TW528599B - Stimulation of host defense mechanisms against viral challenges - Google Patents

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528599 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（j ) 本發明係關於在哺乳類宿主藉由經口腔黏膜施用干擾 素來剌激宿主防禦機制對抗病原條件的方法。特別是本發 明可應用至自體免疫，分枝稈菌，神經壞死，寄生蟲性和 病毒性疾病的處理方法。 λ 發明背景 干擾素一 ot (IFN — α)廣泛地被用於許多病症的 處理包括白血病，淋巴癌，A I D S —相關的卡波西氏肉 瘤，和肝炎。（Gutterman， J . U. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994 91 : 1198 -1205)。干擾素一/3 (I FN — /3 )被認可臨床使用於復發一緩和多重硬化和B型肝炎病 毒的慢性感染的處理。雖然一些施用途徑，包括靜脈注射 ，皮下注射，肌肉注射，局部注射，和傷口內注射，通常 被用來施用第一型的干擾素，口服途徑選未被一般性地使 用，因為千擾素是蛋白質，其被認為會被蛋白質分解酵素 m 所不活化，且其在腸胃道内無法Μ他們原始形式被適當地 吸收。（ Cantell and Pyhala, J. Gen. Virol., 1973 2 0 : 9 7 - 1 0 4 ； Wills 等人，J· IFN Res. , 1 9 8 4 4： 3 9 9 - 4 0 9 ; Gilson 等人，J. IF N Res., 1985 5:403-408 )0 曾顯示干擾素的誘導者能夠保護老鼠以對抗的瘧原蟲 (Plasmodium berghei malaria)實驗性感染，且此種保護 作用對抗子孢子引起的感染比對抗此寄生蟲的血液形式所 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 _ B7 五、發明説明（y) 引起的感染更加有效（Jahiel等人，Science, 1986 16: 1S02 ； Nature , 1 9 6 8 2 2 0 : 7 1 0; Anier . J . T r ο p . Med .

Hyg·， 1 9 6 9 1 8: 8 2 3 ) 。M腹腔注射或靜脈注射含干擾素 之紐加塞疾病病毒（N e w c a s 11 e d i s e a s e v i r u s )感染的老鼠 血清的老鼠會被保護K對抗子孢子引起的瘧原蟲瘧疾。但 •λ 是，來自兔子血清的干擾素則沒有效果。當干擾素是在此 寄生蟲發育的前紅血球時期之間（例如接種子孢子前三小 時或是接種後約40小時〔Jahiel 等人，Nature 1970 2 2 7 : 1 3 5 0 - 1 3 5 1〕）被注射入可獲得到保護作用。 曾經有過一些低劑量干擾素Μ鼻腔噴灑或當作口服液 體配方的施用法用在一些病毒性條件，特別是流行性感冒 的處理之效果的軼事報導。但是，在大多數這些報告中所 使用的千擾素製備均相當粗糙。高劑量鼻腔内干擾素處理 鼻病毒（rhinov.irus)的感染之安慰劑—控制（Placebo-controlled) 試驗顯示此種處理是有效的，但是有相當的 副作用發生率（Hayden 等人，J. Infect· Dis·，1983 1 4 8 : 9 1 4 - 3 2 1 )。相同地，雖然一些研究包括兩種隨機雙 重隱瞞（double-blind)臨床試驗（Douglas等人，New Engl. J· Med., 1986 314: 65-80; Hayden 等人，New Engl. J. Med.，1 9 8 6 3 1 4 : 7 1 - 7 5 )已經顯示經鼻施用高劑 量重組的cx 2在保護暴露的物體對抗鼻病毒感染的效果，這 些研究沒有提供一系統性效果的證明。 最近一系列的專利說明書描述低劑量口服施用異源性 ~ ^ — 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 528599 A7 B7 五、發明説明（汐） 種類的干擾素的使用於牛的感染性鼻氣管炎（i n f e c t i 〇 u s rhinotrachetitis)(shipping fever),和貓科的白血病貧 血的處理，M及其他條件下的處理，為了增進疫苗的效率 ;為了增加食物利用的效率；以及為了避免牛科的泰勒氏 蟲病（t h e i 1 e 1? i 〇 s i s )。分別見美國專利申請案件編號4， ♦ 4 6 2，9 8 5 ,澳洲專利申請案件編號6 0 8 5 1 9， 澳洲專利申請案件編號5 8 3 3 3 2和美國專利申請寨件 編號5，215，741 。在這些專利說明書中，所使用 的干擾素是藉由C ant e 11的方法製備出來的人類干擾素α ,在磷酸緩衝生理食鹽溶液内，Κ體重每磅0 · 0 1至5 I U的劑量被施用。這些專利說明書建議如此低劑量干擾 素施用於口咽黏膜最好是在一適應長期與口腔黏膜接觸的 形式，才足夠對於相當多條件的處理有效果，對於牛科鼻 氣管炎，貓科白血病貧血，犬科小病毒和泰勒氐蟲病Κ外 條件之實驗證明大部份只是軼事。 m 對於非常低劑量藉由口腔或口咽黏膜施用干擾素之效 果的更近研究已經被檢閱（ B 〇 c c i，C 1 i η . Pharmacokinet. , 19 9 1 21: 4 11-417 ; Critic. Rev.

The rap· Drug Carrier Systems, 1 9 9 2 9 : 9 1 - 1 3 3 ;

Cummins and Georgiades, Archivum I m in u n . Ther ap . Exp. , 1 9 9 3 4 1 : 1 6 9 - 1 7 2 )。其建議此種形式的處理對於 Η I V感染的處理特別有效，且至少可K增進A I DS病 人生活的品質（Kaiser 等人，AIDS， 1992 6: 563-569; -5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項

頁 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 B7 五、發明説明（‘）

Koech 等人，Mol· Biol· Ther·， 1990， 2: 9卜95)。但 是，其他的報導顯示如此的處理沒提供任何臨床上的肋益 。一使用包含低劑量干擾素的口服錠劑以處理B型肝炎的 第一期（Phase I)研究也有被報導（Zielinska等人，

Ar c h i v . Immunol . Therap. Exp·，1 9 9 3 4 1: 2 4 1 - 2 5 2 ) 〇 相反地，由Brigham and Women’s醫院所提出的國際專 利申請案件編號WO 9 5/2 74 9 9顯示藉由胃管插入 法（gastric i n t u b a t i ο η)施用的干擾素/3 ,如果在誘導 抗原之前給予，至少能部份抑制自體免疫疾病例如第一型 糖尿病和自體免疫關節炎在相當已知的動物模式內發生。 藉由此途徑或是腹腔内注射途徑，所給予的連接上胃内 ” by st and er”抗原的干擾素点在誘發耐受性上是更有效的。 此表示干擾素；S對於口腔耐受性誘發的增進比起誘發對於 外來抗原之體液性或細胞性反應是更有效果的。 發明總論 本發明提供一種在哺乳類動物經由一種干擾素之口腔 黏膜施用K剌激宿主防禦機制的方法。在一層面上，此發 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 入 入分施量 用 用，所的 施 施疫。應 觸 膜免法反 接。黏體方理 膜法腔自的病 黏方口理病起 腔的經處疾引 口應由以性用 經反藉素毒施 由疫内擾病道 藉免體干和胃 物激物的性腸6-動剌動量蟲非 * 類以乳療生經 乳素哺治寄當 哺擾在效 ，起 一干一有死比 在的供一壞量 是量提 内經的 為激明物神素 認剌發動 ，擾 被疫此乳菌干 可免 .哺稈的 明一 此枝用 本紙悵尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 528599 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（f) 要少。本發明提供處理自體免疫例如關節炎，糖尿病，狼 瘡和多重硬化，分枝桿菌疾病.例如麻瘋和·结核病，神經 壞死症，例如腦炎和Creutzfeldt_Jakob症，寄生蟲性疾病 ，例如瘧疾，K及病毒性疾病，例如子宫頸癌，生殖器疱 疹，B型和C型肝炎，Η I V , Η P V和H S V — 1和2 Λ 0 口腔黏膜施用包括在一翬一劑量施用一有效劑量的干 擾素或是此有效劑量乃在一足Κ引起宿主相同於單一劑量 的防禦剌激時間的期間內Μ多次較少劑量施用。同樣地， 此干擾素的有效劑量能持續地施用在一足Κ引起宿主相同 於簞一劑量之防禦剌激的一段期間時間內。 此方法可藉由每天施用從約1 5 Ο Ο I U，最好是 5 0 0 0 I U至約2 0 X 1 0 6 I U的干擾素，更好是 每天從約1乂104111至約20乂106111的干擾素 J最好是從每天約1 X 1 0 4至約1 X 1 0 6 I U的干擾 素來實行，此選出的劑量當非經腸胃道施用時不會引發病 理反應。 在另一個具體事實，本發明提供一為了 口腔黏膜施用 製藥組成物，其包括至少一種治療有效量的干擾素。此組 成可Μ溶液，藥片，錠劑，膠體，糖漿，軟罾，或是控制 釋放的口腔黏膜傳送系統來提供。隨意地，此組成可以包 含媛衝液，穩定劑，增稠劑，吸收和黏度增加劑以及相似 的東西。 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再蹲寫本頁) 睡衣· 、1Τ

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 Α7 Β7 五、發明説明（^) 在一具體事實，此製藥組成物是以單位劑量來提供的 從約1 5 ο ο I U ,最好5〇Ο ο I u ,至約2 0 X 1 〇 6 I u的干擾素，更好是從約i X 1 〇 4 I u至約2 ΟΧΙΟ6 I U的干擾素，最好是從約1 X 1 0 4至約1 X 1 〇 6 I U的干擾素。

A 此方法可當作單一的治療步驟或是當作其他治療的附 加物，或是與其他细胞素，例如白介素一 2 , 1 2，或1 5,與IFN —誘發物一起施用。

此方法是使用一種第I型或第I I型的千擾素，選自 α，Θ，7 , ω ,和相同一致的干擾素，最好是用重組I F Ν — α 〇 發明詳述 本發明琨在將Κ參考文獻方式只使用Μ下的定義和實 例詳细描述。所有在此所指的專利案件和出版品均Κ參考 文獻來併入本案。 定義 如在此所使用的，“干擾素”指的是一種第I型或第 I I型的干擾素，包括那些通常被命名為α , Θ ，7和ω ,Κ及他們的混合物，包括相同一致的序列。干擾素可自 許多商業上的來源獲得且被同意可治療許多徵候。此干擾 素可來自自然來源，但是最好是一重組產物。為了本發明 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再辑馬本頁) 、1Τ

J 528599 A7 B7 五、發明説明 的目的，此詞“干擾素”也包括有干擾素活性的多肽和他 們的片段，K及干擾素之鑲嵌或突變形式其有引入序列的 修飾，例如K增加穩定性.而不會影響到他們生物活性的 本質，例如揭露於美國專利編號5，5 8 2，8 2 4，5 ，593，667,5，594，1〇7〇 雖然將可清楚地明白本發明可應用至任何病理條件， 其中剌激宿主防禦機制或免疫性剌激是有益處的，但偏好 的病理條件是一種自體免疫疾病或是一種病毒性或寄生蟲 慼染症。亦將瞭解的是，為了本發明的目的此干擾素可單 獨使用或是與其他試劑或處理一起使用。 此干擾素可隨意地與干擾素合成或釋放的誘發物一同 施用。此誘發物可與干擾素一起施用或是個別施用。已知 有許多干擾素的誘發物，例如多核苷酸如p ο 1 y I : C ;最好使用低分子量，口服可接受的干擾素誘發物。在此 g藝中有已知的適當誘發物，例如Ti lor one (美國申請專 利寨件編號 3 5 9 2 8 1 9 ; A 1 b e c h t 等人，J · Med. Chem. 1974 Π : 1150-1156) M 及喹諾嗣（quinolone)的 衍生物 Imiquimod (Savage 等人；Brit· J. Cancer, 1996 74: 1482-1486) 〇 本發明的方法及組成為了特定的條件可隨機地與一種 或更多其他處理结合使用，且參與的醫生或獸翳師將容易 地能夠選擇此其他的處理其在此情況下是適當的。 病毒性的條件可能為急性或猛爆性的感染，例如鼻病 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Α4規格（210X 297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項

ψί 頁I 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 B7 五、發明説明（多） 請 kj 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 毒，流行性感冒病毒，水痘疱疹，帶狀疱疹，登革熱，或 是病毒性腦炎包括但不限制於麻疹病毒腦炎，摩瑞谷（ Murray Valley)腦炎，日本B型腦炎，由II傳染的腦炎K 及疱疹腦炎；出血熱例如艾柏拉（Ebola)病毒，馬柏格（ Marburg)病毒，拉撒（Lassa)熱；漢他（Hanta)病毒感 染症，Μ及其他被認為經由動物傳染到人類的病毒感染症 ，例如馬的麻疹病毒。在這些條件中有許多目前沒有處理 方式或疫苗可供利用，且支持性的處理可能不適合。另外 病毒性絛件可能為慢性感染的结果，例如Β型肝炎，C型 肝炎，D型肝炎或病毒性肝炎的其他形式，以及C Μ V， HIV , HPV和HSVI及I I感染症。Β型肝炎和C 型肝炎兩者現今均以非經腸胃道的干擾素來處理；在會導 致A I DS的Η I V感染症長期處理干擾素目前是在臨床 試驗階段。 在第二個具體事實，被處理的疾病是瘧疾，且第I型 齡 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 或第II型的干擾素再一次如上所述被施用。瘧疾的备 鼻體可能為四日熱瘧原蟲（Plasmodium malariae)，三日 熱瘧原蟲（Plasmodium vivax),熱帶熱瘧原蟲（ P 1 asmodiuin falciparum)或是卵型瘧原蟲（Plasmodium 〇 v a 1 e )。本發明的方法特別被預期將避免瘧疾侵襲到大腦 模式。 • 在第三個具體事實，本發明提供一處理自體免疫不全 ，例如Η I V ，風濕性關節炎，和多重硬化，的方法，不 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528599 A7 _B7___ 五、發明説明（/ ) 論復發-緩和或是慢性發展形式均包括施用如上所述的一 種干擾素的步驟。 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 本發明的方法和劑量形式也可K與其他的處理一起使 用。例如，對於疱疹病毒感染可以使用無環腺苷 (acyclovir)或無環鳥苦（ganciclovir)。對於 Η I V 感染 可Κ 使用疊氮胸苷（azido thymidine (zidovudine))或是 一種或多種Η I V反轉錄酶抑制劑，K及/或Η I V蛋白 酶抑制劑。 在製備本發明的製藥組成，可以使用I F N的許多載 劑 （vehicles)和賦形劑（excipients),且對於已有技藝的 技術人員將會更顯而易見。代表性配方技術在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed·， Mack Publishing Co·, East, on, PA, 1395，K 及他之前的 版本内有教導。.1 F N的配方可能包括穩定性增進劑，例 $甘胺酸和丙胺酸，如在美國專利案件編號4，4 9 6， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 5 3 7中所描述，和/或一或多種載劑，例如一載劑蛋白 質。例如，對於處理人類製藥級的人類血清白蛋白，隨機 地會K磷酸緩衝液生理食鹽水當作稀釋液，是通常被使用 的。對於I F N的輔藥為人類血清白蛋白時，此人類血清 白蛋白可衍生自人類血清或是一重組的來源。一般當血清 白蛋白被使用時它將是相同的來源。 I F N可藉由可提供此I F N與接受者口腔黏膜腔接 觸的任何方法來被施用。因此可清楚地了解本發明並不被 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 528599 A7 B7 五、發明説明（P ) 限制在任一配方的特殊形式。本專利說明書描述I F N深 入口腔黏膜腔的施用法；此可用液體，固體，或是液化氣 體，K及鼻滴液或是噴劑來達成。因此本發明包括，但不 限制在，液體，噴劑，糖漿，甘味藥片（lozenges) , 口腔 藥片（buccal tablets),和噴霧劑配方。在此技藝中熟練 的人將知道對於液態氣體或是噴霧器配方所製備的顆粒大 小是重要的，且將意識到藉由適當的方法可以修飾顆粒的 大小。 在一層面而言，干擾素是K單一劑量被施用的。另外 ，干擾素是K多次低劑量方式被施用的，所以此淨效果相 等於翬一高劑量的施用。此種傳送模式的一個方法是藉由 一持續或受控制的釋放裝置黏接至或是接入口腔黏膜腔一 定量供應且設計為在一時段Μ相等於單一高劑量的量釋放 干擾素。 ^ 對於口腔黏膜所使用的干擾素代表性配方包括Κ下（所 有％均為w / w ): 藥片：葡萄糖ΒΡ 45%;動物膠ΒΡ 3 0%； 小麥澱粉 BP 1 1 % ί Carmellose sodium BP 5 % ;蛋白蛋白BCP 4%;白胺酸USP 3%;丙二醇 BP 2%;和106 I U IFN — α2°此藥片可以 使用且使之慢慢地在口中溶解或可在水中溶解在視需要食 入口中0 一干擾素糊狀物可如美國專利編號4，6 7 5，1 8 -1 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 賣 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 B7 五、發明説明（丨/) 4 ,所述，由甘油45%，鈉CMC 2，棒檬酸媛衝液 (p Η 4 * 5 ) 25%,蒸餾水加至100%，Μ及1 06 IU IFN - 〇(2。此干擾素糊狀物可被黏附至口 腔黏膜腔。 同樣地，一漱口劑或是糖漿可以藉由加入想要的干擾 λ 素的量來製備成為商業上可得到的漱口或感冒糖漿配方。 在如上的專一劑量範圍内，對於任何個體適當的處理 決定於所關心之條件的本質，疾病的階段，之前的治療； 其他持續性的治療，此哺乳動物的一般健康狀態，此生物 體對於干擾素的敏感性，等等，因此將由熟知所有狀況之 醫師或獸翳師自行斟酌。處理的時間長短同樣地也依所處 理的條件不同而不同，例如，一急性感染的處理，如艾柏 拉（Ebola)病毒，將預期包含一不同於慢性疚泰，例如肝 炎，處理法的處理方式。 在此揭露的有效劑量是當K非經腸道施用時在哺乳動 物體内不會產生病理的反應。病理的反應可能為急性的， 慢性的或是累積的，且可能藉由血液化學的改變而顯示出 ，例如白血球減少症，骨髓凹陷，或其他組織的變數。如 在此所使用的^病理反應包括不利的副作用，例如發熱， 不適或似流行性感冒的徵狀，血管的反應，例如靜脈炎（ Phlebitis) ，Μ及在注射部位局部的發炎反應。如此的反 應視個體對於對干擾素的敏感性不同在病人群體中將會相 當地不同。定義一對於口腔黏膜治療可接受的低劑量干擾 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 背 ιέ 之 注 意 事 項 再 舄 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（/>) 素之簡單試驗是注射根據考量其年龄，體重，徵候，病程 發展等等推定的可接受劑量於病人體内，並探知是否此注 射產生如此處所定義的病理反應，於注射部位有局部的剌 激為最容易探知的判斷標準。如果沒有不利的副作用顯示 ，此相同的劑量可K K 口腔黏膜方式施用。如果有一不想 Λ 要的反應，則此過程將以一較低的劑量重複，直到找到沒 有病理反應的劑量為止。 對於許多病人，可預期的是口腔黏膜劑量將與那些在 已知在現存認可的非經腸道步驟相當耐受且有用的劑量大 約相同。因此，為了專一性的目的，一可接受的低劑量千 擾素可能從大約1500 IU,最好是5.0 00 I U ，到約2 0 X 1 0 6 I U的干擾素。更好的是此劑量從約 1 X 1 0 4 IU至約20Χ106 IU的干擾素，最好是 從約1 X 1 0 4 I U到約1 X 1 0 6 I U的干擾素，所提 供的此劑量是當Κ非經腸道施用時不會引發病理反應的。 m 在一具體事實，總劑量可K多次低劑量於一段時間內施用 ,或是可Μ持續的傳送或K 一脈動形式由一受控制的釋放 裝置連接至或插入口腔黏膜中。 干.擾素及干擾素配方 老鼠I F Ν — α /厶 老鼠 IFN — α/召（Mu IFN — cx/>S)由培 -14- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·#衣. 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 B7 五、發明説明（0 ) 養的C 2 4 3 — 3细胞用紐加塞疾病病毒（Newcastle disease virus ) (NDV)引發來製備且如先前所描述 來純化（ Tovey 等人， Proc· Soc. Exp. Biol, and Med. , 1 9 7 4 1 4 6: 8 0 9 -815 )。使用於此研究的製備法可 達效價4 X 1 0 6國際簞位（I U )/毫升以及專一活性 5 X 1 0 7 IU/毫克的蛋白質如之前所描述在老鼠92 9 細胞用泡狀口炎（Vesicular stomatitis virus (VS V ))感染的分析法（Tovey 等人，Proc. Soc. Exp· Biol . and Med·，1 9 7 4 1 46: 8 0 9 - 8 1 5 )。此製備法是針 葑國家健康機構（NIH)的老鼠I‘FN — cx//3之國際 參考製備法（G — 0 0 2 — 9 0 0 4 — 5 4 1 1 )所標準 化的。 人類 I FN — α.1 — 8 重組的人類 I F Ν —（X 1 — 8 (Hu I F N ex 1 — 8 ； B D B B lot no· CGP 3 5 2 6 9 - 1 ，Ciba-Geigy，Basel, Switzerland)如之前所述來製 備 M 及純化（M e i s t. e r 等人，J · G e η · V i r ο 1 ·，1 9 8 6 6 7 : 1 6 3 3 - 1 6 4 3 )。在本研究所使用的製備在同源的人類W I S Η细胞如前所述（Tovey 等人，Nature， 1 9 7 7 2 6 7 : 455 - 457) KV SV感染時有一效價70x 1〇6 I U /毫 升，且在異源的老鼠L 9 2 9细胞有效價1 X 1〇6 I U /毫升。此製備法是針對N I Η的人類I F N — α國際參 - 1 5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 528599 A7 B7 五、發明説明 考製備法（G — 023 — 901 — 527)和ΝΙΗ老鼠 IFN — a/ 厶（G — 0〇 2 — 90 0 4 — 541 1)所 標準化的。此所製備的I F N的專一活性是2 X 1 0 8 I U /每毫克蛋白質。 重組的老鼠干擾素召 重組的老鼠千擾素/3由R&D System Inc.所販售。 使用於此研究（lot no. 1976-Q1S)的製備法可達效價3 • 2xl04國際單位（IU) /毫升以及專一活性8x 1 0 6 IU /每毫克蛋白質，如在老鼠L929细胞用V SV感染的分析法（ Tovey 等人，Proc· S o c . Exp. Biol . Med. 5 1 9 7 4^ 1 4 6 : 4 0 6 - 4 1 5 ) 〇 重組的老鼠干擾素7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 重組的老鼠干擾素7由R&D System Inc.所販售。 使用於此研究（2 5 8 0-G3SA)的製備法可達效價2 X 1 0 5 I U/毫升K及專一活性1 X 1 07 I U /每毫克蛋白質 ，如在老鼠L 9 2 9细胞用V S V感染的分析法（Tovey 等人，Proc· Soc· Exp· Biol· Med·，1974 146: 406-415 )° 所有的干擾素製備法均自動地K相同的分析法來測效 價且針對美國國家健康機構的老鼠干擾素(G —〇 〇2 — 9 0 0 4 — 5 4 1 1 )的國際參考製備法來標準化 -1 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 _ 五、發明説明（ Ο 老鼠干擾素CX / Θ和重組的老鼠干擾素兩者均於施用 之前放入Ferimmune賦形劑內。 輔藥

干擾素製備物K磷酸緩衝生理食鹽溶液（P B S )包 含牛血清白蛋白（BSA)來稀釋。牛血清白蛋白Μ段V (RIA级；無免疫球蛋白；Cat No · A 7 8 8 8 ; S i gma ; USA) Μ最終濃度100微克/每毫 升溶於P B S ( p Η 7 · 4 )内且K過濾法滅菌（0 ♦ 2 微米1 lex - GV，Mi 1 1 ir>ore，US A ) 0 在此所描述的實驗干擾素製備物是稀釋於一有專利的 輔藥內。所使用的輔藥如下，K藥片的形式提供（ Ferimiflune , Pharma Pacific)： (請先閱讀背面之注意事項再倒寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 % w / W 毫克/藥片 葡萄糖 B P « 4 4 ♦ 6 7 *求木 5 5*84 動物膠 B P * * 3 0-06 3 7*58 小麥澱粉 B P « 11*31 14*14 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 528599

7 B 五、發明説明（丨心） 鈉 B P ** 4 ♦ 9 6 6*20 蛋白蛋白 B C P ** 4 ·〇3 5*04 白胺酸 U S P 3 ·〇〇 3*75 丙二醇 B P 1 · 8 8 2*35 聚葡萄糖4 0 ^ 0*06 〇，0 8 磷酸鈉 B P 0 ♦〇3 0*04 氯化鈉 B P 0*01 〇，〇1 m 酸性磷酸鈉 B P 〇♦〇1 〇·〇1 總量 10 0*02 12 5*04 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 κ無水基礎計算 * * *衍生自·· 葡萄糖（G 1 u c ◦ s e ) B P (無水的） 4 4.6 4 ¾ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528599 A7 B7

干擾素傳送系 先前的實 升的结晶紫加 使得染劑分布 〇分鐘之後仍 F N - α 1 -施用的方法因 為了描述 地了解“鼻腔 m 是“鼻腔口腔 的表琨參考I 五、發明説明（1 ) 葡萄糖BP (如聚葡萄糖40注射BP) 0.03¾ 單一藥片是溶解於1 · 5毫升磷酸媛衝生理食鹽溶液 .Μ 1 6，〇 〇 〇 g離心1 5分鐘，之後以過濾法滅菌 (0 ‘ 2 微米，Millex-GV，Millipore, USA)，並於使用 之刖儲存於4 °C。輔藥則於每天使用之前製備。 統 驗顯示KP2 0Eppendrof 微量吸管將5微 於正常成鼠的每一個鼻孔內结果幾乎馬上會 於整個口咽腔。口咽腔的染色於施用染劑3 然很明顯。使用1 2 5 I標示的重組人類I 8應用於相同的方式會得到相似的结果。此 此被使用於所有隨後的實驗中。 於本專利說明書之動物實驗的目的，將清楚 內/ 口腔内”或是“鼻腔内加上口腔内”或 (in/or)”或是“ 口腔黏膜”或是“口咽腔” FN施用的途徑，會被成為I FN製備物深 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 也膜 ’黏 内的 腔腔 咽此 口於 入襯 布與 分可 地此 速如 快 ’ 會喉 他咽 此和 如口 法物 用動 施乳 均哺 平的 的受 腔接。 鼻是㈣· 入就接 物 動. 種 原 病 無 1 專 由 是 鼠 老 的 究 研 本 於 用 使

A F F 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210 X 297公釐） 528599 A7 B7 五、發明説明（I幺） C R E D〇，f r a n c e )所得到的。他們根據E E C 標準居住在 Villejuif的 Institut Federatif CNRS之一專 門無病原的動物房内。 干擾素生物分析 a

干擾素是根據一傳統的方法來分析的。簡言之，樣品 (2 0微升）稀釋於包含2 %經熱不活化之胎牛血清（F CS) (Gibco， France)的 8 0 微升 Eagle’s Minimal Essential Medium (MEM)(Gibco，France)内並 K 一多管道 的微量吸管（Finnpipette， Labsystem, 50-30G 微升）加 至一微量培養皿內的每個孔內 （Falcon，cat no. 3072)。 WISH或是L929细胞（2xl04细胞/每孔）加 於包含2 % F C S的1 0 0微升Μ E Μ内並於3 7 °C ,在 含5%C0z的大氣壓下（Forma 3029 CO 2培養箱）培養隔夜。之後细胞便K配置1 0 X物鏡之 Olympus I M G L· D W倒立顯微鏡檢視任何毒性的症狀。沒有 呈現出可偵測到之毒性的樣品便進一步進行一糸列的兩倍 稀釋而以起始1 : 1 0稀釋於總量2 0 0微升含有2 % F

CS的Eagle’ s MEM内，藉由Μ多管道微量吸 管吸取先前的1 〇 〇微升稀釋的物質，放入每孔内含有1 〇〇微升新鮮的含2 % F C S之E a g丨e ' s MEM 的微量培養盤内° N I H人類I F N — α參考標準（G — 〇2 3 — 9〇1一527)或是1\(114 Mu I F N - -20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） 請 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 寫 本 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___ _ B7五、發明説明（\ f ) α/Z?參考標準（G — 002 — 9004 — 541 1)的 適當系列兩倍稀釋液也準備好。在1 〇 〇微升含2 % F C S的Eagle’ s MEM内的WISH或是L929 细胞（2x 1 〇4细胞/每孔）之後便加入每一盤内適當 地於3 7 Ό含5 % C 0 2大氣壓下培養隔夜。之後便檢視 m n纟田胞是5有任何毒性症狀，若沒有任何明顯的毒性， 則此培養便抽出並Κ 200微升含290FCSK及1〇〇 丁CID50的VSV(對於WISH细胞是2xl〇- 4 V S V 2 3 ，或是對於L929细胞是1〇-5VSV 23)之Eagle， s MEM取代。之後此盤在於3 7°C含5%C02大氣壓之下培養隔夜。之後此單層細胞 M Olympus IM ULWD倒立顯微鏡檢視專一性的病毒细胞病 理變化。干擾素的效價由針對專一性病毒细胞病理變化有 5 0 %保護作用的稀釋濃度的倒數來決定，且K國際參考 單位/毫升（I U / m丨）來表現。 m 實例1 口腔黏膜干擾素對抗病毒感染的效果 以腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EM C V )腹腔内注射入老鼠會產生一快速發展的致死疾病其 特徵包含中樞神經系統C N S Μ及腦炎（Rueckart.， R. E., in Virology, Field ed.， 705-738， 1985， Raven Press , N e w Y o r k )。為了預防而施用或是在病毒已經在標 的器官内複製之後才施用，I F N — α均曾經顯示對於保 _2卜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ297公釐) — (請先閱讀背面之注意事項再^寫本頁) 裝· ^^寫太

、1T 4 528599 經濟部中央摞準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（户） 護老鼠對抗致死的E M C V感染是有效的（F i n t e r，N . B .; Front· of Biol·, 1973 2 135-147)。因此，在這些研究 我們決定口腔黏膜施用低劑量自然或是重組的I F N s對 於注射致死劑量之E M C V之老鼠的存活率的效果，換言 之，在一非常嚴格的抗病毒活性試驗。 腦心肌炎病毒品糸（J Η )如之前所描述（G r e s s e r 等人；Proc.Soc· Exp. Biol and Med. , 1 9 6 8 1 2 7 : 4 9卜4 9 6 )在老鼠L 9 2 9细胞繼代。使用於此研究的病 毒（EMC — α)在老鼠L929细胞内有5x10 8 · 6 2 T C I D s 〇的效價。 Κ 200 或 2000 IU 的 Mu I F N - a / β 或Hu IFN - αΐ - 8經由i n/or途徑來處理老 鼠會使得注射過致死劑量E M C V ( 3 0 0 L D s 〇 )的 老鼠增加平均存活時間。在所有6個實驗中（表1和2 ) H u IFN — cxl— 8 和 Mu IFN — α/召一樣有 效。 藉由鼻腔口腔途徑施用I F N s會造成本研究進行的 9組實驗中有6組的平均存活時間在統計上有顯著的增加 。再者，在所有進行的實驗中所有的趨勢均傾向有療效的 藉由腹腔注射途徑（每次注射2 0 0微升）施用會 成本研究使用腹腔施用的8組實驗中有7組的平均存活 間有顯著的增加（表1和2 ) 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）

請 先 閲 讀 背 意 事 項 再I fL·J裝 I 訂 她 造 528599 A7 B7 五、發明説明（yf ) 表1 干擾素對於注射E MC V老顏的存活的影響 IFN 劑量 IU/老鼠 麵劑纖 老鼠 數量 死亡 m 存活率 % 平均死亡通 土標準_ Μ j\\\ Μ-α/β 10000 4be BSA 5 5 5,5,5,6,6 0 100 5.4+0.2 Μ-α/β 2000 BSA 雛 5 100 一 Mu-α//3 200 BSA 躑空 5 7,--- 80 - Mu-α/,θ 2000 BSA 鼻腔口腔 5 7,7,7,8,10 0 7.8+0.6 Μιι-α//? 200 BSA 鼻腔口腔 5 7,10— 60 一 Hula~8 2000 BSA mi 5 100 - Hula ~8 200 BSA 觀 5 7,10— 60 - Hula-8 2000 BSA 鼻腔口腔 5 5,7,11- 40 - Hul a~8 200 BSA 鼻腔口腔 5 5,7,7- 40 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 4 书憂素麵麵在字職於第0对擺一2，一 1 )〇，+ 1，和+3天每天刪一次。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - 23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210 X 297公釐） ^28599 A7 B7 五、發明説明（；>〆) 遞且 表2 用IFN-α结^»和治癒搬備375LD5〇 EMCV &5§±^鼠存活率的f遵 存活目/每組&M^m) 劑量途徑 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 26 理 Mu IFN-aAS 200 Ιϋ 鼻腔口腔 Mu IFN-aAS 2000 IU 鼻腔口腔 Hu IFN-a-8 200 IU 鼻腔口腔 Hu IFN-a-8 2000 Ιϋ 鼻腔口腔 Mil IFN-αΛδ 200 IU 腹腔 Mu m-α/β 2000 IU KK Mu m-α/β 104 Ιϋ KK Hu IFN~a-8 200 IU 腹腔 ffii IFN_a-8 2000 Ιϋ 腹腔 5/5 5/5 1/5 0/5 5/5 4/5 4/5 4/5 2/5 2/5 2/5 1/5 1/5 1/5 1/5 5/5 5/5 5/5 4/5 3/5 2/5 2/5 2/51/5 1/51/5 4/4 4/4 3/4 3/4 1/4 1/4 1/4 0/4 5/5 3/5 1/5 1/5 0/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 5/5 5/5 5/5 δ/5 5/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/5 4/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂--- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 與在车豳於猶寸EMCV於第〇効購一2，一 1，〇，+1，和+2天每兩次< -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 528599

7 7 A B 五、發明説明（>句 表3 干擾素劑量對於注射E MC V老鼠的存活的影響 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 IFN 劑量 IU/老鼠 纖 老鼠 數量 死亡 存活率 % 平均死亡通 +標準薩 Ί» 無 鼻腔口腔 6 4,4,5,5,6,6 0 5.4+0.2 Hula -8 2000 隨 5 15,17,— 60 - Hula-8 200 醮 5 9,10,16,17,1 0 13.8+1.8 Met - 8 2000 鼻腔口腔 5 5,6,7,7,21 0 9.2+2.3 Hula-8 200 鼻腔口腔 5 5,6,6,7,9 0 6.6+0.7 干擾素與在相對於注射E M C V於第0天的第0，+ 1 + 2 ，+ 3和+ 4天每天施用兩次。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 Γ

——rL ^28599 A7 B7 五、發明説明（对） 由表1和2的數據很清楚直接比較腹腔注射與鼻口腔 施用，腹腔内注射途徑勉強較有效（7 / 1 6例子）或是 沒有顯著的不同（9 / 1 6例子）。 我們初步的數據顯示藉由兩種任一種途徑一天兩次施 用I F N ,相較於一天施.用一次I F N (表1和2 )顯示 不出保護老鼠對抗感染的處理效果有顯著地增加（表3 ) 〇 實例2 對抗口腔慼染E M C V之預防及治療處理的相對 有效性 Κ 200 或是 2000 IU 的 Hu I F N - α 1 一 8鼻口腔或腹腔處理的老鼠之平均存活時間，當I FN 處理是開始於被E M C V感染的那天及感染後持續4天， 並不會比當I FN是在病毒感染4天前處理且於感染當天 .停止處理之平均存活時間明顯較大（表3 )。 m 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 我們的结果顯示藉由口腔黏膜途徑低劑量I F N S的 施用對於感染一致死劑量E M C病毒的老鼠的存活率，Μ 對數X 2試驗（M an t e 1，1 9 6 6 )來決定，發揮出一統計上顯 著的增加。 實例3 口腔黏液千擾素對抗泡狀口炎病毒的效果 十組來自專一無病原育種種原的6周大老鼠K鼻腔内 方式感染體積1 0微升1 0 0 L D 5 0的泡狀口炎病毒（ -26 - 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ：Ζ97公釐） 528599 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（/) V S V ) ( Tovey 等人，Proc· Soc. Exp. Biol· Med·, 1 9 7 4 , 1 4 6 : 4 0 6 - 4 1 5 )。病毒感染七小時之後老鼠一則留著 不處理，或是每天以鼻腔内/ 口腔途徑處理在1 0微升的 Ferifiimune賦形劑内之一定劑量的老鼠干擾素cx / yS —次， 或是只有1 0微升的賦形劑（控制組），處理4天。 K老鼠干擾素cc/点處理成鼠造成感染一致死劑量V S V後動物存活率百分比顯著的增加。也就是，處理1 0 ，〇00 IU的干擾素α/θ的動物有30%在感染致 死劑量之V S V 2 1天之後是存活的，而其他條件相同 下，所有未處理或是Κ賦形劑處理的病毒感染動物在1 0 天内全死亡。臨床觀察顯示大部份在2 1天活著的干擾素 處理過之動物將會存活下來。 實例4 口腔黏膜干擾素對於细胞蛋白質表現的影響 I F Ν — α已知在使此蛋白質與其细胞表面的受體结 m· 合後會引發一些细胞蛋白質的表琨。這些蛋白質被認為提 供I F N作兩一有用的指標。 我們評估藉由鼻口腔途徑施用I F N — α對於三種I FN —誘發的蛋白質，MHC class I抗原，L • y 6 A / E抗原和2 ’ 一 5 ’ 一寡腺苷酸合成酯，之表 現的影響。 藉由鼻腔口腔途徑處理DBA — 2老鼠（H — 2K) 至20，0〇〇 IU的Mu IFN — α並不能顯著增 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 528599 A7 B7 五、發明説明（ >备）

加 Η - 2 -現，而如2 給予則會顯 顆粒球兩者 抑制的。 相同地 I U 的 沒有顯著的 處理後會顯 人；1 9 8 6，J Κ在周邊血液淋巴球，單核球或顆粒球内的表 〇 IU般少的Mu IFN—α以腹腔方式 著地增加Η — 2 - Κ抗原在周邊血液單核球和 的表現。事實上，在單核球上的表現是稍微受 ，藉由鼻腔口 效果，而其表 著的增加於許 J. Iiinuno 1, 2〇〇或2 0 ，〇〇〇 腔途徑處理老鼠至20，0〇0 於L y 6 A / E抗原的表現並 琨在K第I型 I F N非經腸道 多類淋巴细胞的表面（Dumont等 1 3 7 : 2 0 1 - 2 1 0 )。相同的结果可由 IU 的 Mu IFN — α 或 Hu 請 閲 讀 背 之 注 項

頁 IFN— ccl—8 經由 處理瑞 υ I F N 苷酸合成酶 加。相反的，在相同的實 士或是D B A 一 α Μ腹腔注 的活性在周邊 U的Μ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I F Ν — α 經 -寡腺苷酸合 鼻腔或 / 2老 射方式 血液單 驗處理 由鼻腔 成®的 口腔來達到。 鼠如2〇 I U般少的Μ- 會造成2 寡腺 核球和脾臟细胞顯著的增 老鼠至2 0，0 0 0 I 口腔途徑不會明顯地增加 活性。再者，藉由鼻腔口 腔途徑處理Κ 200或2 0 ，〇〇0 IU的Mu N — or 或 H u 腺苷酸合成 何時間試驗 藉由腹 I F Ν

F 寡 F Ν處理開始後至第十天内的任 的影響。 酾的活性在I 點都沒有顯著 腔内注射或是鼻腔口腔施用途徑處理動物至2 -28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X ：297公釐） 528599 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（W) 〇 , 〇 〇 〇 I U的M u I F Ν — α對於在四組獨立的 實驗之周邊血丨夜樣品的彳貞測之血液學變數（紅血球數，血 容比，血紅素含量，平均细胞容積（M C V )，平均细胞 血紅素（M C Η )，平均细胞血紅素丨農度（M C H C ), 網狀细胞數，總白血球數，淋巴球，單核球和多核球包括 嗜中性球，嗜酸性球，和嗜鹼性球的數目）或是在三個獨 立的實驗下偵測之血丨夜化學變數（血液尿素氮量（B U N )^肌氨酸酐（creatinin)，乳酸去氫酶（LDH)，血 清麩氨酸鹽草乙酸鹽轉移醸（SGOT),血清磷酸轉移 酶（SGPT)，鹼性磷酸酶，總蛋白質和白蛋白含量） 均不會造成相同一致的影響。 但是，對於一特定的變數所得到的值，在一特定的時 間點個體動物之間以及在相同實驗内部不同時間點之間可 觀察到相當的變化。變化也可Μ在一個實驗至另一個實驗 所得到的值内觀察到。因此在這些情況下在未經處理及經 過I F Ν處理的動物之間之特定變數的些微不同將不會被 偵測出。但是，對於血液學和血液化學決定因子所得到的 值均落於Κ前曾發表過正常老鼠的值之內。 這些结果顯示所試驗的三種生物標記均沒有絕對反映 出由I F Ν — α 口腔黏膜施用所發揮的對抗一系統性病毒 感染之顯著的抗病毒活性。 實例5 經由口腔黏膜施用千擾素的生物有效性 - 2 9 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝_ 訂 528599 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（0) 1 1 I 為 了試 驗 I F N 的 生 物 有 效 性 以 及 藥 物 動 力 學， 對 於 1 1 1 這 些 研 究有 m 適 合 的 藥 物 一 血 液 容 積 比 例 的 老 鼠 以簞 一 局 /^V 1 I 劑 量 處 理， 標 示 最 高 專 一 放 射 性 活 性 可 能 為 X 2 5 I 之 重 請 先 1 1 閲 I 組 I F N — α 〇 讀 背 | I 一 純的 7 〇 X 1 〇 6 I U 之 Η U I F N — a 1 — 8 之 注 1 I 意 1 I 被 放 入 1 ♦ 4 毫 升 的 P B S 內 j 且 藉 由 Mo ge ns e η 等人 ( 項 1 I I n t · J . C an C € r , 1981 28 : 5 7 5 - 5 8 2 ) 所描述的用Η un ter 只 再 填 寫 % 和 Gi e e nwoc >d所描述的c hi 0 Γ am i η ，Τ方 法 修 正 法 ( N a t υ re 9 外、 頁 1 1962 1 94 : 4 9 5 - 4 9 6 ) 進行碘化< 1 1 1 Z 5 I 標 示 的 Η υ I F Ν 一 a 1 一 8 ( lot no . 1 1 CGP35269-1) 當 在 感 染 上 V S V 的 人 類 W I S Η 細胞 上 分 1 訂 析 顯 示 有2 X 1 〇 7 I U / 毫 升 的 生 物 活 性 9 而 在感 染 上 1 | V S V 的老 L 9 2 9 细 胞 上 分 析 有 1 X 1 〇 6 I U / 毫 1 1 升 的 生 物活 性 〇 1 1 • V · 至t 周 大 的 母 瑞 士 以 靜 脈 y 腹 腔 注 射 或 是鼻 腔 P 4 腔 處 理 2 X 1 〇 7 I U / 毫 升 相 當 於 1 X 1 〇 6 老鼠 I U 1 I / 毫 升 的1 z 5 I 標 示 的 Η U I F N 一 a 1 — 8 ( 1 * 1 1 〇 3 6 9 X 1 0 7 C Ρ m / 老 ) 〇 在 所 顯 示 的 時間 點 ί 1 1 每 一 組 有三 隻 老 被 犧 牲 血 液 被 收 集 並 測 定 其 容積 0 收 1 1 集 腎 臟 ，肝 臟 ) 肺 臟 y 脾 臟 和 胃 / 食 道 並 吸 乾 水 分， 秤 重 1 I 精 確 至 正負 1 * 〇 微 克 0 每 一 個 樣 品 的 放 射 性 強 度個 別 1 1 • 7 計 數 器來 決 定 0 之 後 全 血 藉 由 離 心 ( 8 0 〇 g X 1 〇 1 1 分 鐘 > 4 r ) 來 分 離 血 清 收 集 起 來 > 計 數 並 冰凍 於 一 1 1 一 30 一 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528599 A7 B7 五、發明説明（>/ ) 8 ου。血清之後以一標準的生物分析法在如前所述人類 WI SH细胞Κ及老鼠L929细胞兩者內分析I FN的 含量。出現在血清樣品內之有放射性活性的物質之後藉由 吸附免疫沈澱法分離並用SD S - PAGE分析。 在藉由靜脈注射具1 · 0369xl07 cpm /老 鼠之12 5 I標示的Hu IFN — ccl 一 8於5分鐘後 動物的周邊血液内可偵測出非常高量的放射性活性（> 2 X 10s cpm /毫升）。出現在全血的放射性活性的量 隨後會於1 5和3 0分鐘漸進地下降。在藉由腹腔注射具 l.〇369xl07cpmt125 I 標示的 HuIF N — α 1 — 8於5分鐘後動物的周邊血液内可偵測出的放 射性活性程度大約比用靜脈注射所偵測到的要低二十倍。 放射性活性的程度隨後在注射後1 5分鐘和3 0分鐘時漸 進地増加。經過鼻腔口腔施用1 2 5 I標示的I FN — α 1 一 8之後5，1 0或1 5分鐘之動物的血液内偵測到的 放射性活性程度明顯地比藉由應腔注射相同量之Si射性標 示的I F N —定時間下所偵測到的要來的低。對於所有三 種施用途徑，在隨後K鼻腔口腔施用1 z 5 I標示的I F N — α 1 - 8於血清内要比於全血内偵測到較高程度的放 射性活性。每毫升全血相較於相同容積的血清所偵測到較 低程度的放射性活性反映出在除去全血内细胞組成後所測 •得的有效較大容積。 來自此研究所有老鼠的血清樣品均使用如上所述的標 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再ιΡΡ本頁) 4丨 訂 528599 A7 B7 五、發明説明（>P) 準生物分析法來 在所有K靜脈或 1 一 8之動物在 出的具生 I F N之 生物活性 相當高程 為了 8處理過 正表7F本 疫沈澱， 附-純化 物活性 任一動 的I F 度的放 測定在 的動物 來的I 為了沈 的多株 如上所 脈或腹 内放射 分析有生物活性之I FN的存在，且顯示 是腹腔注射125 I的Hu IFN — α 所有試驗的時間點其血清内均有容易偵測 之I FN的量。相反地^ Κ鼻腔口腔施用 物在任一試驗的時間點其血清內均沒有具 Ν被偵測出，雖然在這些動物的血清内有 射性活性存在。 I標示的Η I F Ν - α 1 — 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 之後樣品 經靜 後在血清 有與未注射之1 2 5 I 移動性的單一同源移動 血清内所偵測到的放射性活性物質是否真 F Ν，樣品均用蛋白質Α - G Agarose做免 澱出存在於樣品内的免疫球蛋白，再K吸 抗一 I F N — α抗體進一步做免疫沈澱。 S D S —聚丙烯醯胺膠體電泳。 述進行 腔注射 性活性 Η IFN — αΐ — 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 為2〇〇 1 一 8的 5 I H u 何物質有 •均加入相 放射 〇〇道 分子量 IF 相似於 同量的 性標示 耳吞， 一致。 Ν ~ α 本來I 放射性 之物質 物質的SDS—PAGE分析顯示 Hu IFN 了 αΐ— 8相同電泳 帶。此物質明顯的分子量估計大約 其正好與本來的Hu IFN — α 相反的，來自Κ鼻腔口腔處理12 1 一 8的老鼠血清樣品沒有包含任 FN的分子量，即使在每一 Μ膠體 活性物質。 的組纖分布顯示在Μ靜脈注射1 2 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 528599 A7 B7 五、發明説明（；w ) I F N — cx 1 — ，在肝 種器官 漸進地 〇分鐘 後存在 藉 分鐘内 之後在 5 I Η 内均造 性的量 I F Ν 比任何 腸道施 標示的 量。 臟，肺 每一種 降低。 會漸進 於動物 由靜脈 在所有 3 0分 u I F 成放射 臟和脾 的放射 相反的 地增加 血清內 注射施 檢視的 鐘會降 8於5 臟有高 性活性 ，在胃 ，到達 的程度 用1 2 組織内 低。相 分鐘後動物的腎臟有非常高量 量的放射性活性。存在於這四. 之後發現在15和30分鐘會 的放射性活性程度在1 5和3 一相當於經靜脈注射3 0分鐘 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 Ν — c( 1 一 8 線活性的高峰 有一些的降低。經過 8存在於貢 程度上 脈注射或是腹 I H u I F Ν 一 α 1 其他器官在 用，靜 5 I I F 均造成放 似地，藉 在1 5鐘 量，在3 鼻腔口腔 /食道之 來的大， 腔注射途 —α 1 一 Ν — α 1 一 8 射性活 由鼻腔 内在所 〇分鐘 施用1 放射性 且明顯 徑，相 8之些 性的高 口腔施 有檢視 時在放 2 5 I 活性的 的局於 同量之 器官内 在1 5 峰量， 用1 2 的組織 射性活 標示的 程度是 經非經 放射性 存在的 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實例6 鼻腔口腔施用干擾素的藥物動力學 為了精確地測定H u F Ν α 1 8的藥物動力 學，將老鼠以靜脈注射，腹腔注射或鼻腔口腔施用Μ 1 · 369x10 7 cpm/老鼠之12 5 I標示的Hu F N — α 1 — 8，且存在於全血及血清兩者内的放射性 〇

I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 528599 A7 B7 五、發明説明（j/) 活性的量在2 4小時期間 經過靜脈注射存在於 u FN — al-8 的 線。此與 人類a A J. IFN 曲線之下 / D 〇經 雙相的費 實例4的 1 一 8之 所報導的 容易 靜脈注射 Κ前的 / D ( Res ., 的面積 由靜脈 時清除 结果栢 藥物動 结果。 偵測到 或是腹 研究在老 B g 1 ) 1986 6: 所得之生 注射1 2 曲線，其 符。腹腔 力學相當 內於一系列時間點進行測定。 老鼠血疲之125 I標示過的Η 藥物動力學圖接近一對數清除曲 鼠使用一相當有關的分子，重組 之结果相符（Bohoslawed等人； 2 0 7 - 2 1 3 )。計算自濃度對時間的 物有效物質的量也同於人類α A 5 IIFN—αΐ—8可得到一 特色是物質自腎臟被清除，此與 注射 I標示的I F Ν 近似先前Κ肌肉注射施用I F Ν 之具生物活性的I F Ν的程度存在於經過 腔注射 標示之I F Ν — α 1 8 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 的所有動物血清内。雖然在經鼻腔口腔施用1 2 5 I I F Ν—α1—8的動物血清內沒有偵測到抗病毒活性，然而 在這些動物內有觀察到保護對抗致死劑量之EMCV的一 統計上顯著的程度（表4 )。 34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 528599 A7 B7 表4

MiZ5 I 一 IFN一α單一蔚臟tai寸EMCVSW^鼠存活率的謎 理姐 劑量 存目/每組mmm) 3 4 5 6 7 8 9 15 請 先 閱 讀 背 ιέ 之 注 意 事 項 頁 6/6 4/6 2/6 0/6 6/6 5/6 4/6 3/6 1/6 1/6 6/6 5/6 5/6 4/6 3/6 2/6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7f^il

HuIFN-al-8 1·4χ105Ιϋ 鼻口腔 Mu IFN-cc/zS 6.4Χ104 IU 鼻口腔 討論 我們在一完整建立之急性病毒感染 獲得的结果提供了確定的證明來支持對 黏膜IFN在人類上為了急性系統性病 理論證據”，並且顯示自然多重I F N 單一重組I FN — a同型兩者均在此模 著的抗病毒活性。自然的Mu IFN I FN — a 1 — 8當K 口腔黏膜腔施用 果。 當一給定形式和劑量的I F N以口 -35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1/6 1/6 1/6 1/6 2/6 2/61/6 1/6 的前臨床模式内所 於使用低劑量口腔 毒感染的治療之“ 一 a亞型的混合和 式下發揮統計上顯 一 a /点和H u 時顯示有相同的效 腔黏膜途徑施用與 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 528599 A7 _B7_ 五、發明説明ut) 以系統性施用（腹腔注射）所得到的结果做比較來比較所 獲得的保護作用程度顯示非經腸道的I F N施用法在一些 例子勉強較口腔黏膜施用法有效，且在另一些例子裡並沒 有較有效。 生物標記引導研究的结果（實例4 )相當清楚地顯示 所試驗的三種生物標記（MHC class I抗原， L y 6 A/E抗原，和2' — 5’ 一寡腺苷酸合成酶活 性）在藉由鼻腔口腔途徑施用IFN-α並沒有一種絕對 反映出非常顯著的抗病毒活性。 在所有實驗Μ腹腔注射如20 I U般少的I FN — α所觀察到的在所有三者I F Ν —引發的蛋白質的表現有 非常顯著的增加，與藉由口腔黏膜途徑施用至20，〇0 0 I U的I F Ν - ex沒有任何可偵測到的效果兩者之間 對照是顯著的。. 雖然我們不能摒除對於一種或其他生物標記的效應曾 在一較早或過渡時間點時被觀察到的可能性，佴从乎不太 可能如I F Ν作用於編碼這些蛋白質基因的轉錄過程且因 此不能期望直到I F Ν處理一些小時之後才看到對任何這 些生物標記的影響。 再者，雖然我們不能摒除對於一種或其他許多I F Ν 一引發的蛋白質一系統性的影響在Κ鼻腔口腔途徑處理I F Ν — α後會觀察到的可能性，這Μ乎不可能.此將暗示 特定I F Ν —引發的基因的表現之不同的調節作用。但是 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再HR本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 528599 A7 B7_ 五、發明説明（々Λ ，經由鼻腔口腔施用I FN — α相當有可能對於一種I F Ν生物標記的影響可能局部地被觀察到，例如在鼻腔淋巴 球内。 與在生物標記研究沒出現可偵測得到的效果一樣，對 於在口腔黏膜IFN治療過程中所偵測得任何血液學或血 液化學變數均沒有觀察到一致的效應，即使在處理到2 0 ，000 IU的IFN—α之動物體内。 藥物動力學-生物活性研究的結果相當清楚地顯示Κ 口腔黏膜施用單一劑量之放射性標示的Hu I FN - α 1 一 8在使用比Μ前所使用要多一涸強度敏感的偵測方法下 沒有循環I F Ν於周邊血液內偵測到的條件下所獲得一統 計上顯著的抗病毒效應。與這些結果相符，藉由口腔黏膜 施用IFN所發揮的抗病毒活性程度確實顯示依循古典的 劑量依賴關係。 在經鼻腔口腔施用1 2 5 I標示之I FN - α 1 - 8 之動物的全血和血導兩者内均可發現容易偵測到之程度的 放射性標示物質。這些结果與之前的研究結果構成對照， 其在Μ口腔施用大量未標示的IFN之後在動物的血清内 無法偵測到I F Ν。但是，經鼻腔口腔施用後在全血Κ及 血清所偵測到的放射性活性物質是不具生物活性的。再者 ,SDS—PAGE分析的結果顯示此物質是低分子量的 •，且大部份可能反映出是I F N於未和小腸經消化作用後 的分解產物的吸收作用。分析經鼻腔口腔施用後放射性標 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁)

訂 528599 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明UM 示的物質之組織分布顯示在Μ裡有比在任何其他試驗器官 較高程度的放射性活性。我們的结果相當清楚地顯示即使 具生物活性的I FN沒有在鼻腔口腔施用後被吸收，然而 此處理劑量在活體上發揮一統計上顯著的抗病毒活性。 對於所觀察到的有益效應並不期望符合任何已被提出 的機制，我們的结果顯示口腔黏膜升用的I F Ν發揮其效 應對抗病毒乃藉由一目前尚未闉明的新機制，其並不包含 外來施用的I F Ν之直接作用，或是内升I F Ν的引發作 用。此可由不存在可偵測到程度之循環IFN或是三種生 物標記試驗來支持之。他顯示此機制至少部份藉由大量的 在鼻咽腔及口腔周圍的類淋巴組織之剌激作用來作用。因 為我們已經顯示口黏疲I F Ν至少在效果上可與系統性施 用的I F Ν相比，我們的结果對於在處理急性病毒感染症 Κ口腔黏膜途徑施用IFN提供了強有力的支持。此將對 於I F Ν的臨床使用有重要的密切闢係。 _ 對於在此技藝熟練的人是明顯的本發明為了始知明白 和了解的目的曾在一些詳细地描寫，許多修正或改變對於 在此所描述的具體事實及方法在不遠離於此專利說明書所 揭露之本發明的概念範圍之下均可以進行。 (請先閲讀背面之注意事項再本頁) .裝· 訂 線 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 528599 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 適於施用從約1 -X 1 0 4至2 Ο X 1 0 6 I U的干擾素。 0 <請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 9 ·根據申請專利範圍第8項之干擾素，其中該藥劑 適於旛羯從約1 X 1 0 4 I U至1 X 1 0 6 I U的干擾素 0 1 〇 ♦根據申請專利範園第1或2項之干擾素，其中 該藥劑包括另外為了同時，分別或達績治療之治療劑。 1 i…根據申請專利範圍第1 0項之干擾素，其中治 療劑是另一種抗病毒麵。 1 2 *根據Φ請專利範圍第1或2項之干擾素，其中 該千擾素是第I型干擾素。 1 3 ♦棍據Φ請專利範園第1 2項之干擾素，其中該 干擾素是選自α干擾素，点干擾素，ω千擾素，一致的干 擾素，及其混合锪所組成之族群中。 1 4 ♦棍據Φ請專利範圍第1 3項之干擾素，其中該 干擾素是α干擾素。 1 5 *棍據串請專利範圍第1或2項之干擾素，其中 該干擾素是第Ε型干擾素。 1 6 ·根據串請專刹範園第i 5項之干擾素，其.中該 第ii型干擾素是7干擾素。 1 7 +根據申請專利範圍第1或2項之千擾素，其中 該干擾素是一種重組物質。 1 8 ·根據申請專利範圍第1或2項之干擾素，其中 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 528599 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 該宿主防禦機制對抗_節炎，糖尿病，狼瘡，多重硬化， 麻風，结核病，腦炎，CreuUfeld卜Jalcob症，瘧疾9 S貝fe ’生殖器瘤瘆5 B型祁C型肝炎，Η I V，Η P V和 H S V - 1 和 2 。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐)

   528599 六、申請專利範圍 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 1 種用於製儀供在一哺乳動物體内Μ 口黏膜接觸 來剌激宿主陪禦機制之藥_之干擾素，該藥劑包括治療上 有效量的干擾素，該有效量是從約1 500 I U至約20 X 1 0 6 IU，其條件為當Κ非經腸道施用詩，該量不會 在哺乳動物體内引發病理反應且當病況為鼻病毒時；該干 擾素並不Κ多劑量或連讀劑量經口施羯引發病理反應。 2 +根據Φ請專利範匯第1項之干擾素，其中該宿主 防禦機制對抗一病毒性，自體免疫，分枝桿菌，神經變性 或寄生蟲性病況。 3 *根據申請專利範園第1或2項之千擾素，其中該 藥劑包括單一麵量的干擾素。 4 *根據串請專利範園第1或2項之干擾素5其中該 藥類I包含足夠引起相同於單一劑量的剌激作周之多次較低 劑量的干擾素。 5 ‘根據串請專利範園第1或2項之干擾素$其中該 藥爾提供足夠引起相當於單一麵量的剌激作周之一非毒性 劑量在一段詩間肉的持績施周。 6 ♦棍據串譆專莉範圍第1或2項之干擾素$其中該 __包括另一種鼦脗活素或是一種干擾素誘發物。 7 *根據串請專莉範圍第1或2項之干擾素，其中該 _劑適於施馬從約5000 IU至約20x10s I U 的干擾素。 8 *根據申請專莉範圍第7項之干擾素，其中該藥謂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)