TW520395B - Methods for enhanced virus-mediated DNA transfer using molecules with virus-and cell-binding domains - Google Patents

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520395 A7 B7 五、發明説明（1) 發明領域 概略而言，本發明係關於一種藉病毒提高细胞轉導效率 之方法，特別係關於利用含病毒结合區及细胞结合區之分 子，例如多肽，增進病毒媒介基因移轉入细胞之方法。 發明背景 多種對人類疾病基因基礎了解的進展以及基因移轉技術 的改良導致晚近嘗試開發嚴重基因疾病之體基因治療計畫 。目前人類基因治療之可能疾病候選者包含其酶或其它蛋 白質有缺陷或缺失的疾病，此處無須正確調節酶或蛋白質 含量，特別作組成性調節，Μ及該等缺陷出現於病人骨髓。 例如，基因治療之一種疾病候選者為腺核苷脫胺酶 (ADA)缺陷结果導致嚴重舍併免疫缺乏病（SCID)。ADA缺陷 病人之骨髓细胞可檢測的酶濃度極低或無。但ADA缺陷曾 經藉匹配骨髓移殖治癒。ADA正常细胞具有優於ADA缺陷细 胞的選擇性，通常可再度繁殖人類骨髓。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 骨髓细胞為體细胞治療的主要目標，原因為骨髓組織於 試管試驗容易操控且含有繁殖细胞。另外，人類臍帶血過 去也驗證含有大量原始祖先细胞。成功的基因移轉入造血 幹细胞，亦即長期繁殖细胞對多種此等细胞後代表現疾病 可終生治癒。 基因轉移入繁殖细胞，及長期基因表現於繁殖幹细胞由 多個研究學者於鼠模式達成。但大型動物，例如犬或靈長 類之活體試驗成功有限，主要由於感染原始造血幹细胞之 效率低之故。近來基因移轉技術的限制應用於人體時由於 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（2) 數種因素更為複雜，包含成人骨髓（ABM)存在的幹细胞數 目少，缺乏適當方法純化此等細胞，及原始细胞於细胞周 期中的比例低。 使用骨髓细胞之鼠實驗及大型動物實驗中，發現最成功 的方案係利用共同培育目標细胞與反錄病毒生產者细胞株 。又，人類之大部份美國食品藥物檢驗局核淮的基因移轉 試驗依靠基因轉導至重組株反錄病毒載體。重組株反錄病 毒載體為基因治療所需，原因為其可有效移轉且準確穩定 地整合外源DNA進入细胞DN A。此等載體含有基因移轉用外 源D N A，經進一步修改而消除病毒病原性。由於此等修改 ，病毒生產一般使用反錄病毒包封细胞達成。但用於臨床 基因治療，不含細胞之轉導更合所需，原因是擔憂生物安 全性及品管。不幸，未與病毒生產性细胞共同培育通常無 法有效基因移轉入造血细胞如幹细胞。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 近來，顯示基因移轉效率可藉目標细胞於感染期間暴露 於基質细胞增高。基質细胞為造血顯微環境（HM)之主要成 份。造血顯微環境係由巨噬细胞，基質细胞，內皮细胞， 脂细胞及多種經由定義的黏著细胞製成的複合胞外母質 (ECM)的有組織網路組成。胞外母質分子如毘布胺酸，膠 原，thrombospondin，蛋白聚糖類，糖胺聚糖類及纖維網 蛋白提供造血细胞及生長因子的定根位置。此種基質對反 錄病毒感染的促進效果機轉未明，已知當此等细胞直接接 觸胞外母質细胞時，造血细胞的增生及分化發生生理調節。 有效基因移轉入長期繁殖造血幹細胞及其它细胞仍然成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5 - 520395 A7 B7 五、發明説明（3) 的類 病乳 疾哺 它入 其轉 及移 病效 疾有 血質 造物 前 因 目基 為使 作可 畫種 計一 轉有 移要 因需 基仍 礙 〇 妨法 ， 療 題癒 問治 需 -*—1 種 此 足 滿 可 明 發 本 ο 者 制 I 與 險 危 之 法 方 去 過 無 而 胞 〇 细求 逑 概 明 發 體 載 毒 病 錄 反 藉 種 1 供 提 例 體 具 佳 較 之 明 發 本 之 言 簡 法 方 之 率 頻 導 轉 胞及 细胞 血细 造網 高維 提纖 之 質 純 澧 大 於 含 包 法 方 該 之 率 頻 導 轉 毒 病 錄 反 被 胞 细 高 提 效 有 可 或 陷 缺及 製白 複蛋 以網 ， 維 下纖 在。 存胞 段细 片 血 胞造 细存 網活 維染 纖感 體 載 毒 病 錄 反 株 組 重 段 片 白 蛋 網 維 纈 或 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .三 f S 生 e i 自 成 維 ^ ^ 0 藉彳的 或 可 y 用 或程利 質工明 物因發 然基本 天行解 自進了 生術須 衍技 ， s LT 域 夕 合 此 學。 化合 或組 組質 重物 藉成 如合 例與 纖 然 天 含 包 肽 多 或 肽 多 白 明 胞 發 细 本 血 據 造 根 導 成。轉 達肽產 可多生 1J 0B 肚基種 如能 一 言 官 供 雖的提 , 質 例 變性體 突著具 之黏佳 列有較 序具個 酸的一 基需另 胺所之 白導明 蛋轉發 網進本 維增 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 制在 之存 率物 頻合 導混 轉動 毒制 病其 錄或 反段 藉 1C 胞白 细蛋 高網 提維 效纖 有 肋 33 可 制 於、 括白 包蛋 ， 網 法維 方纖 之動 活 存 染 感 毒 病 錄 反 株 組 S 陷 缺 製 複 之 A N D 源 外 有。 載胞 K 细 , 血 下造 法胞 方细 植血 移造 胞活 细存 之得 良獲 改者 種予 一 給 供物 提動 例由 體 ： 具驟 佳步 較列 一 下 另含 之包 明法 發方 本該 造蛋 活網 存維 導纖 轉的 產率 生頻 而導 胞轉 细高 血提 造可 染且 感式 體形 践ij -lulu 毒制 病於 錄係 反染 株感 組 ， «包 K 细 ; 血 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 6 520395 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印— 五、發明説明 ( 4 ) 1 1 白 及 /或其片段存在下進行感染； 及將經轉導的存活造血 1 1 细 胞 引 進 動 物 接 受 者 作 為 细 胞 移 植 物 0 較 佳 模 式 中 感 染 细 1 •1 胞 可 引 進 體 給 予 者 體 內 〇 請 先 1 1 本 發 明 之 另 一 較 佳 具 體 例 提 供 一 種 獲 得 適 合 细 胞 移 植 程 閱 讀 背 1 1 序 用 之 經 轉 導 臍 帶 血 之 方 法 〇 該 方 法 包 含 於 可 有 效 增 高 造 之 1 注 血 细 胞 藉 反 錄 病 毒 載 體 轉 導 頻 率 之 有 效 制 動 量 之 纖 維 網 细 思 事 1 項 U I 胞 及 /或纖維網细胞Μ段存在下， K複製缺陷重組株反錄 再 填 寫 噘 1 病 毒 載 體 感 染 得 白 臍 帶 血 之 造 血 细 胞 〇 本 發 明 亦 包 含 藉 此 本 頁 種 方 法 得 白 臍 帶 血 之 存 活 經 轉 導 细 胞 族 群 及 细 胞 移 植 方 1 1 法 其 包 含 將 經 轉 導 细 胞 族 群 引 進 動 物 體 內 作 為 细 胞 移 植 物0 1 | 根 據 前 逑 本 發 明 之 具 體 例 之 更 為 特 異 態 樣 9 使 用 的 纖 維 1 訂 網 蛋 白 或 纖 維 網 蛋 白 片 段 含 有 第 . 胺 基 酸 序 列 其 可 提 供 纖 1 維 網 蛋 白 之 肝 素 - I - 结 合 領 域 之 反 錄 病 毒 结 合 活 性 ， 1 1 及 第 二 胺 基 酸 序 列 其 可 提 供 纖 維 網 蛋 白 之 CS -1 領 域 之 细 胞 1 1 結 合 活 性 〇 共 同 使 用 纖 維 網 蛋 白 之 兩 種 结 合 領 域 證 實 可 極 1 為 有 效 增 進 巨 標 细 胞 被 反 錄 病 毒 轉 導 效 率 〇 1 本 發 明 之 另 一 較 佳 具 體 例 提 供 一 種 生 產 構 成 體 之 方 法 9 1 該 構 成 體 係 供 增 進 預 定 百 標 细 胞 被 反 錄 病 毒 載 體 轉 導 的 頻 1 率 〇 該 方 法 包 含 下 述 步 驟 9 共 價 偶 合 结 合 至 巨 標 细 胞 的 配 1 合 基 至 種 含 胺 基 酸 序 列 之 多 肽 贅 該 胺 基 酸 序 列 可 提 供 纖 | 維 網 蛋 白 之 肝 素 -] I - 结 合 領 域 之 反 錄 病 毒 結 合 活 性 〇 本 發 1 I 明 也 包 含 利 用 此 等 構 成 體 來 提 高 預 定 巨 標 细 胞 被 反 錄 病 毒 1 1 I 載 體 轉 導 頻 率 之 方 法 及 利 用 轉 導 细 胞 移 植 程 序 〇 1 1 本 發 明 之 另 一 較 佳 具 體 例 提 供 一 種 局 限 病 毒 數 量 之 方 法 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（6) 序 酸 基 胺 之 子 因 長 生 胞 细 母 維 纖 或 V 原 膠 自 得 之 毒 病 錄 反 细 T 導 轉 毒 病 錄 反K -I 種1 供 提 例 體 具 佳 較 1. 另 之 明 發 本 胞 细 染 感 毒 病 錄 反 M 下 在 存 質 物 種至 一 合 於結 含個 包 一 , 含 法包 方質 之物 胞該 錄 反 至 合 結 個1 及 基 合 配 之 胞 细 胞多 细為 高質 提物 及該 胞 ， 细中 及式 毒形 病佳 錄較 反之 限質 局物 同用 共使 此法 因方 , 該 基。 合率合 配效結 之導含 毒轉包 病之肽

第 之 毒 病 錄 反 合 结 及 列 序 酸 基 胺1 第 之 胞 细 T 提 例 具 佳 較ο 一 列另 序之 酸明 基發 胺本二 法 方 之 毒 病 錄 反 艮 ffnr 局 til 種 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 之 量 效 有 S3、 P 毒原 病 膠 錄自 反 得 含之 包毒 , 病 錄 反 合 結 可 有 具 的 離 分 經 種 的 列 序 酸 基 胺 之 子 因 長 生 胞 细 母 隹 纖 或 方 之 胞 细 類 乳 哺 染 感 效 有 毒 病 錄 反 供 提 係 的 巨 〇 之 觸明 接發 肽本 多 法 之 轉 移 因 基 遵 ιδ 之 毒 病 錄 反M 供 提 係 的 巨 一 又 之 明 發 本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胞 细 體 異 i 種 同 或 / 〇 及 求體 需自 的種 育一 培供 同提 共係 免的 避目 可一 法又 方之 該明 , 發 法本 方 下 由 士 人 界 業 對 黏 03^. 特 及 點 優 ο \ 養的 培 目 胞 它 細其 及及 法等 方此 良之 改明 之發 植本 移 用 易明 然說 顯單 將簡 明之 說式 文圖 示 之 段 片 酶 白 ί 乳 凝 ft 0 含 包 子 分 白 i 網 維 纖 供 提 圖 圖 表 代 意 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 520395 A7 B7 五、發明説明（7) 圖2顯示使用ΤΚ ΝΕ0載體於纖維網蛋白片段存在下，人類 關鐽祖先细胞之感染效率，如後之實例1進一步說明。 圖3比較使用ΤΚΝΕ0載體於纖維網蛋白片段存在下，多種 人類造血關鐽祖先细胞之感染效率，如下文實例1進一步 說明。 圖4比較Κ下列轉導之骨髓细胞移植小鼠是否存在有 hADA : (i)共同培養方法（2-4行），（i ί)於制動纖維網蛋白 片段存在下Κ上清液感染（第5-7行），及（iii)於BSA之上 清液感染（第8-1〇行），如後文實例7進一步說明。hADA之 對照示於第1及12行而鼠ADA示於第11行。 圖5驗證反錄病毒結合至纖維網蛋白片段，如下文實例8 進一步說明。 圖6驗證反錄病毒结合至纖維網蛋白片段係與劑量有關 ，如後之實例8進一步說明。 圖7提供說明後之簧例9-11使用之多種重組株纖維網蛋 白片段之示意圖。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖8顯示反錄病毒結合至多種纖維網蛋白Η段，包含结 合至若干重組株片段，如後文實例9所逑。 圖9驗證肝素阻斷反錄病毒结合至纖維網蛋白片段，如 後文實例9所述。 圖10顯示於多種纖維網蛋白Η段存在下鼠造血细胞之反 錄病毒感染效率，如後文實例10進一步報告。 圖11及1 2比較以下列各者轉導骨髓细胞移植的小鼠體是 否存在有hADA: U)共同培養方法* Ui)於多種缬維網蛋 10 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520395 A7 B7_ 五、發明説明（8) 白片段之上清液感染，及（in)於BSA之上清液感染，如後 文實例11所述。 圖13顯示纖維網蛋白α -鐽構造及其與實例使用之重組 株片段之關係。纖維網蛋白I ，II及1Ε型重複本指示出和 皿型重複本編號1至14。細胞之三個結合位置標示為CELL 表示细胞結合領域（CBD)，HEPARIH表示肝素結合領域 (HBD)，及CS1表示由交替剪接ICS區之頭25個胺基酸形成 的VLA-4結合位置CS-1。 圖14顯示於多種纖維網蛋白片段存在下，反錄病毒感染 NIH/3T3细胞之效率，如後文實例12之進一步報告。 圖15顯示於多種纖維網蛋白片段存在下，反錄病毒感染 非黏附HL60细胞之效率，如後文實例12之進一步報告。 圖16顯示低及高分子量肝素對反錄病毒结合至纖維網蛋 白之影響。 圖17顯示於重組株纖維網蛋白片段存在下，於CD34 +细 胞族群內部各型祖先细胞之反錄病毒感染效率，如後文實 例1 3之討論。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖18顯示於重組株纖維網蛋白片段存在下，於C-KIT +细 胞族群內反錄病毒感染HPP-CFC细胞之效率，如後文實例 1 4之討論。 圖19驗證反錄病毒感染NIH/3T3细胞效率隨著 hexadimethrine bromide濃度之增高而減低，如後文實例 15之討論。 圖20驗證純株生成性骨髓细胞之反錄病毒感染效率随著 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（9) hexadimethrine bromide濃度之增高而減低，如下之實例 15之討論。 圖21顯示流動细胞計量試驗結果，驗證T细胞可表現纖 維網蛋白受體。 圖22顯示流動细胞計量試驗结果，驗證預先剌激人類T 细胞。 圖23顯示藉ADA同功酶檢定分析分析基因移轉入人類體 细胞效率结果。 圖2 4提供多肽用於感染計畫之示意圔，進一步敘述於實 例1 6 〇 圖25為圖表顯示於圖24標示之肽C-FGF，C-C0L及bFGF存 在下轉導NIH/3T3细胞之效率。 圖26顯示藉流量细胞計量分析檢定分析，於圖24標示之 肽存在下反錄病毒基因移轉入HEL细胞效率。 圖27為圖表顯示於圖24標示之多肽存在下CD34 +骨髓细 胞之轉導效率。 較佳具體例之說明 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 欲促進對本發明之了解，現在參照某些具體例且使用特 殊表達法來敘述之。但須了解絕非藉此限制本發明之範圍 ，業界人士預期本發明相關之如此處示例說明之本發明原 理的變化、進一步修改及應用。 如前述，本發明提供一種藉病毒，如反錄病毒，提高存 活细胞轉導效率之方法。本發明也提供使用重組株反錄病 毒載體有效基因移轉入存活细胞之方法，獲得轉導细胞之 12 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（j 0 ) 方法，及達成自體及其它细胞移植物之方法及材料。 本發明之一特點為發現纖維網蛋白（FH)，及含FN之CS-1 细胞黏著領域之纖維網蛋白片段，可顯著增進反錄病毒媒 介之基因移轉入細胞，如造血细胞，例如載有纖維網蛋白 受體因此具有结合至纖維網蛋白或其片段的能力的關鐽祖 先及原始造血幹細胞或長期培養引發细胞（LTC-1C)。較佳 ，此種效率增高可無須與病毒產生性细胞共同培養。本發 明之其它特點包括發現位於肝素-I[結合領域内的纖維網 蛋白之病毒結合領域。此種病毒结合領域可用於多種用途 定位病毒顆粒，包含例如多種輸送病毒至目標细胞之構成 體。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據本發明之較佳態樣之重組株病毒載體含有外緣DN A 且為非病原性，亦即複殖缺陷。此等重組株病毒載體可有 效移轉且準確穩定整合外緣DN A至寄主细胞，如動物细胞 ，特別哺乳類细胞之细胞DNA。例如，本發明中一個包含 得自感興趣基因之編碼序列氮鹼基核苷酸序列可於適當驅 動基因的促進子，如外緣促進子控制下，合併入重組株反 錄病毒載體内。就此方面而言，外緣DN A含有可天然或人 工生產DNA，可得自衍生自一種來源部份，該部份可為天 然或化學合成分子，及其中該等部份係藉结合或業界已知 其它手段組合。 合併入病毒的外源DNA可為可引進细胞之任一種感興趣 DNA。例如，外源DNA可編碼蛋白質如已知病症相關的ADA ，或反訊息RNA，r ibozyme或假引子（例如參見W0 90 / 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 1 3 - 520395 A7 B7 五、發明説明（11) 13641, 1990年11月15日公告），編碼胞内抗體（例如參見 W0 94/02610，1994年2月3日公告），編碼生長引子等。 如指示，引進的核苷酸序列處於啟動子控制之下，通常 位於啟動子下游。另外陳述，啟動子序列通常位於編碼序 列上游（亦即位於5’端）。於此脈胳中，眾所周知可能有或 無其它調節元體（例如促進子序列）與啟動子及轉錄開始密 碼子共同發揮作用達成外源編碼序列的轉錄。”處於控制 之下”一詞表示存在有其它達成引進基因的轉錄所需元體 。又，重組株DN A較佳包含位於引進的編碼序列下游的終 結序列。 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可使用包含外緣DN A可提供可選擇標記或其它可選擇長 處的反錄病毒載體。例如，載體含有一種或多種外源基因 其可提供對各種選擇劑含抗生素如新黴素抗性。可用於本 發明之代表性載體包含例如N2/ZipTKNEO載體（ΤΚΝΕ0)(力 價：lx 105 GUf cf u/ml 於 N IH 3T3细胞），ZipPGK-hADA 載體，及ZipPGK-mADA載體（先前皆報告於Moritz et al. (1993) J, Exp. Med· 178:529) 〇TOEO 載體中，neo 轉磷 酶序列經由單純疱疹胸腺核苷激酶啟動子表現於訊息取向 (相對於5’長端重複-LTR)。此種載體含有可選擇標記基因 ，其提供新徽素抗性來輔肋鑑別轉導细胞。ZipPGK-hADA 載體中，人類ADA(”hADA”）cDNA經由人類磷酸甘胺酸激酶（ PGK)啟動子於相對於5彳TR之訊息取向表現。僅含有一個 可表現基因序列而缺乏主控可選擇標記。ZipPGK-mADA( PGKiADA)載體與ZipPGK-hADA載體相同，但人類ADA cDHA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） _ 1 4 - 520395 A7 B7 五、發明説明U 2) 以鼠ADA(”mADA”）DNA置換。此等及其它病毒載體及其生產 技術為眾所周知而其執行於用於本發明為業界人士熟知屬 於此處揭示內容。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明使用之病毒載體具有结合至孅維網蛋白包含人類 纖維網蛋白之肝素-I結合領域之胺基酸序列的能力。容 後詳述，雖然本發明不欲受限於任何理論，但相信經由病 毒及细胞结合至個別功能領域而共同局限病毒及目標细胞 有助於增進细胞被病毒轉導。就此方面而言，病毒结合至 肝素-ϋ結合領域胺基酸序列之能力，因而病毒有效用於 本發明之能力亦使用例行程序如下文實例8及9所述程序確 定。一般而言，此等檢定分析決定病毒顆粒結合至含肝素 - I結合領域之制動多肽的程度，因而可對抗由制動多肽 基體被洗掉。簡言之，例如含病毒上清液可於包含纖維網 蛋白肝素-Ε結合領域之制動多肽的孔内培育。然後孔徹 底Μ生理鹽水緩衝液洗滌，隨後病毒的目標细胞於孔內培 育決定殘留於孔内的感染能力。感染活性或力價相對於最 初病毒上清液降低經評估且與類Μ的對照操作（例如使用 BSA-塗覆孔）比較。含肝素-ϋ孔比較對照孔殘留力價顯著 加高表示本病毒適用於本發明。欲輔助此種篩檢程序，如 前述，病毒載體含有可選擇標記基因。 用於本發明之纖維網蛋白片段可為天然或合成來源，可 由天然物質Μ大體純度製備，例如前文述於RuosUhti et al.(1981)J, Biol· Chem. 256:7277; Patel and Lodish (1986)«1.〇611.8][〇1.1〇2:449;及80「113「(116七31. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 1 5 - 520395 A7 B7 五、發明説明（！ 3) (1987)J. Cell. Biol, 105:489。就此方面而言，此處述 及大體純質纖維網蛋白或纖維網蛋白Η段表示其大體不含 纖維網蛋白天然可能出現的其它蛋白質。用於本發明之大 體純質纖維網蛋白或纖維網蛋白片段也可重組生產，概路 逑於美國專利5,198,42 3(1993年3月30日頒予Tasuchi等人 及讓予日本京都寶酒造公司）。特別，下列實例列擧之重組 株片段 H-271,H-296,CH -271,CH-.2 96 及 C-CS1,及其獲得方 法詳逑於此U23專利案。如下實例使用之C274片段係如美 國專利5 , 1 0 2，9 8 8獲得。此等片段或可例行衍生之片段係 經由培養大腸桿菌獲得，大腸桿菌寄存於日本工業科技協 會發酵研究所編號 FERM P-10721(H-296)，FERM BP-2799 (C - 277 經由蛋胺酸鍵結至 Η-271)，FERM BP-2800(C-277 經 由蛋胺酸鍵結至H-296)，及FERM BP-2264(H-271)，亦述 -於美國專利5, 1 98, 423。此外，至於此處可利用的纖維網 蛋白片段之有用資訊或此等片段之原料參見kimiziika et Biochem. 110, 284-291 (1991)，該報告又敘述 前逑重組株片段；EMBO J.， 4， 1755-1759 (1985)，其報 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 告人類纖維網蛋白基因構造；及Biochemistry, 2 5,4936 -4941(1986)，其報告人類纖維網蛋白肝素-I结合領域° 含有CS-1细胞黏著領域及肝素-I结合領域之纖維網蛋白 片段，例如包含於約3 0或3 5 k d片段（3 0 / 3 5 F N )及包含於多 種下列實例報告之重組株片段，可顯著增進基因移轉入造 血细胞功效，故較佳用於本發明。如此須了解，廣義言之 ,本發明使用之孅維網蛋白相關多肽提供一種可提供纖維 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 1 ~16~1 520395 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 :]1) 1 1 I 蛋 白 之 CS -1 细 胞 黏 著 領 域 之 细 胞 結 合 活 性 的 胺 基 酸 序 列 以 1 I 及 可 结 合 病 毒 之 纖 維 網 蛋 白 肝 素 - I结合領域之胺基酸序 1 I 列 〇 業 界 人 士 了 解 所 需 细 胞 -及病毒- 結 合 活 性 可 由 此 等 功 請 先 1 1 I 能 纖 維 網 蛋 白 領 域 之 胺 基 酸 序 列 9 Μ 及 由 與 天 序 列 不 同 阅 讀 背 1 1 但 仍 充 分 類 U 可 具 有 細 胞 结 合 及 病 毒 •结 合 活 性 之 胺 基 酸 序 面 之 注 1 列 提 供 〇 此 等 類 胺 基 酸 序 列 具 有 下 體 序 列 與 其 對 應 序 列 意 事 項 1 同 供 類 具 有 包 所 含 需 胺 细 基 胞 酸 結 已 合 被 或 刪 病 失 毒 结 取 合 .代 特 及 性 /或修改者但仍可提 之胺基酸序列。 再 填 馬 本 頁 t 1 就 此 方 面 而 ,,,¾ ^ > 相 m 生 物 技 術 業 界 已 經 進 展 至 功 能 領 域. 1 1 之 胺 基 酸 之 刪 失 Λ 取 代 加 成 或 其 它 修 改 可 K 例 行 方 式 進 1 | 行 〇 後 所 得 胺 基 酸 序 列 可 例 行 篩 檢 所 需 细 胞 结 合 或 病 毒 1 訂 结 合 活 性 〇 例 如 y 纖 維 網 蛋 白 之 肝 素 -I結合領域之變異 1 I 型 或 修 改 型 之 病 毒 結 合 活 性 可 概 略 如 前 述 9 及 更 特 別 ， 如 1 1 一下 實 例 8及9所 逑 師 撿 9 篩 撿 時 使 用 病 毒 培 育 Λ 洗 滌 Λ 及 病 1 1 毒 力 價 撿 定 分 析 來 測 定 與 對 昭 組 比 較 感 染 能 力 之 保 有 〇 由 k 此 處 教 示 ， 結 合 撿 定 分 析 僅 表 示 業 界 例 行 實 厶 IS 〇 1 I 细 胞 结 合 至 纖 維 網 蛋 白 之 CS -1 细 胞 黏 著 領 域 之 修 改 型 或 1 Γ 異 型 ，或结合至其它细胞结合多肽， 同 理 可 使 用 習 知 技 術 1 1 M 檢 定 分 析 〇 例 如 此 等 程 序 包 含 Na t υ re 3 5 2 43 8 - 441 ( \ I 1 9 9 1)所述* 。簡吕之 ，细胞結合多肽塗覆於塑膠皿上 ，有 1 I 待 檢 定 分 析 的 細 胞 族 群 接 種 於 培 養 基 上 歷 時 30分 至 2小時 1 1 I 0 經 此 培 育 期 後 f 去 除 未 與 蛋 白 質 结 合 的 细 胞 f 計 算 及 檢 1 1 定 分 析 存 活 能 力 0 也 使 用 胰 蛋 白 酶 或 細 胞 解 離 緩 衝 液 (例 1 1 如 G i :b c :〇) 去 除 黏 著 於 多 肽 之 细 胞 9 計 算 數 巨 及 試 田Λ m 存 活 能 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 17 520395 A7 B7 五、發明説明（丨5) 力。某些情況下，例如對造血群落生成细胞，细胞又培育 12 - 14日確定細胞的群落生成特性。然後求出黏著细胞百 分率並與標準對照組如牛血清白蛋白（BSA)塗覆塑膠皿比 較。目標细胞大體结合至經檢定分析的多肽表示多肽/细 胞組合適用於本發明，多肽可偶合至得自纖維網蛋白之反 錄病毒结合片段產生供增進目標细胞被病毒載體感染的本 發明之構成體。 至於本發明之更特定態樣，用Μ增進被反錄病毒載體轉 導之病毒結合多肽包括（i)對應於人類纖維網蛋白之肝素- lt>^〇 iqb〇 I[結合領域Ala -Thr，S 之第一胺基酸序列，以下式（序 列識別編號tt 1)表示： 1ϋ m J— ------^---7^5;衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明 (17) 1 1 或 充 份 類 似 的 胺 基 酸 序列 而 具有 结 合 反 錄 病 毒 能 力 5 及 1 ί I (ί ί) 對 應 於 人 類 纖 維 網 蛋白 之 I CS 結 合 領 域 一 部 份 (CS - 1 1 I 细 胞 结 合 領 域 )之第二胺基酸序列， Μ下式（序 列 識 別 編 號 請 先 1 1 2)表示 閱 讀 1 背 1 As Ρ G 1 U Le U Pr 0 G 1 η Leu Va 1 Th Γ Le υ Pr 0 Hi S Pr 0 面 之 1 注 As η L e U Hi S G 1 y Pr 0 G lu 11 e L e U As P Va 1 Pr 0 Se Γ 意 事 1 Th Γ 再 填 t 馬 或 充 份 類 Μ 之 胺 基 酸 序列 而 具有 結 合 造 血 细 胞 如 原 始 祖 本 頁 1 先 细 胞 及 /或長翻繁殖（幹）细胞之能力c 1 1 I 如 月(I 述 贅 須 了 解 天 妖 序列 之 某些 修 改 及 /或變異於本發 1 I 明 之 實 務 範 圍 内 係 屬 可 能， 只 要所 得 胺 基 酸 序 列 充 份 類 似 1 1 訂 天 然 序 列 而 具 有 结 合 病 毒（於肝素- I 结 合 領 域 之 例 的 能 力 1 I )及结合目標细胞的能力（於 CS -1領 域 之 例 )c 1 1 例 如 > 已 知 具 有 结 合 肝素 序 列且 具 有 大 體 與 纖 維 網 蛋 白 1 1 之 肝 素 -11结合領域同糸序列之已知多肽， •包含例如膠原V «1 1 I 及 纖 維 母 细 胞 生 長 因 子 〇如 下 特例 實 16 驗 證 > 包 含 此 等 鐽 聯 至 細 胞 结 合 序 列 例 如 VLA- 4及/或 VLA- 5结合位置之多肽 1 9 可 用 於 增 進 反 錄 病 毒 媒介 DHA移轉入细胞其结合至细胞 • 結 合 序 列 〇 1 本 發 明 之 一 個 態 樣 提 供一 種 體基 因 治 療 方 法 9 包 括 試 管 I 試 驗 细 胞 治 療 及 隨 後 移 植目 標 细胞 至 宿 主 體 内 f 亦 稱 為 只 1 1 I 有 轉 導 巨 標 细 朐 之 寄 主 ”移植” 。造 血 细 胞 或 其 它 细 胞 » 例 1 1 Ι 如 分 離 白 骨 髓 或 周 邊 血 液之 幹 细胞 9 胚 胎 幹 细 胞 9 或 其 它 1 1 以 CD34 卜及/ ，或 C- • k i ： 為 特徼 的 细胞 可 使 用 標 準 方 案 收 集 白 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 20 ~ 520395 A7 B7 五、發明説明（丨8) 人類或其它哺乳動物來源。例如，造血细胞可收集自人類 給予者之骨髓或周邊血液或收集自胎兒臍帶血。一旦收集 ，造血细胞可選擇性藉標準技術處理而使其富含幹细胞及 /或原始祖先細胞。然後造血细胞，例如可於組織培養皿 上適當培育。於此期間，選擇性地，黏著陰性低密度單核 细胞可於反錄病毒感染之前預先剌激。業界已知及此處使 用預先剌激表示於暴露於反錄病毒之前细胞暴露於生長剌 激因子的過程。此種預先剌激證實可改良造血细胞被反錄 病毒轉導。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 預先剌激之後，收獲细胞並與纖維網蛋白或其片段共同 培育，如此處所述其可增進细胞由反錄病毒轉導頻率。較 佳，细胞係與經純化及/或不可溶，如制動纖維網蛋白或 纖維網蛋白片段共同培育。然後细胞可於可有效提高细胞 被病毒轉導頻率數量之纖維網蛋白或纖維網蛋白片段存在 下，以重組病毒感染，例如含有可矯正细胞内酶或其它蛋 白質缺陷或異常之基因的反錄病毒。然後所得經轉導造血 细胞可κ習知方式，例如經由靜脈引進動物细胞移植物接 受者，較佳為自體給予者但也包含同種異體移植物，後者 於期待血球用作移植物時尤為如此，容後詳述。 本發明方法可用於多種病症包含骨髓病症之基因標記或 基因治療計畫，例如包含癌症、白血病、涉及蛋白質缺陷 或異常之病症，及作為修改造血细胞而改良對其它治療計 畫如化學治療之抗性之療法。本發明有用之代表性病症包 含ADA缺陷，例如ADA缺陷SCID，兒童急性骨髓原性白血病 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2 1 _ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 '—------—- 五、發明説明Π 9)

I (AML),神經母细胞瘤，及成人AML及急性淋巴球性白血病 (ALL) 〇 本發明之特佳具體例中，用作细胞移植物之细胞係得自 人類期待血。如此，可收集人類期待血及例如經由獲得黏 著陰性之低密度單核细胞族群而富含可存活原始造血细胞 及/或幹细胞。然後此一族群選擇性經預先剌激，及於反 錄病毒載體及制動及/或純化纖維網蛋白或纖維網蛋白片 段存在下培育，俾增進细胞由載體轉導效率。於此方面發 現得自期待血之原始造血细胞及/或幹细胞之轉導於纖維 網蛋白或纖維網蛋白存在下大為增進，即使纖維網蛋白並 未構成期待血之ECM之一部份以及即使得自期待血之原始 袓先细胞及幹细胞特徵與得自骨髓之细胞不同亦如此。特 別，期待血幹细胞特徵化為CD34+ ，HLA-DR+ ，而得自骨 髓之幹细胞特徵化為CD34+ ，HLA-DR~ 。發現得自期待血 之原始祖先细胞可於纖維網蛋白或纖維網蛋白片段存在下 K增進方式轉導，因而可使用方便且高度富含幹细胞的造 血细胞源。此外，Μ富含原始祖先细胞及幹细胞之期待血 之同種異體移植物成功地移植多涸病人，使期待血變成造 血细胞之高度較佳來源。參見fCohli-Kummer et al.,

Brit. HeaeraatoK 85*419-422 (1993)；Broxmeyer et al., Blood Cell 17:313-329 (1991); Gluckman et al·， Br· J. Heaematol* 45*557 (1980)； Heidelberg*

Springer-Verlag pp. 60-68 ( 1 9 8 9 ) ； Wagner et al.,

Blood 79:1874-1881 (1992);及 Wagner et al*, Blood 本紙張尺度適用中國國家標準（cnsYa4規格（210X297公釐） -22 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

520395 Α7 Β7 五、發明説明（20) 82-86a (Abstract) · 若有所需，收獲的經轉導造血细胞或其他细胞可試驗轉 導效率及基因表現。例如，本發明提供反錄病毒媒介基因 移轉之顯著改良可於下列特例驗證，其敘述若干試驗驗證 於纖維纈蛋白或有效纖維網蛋白片段存在下被反錄病毒感 染及基因移轉效率高。特別，MPGK-hADA反錄病毒感染的 鼠造血细胞可表現高濃度經移轉釣A D A c D N A。同理，個別 PGK-m ADA病毒感染人類祖先群落表現鼠ADA濃度比內生性 人類ADA蛋白質更高10倍。因此，欲嚴格分析移轉效率， 考慮袓先群落僅能於經移轉m ADA的表現等於或大於内生人 類ADA濃度時視為被轉導。得自ΤΚΝΕ0載體高度表現neo可 由G418抗氧性檢測，作為新磷酸轉移酶（neo基因產物）活 性之檢定分析。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 - 如前述，本發明方法可優異地進行而無須於反錄病毒生 產者细胞存在下共同培育。如此，根據本發明之一種態樣 ，反錄病毒媒介基因移轉可於大體無目標造血细胞或其他 细胞K外的细胞存在下進行。例如，含反錄病毒載體質體 之生產者细胞可經培養及收集上清液。然後含反錄病毒上 清液用於纖維網蛋白及/或纖維網蛋白片段存在下感染造 血細胞，纖維網蛋白及/或Η段較佳為制動形式，例如塗 覆於進行感染之基質上，或Κ其它方式接觸感染介質。 於此方面，任何可產生高力價不含助手細胞之反錄病毒的 生產者细胞預期皆適用於本發明。例如包含包裝细胞如 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（21)

Psi-2，C2，PAI2，PA317，及 GP + eyivAM12，Μ 及業界已知 之多種其它包裝细胞株。 根據本發明之其它特點，病毒強力結合於纖維網蛋白之 肝素-Ε结合領域内部的胺基酸可用來構成廣泛多種细胞 類型之病毒治療的輸送系統。欲達此目的，包含得自纖維 網蛋白之反錄病毒结合領域的多肽可共價偶合至任何配合 基其可獲得此種構成體對目標细胞的特異性。此種辦法可 克服過去需要對各種目標细胞構成特定反錄病毒细胞株（ Kasahara, N . , A· M. Dozy, and Υ· W. Kan., Science, Vol. 266, pp· 1 373- 1 376 ( 1 994)及 Valsesia-Wittfflann, S · , A · D r y n d a , G · D e 1 e a g e , M ♦ A u m a i 1 1 e y , J ♦ M · Heard, 0. Danos, G· Verdier, and F· L· Cosset, J· Virol·, Vol ♦ 68, pp 4609-46 1 9 ( 1 994))。目標構成體 之特異性可經由使用配合基提供，配合基包含例如1)细胞 黏著蛋白質，2)激素或细胞激素，3)目標细胞之單株抗體 ，4)结合目標细胞之碳水化合物（G· Ashwell，et. al·， Annu· Rev· Biochem.，Vol.51, ρρ· 53 1 -554 ( 1 982 ))， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 5)目標细胞之代謝產物，或6)结合目標细胞之功能多肽。 構成體供基因輸送效率可藉包含數種肝素-I病毒結合領 域改良，因此增加輸送至目標细胞之病毒顆粒量。例如， 對應於？「〇〃34?-$6"95(如美國專利5,1 98,42 3所述）之人 類纖維網蛋白之细胞結合領域顯示可結合至含ΒΗ1(及Β16-F10細胞之细胞（Kimizuka et al., J. Biochem· Vol. 110, pp. 285-291(1991))。此外，顯示肝素-Π領域本身 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 2 4 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 五、發明説明（22) 可结合至纖維母细胞、内皮细胞，及腫瘤细胞。此等多肽 序列可偶合至得自纖維網蛋白之反錄病毒结合領域而鎖定 預定细胞被反錄病毒感染。 造血糸統之應用範例也包含紅血球生成數或G-CSF偶合 至纖維網蛋白之反錄病毒結合領域供分別鎖定高度特異性 之類紅血球细胞或顆粒球前驅细胞之構成體。本發明之另 一常見應用係組合反錄病毒結合領域與可特異性或主要结 合至惡性腫瘤細胞之配合基。例如，於試管試驗甚至活體 試驗顯示使用結合至目標细胞上的受體物質，例如黃體化 激素釋放衍生物可影響乳癌细胞的生長，Emons, G. et al,, Hum. Reprod* 9:1364-1379(1994)，動情素，

Tolcher, A. W., Oncol. 8:39-43(1994)，或抗動倩素，

Howell, A* et al·, Lancet 345:29-30(1995)，助孕素 或抗助孕素，Klijn. F.G. at al. Hum. Reprod· 9

Supp 1 . 1:181-189(1994) ; Griffiths, K. et a 1 .,

Semin, Oncol, 21:672-687(1994)，其將作為本發明之含 有一或多個得自纖維網蛋白之病毒结合領域的構成體中之 配合基。至於進一步範例，甲狀腺（例如癌）细胞可使用附 有Jodid之構成體高度特異性鎖定目標，而肝（癌）细胞可 藉合HDL或其部份之構成體鎖定目標。最後，單株抗體與 纖維網蛋白之反錄病毒結合領域之構成體可鎖定該抗體對 抗之细胞及器官之目標。如此廣泛哺乳類细胞可由孅維網 蛋白之反錄病毒結合領域結合及局限病毒載體之能力鎖定 目標〇_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） · 25 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¾------iT------— 520395 A7 B7 五、發明説明（23) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於 f 合蛋及謝结 Μ 舉 驗例理構鎖 病 泛效如效 用 Η 配種# 代性可別 試素生限供 限ne廣導例導 可 h 之一 IP , 異體特 管因與局脈 局Γ1經轉於轉 其 § 上另 Μ 素特成， 試.種體統靜 同 te 曾毒在低 I 0 e η 體 I 其或 — 激佳構用 於多成糸門 共ffleiη質病存降含 成素合白1, 較總使 用慮構送於 括dihr物錄de著不 構肝结蛋_«>有的式 述考毒輸管 包xaet子反mi顯體 備之胞網^(11具得形 前，病改導 之heinl離由ΓΟ會大 製白细維 uoη它獲動 如標錄修置 明無ad陽良 bs0 含 蛋標纖SP其果制 可目 反由留 發體ex多改ne計至 包網目自J^Dbo何結呈 法毒及經如 本大 1 種供Γ1轉於 例維至得^offl任。式 方病 K 可例 現或 —一畫th移係 體纖合為hr或基方 標錄，也， 發無 是計 m 因法 具。偶可tt, 合之 目反性性良 於於e)轉di基方 佳導列基igfi)配肽 定定異異改 關當 Leη移Xa進良 較轉序合 utI· 的多 鎖鎖特特胞 係，br因he增改 S-毒酸配㈣ΟΪ1Β 力白。胞驗及。細 樣法ly基現限之 之病基，㈣OP“能蛋例细試性用標 態方 ιρο<7Γ發局明 明之胺論 MteH 的網實及體定作目。 一導 名媒，同發 發胞合討 Mosi 胞維列體活穩互至標另轉 品毒此共本 本細结之(®, 體细纖下成於之交送目之之 g 商病如之， , 標毒前肽白抗標於於構用體之輸胞明胞 ee(錄言述Jit 此目病如多蛋，目用明等亦成下之細發细idid反雖所如 如進之。之網物至似說此及構件體肝本及omora於。處 。 増域基白喊產合類例 ，如條成定 毒brbr用率此率 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 痛26 520395 A7 B7 五、發明説明（24 ) hexadimethrine bromide (亦即含有不多於約 1// g/ffll hexadimethrine bromide)之介質内進行，更加於無 hexadimethrine bromide存在下進行。此種方法提供本發 明之較佳细胞組成物，其包含大體反錄病毒轉導的存活细 胞族群，其大體不含反錄病毒生產者细胞及 hexadimethrine bromide。就此方面而言，此處使用大體 轉導的存活细胞族群表示族群內至少20¾细胞已經由反錄 病毒轉導。更佳族群為至少約5 0 S：轉導细胞，最佳至少約 75¾轉導细胞。根據本發明，此一態樣之較佳细胞組成物 包含造血细胞，更佳包含富含原始祖先细胞及幹细胞之造 血细胞族群。一般而言，本發明之優異方法可於無多陽離 子劑或其它劑#在下進行，於對應反錄病毒感染計晝（例 如共同培養）不含纖維網蛋白片段或其它共同局限材料， 導致轉導效率增高，但該等劑於共同局限材料存在下降低 轉導效率。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 預期利用特別設計供實施本發明方法之套件組可進行高 度方便的反錄病毒媒介DN A移轉。如此，本發明之另一態 樣提供套件組其包含定量前述實質純質多肽或構成體其可 增進目標细胞被反錄病毒轉導，連同可進行反錄病毒感染 之人工基質。多肽或其它構成體可分開提供或塗覆於人工 基質上。Μ感染人類造血细胞為例，套件組亦含细/§陶剌激 用之造血细胞生長因子。此外，套件組包含前述轉導用之 重組反錄病毒載體。概略而言，套件組包含無菌包裝其可 保持個別套件組成份彼此充分隔開，以防套件組處理期間 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 一 2飞一 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 五、發明説明（25) .各成份破裂。如此，常見實務係利用具有多隔間或多區的 模塑塑膠物件來保持套件組成份圼隔開關係。 欲促進進一步了解本發明，提供下列特例。須了解此等 實例僅供示例說明而非限制性質。 實例1 使用ΤΚΝΕ0基因移轉人骨髓细胞 1,1 病毒上清液之製備 GD + EnvAM 12 生產者细胞（參見 MarKowitz et al. (1988)Virology 167:400)含反錄病毒質體1'0£0載體於伊 思可改質杜別克培養基（IMDM, Gibco，馬里蘭州蓋瑟堡） 培養，培養基含有10%胎牛血清（PCS，Hyclone，猶他州羅 根）及lOOiu/ml青黴素及lOOMg/ml鏈黴素（P/S，皆為 011)<:〇)。藉加入1〇1111含20% FCS之IMDM至融合平板隔夜收 集含病毒上清液。收獲培養基經0.45微米濾膜（Gelman Sciences,密西根州恩哈伯）過濾及於使用前儲存於-80¾。 1.2纖維網蛋白片段之製備 FN如先前述於 Ruoslahti et al·, Methods Enzymol*82 :803-831 (1982)由人類血漿（Lifesource，伊利諾州 G lenv iew)純化，但明膠-瓊脂柱Μ 1M尿素洗滌隨後FNK 4M 尿素溶離。純化後之FN於4£1〇對1〇11^ 3-(環己胺基）-卜丙 烷磺酸（CAPS)，150inM Na(M，2mM CaCl2 pH 11.0 徹底透 析及整份儲存於-80 1C。FN之胰凝乳蛋白酶細胞結合領域 (C B D ) ( C S - 1)及肝素-I结合片段如前述純化（R u 〇 s 1 a h t i e t a 1 . ( 1 9 8 2 )，supra, Patel and Lodish，J . Cell. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 28 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T d 520395 A7 B7 五、發明説明（2B )

Biol, 102， pp. 449-456 (1986)，及 Bernardi et al·, J· Cell. Biol· 105, ρρ· 489-498 ( 1 987 )).三個主要肝 素结合片段（30KD，35KD及 42KD)係得自由肝素-瓊脂柱 之1Μ HaCl溶離分。欲進一步純化肝素结合片段，1Μ NaC 1溶離分於4°C對ΙΟιπΜ T r i s - H C 1，ρ Η 7 . 0透析隔夜及通 過陰離子交換柱（2ml DEAE西法羅斯（Sepharose)快速流（ Pharmacia精细化學品公司，瑞典Uppsala)/ing蛋白質）其 事先 MlOioM Tris-HCl PH7.0平衡。30/35KDH 段收集於與 未結合部份而42KD片段係KlOOinM HaCl由柱溶離。由500 mg FN獲得約26mg 30/35KD片段及4mg 42KD片段。42KD片 段可藉纖維蛋白结合領域抗體藉西方墨點計數測定辨認， 但30/350片段則否。又，42KD片段结合至纖維蛋白/西法 羅斯親和柱。 用於感染，纖維網蛋白Η段M75pmol/cffl2濃度制動於 35或ΙΟΟιπιπ培養皿（Falcon，紐澤西州林肯公圜），如Patel 及Lodish(1986)，參見上文所述。對照平板Μ類似方式塗 覆^2¾(不含FN)之牛血清白蛋白（BSA，Boehringer Mannheim，德國曼坦）。 1.3 反錄病毒感染計畫 得自健康成人給予者之骨髓樣品根據印地安那大學醫學 院法規審議委員會核淮方案收集於含無菌且不含保藏劑之 硫酸鈉-肝素試管内。低密度單核細胞係經由於Ficol卜

Hypague(密度 1.077g/rol，Pharmacia ’ 紐澤西州皮卡威） 於25t：離心45分鐘。塑膠黏著细胞經由於37¾於5% (：02於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 29 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 开填寫本 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 五、發明説明Γ27) 含2XFCS之I MD Μ又於組纈培養平板培育4-16小時而由低密 度骨髓细胞去除。 黏著陰性之低密度單核细胞於反錄病毒感染前預先剌激 ，如 Luskey et a 1 · ( 1 992 ) B 1 οod 80 : 396先前所述，前 剌激係於37t：及5% C02於IMDM進行48小時，IMDM含20¾ FCS，1 0 0 /i /ml rhIL - 6，lOOng/ffll rhSCF(皆得自 Amgen’ 加州千橡），及？/5於细胞密度1父1〇6细胞/1»1於培養皿培 養。前剌激细胞藉激烈抽取而移出鬆鬆黏著於塑膠的细胞 收獲〇 前剌激细胞（5X105细胞/ ml)於塗覆有BSA(對照平板） 或纖維網蛋白或其片段（接受紫外光照射而使蛋白質更黏 著於塑膠板）之平板培育6小時然後於生長因子（如前述）及 7.5/ig/ffll polybrene(Aldrich化學公司，威斯康辛州米 瓦基）以病毒上清液感染。2小時後更換病毒上清液（含生 長因子及5.0y g/ml polybrene)及细胞又培養12-24小時 。每次更換培養基時再添加未黏著细胞。 於感染計畫後，傾析去除未黏著细胞而黏著的造血细胞 根據製造商指示使用细胞解離緩衝液（CDB)(不含酶/基於 PBS，Gibco)由培養醪收集。黏著细胞添加至未黏著部份 ，洗二次及計算數目。收獲细胞接種於純株產生性甲基孅 維素祖先细胞撿定分析或長時間骨髓培養。 1.4 長期骨髓培養 LTC-1C (人類幹细胞）檢定分析係根據前述方法略為修改 進行0 Sutherland et al· Blood 74:1563(1989)。簡吕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） , - - · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 五、發明説明（2S) 之，0.5-1X106感染细胞播種於長期骨髓培養（LTMC)， LTMC包含6孔組織培養平板（Costar，麻省康橋）内融合預 先照射（如前述）之同種異體人類骨髓纖維母细胞（BMF)於 5ml IMDM，IMDM 含 1(UFCS，10¾馬血清（Sigma)及 P/S，IX 10- 5 M hydrocortisone(Upjohn，密西根州 Kalamazoo) ，及320mosmol氯化納。LTMC於330 °C於5¾ C02培育每周去 除50¾培養基及未黏著细胞進料。5周後，使用CDB犧牲LTC - 1C培養而由BMF去除黏著造血细胞。未黏著於黏著造血细 胞組合及接種於甲基纖維素獲得衍生自LTC-1C之群落。 1.5 純株產生性甲基纖維素檢定分析 甲基纖維素撿定分析係如Toksoz et al, Proc, Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 89, p7350 (1992)先前所逑進行 ，但略有修改。簡言之，2.5X104感染成人骨髓细胞接 種 5w/inl 紅血球生成素（Epo，Amgen)，100ng/ml rhSCF， lOng/ml rhIL-3 (Genzyme，麻省康橋）於 Irol 2,4¾ IMDM甲基纖維素（Fluka，紐約州洛可卡馬）含25% FCS， 10%人血漿，10 - 5 Μ泠-氫硫乙醇（Sigma)，及P/S。培養 醪於371C於5¾ C02/95S!空氣培育及群落（多於50個细胞）於 第13日於反相顯微鏡上撿査依CFU-GM(含顆粒细胞及巨噬 细胞），CFU-Mix(含類骨髓及類紅血球元體），或BFU-E(僅 含類紅血球元體）記分。 1.6 反錄病毒感染之分析 感染ΤΚΝΕ0病毒之效率係經由於第13日測定甲基缴維素 群落對l,5mg/nil(乾粉，Gibc〇)G418之抗性百分率分析。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7_ 五、發明·説明（29 ) 各個實驗進行Mock感染’係於GP + EnvAM12包裝株上培育骨 髓使其不含重組株病毒。此種Mock細胞與1.5fflg/ml G418 培養一致地驗證小於1背景群落。 1.7 基因移轉入祖先细胞之效率 轉導效率係經由感染骨髓细胞同時接種於30/35FN一或 BSA-塗覆皿比較。感染後未經選擇所得群落數目無差異。 圖2驗證感染後G418h (群落百分率。由各型祖先细胞，包 含衍生自繼代培養約束（BFU-E及CFU-GM)以及办繼代培養 (CFU-Mix)袓先细胞衍生而得者之30/35FN所得G418K群落 百分率較高。30/35FN相對於BSA感染於全部祖先细胞增高 9倍。 1.8 基因移轉入長期培養引發细胞之效率 基因移轉入LTC-IC係使用ΤΚΝΕ0載體評估。基因移轉入 LTC-IC衍生群落僅於感染於30/35FNU6% G418’相對於0¾ G418〃群落，30/35FN相對於BSA)後檢測。 1.9 30/35FN對造血细胞感染效率之特異性 欲測定於30/35FN所見基因移轉效率增高之特異性，於 塗覆有下列各者之平板ΜΤΚΝΕ0感染：BSA; 30/35 FH;完整 纖維網蛋白；含有中心细胞結合領域（CBD)且含RGDS四肽序 列之115kd FN片段；及42kd C-端FN片段，（42FN)其特徵 為含肝素-I結合領域但不含CS-1序列（圖1)。於BSA感染 獲得 3 士 1% G418r BFU-E， 1 士 1 % G 4 1 8 h C F U-G Μ，及 0土 0S： 0418^ CFU-MIX.於CBD未見G418K群落比例顯著增高，於 42FN發現BFU - E感染略為增高（6.0 土 -1S；)(圖3)。但，完整 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3 2 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 d 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 B7 五、發明説明（30) FN啟動可提高基因移轉入全部關鐽祖先细胞。感染於完整 FN後G4181"群落之百分率於各繼代培養皆低於30/35FN，包 含 BFU-E(16±-2 相對於 24 士 4!K)，CFU-GM(5 土 2 相對於 20 士 4¾)及 CFU - Mix(6土 1 相對於 9土 1;完整 FN 相對於 30/35FH)。 實例2 使用PGK-mADA基因移轉人骨髓细胞 2.1 概略程序 如實例1對ΤΚΝΕ0所述製備PGK_niADA病毒上清液。如實例 1所述製備纖維網蛋白之胰凝乳蛋白酶片段（圖1)並遵循實 例1之反錄病毒感染方案。LTC-1C(人類幹细胞）檢定分析 及甲基纖維素檢定分析係根據實例1進行。 2.2 反錄病毒感染分析 K PGK-mADA載體感染效率係使用ADA同功酶電泳藉蛋白 質分檢測定。各別袓先群落之分析係如Mor itz ( 1 993 )及 Lίm et al. (1989)Proc^ Natl. Acad. Sci., USA,

Vol. 86,p 8892先前所述進行。欲嚴謹分析移轉效率，僅 於比較內生人類ADA相同或更高濃度表現niADA之群落視為 經轉導。欲分析匯集群落，由甲基纖維素培養失去的群落 組合於1 . 5 m 1微試管（R a i n i η，麻省渥本），K熱培養基及 磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)洗滌，離心及儲存於-20 °C。供ADA 分析，细胞藉反覆冷凍/解凍周期分解於5/z 1分解緩衝液 而同功酶電泳係如前述進行。 2.3 基因移轉入關鐽祖先细胞之效率 轉導效率係經由感染骨髓细胞接種於30/35 FN-或BSA -I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~ - 33 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 d 520395 A7 B7 五、發明説明（31) 塗覆皿比較。兩種條件於感染後未經選擇所得群落數目未 見差異。如表1所示，感染入全部關鐽祖先细胞之效率於 30/35 FN比較BSA大體增高。如使用高力價（約1X1 07病毒 顆粒/ml)載體預期，關鐽祖先细胞之轉導效率極高。參見 表1，M PGKiADA感染30/35 F N上的骨髓於二次各別實驗 獲得近100¾:關鐽祖先细胞之轉導。 表1 使用PGK_m ADA載體於纖維網蛋白30/35片段上感染關鍵人 類袓先细胞之效率 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝. 實 驗 BSA 30/35FN 實驗1 1 / 1 8 ❖ 13/14 實驗2 2/13 12/13 “ADA數目表示群落/總分析群落 訂 2.4 基因移轉入長期培養引發细胞之效率 -1¾ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 K PGK-mADA進行的四次獨立實驗中顯著比例之衍生自5 周齡LTMC之祖先群落（亦即LTC-IC衍生群落）表現經移轉的 鼠ADA基因。表現係占分析群落之2/12(17¾)至6/6(100¾) 之範圍（表2)。引進之mAD A基因的表現超過或至少等於全 部群落之內生人類ADA活性量視為陽性反應。PGK-mADA之 感染效率高於ΤΚΝΕ0。如表2所示，MPGK-raADA感染於 30/3 5 FN之骨熥於二次各別實驗獲得近100¾關鐽祖先细胞 轉導。 表2 使用PGK-roADA載體感染人類長期培養引發细胞（LTC-IC)之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 一 34 - 520395 A7 B7 發明锐明（32 ) 效率 實驗 BSA 30/35FN 實驗1 0/14 本 10/19 實驗2 Ν/Α 2/12 - - —--—--- 實驗3 0/4 3/5 實驗4 0/4 6/6 總計 0/22 21/42 夂inADA數目表示群落/總分析群落； Μ/A :未分析 2.5 30/35FN對造血细胞感染效率之作用特異性 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 基因移轉入LTC-1C之效率於30/35FN增高。由於二次 LTC-1C衍生群落之大小相對較小，故於單一群落進行蛋白 質分析的能力有限。於BS AM PG Ki ADA感染後，完整纖維 網蛋白及42FN0/6，0/4，及0/3 L Τ Ο I C -衍生群落分別驗 證表現鼠ADA，而3/5 LTC-IC衍生群落感染於30/35FN表規 的mADA。此外，於另外二次實驗分析前匯集多個LTC-IC衍 生群落，於30/35FN感染後僅測得inADA表現，於完整FN之 程度較低，但於42FN或BSA則否。 實例3 使用DGK-hADA基因移轉人骨髓细胞 3.1 概略程序 如實例1對ΤΚΝΕ0所述製備PGK-hADA病毒上清液。如實例 1所述製備纖維網蛋白之胰凝乳蛋白酶片段（圖1)並遵循實 1之反錄病毒感染方案。LTC-IC及甲基纖維素檢定分析 35 ------,----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（33 ) 係根據實例1進行。 3.2 反錄病毒感染分析 欲分析匯集群落，由甲基孅維素培養檢出之群落合併入 1 . 5 in 1微試管（R a i n i η，麻省渥本），K溫熱介質及P B S洗滌 ，離心及儲存於-20 °C。供ADA分析，细胞藉反覆冷凍解凍 周期分解於1分解緩衝液及如前述進行共功酶電泳。 實例4 使用ΤΚΝΕ0基因移轉入臍帶血液细胞 4.1 概略程序 TO E0病毒上清液及纖維網蛋白之胰凝乳蛋白酶片段（圔 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1) 係 如 前 實 例1所述製備。 •遵照實例1. 之反錄 病 毒感 染 方 案 但 得 白 正 常 足月 新 生嬰兒 之臍帶 血根： 據印地 安 那大 學 翳 學 院 法 規 審 議 委員 會 核淮的 方案收 集入 含肝素 之 試管 內 ， 並 用 K 替 代 骨 髓細 胞 〇 LTC- 1C (人類幹细 1胞）及 甲 基纖 維 素 檢 定 分 析 根 據 實例 1施行。 4 . 2 基因移轉入關鍵祖先细胞之效率 三 次 各 別 實驗 中 於FN30/35之感染比較BSA 高 4倍（ 表 3) 〇 表 3 使 用 30/35FNH段及ΤΚΗΕ0載體感 染臍 帶血袓 先 细胞 之 效 率 BSA 12 土 17 30/35 55 士 16 實 例 5 使 用 PGK- -m A D A 基 因 移轉入 臍帶血 流细 胞 .1 概略程序 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（34) 液述 清所上们 ΑΓ前 AD如 f 係 K V), G 1 P圖 新 月 足 常 正 自 得 但 案 方 段 g 學 片染大 酶感2白了 S 也 蛋錄地 乳反印 凝 U 據 之 胰 1 根 之例血 白實帶 蛋照臍 網遵之 維。兒 纖備嬰 及製生 内維 管纖 試基 之甲 素及 肝丨 含 入 集 收 案 方 的 淮 核。 會 胞 員细 委髓 議骨 審代 規替 法M 院用 學並 醫 ，

L 胞 细 幹 類 人 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 素檢定分析根據實例1施行。 5.2 基因移轉入長期培養引發细胞之效率 使用高力價PG Ki ADA載體，分析LTC-1C衍生群落驗證高 度表現引進的mAD A cDN A僅得自使用上清液與FN 30/35感染 臍帶血建立的培養。於BSA對照平板於LTC-IC衍生群落極 少測得m A D A之表現。 實例4及5之結果驗證使用IN 30/35之改良效率僅能於使 用臍帶血袓先细胞及幹细胞時達成。 實例6 使用PGK_h ADA基因移轉人臍帶血流细胞 PGK-h ADA病毒上清液及纖維網蛋白之胰凝乳蛋白酶片段 (圖1)係如前實例1對ΤΚΗΕ0所述製備。遵照實例1之反錄病 毒感染方案但得自正常足月新生嬰兒之臍帶血根據印地安 那大學醫學院法規審議委員會核淮的方案收集入含肝素之 試管内，並用K替代骨髓细胞。LTC-IC及甲基纖維素檢定 分析根據實例1施行。 實例7 - 11 實例7-11之反錄病毒載體及生產者细胞株 實例7-11使用兩株反錄病毒生產包裝细胞株： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —3 ? _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 520395 A7 B7 五、發明説明（35 ) ecotropic GP+E86 (Markowitz, D., S. Goff, and A. Bank, J· Virol·, Vol· 62, pp 1120-1124 (1988)) 及親兩性 GP+envAM12细胞株（Mavkowitz，D.， S· Goff， and A. Bank, Virology, VoK 167, pp 400-406 (1988))。用於此處研究之反錄病毒載體及生產者純株列 舉於表4。 表4

載 體 生產者/純株 表現c D N A PGK-hADA GP+E86/EPHA-5 人類ADA Ρ Μ 5 n e ο GP+E86/EAL2a 新磷酸轉移酶，LAC-Z TKNeo GP+E86/TKNeo 新磷酸轉移酶 PGK-mADA GP+EnvAM12/55/6 鼠ADA 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 全部细胞轉皆於杜別克改質鷹式培養機（DME，Gibco，紐 約大島）培養，培養基含有10¾胎牛血清（FCS，Hyclone， 猶他卅洛根）及100/i/ml青黴素及100/ig/ml鏈黴素1 P/S ，皆得自Gibco)，但EAL2a细胞係於含10¾ FCS加P/S之 DME-F12(Gibco)生長。收集含病毒上清液，對鼠细胞係添 加lOinl α-最低必須培養基（aMEM，Gibco)或對人類细胞 係添加伊思可杜別克培養基（I M D Μ，G i b c 〇 )各別含1 0 % F C S 加P/S使10cm平板生長至融合隔夜。收獲的培養基通過 〇.45Win濾膜（Gelraan Sciences，密西根州思哈伯）過濾及 使用前儲存於-80t：。 實例7 一次鼠造血细胞之轉導 尺 一張 一紙 I本 準 標 家 國 國 中 用 I適 格 一釐 公 7 9 2 8 3 520395 A7 B7 五、發明説明（36) 7.1 實驗 使用鼠细胞研究，骨髓係得自6至8周齡C 3 H / H e J小鼠投 予150mg/kg 5-氟脲嘧啶（SoloPack實驗室，伊利諾州富蘭 克林公圜）後2日由股骨及脛骨收獲（Lim, B., J.P. A p p e r1e y, S.H♦ Orkin, and D.A* Williams, P r o c . Natl. Acad . Sci· USA , Vo 1 · 8 6,· pp 8892-8896 (1989)) ♦细胞 M5xi〇5 细胞 / ffli 濃度於 IMDM/20%FCS 加 P/S 含lOOmg/ml大鼠重組株幹细胞因子（rrSCF; Amgen，加州 千橡）及100/i/inlfi組株人類介白素-6(rhIL - 6; Ρθργο Tech Inc·,紐澤西州岩山）預先剌激48小時（Luskey, B, D·， Rosenblatt, Κ· Zsebo, and D*A. Williams, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Blood, Vol· 80, pp 396-402 ( 1 992 )) ♦隨後，由 EPHA-5 生產者细胞生產之PGK-hADA載體之基因移轉效率使用三種 不同感染方案進行比較：1)上清液感染；2)與FH30/35之 上清液感染；3)於EPHA-5生產者细胞之共同培養。因此， lOOrain細菌培養皿塗覆M2,5/ig/cm2 FN30/35(相當於75 Pmol/cin2 )溶解於5ιπ1磷酸鹽媛衝鹽水（PBS; Gibco)於室 溫於紫外光照射下打開蓋經歷1小時及關上蓋又經歷1小時 。於室溫M 2¾牛血清白蛋白（BSA，部份V ; Boehr inger M a η n h e i ππ 地守喊狎波里）遮斷30分鐘後，培養皿K補充 有2.5!K(V/V)1M Hepes之漢克平衡鹽溶液（HBSS)(二者皆得 自Gibco)洗一次。而上清液感染僅使用塗覆MBSA之皿。5 χ 1〇6前剌激給予者细胞與得自EPHA-5细胞（如前述補充 有 100U/ml r hIL ~ 6 » 100ng/ml hrSCF及 7.5ug/ml 39 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 520395 A7 B7 五、發明説明（3 r) polybrene)所得ΙΟιπΙ病毒上清液共同培育。收集未黏著细 胞並再添加新鮮病毒上清液。供共同培養，ΕΡ Η A-5细胞於 4ml培養基與10/ig/ffll mitomycin C於37°C共同培育2小時 ，洗滌，以胰蛋白酶分解及接種於lOOfflffi組織培養皿於 10ml αΜΕΗ/20% FCS 加 P/S，濃度 3X106 细胞。次日， 添加5X106前剌激骨髓细胞含lOOiu/ml rhIL-6，100hg/ ml rrSCF 及 4/i g/inl polybrene歷 48小時。感染方案後， 傾析去除未黏著细胞而黏著的造血细胞根據製造沲指示使 用细胞解離緩衝液（CDB)(不含酶/基於PBS，Gibco)又培養 收集。黏著细胞添加至未黏著部份，洗二次及懸浮於約 1ml HBSS/Hepes。得自5X 106前剌激细胞之全部细胞注 射曾經接受致命總計量照射（使用700加400cb，WCs來源） 的三頭接受者小鼠體（Luskey, B.D., Μ· Rosenblatt,K· Zsebo, and D.A* Williams, Blood, Vol* 80, pp 396-402 (1992)).造血幹细胞之轉導係經由檢視重建小鼠之引 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 進人類ADA cDNA之表現分析。ADA同功酶之分析係於移植 小鼠藉纖維素乙酸酯原位酶分析檢視周邊血液是否存在有 hADA蛋白質進行（Lim, B., D· A· Williams, and S*

Ork i η , Mol . Cell. Biol., Vo 1 . 7, pp 3459-3 465 (1987)).檢視始於移植後4個月且每月重複進行。 7.2 結果 以基因操縱造血幹细胞進行小鼠之長期骨髓重建一般接 受作為移植後4個月測定幹细胞轉導效率的橫式。7個月後 藉同功酶分析接受者之轉導骨髓顯示：1)人類ADA cDHA表 40 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 A7 B7 1、發明説明（3 S ) 現存在於FN30/35上使用共同培養或上清液感染組’但不 存在於不含FN30/35之上清液感染後移植組；及2)表現程 度媲美共同培養組及FN30/35組。如圖4，行2-4顯示，3頭 小鼠移植經由於EPHA-5细胞上共同培養而轉導的骨髓驗證 易撿測人類ADA。3頭移植藉FN30/35上清液感染轉導的造 血细胞可測得人類ADA之類Μ含量（圖4，行5-7)。相反地 ’三頭移植於BS Α上藉上清液感染轉導的造血细胞未測得 人類ADA(圖4，行8-10)。人類ADA之位置對照組示於圖4之 行1及12及鼠ADA示於行11。行2-10之鼠帶顯示載有等量蛋 白質。經由於PN30/35上藉上清液感染轉導長期重建造血 幹细胞等於共同培養組遠優於不含FN 30/35之上清液感染 組。 賓例8 藉反錄病毒載體结合至FN30/35改良轉導之機轉 8. 1 實驗 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 欲實驗轉導增高是否為病毒及造血细胞共同定位結果， 發明人分析重組株反錄病毒顆粒驗證結合至FN30/35。因 此，FN 30 / 3 5塗覆平板與含TKNeo病毒之上清液前培育30分 鐘，隨後徹底洗滌。上清液之病毒力價係根據標準程序使 用 NIH/3T3细胞測定（Markowitz, D., S. Goff, and A· Bank , J · Virο 1 ·，V ο 1♦ 62, pp 1 1 20 - 1 1 24 ( 1 988))。簡 言之，3T3细胞Μ 1000细胞/孔濃度接種於6孔組織培養平 板及生長隔夜。一糸列病毒上清液稀釋液加至各孔含7.5 w /ml Polybrene及於371C培育2.5小時随後加入2ml培養 41 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7_五、發明説明（39) 基。24小時後，培養基Μ含G418((K75rag/ml，乾粉， Gibco)之培養基替代而平板培育10-12日。10-12日後G418 抗性群落（G418K)經染色及記分。每孔群落數目成病毒上 清液稀釋度用作上清液之感染顆粒（cfu)/ml。發明人於與 病毒上清液前培育並藉加人1000NIH/3T3/35mni细菌學使用 皿细胞加poly brene徹底洗滌後評估/ ”測定力價”殘留於 FN30/35塗覆或BSA塗覆35πιιπ平板上的反錄病毒顆粒數量。 24小時後，培養進料含0.75mg/nil G418(乾粉）培養及细胞 又培育10-12日。培育後，計算G418抗性NIH/3T3群落數目 定量是否存在有黏附病毒。 欲評估病毒黏著於FN30/35是否呈劑量相關關係，以漸 增濃度之FN30/35塗覆且重複前述實驗。因此，35ara细菌 學皿如前述塗覆Ml，4，10及20m g/cm2 FN30/35。先前 測定力價為1 X 1〇4感染顆粒/nil之TKNeo病毒備料之1 : 50 稀釋液於FN30/35塗覆平板上培育30分鐘。撤底洗滌後， 2000N IH/3T3细胞加至各個孔。如前述進行選擇，選擇10 日後計算G418抗性NIH/3T3群落數目。 8.2 結果 圖5陳述三次代表性實驗之一的結果。使用TKNeo上清液 ，藉G418h群落於NIH/3T3測得的反錄病毒力價於BSA塗覆 平板減低超過3對數值（4X103至0)，而塗覆FN30/35之平 板僅減低1個對數值。資料驗證反錄病毒定量結合至FN30/ 35但未结合至塗覆BSA之皿（對照皿）。圖6驗證當含病毒上 清液與塗覆有漸增濃度之FN30/35之平板上培育時測得 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） - 42 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^衣· 訂 d 520395 A7 B7 五、發明説明（40 ) G418抗性群落數目增加。因此，病毒結合至FN30/35呈劑 量相關關係。 實例9 病毒结合至重組株纖維網蛋白片段 i 1 實驗 kimizuka等曾報告於大腸桿菌表現經選殖FN DNA序列 (K i m i z u k a , F. , Y. Taguchi, Y ♦ Ohdate, Y * K a w a s e, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) d T. Shimojo, D . Hashino, I . K a t ο , K · Sekiguchi, and K· Titani, J. Biochem., Vol, 110, pp 284-27/ (IW/A經選殖的嵌合型肽包含纖維網蛋白中已知參與細胞黏 著的若干重要序列（包含RGDS，CS-1及肝素結合位置）之一 或其組合，參見圖7。欲分析反錄病毒是否结合至此等重 組FN片段，使用兩種不同具lx 104感染顆粒/ ml冷凍反錄 病毒T O e 〇備料稀釋度（1 : 1 0及1 : 1 0 0 )於塗覆有重組株片 段 C-274，Η - 271，Η - 296，CH - 271，CH-296，及 OCS1 平板 上重覆3Τ3细胞群落生成檢定分析。FN片段之使用濃度為 1 20 — 1 30 pinol/cin2 (相當於 g/cm2 C-274，Η-271，Η-296，C-CS1，FN30/35 及 g/cin2 CH - 271 及 CH - 296卜簡 言之，平板經塗覆，加入病毒，徹底洗滌平板，加入NIH/ 3T3细胞24小時然後於選擇培養基生長10日，隨後染色群 落並計算數目。 9.2 結果 圖8驗證G418抗性群落（因此病毒黏著群落）數目於片段Η -271，Η-296，CH-271及CH-296增加。此外，顯示此等重 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 一 43 - 520395 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（41 ) 組片段與FN30/35之病毒結合數量粗略相媲美，但本2作中 CH-271片段具有最高度病毒结合。全部5個FN片段共同者 為含高親和力肝素結合位置之Μ型重複本12-14( Ruoslahti, E. , Ann. Rev. B i o c h eι . , V ο 1 ♦ 57, p p 3 7 5 - 4 1 3 ( 1 9 8 8 )及 Ki in i z u k a，F ♦，Y ♦ T a g u c h i , Y · 0 h d a t e , Y . K a w a s e, T♦ S h i ra o j ο , K . Hashino, I . K a t ο , K ♦ Sekiguchi, and K . Titani, J . B i o c h e m .,

Vol. 110, pp 284-29 1 ( 1 99 1 ))可能位於重複本 13( K i in i z u k a , F * , Y · Taguchi, Y ♦ 0 h d a t e , Y . K a w a s e , T * Shiinojo, K · Hashino, I . K a t ο , K . Sekiguchi, and K. Titani, J♦ Biochem·, V ο 1 * 110, p p 284- 29 1 ( 1 99 1 )).提示病毒结合係經由此種已知黏著位置。可 由下逑方法證實塗覆M4/ig/cra2 CH-271之皿與漸增濃度 (10-1000Wg/ffll)之肝素硫酸鹽前培育，肝素硫酸鹽是一 種已知可抑制细胞结合至肝素结合位置的高度帶電分子。如 圖9可知，於CH-271與漸增濃度之肝素硫酸鹽前培育後， G 41 8抗性群落數目減少。資料提示病毒結合至FN係經由緊 鄰FN羧端領域之CS-1位置的高度親和力肝素結合位置媒介。 實例10 於重組株孅維網蛋白Η段上轉導造血细胞 10.1 實驗 欲分析先前對FN30/35所述之造血细胞轉導增高是否可 見於重組株FN片段，發明人於試管試驗使用具高度增生前 例之群落生成細胞（HPP-CFC)檢定分析評估上清液感染之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -44 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 520395 A7 B7 五、發明説明（42) 轉導效率。採用EAL2a媒介，發明人比較多個重組株FN片 段相對於BSA上FN30/35上清液感染對造血细胞轉導的影響 ，使用G41 8抗性群落之生長作為基因移轉的指標。此外， 發明人比較已經黏著於FN Μ段之病毒顆粒（相對於上清液 病毒）轉導造血细胞的能力。0.5-lx 106前剌激骨髓细胞 如前述於35mm FN塗覆培養皿上於1 - 2 m 1含E A L 2 a病毒上清 液且含生長因子及g/ml polybrene培育。欲評估由结 合至FN片段之病毒對造血细胞的轉導，35mfflFN塗覆皿與含 病毒上清液共同培育，每次使用2ml PBS共洗三次。隨後 ，0.5-1X106前剌激骨髓妞胞加入2ml補充生長因子及 polybrene培養基。22小時後，收獲细胞並接種如所述於 含及未含l,5ing/ml G418之HPP-CFC撿定分析平板（ Bradley, T . R♦ and D· Metcalf, A u s t . J· Exp. B i ο K Med· Sci，， Vol. 44， pp 287-293( 1966))。培養醪於 7¾ C02M33°C培育14日，基因移轉效率係MG418抗性群落之 百分率計算。 10.2 結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 原始造血细胞經由上清液感染轉導（圖1 0)對全部片段其 包含肝素结合位置（HBS)及至少一涸更具活性的细胞黏著 位置（實心柱）而言顯著高於與BSA之上清液感染。重組株 片段CH-271，H-296，CH-296及C-CS'l之轉導效果類似FH 30/35，3片段皆含肝素結合位置及CS-1位置。全部其它例 中轉導大減。資料驗證先前於FN30/35顯示之原始造血细 胞轉導增高可再現於重組株FN片段。又驗證病毒直接結合 45 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 520395 A7 B7 五、發明锐明（43 ) 至纖維網蛋白可進行造血细胞之基因轉導。最後確證存在 有cs-1及肝素结合位置對原始造血前驅（幹）细胞轉導之用 途。 實例11 使用於重組株纖維網蛋白片段上鼠給予者细胞之轉導長期 進行小鼠之骨髓重建 11.1 實驗 發明人重複前述原始造血祖先细胞之試管試驗研究（實 例10)使用骨髓移植比較於BSA之上清液感染相對於 FH30/35相對於重組株FN片段相對於共同培養未分析對重 建造血幹细胞的影響。簡言之，經致命劑量照射的小鼠注 射給予者细胞，细胞Μ含人類ADA cDNA之EPHA-5媒介轉導 。一個月後及約6個月後，於ADA同功酶檢定分析分析源自 周邊血液的基因移轉效果。 1 1 . 2結果 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖11顯示1個月後的結果，明白顯示含肝素結合位置及 CS-1二者之纖維網蛋白片段H-296對FN30/35及共同培養獲 得類Μ結罘。而不含此二位置之片段用於轉導可移植造血 细胞較為無效。資料驗證共同定位原始造血/幹细胞及反 錄病毒結合至含CS-1位置及肝素结合位置之重組株FN片段 可有效轉導可移植造血细胞。 圖12顯示移植後4個月及6個月的結果。此時，再生造血 幹细胞之基因轉導無法於對照平板或僅含CBD(C-274)或 皿12-14(H-271)之片段轉導细胞移植動物體内驗證。HSC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） —46 - 520395 A7 B7 五、發明説明（44) 之基因轉導較不常見於C-CS1片段，此種情況下1/3動物對 人類蛋白質呈陽性反應。活體試驗再生幹细胞之基因移轉 於含HBD合併CBD(CH-271)或CS - 1(Η-296)之片段可一致地 發現。含全部3個细胞結合位置之片段（CH-296 )之轉導比 較目標细胞與生產者细胞株之共同培養最有效。資料顯示 含I 12-14組合VLA-4及/或VLA-5結合位置之孅維網蛋白片 段可增加反錄病毒媒介基因移轉入鼠造血祖先细胞及幹细 胞。 實例12 纖維網蛋白指導细胞黏著至少經由三個位置（圖13):细 胞結合領域（CBD)其於重複本10經由integrin VLA-5含有 四肽RGDS ;肝素結合領域其經由细胞表面蛋白聚糖分子含 於Μ型重複本12-14(1 12-14);及CS1序列其經由 integrin VLA-4含於交替剪接Μ CS區。此等研究中，發明 人利用圖13所示六段嵌合型重組株FN片段其含有此等單一 细胞黏著位置或單獨或組合於肽。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) FN塗覆细菌培養皿與200cfu於2ml得自親兩性包裝细胞 株TKNeo之上清液（6N)培育。於37C經30分鐘後，皿MPBS 洗三次然後2000NIH/3T3(纖維母）细胞加人2ml補充10¾胎 牛血清（CS; Sigma，美國）及2¾ P/S之DMEM。次日，细胞 注入於含〇.75mg/ffll G418之選擇培養基。8-10日後，皿以 stat stain (Volu-Sol，美國）染色及計算G418「群落數目 。藉此檢定分析，反錄病毒未結合至未經塗覆或BS A塗覆 平板。如圖14顯示，基因移轉入NIH/3T3细胞僅出現於含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） - 47 - 520395 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（45) 肝素ϋ结合領域片段，此處亦稱”M i2-14(h - 271，CH - 271 ，H-296，CH-296 )。資料驗證反錄病毒顆粒直接结合至纖 維網蛋白1E 12-14重複本內部序列。HIH/3T3细胞感染於含 ® 12-i4及CBD二者之FN片段比較單含I 12-14片段顯著更 高（比較H-271與CH-271)。顯然，僅輸人200NE0 cfu/平板 可生成高達80 G4lSh NIH/3T3群落/平板。相反地，添加 CS1對NIH/3T3轉導未顯示任何影響（H-271比較H-296，CH-271比較 CH-296)。 欲證實FH增高反錄病毒媒介基因移轉的機轉係經由反錄 病毒與目標细胞同時結合至片段，使用非黏著细胞株 (HL60-，已知骨髓细胞原性白血病细胞株）進行實驗。 HL60细胞Μ直接螢光色素共軛接合抗VLA-4單株抗體（FITC ;Immunotech，美國）及抗 VLA-5 單株抗體（PE; Antigenix America，美國）染色或使用IgGl及IgG2a之同功型對照（ Becton Dickinson)。死细胞藉propifium碘染色剔除。然 後K FACScan(Becton Dickinson)分析细胞。供基因移轉 研究，104 HL60细胞K得自親雨性包裝株DAG(得自美國田 納西州曼菲斯聖茱德兒童研究翳院）上清液懸浮，上清液 含有神經生長因子受體（HGF-R)之胞外領域（力價105 cfu/ ml)然後M2//g/cin2濃度加至塗覆有6段FN片段之6孔细菌 學平板。4小時後，加入2ml得自HL60培養之經調理培養基 。4-5日後添加4ml新鮮培養基（RPMI (Gibco)含5¾ FCS及 2!K P/S)。任細胞生長8日然後Μ抗HGF-R之單株抗體8211( Boehringer，美國）或以同功型IgGl對照（Dako*美國）染 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^裝· 訂 d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 48 520395 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（46) 色然後與二次FITC-共軛接合羊抗鼠血清（Boehringer)反 應。樣品Kpropidium碘（PI)共同培育剔除细胞碎屑隨後 KFACScan測量。分析NGF-R表現於活细胞驗證係基因移轉 。全部基因移轉研究進行中皆未含Polybrene或protamine 。如圖15顯示，HL60细胞於流動细胞儀分析（A + B)表現VLA -4但未表現VLA-5。與表現資料一致，HL60细胞僅黏著至 塗覆有含CS1片段（H-296，CH - 296，C-CS1)之平板。如圖 15顯示，HL60细胞之基因轉導僅出現於含瓜12-14組合CS1 之片段（H-296，CH-296)。雖然HL60细胞係經由VLA-4 integrU黏著至C-CS1片段，但不存在有可進行反錄病毒 結合之Μ ι2-14使HL60细胞之轉導大減。 另一組實驗中，漸增濃度之高分子量（HMW)肝素（Sigma *美國；分子量約7000-25000)溶解於2ιπ1漢克平衡鹽溶液 補充 2.5¾ (v/v) 1M Hepes (HBSS/Hepes ;皆得自 Gibco)及 K4/ig/cni2濃度添加至塗覆有不同FN片段之细菌學6孔平 板。30分鐘後平板以PBS洗三次然後加人400 cfu/2 ml親雨 性TKNeo載體。於37 °C經30分鐘後，平板再度M PBS洗滌， 然後加人2000NIH/3T3细胞於DMEM含10S!cs及2S：P/S。如前 述進行選擇及培育後8-10日之G41吵群落數目作為基因移 轉效率。一組類以實驗中，分選低分子量（LMW)肝素（ Sigma，美國，分子量約3000)M漸增濃度溶解於2ml HBSS/Hepes〇然後如前述對HMW肝素進行設計〇 8 - 10日後 計算G418h群落數目作為基因移轉效率。全部基因移轉研 究進行時皆未含Polybrene或protamine。實驗结果示於圖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 49 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 d 520395 Α7 Β7 五、發明説明（47) 16。如所示，病毒结合至FN可由高分子量肝素（16A) ’但 非低分子量（16B)M劑量相關方式競爭。结果證實反錄病 毒顆粒结合至Μ 12_14内部序列0 實例13 BFU-E细胞於CD34 +细胞族群選擇性轉導 本實例驗證混合细胞族群中的特選细胞可使用具有病毒 结合領域及细胞結合領域其對鎖定目標的细胞具有特異性 之多肽鎖定目標進行轉導。重複實例1之概略TKNeo感染及 檢定分析方案，但使用大體均句之含BFU_E，^^“及 CFU-Mix细胞之CD34 +细胞均質族群（藉親和層析術得自腾 帶血（CB)细胞），及使用1，2，4，δ，16及20“s/cni2不 等濃度之重組株FN片段CH-271。結果示於圔17。如所示， BFU-E细胞結合至VLA-5结合位置以高效率轉導（大於25黑 G418抗性群落）而不具有顯著结合VLA-5之CFU-GM及CFU-Mix族群Μ大體較低效率轉導（低於約5¾ G418抗性群落）。 實例14 C-KIT +细胞之轉導 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本實例中大體均質如同C-KIT +之細胞族群根據本發明轉 導。如此，C-KIT +细胞使用流量细胞儀分選技術分雛自鼠 骨髓。细胞使用概略如實例1所述之TKNeo病毒進行感染計 畫，但如圖18所示改變FN片段，及感染细胞檢定分析 HPP-CFC。如圖18所示，含Μ 12-14及VLA-4結合位置之FN 片段（FN30/35，Η296及CH - 296)可獲得高轉導效率（大於 80¾ G418抗性群落），而缺此二領域之FN片段導致並無有 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 一 50 - 520395 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（⑽） 意義的轉導（C274及C-CS1)或大體較低效率轉導（H271， C271’低於20¾ G418抗性群落）。 實例15 使用不等濃度P〇lybrene轉導NIH/3T3及純株原性BM细胞 本組實驗驗證本發明之優異轉導方法可於無 hexadimethrine bromide存在下進 fj。HIH/3T3(纖維母：） 细胞及純株原性骨髓细胞概略如實例12及1所述接受ΤΚ ΝΕ0 感染計畫，但病毒、細胞及不等濃度之Polybrene首先共 同懸浮然後施用於塗覆有FN片段CH-296(8m g/ml)之基質 。如前對各型细胞進行檢定分析。結果示於圖19及20。如 圖19所示，G418抗性NIH/3T3族群數目隨著Polybrene濃度 的增高而大減，未使用Polybrene約14降至使用12.5m g/ml Polybrene約4。同理，圖20反應該計畫於無 Polybrene存在下進行時，觀察得近40涸群落而使用10/ig /ml Polybrene時，對應值低於15。 實例16 T細胞之轉導，及使用具有膠原V及FGF病毒结合序列之多 肽 本實例驗證DN A移轉入人類T细胞增進，及得自膠原V及 纖維母细胞生長因子（FGF)至反錄病毒結合序列之用途， 此等序列大體與纖維網蛋白之肝素-I結合位置同系。如 此，全血於室溫Μ單株抗體（MoAbs to CD3 perCP; Becton Dickinson) * CD49e (PE；Anitenix America), CD 49d (FITC,PE:Becton Dickinson)染色 15分鐘然後準 I-----^---II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 d 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 51 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 520395 A7 _____B7_ 五、發明説明（4 3 ) 餚根據製造商的指示使用FACS溶解溶液（BECT0N D ICKINS0N)於 FACScan (BECTON D ICK I NS0N)上分析。周邊 血液衍生之單核细胞（PB-MNC)於1X106细胞/ ml濃度K1 w g/ml 0KT-3(0rtho)及 50/i /ml IL-2(Cetus)前剌激。2-3日後，收獲细胞，洗滌然後K含鼠腺核苷脫胺酶（ADA) cDNA之親雨性反錄病毒55/6於PGK啟動基因控制之下於未 經組織培養處理的平板上（平板塗覆M8/ig/cffl2 CH296或 2¾ 牛血清白蛋白，（BSA，Boehringer))於 7.5/ig/ml Polybrene (Aldrich)連續存在下轉導1或2日。每隔一日 ，50¾培養基M 50U/ml IL-2之新鮮培養基替代。感染後 4-6 日，收獲细胞並使用 MoAbs to CD3，CD56，TCR-a>S 及H LA*~D R(全部得自Bectin Dickinson)進行表琨型分析。 基因移轉效率之分析係於未特選族群進行，分析係測量經 轉導鼠ADA酶活性比較ADA同功酶檢定分析中内生人類ADA 蛋白質之活性（Bodine, D.M.et al., Blood 82:1975-80 (1993);Moritz, T. et al., J. Exp. Med· 178:529-36 ( 1 9 9 3 ) ) ♦ 结果： A. T细胞

首先對人類T細胞分析FN受體VLA-4及VLA-5之表現。欲 達此目的，周邊血液（PB)-衍生之單核细胞（MNC)以單株抗 體（MoAbs)CD3，CD49d及CD49e染色並藉流量细胞儀分析。 如圖21所示，细胞選出CD3陽性淋巴细胞（R1及R4)表示全 部周邊血液T细胞。94¾ PB T细胞為CD49d陽性而96¾為CD 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 52 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-- 4 520395 A7 _B7 _ 五、發明説明（5〇 ) 49陽性。90% T细胞可表現VLA-4及VLA-5。 其次，PB-衍生 PB-MNCM CD3 Mo Ab 0KT-3及重組株 IL - 2 前剌激2-3日然後於塗覆有重組株IL-2之未經組織培養處 理平板轉導1-2日，然後於塗覆以重組株FN Η段CH-296或 塗覆K BS Α (作為對照）之未經組織培養處理平板上使用得 自親雨性生產者细胞株AMibA5 5/6之反錄病毒上清液轉導 1-2日（Bodine, D.M. et al·, Blood 82:1975-80(1993); Moritz, T. et al., J· Exp· Med. 178 :529-36(1993)) ，該细胞株含有鼠腺核苷脫胺酶（ADA) cDNA處於PGK啟動 基因的控制之下。 感染後4-6日進行流量分析顯示细胞培養含有大於90%T 细胞，由HLA-DR及CD56表現指示大半強力活化（圖22)。 藉ADA同功酶撿定分析分析基因移轉效率（圖23)驗證引 進的鼠ADA蛋白質活性於轉導方案包含重組株肽CH-296時 等於内生人類蛋白質活性。感染於BS A獲得基因移轉程度 超過檢定分析的敏感度。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ------^----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 資料驗證一次人類T细胞可Μ不含细胞之含反錄病毒上 清疲於重組株FNH段CH-296上於無聚陽離子化合物如 Polybrene存在下有效轉導。基因輸送效率遠高於使用上 清液單獨加polybrene之標準方法。 B ·新穎重組株肽 由於膠原V(COL)及基本纖維母细胞生長因子（bFGF)顯示 與纖維網蛋白之HBD序列同糸，fc可結合肝素，對圖2 4所 示7種重組株蛋白質分析反錄病毒結合活性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 53 - 520395 A7 B7 、發明説明（51 ) CC此 , 達 先欲 首 〇 列

序親 合含 结入 毒加 病後 錄然 反肽 能株 官組 有重 具 K 否覆 是塗 定板 測平 析菌 分细 F 兩性ΝΕΟ反錄病毒上清液。30分鐘後，平板徹底洗滌去除 全部未结合的反錄病毒顆粒，然後2000個ΝΙΗ/3Τ3细胞加 至各個平板。8-10日後KG418抗性（6418^·)ΝΙΗ/3Τ3细胞群 落數目評估基因移轉效率。 由圖25顯示，基因成功移轉入ΝΙΗ/3Τ3细胞評估為於含 FN之细胞結合領域（CBD)組合HBD (片段CH-271)或具有膠原 V(C-COL)或FGF(C-FGF)序列之重組株肽。结果驗證反錄病 毒也可直接结合至膠原V或bFGF内部序列，證實含有此等 序列之重組株肽也可用於鎖定造血细胞目標。 如此，可表現VLA-4及VLA-5之HEL细胞Μ含截頭神經生 長因子受體ρ75鐽（NGF-R)cDNA之親雨性反錄病毒於重組株 片段 C—274(CBD) ， H-271(HBD) ， CH—271(CBD-HBD) ， C0L, C-C0L(CBD + C0L)，C-FGF,C-FGF-CS1，及於 BSA(作為對照） 轉導。8日後藉流量細胞計量分析NGF-R表現分析基因移轉 效率。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如圖26所示，塗覆M C-27 4之平板或BS A所見基因移轉程 度低。於H-271 (HBD)及C0L之轉導獲得33-36¾ NGF-R陽性 细胞。添加CBD至HBD(CH-271)可於本實驗提高轉導細胞至 最高程度。令人感興趣地，添加CBD( = VLA-5結合位置）至 片段C-C0L之C0L或添加CS-l( = VLA-4结合位置）於片段 C-FGF-CS1可顯著提高HEL细胞之基因轉導。 最後，1日IL-6及SCF前剌激人類CD34 +骨髓（BM)细胞於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 54 - 520395 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 i、發明説明（52) 嵌合型態上使用親雨性ΝΕΟ反錄病毒轉導1日然後接種於祖 先细胞檢定分析可存在或未存在有G418° 培養後14日Μ含H-271或FGF内部反錄病毒结合序列之片 段組合细胞结合受體出現之G 41#群落百分率評估有效基 因轉導。發琨，與NGF-R反錄病毒基因修改HEL细胞所得结 果（圖27)相反，添加CS1位置至C-FGF大為有肋於基因移轉 入純株原性CD34 + BM细胞之效率趨近於片段以一296“81^ Η B D + C S 1)所得水平。 如此驗證一次Τ细胞可Μ反錄病毒載體於纖維網蛋白之 特異性黏著領域有效轉導，係採用Τ细胞經由其VLA-4或 VLA-5 integrins结合至纖維網蛋白的症力。也顯不反錄 內病毒顆粒黏著至膠原V或bFGF內部序列’其顯示與纖維 網蛋白之肝素結合領域同系，及造血细胞及细胞株可 於含膠原V或bFGF反錄病毒結合序列組合目標细胞结合位 置之重組株肽上有效基因修改。 雖然於前文說明詳细擧例說明本發明’但其僅供舉例說 明之用，涵非限制性，須了解前文僅說明較佳具體例’而 屬於本發明之精髓範圍内之全部變化與修改皆希望受到保 護。 此處引述之全部公開文獻皆併述於此以供參考。此外’ 同在審査中之美國專利申請案第081218,355號，申請曰 1994年3月25日及同在審査中之國際申請案第PCT/US95/ 03817號，申請日1995年3月27日並指定美國等案皆併述於 此Μ供參考。 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇Χ297公釐） 55 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 修正

   91. 12. I I 替換本 申請專利範圍 52039 1 . 一種藉反錄病毒獲得轉導之活存哺乳類細胞族群之方 法，包含： 以反錄病毒於有效制動數量之材料存在下感染細胞，該 材料包含一個可結合至細胞之配合基及一個可結合至反錄 病毒之配合基，因此可同時侷限反錄病毒及細胞而提高細 胞之轉導效率，該感染係於大體不含hexadimethrine bromide之培養基內進行；以及其中該材料爲一多肽，其 包含一第一胺基酸序列可提供纖維網蛋白之肝素-I I領域 之反錄病毒結合活性_· Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr iie Thr Giy Phe Gin Vai Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 及一第二胺基酸序列可提供纖維網蛋白之CS - I領域之細 胞結合活性： Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr O 2 ·如申請專利範圍第i項之方.法，其中該等細胞包括造 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線丨 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 520395 AS B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 六、申請專利範圍 血幹細胞。 3 . —種獲得藉反錄病毒轉導之活存哺乳類細胞族群之方 法，包括： 以反錄病毒於有效制動數量之材料存在下感染細胞’該 材料包含一個可結合至細胞之配合基及一個可結合至反錄 病毒之配合基，因此可同時侷限反錄病毒及細胞而提高細 胞之轉導效率，該感染係於大體不含某種化學劑之培養基 內進行，該化學劑可於共同培養提高由反錄病毒轉導細胞 之效率，但該化學劑於該材料存在下會降低細胞由反錄病 毒轉導之效率；以及其中該材料爲一多肽’其包含一第一 胺基酸序列可提供纖維網蛋白之肝素-I I領域之反錄病毒 結合活性· Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin T「p Thr Pro Pro Asn Vai Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Va! Thr Pro Lys G!u Lys Thr Gly Pro Met Lys GIu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser A「g Pro Ala Gin Gly Vai Val Thr Thr Leu GIu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Va! Thr Asp Ala Thr GIu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr GIu Thr He Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu 丁yr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Vai Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp A!a Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr GIu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg GIu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr GIu Ala Thr He Thr G!y Leu GIu Pro Gly Thr GIu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser GIu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 及一第二胺基酸序列可提供纖維網蛋白之CS - I領域之細 胞結合活性： Asp GIu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro GIu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂l---一------線— 2 520395 AS B8 C8 ' D8 ' -申請專利範圍 4 . 一種於活體外以反錄病毒轉導T細胞之方法，包含於 一種材料存在下以反錄病毒感染細胞，該材料包含一個結 合至Τ細胞之配合基及一個結合至反錄病毒之配合基，因 此同時侷限反錄病毒及細胞，而提高細胞之轉導效率；以 及其中該材料爲一多肽，其包含一第一胺基酸序列可提供 纖維網蛋白之肝素-I I領域之反錄病毒結合活性： Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin 丁rp 丁hr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin G!y Va! Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Va! Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin A「g Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Se「Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr I 丨e Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Vallle A丨 a Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 及一第二胺基酸序列可提供纖維網蛋白之CS - I領域之細 胞結合活性： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Giu lie Leu Asp Val Pro Ser 丁hr o 5 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該等細胞爲人類 細胞。 6 . —種藉反錄病毒獲得轉導之活存哺乳類細胞族群之方 法，包含： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 520395 Αδ Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 以反錄病毒於有效制動數量之材料存在下感染細胞，該 材料包含一多肽含有一第一胺基酸序列可提供纖維網蛋白 之肝素-I I領域之反錄病毒結合活性，及一第二胺基酸序 列可提供纖維網蛋白之C S - I領域之細胞結合活性，因此可 同時侷限反錄病毒及細胞而提高細胞之轉導效率，該感染 係於大體不含多陽離子劑之培養基內進行。 7 .如申請專利範圍第6項之方法，其中該第一胺基酸序 列具有序列： Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val 丁hr Pro 丁hr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Va) Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Giu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala V3·1 Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Vallle Asp Ala Ser Thr Ala He Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr o 經濟部智慧W產局員Τ;消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 .如申請專利範圍第6項之方法，其中該第二胺基酸序 列具有下列序列： Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr o 9 · 一種藉反錄病毒獲得轉導之活存哺乳類細胞族群之方 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 520395 AS B8 C8 D8 六、申請專利範圍 法，包含： 以反錄病毒於有效制動數量之多肽存在下感染細胞，該 多肽具有一胺基酸序列可結合至細胞，及一多肽具有一胺 基酸序列可結合至病毒，因此可同時侷限反錄病毒及細 胞，該感染係於大體不含多陽離子劑之培養基內進行，該 多陽離子劑可於共同培養提高由反錄病毒轉導細胞之效 率’但多陽離子劑在該多肽存在下會降低藉由反錄病毒之 細胞之轉導效率；以及其中該材料爲一多肽，其包含一第 一胺基酸序列可提供纖維網蛋白之肝素-11領域之反錄病 毒結合活性 . Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Se「Pro Pro Arg Arg Ala A「g Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr He Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Cys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 及一第二胺基酸序列可提供纖維網蛋白之CS - I領域之細 胞結合活性： Asp Glu Leu Pro Gin Leu Va! Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu He Leu Asp Val Pro Ser Thr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 520395 AS B8 C8 D8 #、申請專利範圍 1〇.如申請專利範圍第9項之方法，其中該多陽離子劑爲 hexadimethrine bromide。 1 1 . 一種藉反錄病毒獲得轉導之活存哺乳類細胞族群之 方法，包含·· 以反錄病毒於有效制動數量之多肽存在下感染細胞，該 多肽具有一胺基酸序列可結合至細胞，及一多肽具有一胺 基酸序列可提供纖維網蛋白之肝素_ Π領域之反錄病毒結 合活性，因此可同時侷限反錄病毒及細胞，該感染係於大 體不含多陽離子劑之培養基內進行，該多陽離子劑可於共 同培養提高由反錄病毒轉導細胞之效率，但多陽離子劑在 該多肽存在下會降低藉由反錄病毒之細胞之轉導效率。 1 2 .如申請專利範圍第1、3、6或9項之方法，其中該細 胞包含人類造血幹細胞。 1 3 ·如申請專利範圍第1、3、4、6或9項之方法，其中 該多肽爲一重組多肽。 1 4 .如申請專利範圍第1 3項之方法，其中該重組多肽爲 CH-296 或 H-296 ° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 5 .如申請專利範圍第1 4項之方法，其中該重組多肽爲 CH- 296。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）