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖適合做爲本發明之α-D -葡糖甞酸酶或内- a- L-岩藻糖答酶之基質。 因此，本説明書中之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，包含 具備前述特徵之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，或者藉由本 發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解酵素而被低分子化 之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖等全部由褐藻類而來者。其 來源雖無特別限定，但例如沖繩海蘊藻、石海蘊藻、似粗 海蘊藻、粗海蘊藻等長松藻科之褐藻類，因硫酸化葡糖醛 酸化岩藻聚糖含量多，所以特別適合作爲原料。 例如來自沖繩海蘊藻之硫酸化多糖，由於其主鏈係由對 酸抗性比一般糖弱之L -岩藻糖形成，所以藉由p Η 3.0及 0.2Ν等鹽酸萃取時，被認爲會引起硫酸化多糖之低分子 化。亦即，來自沖繩海蘊藻之硫酸化多糖，與其他以硫酸 化L_岩藻糖爲主要構成糖之多糖一樣，藉由加熱或酸處理 可容易地被低分子化。 本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖於分子中具有硫酸 基及/或羧基，該基可與各種鹼反應而形成鹽。本發明之硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖形成之鹽狀態安定，通常以鈉及/ 或鉀及/或鈣等鹽之形態被提供。此等物質之鹽，可利用陶 外克斯（Dowex)50W等陽離子交換樹脂，而導入游離之本 發明硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖中。再者，彼等視需要可 進行公知之鹽交換法，以變換成各種所期望之鹽。 本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之鹽，可使用醫藥 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（24 ) 上容許之鹽，例如鈉及钾等驗金屬、|弓、鎂及鋅等驗土金 屬及銨等鹽。 製造本發明所使用之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖時，首 先取得褐藻類之水溶性溶份萃取液。此時，爲防止硫酸化 葡糖路酸化岩藻聚糖之低分子化，以使用pH4〜9、溫度 100 °C以下得到之水溶性溶份萃取液爲較佳。再者，上述 萃取液中胺基酸及低分子性色素等，可藉由超遽法有效地 除去。再者，在疏水性物質之除去上，活性碳處理等亦有 效。依此種方式，可得到來自褐藻類之硫酸化多糖溶份。 又，將該溶份若藉由陰離子交換管柱分離，將可得到純度 較高之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 藉由上述方法得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖顯示育 毛效果。因此，例如可做爲育毛劑之構成成分。 再者，上述方法得到之硫酸化多糖溶份或藉由陰離子交 換管柱精製之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，均可被用做本 發明之α-D -葡糖菩酸酶及内- a- L-岩藻糖芬酶之基質。 再者，可在本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、α-D -葡糖甞 酸酶、及内-a - L -岩藻糖甞酶精製時做爲測定活性用之基 質，或者亦可做爲製造脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖、脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖、 及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖時之原料。 本説明書中之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，意指從硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖生成之寡聚糖。雖然基本上包含 硫酸基、葡糖醛酸基、岩藻糖基、乙醯基，但亦有例如只 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（25 ) 由硫酸基與岩藻糖基形成之情況；來自硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖之情況，稱爲硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。 本發明中之岩藻依聚糖脱乙醯酶，係指可作用於硫酸化 葡糖醛酸化岩藻聚糖及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，而 將乙醯基加水分解，使醋酸游離之酵素。本發明岩藻依聚 糖脱乙醯酶之物理化學性質如以下所述。 (I) 作用：作用於硫酸化葡糖酸酸化岩藻聚糖及硫酸化葡 糖酸化岩藻寡聚糖等，而將乙醯基加水分解，使醋酸游 離。 (II) 最佳pH値：本酵素之最佳pH値在約6〜9.1之範圍内 (圖 1)。 亦即’圖1爲表示本酵素反應時p Η値與相對活性之關係 圖，其中縱軸表示相對活性（〇/〇)，以及橫軸表示pH値。 (III) 最佳溫度：本酵素之最佳溫度在約2 3〜4 5 t之範圍 内（圖2)。 亦即，圖2爲表示本酵素反應時溫度與相對活性之關係 圖’其中縱軸表示相對活性（％)，以及橫軸表示溫度 rc)。 (IV) 分子量：藉凝膠過濾測定時，爲約3萬〜5萬。 本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶之確認，藉由測定具有乙 醯基之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖及其還原性末端基以 螢光標識之化合物之分解活性而進行。藉由使用此等螢光 標識之寡聚糖可構築微量、高感度之活性測定系統。再 者，使岩蕩依聚糖脱乙酿酶作用於硫酸化葡糖駿酸化岩藻 -28-

1243853 五、發明説明（26 寡聚糖後，將反應生成物所 糖駿酸化岩讓寡聚糖分離乙醒化硫酸化葡 之量，或藉由進行反應生成醋酸量及-基 依聚糖脱乙酿酶之活性。本發明===可確認岩藥 ..,,、 心石/来依聚糖脱乙醯酶之 可用生產菌之無細胞萃取液或用藉由各種管柱層 析法精製後之酵素液加以測定。 :::施態樣中，本發明之脱乙酿酶可於氣化鋼及/或蛋 且右外耍 ^ ^ …_早獨或猎由二者組合均 睡 。首先’對氣化納加以説明，試藥之氣化納、食 二、母7 、人工海水等’只要含有氯化納，無論任何物質 句可使用。添加至本發明脱乙酿酶反應液之氣化納濃度以 ^•^河韻之範圍爲較佳^則囊〜咖福之範圍 更佳。 繼而，對於蛋白質加以説明，以使本發明之岩藻依聚糖 脱乙醯酶活性化爲目的而添加於反應液中之蛋白質，只要 既不會分解本發明之岩藻依聚糖脱乙酿酶，亦不會阻害其 反應’則任何蛋白質皆可。其中以使用牛血清白^白等爲 較佳。再者’舉例而言’亦可使用從本發明岩讓依聚糖分 解嗜岩藻菌SI- 1234菌株之菌體萃取而來之蛋白質。添加 於本發明石藻依聚糖脱乙酿酶反應液之蛋白質濃度以 0.001〜1 0毫克/毫升之範圍爲較佳，而以〇 〇1〜丨毫克/毫升 之範圍爲更佳。 本發明中之以-D •葡糖苷酸酶者，係指可作用於脱乙醯 化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖及脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸 -29 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 裝 訂 1243853 A7 ______ B7 五、發明説27—) ' ' ' 化岩藻寡聚糖等，而將葡糖醛酸與岩藻糖間之α-D-葡糖 酸酸基鍵結加水分解，使D -葡糖醛酸游離之酵素。本發明 a - D -葡糖荅酸酶之物理化學性質如以下所述。 (I) 作用··作用於脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖及 脱乙酿化硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖等，而將-葡 糖趁酸基鍵結加水分解，使D -葡糖醛酸游離。 (II) 最佳pH値：本酵素之最佳ρΗ値在約5.8〜7.8之範圍 内（圖3)。 亦即，圖3爲表示本酵素反應時ρ η與相對活性之關係 圖’其中縱軸表示相對活性（％ )，以及橫轴表示ρ Η値。 (III) 取佳溫度：本酵素之最佳溫度在约14〜29 °C之範圍 内（圖4)。 亦即，圖4爲表示本酵素反應時溫度與相對活性之關係 圖’其中縱軸表示相對活性（％)，以及橫軸表示溫度 (°C) 〇 " (IV) 分子量：藉由凝膠過濾測定時，爲約12萬〜18萬。 本發明之a - D-葡糖菩酸酶之確認，可藉由測定脱乙醯 化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之分解活性而進行。再者， 將硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖及其還原性末端基藉由2_ 胺基吡啶螢光標識之化合物亦可成爲本酵素之基質，且藉 由使用此等螢光標識寡聚糖，可構築微量、高感度之活性 測定系統。於硫酸化葡糖遂酸化岩藻寡聚糖使泛_D_葡糖 苷酸酶作用後，將反應生成物所含之葡糖醛酸及硫酸化葡 糖酸酸化石藻券聚糖分離，藉由分別測定總糖量及總糖趁 «30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1243853 A7 ______B7 五、發明説明（28一) " ~ - 酸量，且藉由進行反應生成物之質量分析，亦可確認“ · D_匍糖苷酸酶之活性。本發明之葡糖荅酸酶之活 亦可藉由生產菌之無細胞萃取液、或藉由各種管柱層 析法精製後之酵素液加以測定。 於一實施態樣中，本發明之從-D-葡糖苷酸酶可於氣化 鈉、鈣離子及/或蛋白質存在下活性化。此等因素無論單獨 或藉由兩種或三種組合均具有效果。首先，對於氣化鈉加 以說明，試藥之氣化鈉、食鹽、海水、人工海水等，只要 含有氣化鈉，無論任何物質均可使用。添加於本發明以· D-葡糖：y：酸酶之反應液中之氣化鈉濃度以〇^ mM〜iM之範 圍爲較佳，而以i mM〜600 mM之範圍爲更佳。 繼而，對於鈣離子加以説明，只要可使鈣離子產生，無 論任何物質均可使用。較佳之可溶性鈣鹽，可使用例如氯 化鈣及醋酸鈣等。再者，即使爲難溶性鈣鹽，例如碳酸 鈣、磷酸鈣、檸檬酸鈣及硫酸鈣等，在硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖等硫酸化多糖爲溶解狀態下，會慢慢地產生鈣離 子，因此可被用於本發明a - D _葡糖菩酸酶之活性化。再 者，在硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之硫酸基及羧基之平衡 離子含有鈣鹽之情況，由於基質成爲鈣離子之產生來源， 因此爲活性化而添加之鈣離子源可予以減少。視情況，縱 使不添加鈣鹽，本酵素亦可作用。添加於本發明π _D-葡 糖甞酸酶反應液中之鈣離子濃度以在0 i mM〜200 mM之範 圍内爲較佳’而以在1 mM〜100 mM之範圍内爲更佳。 繼而，對於蛋白質加以説明，在以使本發明之泛_D_葡 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853

發明説明（29 糖a酶活性化爲目的而於反應液中添 既不分解本發明“·D_葡糖甞酸酶 蛋白…、要 則任何蛋白質均可。其中以使用牛血清=其反應， 再者舉例而1，料使毅本發明 ^• 1234菌株之菌體萃取而來之 石 明--D-葡糖菩酸酶反應液中之：二、加於本發 戽古/古1、从 貝/辰度以在0.001〜10 毛克/笔升<範圍内爲較佳，而在 圍内爲更佳。 在0.01〜克/毫升之範 化：！:月中之内…L-岩藻糖菩酶，係指可作用於脱乙酿 乂匍搪.酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖及硫酸化葡糖 恥酸化石澡寡聚寿唐，而將-岩藻糖基鍵結以内向方式 加水分解，以使還原性末端具有[•岩藻糖之寡聚糖生成之 酵素:本發明之内…岩藻糖I酶，對天然之硫酸化葡 糖路酸化石藻I糖幾典作用，然而對於預先以岩藻依聚糖 脱乙醯酶及泛_D-葡糖茹酸酶處理之硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖，或對於與岩藻依聚糖脱乙醯酶及“ _D·葡糖答酸 酶共存下之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖則作用良好。不過 即使爲天然硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，若藉由來自例如 其他海洋細菌之酵素或物理或化學因素等任何理由使乙醯 基及葡糖趁酸基除去，則適合做爲本發明内-岩藻糖 苷酶之基質。 本發明之内-以-L -岩蕩糖芬酶之物理化學性質如以下所 述0 (I)作用：作用於脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 ___B7 五、發明説明（3Q"")^ " 化石藻聚糖及硯酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖等作用，而將 以-L-岩藻糖基鍵結内向方式加水分解，以使還原性末端 具有L-岩藻糖之寡聚糖生成。 (II) 最佳pH値：本酵素之最佳pH値在約4 5〜7 4之範圍 内（圖5)。 亦即，圖5爲表示本酵素反應時pH値與相對活性之關係 圖，其中縱軸表示相對活性（％)，以及橫軸表示pH値。 (III) 最佳溫度：本酵素之最佳溫度在約23〜42Ό之範圍 内（圖6 )。 亦即，圖6爲表示本酵素反應時溫度與相對活性之關係 圖，其中縱軸表示相對活性（％)，以及橫軸表示溫度 (。。）。 (iv)分子量··藉由凝膠過濾測定時，爲約15萬〜2〇萬。 本發明之内-以-L-岩藻糖甞酶之確認，可藉由測定脱乙 酿化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之分解活性 而進行。再者，將硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖以本發明 之以-D·岩藻糖答酶處理而得到之寡聚糖且其還原末端用 2 -胺基ρ比淀勞光標識之化合物亦可做爲本酵素之基質，以 及藉由使用此等螢光標識之寡聚糖可構築微量、高感度之 活性測定系統。舉例而言，將8Fuc-4S-PA (下述）用於基質 使其反應後’若將反應生成物以HPLC分析，可測定内·以· L _岩藻糖苷酶之活性。本發明之内-以-L _岩藻糖嘗酶之活 性，亦可用生產菌之無細胞萃取液，或用各種管柱層析法 精製後之酵素液來進行測定。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 ____B7 五、發明説明（31 ) 於一實施態樣中，本發明之内_ L -岩藻糖甞酶可於氯 化鈉、鈣離子及/或蛋白質存在下活性化。此等因子無論單 獨或藉由兩種或三種組合均具有活性化作用。首先，對於 ，化鈉加以説明，試藥之氣化鈉、食鹽、海水及人工海水 等八要含有氣化鈉，無論任何物質均可使用。添加於本 發明内-從-L-岩藻糖苷酶反應液中之氯化鈉濃度以在〇^ mM〜1 Μ〈範圍内爲較佳，而以在i mM〜6〇〇 mM之範圍内 爲更佳。 繼而，對於鈣離子加以説明，只要可使鈣離子產生，無 論1何物質均可使用。較佳之可溶性鈣鹽例如爲氣化鈣及 醋酸鈣等。再者，即使爲難溶性鈣鹽例如碳酸鈣、磷酸 鈣、檸檬酸鈣、硫酸鈣等，在硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 等之硫酸化多糖爲溶解狀態下，會慢慢地產生鈣離子，因 此可被用於本發明内_ “ · L -岩藻糖甞酶之活性化。再者， 硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之硫酸基及羧基之平衡離子含 有鈣鹽之情況，由於基質成爲鈣離子之產生來源，因此爲 活性化而添加之鈣離子源可予以減少。視情況，在不添加 約鹽下本酵素亦可作用。添加於本發明内-“-乙-岩藻糖菩 酶反應液中之鈣離子濃度以在〇1 〜2〇〇 之範圍内爲 較佳，而以在1 mM〜100 mM之範圍内爲更佳。 繼而，對於蛋白質加以敘述，以使本發明之内_ α 藻糖甞酶活性化爲目的而於反應液中添加之蛋白質，只要 既不分~本發明之内-沒-L-岩漠糖答酶，亦不抑制其反 應’任何蛋白質均可。其中以使用牛血清白蛋白等爲車六 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 _B7__ 五、發明説明（32 ) 佳。再者，舉例而言，亦可使用從本發明岩藻依聚糖分解 嗜岩藻菌SI- 1234菌株之菌體萃取而來之蛋白質。添加於 本發明内-a -L-岩藻糖苷酶反應液之蛋白質濃度以在 0.001〜10毫克/毫升之範圍内爲較佳，而以在〇.〇1〜1毫克/ 毫升之範圍内爲更佳。 在本發明中用於製造岩藻依聚糖脱乙醯酶、π-D -葡糖 甞酸酶及内- α- L·岩藻糖甞酶之微生物，只要爲能生產將 上述硫酸化多糖溶份或硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖低分子 化之酵素之微生物即可，並無特別限定，例如適合使用嗜 岩藻菌屬細菌。上述之嗜岩藻菌屬細菌，包含從細菌學性 質被分類爲同屬者或依據與16S rDNA之鹼基序列之相同性 而被分類爲同屬者之全部微生物，亦包含能生產，與本發 明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、以-D-葡糖甞酸酶及内- a- L-岩蕩糖#酶同樣，可將硫酸化葡糖趁酸化岩蕩聚糖分解之 酵素之全部微生物。 適合培養生產本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、π-D -葡 糖甞酸酶及内- π- L-岩藻糖甞酶之微生物而添加於培養基 中之營養源，只要能被使用之微生物利用，且於其存在下 可以生產該酵素即可；碳源，可利用例如硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖、沖繩海蘊藻等海藻，褐藻酸、昆布多糖、岩 藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油、蔗糖、麥芽糖及澱粉等； 適合作爲氮源者，例如爲酵母萃取液、蛋白腺、酶蛋白胺 基酸、玉米浸潰液、肉萃取液、脱脂大豆、硫酸銨、氯化 铵、尿素及尿酸等。亦可添加其他納、钾、鍰及#5等之氣 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（33 化物、磷酸鹽或硫酸鹽等。再者，該微生物之培養基可爲 海水或市售之人工海水培養基。 再者，培養條件及培養基組成，當然應根據所使用之微 生物而設定成能使本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、以_ D _ 匍糖甞酸酶及内-從-L -岩藻糖苷酶之生產量達到最大者。 例如，以培養溫度爲15〜3〇1，培養基之卩{^爲5〜9以及進 行5〜72小時之通氣攪拌培養爲較佳，在前述條件下，本發 明〈石藻依聚糖脱乙醯酶、a_D-葡糖甞酸酶及内以_l_ 岩漢糖㈣之生產量可達到最大。培養終了後，藉由離心 γ將菌體與培養上清液分開，從其中可分別得到本發明之 岩澡依聚糖脱乙酿酶U-葡糖苷酸酶及内_以彳_岩 糖苷酶。 雖無特別限定’但舉例而言’可藉由將本發明之岩藻依 聚糖分解嗜岩藻菌SI_ 1234菌株在適當之培養基中培養， 收集其菌體’然後藉習用之細胞破碎手段（例如超音波處理） 將菌體弄碎，可得到無細胞萃取液。繼而藉由習用之精製 手段:可從此萃取液中得到精製的酵素樣品。藉由鹽析、 離子人換&柱層析法、疏水管柱層析法及凝膠過遽等進 精製’可得到實質上不包含其他含硫酸化岩藻财糖之分 解酵素之純化本發明岩隸聚糖脱乙㈣、^D·葡 酸酶及内m藥㈣酶。再者’若使用將硫酸 趁酸化岩藻聚糖固定化之樹脂，可輕易地將本發明之： D-葡糖純酶與本發明之内·a_L•岩_麵分離。· 再者，上述之培養上清液中，由於亦存在本發明之岩藻 -36- 1243853 A7 _____B7 五、發明説明（35 ) 比從4 : 1至4 : 0之各種葡糖醛酸含量之脱乙醯化脱葡糖醛 酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 爲了獲得本發明脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖，使a - D -葡糖甞酸酶作用於脱乙醯化硫酸化 葡糖趁酸化岩藻聚糖，然後將游離之D -葡糖醛酸藉由例如 超遽法、凝膠過滤及陰離子交換管柱處理等除去即可。視 需要可進行脱鹽及凍結乾燥等處理。進行脱葡糖醛酸化處 理時，若預先將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖用岩藻依聚糖 脫乙酿酶處理及鹼處理以脱去乙醯，可使脱葡糖醛酸化有 效率地進行。 舉例而言，將來自沖繩海蘊藻之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖予以脱乙醯化得到之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖中’約每4分子岩藻糖有1分子D -葡糖趁酸，但藉由以 -D -葡糖:y：酸酶將D -葡糖醛酸除去，可調製成具各種葡糖 趁酸含量之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖。藉由調整脱葡糖醛酸反應所用之酵素量及基質量、 反應時間、反應溫度及P Η値等之條件，例如（但非限於此） 將適量之氣化鈉、牛血清白蛋白及500 mlJ之本發明α - D-葡糖荅酸酶混入1公克之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖中，並使其於20 °C及约ρΗ7下反應歷各種時間，可製 造出岩藻糖與葡糖遂酸之莫耳比爲4 : 1至4 : 0之具各種葡 糖遂酸含量之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖。 脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖雖可 -38· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（36 ) 以原樣做爲糖鏈工學用試藥，但除做爲本發明内-泛-L _岩 藻糖苷酶之基質而用於活性測定之外，爲其反應生成物之 本發明硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，亦可做爲糖鏈工學 用試藥。 當調製本發明之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖時，脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖或脱 乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖含有物之溶解，可藉通 常之方法進行，而溶解液中之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖或脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖含有物之 濃度，雖可爲其最高溶解濃度，但通常以考量其之操作性 及酵素活性値而選定爲較佳。作爲脱乙醯化硫酸化葡糖醛 酸化岩藻聚糖之溶解液者，可按照目的從水及緩衝液等中 選擇。溶解液之pH通常在中性附近，酵素反應通常在20°C 附近進行。藉由調整酵素量、反應液之組成及反應時間 等，可調整脱葡糖醛酸之程度。脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖，視需要可進一步進行離子交換 樹脂處理及超濾法等精製操作，視需要亦可進行脱鹽處 理、無菌處理及凍結乾燥處理。 本發明之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖於分子中具有硫酸基及/或羧基，該基與各種鹼反應形 成鹽。本發明之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖形成之鹽狀態安定，通常以鈉及/或鉀及/或鈣等 鹽之形態被提供。此等物質之鹽，可利用陶亦克斯（Dowex) 50W等陽離子交換樹脂，導入游離之本發明脱乙酸化脱葡 -39- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（37 ) 糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖中。再者，彼等視需 要可進行公知之鹽交換法，以變換成各種期望之鹽。 本發明之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖之鹽，可使用醫藥上容許之鹽，例如鈉及鉀等鹼金 屬、鈣、鎂及鋅等鹼土金屬及銨等之鹽。 本説明書中硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，係指藉由本 發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶作用於上述硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖，或者進行鹼處理以脱乙醯化後，以a - D -葡糖 甞酸酶及内-a - L -岩藻糖苷酶作用而得到之還原性末端糖 爲L -岩藻糖之寡聚糖。例如具有從下列通式（I)〜（111)選出 之化學構造之糖化合物，但.非僅限於此。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853 Α7 Β7 五、發明説明（ 38

(式中，R爲Η，S03H或CH3CO ; η爲0以上之整數）。 -41 -

本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（39

〇 X X

J (式中，R爲Η，S03H或CH3CO ; η爲0以上之整數) 〇 42

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1243853

五、發明説明（4Q (\ HH »—ί

X

〇 X π: (式中，R爲Η，S03H或CH3CO ; η爲0以上之整數） -43-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（41 ) 本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，可藉由使本發 明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、π-D -葡糖芬酸酶及内-a-L-岩藻糖甞酶作用於硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖或硫酸化葡 糖醛酸化岩藻聚糖含有物，而有效率地調製，亦可藉由使 本發明之π-D·葡糖甞酸酶及内- α- L-岩藻糖荅酶作用於 預先經過鹼處理等化學處理之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖而調製。作爲硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖含有物 者，適合使用例如硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之部份精製 品、來自褐'藻類之含岩藻糖之多糖成分、褐藻類之水性溶 劑萃取物或褐藻類藻體等。再者，使本發明之内- π- L-岩 藻糖苷酶作用於本發明之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡 糖醛酸化岩藻聚糖，當然亦可得到本發明之硫酸化葡糖醛 酸化岩藻寡聚糖。例如（但非限於此）藉由將來自沖繩海蘊 藻之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖予以脱乙醯化，然後以本 發明之a_D -葡糖甞酸酶及内- α- L-岩藻糖苷酶作用，可 得到具有從上述通式（I)〜（III)選出之化學構造之糖化合物 或其鹽。 當調製本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖時，硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖或硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖含有 物之溶解可藉通常之方法進行，而溶解液中之本發明硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖或該硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖含 有物之濃度雖可爲其最高溶解濃度，但通常以考慮其操作 性及本發明岩藻依聚糖脱乙醯酶、α-D -葡糖芸酸酶及内-沒-L -岩蕩糖嘗酶之量而選定爲較佳。作爲硫酸化葡糖路 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（42 酸化岩藥聚糖之溶解液者，可視目的而從水及緩衝液等中 選擇。溶解液之pH通常在中性附近，酵素反應通常在25 °C 附近進行。藉由調整反應中所使用之本發明岩藻依聚糖脱 乙酿酶、α-D·葡糖荅酸酶及内-泛-l•岩藻糖甞酶之配合 比率及使用量、反應液之組成及反應時間等，可調整硫酸 化葡糖路酸化岩藻寡聚糖之分子量及葡糖醛酸與乙醯基之 含量。硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖可藉由3種酵素，亦即 本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、a_D_葡糖棼酸酶及内-泛 -L-岩蕩糖苷酶而分解，然而此3種酵素之反應可同時進 行’亦可各別進行。亦即，預先將硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖藉由本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、江_;〇_葡糖甞酸 酶予以脱乙醯化及脱葡糖醛酸化，隨後藉由熱處理或酸或 驗處理等使本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶及α-D·葡糖嘗 酸酶失去活性後，以本發明之内岩藻糖苷酶作用， 則所生成之本發明硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖之分子量 分布及葡糖趁酸及乙醯基含量之調整將變得容易。 上述方式所得到之本發明硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚 糖，藉由分子量分劃或陰離子交換管柱分劃，可進一步調 製分子量更均一或均一電荷分布之本發明硫酸化葡糖醛酸 化岩蕩寡聚糖。分子量分劃適用通常被使用之方法，例如 可使用凝膠過濾或分子量分劃膜。低分子化物視需要可進 一步進行離子交換樹脂處理及活性碳處理等精製操作，視 需要亦可進一步進行脱鹽處理、無菌處理及凍結乾燥處理 等。藉由此等方法，可得到均一構造（以NMR分析決定構 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

装 訂

1243853 A7 B7 五、發明説明（43 ) 造）之本發明硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。 本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖於分子中具有硫 酸基及羧墓，該基與各種鹼反應可形成鹽。本發明之硫酸 化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖形成之鹽狀態安定，通常以鈉及/ 或鉀及/或鈣等鹽之形態被提供。此等物質之鹽，可利用陶 亦克斯（Dowex)50W等陽離子交換樹脂，導入游離之本發 明硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖中。再者，彼等視需要可 進行已知之鹽交換法，以變換成各種期望之鹽。 本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖之鹽，可使用醫 藥上容許之鹽，例如鈉及鉀等鹼金屬，鈣、鎂及鋅等鹼土 金屬以及銨等之鹽。 再者，本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖可做爲糖 鏈工學用試藥使用。舉例而言，若藉由特公平5-65108號 公報記載之方法進行2-胺基吡啶化（PA化），及調整該寡聚 糖之P A -化物，則可做爲本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、 以-D -葡糖甞酸酶及内-沒-L -岩藻糖苷酶之活性測定用基 質。依此方式，本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖在 做爲糖鏈工學用試藥上爲極有用之物質。 本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、α-D -葡糖甞酸酶及内-泛-L -岩藻糖甞酶，可被用於供硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖低分子化用之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之構造解析。 再者，由於本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、α-D -葡糖甞 酸酶及内-α-L-岩藻糖芬酶藉由反應液中有氣化納、蛋白 質及/或鈣離子共存，可提高安定性及反應速度，因而藉由 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 .ΛΛ 、 五、發明説明（ ） 此等硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解酵素活性化因子之共 存，可有效率地進行上述之低分子化。再者，本發明之硫 酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖、脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖及脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖可被用做糖鏈工學用試藥，亦可被用做本發明之岩藻 依聚糖脱乙醯酶、π-D -葡糖甞酸酶及内- a- L-岩藻糖甞 酶之活性測定用基質。 實例 以下，將藉由實施例具體地説明本發明，然而本發明不 只限定於以下之實施例範圍。 ’ 參考例1 (1 )粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份之調製 將市售之鹽腌沖繩海蘊藻625公克懸浮於4375毫升之30 mM磷酸鈉緩衝液（ρΗ6·0)中，藉由均質機進行8000迴轉/ 分鐘之5分鐘處理後，於9 5 °C處理1小時，藉由離心得到上 清液。於所得到之上清液中添加1 0公克之活性碳後攪摔3 0 分鐘，藉由離心得到上清液。將所得到之上清液藉由裝設 有排除分子量爲1 0萬之中空纖維之限外過濾機濃縮爲2公 升後，以20 mM氣化鈉置換溶媒，然後凍結乾燥，得到 10.9公克之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份之乾燥物。 (2 )硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性測定方法 以本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶、α - D -葡糖:y：酸酶及 内-a - L -岩藻糖甞酶單獨地對硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 作用雖無法效率良好地生成寡聚糖，然而藉由組合可將硫 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 1 45~ 五、發明説明（ ） 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解，效率良好地使其低分子 化。前述3種酵素共存下將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分 解之活性·，稱爲「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 性」，其可藉由下列之活性測定方法數値化。 亦即，將1 0微升之1 %粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份 溶液，52.5微升之50 mM咪唑鹽酸緩衝液（ρΗ6·6)，5·5微 升之4Μ氣化鈉，2微升之1Μ氣化鈣及10微升之5毫克/毫 升牛血清白蛋白與20微升共存有本發明岩藻依聚糖脱乙醯 酶、“ -d -葡糖:y：酸酶及内-α - L -岩藻糖茹酶之酵素液混 合，並於30°C反應3小時後，將反應液於l〇〇°C處理1 0分 鐘，離心後以9 0微升進行HPLC分析，以測定低分子化之 程度。做爲對照者，係將共存有本發明岩藻依聚糖脱乙醯 酶、a - D -葡糖苷酸酶及内-a - L -岩藻糖甞酶之酵素液用 溶解該酵素液之緩衝液代替進行反應，粗硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖部份係使用水代替進行反應，同樣地進行HPLC 分析。所謂1個單位之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 性係指上述反應系統中1分鐘内將1微莫耳硫酸化葡糖醛酸 化岩、藻聚糖之岩藻糖基鍵結切斷之酵素量。切斷之岩藻糖 基鍵結之量可藉由下列公式求得。 數學式1 {(ΙΟχΙΟΟΟχ l/100)/MG}x{(MG/M)-l}x{ 1/(180x0.02)} =U/ml 1 0 x 1000 x 1/ 100 ··反應系中所添加之粗硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖部份（微克） M G :基質粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之平均分子量 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（46 ) Μ:反應生成物之平均分子量 (MG/M)-1 : 1分子硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖藉由酵素 切斷之部位數 180 ··反應時間（分鐘） 0.02 :酵素液量（毫升） 再者，HPLC之條件如下述。 裝置：L-6200型（曰立製作所製） 管柱：OHpak SB-806HQ(8 X 300 mm，昭和電工公司製） 溶離液：含有5 mM疊氮化鈉之50 mM氯化鈉 檢涓J :視差曲折率檢測器（Shodex RI-71，昭和電工公司 製）

流速：1毫升/分鐘 管柱溫度：25°C 爲測定反應生成物之平均分子量，將市售已知分子量之 出芽短梗孢糖（Pullulan) (STANDARD P-82，昭和電工公司 製）藉由上述HPLC分析之相同條件分析，將出芽短梗孢糖 之分子量與保持時間之關係以曲線表示，做爲供上述反應 生成物之分子量測定用之標準曲線。再者，蛋白質之定量 係藉由測定酵素液之280 nm吸光度而進行。此時係以1毫 克/毫升之蛋白質溶液之吸光度當作1.0計算。 實例1 將岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌SI - 1234菌株接種於培養基 上，該培養基係將含有以參考例1 ( 1)之方法調製之來自沖 繩海蘊藻粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份0.2 %及蛋白腺 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1243853 A7 B7 47 五、發明説明（ 1%之人工海水（ρΗ8·0)(加馬林拉勃拉翠公司製）組成之培 養基50毫升於120°C經20分鐘熱壓器處理而得。接種後， 於2 4 °C培養7 2小時做爲菌種培養液。將含有以參考例丨（^ ) 之方法調製之來自沖繩海蘊藻之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖部份0.2 %、蛋白腺1 %及消泡劑（KM70，信越化學工 業公司製）之人工海水所組成之PH8.0培養基600毫升加入2 公升之三角燒瓶中，於115。(：經10分鐘熱壓器處理而得培 養基，如此製備7瓶，將上述菌種培養液在每個三角燒瓶 接種5毫升，於每分鐘90迴轉之迴轉速度下，在24t培養 7 2小時。培養終了後，將培養液離心，得到菌體及培養上 清液。 裝 訂 將所得到之菌體懸浮於250毫升之含有1〇〇 mM氣化鈉及 10mM氣化鈣之i〇mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7〇)中，以超 音波破碎後’離心，得到上清液。將所得到之上清液藉由 相同之緩衝液充分透析，離心，將上清液做爲粗酵素液。 將所得到之粗酵素液饋入以相同緩衝液平衡化之3 00毫升 DEAE-赛璐玢A_800管柱中，用相同緩衝液洗淨後，用1〇〇 mM至400 mM之氣化鈉梯度溶析，收集活性溶出部份。以 此種方式得到部份精製酵素液。再者，測定被包含於上述 培養上清液與粗酵素液中之「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 刀解活性j ，結果可確認在任一者中均有活性，於菌體萃 取液中，每1毫升培養基檢測出〇 4 mlJ之活性。 實例2 (1 )使實例1記載之粗酵素液作用於參考例丨（丨）記載之粗 -50- 1243853 A7 _ B7 五、發明説明（48~Γ ' 硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份，以調製本發明之硫酸化 葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。亦即，將5公克之粗硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖部份溶解於1公升之含有25〇 氯化納及 20 mM氣化鈣之10 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH6.6)中後，添 加35 mU之實例1記載之粗酵素液，使其於3 〇 t反應6日。 將反應液離心，所得到之上清液使用裝設有排除分子量爲 1萬之中芝纖維之限外過遽機處理，回收分子量1萬以下之 寡聚糖部份，做爲硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚耱酵素消化物 部份1。 (2 )實例2 ( 1)所得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素消 化物部份1藉由脱鹽裝置（微阿西來札-G3，旭化成工業公 司製）脱鹽。於脱鹽之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素消化 物邵份1中，添加咪唑並使其濃度爲5 m Μ以及添加氣化鈉 並使其濃度爲20 mM，將該混合物饋入預先以含有20 mM 氣化鈉之5 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH 7· 0)平衡化之1公升 DEAE -赛璐玢A - 8 0 0管柱中，用相同緩衝液洗淨後，藉由 20 mM至600 mM之氣化鈉梯度溶析。被溶出之部份，其總 糖量藉由g分-硫酸法測定，總糖趁酸量藉由味峻-硫酸法測 定。其結果，溶出之部份中至少8個有明顯之尖峰存在， 將各個尖峰部份集合，做爲寡聚糖i _ (丨）〜（8 )，分別將其 藉由蒸發器濃縮爲40毫升後，饋入預先以1〇%乙醇平衡化 之赛路玲GCL-25管柱中，然後以10%乙醇溶析及脱鹽。 由此可得到本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1-(丨）〜 (8)，亦即寡聚糖1-(1)〜（8)。 -51 - 本紙張尺度適财g g家標準(CNS) A4規格(2脳297公爱) 1243853 A7 _____ B7 五、發明説明（49 ) (3)對於實例2(2)得到之寡聚糖卜（1)〜（8)，藉由使用2-胺基吨淀之螢光標識法進行還原末端糖及糖組成之分析， 再者’使用UFC測定試藥Takara(寶酒公司造）進行岩藻糖 絕對配置之決定時，發現寡聚糖1_(1)〜（8)之還原性末端 糖全邵爲L -岩藻糖。再者，關於糖組成，寡聚糖I·(丨）爲 只由岩藻糖形成，寡聚糖1-(2)〜（8)爲由岩藻糖與葡糖醛 酸所形成。繼而，測定硫酸含量（藉由使用氯化鋇之比濁法） 及糖路酸含量（藉由咔唑-硫酸法），且藉由質量分析裝置 (API-III，帕金艾瑪-赛克斯公司製）分析質量。再者，使 用JNM_ α500型核磁共振裝置（日本電子公司製）進行nmR 分析。將分析試料藉由固定方法以重水置換後進行構造解 析。構成糖之結合方式，係使用Η Μ B C法（一種1 Η -檢測異 種核檢測法）而進行。1H-NMR之歸屬係使用dqf-COSY法 及ΗΟΗΑΗΑ法，13C-NMR之歸屬係使用HSQC法。以下， 表示寡聚糖1-(1)〜（8)之物性。 (a)寡聚糖1-(1)之物性 質量分析及NMR分析之結果如以下所示，本發明之硫酸 化葡糖趁酸化岩藻寡聚糖1-(1)之- NMR光譜如圖7所 示’ 13 C- NMR光譜如圖8所示，質譜如圖9所示。圖7與圖 8中縱轴表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値（ppm)。再 者’圖9中縱軸表示相對強度（〇/〇)，橫軸表示m/z値。 分子量·· 762 MS m/z 380.2[M-2H + ]2· 藉由1Η-NMR及13C_NMR分析之結果如表！所示。 -52· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7

五、發明説明（5Q 表1 化學位移値(ppm) 13c-nmr 'HNMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 97.0 4.48, d, 7.6 F1-2 70.8 3.44, dd, 7.6, 10.1 F1-3 78.4 3.59, dd, 3.7, 10.1 F1-4 68.6 3.86, d, 3.7 F1-5 71.4 3.66, q, 6.8 F1-6 16.5 1.13, d, 6.8 F2-1 96.5 4.98, d，4.0 F2-2 67.5 3.85, dd，4.0, 10.4 F2-3 77.5 3.98, dd, 3.1, 10.4 F2-4 80.5 4.65, d, 3.1 F2-5 67.2 4.30, q，6.8 F2-6 16.5 1.13, d, 6.8 F3-1 99.9 4.99, d, 4.0 F3-2 68.0 3.72, dd, 4.0, 10.6 F3-3 76.1 3.90, dd，3.0, 10.6 F3-4 80.3 4.65, d, 3.0 F3-5 67.4 4.34, q, 6.7 F3-6 16.5 1.11, d, 6.7 F4-1 98.4 4.97, d, 4.0 F4-2 69.3 3.59, dd，4.0, 10.4 F4-3 70.8 3.76, dd, 3.4, 10.4 F4-4 72.8 3.68, d? 3.4 F4-5 68.0 4.21, q, 6.7 F4-6 16.0 1.09, d, 6.7 糖組成只有L -岩藻糖（4分子） -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 51 为 1 X Ο Ο

X 〔IV〕 A7 B7 五、發明説明（ 硫酸基2分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (IV)所示。 〇 -=

Sr

-54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

1243853 A7 B7 五、發明説明（52 ) (b)寡聚糖1-(2)之物性 質量分析之結果如以下所示，本發明之硫酸化葡糖醛酸 化岩藻寡聚糖1-(2)之質譜如圖10所示。圖10中縱軸表示 相對強度（％)，以及橫軸表示m/z値。 分子量：1456 MS m/z 484.6[M-3H+]3' 糖組成L-岩藻糖：D-葡糖醛酸=7 : 1 硫酸基3分子 (c )寡聚糖1 - ( 3 )之物性 質量分析及NMR分析歸屬之結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1 - ( 3 )之1 Η - NMR光譜如圖 1 1所示，13 C-NMR光譜如圖1 2所示，質譜如圖1 3所示。 圖11與圖12中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖13中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示 m / z 値 0 分子量：1682 MS m/z 873.4[M+3Na+-5H+]2·、862.4[M+2Na+-4H+]2 、 574.4[M+2Na+-5H+]3·、567.2[M+Na+-4H+]3-、425·2 [M+ Na+-5H+]4-、419.8[M-4H+]4·、 藉由1H-NMR及13C-NMR分析結果如表2所示。 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表2 化學位移値(ppm) 13c_nmr lH-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 97.1 4.47, d, 7.9 F1-2 70.9 3.44, dd，7.9, 10.1 F1-3 78.6 3.57, dd, 3.2, 10.1 F1-4 68.7 3.85, d, 3.2 F1-5 71.5 3.65, q, 6.7 F1-6 16.6 1.13, d, 6.7 F2-1 96.6 4.98, d，4.0 F2-2 67.6 3.86, dd, 4.0, 8.6 F2-3 77.6 3.97, dd, 2.9, 8.6 F2-4 80.6 4.65, d, 2.9 F2-5 67.4 4.29, q, 6.7 F2-6 16.7 1.11，d，6.7 F3-1 100.1 4.99, d, 4.0 F3-2 68.1 3.74, dd, 4.0, 10.4 F3-3 77.4 3.89, dd，2.8, 10.4 F3-4 80.6 4.62, d, 2.8 F3-5 67.4 4.33 q, 6.7 F3-6 16.6 1.12, d, 6.7 F4-1 99.6 4.95, d，4.0 F4-2 67.7 3.72, dd, 4.0, 10.4 F4-3 74.8 3.86, dd，3.1，10.4 F4-4 69.1 3.95, d, 3.1 F4-5 68.1 4.22, q, 6.8 F4-6 16.2 1.09, d, 6.8 F5-1 95.1 5.00, d, 4.0 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表2 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.4 4.04, dd，4.0, 10.4 F5-3 73.7 4.19, dd，2.8, 10.4 F5-4 68.1 4.00, d，2.8 F5-5 67.4 4.20 q, 6.7 F5-6 16.2 1.11, d, 6.7 F6-1 94.3 5.08, d，4.0 F6-2 67.4 3.89, dd, 4.0, 10.4 F6-3 76.5 3.99, dd,, 10.4 F6-4 80.3 4.58, d, 2.4 F6-5 67.8 4.37, q, 6.7 F6-6 16.7 1.12, d, 6.7 F7-1 99.1 4.99, d, 4.0 F7-2 68.1 3.74, dd, 4.0, 10.4 F7-3 76.4 3.91，dd，3.0, 10.4 F7-4 80.2 4.64, d，3.0 F7_5 67.4 4.37, q，6.7 F7-6 16.7 1.12, d, 6.7 F8-1 98.7 4.96, d，4.0 F8-2 69.4 3.57, dd, 4.0, 10.1 F8-3 70.9 3.76, dd, 3.0, 10.1 F8-4 73.0 3.66, d，3.0 F8-5 68.1 4.23, q, 6.7 F8-6 16.1 1.07, d, 6.7 GA-1 100.4 5.16, d, 4.0 GA-2 72.1 3.48, dd, 4.0, 9.8 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（55 表2(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 GA-3 74.0 3.59, t, 9.8 GA-4 72.7 3.36, t，9.8 GA-5 73.7 3.81, d, 9.8 GA-6 177.3 糖組成L -岩藻糖·· D -葡糖醛酸=8 ·· 1 硫酸基4分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式（V) 所示。 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 56 〔V〕 GA 1

Η c F 7 F6 F 5 Η

S 匀1 U *

OH -59-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ ） (d)寡聚糖1-(4)之物性 質量分析之結果如以下所示，本發明之硫酸化葡糖醛酸 化岩藻寡聚:糖1-(4)之質譜如圖14所示。圖14中縱軸表示 相對強度（％)，橫轴表示m/z値。 分子量：2376 MS m/z 598.8[M+Na + -5H + ]4-、474.6[M-5H+]5· 糖組成L·岩藻糖：D_葡糖醛酸=11 : 2 硫酸基5分子 (e )寡聚糖1 - ( 5 )之物性 質量分析之結果如以下所示，本發明之硫酸化葡糖醛酸 化岩藻寡聚糖1-(5)之1H-NMR光譜如圖15所示，13C-NMR光譜如圖16所示，質譜如圖17所示。圖15與圖16中 縱轴表示訊號之強度，橫轴表示化學位移値（ppm )。再 者，圖17中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示m/z値。 分子量：2602 MS m/z 666.4[M+3Na+-7H+广、661.0[M+2Na+-6H+]4"、 524.0[M+Na+-6H+]5-、433·0[Μ-6Η+]6-、 藉由1H-NMR及13C-NMR分析結果如表3所示。 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（58 ) 表3 化學位移値(ppm) 13c-nmr iH-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 96.8 4.48, d, 8.0 F1-2 70.6 3.45, dd, 8.0, 9.5 F1-3 78.3 3.58, m F1-4 68.3 3.85,m F1-5 71.2 3.66, q, 6.7 F1-6 16.2 1.14, d, 6.7 F2-1 96.3 4.99, d, 4.0 F2-2 67.4 3.86, m F2-3 77.1 3.98, m F2-4 80.2 4.65, m F2-5 67.0 4.30, q, 6.7 F2-6 16.3 1.10, d, 6.7 F3-1 99.7 5.00, d, 4.0 F3-2 67.8 3.75, m F3-3 77.0 3.90, m F3-4 80.2 4.63, m F3-5 67.4 4.34, q, 6.7 F3-6 16.3 1.13, d, 6.7 F4_l 99.2 4.96, d, 4.0 F4-2 67.4 3.73, m F4-3 74.5 3.86, m F4-4 68.7 3.96, m F4-5 67.8 4.22, q, 6.7 F4-6 15.8 1.10, d, 6.7 F5-1 94.7 5.01, d, 4.0 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表3(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr b-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.1 4.05, dd，4.0, 10.0 F5-3 73.4 4.20, m F5-4 67.8 4.01, m F5-5 67.0 4.21, q, 6.7 F5-6 15.8 1.12, d, 6.7 F6-1 94.0 5.09, d, 4.0 F6-2 67.0 3.90, m F6-3 76.2 3.99, m F6-4 79.9 4.60, m F6-5 67.4 4.38, q, 6.7 F6-6 16.4 1.13, d, 6.7 F7-1 98.7 5.00, d，4.0 F7-2 67.8 3.75, m F7-3 76.0 3.91, m F7-4 79.8 4.65,m F7-5 67.4 4.38, q, 6.7 F7-6 16.4 1.13, d, 6.7 F8-1 99.2 4.96, d, 4.0 F8-2 67.4 3.73,m F8-3 74.5 3.86, m F8-4 68.7 3.96, m F8-5 67.8 4.22, q, 6.7 F8-6 15.8 1.10, d, 6.7 F9-1 94.7 5.01, d? 4.0 F9-2 71.1 4.05, dd, 4.0, 10.0 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表3 (續） 化學位移値(ppm) 13c_nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F9-3 73.4 4.20, m F9-4 67.8 4.01, m F9-5 67.0 4.21, q, 6.7 F9-6 15.8 1.12, d, 6.7 F10-1 94.0 5.09, d, 4.0 F10-2 67.0 3.90, m F10-3 76.2 3.99, m F10-4 79.9 4.60, m F10-5 67.4 4.38, q, 6.7 F10-6 16.4 1.13, d, 6.7 F11-1 98.7 5.00, d, 4.0 F11-2 67.8 3.75, m F11-3 76.0 3.91, m F11-4 79.8 4.65, m F11-5 67.4 4.38, q, 6.7 F11-6 16.4 1.13, d, 6.7 F12-1 98.3 4.96, d, 4.0 F12-2 69.1 3.58, m F12-3 70.5 3.77, m F12-4 72.6 3.67, d, 4.0 F12-5 67.8 4.23, q, 6.7 F12-6 15.8 1.08, d，6.7 GA1-1 100.0 5.16, d, 4.0 GA1-2 71.8 3.49, dd, 4.0, 10.0 GA1-3 73.6 3.60, t, 10.0 裝 訂

-63-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表3 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 GA1-4 72.4 3.37, t, 10.0 GA1-5 73.2 3.82, d, 10.0 GA1-6 176.9 GA2-1 100.0 5.16, d, 4.0 GA2-2 71.8 3.49, dd, 4.0, 10.0 GA2-3 73.6 3.60, t, 10.0 GA2-4 72.4 3.37, t, 10.0 GA2-5 73.2 3.82, d, 10.0 GA2-6 176.9 糖組成L-岩藻糖：D -葡糖醛酸=12 : 2 硫酸基6分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (XI)所示。 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7

1243853 A7 B7 五、發明説明（63 ) Η 1F 8

F 1 W F 7 F 1 1

F 1 0 F 9 再者，以下將本物質稱爲12Fuc-6S-2GlcUA 〇 (f)寡聚糖1-(6)之物性 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

1243853 A7 B7 五、發明説明（ ） 質量分析之結果如以下所示，本發明之硫酸化葡糖醛酸 化岩藻寡聚糖1 - ( 6 )之質譜如圖1 8所示。圖1 8中縱軸表示 相對強度（％)，橫軸表示Πΐ/ζ値。 分子量：3296 MS m/z 840.0[M+3Na+_7H+]4. 、 672.0[M+3Na+-8H+]5.、 556.0[M+2Na+-8H+]6-、473.2[M+Na+-8H+]7· 糖組成L_岩藻糖：D -葡糖醛酸=15 : 3 硫酸基7分子 (g)寡聚糖1-(7)之物性 質量分析及NMR分析歸屬之結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1-(7)之1 H-NMR光譜如圖 1 9所示，13 C- NMR光譜如圖2 0所示，質譜如圖2 1所示。 圖19與圖20中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖2 1中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示 m / z 値 0 分子量：3522 MS m/z 896.6[M+3Na+-7H+]4· 、 712.6[M+2Na+-7H+]5* 、 597.2[M+3Na+-9H十]6·、505.4[M+Na十-8H+]7-、439.6[M-8H+]8· 藉由1Η-NMR及13C-NMR分析結果如表4所示。 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 訂

1243853 A7 B7 五、發明説明（65 ) 表4 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 96.8 4.46, d? 8.0 F1-2 70.6 3.43, dd, 8.0, 9.5 F1-3 78.3 3.57, m F1-4 68.3 3.83,m F1-5 71.2 3.65, q, 6.7 F1-6 16.2 1.12, d, 6.7 F2-1 96.3 4.98, d, 4.0 F2-2 67.3 3.84, m F2-3 77.1 3.96, m F2-4 79.9 4.65, m F2-5 67.1 4.29, q, 6.7 F2-6 16.3 1.09, d，6.7 F3-1 99.7 4.98, d, 4.0 F3-2 67.8 3.73,m F3-3 77.0 3.88, m F3-4 80.2 4.61, m F3-5 67.1 4.33, q, 6.7 F3-6 16.3 1.11, d, 6.7 F4-1 99.3 4.94, d, 4.0 F4-2 67.3 3.71，m F4-3 74.5 3.84, m F4-4 68.7 3.93, m F4-5 67.8 4.20, q, 6.7 F4-6 15.9 1.07, d, 6.7 F5-1 94.7 4.99, d，4.0 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表4(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr bNMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.2 4.03,m F5-3 73.4 4.18, m F5-4 67.8 3.99, m F5-5 67.1 4.19, q, 6.7 F5-6 15.9 1.09, d, 6.7 F6-1 94.0 5.07, d, 4.0 F6-2 67.1 3.88, m F6-3 76.2 3.98, m F6-4 79.8 4.58, m F6-5 67.4 4.36, q, 6.7 F6-6 16.4 1.11, d, 6.7 F7-1 98.7 4.98, d，4.0 F7-2 67.8 3.73,m F7-3 76.0 3.90, m F7-4 79.8 4.64, m F7-5 67.1 4.36, q, 6.7 F7-6 16.4 1.11, d, 6.7 F8-1 99.3 4.94, d, 4.0 F8-2 67.3 3.71, m F8-3 74.5 3.84, m F8-4 68.7 3.93, m F8-5 67.8 4.20, q, 6.7 F8-6 15.9 1.07, d, 6.7 F9-1 94.7 4.99, d，4.0 F9-2 71.2 4.03,m -69- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（67 表4(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F9-3 73.4 4.18, m F9-4 67.8 3.99, m F9-5 67.1 4.19, q, 6.7 F9-6 15.9 1.09, d, 6.7 F10-1 94.0 5.07, d, 4.0 F10-2 67.1 3.88, m F10-3 76.2 3.98, m F10-4 79.8 4.58, m F10-5 67.4 4.36, q, 6.7 F10-6 16.4 1.11, d, 6.7 F11-1 98.7 4.98, d, 4.0 F11-2 67.8 3.73, m F11-3 76.0 3.90, m F11-4 79.8 4.64, m F11-5 67.1 4.36, q, 6.7 F11-6 16.4 1.11, d, 6.7 F12-1 99.3 4.94, d, 4.0 F12-2 67.3 3.71, m F12-3 74.5 3.84, m F12-4 68.7 3.93, m F12-5 67.8 4.20, q, 6.7 F12-6 15.9 1.07, d, 6.7 F13-1 94.7 4.99, d，4.0 F13-2 71.2 4.03,m F13-3 73.4 4.18, m -70- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（68 ) 表4(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F13-4 67.8 3.99, m F13-5 67.1 4.19, q, 6.7 F13-6 15.9 1.09, d, 6.7 F14-1 94.0 5.07, d, 4.0 F14-2 67.1 3.88, m F14-3 76.2 3.98, m F14-4 79.8 4.58, m F14-5 67.4 4.36, q, 6.7 F14-6 16.4 1.11, d, 6.7 F15-1 98.7 4.98, d, 4.0 F15-2 67.8 3.73, m F15-3 76.0 3.90, m F15-4 79.8 4.64, m F15-5 67.1 4.36, q, 6.7 F15-6 16.4 1.11, d, 6.7 F16-1 98.3 4.97, d, 4.0 F16-2 69.1 3.57, m F16-3 70.6 3.75, m F16-4 72.6 3.66, m F16-5 67.8 4.23, q, 6.7 F16-6 15.8 1.06, d, 6.7 GA1-1 100.1 5.15, d，4.0 GA1-2 71.8 3.47, dd, 4.0, 10.0 GA1-3 73.6 3.58, t, 10.0 GA1-4 72.4 3.36, t, 10.0 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（69 ) 表4(續） 化學位移値(ppm) 13c_nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 GA1-5 73.2 3.81, d, 10.0 GA1-6 177.0 GA2-1 100.1 5.15, d, 4.0 GA2-2 71.8 3.47, dd，4.0, 10.0 GA2-3 73.6 3.58, t, 10.0 GA2-4 72.4 3.36, t, 10.0 GA2-5 73.2 3.81, d, 10.0 GA2-6 177.0 GA3-1 100.1 5.15, d，4.0 GA3-2 71.8 3.47, dd, 4.0, 10.0 GA3-3 73.6 3.58, t, 10.0 GA3-4 72.4 3.36, t, 10.0 GA3-5 73.2 3.81, d, 10.0 GA3-6 177.0 糖組成L -岩藻糖·· D -葡糖醛酸=1 6 ·· 3 硫酸基8分子 再者，1 Η - NMR及13 C- NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (X11)所示。 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 1243853 A7 B7

1243853 A7 B7 五、發明説明（71

F 1 4： F 1 3 -74-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 五、發明説明（72 A7 B7

再者，以下將本物質稱爲16Fuc_8S-3GlcUA。 (h)寡聚糖1-(8)之物性 質量分析之結果如以下所示’本發明之硫酸化葡糖駿酸 化岩藻寡聚糖1-(8)之質讀如圖22所示。圖22中縱轴表示 相對強度（％ )，橫轴表示m / z値。 分子量：4216 MS m/z 1092.0[M+7Na+-llH+]4_、869.0[M+6Na+_llH+]5.、 713.0[M+3Na+-9H+]6' 、 611.0[M+3Na+-10H+]7' > 529 2 [M+Na、9H+]8·、470.2[M+Na、10H+]9-糖組成L-岩藻糖：D -葡糖趁酸=19 : 4 硫酸基9分子 實例3 (1)使實例1記載之部份粗酵素液作用於參考例1 (i )記載 之粗硫酸化葡糖路酸化岩藻聚糖部份中，調製本發明之硫 酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。亦即，將3公克之粗硫酸化 葡糖趁酸化岩藻聚糖部份溶解於1公升之含有250 mM氯化 納、20 mM氣化爹弓及1公克牛血清白蛋白之1〇 mM味也-鹽 酸緩衝液（ρΗ6·6)中後，添加29 mU之實例1記載之部份精 製酵素，使其於3 0 °C反應3日。將反應液離心，所得之上 清液用裝設有排除分子量爲1萬之中空纖維之限外過濾 機，回收分子量1萬以下之寡聚糖部份，做爲硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖酵素消化物部份2。 (2 )將實例3 ( 1)所得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素 消化物部份2藉由脱鹽裝置（微阿西來札-G3，旭化成工業 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

裝 訂

線 1243853 A7 B7 五、發明説明（73 ) 公司製）脱鹽。於脱鹽之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素消 化物部份2中，添加咪唑並使其濃度爲5 m Μ，以及添加氯 化鈉並使莫濃度爲1 〇 mM，饋入預先以含有10 mM氯化鋼 之5mM咪唑-鹽酸緩衝液（PH7.0)平衡化之1公升DEAE -赛 璐玢A-800管柱中，用相同緩衝液洗淨後，藉由10 mM至 600 mM之氯化鈉梯度溶析。被溶出之部份，其總糖量藉由 酚-硫酸法測定，總糖醛酸量藉由咔唑-硫酸法測定。其結 果，溶出之部份中至少5個有明顯之尖峰存在，將各個尖 峰部份集合，做爲寡聚糖2-(1)〜（5)，分別將其藉由蒸發 器濃縮爲4 0毫升後，饋入預先以1 〇 %乙醇平衡化之赛璐玢 GCL-25管柱中，以10%乙醇溶析及脱鹽。由此可得到寡聚 糖2-(1)〜（5)。 (3)寡聚糖之構造解析 對於實例3 ( 2 )所得到之寡聚糖2 - ( 1 )〜（5 )之脱鹽物，使 用2 -胺基吡啶之螢光標識法進行還原末端糖及糖組成之分 析時，發現該寡聚糖之還原性末端糖全部爲L-岩藻糖。再 者，關於糖組成，寡聚糖2-(1)只由岩藻糖形成，而寡聚 糖2 - (2 )〜（5 )則係由岩藻糖與葡糖趁酸形成。繼而，測定 硫酸含量（藉由使用氣化鋇之比濁法）及糖醛酸含量（藉由咔 峻-硫酸法），且藉由質量分析裝置（API _〗Π，帕金野如馬 赛也克斯公司製）分析質量。再者，使用JNM-泛500型核磁 共振裝置（日本電子公司製）進行NMR分析。將分析試料藉 由固定方法以重水置換後進行構造解析。構成糖之結合方 式，係使用HMBC法（爲一種1 Η -檢測異種核檢測法）而進 -76- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 ____B7__ 五、發明説明（74 ) 行。1H-NMR之歸屬係使用DQF-COSY法及HOHAHA法， 13C-NMR之歸屬係使用HSQC法。 以下，表示寡聚糖2-(1)〜（5)之物性。 (a) 寡聚糖2-(1)之物性 上述分析之結果，判定本物質爲與寡聚糖1-(1)相同之物 質。 (b) 寡聚糖2-(2)之物性 上述分析之結果，判定本物質爲與寡聚糖1-(3)相同之物 質。 (c) 寡聚糖2-(3)之物性 質量分析及NMR分析歸屬之結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖2-(3)之1 H-NMR光譜如圖 23所示，13C-NMR光譜如圖24所示，質譜如圖25所示。 圖23與圖24中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖25中縱軸表示相對強度（％)，橫抽表示 m / z 値0 分子量：1536 MS m/z 800.2[M+3Na+-5H+]2_、789.2[M+2Na+-4H+]2-、526.0 [M+2Na+-5H+]3-、518.6[M+Na+-4H+]3·、388.8 [M+Na+-5H+]4. 、383.2[M-4H+]4· 藉由1H-NMR及13C-NMR分析之結果如表5所示。 •77- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表5 化學位移値(ppm) 13c_nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1 -1 97.1 4.47, d, 7.9 F1-2 70.9 3.44, d-d, 7.9, 9.8 F1-3 78.6 3.58, d-d, 2.8, 9.8 F1-4 68.7 3.85, d, 2.8 F1-5 71.5 3.66, q, 6.8 F1-6 16.6 1.13, d, 6.8 F2-1 96.6 4.99, d, 4.0 F2-2 67.7 3.85, d-d, 4.0, 8.6 F2-3 77.6 3.98, d-d, 3.1, 8.6 F2-4 80.6 4.65, d, 3.1 F2-5 67.3 4.30, q, 6.8 F2-6 16.6 1.13, d, 6.8 F3-1 100.1 4.99, d，4.0 F3-2 68.2 3.75, d-d, 4.0, 11.3 F3-3 77.4 3.90, d-d, 2.7, 11.3 F3-4 80.6 4.62, d, 2.7 F3-5 67.4 4.34, q，6.8 F3-6 16.7 1.12, d, 6.8 F4-1 99.6 4.96, d, 4.0 F4-2 67.8 3.73, d-d, 4.0, 10.4 F4-3 74.9 3.86, d-d, 3.1, 10.4 F4-4 69.1 3.95, d, 3.1 F4-5 68.1 4.21，q，6.8 F4-6 16.2 1.09, d, 6.8 F5-1 95.1 5.01, d, 4.0 -78- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 表5 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.4 4.05, d-d，4.0, 10.4 F5-3 73.7 4.18, d-d，3.1，10.4 F5-4 68.1 4.00, d, 3.1 F5-5 67.3 4.19, q, 6.4 F5-6 16.2 1.13, d, 6.4 F6-1 94.2 5.08, d, 4.0 F6-2 67.6 3.85, m F6-3 75.8 4.00, m F6-4 80.0 4.59, d, 2.4 F6-5 67.4 4.37, q, 6.8 F6-6 16.8 1.14, d, 6.8 F7-1 98.3 5.01, d, 4.0 F7-2 69.5 3.66, d-d, 4.0, 10.7 F7-3 70.0 3.87, d-d, 2.5, 10.7 F7-4 81.6 4.48, d，2.5 F7-5 67.4 4.37, q, 6.8 F7-6 16.8 1.11, d, 6.8 GA1-1 100.3 5.16, d，4.0 GA1-2 72.1 3.47, d-d, 4.0, 9.8 GA1-3 74.0 3.59, t，9.8 GA1-4 72.7 3.37, d-d，9.8, 10.4 GA1-5 73.6 3.81, d, 10.4 GA1-6 177.3 - -79- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7五、發明説明（77 )糖組成L-岩藻糖·· D-葡糖醛酸=7 ·· 1 硫酸基4分子再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (VI)所示。 GA1

3 2 H F 7 X H H F 6 F 5 ^

Η Η H -oyo/ H % 〔VI〕

H

啕3 F 2 匀1 -80-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（78 ) (d) 寡聚糖2-(4)之物性 上述分析之結果，判定本物質爲與寡聚糖1 - ( 5 )相同之物 質。 (e) 寡聚糖2-(5)之物性 質量分析之結果如以下所示，本發明之硫酸化葡糖醛酸 化岩藻寡聚糖2-(5)之1H-NMR光譜如圖26所示，13C-NMR光譜如圖2 7所示，質譜如圖28所示。圖26與圖27中 縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値（ppm)。再 者，圖28中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示m/z値。 分子量·· 2456 MS m/z 854.8[M+5Na+_8H+]3、847.2[M+4Na+-7H + ]3·、840.4 [M+3Na+-6H+]3- 、63 5.4[M+4Na+-8H+广、630.0[M+3Na+-7H+]4·、624.4[M+2Na+_6H+]4·、503.6[M+3Na+-8H + ]5·、499.4 [M+2Na+-7H+]5· 、 495.0[M+Na+-6H + ]6' 、 416.0[M+2Na+- 8H+]6、412.4[M+Na+-7H+]6-、408·8[Μ·6Η + ]6· 藉由1H-NMR及13C_NMR分析之結果如表6所示。 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（79 表6 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 97.1 4.48, d，8.0 F1-2 70.9 3.45, dd, 8.0, 9.5 F1-3 78.6 3.59, m F1-4 68.7 3.87, m F1-5 71.5 3.67, q, 6.7 F1-6 16.6 1.15, d, 6.7 F2-1 96.6 4.99, d, 4.0 F2-2 67.6 3.87, m F2-3 77.5 3.99, m F2-4 80.6 4.66, m F2 - 5 67.4 4.30, q, 6.7 F2-6 16.6 1.10, d, 6.7 F3-1 100.1 5.00, d, 4.0 F3-2 68.1 3.78, m F3-3 77.5 3.88, m F3-4 80.6 4.63, m F3-5 67.6 4.35, q, 6.7 F3-6 16.7 1.13, d, 6.7 F4-1 99.6 4.97, d, 4.0 F4-2 67.8 3.73, m F4-3 74.8 3.87, m F4-4 69.1 3.96, m F4-5 68.1 4.22, q, 6.7 F4-6 16.2 1.10, d, 6.7 F5-1 95.1 5.02, d, 4.0 -82- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（8Q ) 表6(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.4 4.06, dd，4.0, 10.0 F5-3 73.7 4.20, m F5-4 68.1 4.01,m F5-5 67.4 4.21, q, 6.7 F5-6 16.2 1.12, d, 6.7 F6-1 94.3 5.09, d, 4.0 F6-2 67.4 3.88, m F6-3 75.8 4.00, m F6-4 80.0 4.60, m F6-5 67.6 4.38, q, 6.7 F6-6 16.8 1.13, d, 6.7 F7-1 99.1 5.02, d, 4.0 F7-2 68.2 3.76, m F7-3 76.4 4.00, m F7-4 80.5 4.66, m F7-5 67.6 4.38, q, 6.7 F7-6 16.7 1.13, d, 6.7 F8_l 99.6 4.97, d, 4.0 F8-2 67.8 3.73,m F8-3 74.8 3.87, m F8-4 69.1 3.96, m F8-5 68.1 4.22, q, 6.7 F8-6 16.2 1.10, d, 6.7 F9-1 95.0 5.02, d, 4.0 F9-2 71·4 4.06, dd, 4.0, 10.0 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（81 表6(續） 化學位移値(ppm) 13C-NMR ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F9-3 73.7 4.20, m F9-4 68.1 4.01, m F9-5 67.4 4.21, q, 6.7 F9-6 16.2 1.12, d5 6.7 F10-1 94.2 5.09, d? 4.0 F10-2 67.4 3.88, m F10-3 75.8 4.00, m F10-4 80.0 4.60, m F10-5 67.6 4.38, q, 6.7 F10-6 16.8 1.13, d, 6.7 F11-1 98.3 5.02, d, 4.0 F11-2 69.5 3.67, m F11-3 70.0 3.88, m F11-4 81.6 4.49, m F11-5 67.6 4.38, q，6.7 F11-6 16.7 1.12, d, 6.7 GA1-L 100.4 5.17, d, 4.0 GA1-2 72.1 3.49, dd，4.0, 10.0 GA1-3 74.0 3.60, t, 10.0 GA1-4 72.7 3.37, t, 10.0 GA1-5 73.6 3.82, d, 10.0 GA1-6 177.3 GA2-1 100.3 5.17, d, 4.0 GA2-2 72.1 3.49, dd, 4.0, 10.0 GA2-3 74.0 3.60, t，10.0 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（82 ) 表6(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr !h-nmr 化學位移値、多重度、結合常數 GA2-4 72.7 3.37, t, 10.0 GA2-5 73.6 3.82, d, 10.0 GA2-6 177.3 糖組成L -岩藻糖·· D -葡糖醛酸=1 1 : 2 硫酸基6分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (XIII)所示。 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 Α7 Β7 五、發明説明（ 83 GA 1

F4 F3 F2 Fl ο π:

X -86- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

^ § X 1243853 A7 B7 五、發明説明（84 ) Ο H J——Ο-Ϊ & X οχGA2

Η *

再者’以下將本物質稱爲11Fuc-6S-2(Hcl；A 〇 由上述實例2及實例3得到之酵素反應生成物所見，舉例 而各’寡聚糖1-(1)、、1气5)及1-(7)間之質量差， 相當於岩蓮糖4分子、硫酸基2分子與葡糖醛酸1分子之質 量。寡聚糖1-(2)、1_(4)、1-(6)及1-(8)間之質量差、寡 聚糖2-(1)、2-(2)及2-(4)間之質量差及寡聚糖2-(3)與2-(5 )間之質量差亦相同。因此，認爲在實例1得到之粗酵素 液及部份精製酵素液中，包含在硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖之重覆單位{亦即岩藻糖4分子、硫酸基2分子及葡糖遂 酸 1 分子之單位（（-3F-3(4S)Fl-3(4S)Fl-3(GUl-2)Fl-)，其中 泛-L -岩藻糖簡稱F，硫酸基簡杈S，π - D -葡糖醛酸簡稱 GU)}間切斷之酵素。不過，反應生成物中不存在由岩藻 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 χ 297公董) 1243853 A7 B7 五、發明説明（85 ) 糖4分子、硫酸基2分子及葡糖醛酸1分子形成之寡聚糖， 近似其構造者’爲岩藻糖4分子及硫酸基2分子形成之春聚 糖。亦即’隱約表示實例1 ( 1)所得到之粗酵素液及部份精 製酵素液中，至少爲葡糖酸甞酶及岩藻糖甞酶之混合物。 實例4 (1 )硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖赛璐玢之調製 爲調製供分離實例1 ( 1)得到之部份精製酵素液中所含之 酵素用之親和性樹脂，將參考例i (丨）記載之粗硫酸化葡糖 酸酸化岩藻聚糖部份固定於胺基赛璐玢（生化學工業製） 上。該固定化之方法係依據生化學工業之説明書。亦即， 將1 · 5公克之粗硫酸化葡糖趁酸化岩蕩聚糖部份溶於$ 〇毫 升水中後’用鹽酸調成ρΗ4·5，添加50毫升之胺基赛璐玢 與3公克之1-乙基·3-(二甲胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽，於 4 C攪摔2 0小時，過濾後，用水充分洗淨，得到硫酸化葡 糖醛酸化岩藻聚糖-赛璐紛。 (2)藉由硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖·赛璐玢將α-D -葡糖 菩酸酶及内-a - L-岩藻糖荅酶分離 將實例1 ( 1)所得到之部份精製酵素液，用含有5〇 氣 化鈉及10 mM氣化鈣之1〇 mM咪唑_鹽酸緩衝液（pH7 5)充 分透析後，债入以相同緩衝液平衡化之5〇毫升硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖赛璐玢中，用相同緩衝液洗淨後，用5〇 mM至1M之氣化鈉梯度溶析。若測定溶出部份之「硫酸化 葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性」―，活性之回收率約爲2%， 仁疋方知僅具些微「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 -88 -

1243853 A7 B7 五、發明説明 性」之殘餘溶出邵份與硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖赛路纷 未吸著部份之混合，則「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解 活性」變得約略與加至管柱之活性相等。 由於上述未吸著部份單獨使用時完全不會將硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖低分子化，以及僅具有些微「硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖分解活性」之溶出部份單獨使用時亦完全 不會將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖低分子化，可以判定未 吸著部份及溶出部份分別藉由不同作用將硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖分解，以及若未使溶出部份預先作用於硫酸化 葡糖路酸化岩藻聚糖作用，未吸著部份亦不會作用。由此 暗示溶出部份係切斷硫酸化.葡糖醛酸化岩藻聚糖之側鏈（亦 即a - D -葡糖醛酸基鍵結或硫酸酯鍵結等使硫酸化葡糖醛 酸化岩藻聚糖之分子量變化不太大之部份），而未吸著部份 則係切斷其主鏈（亦即a - L -岩藻糖基键結）。 實例5 (1)藉由2 -胺基吡啶螢光標識（ρ Α化）法標識寡聚糖 爲確認實例4 ( 2 ) I己載之非吸著部份及溶出部份之作用機 構，進行以下之實驗。 取硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖1-(1)〜（8)及2-(3)及2-(5) 之乾燥物各50毫微莫耳，使用糖基標示劑及糖基標示試劑 套組（均爲寶酒造公司製）將還原性末端用2 ·胺基吡啶進行 勞光標識（P A化），以調製該寡聚糖之P A化物。 (2 )藉由下述反應系調查實例4 ( 2 )記載之未吸著部份及溶 出部份對實例5 ( 1)記載之1 0種寡聚糖P A化物之作用。 -89 本紙張尺度適用中S S家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

裝 訂

線 1243853 A7 B7 五、發明説明（87 反應系 50微升50mM咪唑鹽酸緩衝液（ρίί6.6) 2 3微升水 5微升4Μ氣化鈉 2微升1 Μ氣化鈣 5微升5¾克/ ¾升牛血清白蛋白 10微升2微微莫耳/微升寡聚糖之pa化物 5微升水或實例4(2)記載之未吸著部份或實例4(2)記 載之溶出部份 將上述所有成分混合後，於3crc反應3小時，於1〇〇1處 理10分鐘後進行離心，將上清液以下列條件進行HpLC* 析’然後確認對各個寡聚糖PA化物之作用。 裝置：L - 6200型（日立製作所製） 管柱：OHpak SB-803(8x300 mm，昭和電工公司製） 溶析液：含有5mM疊氮化鈉及1〇%甲基亞砜之〇·2Μ氯化 鈉。 檢測：螢光檢測器F-1150(曰立製作所製），激發波長320 nm ’螢光波長400 nm。

流速·· 1毫升/分鐘 管柱溫度：50°C k上述分析之結果判定，實例4 ( 2 )記載之未吸著部份及 溶出部份對各種硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖p A化物作用 之有無，及作用前後SB803管柱中之保持時間，如表7所 示。 -90-

1243853 A7 B7 五、發明説明（88 ) 表7 寡聚糖之PA化物 作用之有無 未吸著部份 溶出部份 使溶出部份作用前後之保持時間 作用前 作用後 K1) 無 無 9.74 9.72 1-⑵ 無 有 9.09 9.22 H3) 無 有 8.94 9.06 H4) 無 有 8.76 8.91 H5) 無 有 8.56 8.65 H6) 無 有 8.50 8.60 1_⑺ 無 有 8.40 8.48 H8) 無 有 8.31 8.40 2-⑶ 無 有 8.92 9.04 2-⑶ 無 有 8.56 8.68 如表7所示之方式，實例4 ( 2 )之未吸著部份對上述寡聚 糖之PA化物全無作用。另一方面，實例4(2)之溶出部份雖 對硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1 - ( 1 )無作用，但對其他 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖有作用。藉由此結果，強烈 顯示4 ( 2 )之溶出部份爲切斷硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 之葡糖醛酸之酵素。舉例而言，若從寡聚糖1-(3)將岩藻 糖1分子切斯，可生成寡聚糖2 - ( 3 )。此時之保持時間變化 被認定係從8.94分鐘變成8.92分鐘。然而實例4(2)之溶出 部份對寡聚糖1-(3)之反應中，保持時間係從8.94分鐘變 化成9.06分鐘。因此，可以認定此反應並非爲切斷岩藻糖 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 _______B7 五、發明説明Γ89~~) ^ "~ 之反應。同樣地藉由比較寡聚糖2_(5)與1-(4)及2-(3)與 1 - ( 2 )’可以認定實例4 ( 2 )溶出部份之反應並非爲切斷硫 酸酯之反應。再者，藉由比較寡聚糖丨气”與卜㈠）、1·(7) 與1-(6)及1-(3)與1-(2)，暗示實例4(2)溶出部份之反應 並非切斷硫酸化岩藻糖之反應。 (3 )爲確認實例4 (2 )記載之溶出部份具有從-〇 -葡糖甞酸 酶活性’使實例4 ( 2 )記載之溶出部份作用於實例2記載之 石荒酸化葡糖酸化岩藥寡聚糖1 - ( 3 )，然後分析其質量變 化。首先，構築下列之反應系。 反應系 32.1毫升50mM咪唑鹽酸緩衝液（ρΗ6·6) 2.0毫升4Μ氣化鈉 0.8毫升1Μ氣化鈣 4.0毫升5毫克/毫升牛血清白蛋白 10毫克實例2記載之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖b(3 ) 1·〇毫升實例4(2)記載之溶出部份 將上述所有成分混合後，於3 〇 °C使其反應5日，爲了脱 鹽，饋入以10%乙醇平衡化之赛璐玢GCL-25管柱（4 X 90 公分）中，以每一溶份9 · 1毫升之方式分取溶份，對於被分 取之溶份’測定總糖量（-硫酸法）及總糖趁酸量（叶峻-硫 酸法）。其結果，藉由酚·硫酸法之顯色爲強陽性之部份， 藉由咔吐-硫酸法之顯色爲陰性。亦即，強烈顯示將含有葡 糖醛酸之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1-(3)中之葡糖醛 酸切斷。更且，爲確認葡糖醛酸之切斷，對藉由酚-硫酸法 -92- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（9Q ) 之顯色爲強陽性之部份進行質量分析。結果此等部份質量 爲1506，亦即存在與從硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1-(3) 中切除葡糖醛酸後之質量（1506)—致之物質。再者，由於 無法測出與硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1 - ( 3 )質量（1682 ) 一致之物質，可知脱葡糖醛酸化反應進行得很完全。 藉由以上之結果，判定實例4 ( 2 )記載之溶出部份中有以-D -葡糖甞酸酶存在。與從硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖1-(3)切除葡糖醛酸後之質量（ 1506)—致之物質，被認定具有 下式（VII)之構造。 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 91 〔VII〕

句8 F7 F6 P5

F 3 F 2 F 1 -94-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 ----------_ . 五、發明説明（92 ) 再者’以下將本物質稱爲8Fuc-4S 0 藉此，檢纣本發明“ _ D -葡糖甞酸酶對於實例5 (丨）所得 到硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖b (3 )之p A化物之最佳反 應條件。再者，於求取本發明之々-D_葡糖甞酸酶活性 時’係藉由下列反應系測定活性。 反應系 5 0微升含有1〇〇 mM氣化鈉之5〇 咪唑-鹽酸緩衝液 (PH7.0) 2 1微升水 4微升1μ氣化鈣 10微升3毫克/毫升牛血清白蛋白 1 0微升4微微莫耳/微升實例5 ( 1 )所得到之硫酸化葡糖 路酸化岩藻寡聚糖1-(3)之ΡΑ化物 5微升α-D-葡糖甞酸酶溶液 將上述所有成分混合後，於2 2 °C反應3小時，於1〇〇。(：處 理1 0分鐘後進行離心，將上清液以下列條件進行Hplc分 析0 裝置：L_ 6200型（日立製作所製） 管柱：L·管柱（4.6x250 mm，財團法人化學品檢查協會 製） 溶析液：含有0.3 % 丁醇之50 mM醋酸-三乙胺緩衝液 (ρΗ5·0) 檢測：螢光檢測器F-1150(日立製作所製），激發波長320 nm，螢光波長400 nm。 -95- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 _____B7 五發明説明（93^) 一 ' "

流速：1毫升/分鐘 管柱溫1 : 4(TC 1單位之本發明α _ D -葡糖:y：酸酶，係指上述反應系中以 1分鐘時間將1微莫耳實例5 ( 1 )得到之硫酸化葡糖醛酸化岩 漢暴聚糖1-(3)PA化物之葡糖酸酸基鍵結切斷之酵素量。 所切斷之葡糖醛酸基鍵結之量係藉由下式求得。 數學式2 DGA/18〇x〇.〇〇5=U/ml DGA :被切斷之實例5 ( 1)得到之硫酸化葡糖遂酸化岩藻寡 聚糖1-(3)PA化物之量（微莫耳） 180 :反應時間（分鐘） 0.005 :酵素液量（毫升） (4) 將實例5 (3 )記載之8FUC-4S藉由2 -胺基吡啶勞光標識 (PA 化） 取50毫微莫耳之實例5(3)記載之8FUC-4S，使用糖基標 示劑及糖基標示試劑套組（均爲寶酒造公司製）將還原性末 端用2-胺基峨症進行螢光標識（PA化），調製該寡聚糖之 PA化物。以下將本物質稱爲8Fuc-4S-PA 〇 (5) 使用8Fuc-4S-PA之實例4(2)記載之未吸著部份及溶出 部份之作用之檢討 實例4(2 )記載之未吸著部份及溶出部份對實例5 (4)記載 之8Fuc-4S-PA之作用，藉由下列反應系調查。 反應系 50微升50mM咪唑·鹽酸緩衝液（PH6.6) -96-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(210 X 297公爱) 1243853

2 3微升水 5微升4M氣化鈉 2微升1 Μ氣化_ 5微升5毫克/毫升牛血清白蛋白

1〇微升2微微莫耳/微升8Fuc-4S_pA 5微升水或實例4(2)記載之未吸著部份或實例4(2)記载 之溶出部份 將上述所有成分混合後，於3〇。〇反應3小時，於10(rc處 理10分鐘後進行離心，將上清液以5(3)記載之條件進行 HPLC分析。 上述分析之結果，實例4(2)記載之未吸著部份可將8Fm_ 4S-PA，解，而實例4(2)記載之溶出部份無法將盱叫_4孓 PA分解。再者，藉由實例4(2)記載之未吸著部份將aw 4S-PA分解所得到之分解物，與實例5(1)所得到之硫酸化 葡糖醛酸化岩藻寡聚糖丨^丨泞八化物在相同位置溶出。此 ，況與實例2及實例3中大量得到與硫酸化葡糖醛酸化岩藻 寡聚糖1-( 1)相同物質之情況並無矛盾。亦即，實例 記載之未吸著部份，可判定爲對脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫 酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 等作用之内-α-L-岩藻糖甞酶。 藉由此結果，可判定實例4所調製之硫酸化葡糖醛酸化岩 藥聚糖赛路纷爲可將本發明之-葡糖苷酸酶及本發明 之内-從-L -岩藻糖荅酶分離之有用樹脂。 (6)再者’檢讨本發明之内-沒-l·岩藻糖答酶對8Fuc_4S_ -97-

1243853 A7 B7 五、發明説明（95 ) PA之最佳反應條件。再者，於求取本發明之内-沒-L-岩藻 糖苷酶活性時，係藉由下列反應系測定活性。 反應系 5 0微升含有40 mM氣化鈉之50 mM醋酸緩衝液（ρΗ5·5) 23微升水 2微升1 Μ氣化鈣 10微升3毫克/毫升牛血清白蛋白 10微升4微微莫耳/微升8Fuc-4S-PA 5微升内-a - L -岩藻糖苷酶溶液 在3 0 °C反應3小時，反應液之分析以與上述同樣之方式 進行。 1單位之本發明内-α - L -岩藻糖甞酶，係指上述反應系中 以1分鐘時間將1微莫耳8Fuc-4S-PA之切斷之酵素量。所切 斷之岩藻糖基鍵結之量係藉由下式求得。 數學式3 DPA/180x0.005=U/ml DPA :所切斷之8Fuc-4S-PA之量（微莫耳） 180 :反應時間（分鐘） 0.005 ··酵素液量（毫升） 實例6 將實例4 ( 2 )記載之未吸著部份及溶出部份分別藉由預先 以含有100 mM氣化鈉、10 mM氣化#5及5 m Μ疊氮化納之 10 mM咪吐-鹽酸緩衝液（ρΗ7·5 )平衡化之Sephacryl S-200 管柱（4.4 X 100 cm)凝膠過濾，以每溶份13.5毫升之方式分 -98- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 訂

線 1243853 A7 B7 五、發明説明（96 ) 取溶份。對於溶出部份，分別測定其中本發明之π _ D -葡 糖菩酸酶及本發明之内-以-L -岩藻糖答酶之活性，其中實 例4 ( 2 )記載之未吸著部份藉由實例5 ( 2 )記載之方法，基質 係使用硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖i 3 )之ρ Α化物，以 及實例4 ( 2 )記載之溶出部份藉由實例5 ( 5 )記載之方法測 定。測定本發明a - D -葡糖甞酸酶及α - L _岩藻糖苷酶之活 性。藉由上述凝膠過濾法所測得之本發明以-D -葡糖苷酸 酶之分子量約爲12萬〜18萬，而本發明内-α-L-岩藻糖答 酶之分子量約爲15萬〜20萬。 實例7 將參考例1 ( 1)記載之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份 用DEAE -赛路纷Α·800精製。亦即，於預先以含有50mM 氣化鈉及1 0 %乙醇之20 mM咪嗅-鹽酸緩衝液（ρΗ8.0 )平衡 化之5公升DEAE -赛路紛A - 800之管柱中，積入溶於相同緩 衝液中之5公克參考例1 ( 1 )記載之粗硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖部份，用相同緩衝液洗淨後，再用含有1 〇〇 mM氯化 鈉及10%乙醇之20 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH8.0)洗淨，用 1Q0 mM至2 Μ之氯化鈉梯度溶析。將被溶出之溶份分劃爲 每份500毫升，然後藉由驗·硫酸法測定總糖量。將溶出鹽 濃度500 mM附近所溶出之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖認定 爲主成分部份而加以收集，藉由裝設有排除分子量爲1〇萬 之中空纖維之限外過濾裝置予以脱鹽，然後凍結乾燥，得 到精製硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份0.9公克。檢討上述 精製硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份之葡糖醛酸含量之調 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（97 ) 整。首先，構築下列之反應系。 反應系 5微升50mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH6.6) 0.5微升4M氯化鈉 0.5微升1 Μ氣化鈣 0.25微升5毫克/毫升牛血清白蛋白 3.35微升實例4(2)記載之溶出部份 2.4毫升1.25 %精製硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份水溶 液 將上述所有成分混合後，於2 5 °C使其反應，經不同時間 取樣，將樣品充分透析，以及除去切斷之葡糖醛酸。表8 中係記載各樣品中所含之岩藻糖量、葡糖醛酸量及彼等之 比率。 表8 反應時間 (小時） 岩藻糖含量 (mM) 葡糖醛酸含量 (mM) 岩藻糖與葡糖醛酸 之莫耳比 0 6.1 1.4 4.4 ： 1 1 6.3 1·3 4.9 ： 1 2 6.9 1.2 5.8 ： 1 5 6.5 0.90 7.2 ： 1 10 6.9 0.70 9.9 ： 1 20 6.3 一 0.65 9.7 ： 1 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（98 ) 藉由上述結果，判定若使用實例4(2)記載之溶出部份， 可以藉由將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之葡糖醛酸切除， 而調整岩藻糖與葡糖醛酸之莫耳比。 實例8 (1) 鈣鹽濃度對於酵素反應之影響 在測定本發明之Γ硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 性」之時，若將反應系中所含有之氣化鈣濃度降低，則見 到活性降低。因此，對於本發明之α-D-葡糖苷酸酶及本 發明之内-a - L -岩藻糖苷酶，亦調查反應系中所含氣化鈣 之濃度與酶相對活性之關係。結果，判定該二酵素皆會被 氣化鈣活性化。再者，發現該二酵素亦被醋酸鈣同樣地活 性化。 (2) 蛋白質對於酵素反應之影響 當測定本發明之「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 性」時，若將牛血清白蛋白從反應系中除去，則見到活性 降低。因此，對於本發明之《·〇-葡糖荅酸酶及本發明之 内_ a _ L -岩藻糖甞酶，亦調查反應系中所含之牛血清白蛋 白濃度與酶相對活性之關係。結果，判定該二酵素$會被 牛血清白蛋白活性化。再者，發現亦可被本發明之岩^依 聚糖分解嗜岩藥菌SI- 1234菌株生產之蛋白質同樣地活 化。 (3) 氣化鈉對於酵素反應之影響 當測足本發明之「硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活 性」時，若將氣化鈉從反應系中除去，則見到活性;低'。 101 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1243853

因此，對於本發明之a_D•葡糖苷酸酶及本發明之内-江· L -石深糖菩酶’亦調查反應系中所含之氣化鈉濃度與酶相 對活性之關係。結果，判定該二酵素在以低分子之寡聚糖 做爲基貧時，並未被氣化鈉活性化。由此，可確認氣化鈉 係在酵素之基質爲高分子之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 時’將兩酵素活性化。 實例9 將石藥依聚糖分解嗜岩藻菌SI - 1234菌株接種於培養基 上’孩培養基係將含有以參考例丨（丨）之方法調製之來自沖 繩海級藻之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份〇.2 %及蛋白 腺1 /〇之人工每水（pH8.0 )(加馬林拉勃拉翠公司製）組成之 培養基600毫升於12〇。(：經20分鐘熱壓器處理而得。接種 後’於24 X：培養72小時做爲菌種培養液。於30公升之搖 瓶發酵器中，將含有蛋白腺2〇〇公克及消泡劑（Κλ17〇，信 越化學工業公司製）之人工海水形成之ρΗ8·0培養基18公升 於120°C進行20分鐘熱壓器處理所得之培養基，與以參考 例1 ( 1)之方法調製之來自沖繩海蘊藻之粗硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖部份4 0公克溶於2公升之人工海水並於9 5 °C處 理1小時而得者加以混合，然後接種上述菌種培養液，並 於每分鐘125迴轉之迴轉速度下，在24 °C培養72小時。再 者’於培養中將培養基之pH値自動控制在7以上。培養終 了後’將培養液離心’得到菌體及培養上清液。 如上述之方法，對於添加在本培養之培養基中之硫酸化 葡糖醛酸化岩藻聚糖，將加熱溫度爲約9 5 Ό之情況與於約 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q1 )

Invest. Dermatol.，103: 306-309，1994)之方法，於顯微鏡下 在玻璃培養m中將鬍鬚與毛囊分離。從一隻鼠採取大約 1 4〜1 6根鬍鬚。繼而，將參考例1 ( 1)記載之來自沖繩海蘊 藻之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份溶解於RPMI-1640 培養基中，調製成所設定濃度2 0倍之濃度液，然後於培養 系中添加二十分之一之量。對照組中添加同量之培養基。 鬍鬚之培養，使用組織培養用培養孤Falcon 3037(Becton Dickinson Labware公司製），於中央穴中加入添加0.7毫升 20%FCS之RPMI- 1 640培養基，於其上舖上滅菌之不銹鋼 網（池田理化股份有限公司製）及拭透鏡紙（提西凱斯股份有 限公司製）。 將毛髮加載於其上培養。將來自沖繩海龜蕩之硫酸化葡 糖趁酸化岩藻聚糖部份預先添加於培養基中。培養係在3 5 °(：及5%(：02存在下進行6曰。毛髮之長度，於培養開始前 及終了後在顯微鏡下使用卡尺測定至0 . 1毫米之位數。對 於各種樣品濃度，同一組使用3〜5根毛髮測定，伸長之長 度藉由平均値土標準誤差表示。再者，有意義差檢定係進 行學生之t檢定，並求出相對於對照組之P値。將其結果示 於表9中。 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q2 表9 添加樣品 濃度 (毫克/毫升） 檢體數 毛髮伸長度(平均値 土標準誤差)(毫米） P値 沖繩海蘊藻 0.01 5 0.9 土 0.25 0.17 對照 0 6 0.38土0.23 如表9中所示，來自沖繩海蘊藻之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖部份，與對照組相較，可確認有使老鼠之毛髮伸長之 效果。 實例1 1 (1)酵素之調製 將藉由實例9之方法調製之岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌S I -1234菌株之菌體萃取液，用含有10 mM氣化鈣之10 mM咪 唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)充分透析，離心後，得到上清液， 亦即本發明之泛-D-葡糖甞酸酶及内- π- L-岩藻糖甞酶共 存之粗酵素液。將所得到之粗酵素液饋入以相同緩衝液平 衡化之5 00毫升DEAE-赛璐玢A-800管柱中，用相同緩衝 液洗淨後，藉由100 mM至40 OmM之氣化鈉梯度溶析，以 每瓶6 7毫升之方式分取溶出部份，收集硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖分解活性部份。將所得到硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖分解活性部份，藉由裝設有分劃分子量爲1萬之中空 纖維之限外過濾機濃縮，然後用含有50 mM氣化鈉及10 mM氣化鈣之10 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)將緩衝液置 換。將所得到之酵素液饋入以相同緩衝液平衡化之實例 -105- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（ 4 ( 1)記載之5 0毫升硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖-赛璐玢管 柱中，用相同緩衝液洗淨後，用50 mM至600 mM之氣化鈉 梯度溶析。以每瓶1 0毫升之方式分取溶出部份，測定各部 份之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性。結果，僅僅只 有溶出部份可檢測出活性，未吸著部份並未發現活性。但 是，若將未吸著部份與溶出部份混合，硫酸化葡糖醛酸化 岩藻聚糖分解活性將與加至管柱中之活性約略相等。 收集未吸著部份，藉由限外過濾機濃縮成1〇〇毫升，而得 到未吸著部份濃縮液。另一方面，使用濃縮之未吸著部份 測定硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性，其活性部份， 藉由限外過濾機濃縮成200毫升，得到溶出部份濃縮液。 將此等酵素進一步精製，以嘗試調製硫酸化葡糖醛酸化岩 藻寡聚糖。首先，構築爲測定各個部份之活性之反應系。 上述之溶出部份及未吸著部份單獨使用時，無法對硫酸 化葡糖备故化石澡聚糖作用’因而無法有效地生成寡聚 糖，但若共存，則可將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解， 而效率良好地使其低分子化。兩酵素共存之狀態下，將分 解硫酸化葡糖路酸化岩蕩聚糖之活性藉由下列之活性測定 方法數値化。 未吸著邵份之活性測定方法如以下之方式進行。亦即， 將1 0微升之1 %粗硫酸化葡糖趁酸化岩藻聚糖部份溶液， 5 3微升之50 mM咪咬-鹽酸緩衝液（ρΗ6·6 )，5微升之4 Μ氯 化鈉，2微升之1Μ氣化鈣，10微升之5毫克/毫升牛血清白 蛋白，1微升之溶出部份濃縮液與1 9微升之供測定活性用 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 裝 訂

線 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q4 ) 之來自未吸著部份之酵素液混合，於3 0 °C反應3小時後， 於100 °C處理10分鐘，進行離心後，用90微升進行HPLC分 析，以測定低分子化之程度。做爲對照者，係將來自未吸 著部份之酵素液用溶解該酵素液之緩衝液代替而反應，並 且粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份，使用水代替而反 應，然後同樣地藉由HPLC進行分析。 1單位之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性，係指在上 述反應系中於1分鐘時間將1微莫耳硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖之岩藻糖基鍵結切斷之酵素量。所切斷之岩藻糖基鍵 結之量係藉由下式求得。 數學式4 {(10xl000xl/100)/MG}x{(MG/M)-l}x{l/(180x0.019)}=U/ml 10x1000x1/100 :添加於反應系中之粗硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖部份（微克） M G ··對照反應液之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之平均分 子量 Μ:反應生成物之平均分子量 (MG/M)-1 : 1分子硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖藉由酵素 切斷之部位數 180 :反應時間（分鐘） 0.019 :酵素液量（毫升） 再者，HPLC之條件係如以下所述。 裝置·· L-6200型（日立製作所製） 管柱：OHpak SB-806HQ(8 x 3 00mm，昭和電工社製） -107- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q5 )

溶析液：含有5 m Μ疊氮化鈉之5 0 mM氯化鋼 檢測：視差曲折率檢測器（ShodexRI-71，昭和電工社製） 流速：1毫升/分鐘 管柱溫度：25°C 爲測定反應生成物之平均分子量，將市售已知分子量之 出芽短梗孢糖（Pullulan)(STANDARD P-82，昭和電工社製） 用與上述HPLC分析之相同條件分析，將出芽短梗孢糖之分 子量與保持時間之關係以曲線表示，做爲供測定上述反應 生成物之分子量用之標準曲線。 另一方面，溶出部份之活性測定方法如以下之方式進 行。亦即，將1 0微升之1 %粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 部份溶液，53微升之50 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH6.6)，5 微升之4M氯化鈉，2微升之1M氣化鈣，10微升之5毫克/ 毫升牛血清白蛋白，1 9微升之未吸著部份濃縮液與1微升 之供測定活性用之來自溶出部份之酵素液混合，於3 0 °C反 應3小時後，於1 0 0 °C處理1 0分鐘，進行離心後，將9 0微 升進行HPLC分析，以測定低分子化之程度。做爲對照者， 係將從溶出部份而來之酵素液，使用溶解該酵素液之緩衝 液代替而反應，並且粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份， 使用水代替而反應，然後同樣地藉由HPLC進行分析。 1單位之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性，係指上述 反應系中於1分鐘時間將1微莫耳硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖之岩藻糖基鍵結切斷之酵素量。所切斷之岩藻糖基键結 之量係藉由下式求得。 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q6 ) 數學式5 {(ΙΟχΙΟΟΟχ 1/100)/MG}x{(MG/M)-l}x{ 1/(18〇χ〇. 00 l)}=U/ml 10x1000x1/100 :添加於反應系中之粗硫酸化葡糖醛酸化岩 藻聚糖部份（微克） M G :對照反應液之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之平均分 子量 Μ :反應生成物之平均分子量 (MG/M)-1 : 1分子硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖藉由酵素 切斷之部位數 180 ··反應時間（分鐘） 0.001 :酵素液量（毫升） 未吸著部份濃縮液之精製，以下述之方式進行。亦即， 於上述未吸著部份濃縮液中添加4 Μ氣化鈉，並調成濃度爲 250 mM，然後饋入以相同緩衝液平衡化3 0毫升之苯基-赛 璐玢管柱中。用相同緩衝液洗淨後，用250 mM至0 mM之 氯化鈉梯度溶析，然後，用含有10 mM氣化鈣之10 mM咪 唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)溶析，繼而用含有1 0%乙醇與10 mM氣化鈣之10 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)溶析，並以 每瓶1 0毫升之方式分取溶出部份，收集藉由上述方法測定 之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性部份。 將得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性部份，用 含有100 mM氣化鈉、10 mM氯化鈣及5 mM疊氮化鈉之10 mM咪也-鹽酸緩衝液（pH7.5 )做爲溶析液，經由Sephacryl S-200管柱（4.4 X 100cm)分離。以每瓶13.5毫升之方式分取 -109- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q7 ) 溶出部份。將藉由上述方法測定之硫酸化葡糖遂酸化岩藻 聚糖分解活性部份做爲精製未吸著部份。 再者，溶出部份濃縮液之精製以下述之方式進行。亦 即，將上述溶出部份濃縮液，藉由裝設有分劃分子量爲1 萬之中空纖維之限外過濾裝置，以含有100 mM氣化鈉及10 mM氣化鈣之10mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)置換，然後饋 入以相同緩衝液平衡化之4 5毫升DEAE -赛璐玢管柱中，用 相同緩衝液洗淨後，用100 mM至400 mM之氣化鈉梯度溶 析，以每瓶1 0毫升之方式分取溶出部份，收集藉由上述方 法測定之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性部份。 將得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解活性部份，用 含有100 mM氣化鈉、10 mM氣化鈣及5 mM疊氮化鈉之10 mM咪峻-鹽酸緩衝液（ρΗ7·5 )做爲溶析液，經由Sephacryl S-200管柱（4·4 X 100cm)分離。以每瓶13.5毫升之方式分取 溶出部份。將藉由上述方法測定之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖分解活性部份做爲精製溶出部份。 (2 )硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖之調製 使用上述精製未吸著部份及精製溶出部份進行硫酸化葡 糖醛酸化岩藻寡聚糖之調製。 亦即，將1 0公克之粗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖部份溶 解於1公升之含有250 mM氣化鈉、20 mM氯化#5、5 mM疊 氮化鈉及1公克牛血清白蛋白之10 mM咪峻-鹽酸緩衝液 (ρΗ6·6)後，添加100 mU之精製溶出部份及600 mU之精製 未吸著部份，使其於3 0 °C反應1 0日。將反應液離心，所得 -110- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q8 ) " ^' 到之上清液用裝設有排除分子量爲1萬之中空纖維之限外 過/慮裝置’回收分子量1萬以下之暴聚糖部份，做爲硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素消化物部份3。 (3 )硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖之精製 將上述之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖酵素消化物部份3藉 由脱鹽裝置（微阿西來札-G3，旭化成工業公司製）脱鹽。 於脱鹽之硫酸化葡糖酸酸化岩藻聚糖酵素消化物部份3， 添加咪咬並使其濃度成爲5 m Μ，以及添加氣化鈉並使其濃 度成爲10 mM，然後饋入預先以含有10 氣化鈉之5 mM 咪也-鹽酸緩衝液（ρΗ7·0)平衡化之i公升dEaE-赛璐纷A-800管柱中，用相同緩衝液洗淨後，用1〇 至4〇〇 mM< 氣化鈉梯度溶析。被溶出之部份，其總糖量藉由酚·硫酸法 測定，以及總糖醛酸量藉由咔唑-硫酸法測定。結果，溶出 之溶份中有至少5個明顯之尖峰存在，將各個尖峰部份集 合’做爲暴聚糖3-(1)〜（5) ’分別將其藉由蒸發器濃縮爲 4〇毫升後，饋入預先以10%乙醇平衡化之赛璐玢GCL-25 管柱中，以1 〇 %乙醇溶出脱鹽。由此可得到本發明之硫酸 化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖3-(1)〜（5)，即寡糖3_(1)〜（5)。 (4)寡聚糖之構造解析 對於上述之春聚糖3-(1)〜（5)之脱鹽物，藉由使用2 -胺 基批呢之螢光標識法進行還原末端糖及糖組成之分析時， 發現該寡聚糖之還原性末端糖全部爲岩藻糖。再者，關於 糖組成，寡聚糖3-(2)只由岩藻糖形成，寡聚糖3-(1)及3_ (3)〜（5)由岩藻糖與葡糖醛酸所形成者。繼而，測定硫酸 -111 - 本紙張尺度適用中@ g家標準(CNS) A4規格(⑽x297公爱) 1243853 A7 B7 五、發明説明（1Q9 ) 含量（藉由使用氯化鋇之比濁法）及糖醛酸含量（藉由咔唑-硫酸法），且藉由質量分析裝置（API-III，帕金野如馬赛也 克斯公司製）分析質量。再者，使用JNM- α 500型核磁共振 裝置（日本電子公司製）進行NMR分析。將分析試料藉由固 定方法以重水置換後進行構造解析。構成糖之結合方式， 係使用HMBC法（爲一種1 Η -檢測異種核檢測法）而進行。 iH-NMR之歸屬係使用DQF-COSY法及ΗΟΗΑΗΑ法，13C-NMR之歸屬係使用HSQC法。以下，表示寡聚糖3-(2)〜（5) 之物性〇 (a) 寡聚糖3-(2)之物性 上述分析之結果，判定本物質爲與寡聚糖1 - ( 1 )相同之物 質。 (b) 寡聚糖3-(3)之物性 質量分析及NMR分析之歸屬結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖3 - (3 )之1 Η - NMR光譜如圖 2 9所示，13 C- NMR光譜如圖3 0所示，質譜如圖3 1所示。 圖29與圖30中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖3 1中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示 m / z 値0 分子量：1230 MS m/z 1273.4[M+2Na+-3H+]- 、 625.2[M+Na+-3H+]2·、 409.2[M-3H+]3· 藉由1H-NMR及13C-NMR分析之結果如表10所示。 -112- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7

五、發明説明（11Q 表10 化學位移値(ppm) 13c-nmr [H-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 96.9 4.47, d，8.0 F1-2 70.7 3.44, dd，8.0, 10.0 F1-3 78.4 3.57, dd，3.0, 10.0 F1-4 68.5 3.85, d，3.0 F1-5 71.3 3.66, q, 6.5 F1-6 16.5 1.13, d, 6.5 F2-1 96.2 4.96, d, 4.0 F2-2 67.1 3.81, dd? 4.0, 10.0 F2-3 75.6 3.90, dd, 3.0, 10.0 F2-4 69.2 3.93, d, 3.0 F2-5 66.8 4.06, q, 6.5 F2-6 16.5 1.09, d, 6.5 F3-1 96.5 4.98, d, 4.0 F3-2 67.4 3.84, dd, 4.0, 11.0 F3-3 77.5 3.97, dd, 2.5, 11.0 F3-4 80.4 4.65, d, 2.5 F3-5 67.2 4.29, q, 6.5 F3-6 16.5 1.13, d，6.5 F4-1 100.0 4.98, d, 4.0 F4-2 68.0 3.75, dd, 4.0, 11.0 F4-3 77.2 3.89, dd，2.5, 11.0 F4-4 80.4 4.61, d, 2.5 F4-5 67.5 4.33, q, 6.5 F4-6 16.5 1.11, d, 6.5 F5-1 99.5 4.95, d，4.0 -113- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（111 表1〇(續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr b-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 67.7 3.73, dd, 4.0, 11.0 F5-3 74.0 3.84, m F5-4 68.2 3.89, m F5-5 68.0 4.19, m F5-6 16.0 1.09, d, 7.0 F6-1 94.4 5.00, d, 4.0 F6-2 75.9 3.77, dd, 4.0, 10.5 F6-3 70.0 4.05, dd, 3.5, 10.5 F6-4 73.1 3.70, d, 3.5 F6-5 67.6 4.17, q, 6.5 F6-6 16.0 1.09, d, 6.5 GA1-1 99.5 5.115d, 4.0 GA1-2 71.3 3.45, dd, 4.0, 10.0 GA1-3 73.3 3.64, t, 10.0 GA1-4 72.0 3.35, t, 10.0 GA1-5 72.6 3.96, d, 10.0 GA1-6 176.7 糖組成L -岩澡糖：D -葡糖备酸=6 : 1 硫酸基2分子 再者，1 H-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (XIV)所示。 -114- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（112 GA 1

HCOCOOH

cn 1cn

〔X I VJ

CO

CO ΟΗ· Η -115-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（113 ) 再者，以下將本物質稱爲6Fuc-2S-lGlcUA。 (c)寡聚糖3-(4)之物性 質量分析及NMR分析之歸屬結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖3-(4)之1 H-NMR光譜如圖 3 2所示，13 C_ NMR光譜如圖3 3所示，質譜如圖3 4所示。 圖32與圖33中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖34中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示 m / z 値。 分子量·· 1724 MS m/z 894. l[M+3Na+-5H + ]2· 、588.7[M+2Na+-5H + ]3-、 435.6[M+Na+-5H+]4· 藉由1H-NMR及13C-NMR分析之結果如表11所示。 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（114 表1 1 化學位移値(ppm) 13c_nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 FM 96.4 4.47, d, 7.9 F1-2 70.2 3.44, dd, 7.9, 9.9 F1-3 77.9 3.57, m F1-4 68.0 3.85, m F1-5 70.8 3.66, q, 6.7 F1-6 15.9 1.13, d, 6.7 F2-1 95.9 4.98, d, 4.0 F2-2 67.0 3.85, m F2-3 76.9 3.98, m F2-4 79.9 4.65, m F2-5 66.7 4.29, q, 6.7 F2-6 15.9 1.13, d, 6.7 F3-1 99.4 5.00, d, 4.0 F3-2 67.5 3.75, dd, 4.0, 10.4 F3-3 76.8 3.89, dd, 2.8, 10.4 F3-4 80.0 4.62, d, 2.8 F3-5 66.9 4.35, q, 6.7 F3-6 16.0 1.11, d, 6.7 F4-1 99.0 4.96, d, 4.0 F4-2 67.1 3.74, dd, 4.0, 10.4 F4-3 74.7 3.88, dd，3.1，10.4 F4-4 68.6 3.96, d, 3.1 F4-5 67.4 4.21, q? 6.7 F4-6 15.5 U0，d，6.7 F5-1 94.7 5.04, d，4.0 -117- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（115 表1 1 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 70.8 4.20, dd, 4.0, 10.4 F5-3 70.7 4.32, dd, 2.5, 10.4 F5-4 69.2 5.40, d, 2.5 F5-5 65.7 4.36, q, 6.7 F5-6 15.3 1.02, d, 6.7 乙醯基之ch3 20.5 2.06, s 乙醯基之CO 173.9 F6-1 93.4 4.98, d, 4.0 F6-2 66.6 3.78, dd, 4.0, 10.4 F6-3 77.5 3.82, dd，2.5, 10.4 F6-4 79.8 4.55, d，2.5 F6-5 66.5 4.35, q, 6.7 F6-6 16.0 1.13, d, 6.7 F7-1 99.7 4.96, d, 4.0 F7-2 67.6 3.71, dd, 4.0, 10.4 F7-3 75.6 3.89, dd, 2.8, 10.4 F7-4 79.6 4.64, d, 2.8 F7-5 66.7 4.25, q, 6.7 F7-6 16.2 1.11, d, 6.7 F8-1 97.9 4.96, d, 4.0 F8-2 68.7 3.57, dd, 4.0, 10.4 F8-3 70.2 3.76, dd, 3.1, 10.4 F8-4 72.3 3.66, d, 3.1 F8-5 67.4 4.20, q, 6.7 F8-6 15.4 1.08, d, 6.7

裝 訂

線 -118-本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（116 表1 1 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 GA1-1 99.5 5· 19, d，4.0 GA1-2 71.3 3.47, dd, 4.0, 9.8 GA1-3 73.3 3.58, t, 9.8 GA1-4 72.0 3.37, t, 9.8 GA1-5 72.6 3.81,d5 9.8 GA1-6 176.7 糖組成L·岩藻糖：D-葡糖醛酸=8 : 1 硫酸基4分子 乙醯基1分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式 (IX)所示。 -119- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A7 B7 117 五、發明説明（ i X3 OH Η GA 1

noox

V、* * j

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（118 ) 再者，以下將本物質稱爲8Fuc-4S-lGlcUA_ 1乙醯基。 (d)寡聚糖3-(5)之物性 質量分析及NMR分析歸屬之結果如以下所示，本發明之 硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖3-(5)之1H-NMR光譜如圖 35所示，13C-NMR光譜如圖36所示，質譜如圖37所示。 圖35與圖36中縱軸表示訊號之強度，橫軸表示化學位移値 (ppm)。再者，圖37中縱軸表示相對強度（％)，橫軸表示 m / z 値0 分子量：2689 MS m/z 924.0[M+4Na+-7H + ]3* 、687.3[M+3Na+-7H+]4'、 545.3[M+2Na+-7H+]5.、450.5[M+Na+-7H+]6_ 藉由1H-NMR及13C-NMR分析之結果如表12所示。 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（119 表12 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F1-1 96.8 4.46, d, 7.9 F1-2 70.5 3.43, dd, 7.9, 10.0 F1-3 78.3 3.57, m F1-4 68.3 3.85, m F1-5 71.2 3.65, q, 6.7 F1-6 16.2 1.12, d, 6.7 F2-1 96.3 4.97, d, 4.0 F2-2 67.3 3.85, m F2-3 77.1 3.97, m F2-4 80.1 4.65, m F2-5 67.1 4.29, q, 6.7 F2-6 16.2 1.12, d, 6.7 F3-1 99.7 4.98, d, 4.0 F3-2 67.9 3.74, m F3-3 77.1 3.88, m F3-4 80.3 4.62, m F3-5 67.3 4.35, q, 6.7 F3-6 16.3 1.11, d, 6.7 F4-1 99.3 4.94, d, 4.0 F4-2 67.4 3.73, m F4-3 75.0 3.87, m F4-4 69.0 3.95, m F4-5 67.7 4.20, q, 6.7 F4-6 15.9 1.10, d, 6.7 F5-1 95.0 5.03, d, 4.0

裝 訂

線 -122-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7

五、發明説明（12Q 表1 2 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F5-2 71.1 4.20, m F5-3 71.1 4.31, m F5-4 69.6 5.39, m F5-5 66.1 4.36, q, 6.7 F5-6 15.6 1.01, d, 6.7 F5之乙醯基之CH3 20.8 2.06, s F5之乙醯基之CO 174.2 F6-1 93.7 4.97, d, 4.0 F6-2 66.9 3.79, m F6-3 77.8 3.82, m F6_4 80.1 4.55, m F6-5 66.9 4.35, q, 6.7 F6-6 16.3 1.12, d, 6.7 F7-1 99.9 4.94, d, 4.0 F7-2 67.9 3.70, m F7-3 75.9 3.88, m F7-4 79.9 4.64, m F7-5 67.1 4.24, q, 6.7 F7-6 16.5 1.11, d, 6.7 F8-1 99.3 4.94, d, 4.0 F8-2 67.4 3.73,m F8-3 75.0 3.87, m F8-4 69.0 3.95, m F8-5 67.7 4.20, q, 6.7 F8-6 15.9 1.10, d, 6.7 -123- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（121 表1 2 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr lH-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F9-1 95.0 5.03, d, 4.0 F9-2 71.1 4.20, m F9-3 71.1 4.31, m F9-4 69.6 5.39, m F9-5 66.1 4.36, q, 6.7 F9-6 15.6 1.01, d, 6.7 F9之乙醯基之CH3 20.8 2.06, s F9之乙醯基之CO 174.2 F10-1 93.7 4.97, d, 4.0 F10-2 66.9 3.79, m F10-3 77.8 3.82, m F10-4 80.1 4.55, m F10-5 66.9 4.35, q? 6.7 F10-6 16.3 1.12, d, 6.7 F11-1 99.9 4.94, d, 4.0 F11-2 67.9 3.70, m F11-3 75.9 3.88, m F11-4 79.9 4.64, m F11-5 67.1 4.24, q, 6.7 F11-6 16.5 1.11, d, 6.7 F12-1 98.2 4.94, d, 4.0 F12-2 69.1 3.57, m F12-3 70.5 3.75, m F12-4 72.6 3.66, m F12-5 67.7 4.20, q, 6.7 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（122 表1 2 (續） 化學位移値(ppm) 13c-nmr b-NMR 化學位移値、多重度、結合常數 F12-6 15.8 1.07, d，6.7 GA1-1 99.7 5.19, d, 4.0 GA1-2 71.6 3.47, dd, 4.0, 9.8 GA1-3 73.6 3.58, t, 9.8 GA1-4 72.3 3.37, t, 9.8 GA1-5 73.0 3.81, d, 9.8 GA1-6 177.0 GA2-1 99.7 5.19, d, 4.0 GA2-2 71.6 3.47, dd, 4.0, 9.8 GA2-3 73.6 3.58, t，9.8 GA2-4 72.3 3.37, t, 9.8 GA2-5 73.0 3.81, d, 9.8 GA2-6 177.0 糖組成L-岩藻糖：D -葡糖醛酸=12 : 2 硫酸基6分子 乙醯基2分子 再者，iH-NMR及13C-NMR中尖峰歸屬之編號如下式（X) 所示。 -125- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（124 §

* zy F 1 2 F 1 1 F 1 0 F 9 to -127-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1243853

再者’以下將本物質稱爲12Fuc_6S_2G1cUA_2乙醯基。 (5)藉由超骨波處理之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖之調 製 檢有關藉由非酵素方式處理之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖低分子化方法。 Y亦即’ 1周製參考例1 (1)記載之方法得到之來自沖繩海蘊 深I粗硫酸化葡糖酸酸化岩藻聚糖之0. i %水溶液，藉由強 力超音波產生裝置201M(久保田商事公司製）以2〇〇w處理 分鐘。將該處理液藉由陰離子交換樹脂分劃，將其各部 <刀藉由質量分析’找出有分子量762之物質存在之部份。 再者’收集？S部份，藉由脱鹽及凍結乾燥，可得到本發明 T硫酸化葡糖趁酸化岩藻寡聚糖〖_ (丨）。更且，藉由上述 同樣 < 方法’可得到本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚 糖1-(2)〜（7)、2-(1)〜及3-(2)〜（5)、。 實例1 2 (Ua-D -葡糖:y：酸酶及内-以-L-岩藻糖荅酶之精製 藉由實例9之方法將岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌S I - 1234菌 株培養3次’從各次培養得到之菌體，藉由實例9之方法調 製菌體萃取液，以含有100 mM氣化鈉及10 mM氣化鈣之10 mM咪唑—鹽酸緩衝液（ρΗ7·5)充分透析，離心後，得到上清 液，亦即有本發明之-葡糖：y：酸酶及内岩藻糖 苷酶共存之粗酵素液。以下，本發明之α-D -葡糖苷酸酶 活性藉由實例5(3)記載之方法測定，本發明之内-泛-L-岩 深糖芬酶活性藉由實例5(6)記載之方法測定，並藉此將各 -128- )x 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（126 ) 個酵素精製。 將所得到之粗酵素液饋入以相同緩衝液平衡化之3公升 DEAE-赛璐玢A-800管柱中，用相同緩衝液洗淨後，藉由 100 mM至400 mM之氯化鈉梯度溶析，以平均每瓶200毫升 之方式分取溶出部份，收集本發明之a - D -葡糖甞酸酶活 性部份及本發明之内-a - L -岩藻糖苷酶活性部份。在此時 點，本發明之兩種酵素幾乎呈現相同之行爲特性，無法加 以分離。 將上述兩酵素活性部份，用裝設有分劃分子量爲1萬之中 空纖維之限外過濾機濃縮，用含有100 mM氯化鈉及10 mM 氣化鈣之10 mM咪唑·鹽酸緩衝液（pH7.5)將緩衝液置換。 將得到之酵素液饋入以相同緩衝液平衡化之240毫升 DEAE-赛璐玢A- 800管柱中，用相同緩衝液洗淨後，藉由 100 mM至300 mM之氯化鈉梯度溶析。以每瓶25毫升之方 式分取溶出部份，收集本發明之a - D -葡糖甞酸酶活性部 份及本發明之内-a - L -岩藻糖苷酶活性部份。在此時點， 本發明之兩種酵素幾乎呈現相同之行爲特性，無法加以分 離0 將上述兩酵素活性部份，藉由裝設有分割分子量爲1萬之 中空纖維之限外過濾機濃縮，藉由含有50 mM氯化鈉及 5mM氯化鈣之10mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7.5)將緩衝液置 換。 將得到之酵素液饋入以相同緩衝液平衡化之5 0毫升硫酸 化赛璐玢（生化學工業公司製）管柱中，用相同緩衝液洗淨 -129- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 ___ B7 五I發明説明（127 ) "~ ' 後，用50 mM至1 Μ之氯化鈉梯度溶析。以每瓶5 〇毫升之 方式分取溶出部份，收集本發明之α 葡糖甞酸酶活性 部份及本發明之内-從-L -岩藻糖苷酶活性部份。此時，兩 種酵素可完全分離，以下將各個酵素分別精製。 (2) 内-戊_；L-岩藻糖菩酶之精製 將上述（1 )得到之内-泛-L -岩藻糖芬酶活性部份，用分劃 分子量爲1萬之限外過濾膜濃縮，饋入用含有1〇〇 mM氣化 鈉、10mM氣化鈣及5mM疊氮化鈉之1〇mM咪唑_鹽酸緩衝 液（ρΗ7·5)平衡化之Sephacryl S-200 管柱（4 4 X 100cm)中， 藉由相同之緩衝液溶出。以每一瓶13·3毫升之方式分取溶 出部份’然後收集内-泛-L -岩藻糖茹酶之活性部份。 將知到之内-a - L -岩藥糖苷酶活性部份，饋入用含有工〇 mM氣化鈉及5mM氣化鈣之10 mM咪唑·鹽酸緩衝液（pH7.5 ) 與乙醇混合比爲8 5 ·· 1 5之緩衝液平衡化之苯基赛璐玢管柱 (2·4 X 44 cm)中，藉由相同之緩衝液溶析。以每一瓶3〇毫 升4方式分取溶出部份。得到之活性部份於S d S -聚丙烯醯 胺電泳試驗中顯示均一性質。以此方式，得到本發明之内_ 以-L-岩藻糖苷酶精製物。 (3) a-D -葡糖芸酸酶之精製 將上述（1 )得到之本發明a - D -葡糖：y：酸酶活性部份，用 分劃分子量爲1萬之限外過濾、膜濃縮，饋入用含有丨〇〇 mM 氣化鈉、10mM氣化鈣及5mM疊氮化鈉之10mM咪唑-鹽酸 緩衝液（ρΗ7·5)平衡化之Sephacryl S-200 管柱（4.4 X 100 cm) 中，藉由相同之緩衝液溶析。以每一瓶丨3 · 3毫升之方式分 -130- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853

取溶出部份，然後收集本發明^葡料酸酶之活性部 份。 知ί于到之本發明a_D_葡糖答酸酶部份，以含有3⑼mM 氣化鈉及5mM氣化鈣之1〇 mM咪唑_鹽酸緩衝液充分透 析，饋入用相同緩衝液平衡化之2〇亳升硫酸化-赛璐玢管 柱中’藉由相同之緩衝液洗淨後，用3〇〇 至900 mM之 氣化鈉梯度溶析。以每一瓶1〇毫升之方式分取溶出部份， 然後收集本發明a - D _葡糖菩酸酶之活性部份。 將得到之本發明α - D -葡糖荅酸酶部份，以含有2〇〇 氣化鈉及5 m Μ氣化鈣之丨〇 咪唑-鹽酸緩衝液充分透 析’饋入用相同緩衝液平衡化之2 〇毫升硫酸化-赛璐玢管 柱中’藉由相同之緩衝液洗淨後，用2〇〇 mM至800 mM之 氣化納梯度溶析。以每一瓶7毫升之方式分取溶出部份， 然後收集本發明a - D -葡糖甞酸酶之活性部份。所得到之 活性邵份於S D S -聚丙烯醯胺電泳試驗中顯示均一性質。以 此方式，得到本發明之α - D -葡糖:y：酸酶精製物。 實例1 3 使用實例12(2)得到之本發明内-“ -L-岩藻糖苷酶精製 物及實例12(3)得到之本發明以-D-葡糖甞酸酶精製物，試 驗硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之低分子化。首先，爲了調 查乙醯基對於硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖分解之影響，進 行脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之調製。 (1)脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之調製 將藉由參考例1 (1)之方法調製之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 -131 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ 297公釐) 1243853 A7 ____B7 五、發明説明（129 ) 聚糖200毫克溶解於20毫升之1N氫氧化鈉中，於25 °C下處 理20小時，繼而以含有2〇〇 mM氣化鈉及50 mM氣化鈣之20 mM咪唑-鹽酸緩衝液（ρΗ6·6)充分透析，得到脱乙醯化硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 (2)各基質之分解 對參考例1 ( 1 )之方法調製之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 及藉由上述（1)之方法調製之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩 澡聚糖，平均每200毫克添加本發明之以-D-葡糖：y：酸酶 150 " u及本發明之内-α - L-岩藻糖甞酶1 mU，於25 °C進 行分解反應。再者，此等反應液各成分之最終濃度，硫酸 化葡糖路酸化岩藻聚糖爲6.7毫克/毫升，牛血清白蛋白爲 〇· 1毫克/毫升，氣化鈉爲200 mM，氣化鈣50 mM ,咪唑爲 20 mM，pH調整爲6.6。結果，雖反應開始時硫酸化葡糖 酸酸化岩藻聚糖與脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之 分子量約略相等，但2日反應後之平均分子量，硫酸化葡 糖酸酸化岩藻聚糖約爲195萬，而脱乙醯化硫酸化葡糖路 酸化岩藻聚糖約爲27,000。 亦即’可確$忍若要藉由本發明之α-D -葡糖替酸酶及本 發明之内-a - L-岩藻糖荅酶以良好效率得到硫酸化葡糖醛 酸化岩藻寡聚糖’必須脱乙醯化。再者，若使實例1記載 之粗酵素及部份精製酵素作用於硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚 糖，則彳于到之暴聚糖幾乎未帶有乙醯基，又若使實例！丨（i) β己載之精製未吸著部份及精製溶出部份作用於硫酸化葡糖 醛酸化岩藻聚糖，則生成帶有乙醯基之寡聚糖，由此可推 -132-

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斷本發明之岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌SI- 1234菌株能生產 可將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之乙醯基游離之岩藻依聚 糖脱乙醯酶。 實例1 4 檢討關於岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌SI- 1234菌株生產之可 將硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之乙醯基游離之岩藻依聚糖 脱乙醯酶。 (1)岩藻依聚糖脱乙醯酶之純化 首先，確立用於測定藉實例11(1)之方法調製之本發明 岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌s I- 1234菌株之粗酵素溶液中存 在之岩藻依聚糖脱乙醯酶活性之反應系。 亦即，於100微升之50 mM咪唑-鹽酸緩衝液（pH7 5)、1〇 微升之4M氣化鈉、1微升之1M氣化鈣、40微升之1%硫酸 化葡糖趁酸化岩藻聚糖及29微升之水中添加2〇微升之岩藻 依聚糖脱乙酿酶溶液，於3 0 t反應3小時後，藉由市售之 醋酸定量用套組（F -醋酸套組，羅修代阿古語史替克斯公司 製）測定游離出來之乙醯基。其結果，平均每1毫升培養液 中本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶活性約爲2mU。 另一方法爲將寡聚糖3-(4)之還原性末端用2 -胺基吡啶螢 光標識者做爲基質，藉由以下之反應系，測定岩藻依聚糖 脱乙醯酶之活性。 反應系 75微升50mM磷酸鈉之緩衝液（pH7.5) 28.5微升水 -133- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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線 1243853 A7 _ __B7 _____ 五、發明説明（131 ) 9微升4M氣化鈉 15微升3毫克/毫升牛血清白蛋白 15微升4微微莫耳/微升寡聚糖3-(4)之螢光標識物 7.5微升岩藻依聚糖脱乙醯酶溶液 將上述所有成分混合後，於30 °C反應1小時，於100 °c處 理1 0分鐘後進行離心，將上清液以下列條件進行HPLC分 析，測定脱乙醯化量。 裝置：L - 6200型（日立製作所製） 管柱：L -管柱（4.6χ 250 mm，財團法人化學品檢查協會 製） 溶析液：含有〇·5 % 丁醇之50 mM醋酸-三乙胺緩衝液 (ρΗ5·0) 檢測：螢光檢測器F - 1150(曰立製作所製），激發波長320 ηιπ ’赏光波長4〇〇 nm。

流速：1毫升/分鐘 管柱溫度：40°C 1單位之本發明岩藻依聚糖脱乙醯酶，係指上述反應系中 於1分鐘時間將1微莫耳乙醯基鍵結切斷之酵素量。再者， 由於若將上述反應系中之乙醯基鍵結切斷，則形成與實例 5 ( 1)所得到之硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖丨_ ( 3 ) p A化物 相同之構造，因此爲確認乙驢基被切斷之基質之管柱保持 時間，使用該P A化物。被切斷之乙醯基之量係藉由下式東 得。 數學式6 -134- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐^ ^----- 1243853 A7 __—— ____B7 五、發明説明（132 ) ~ ~- DA/6〇x〇.〇 15=U/ml DA :被切斷之乙醯基之量（微莫耳） 6 〇 ··反應時間（分鐘） 0.015 :酵素液量（毫升） ^由、上述之方法測定之情況，平均每丨毫升培養液中本發 明石藻依聚糖脱乙酿酶之活性爲〇· 8 mU /毫升。 將上述之粗酵素溶液50毫升，饋入用含有i〇〇mM氣化 鋼1 〇 mM 1化#5及5mM疊氮化鈉之1〇 mM味吨_鹽酸緩衝 液（ρΗ7·5)平衡化之Sephaeryl S2〇〇 管柱（4 4 χ ι〇〇 ， 藉由相同之緩衝液溶出。以每一瓶13毫升之方式分取溶出 部份，藉由上述方法測定各部份所含有本發明岩藻依聚糖 脱乙醯酶之活性。從溶出液量算出本發明岩藻依聚糖脱乙 醯酶之分子量約爲3萬〜5萬。 收集上述之活性部份，調查本發明之岩藻依聚糖脱乙醯 δ母之性貝。其結果如圖1〜圖2所示。亦即，圖1表示最佳 ρ Η値，圖2表示最佳溫度。 如圖1所示，本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶之最佳pH値 約在6〜9.1之範圍内，最佳溫度在23〜45。〇之範圍内。 (2)使用岩藻依聚糖脱乙醯酶進行從各種岩藻依聚糖脱乙 酿基之反應 構築以下之反應系，以測定各種岩藻依聚糖含有之乙醯 基量。 在反應中使用下列表13所示之來自海藻之岩藻依聚糖。 反應系 -135- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1243853 A7 B7 五、發明説明（133 ) 60微升1%岩藻依聚糖 50微升100mM磷酸鈉之緩衝液（pH7.5) 10微升4M氣化鈉 20微升3毫克/毫升牛血清白蛋白 3 0微升水 30微升岩藻依聚糖脱乙醯酶 將上述所有成分混合後，於3 0 °C反應2 1小時，藉由上述 之醋酸定量套組測定生成之醋酸量。再者，將各個岩藻依 聚糖以1N氫氧化鈉於25 °C處理18小時，藉由上述之醋酸 定量套組測定生成之醋酸量。其結果如表1 3所示。 表1 3 海藻 使用脱乙醯酶之情況 使用氫氧化鈉之情況 沖繩海落蕩 13.6 17.2 海蘊藻 n.d. 1.74 囊狀岩蕩 0.91 15.4 結節囊葉藻 \ 0.69 7.74 加格眉昆布 1.27 4.40 眞昆布 2.00 11.3 阿拉美藻 1.70 3.77 裙帶菜雌株 2.70 30.3 黑巨藻 3.80 22.9 梨形大囊傘藻 1.46 12.9 南極杜維利藻 1.84 15.3 -136- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（134 ) 毫克·乙醯基/公克·岩藻依聚糖 n . d .:未測定 如表1 3所示，可確認本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶爲作 用於來自各種海藻之岩藻依聚糖而將乙醯基加水分解之酵 素。再者，藉由與使用氫氧化鈉進行非特異性地脱乙醯化 之情況比較，可確認本發明之岩藻依聚糖脱乙醯酶對來自 沖繩海蘊藻之岩藻依聚糖（亦即硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖） 之乙醯基具高特異性。 實例1 5 (1)本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之主要構造解析 爲決定藉由實例7調製之精製硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 部份之全構造及硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之切斷部位， 進行NMR分析。NMR分析歸屬之結果如以下所示，本發明 之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖之1 H-NMR光譜如圖3 8所 示，13C-NMR光譜如圖39所示。圖38與圖39中縱軸表示 訊號之強度，橫軸表示化學位移値（ppm)。再者，紅外線 光譜如圖40所示。圖40中縱軸表示透過率（％)，橫軸表示 波數（cm·1)。藉由1H_NMR及13C-NMR之分析結果如表14 所示。 -137- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（135 ) 表14 化學位移値(ppm) 13c-nmr ^-NMR FM 94.8 5.03 F1-2 71.0 4.10 F1-3 72.0 4.20 F1-4 69.4 5.31 F1-5 66.8 4.33 F1-6 15.4 1.01 乙醯基之ch3 20.5 2.07 乙酿基之CO 175.0 - ch3 20.5 2.07 F2-1 94.5 5.01 F2-2 67.0 3.85 F2-3 76.6 3.85 F2-4 80.0 4.63 F2-5 66.9 4.33 F2-6 16.0 1.10 F3-1 99.2 4.96 F3-2 67.0 3.80 F3-3 76.6 3.88 F3-4 80.0 4.63 F3-5 66.9 4.24 F3-6 16.0 1.10 F4-1 99.2 4.96 F4-2 67.2 3.73 F4-3 74.7 3.85 F4-4 68.7 3.95 F4-5 67.4 4.18 -138- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（136 ) 表14(續） 化學位移値(ppm) 13c_nmr ^-NMR F4-6 16.0 1.10 GA1 -1 99.6 5.18 GA1-2 71.2 3.47 GA1-3 72.4 3.63 GA1-4 71.8 3.42 GA1-5 72.6 3.87 GA1-6 177.0 - 藉由表1 4所示之歸屬，本發明之硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖，爲如下式（XV)所示，F1之岩藻糖爲π鍵結，而其 他重複5糖中F4之岩藻糖係在第3位鍵結者。再者，關於乙 醯基，可確認每重複5糖有1殘基，且主要键結於F 1岩藻糖 之第4位。亦即，可判定硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖爲具 有重覆下列所示主要骨架之構造者。 -139- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 裝 訂

1243853 A7 B7 五、發明説明（137 )

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（138 ) 產業上利用之可能性 藉由本發明可提供新穎之岩藻依聚糖脱乙醯酶、q-D-葡糖甞酸酶及内-π - L -岩藻糖甞酶，其可被用於解析硫酸 化葡糖醛酸化岩藻聚糖之構造及再現性良好地製造硫酸化 葡糖醛酸化岩藻聚糖之低分子化物。又，本發明提供該酵 素之製造方法。再者，藉由使用該酵素，可提供各種比例 脱乙醯化之脱乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖、各種比 例脱葡糖醛酸化之脱乙醯化脱葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸 化岩藻聚糖及硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖，彼等可做爲 糖鏈工學用試藥。再者，提供能使該酵素使用效率良好之 添加物。再者，提供生產能分解來自各種褐藻類之硫酸化 多糖之酵素之微生物。 序列表 SEQ ID NO: 1 :被設計用於擴增16S rDNA區之寡核苷酸引 子。 SEQ ID N0:2 :被設計用於擴增16S rDNA區之寡核甞酸引 子。 -141 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

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1243853 A7 B7 五、發明説明（139 ) 序列表 <110>塔卡拉徐州公司 <120>硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖 <130> <150>JP 2000-186346 <151〉2000-06-21 <160>3 <2101 <211>20 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223〉被設計用於擴增16S rDNA區之寡核甞酸引子。 <400〉 1 agagtttgat cctggctcag <210〉2 <211>19

<212〉DNA -142- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A7 B7 五、發明説明（14〇 ) <213〉人造序列 <220> <223>被設計用於擴增16S rDNA區之寡核苷酸引子 <400〉2 ggctaccttg ttacgactt <210>3 <211>1535

<212>DNA <213>岩藻依聚糖分解嗜岩藻菌SI-1234菌株 <400〉3 gagattcttt gtattgaagc 60 taacacgtga gcaatctgcc 120 ggaLgtgata cgccaactca 180 gctcgcggcc tatcagcttg 240 ggtctgagag gatgatcagc 300 cagcagtttc gaatcattca 360 tgaaggcctt cgggtcgtaa 420 ccctgagtta acctggagag 480 ggagactgca agcgttactc 540 gtcaggtgtg aaatctcggg 600 tattggaggg gtaagcggaa 660 agtgaacgct ctcggtggat ctaaagatcg tgttggtagt ttggtgaggt cacactggaa caatgggggc acctctgtca gaagcagtgg ggattcactg gctcaacctc ggcggcgtgg ttataaagat gaatagctcg attaaagcU aaaggctcac ctgagacacg aaccctgatg ccagggagca ctaactccgt ggcgtaaagg gaaactgcgc ttaagacatg gaaagtggca aggaaactcg gtaatggcgc caaggcaaag gtccagacac gtgcaacgcc acaagcaggt gccagcagcc gtgcgtaggc ctgaaactgt caagtcgaac aacgggtgcg aatLaatgcc tttaggagga acgggtagct ctacgggtgg gcgtgaggga tcatagcctg gcggtaatac ggatagatgt ctatctagag -143- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1243853 A7 B7 五、發明説明（141 ) tttctggtgt agcggtgaaa tgcgtagata tcagaaggaa caccaatggc gaaggcagct 720 tactggacaa atactgacgc Lgaggcacga aagcatgggt agcgaaaggg attagatacc 780 cctgtagtcc atgccgtaaa cgttgcacac taggtcttgg gggtttcgac cctttcagga 840 ccccagctaa cgcgataagt gtgccgcctg aggactacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa 960 gaaccttacc taggcttgac atgtaatgga cgattttcag agatgaattt ttcccttcgg 1020 ggctgttaca caggtgctgc atggccgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg tttggttaag 1080 tccagcaacg agcgcaaccc tcgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg ggactctaag 1140 gagacaaact ctcLttgaga gLgggaaggt ggggatgacg tcaggtcagt atggccctta 1200 cgcctagggc tacacacgtg ctacaatgcc cggtacaata ggacgcaata ccgcgaggtg 1260 gagcaaatcc tcaaaaccgg gcccagttcg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag 1320 tcggaatcgc tagtaatgac gtatcagcta tgacgtcgtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc cgtcacatca tgaaagccgg ttttgcccga agtacgtgag ctatccctcg 1440 ggaggcagcg tcctaaggca gggctggLga ttgggatg 1478 -144- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）

Claims (1)

1. 申請專利範圍

   •-種岩藻依聚糖脫乙醯酶’其特徵為具有下列物理化學 性質： ⑴作用於硫g复化葡糖路酸化岩蒸聚糖及硫gt化葡糖酿 酸化岩藤寡聚糖’而將乙醯基加水分解，使醋酸游離； (Π)最佳p Η值為約6〜9 · 1之範圍； (ΠΙ)最佳溫度在約23〜45t：之範圍内。 種a - D -葡糖$•酸酶，其特徵為具有下列物理化學性 質： (I) 作用於脫乙醯化硫酸化葡糠醛酸化岩藻聚糖及脫乙 醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻募聚糖，而將a_D-葡糠醛酸 基鍵結加水分解，使D-葡糖醛酸游離； (II) 最佳p Η值為約5 · 8〜7 · 8之範圍 (in)最佳溫度在約14〜29c之範圍。 3 · —種内_ a _ L -岩藻糖智:酶，其特徵為具有下列物理化學 性質： (I)作用於脫乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖及脫乙 醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻募聚糖，而將^ - L—岩藻糠基 内向式加水分解’生成在還原性末端具有L _岩藻糖之募 聚糖； (Π)最佳pH值為約4.5〜7.5之範圍； (III) 最佳溫度在約2 3〜4 2 °C之範圍内。 4 · 一種製造申請專利範圍第1項之岩藻依聚糖脫乙醯酶之方 法’其特徵為培養具有該酵素生產能力之微生物，再從 其培養物取得該酵素。 本紙張尺麟财關緖準(CNS)域格_χ 297公g 1243853 丨· •、申請專利範圍 5.:種：造申請專利範圍第2項之“ _ 法，其特徵為培養且右兮觖主 W捃甘之方 其培養物取得該酵素。 俽玍物再從 6· 一種製造申請專利範圍第3項之内_ ” 法，其特徵為培養具有㈣“ “糖甘蛛之方 其培養物取得該酵素。’、月匕力之微生物，再從 7· -種脫乙醯化硫酸化葡糖駿酸化岩藻聚糖之製造方法， 其特徵為使申請專利範圍第1項之岩藻依聚糖脫乙醯酶作 用於硫酸化葡糖酸酸化岩藻聚糖，以取得除去至少ι分子 以上乙醯基之脫乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 8·=申5月專利靶圍第7項之脫乙酿化硫酸化葡糖醛酸化岩藻 聚糖之製這方法，其特徵為在氯化鈉、鈣鹽及/或蛋白質 共存下進行。 、 9. 一種脫乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖或其鹽，其係 藉由申請專利範圍第7項之方法得到。 1〇#種脫乙醯化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 之製造方法，其特徵為使申請專利範圍第2項之α _D_葡 糖4酸S學作用於脫乙醯化硫酸化葡糖駿酸化岩藻聚糖， 以取得除去至少1分子以上葡糖醛酸殘基之脫乙醯化脫葡 糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖。 11·如申請專利範圍第1 〇項之脫乙醯化脫葡糖醛酸化硫酸化 葡糖醛酸化岩藻聚糖之製造方法，其特徵為在氯化鈉、 妈鹽及/或蛋白質共存下進行。 12. —種脫乙醯化脫葡糖醛酸化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖 2 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公董） 1243853

   或其鹽，其係藉由申請專利範圍第丨〇或丨丨項之方法得 到。 13· —種硫酸化葡糖醛酸化岩藻募聚糖之製造方法，其特徵 為使岩藻依聚糖脫乙醯酶、α _ D -葡糖茹酸酶及内· α l _ 岩藻糠茹酶作用於硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖而取得硫 酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖。 14. 一種硫酸化葡糖醛酸化岩藻募聚糖之製造方法，其特徵 為使a - D-葡糖:y：酸酶及内_ α .^岩藻糖甞酶作用於經鹼 處理之脫乙醯化硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖而取得硫酸 化葡糖醛酸化岩藻募聚糖。 15·如申研專利範圍第^ 3或丨4項之硫酸化葡糖酸酸化岩藻募 I糖之製造方法’其特徵為可在氣化納、I弓鹽及/或蛋白 質共存下進行。 16· —種硫酸化葡糖醛酸化岩藻寡聚糖或其鹽，其係藉由申 請專利範圍第1 3〜1 5項中任何一項之方法得到。 17· 一種具有從下列通式（I)〜（m)選出之化學結構之糖化合 物或其鹽： -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 六、申請專利範圍 *

   〇 I_

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 申請專利範園 I~~I ►—I

   X X

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1243853 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 〔I 二；I

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 43 2 3 5 8 8 8 8 8 A BCD 、申請專利範圍 (式中，R為Η ’ SO3H或CH3CO，以及η為〇以上之整數） 18· —種硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖或其鹽，其特徵為具有 下列物理化學性質： (1) 構成糖：含有岩藻糖及葡糖醛酸，其莫耳比為 3 5 〜4 4 ·· 1 0， (2) 以下列通式（V111)表示之硫酸化糠做為構成糖之必 需成分者· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1243853 A8 B8 C8 D8 申請專利範園

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A B c D 1243853 々、申請專利範圍 (式中，R 為 Η，S03H 或 CH3CO)。 19.如申請專利範圍第1 8項之硫酸化葡糖醛酸化岩藻聚糖， 其特徵為該η在1〜5000之範圍内。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）