TW408133B

TW408133B - Bradykinin antagonist peptides incorporating N-substituted glycines

Info

Publication number: TW408133B
Application number: TW084102476A
Authority: TW
Inventors: Val S Goodfellow; Manoj V Marathe; Eric T Whalley; Timothy D Fitzpatrick; Karen G Kuhlman
Original assignee: Cortech Inc
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1995-03-15
Publication date: 2000-10-11
Also published as: ZA951974B; ATE280777T1; DE69533704D1; AU696429B2; CA2184824A1; CN1150206C; AU1932595A; US5700779A; KR100360639B1; WO1995024422A1; CN1148393A; JPH09511500A; EP0813544A4; EP0813544A1; EP0813544B1

Description

A7 B7 五、發明説明（）龙發明：> 背軎本發明係有關激肽，更詳細而言係有關緩激肽受體掊抗劑。緩激肽（Bradykinin, BK)是一種内源性胜肽激素，係由一群肽鐽内切酶如血管舒缓素對激肽原進行蛋白水解分離作用而釋放出來。缓撖肽羼於調節劑，藉由周圃A-及C-織維神經元的剌激而引發許多包括疼痛及疼痛過敏之病理反應。已有證據顯示BK在發炎反應中扮演重要的角色，而且在許多疾病狀態中係為重要的調節劑，這些疾病狀態包括與敗血症及肺氣管失調如哮喘相關的低血壓。 BK拮抗劑被視為可用於預防或減低BK的作用，因而消除或減低上述的失調。同時亦有顯箸的證據顯示缓激肽掊抗劑可用於治療頭部外傷的水腫（腫脹）、嚴重燙傷的水腫及疼痛、及與外科手術或癌相關的疼痛。經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本貫) 緩激肽是一種九肽，順序爲4以1-?5：〇3-?1'〇3-61丫4-Phee-Sers-Pro7~Phee-Arg3。這衷所用的編號是最近在這領域中所使用的，Μ比較相關的激動劑或拮抗劑之順序與緩激肽母結構的差別。K.G. Claeson及其共事者（美國專利第4,242,329號）發表了含有D-苯丙胺睃或D-腩胺酸替代ProT的緩激肽順序之斷截胜肽顯示溫和但可測得的缓激呔拮抗劑活性。Stewart在緩激肽順序的7號位置加入D-Phe，結果對緩激肽受體具有拮抗活性（美國專利第4,801,613 號）。雖然具有學理上的有趣性，但是這些化合物缺乏有效的效力及當作活體藥劑時的活髏摄定性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 A7 B7 在 Hoechst 的 G. Breipohl 及共同硏究者（EPA 0 455 133 A2)及在 Scios-Nova 及共事考（PCT/US92/03031)均硏究出高效力的缓激呔拮抗劑，他們是在緩激呔順序的7號位置加入D-Tic、D-環己基丙胺酸或取代的D-脯胺酸類似物。在Hoechst所合成的化合物含有D-Tic7 *而且必須在 8號位置含有一痼雜環胺基酸，其中該α-胺基酸気及α-碳形成一個雜環。這些殘基的實例包括L-0ic或L-Tic ,較其他爲佳。Ky 1 e所合成的化合物係在8號位置加入相似的雜環或取代的4-羥基脯胺酸或取代的4-氫硫基脯胺酸殘基。Young及共同硏究者在緩激呔順序的7號位置加入N-苄基甘胺酸，所得到胜肽具有溫和的緩激呔受體激動活性（ Thirteenth American Peptide Symposium, Edmonton, Alberta, 1993年 6月 20日）。雖然習知技術已作了努力，但是仍相當需要新穎且改良的BK拮抗劑，其具可利用的拮抗性質。本發明的主要目的印在於提供這種拮抗劑，在其肽鍵上包括有N-取代的甘胺酸。在此所意指的N-取代甘胺酸之緩激肽拮抗劑，而且具有效力，並未在先前被報告過。龙發明：> 概里本發明係提供含有一或多個N-取代甘胺酸之胺基酸殘基之緩激肽拮抗劑，其中該N-取代基是烷基、環烷基、雜環基、芳香基、或雜芳香基。這些化合物已顯示係為高效力的緩激肽拮抗劑，而且表現出在活體中優異的穩定性及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 A7 —-__ 五'發明説明（）作用期間。因爲是髙效力的缓激呔拮抗劑，本發明的這些化合物將可有效用於治療由縷激肽調節的症狀，包括：疼痛、發炎、水腫、與頭部受傷相關的水腫、晈傷及刺傷、偏頭痛、SIRS/敗血症、長期炎性疾病、燒傷、小钿胞癌、與哮喘相關的氣道過敏及氣道發炎。廣泛的定義，本發明的緩激呔受髏拮抗劑傺包括有一或多値N-取代的甘肢酸殘基的胜呔。更詳細而言，本發明所意指的是下面化學式（I)的緩激肽受體拮抗劑： Γ-ZLA1-Ba-C3-D4-Es-Fs-G7-He-I 3-J" (I) 其中： Z'可依倩況從鈇，但如果存在*則為氫、乙醯基、金鋼烷基羧基、金鋼烷基乙醸基、（Ci-C·*〉-烷基、烷醯基、芳基磺醯基或烷氧基羰基，或二氫奎寧環基羧酸之衍生物 9 可依情況存在，或z°與“可以相同或不同，且係表示直接的鍵結，氫，一包含有D或L精胺酸、D或L離胺酸、 D或L鳥胺酸之胺基酸殘基衍生物，或H2N(NH=C)NHCH*CHaCMCHa)nCO-，其中n=〇至3,或如一般在戡藥化皋技蕤中的方法將精胺酸替換而產生在生理pH中呈正電荷的雜原子，如含有烷胺、苯脉、六氫吡啶、烷胍或烷鎩基圃之鳥胺酸、精肢酸、或離胺酸之類似物或同系物，條件是當Z’從缺時Z°不是直接鍵結；進一步的條件是當A1是H*N(NH=C)NHCH2CH3CMCH2)nC0- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS Μ4現格（21 〇 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 408133 A7 _；___B7_ 五、發明説明（）時，其中n=〇至3,則Z’及Z°均從缺；當A1是氫時Z*從缺 B8及C3可以相同或不同，且係為脯胺酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、甘胺酸、絲肢酸、蘇胺酸、氫硫基脯胺酸、N-甲基絲胺酸、N-甲基蘇胺酸、N-甲基苯丙胺酸、甘胺酸或 NR’CHR”C0,其中FT及R”係分別選自該氫、烷基（例如Cl-C8直鍵或支鍵或c3-ce環烷基）、芳香基、雜芳番基、或烷胺基； D4是甘胺酸、丙胺酸、或噻盼丙胺酸； 82(：^1!可被代之以-關（(：11〇„(：0-，其中11是從4至14 的整數； P是苯丙胺酸、甲基取代的苯丙苯胺酸、甘肢酸、環戊基甘胺酸、環己基甘胺酸、環己基丙胺酸、2-無化K甘胺酸、噻吩丙胺酸、N-(2-氫化茚）甘胺酸、或N-取代的甘胺酸，其中該取代基是院基（Cl-Ce)'環院基（C3-Cb〉、 CfUAr、CHaCHaAr，其中Ar是芳香基或烷噻吩基，一芳香族肢基酸、或一在ct-氮或α-碩上甲基或乙基被取代的芳香族胺基酸；

Ps是中性、鹼性或酸性的脂肪族或芳番族胺基酸，其側鍵可Μ被取代，例如取代的絲胺酸或半胱胺酸，該取代基係選自Ν-(烷基卜丁二醯亞胺基、Ν-(烷基）批咯酮、烷（ h-c*。）、烯基烷基（c2-cae)、芳香基、或烧基芳香基（c7 -ci0); G7是一擇自下列群中的芳香族胺基酸：D-Tic、D-Dic 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21 OX297公釐） (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) τ ,ΤΓ' '"________ 408133 at ____B7 五、發明説明（），D-苯丙胺酸、2-氫化喆甘胺酸、D-環戊基甘胺酸、D-環己基甘胺酸、D-脯胺酸或在其3或4號位置被烷基、芳香基、氳硫基烷基、氫硫基芳香基、氧烷基、或氧芳香基取代的脯胺酸，或N-取代的甘胺酸殘基，其中該取代基是芳香基、烷基芳香基、-CHaR或-CHaCH2R，其中R是氫化茚、吲哚、禁基或苯基； HB是一選自下面結構的胺基酸殘基： -n-chr2co-

-N-CHRjCO- I I ^ (ch2)〇

I

Ri 其中ffl是從1至6的整數； h是烷基（Ci-C^，直鏈或支鍵 >、環烷基（c3-ce>、單環或多環芳香基，例如苯基或萘基，雜芳番基、含有三至八個選自碳、気、氧或硫原子之一或多環的雜環基；亦可Μ是取代的環烷基，該取代基是一至四個選自胺基、苯并基、羥基、氫硫基、氫硫基烷基、烷基、氣烷基、烷氧基、狻基、羧基、鹵素、苯基、三氟甲基、三氟甲氧基、胺烷基、烷胺基、或羧醯胺之基團；或. 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注^^項再填寫本頁) h亦可Μ是取代的芳番基或雜芳香基，該取代基是一至四個選自胺基、苯基、羥基、氫硫基、氫硫基烷基、烷基、氧烷基、烷氧基、羧基、齒素、三氟甲基、三氟甲氧基、胺烷基、烷肢基、或羧醢胺之基圃；是Η，甲基或較高之烷基（例如1-8値碩原子之直鏈或支鏈烷基），或某種胺基酸之酸性、鹼性或中性側鏈（本紙蒗尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） 408133 at _____B7 _ 五、發明説明（）烷基或芳香基）；當G7是N-取代的甘胺酸時，H8可Μ是順式-内向-八氫岡晚-2-類基；

Is從缺或是直接的鍵結，0Η，或鹼性、酸性、或中性胺基酸，特別是精胺酸或離胺酸或HaN(NH=C)NHCHaCHaCHa(CHa)nNH-其中n=〇至3,或如一般在醫藥化學技藝中的方法將精胺酸替換而產生在生理PH中呈正電荷的雜原子，如含有烷胺、苯脒、六氫吡啶、烷胍或烷鎩基圍之精肢酸或離胺酸之類似物或同糸物；條件是當V存在時I9不是0H，及當J1。從缺時I3從缺或不是直接鍵結；及 J111係從缺，或如果存在則是0H，或鹼性、酸性、或中性胺基酸，或0-R，或NHR，其中R是含有1至15個碳原子的烷基（直鍵或支鍵）。經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係基於發現在與緩激呔相關的胜肽順序中加入一或多値N-取代的甘胺酸殘基，產生的拮抗劑具有實質上的緩激肽拮抗括性。另外次要特徵是發現某些在其呔鏈中含有N-取代的甘胺酸之胜肽顯示出有用的激動活性。無論 '如何，本發明主要是有關於在呔鏈上包括有N-取代的甘胺酸之新穎胜肤，其顯現出顯著的緩激肽拮抗活性以及在後面所示出的其他有用性質。重要的是本發明的化合物其藥理特性與那些高效力的化合物如HOE-140係有顯箸的不同，H0E-140的順序式如下： D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-〇ic-Arg HOE-140在許多活體内或外的藥理行為中對緩激肽類型2 本紙張尺度適用申國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐）經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ^08133 A7 B7 五、發明説明（） (ΒΚ2)受體非常有效，但是對緩激肽類型1 (BKO受髏毫無效力β最近的資料顯示1受體的活化在多種模式的長期發炎或持纊性疼痛過敏症狀中很重要（Dray, Α.等人，TIRS, 11 287 ( 1993))。本發明的較佳化合物在^受體拮抗劑模式中顯現出相當程度的栝體内栝性（LPS-處理的兔血壓分祈）。比較上，HOE-104在該分析中毫無活性。在此所揭示的化合物比習知技藝的化合物更具有經濟上的優點，因爲本發明之N-取代的甘胺酸在合成上更經濟，這些化合物沒有多重的立體中心，不會涉及複雜及昂貴的殘基如Oic或4-取代的羥基脯胺酸或筮硫基脯胺酸之情形。在本發明的較佳實施例中，可以在缓激肽順序中的7 號或8號位置加入N-取代的甘胺睃殘基而產生高效力的緩激肽受髖拮抗劑。這些化合物與習知技藝者不同，因為其等未含有拘束性的雜環胺基酸，這些環包括該胺基酸殘基上的氮，例如取代的脯胺酸或八氫-吲哚-2-羧酸（Oi c)。 ' 一項持別佳的實施例係包含那些如上述定義的緩激呔順序中的8號位置含有N-環戊基、N-環己基、N-芳香基或 N-烷基芳香基甘胺酸之化合物。熟悉本技藝的人士將會知悉在組織中可能存有多種受體亞型。因此對於値別化學療法之最佳實施例係依據在治療期間所要針對的疾病狀態Μ及緩激呔拮抗劑所要針對的組識而定。這些參數只能在人體臨床試驗中得到真正的結果，但是對動物組織的作用Μ及在本說明書中所說明的受 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙浪尺度適用中國國家操準（CNS ) Λ4规格（210X297公嫠) -^ Γ]- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（）體結合資料可以當作選擇活性化合物的指引。在此所用的“緩激肽受體拮抗劑”係定義彘一種分子，其會阻隔缓激呔與其受髏結合的能力或使緩激呔與其受髖改變結合的方式而使其間有效信息交換不會發生。拮抗劑可以是一般的競爭性抑制劑或非競爭性者。因此*受體拮抗劑不需要與自然的配體一樣以相同的位置或方向結合，但必須顯示出該分子在物理作用上與受體作用Μ阻隔受體的活性。在此所使用的其他術語可Μ定義如下："緩激肽型胜肽”是一種含有至少一値連接兩個ct -胺基酸之酿胺鍵結之分子，而且具有與哺乳類緩檄肽受體結合的能力。鍰激肽型胜呔可Μ是激動劑、部分激動劑、拮抗劑、或不具有可測得的生物活性，但是在低於1毫其耳摄度下可測得與哺乳類緩激肽受髏的結合。 “雜芳香族”及“雜芳番基"之術語係指含有気、氧或硫之單環或多環芳香族環糸統，包括，但不受限於，吡咯、吡聢、吲哚、哼唑、Ptt唑、嘧啶、瞟呤、腺瞟昤、吡畊、喹啉、異喹啉、呋喃、苯并呋喃、苯并枵唑、噻盼、苯并噻吩、及噻唑。 wAr”或“芳番基”之術語包括苯基、萘基、聯苯基、氫化15、或舞。 w雜環族”表示含有3至8個包括碳及至少一値選自氮、氧、或硫之原子之一或多環。這些包括如前面定義的雜芳香族結構，Μ及環氧化物、環氧乙烷、四氫呋喃、四本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公釐） (諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-11 - 4〇8133 A7 B7 五、發明説明（）氫吡喃、氮丙啶、/3-內醯胺、內醯胺、六氫吡啶、六氫吡畊、吡咯嗣、二吖取、η 丫获<、噚唑啶、或晬唑嗣。前面所指的“烷醯基”或“烷氧基”可理解為分別意指為從2至8及1至8個硕原子。該烷取代基個別或一起可Μ包含從1至8値碳。前面所指的脯胺酸之3或4號位置可Μ說明如下ί 4__3 vJ— Ο 在此所使用的“精胺酸取代物”係指如一般在醫藥化學技藝中的方法將精胺酸替換而產生在生理pH中呈正電荷的雜原子，如含有烷胺、苯眯、六氫吡啶、烷胍或烷辚基圍之鳥胺酸、精胺酸、或離胺酸之類似物或同条物。在敍述胺基酸時，一般已接受在European J. Biochemistry 9 (1984)中對胺基酸所編的三字母碼，而且已被廣泛使用。但是如果使用某些這種縮寫來敘述新穎的N-取代甘胺酸可能引起混淆。因此，爲了清楚敘述，對某些在此使用的縮寫係說明如下：經濟部中央標準局員工消費合作社印製

:Igl=2-氪化茚甘胺酸 {請先聞讀背.面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12 - 五、發明説明（）

I

9

A7 B7 MNch= N-(甲基環己基）甘胺酸 NPeg= N-(苯乙基）甘胺酸 NBng= N-苄基甘胺酸 :NPhg= N-苯基甘胺酸 :NCpg= N-環戊基甘胺酸經濟部中央標準局員工消費合作杜印製

:Cpg=環戊基甘肢酸 :NChg= N-環己基甘胺酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〖0'乂2耵公釐） -13 4〇8l33 A7 _ B7五、發明説明（）

Η 經濟部中央標準局員工消費合作社印製另外在本申請案中所使用的縮寫表示如下：

Boc :三级丁氧基羰基

Bop-CI :雙（2-氧基-3-ttf唑啶基）次膦酿氣 D-Dic :二氫異喹啉-3-羰基 DMF :二甲基甲醢胺

Oic:順式-內向-八氫吲哚-2-羯基

PyBrop :溴-三-吡咯啶基鎸六氟磷酸鹽 TFA :三氟乙酸

Tic: 1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羰基本發明的胜呔可由多種在本技慈中所知悉的傳統方法予Μ製備。例如許多這種胜肽可以利用本技藝中熟知的方法藉由溶液或固相方法予Μ合成（Stewart. J.等人，固相胜肽合成，Pierce Chemical Coapany, (1984〉（Bodanszky, M.等人，胜肽合成方法，Springer Verlag, 1984。Bodanszky ，胜·肽合成原理，Springer Verl.ag，（1984>) (Bar.any, G. 等人，Int. J. Peptide Protein Res. 30:705739 (1987)) 。但是*胺基酸與立障性N-取代的甘胺酸之結合僅可以使用特別的縮合劑如Βορ-Cl (Tung, R.D,等人，J. Am· Chem. Soc. 107 4342 (1985))或ByBrop (Coste, J .，Peptides 'Proceedings of the Twenty-first European Peptide Symposium (1990))或由適當保護的胺基酸所衍生出的醢本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ,, 一 14 _ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

4081S3 Α7 Β7 五、發明説明（）經濟部中央標準局貝工消費合作社印製氣（Beyermann，. M.等人 ’ J. 〇rg. Chem. 55，721-728, (1990))或酿氟(Carpi no, L.A.等人 > J. An. Chei, Soc, 1 1 2 9652 (1990))予 H 完成。固相方法（Zuckermann， R.N., J. Am. Chem. Soc, ill 10646 (1992))係利用 α-鹵羰基化合物藉由胺或苯胺的N-烷化作用而合成得N-取代的甘肢酸*亦邸己知的方法：利用固相合成方法合成含有 N-取代的甘胺酸之胜呔。但是，在固相方法中使用不昂貴且有效的結合劑Bop-Cl在先前並未被報告過。新頴的N-取代的甘胺酸或N-取代的胺塞酸可由下面方法予Μ合成：可Μ在一種極性溶劑如乙腈、二氣甲烷、氯仿、四氫呋喃、或二甲基甲酿胺中加入或不加入另外的鹼如三级胺、金厪氫化物、金屬或銨磺酸鹽或碳酸氫鹽使結構為lUNHa 的胺或苯胺與結構為A的適當保護的α-鹵基乙酸鹽反應而生成Ν-取代的胺基酸Β。利用本技藝中熟知的方法保護該α-胺基（T. Greene及P.G.M. Wuts提供了對許多保護基的實例，這砦實例與一般應用於胜肽合成的技術相差不多（Greene, T.等人），在有機合成中的保護基，第二版， John Wiley and Sons, U991))而生成胺基酸衍生物C > 適合於傳統胜肽合成的方法。

X

A I-·-·-=. ----------—— 5 . (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 OP. Η,ΝΗ, Ο R，c〇本紙張尺度適用中固國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 15 刪!33ί77 五、發明説明（) 其中X是鹵素或離s，？^及？2是保護基。另外*適當保護的胺基酸D可以與含有離基X如氯離子、溴離子、碘離子、甲苯磺酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根、等等之基圃反應而生成B。利用本技藝中熟知的方法對胺作保護可得到胜肽合成時的中間物（參見Greene, T. 等人，，有機合成中的保護基，第二版，John Wiley and Sons, (1991))。在有限的例子中，X可以被藉由如NaH的強鹼使卜保護的（胺基甲酸乙酯或磺胺所構成的保護基）胺基酸脫去質子所形成的陰離子替代再藉由對該陰離子的烷化作用而直接生成C。 (請先閱讀背面之注項再填寫本頁)

經濟部t央標準爲貝工消費合作社印製

Ι.Η,ΝΗ, 『2·^催細0 其中X是鹵素或離基，Pi及ps是俦護基。

最後，中間物B可以藉由還原胺化反應予以形成，其中適酋的胺與醛或酮經縮合而形成席夫鹼或亞胺，然後利. 用氳及催化劑或具反應性的氫化物試劑如氮棚氫化鈉或硼氫化鈉予以還原而得到想要的胺B。利用本技藝中熟知的方法對該胺作保護反應而得到適於作胜肽合成的冲間物C 〇Ρ. Ο 本紙張尺度逋用中國國家標率（CNS ) A4規格（210 X四7公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 A7 B7_ 五、發明説明（）其中!\及1^是保護基，R3-C0-R4表示環狀或直鍵的酮，或提供L發生還原胺化反應之醛。緩激肽拮抗劑在洽療上的應用包括由缓激呔或其等非常相關的代謝物所調節的外傷性、炎性或病理症狀。這些症狀包括晈傷、剌傷、一般外傷、頭部外傷、包括炎性腹部疾病的炎性症狀、燒傷、發疹、休克或與敗血症相關的低血壓，及疼痛，特別是與外科手術或牙科手術相關的疼痛。再者，缓激狀拮抗劑可以用於治療氣道過敏及發炎， Μ及其他與哮端栢闊的症狀。緩激肽被認為是一種有絲分裂因子，而且本發明所揭示的化合物已顯現出活髅内的活性>表示其可用於當作抗癌劑。這種化合物可Μ局部给藥*或藉由注射或_液或作成溶在適當媒劑中的口服懸浮液或作成錠劑、丸、膠囊、膠粒或類似物的方式給藥。给藥的劑量及方式係依據該缓激呔的應用情形而定，可Μ由臨床測試的例常方法予以測定而找到最佳的劑童。這些劑量預期是活性化合物在0.001 mg/kg至 1〇〇 mg/kg的範圍。可以了解的是本發明的化合物係由可Μ形成鹽類的胺基酸所組成，原因是其等具有酸性或_性的部份，而由在此敘述的化合物所衍生出的任何在藥理上可接受的鹽類，如氫氣酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、順丁烯二酸链、檸様酸鹽、苯甲酸鹽、柳酸鹽、丁二酸鹽、抗壊血酸鹽及類似物，均可視爲本發明的部分。一般翳藥化學的方法是對以胜呔為基礎的藥物作修改Μ形成酯或酿胺形式的原藥物，該原本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）一 17 - {請先閲讀背面之注意事項再4·寫本頁)

408133 a? B7 五、發明説明（）藥物顯現出更高的生物性質性，而由在此所掲示的化合物衍生出的原藥物亦構成本發明的部份。設計及袈備原藥物的方法係詳細敘述於醫藥化學文獻（Bundgaard, H.,原藥物之設計，Elsevier (1985))。本發明的化合物可以與其他蕖劑如激肽拮抗劑一起给藥，這些激肽拮抗劑包括神經激肽拮抗劑，或歐皮伊得（ opioid〉激動劑，蛋白酶抑制劑，特別是彈性蛋白酶抑制劑，或與其他鎮痛藥物或抗癌藥物一起合用。本發明代表性的化合物包括下面的化合物，其中NBng 、NChg、NCpg、NPeg、NMch及NPhg分別表示N-苄基甘胺醴、N-環己基甘胺酸、N-環戊基甘胺酸、N-苯乙基甘肢酸、 N-甲基環己基甘胺酸及N-苯基甘胺酸：化合物 1 : D-Arg-Arg-Pr〇-Hyp-Gly-Thi-Ser-HBng-Oic 化合物 2 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg 化合物 3 : D-Arg-Arg-Pr〇-Hyp-Gly-Thi-Ser-Igl"-NChg

-Arg，異構物A 化合物 4 : D-Arg-Arg-Pr〇-Hyp-Gly-Thi~Ser-Igl_-NChg

-Arg. ·異構物B 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 化合物 5 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Th.i-Ser-D-TidChg -Arg 化合物 6 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-tHy-Thi-Ser-D-NBng-Oic -Arg 化合物 7 : D，Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-SerUBng_NChg -Arg 本紙張尺度適用中國國家擦準（CMS ) A4規格（21 〇X297公釐） 408133 A7

五、發明説明（）化合物 8 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NCpg (请先閱讀背面之注$項异填寫本頁) -Arg 化合物 θ D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Sef-D-Phe-NChg -Arg 化合物 10 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Cpg-NChg -Arg 化合物 11 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NPeg-〇ic-Arg 化合物 li : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-.Gly-Thi-Ser-D-Tic-NMch -Arg 化合物 13 : δ -Gpa-Arg-Pr〇-Hyp**Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg -Arg 化合物 14 : δ -Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg-Arg 化合物 15 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NPhg -Arg 化合物 16 : D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Phe-NPhg -Arg 化合物 17 : D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-NChg -Arg 經濟部中央標準局員工消費合作社印製化合物 18 : δ -Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic.-NChg 依據前面順序式（I>的化合物可進一步列出代表性化合物如下：缺；

Za是D-Arg或S -Gpa或從缺； A1是 Arg或 δ -Gpa ; 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） ,Λ -19 - _133 g 五、發明説明（

Ba是 Pro或 Hyp ; _ C3是Hyp ; D4是Gly ; E5是Thi ;

FlSer; G τ 是 N B n g、N P e g、N C h g 或 D - T i c、I g 1、D - P H e 或 D C p g ;

Ha 是 Oic、Arg、NChg、MNch、NPhg，（57及}18 中至少一個是 N-取代的甘胺酸；‘ T3從缺或Arg ;及從缺。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〉雖然該N-取代的甘胺酸殘基係Μ如前面列舉的胜呔（使用ΒΚ順序編號）在7號及/或8號位置加Μ說明，但是可Κ理解的是該Ν-取代的甘胺酸可Μ作位置的改變。相似的情形*本發明亦可Μ使用與前面說明者不同昀其他Ν-取代基及其他變化。例如，藉由省去前面列舉的化合物之终端的Arg基團可Μ得到有用的類似物。但是，本發明的較佳胜肽群係包含順序式（I)且具有8至10個胺基酸的化合物，其中該7號及/或8號位置（使用ΒΚ順序编號）是Ν-取代的甘胺酸，該取代基較佳是苯基、苄基、苯乙基、環烷基如環戊基或環己基、或較低烷基環己基如甲基環己基〇另外依據本發明之較佳亞群化合物如下：-D，Arg-Arg-Pr〇-Hyp_Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly-Arg或 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-(N-R)Gly ，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 20 五、發明説明（）其中R係指該甘胺酸殘基的取代基，表示Μ甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正或異丙氧基、CH2〇CH3CH3 、CHaCH2〇-CH(CH3)z、CHsCHiOCH3、CH3CH8OCF3、氫硫基甲基、氫硫基乙基、氫硫基丙基（正或異丙基）所取代的環己基上的取代基。本發明將進一步由下面的實施例加以說明，其中的拮抗劑係本發明的較佳實施例。這些實施例的用意是說明性及指示性的，並不是用以限制。音掄例.

g掄例T 会成俐戡胖肽夕一船击親以[：-鈴瞌的焙除酴為主揣：>胖盱所有胺基酸上的ct-氮均K三级丁氧羰基予Μ保護。絲胺酸是以苄基_的方式予Μ保護。除非另外說明，否則精胺酸的胍基是用甲苯磺醸基保護。對於羥基脯胺酸的側鏈並未給予保護。樹階夕剪備經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將ΡΑΜ樹脂（通常是0.20至2克，Bachem)先MN.ct-Boc -Ng-P-甲苯磺醯基-L-精胺酸（每克約0.25至0.75當量）作衍生化，再加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中（ Stewart, J.M.等人，固相胜狀合成方法，Pierce Chemical Company，U984))。該樹脂K気氣起泡攪拌1分鐘的方式加入25 mL乾燥的CfUCU。將該溶液排走並用CHaCls重複清洗（2X 25mL>。接箸用二甲基甲醢胺重複清洗（3x 25mL) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 21 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 408133 A7 ___B7_ 五、發明説明（），再用二氯甲烷重複清洗（3 X 25 mL)。去保議清洗後的樹脂用三氟乙酸在二氯甲烷中之1:1混合液 25 mL處理。利用気氣起泡攪拌5分鐘，然後將溶劑過濾掉。該樹脂再用三氟乙酸在二氯甲烷中之1:1混合液25 mL 處理；再用氣氣起泡攪拌25分鐘，然後將溶劑過濾掉。由和該樹脂依序再用二氨甲烷（3X25 mL)、二甲基甲醢胺 (2 X 25 mL)及二氯甲烷清洗。該樹脂再用二異丙基乙基胺在二氯甲烷中之10% (v/v)溶液清洗（3X 25 mL〉。除去剩下的鹼，樹脂在用二氯甲烷清洗（3 X 25 mL)。 _ N-Bon-胺某酴HDIU酷结全击赚將4當量的Boc-保護的胺基酸溶於最少量的DMF中，然後加入4當量的HOBt (卜羥基苯并三唑-單水合物）。再加入4當量的DCC(二環己基碳二醢亞胺）。反應液在室溫下撗拌1小時。利用過濾將二環己基脲除去，結果的濾液加至含有N-去保護的胜肽基樹脂之胜肽合成容器中。攪拌持續1小時。

Boc-保譁的胺甚酴逛含右M-铱端日立曈的胺如D-Th、ni〇、或N-敗代的甘眩酴硓某> 胖肽某樹眼结会夕击賺將2當量的Boc-保護的胺基酸及2當量的二異丙基乙基胺溶於最少量的二氣甲烷中。將該溶液在氣氣下冷卻至〇亡*再用2當量的Bop-Cl處理。該反應液在氮氣及01 下攪拌3小時。將該均勻的溶液加至含有N-去保護的胜呔本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁)

408133., A7 _B7__ 五、發明説明（）基樹腊之胜肽合成容器中，接著加入1當量體積含有另外 2當量二異丙基乙基胺之二甲基甲醯胺。持缮攪拌2小時。在値別的實施例中所區分的値別情形中，使用4當量該經活化的胺基酸Μ及兩倍量的在該步驟中使用的試劑及溶劑。结会後夕渚洗該樹脂用二甲基甲醯胺<3 X 25 niL)清洗，再用二氣甲烷（3X 25 mL)清洗。荏成銪会評估利用對Kaiser所發展的方法（Stewart, J.M.等人，固相胜耽合成方法，Pierce Chemical Company, (1984) 作修改，讓些許顆粒的樹脂與水合茚三酮反應Μ定性決定該反應是否完成。如果反應完成，將樹脂再用二氯甲烷清洗，然後繼續作與前面一樣的去保護及結合步驟。如果出現未反應的胺，則謅該樹脂再作中和及結合步驟。在Kaiser 的試驗中可能由於N-烷基胺基酸殘基而得到不規律的結果. ，在這種情形下，可K先使少貴的胜肽基樹脂水解，再作肢基酸之定量分析*則有利於決定結合反應的完成。 HF：>去保缣m 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 小心使該胜呔基樹脂乾燥，然後放到特別作為HF反應的容器（Peninsula Laboratories〉中，先加入1 mL的茴番醚，再於低溫下加入約9 »L的HFM進行縮合反應。該反應在0C下保持45-60分瘇，然後利用真空小心將HF除去。讓該樹脂/清除劑混合物在真空下乾燥1小時，然後使用無水乙醚小心清洗剩餘物，再用10%的乙酸溶液萃取該胜本紙張尺度適用t國國家標準（CMS ) A4規格（2丨0X297公釐） 23 «08133 at _B7_.__ 五、發明説明（）肽。將該乙酸溶液冷凍乾燥成為固體*再用反相製備C18 HPLC層析（Dynamax or Vydac 30X2.5 era，10 u C18)給予純化，得到想要的胜肽。以够端的ΠΪγ或M-取代的甘醅酴為末端：> 胖肽將C-終端的Boc-胺基酸（1.0 mmol)溶於10 mL 95%乙醇與3 mL Hs〇之混合液中。加入磺酸氫鉋（1 mmol〉，然後譲反應莜攪拌1小時。利用旋轉蒸發器在真空下將溶劑除去。加入小部份的苯，再於真空中除去苯及微量的水，直到if到白色可自由流動的粉末。使Merri field樹腊（ Bachem, 交聯，100 至 200 米希粒度，約 meq/g，1.0 meq )及絶鹽懸浮於乾燥且經気氟清除過的二甲基甲醯胺（ 6-S mL/g的樹脂）中，該反應液在氦氣及50TC下提拌24至 36小時。將溶液過濂，然後依序用二甲基甲瞌胺、50% 二甲基甲醯胺/水、二甲基甲醯胺及、乙醇之溶劑每次50 mL清洗該樹脂三次。讓該樹脂乾燥過夜。在衍生化過程中依據該樹脂的質貴大約估計樹脂上的Boc-肢基睃取代密度。該Boc-胺基酸衍生的樹腊係準備作胜肽的合成，依據上述對PAM樹脂的方式作去保護。經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 胖吐：> 趦奋在此所用的胺基酸分析方法可Μ對一般天然的胺基酸作準確的定量。對於非一般的胺基酸要定量時則需要進一步發展的方法。非一般的胺基酸如D-Tic、0U、及Ν-取代的甘胺酸可以利用在胺基酸分析儀上的滯留時間加以確認及定量。對於胜胜順序的鑑定亦為相似的方式。對於只能本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -24 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 Α7 Β7 五、發明説明（）作定性辨認但不能作定量分折的殘基則以星號"作記號。依據所得到的資料發現所有化合物的順序均正確；這些在詳細的實驗說明文獻中均可清楚獲得確認。値別的殘基可 Μ利用定胜胜順序的方法予Μ確認，但並不能作非一般殘基的定量。低解折度雷射揮離質譜方法可解決這値問題，依據分子離子的測定可Μ達到約0.1%的準確度。侬據 ' 計算得到的分子量與觀察到的分子量之差別顯示該預期的微小準確度限制係為約1 m，這些化合物的分子童僅有少數在文獻中報導過。啻掄俐τ 化会物1 会成 0-ΑΓκ-Αηζ-Ρρ〇-Ηνρ-ΠΤν-Τ?ιί~5βρ-ΝΒηζ-Πίο Ν-α -Βοη-Μ-芊甚甘踣酴Ζ酷在Ν-苄基甘胺酸乙酯（1.0克，5.17 M〇l，97.0%)及三乙胺（0·79 mL，5.7 mmol)溶於DMF (1_0 mL)之攪拌溶液中加入二-三级-丁基二磺酸鹽（1.28克，5.7 mmol)溶於 DMF (2.0 mL)之溶液。結果的溶液在室溫及氮氣下攪拌19 小時。在真空下將DMF蒸掉，結果的油狀物溶於乙酸乙酯 (50 bjL)中。該乙酸乙酯層用10% ^*(：03溶液（2X 25 及鹽水（2X 30 mL)清洗*經乾燥（MgSO*)及蒸掉溶劑得到該檫題化合物，（1.48克，98.0¾ )呈油狀。NMR (CDC13), 3 1.2-1. .3 (t, 3H), 1.49 (s, 9H), 3.8 (s, 1H), 3 (s, 1H), 4. 1-4.2 (q,4H), 4.5-4.55 (d, 2H), 7.2-7 (m, 5H); 1 3 'C NMR (CDC13); ;δ 13.95 .14.04, 28.06 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） Λ〆 ~ 25 ~ 1.;---:-----0^— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ο, 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 A7 _B7_ 五、發明説明（） , 28.12, 47.54, 47.93, 50.85, 51.33, 60.70, 80.16; 80.33, 127.22, 127.31, 127-93, 128.36, 137,195, 137.43， 155.40, 155.56, 169·67, 169.71。 H-π -Βμ-Ν-苄甚甘胺酿以最少量的水溶解Na0H(0.3克，7.57maol)，將其加於N-ct-Boc-Ν-苄基甘胺酸乙酯（0.74克，2.52 mmol)溶於甲醇（5.0 ihL)之攙拌溶液中。該反應混合液在室溫下攪拌18小時。利用真空將甲醇蒸掉，結果的剩餘物溶於水中。用氯仿（2X 50 mL).萃取該水層*冷卻至0Ό，然後用1N HC1將pH調至2.0，然後用乙酸乙酯萃取該溶液。然後用鹽水清洗該乙酸乙酯層，經乾燥（MgS(K>，在真空下蒸發，得 1. 18克（88.0% )的檷題化合物。1H NMR (CDCU) ; δ 1.49 (s, 9H), 3.82 (s, 1H), 3.98 (s, 1H) , 4.52 (s, 1H), 4.56 (s, 1H), 7.2-7.4 (m, 5H), 11.5 (br s, 1H); 13C NMR (CDC13) δ 28.19, 28.26, 47.43, 47.57, 50.85, 51,49, 80.92, 81.10, 127.46, 127.52, 128.08, 128.6, 136.98, 137.16, 155.58, 155.99, 175.40, 175.70® 依據前逑的方式製備Να-Boc-Oic樹脂；再依據前逑的步驟嵌序結合該胜肽並從樹脂上切離，得到91.3毫克的粗產物。經 HPLC(10_65% CH3CN，〇.l% TFA，55 分鐘梯度，20 mL/rai η)純化得到46. 1毫克的化合物1，呈無色凍乾形式。雷射揮離質譜（LD-MS):計算值1136 (Μ + Η); 實驗值 1136 (Μ + Η)。胺基酸分析（AAA) : Arg 2.06 (2)，

Hyp 0.83 (1), Pro 0.99 (1), Gly 0.99 (1), Thi", Ser 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

26 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 408133 _B7___ 五、發明説明（） 1.12 (1), NBng", Oic*。得到正確的順序分祈。啻飾例π 化会物2 >合成 D-Arg-Apg^Prp"HvP"Gly-Thi~Ser-DT]c-NChg N-摟甚甘辟酴苄醋將環己胺（14.3 aL，125 anol>溶於50 mL的THF中，在氦氣下冷卻至0¾ ;在該溶液中逐滴加入2-溴乙酸苄酯 (7.93 mL，50 mBol)溶於50 mL的THF中。將反應液回驵至室溫，然後攪拌約15小時，利用真空將溶劑除去，將剩餘物溶於200 mL的二氯甲烷中，用100 mL的10%碳酸鈉溶液清洗。該硪酸鈉溶液用50 inL的二氣甲烷萃取兩次。合併所有的二氣甲烷層，在無水硫酸鎂上乾燥*在真空中濃縮 ◊剩餘物用HC1溶於環氧己烷的4N溶液26 i«L處理，利用真空除去揮發物剩餘物用冷且無水的乙KK予硏裂。收集該固體並在減壓下乾燥數小時，得到15克的氫氯酸鹽*並有微量的環己胺氫氣酸鹽污染其中。將該混合物溶於300 mL的二氣甲烷中*然後該溶液用100 mL的10%碩酸納溶液 ‘清洗。該水溶液再用二氣甲烷萃取。合併所有的二氣甲烷層，在硫酸鎂上乾燥，再於高真空（約1毫米汞柱）下乾燥，得到11.63克的純檫題化合物，呈油狀。1H NMR (CDCU) 8 1.0-1.32 (m, 4H) ; α . 55-1.78 (m, 4Η); 1.83 (m, 2H); 2.41 (tt, J=10, 4 Hz, 1H); 3.48 (s, 2H); 5.17 (s, 2H); 7.36 (s, 5H); 13C NMR (DMSO) δ 24.62, 25.82, 33.08, 48.02, 56.12, 66.28, 128.15, 本紙張尺度適用侧家標準（c叫刚膽靖） 27 _ (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁)

^08183 A7 _B7__ 五'發明説明（) 128.36, 135_47, 142.53。揮R甚甘胺酴午酯將Ν-環己基甘胺酸苄酯溶於44.4 mL的環氧己烷中，再加入44.4 mL的IN NaOH溶液，接箸加入二，三级丁基二碩酸鹽（10.68克）。保持攪拌約15小時，之後用旋轉蒸發器将揮發物除去。讓結果的剩餘物分佈在100 mL水與100 mL乙酸乙酯之間。將這兩層分離，水層用5%硫酸氫鉀溶液酸化至pH 3。該水層然後用乙酸乙酯萃取，合併所有的乙酸乙酯溶液*再用飽和碳酸氩鈉溶液及飽和氣化鈉溶液清洗，然後在硫酸鎂上乾燥。利用旋轉蒸發器將溶劑除去，再進一步於空真空下乾燥*得到14.50克的標題化合物，呈油狀。1H NMR (CDCU) 0_ 95-1. 55 (m, 14H) ; 1.63 (m, 1H); 1.77 (m, 4H); 3.70-4.1 (ra, 3H); 5.16 (s, 2H>; 7_36 (s, 5H> 。

Boc-N-環己基甘胺酸經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將Boc-N-環己基甘胺酸苄酯（14.0克，40 mmol)溶於 240 aL的無水乙醇中，充入乾燥的氮氣，在該惰性氣圍下小心加入1. 5克的10%鈀/碩。利用Parr裝置將氮氣圍換成氫氣（43 psi>，然後讓該混合物在室溫下搖晃24小畤。該混合物用気氣加K清除，利用一片賽力特矽蒲土將催化劑及固體過濾掉。利用旋轉蒸發濃縮該濾液，讓剩餘物溶於300 raL的乙酸乙酯中。該乙酸乙酯層用150 mL的1NM氧化鈉溶液萃取。將該鹼性溶液置於冰浴中，用1N氫氯酸溶液酸化至pH 3。用乙酸乙酯（3 X 100 bL)萃取該酸性溶液本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28 - 408133 A7 B7 五、發明説明（) 。用飽和氣化鈉溶液清洗該溶液，在真空下濃縮，得到無色油狀物，進一步在真空下乾燥。結果的玻璃/固體用己烷予以硏製，在經過逋及乾燥之後> 得到撩題化合物（8.89 克），呈無色粉末。M_P, 103-104¾ (非正確）。元素分析（(：13[123關4)(：，}1,!^(：:計算值 60.68，實驗值60.77 ，Η :計箕值9.01，實驗值9.20，N :計算值5.44，實驗值 5.44。1 NMR (CDCM S 1.07 (m, 1H); 1.10-1.55 <m, 4H); 1.43 (s, 9H), 1.55-1.9 (in, 5H) ; 3.67-4.13 (m, 3H) ; 11.33 (br s, 1H); 13C NMR (CDC1 3) 8 25.43, 25.68, 28.20, 30.91, 44.03, 44.26, 44.36, 44.42, 54.03, 54.18, 56.13, 80.36, 80.47, 154.81, 176.83 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

依據前述方式製備!^oc -Boc-NChg樹脂（0.63克，0.79 nteq/g)。再砍據前述的步驟依序結合該胜肽再從樹脂上切離，得到71毫克的粗產物。經HPLC ( 10-6 5% CH3CN , 0·1% TFA，55分鐘梯度，20 roL/min)純化得到23毫克的化合物2，呈無色凍乾形式。LD-MS:計算值1136.6 (忖+1).;實驗值1136.5(时+1)。44八：4^2_01(2)，心？1 0.81 (1), Pro 0.94 (1), Gly 0.98 (D, ThiH, Ser 1.27 (1)，NChg' Tic1*。得到正確的順序分析。 gfeMTV 仆.会物.S及仆合物4· ^会成

Π-Arg-Arg-Pi-n-HYD-GI v-Thi-Ser-Tal "-NChg-Are. * 里嫌物A及R 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 408133 at B7 五、發明説明（）卬.丨.）->{-({^^)-2-奋：化茚甘粧酿 (D, L>-2_氫化茚甘胺酸係依據Porter及Shive的方法 (Porter，T Η及Shive, W . , J Med· Chem. UL 402 ( 1968))予以製備。將D,L-2-氫化茚（3.36克 * 17_54 ramol) 溶於含有氫氧化鈉（1.76克，1.1當置）之環氧己烷<30 mL) 與水（15 bL)之混合液中。加入二-三级丁基二碩酸鹽<4.35 克，19.3 nmol)。該反應液在室溫下攢拌18小時。利用旋轉蒸發器除去揮發物，留下的水溶液用氯仿給予萃取，然後用HC1酸化至pH 2-3,再用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗該乙酸乙酯溶液*再於無水碕酸鎂上乾燥。除去溶劑後得到2.87克（56%)的（0几）1-(8〇(：)-2-氫化茚甘胺酸。經濟部中央標準局負工消费合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將以Net -Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸作預衍生化的Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂（1.52克，Bachem, 1.0 meq)加於設計用於手操作固相胜呔合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜肽再從樹脂上切離，得到330 毫克的粗產物。經 HPLC (10-65% CH3CN，0.1% TFA，55 分鐘梯度，20 BL/BirO純化得到30.4毫克的異構物A (化合物3)及31.5毫克的異構物3(化合物4)。叩1^的滯留時間：（5-55% CH3CN，0.1% TPA，50分鐘，C1& 分析管柱）異構物A (化合物3) 27.9分鐘；異構物Β ( 化合物4) 28.6分鐘。化合物3 (異構物A) :LD-MS: 計箕值 1306 (M + H);實驗值 1307 (M+H>。AAA : Arg 3.36 (3), Hyp 0.93 (1), Pro 0.90 (1), Gly 0.90 (1). Thi* Ser 0.91 (1), NChg", Igl**。化合物 4 (異構物 B) LD- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（hOXW7公釐） 30 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 _33A7 B7 五、發明说明（) MS:計算值 1306 (M+H)實驗值 1305.8 (M+H)°AAA:Arg 3.43 (3), Hyp 0.92 (1), Pro 0.89 (1), Gly 0.89 (1), Thi», Ser 0.91 (1), NChg*, Igl* °

啻掄俐V 化合物5 ：>会成 D-Arg-Apg-Pro-HYP-Glv-Thf-Sp>r-D-Tic-NChg-flrg 將MNct -Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸作預衍生化的Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依據前述的步驟依序结合該胜肽再從樹脂上切離，得到330毫克的粗產物。在該合成過程中使用4當量之預活化的Boc-胺基酸。該粗產物經 HPU (10-65% CHaCN，0.1¾ TPA，55分鐘梯度，20 ml /rain〉純化後得到131.8毫克的化合物5。HPLC滞留時間 :(5-70¾ CH3CN，t)· 1% TFA，65分鐘，Cl 8 5 ju 分析管柱，R.t. = 30.3分鐘）LD-MS:計算值1293 ;實驗值1293 (M + H〉。胺基酸分析：Arg 3.13 (3), Hyp 0.90 (1), Pro 0.95 (1), Gly 0.98 (1), Thi*, Ser l.〇4 (1), NChg·, T i c -。得到正確的順序分析。審掄俐VT 化合物6 >合成 D-Arg-Arg-Pro-Hvp-Grv-Th!-Ser-D~HRn^-nif»-ftrg 將KNot -Boc-Ng-p-甲苯磺醢基-L-精胺酸作預衍生化的N oc -Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂（0.240克，Bachem, 0·14 rae<〇加於設計用於手操作固相胜肽合成本紙張尺度適用t國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之放意事項再填寫本頁)

-31 - 經濟部中央標準局負工消費合作社中聚 ^8133 A7 B7 五、發明説明（）之容器中。依據前逑的步驟依序結合該胜呔再從樹脂上切離，將一部份粗產物經 HPLC (10-65% CH3CN，0.1% TFA ，55分鐘梯度，20 ml/mi η)純化後得到δ. 3毫克的化合物 6。1^1^:!?.1=14.0分鐘（20-60%以3(^，0.1%丁「八，30分鐘，CIS 5W分析管柱）。LD-MS :計算值1293 ;實驗值 1293(M + H)。AAA : Arg 2.98 (3>，Hyp 1. 08(1) , Pro 0.97 (1), Gly 1.10 (1), Thi", Ser 0.87 (1), NBng*f Oic"。得到正確的順序分析。啻旆例VB 仆，会物7 会成 D-Arg~Arg~Pro-HvD-Glv-Thi-Sp. r-D-NRng-NChg-Arg 將MNct -Boc-Ns-P-甲苯磺醯基-L-精陔酸作預衍生化的Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂（0.240克， Bachem, 0.14 meq)加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜肽再從樹脂上切離。將一部份粗產物經 HPLC (5-55% CH3CN，0.1% TFA* 55分鐘梯度，20 ml/rai η)純化後得到42毫克的化合物7 。[^1(：:1^=13.5分鐘<20-60%(：[13(^，0.1%??為， 30分鐘，C18 5w分析管柱）。LD-MS :計算值1280 ;實驗值1280。 AAA: Arg 3.03 (3), Hyp 1.06 (1), Pro 0·99 (1), Gly 1.02 (1), Thi-, Ser 0.90 (1), NBng", NChg-。得到正確的順序分析。本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲請背面之注意事項再填寫本頁)

A7 __B7_ 五、發明説明（）

審渝例V >f卜.会物8 ：>会成 D-Arg-Apg-Pro-Hvp-Glv-Tlii-isftr-R-Tif；-Mrpg-Arg N-頊Γ&某甘胺酴罕酷將溶於20 nL ^(:卜的之-溴乙酸苄酯（3_30 mL，20.0 mmol)溶液逐滴加至溶於20 mL (^“^的環戊胺（8.60克，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 100 mmoi)在0C下攙拌的溶液中。在完成加入該2-溴乙酸苄酯之後，讓該反應液在室溫下攪拌17小時。利用真空將有機溶劑除去，將剩餘物溶於乙酸乙酯中，再用飽和haC〇3 溶液清洗。用IN HC1萃取該溶液。用Na2C〇3將該水層調成鹸性，再用氯仿萃取。使該有機層乾燥（MgSCU)及蒸發。剩餘物用矽石膠快速管柱層折给予純化，依序用己烷及己烷/乙酸乙酯（1:1，v/v) ?容祈，得到2.3克（50.0% >的標題化合物，呈油狀。1H NMR (CDCM δ 1.25-1.85 (in, 9H); 3.0-3.12 (m, 1H); 3.43 (s, 2H); 5.15 (s, 2H); 7.27-7.42 (m, 5H) ; 13C NMR (CDCU) δ 23.72, 32.71, 49.53, 59.03, 66.24, 128.1, 128.32, 135.42, 172.29 o -Rnn-N-頊戍甚甘胺酿午酷

在N-環戊基甘胺酸苄酯（2.31克，9.9 Μ〇υ及三乙胺 (1.66 mL，11.9 mmol)溶於 DMP (3_0 mL)的攢拌溶液中加入二-三級丁基二碳酸鹽（2.16克，9.9 mmol)溶於DMF 本紙張尺度適用中國國家榇準（CMS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 408133 五、發明説明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (3·0 mL>的溶液。結果的溶液在室溫及気氣下抿拌19小時。利用真空將DMF蒸掉，結果的油狀物溶於乙酸乙酯（50 mL>中。用 10% Na2C〇3溶液（2X25 ml}及鹽水（2X30 mL) 清洗該乙酸乙酯層，經乾燥（MgSCU)及溶劑蒸發後得到檁題化合物（3 _28克，99.0%)呈油狀。該化合物不需要進一步純化。i3C NMR (CDC1,) S 23.44，28.13，29.11, 29.80, 44.86, 56.28, 66.61, 79.96, 128.15, 128.30; 128.46, 135.5，155.0，170.48° Ν-π -Bnc-M-厝戊甚甘胺酴經濟部中央標準局員工消費合作社印裂在N-ct -Boc-N-環戊基甘胺酸苄酯<3·28克，9.9 mmol) 溶於除氧氣且加有10%鈀/碳（0.33克〉的乙醇（30 aiL>中。使該反應混合液在Parr加氫器中在氫氣（30 psi)下攪動 17小時。利用賽力特矽藻土片予Μ過濾，再蒸掉乙醇。讓結果的剩餘物溶於乙酸乙酯中，再用冷的IN HC1 (100 inL) 及鹽水（2X 100 raL>清洗該乙酸乙酯層，再經乾燥（MgSOJ 及真空蒸發。結果的化合物用乙酸乙酯/己烷作再結晶，得到1.09克（47.0%>的樓題化合物，呈無色固體。元素分析（(：^11叫*)(：,}],?^(：:計算值59_24;實驗值58.94 ，Η，計算值8.70 ;實驗值8.69 ; N :計箕值5.76 ;實驗值 6.00® NMR (CDCU) d 1.2-1.72 (n,15H); 1.76-1.96 (m, 2H); 3.64-4.0 (br, s, 2H); 4.1-4.6 (m, 1H); 10.36(br, s, 1H) 〇本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 _Ϊ33 a? Β7___ 五、發明説明（）將Bodg-ρ-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂（1·52克， Bachem, 〇.5 meq)加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜呔再從樹脂上切離。在該結合過程中係使用4當量的預活化的胺基酸。經HF去保護後得到428毫克的粗產物。取100毫克的粗產物作HPLC (10-65% CH3CN, 0,1% TFA，55分鐘梯度，20 ml/rain) 純化後得到22.3毫克的化合物8，呈白色凍乾形式。HPLC :R.t. = 28.7分鐘（5-70% CH3CN，0.1% TFA，65分鐘， C18 5 W分析管柱）。LD-MS :計算值1278,6，實驗值1279.6 (M+1) 。 AAA: Arg 2.93 (3)， Hyp 0.96 (1)， Pro 1.01 (1) . Gly 1.04 (1), Thi", Ser 0.90 (1), Tic*. NCpg* 。得到正確的順序分析。

窖掄俐IV 化合物Ω :>会成 D-ftrg-Apg-Pro-Hyp-Glv-Thi-Ser-D-Plift-Hniig-Arg 將Boc-Ng-p-甲苯磺醢基-L-精胺酸PAM樹脂（1.52克， Bachera, 0.5 meq)加於設計用於手操作固相胜呔合成之容器中。依據前逑的步驟依序结合該胜肽再從樹脂上切離。在該結合過程中係使用4當量的預活化的胺基酸。經HF去保護後得到586.7毫克的粗產物。取100毫克的粗產物作 HPLC(10-65% CFUCN，0.1% TFA，55分鐘梯度，20 ml/ mi η)純化後得到72.8毫克的化合物9。HPLC : R.t. = 30.5 本紙張尺度適用肀國國家揉準（CNS ) A4规格（2丨OX297公釐） --------0裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .IT· ο 408133 A7 _B7________ 五、發明説明（）分鐘（5-70% CHaCN， 0.1% TFA，65分鐘，C18 分析管柱）。LD-MS :計算值 1281.5，實驗值 1281· 5 (M+H)。AAA ：Arg 3.11 (3), Hyp 0.91 <1), Pro 0.95 (1), Gly 1.00 (1), Thi*, Ser 1.06 (1), Phe 0.97 (1). NChgH 〇審掄俐X /h会物1 0 n-Arg-Arg-Pro-Hvp-GlY-Thi-Ser-D-Cpg-HChg-Arg H - a -Ron-摄fg某甘眩酿經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) D-環戊基甘胺酸係依據Dunn之方法（Hill, J. T.及 Dunn, F. W . , J. Org. Chem. Ιΰ. 1321 (1965))予 M 合成。將D-瓌戊基甘胺酸（3.93克* 27.5 mmol)及氫氧化鈉 (27.5 mL，1M溶液）加至150 mL環氧己烷與75 mL水的混合液中。將該溶液冷卻至Ot，再加入二-三級丁基二碳酸鹽 (6.60克，30.2 mmol)。將該反應混合液回溫至室溫並攪拌約15小時。利用真空將揮發物除去 > 結果的剩餘物瑢於水中，用5% NaOH鹸化至pH 9。用乙酸乙酯萃取該水層三次，合併該萃取液，用鹽水清洗，在無水硫酸鈉上乾燥，再於真空下濃縮後得到5.44克（81.5%)的檫題化合物，呈玻璃狀。NMR (CDC13) S 1.15-1.9 (m，8H> 1.45 ( s, 9H); 2.25 (m, 1H)； 3.99 (dd, 0.32H); 4.25 (dd, 0.68H); 5.01 (d, 7.0 Hz, 0.68H); 6.27 (d, 7.0 Hz, 0.32H), NH及ct-H由旋轉因子產生兩®訊號。本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 408133 A7 B7 五、發明説明（）將Boc-Ng-p-甲苯磺醢基-L-精胺酸PAM樹腊（1.52克， Bachera, 0.5 nieq)加於設計用於手操作固相胜呔合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜呔再從樹脂上切離。在該結合過程中係使用4當量的預活化的胺基酸。經去保護後得到349毫克的粗產物。取100毫克的粗產物作HPLC (10-65% CHaCN* 0.1% TFA，55分鐘梯度，20 ml/min) 纯化後得到30.2毫克的化合物10。HPLC : R.t. = 29.2分鐘 (5-70% CH3CN，0_ 1¾ TFA，65分鐘，C18 5m 分析管柱）。LD-MS :計算值 1258_9，實驗值 1258.9 (M+H)。AAA : Arg 3.13 (3), Hyp 0.92 (1), Pro 0.96 (1), Gly 0.98 (1), Th”，Ser 1,02 (1)，Cps*，NChg*。眚掄例XT 仆.会物11 合成 O-Arg-Arg-Pro-Hvp-fjlY-Thi-Sftr-NPfig-nifr-Arg N-芏7.甚甘胺酿午酷氣氣酿趨將2-溴乙酸苄酯（3_3 20.0 raraol)溶於CH2Cla ( 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注項再填窝本頁) 30 mL)的溶液逐滴加至苯乙基胺（12.6 ntL，100 mmol)溶於CHaCla (30 mL)在0*0下規拌的溶液中。在回溫至室溫後，讓反應液攪拌24小時，然後過濾，再用真空將溶劑蒸掉。將結果的剩餘物溶於乙酸乙酯中，再用鹽水清洗，再於硫酸鈉上乾燥。用真空將乙酸乙酯蒸掉。粗產物用矽石膠快速管柱餍析純化，依序用己烷及乙酸乙酯/己烷（9:1 ，v/v)溶析。含有產物的分液會有撤量的2-溴乙酸苄酯不本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） A7 B7 五、發明説明（）純物。將這一部份再溶於CHCU中，用IN HC1清洗。使該氯仿層乾燥，用石油醚使該HC1鹽沈澱出來。得到2.3克無色固髏。1111^11(^)(；13>5 1.95(1)1',3,111),2.73- 2.9 (m, 3H), 3.44 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 7.13-7.36 (瓜，10H)。13C NMR (CDCM; S 36·17, 50,46, 50.63, 66.32, 26.06, 128.18, 128.3, 128.4, 128.50, 135.4, 139.4, 171.88。某甘胺酴罕酷經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在N-苯乙基甘胺酸苄酯（2.30克，8.54 mmol)及三乙胺（1.31 bL，9.4 mmol)溶於DMF(3.0 mL)之攪拌溶液中加入二-三级丁基二碳酸鹽（1.87克，8.54mmol)溶於DMF (3.0 mL)之溶液。使結果的溶液在室溫及氣氣下攪拌22小時。利用真空將DMF蒸掉，將結果的油狀物溶於乙酸乙酯（50 raU中。用 10¾ NaaC〇3溶液（2X 25 bL>及鹽水（2X 30 mL) 清洗該乙酸乙酯層，經乾燥（MgSOO及溶劑蒸發後得到3.13 克（98.0%)標題化合物，呈油狀。1H NMR (CDCM δ 1.37, 1.44 (旋轉因子 *9H); 2.75-2.9 (m，2Η>; 3.33-3.55 (m, 2H); 3 8 , 3 92 (旋轉因子，2H) ; 5.15 (s, 2H) ; 7.1-7.4 (tn, 10H);13C NMR (CDCU); δ 28.09, 28.20, 34.64, 35.02, 49.16, 50.07, 50.39, 66.62. 66.68, 80. 12, 126.18, 126.26, 128.14, 128.21, 128.31, 128.38, 128.43, 128.73, 135.41, 138.95, 138.99, 154.85, 155.49, 169.84, 169.89° K- a -Bod-茱7,某甘胺酿本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ _B7__ 五、發明説明（）將卜〇£-8〇^-苯乙基甘胺酸苄0旨（3.13克，8.47 111[11〇〇溶於乙醇（50 mL)中，在用気氣小心去氣後，將10% Pd/C (0.3克）懸浮於該溶液中。讓該混合液在Parr加氫器中使用氬氣圍（約40 psi)给予攙拌18小時。使用賽力特矽蒲土片過濾該混合液，再使乙醇蒸掉。使結果的剩餘物溶於乙酸乙酯中，使用冷的IN HC1 (100 A)及鹽水（2X 100 mL) 清洗，經乾燥（MgSOJ及在真空下蒸發，得到2. 16克（88.2 % )的檫題化合物，呈無色固體。1H NMR (CDCU) S 1.45 (s, 9H); 2.8-2.92 (m, 2H), 3.44-3.6 (m, 2H) , 3.8, 3.92 (旋轉因子，2H), 7.12-7.36 U, 5H), 11.32 (br s, 1H); 13C NMR (CDC13); δ 34.65,35.01, 49.15, 49.69, 50.37, 50.55, 80.65, 80.77, 126.32, 126.42, 128.5, 128.56, 128.80, 138.79, 138.93, 155.97, 175.32, 176.02° 將Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺酸PAM樹脂（1.52克， Bachem, 0.5 meq)加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜肽再從樹脂上切離。在該結合過程中係使用4當量的預活化的胺基酸p經去保護後得到487毫克的粗產物。取100毫克的粗產物作HPLC (10-65% CH3CN，0.1% TFA，55分鐘梯度，20 ml/min) 純化後得到23.0毫克的化合物11，呈無色凍乾彤式。HPLC :R.t. = 32.8分鐘（5-70% CH3CN，0.1% TPA，65分鐘， C18 分析管柱）。LD-MS :計箕值Π05，實驗值1305。 AAA: Arg3_16 (3)，Hyp 0.91 ⑴，Pro 0.94 (1), Gly 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

408133 A7 _B7__ 五、發明説明（） 1.00 (1), Thi", Ser 1.00 (1), Oic", NPeg" ®

音旃剜y T T 仆.会物12：>会成、 D-Arg-Arg-Pro-HYD-G1v-Thf-Sfti~-n-Tio-NHoh-Arg N-璟R烷申某甘腌酴午醋該化合物的合成係使用與對N-苯乙基甘胺酸苄酯合成相同之步驟，起姶是使用2.38克(10 ΒΒ〇υ的2-溴乙酸苄酯及5.66克的環己烷甲基胺。該產物是藉由其氫氯酸鹽之沈澱予Μ純化。然後將該氫氣酸鹽瑢於 <：叮13中，用Na2C〇3 U0%)清洗，分離得到1·3克（52.0%)的檫題化合物，呈油狀。HC1 鹽的 iaC NMli (CDCU) S 25.21，25_27. 25_72, 25.83， 30,43, 30.68, 34.64, 37.58, 46.25, 47.46, 54.17, 68.11, 128.63, 128.70, 128,81, 134.243, 165.63。 nr -Rod-頊F3.烷甲甚甘胺醚，酷與合成Boc-N-苯乙基甘胺酸苄g旨相同之步驟，起始使用1.39克的N-環己烷甲基甘胺酸苄酯。產量1.8克（94.0%〉，呈油狀。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) H-rr -Bnn-M-琨R烷甲甚甘胺酿與合成Boc-N-苯乙基甘胺酸相同之步驟，起姶使用 1.80克的N-ot -Boc-N-環己烷甲基甘胺酸午酯。產量1.28 (95.0%)分離後呈無色固體。111!^11((：1)(：13)3 0,84- 1.8 (m，20H>; 30·04-3.2 (m，2H>; 3.9-4.04 (旋轉因子 » 2H); 11.44 (br s, 1H); 1aC NMR (CDC13); δ 25.67, 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) A4規格（210X297公釐） -4ϋ 一 408133 A7 B7 五、發明説明（） 25. 78, 26. ,25, 26. 36, 28. .13, 28. 1.9, 28. 24, 30. 59, 30. 65, 30. 72, 36. 85, 37. 08, 37. 69, 45. 53, 49. 08, 49. 69, 54, .47， 54. 62, 80, 17, 80. ,37, 155 .46, 156.37 174 .68, 175.06 〇將Boc-Ng-p-甲苯磺醯基-L-精胺睃PAM樹脂（1.52克， Bache®, 〇.'5 meq)加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依據前述的步驟依序結合該胜肽再從樹腊上切離。在該結合過程中係使用4當童的預活化的胺基酸。經HF去保護後得到480毫克的粗產物。取100毫克的粗產物作HPLC (10-65% CH3CN，0.1% TFA, 55分鐘梯度，20 ml/min) 純化後得到191毫克的化合物12,呈無色凍乾形式。HPLC: R.t. = 33,7分鐘（5-70% CH3CN*0.1% TFA，65分鐘，C18 5w分析管柱）。LD-MS、計算值1307，實驗值1308 (M + H>。 AAA ： Arg 3.16 (3), Hyp 0.91 (1), Pro 0.94 (1), Gly 1.00 (1), Thi-, Ser 0.99 (1), Tic*, NMch"〇謇旆例XTTT 仆，会物1 3 δ -Gpa-Arg-Pro-Hvp-filv-Th i-Ser-D-Tic-NChg-Arg 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將Boc-Ns-P-甲苯磺醸基-L-精胺酸Merrifield樹脂（ 4.20克，Bachem HBoc 20 , 0.48 aeq/g)加於設計用於手操作固相胜肽合成之容器中。依序结合該胜肽而形成四肽 (Ser-(OBn)結合〉，然後將造一製程轉移至CS-BI0自動胜肽合成儀中Μ進一步加上Gly、Hyp、Pro、及Arg。在該反應容器中取出一部份的胜肽基樹脂（0.53克）。依據前述方本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐），， -41 _ 408133 A7 B7_ 五、發明説明（) 式使用TFA對該樹脂樣品作去保護，再依據前述對HOBt/ 二醯亞胺活化之步驟以結合N-(Boc)-d-胺基戊酸。再依據前述的方式使用三氟乙酸使這一殘基去保護，接箸依序Μ 二氯甲烷、10%二異丙基乙基胺/二氯甲烷、二氣甲烷及最後M DMF清洗及中和。將該樹腊加至0.566克ΙΗ-吡唑-卜俊脉（Bernatowicz, Μ· S.等人，J. Org. Chem. 572497 (1992)>與0.76 nL二異丙基乙基胺溶於20 ffiL DMF之混合液中在47t!下加熱2.25小時。該樹脂用二氣甲烷及二甲基甲醢胺清洗，然後與ΙΗ-ltt唑-1-羧脒的反應另外重複兩次。該樹脂依序用二氣甲烷、甲醇、二氣甲烷清洗，再於真空下乾燥。經HF去保護後得周80毫克的化合物13,呈無色凍乾形式。11?1^:1^七.=22.6分鐘（5-55%飞1^^0.1 % TFA，55分鐘，Π85μ分析管柱>。LD-MS :計算值1278 (Μ + Η)，實驗值 1278,7 (Μ+Η)。審掄例XTV 化会物1 4 δ -Gpa-Ppo-Hvp-fl1v-Th ΐ-Ser~D~Tip-HChg-Arg 經濟部中央標準局員工消費合作杜印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將8〇(：-?^-?-甲苯磺醯基-[^精胺酸心1'1'丨1;41(1樹脂（ 4.20 克，Bachem RBoc 20* 0_48 meq/g)加於設計甩於手操作固相胜肽合成之容器中。依序結合該胜呔而形成四呔 (Ser-(0Bn〉結合 >，然後將這一製程轉移至CS-M0自動胜肽合成儀中K進一步加上Gly、Hyp、及Pro。在該反應器中取出一部份的胜肽基樹脂（0.260克）。依據前述方式使用TFA對該樹脂樣品作去保護，再依據前述對HOBt/二醯本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） —42 - 經濟部中央標準扃貝工消費合作社印裝 ^08133 at _'_B7_ 五、發明説明（）亞胺活化之步驟以結合N-(Boc>-d-胺基戊酸。再嵌據前述的方式使用三氟乙酸使這一殘基去保護*接著依序Μ二氯甲烷、10%二異丙基乙基胺/二氯甲烷、二氯甲烷及最後以DMF清洗及中和。將該樹脂加至0.40 5克1Η-吡唑-卜羧脒 (Bernatowi cz , Μ S 等人，J Org . Chem，JJL 48-58 (1959))與0.545 mL二異丙基乙基胺溶於14.5 mL DMF之温合液中在47t：下加熱2.25小時。該樹脂用二氣甲烷及二甲基甲醯胺清洗，然後與ΙΗ-lt唑-卜羧脒的反應另外重複兩次。該樹脂依序用二氯甲烷、甲醇、二氣甲烷清洗，再於真空下乾燥。經HF去保護後得到30毫克的化合物14，呈無色凍乾形式。心[(：:11.1 = 22.3分鐘（5-55%(：113^ 0 1% TFA，50分鐘，C18 5u分析管柱>。LD-MS ··計算值 1123 (M + H)，實驗值 1123 (M + H)。 g旆例XT 化会物1 5 R-Arg-Arg-Pro-Hvp-GIv-Thi-yipr-D-Ti^-NPhg-Arg Fm〇f. -1) - T i rt jS 氣將1當量的Fmoc-D-Tic熔於CHeCla中（0·3Μ) .*再將之置於一値裝有攪拌磁心及迴流冷凝器的錐肜瓶中。在攪拌下加入亞磺醯氦（10當量），混合物在氮氣下迴流2小時。利用旋轉蒸發Μ濃縮該反應混合液，剰餘物用（：118(：13稀釋，再給予濃縮以除去過多的亞磺醸氯。渣樣重複兩次，結果的醢氯用己烷硏製（或者是用CHaCU/己烷作再結晶）直到得到撤細的粉末。直接使用，不需進一步純化。本紙張尺度適用中固國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-43 _ 經濟部中央標隼局員工消费合作社印装 408133 Λ7 A / B7 五、發明説明（)

Fm〇f：-D-Tic-N -果甚甘辟酸將N-苯基甘胺酸（1.2當量）懸浮於乾燥的THF中（0.5M) ，置入一插錐形瓶中，再加入3當量的二異丙基乙基胺。將該錐形瓶置於冰浴中*在氮氣下攪拌15分鐘。先將1當量的Fmoc-D-Tic醸氯溶於乾燥的THF中（〇·15Μ>，再緩慢加於該冷卻的錐形瓶中。開始會立卽形成沈澱，讓該反應液回至室溫，再攪拌2小時。當該反應完成時，利用旋轉蒸發除去溶劑，用乙酸乙酯取剩餘物，用5% KHS〇4、H,Q、及鹽水清洗。用NaeS〇4、旋轉蒸發及置於高真空下予Μ乾燥，得到白色的泡沫。該二肽用HPLC (Cie RP管柱，4.6 X 250 nun，1 raL/min 流速，30分鐘梯度，從30至 100% CHaCN/Ha〇，含有0.1% TFA，在254 nm偵測）純化，直接使用，不需進一步處理。

亦 Arg-ΠΗΜΡ樹臍 l· 捺 h FnmdTip-NPhg-nH 使用前述使N-保護的胺基酸與立障性N-取代的胺基酸結合的條件使用Boc-Cl使該Fmoc-D-Tic-NPhg-ΟΗ二呔（約 0.785 mmol)與該胜肽基樹脂（0.25 mmol)結合。胜呔合成··藉由與DMF中20%六氫吡啶反應（2X30分鐘）使該Fmoc-D-Tic-NPtig-Arg-ΟΗΜΡ樹脂作N-去保護.。依序用DMF三次、二氯甲烷二次、甲醇二次、及二氯甲烷三次清洗該樹脂。使用前述的Bop-Cl步驟使Fmoc-絲胺酸-(0-t-Bu)-(3H結合。將該樹脂移至ABI型號431自動旋轉因子合成儀中，使用檫準Fnoc/HBTU結合步驟（ABI Fmoc步驟，應用生物条統型號431A胜肽合成儀使用手冊，2.0版本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局負工消費合作社印策 __408133 B7 _ 五、發明説明（），1992年1月）加入另外的殘.基。然後用二氣甲烷清洗該樹脂數次，在無水的氮氣下乾燥。然後在該榭脂上加上1〇 ml含有0.5 ffiL茴香硫醚及0.25 fflL二氫硫基乙烷之三氟乙酸。使該反應在室溫下起泡3小時。過濾該混合液，再用約1 mL三氟乙酸清洗該樹脂。合併的濾液置於真空中濃縮，再用乙醚溶取剩餘物，然後在冰浴溫度下放置15分鐘。利用過濾收集沈澱物，再用冰冷無水的乙醚詳細清洗，經真空乾燥得到205毫克的無色粉末。這些產物取一部份作 HPLC純化（0-35% CihCN， 0. 1% TFA， 50分撞梯度，10 mL/mi η)得到10毫克的化合物15，呈無色凍乾形式。HPLC :R.t. = 20_9分鐘（5-55% CH3CN，0.1% ΤΡΑ，50分鐘， C18 5 w分析管柱〉。LD-MS :計算值1287.5 (Μ + Η)，賁驗值1287.5 (Μ+Η>。得到正確的胺基酸分析資料。奮旃例ΟΤ 化合物1 D-Arg-Arg-PpQ-Hyp-GIv-Thi-Ser-n-Phfi-NPhg-Arg 依據在化合物15中製備Fmoc-D-Tic-NPNg-ΟΗ之方法製備二肽Faoc-D-Phe-NPhg-ΟΗ。再使用在化合物15中的步驟使該二狀 Fmoc-D-Phe-NPhg-OH (約 0.5 naol)與 Arg-HMP 樹脂（0_25innol)結合。該胜肽經合成後，如在化合物15中所述方式使其從樹脂上切離。取該產物75毫克作HPLC純化（ 5-50% CH,CN，0.1% TFA，60分鐘梯度，10 mL/min) 得到18.9毫克化合物16，呈無色凍乾形式。HPLC: R.t.= 21·9分鐘（5-55% CH3CM，0.1% TFA，50分鐘* C18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）』r -45 - {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 408133 β77 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印裝五、發明説明（）分折管柱）。LD-MS :計箕值 1275 (M + H) , 1298 (M+Na>;實驗值 1274 (M+H)，1298(M+Na〉。窝掄例XVTT 仆.会物1 7 Ρ-Αγκ-Αρκ-Ητγρ 一 Ηγρ-01ν-ΤΙιΐ-5?ΑΓ-Γ)~Τΐπ-ΝΓ>ιζΓΑΓ'β 將Boc-Ng-p -甲苯礎酿基-L-精胺酸Merrifield樹脂（ 4.20克，6&(：{^111,}18〇〇20,0.48 11169/3>加於設計用於手操作固相胜呔合成之容器中。使用前逑的步驟依序結合該胜呔*再從樹腊上切雔。在該結合過程中使用4當量的預活化胺基睃。經去保護後得到1.05克粗產物。取該產物一小部份作 HPLC 純化（0.65% CH3CN*0.1% TFA,50 分鐘梯度，lOmL/min)得到化合物17，呈無色凍乾形式。得到正確的胺基酸及胜肽順序資料。啻掄俐XV TTT:半物袢窨料本發明的最佳化合物是緩激呔拮抗劑，其於與緩激肽作用相關的疾病狀態或病理症狀中具有廣泛的治療效用。下面的方蒂係說明在此用於测定緩激肽拮抗劑活體内及活體外活性之分析以及鑑定多擂本發明化合物選擇性及活體内穩定性之分析。活_體外B a拮抗割活桦^測量檫準老鼠子宮pAa*祈係進行如下：取Sprague-Dawley雌鼠（200-250克〉，先Μ己烯雌酚 (100 ug/kg>處理，於18小時後Μ敲擊頭部方式给予殺死，再给予放血。除取子宮觸角，置於在31¾下含有De ----^-----C 装— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨.· 1 ·" 訂 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） 46 ___408133 B7_ 五、發明説明（）

JalorTs溶液之組織液4 idL中保持1克靜止張力，並给予充氣。作出沒有及存有拮抗劑（預先孵化15分鐘）下緩激狀集中效應之曲線。依據Arunlakshana及Schild (Arunlakshana, 0., Schild, Η.0., Br. J. Pharmacology 1A 48-58 (1959〉）之方法計算得拮抗劑效力。在曝露於最高濃度的拮抗劑（通常為l〇_a冥耳濃度）中之後，每一組繃在40分鐘內每隔10分鐘清洗一次，之後再作出緩激呔集中效應之曲線。計算出這一時間之緩激肽pDa (-log〔產生對緩激肽最高初姶反應之50%時之其耳濃度〕），再與鍰激肽初始控制集中效應曲線之pDfl作比較。與同時控制組作比較的戸匕差值反映出激動劑反應的“百分回收率”。法睹外r,槟杭割话袢夕測量

利用過童的戊巴比妥（80 mg/kg i.v.)殺死紐西蘭白雌兔，除取胸主動脈。將螺形條置於含有Krebs溶液（ 118.3 mM NaCl, 4.7 mM KC1, 2.5 mM CaCla， 1.2 nM

MgS〇4, 1.2 mM KHaP0*, 25 mM NaHC03, 25 mM葡萄糖，經濟部中夹標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 及2.8 «Μ indomethacin)之組織液5 raL中保持2克靜止張力，並M95% 〇a/5% C0a充氣。作出在1及3小時之des -八“3-緩激肽集中效應之兩條曲線。在5小時時，將(^3-Arg3-缓激肽加於該組織液中使結果祺度為10· 7M。這一條件可產生達到45分鐘穩定、保持及延長的濃度。從結果的作圖中可計算出ICeD或產生收縮回復之50%時之濃度。這些結果顯示於表1中。搏宙袢研究本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） -47 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 A7 _B7_ 五、發明説明（）從健康的男性及女性自願者或天竺鼠收集得全血液，再製備得血漿樣品。將樣品收集於含有肝素納之培養皿中 /然後以2000 rpm在4¾下離心10分鐘。將上清液吸出並貯存於-20¾之小試管中。利用如由Skidgel (Booth, A. G.等人，Biochemical Journal 1A2., 575-581 ( 1974))所敘述的微差離心方法製得鼠或豬之肺皮質膜及由Booth ( Erodos, E G.等人，Bi ochemi ca 1 Pharmaco 1 ogy U 3471 -3478 (1984))所述方法製得腎皮質膜。將膜製備液貯存於-20¾下。將缓激呔拮抗劑在PBS (0.0132 Μ磷酸鹽， 0 1454 M NaCl，pH 7.2)中稀釋至1 πιΜ的猥度。將該工作溶液Μ每10撤升裝入一条列的Eppendorf試管中，然後加入人體或天竺鼠血漿（90 WL)或當作控制組的PBS ^再Μ不同的時間孵化。在到逹每段時間時，加入溶於乙睛或乙醇的IN HC1 1〇〇 WL以終止反應。讓樣品靜放約15分鐘，然後K 14,000 rpra離心10分鐘。拿取上清液，M0.22 ίΐΜ濾紙（Mi 1 ipore)過濾，再M HPLC分析（C18，12-80%溶於水之乙睛，兩者均含有0·1%三氟乙酸，在214 nm監測）。豬腎製備液MPBS稀釋為1:10,鼠腎製備液K.PBS稀釋為1:100 ;豬肺製備液M PBS稀釋為1:1。將緩激呔拮抗劑溶液（10 id)加於一糸列Eppendorf試管中，然後分別加入上述稀釋的膜製備液（90 uL)，在不同的時間點加入100 uL的乙醇Μ終止反應，再以前述的方式離‘心及HPLC分析。 HPLC佶號消失的半生期係以電腦程式ENZF IT (Elsevier) 決定。穩定性數據係列於表2中。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 6 獅133 A7 __._____B7 _ 五、發明説明（）表1 在官能組織分析中之活體外緩激肽拮抗劑活性 Ba 經濟部t央標準局員工消费合作社印製化合物 pA8 (鼠子官） η 回復率 % Βι (兔主動脈〉 1 1 5·67士017 3 32 6.41±(K25 3 2 6.76士0.71 3 0 5.79±0.065 3 6.41±0.49 3 100 <5 4 4 激動劑 <5 4 5 9.5士0.05 10 71 <5 3 6 7.3士0.0091 3 93 <5 2 7. 激動劑 3 <5 2 8 8.50土0.09 3 56 <5 4 9 7.73土0.09 3 87 5.52 4 10 5.85土0.09 75 5.34 4 11 激動劑 <5 4 12 激動劑 <5 4 1B 9.09± 0.25 10 66 14 7.65土0_25 6 81 15 8.88±0.12 6 54 16 7.68土0.09 6 60 17 8.48± 0.38 5 60 CP-0589* 6.9土0.89 3 57 未測試 CP-0601" 7‘0土0.20 3 75 未測試 HOE-140 10.3 7 41 不具活性 * CP-0589 D-Arg-Arg~Pr〇-Hyp-Thi-Gly-Ser-D-Tic-〇ic-Arg * CP-0601 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Gly-Ser-D-Tic-Oic-Arg 這兩種化合物係依據如前述對化合物1-12之傳統固相胜肽合成方法合成得到。 {請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 49 408133 A7 B7 五、發明説明（）结桄_结会於乇e窟.湎腺由經頸部異位的Hart ley種公白天竺鼠收集得迴賭。該迴腸以冰冷鹽水沖洗，翻轉，再用棉纱擦拭。然後將該組織置於-70^下冷凍貯存。使用時，取35克迴腸置於冰上融解，使用組織切刀切細*然後加入10倍體積（350 mL〉的TES勻化緩衝液（25 mM，pH 6·8>，含有蛋白質抑制劑混合液（1 βΜ 1,10-啡啉，5 iig/mL大豆胰蛋白酶抑制劑， 100 wg/mL枯草捍菌素，1 mM苯脒*及1〇〇 *ιΜ苯基甲基磺醯氟〉。將結果的混合液置於Brinkman PT-20 Polytron中勻化（調在7的位置，4X 20秒間隔），然後作撤差離心（ 1000 X g，4°C，10分鐘）。丟_固狀物，在溶液部份用新鮮的勻化緩衝液補回體稹，再Μ 43,000 X g、4t!離心15 分鐘。小心將固狀物懸浮於勻化緩衝液中，再依前述方式離心。再將上清液丢索，固狀物懸浮於TES緩衝液（25 mM ，pH 6.8)中，再给予離心（43,000 X g，15分鐘 >。最後的固狀物再懸浮於5倍體積（165 bL)的TES緩衝液中，每毫升約得到2.0毫克的蛋白質，再於-701C下貯存，直到使用。孵化過程係在含有20扯氚檫記缓激呔溶液（0,3 nM> 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、20 «L非特定控制组（藥物或媒劑）、150 jiL分析缓衝液（25 mM TES，pH 6.8，1 mM 1, 10-啡啉，1 mM DTT， 2 uM captopril，140 jig/mL祜草桿菌素，100 (iM thiorphan *及〇·1%牛血清白蛋白 >，及125社稀釋膜（稀釋爲1:4 ，最後濃度爲0.2 rag/mL)之0.315 mL混合液中進行，其中稀釋膜係最後加入Μ啟動結合作用。該分析係於聚丙烯本紙張尺度逋用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -50 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 408133 A7 B7 _ 五、發明説明（）試管中進行，然後樣品於24υ下孵化45分鐘6然後讓混合物快速於Whatnan GF/B玻璃織維濾紙上過濾，該濾紙預先用0.1%聚乙亞胺水溶液處理（超過2小時）。然後甩含有 10 nM Tris (pH 7.5)、100 nM NaCl、及 0.02% 牛血清白蛋白之冰冷清洗緩衝液清洗該濾紙及試管，每次1 eL，洗8次。利用閃爍計數器測定放射性。化合物5(亦即命名為CP-0597)及檫準物之數據係列於表2中。 CP-0597 (實施例 5 )

本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） - -51 - {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

408133 五、發明説明（） A7 B7 表2 活體外數據彙整 ΗΟΕ-140 CP-0597 CP-127 緩激肽 B2 PA2 (鼠子官） 10.3 9.5 8.5 - B2結合 (G，P.I_) 1.4 ρΜ 1.3 ρΜ 4.8 nM 30.1 PM 半半坜人體血漿 >6 hr. >6 hr. 2.75 hr. 0.45 hr. 鼠腎 N.D. >6 hr. 0.66 hr. 0.13 hr. 豬腎β N.D. >6 hr. >6 hr. 0.05 hr. 豬肺 N.D. >6 hr· 0.15 hr 0.05 hr. "NPC17761 1.17小時 "NPC17731 4.34小時 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CP-127是二聚體，揭示於序列第07/859,582號申請案之實施例1中順序式如下： DArg^Arg'-Pro'-Hyp^Gly^Phe^Cys^Phe^Leu'-Arg'

I s

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 s DArg°-Arg'-Pr〇I-Hyp,-Gly4-PheJ-Cyst-〇PheT-Leu,-Arg, - CP-0127 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） 52 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 408133 at _ B7 五、發明説明（.）該化合物本身是一高活性的缓激肽拮抗劑。活鵾肉牛物桦動被免 ifn m K戊巴比妥麻醉紐西蘭白公兔，揷管於股動脈Μ記錄血壓。再將揷管揷於股靜脈中用Μ化合物小九劑的注射或連續輪液。將股動脈導管接於Gould壓力轉換器Μ記錄血壓並顯示於Grass多重作圖記錄器上。在平衡階段之後，開始傾別的實驗步驟。 ΒΚ» DE»。：在血壓基線穗定之後，對這些動物施以缓激肽小九劑注射，產生大約15-25%血壓下降（0.2及0.4 mmol，i.v.)。缓激肽係先於沒有CP-597 (化合物5 )下作測試，然後於不同劑量的CP-597存在下（0.01、0.03、及0.10 Wg/kg/min ί·ν.)作EDe。（亦即使對緩激肽最高反應減低至50%之CP-597劑量）測定。在這一糸統中，測得 EDe〇^0.051± 0.006 iig/kg/nin (29.2 pmol/kg/ mi η) ° EDe。：在實驗前12-18小時時ME. Coli的脂多醣對兔子作靜脈內注射（10 wg/動物）。預先作內毒素給藥可使血管糸統中的BL受體產生正向調節，可作BL措抗劑活性之評估。預先存在的BKa受體與引發的BL受體兩者之刺激均產生低血壓。在血壓平衡之後，對這些動物作緩激肽（0.2 及 0.4 nmol)及 des-Arg3 緩激肽（4.0 及 8.0 mmol)之小九劑注射給藥。兩種激動劑均沒有CP-597下作測試，然後在增加劑量的CP-597存在下（1、3、及10 ttg/kg/®in) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） -53 一 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 * 408133 A7 B7 五、發明説明（）作测定。測得該糸統中BL活性的ED,。為2.9土 0_92 wg/ 1£8/11|4(1.7 1111〇1/1(8/111111)。110£140在劑量逹到10*1宕 /kg/nin時.仍不具活性。醸腩由CP-597：>哉徨袢在由乙醯臛龄（20 nmol)、正腎上腺素（20 nmol)、p 物質（20 pmol)、血管收缩呔（1〇〇 pmol)、血管收縮肽I (2 pnol)、及緩激肽（200 pmol)產生的血壓反應平衡之後，作 CP-597之给藥（0.1 wg/kg/min Uv.)，再對每一種血管活性劑作測試，再與預先的拮抗劑反應作比較。在這一硏究中，對緩激肽的反應顯示出拮抗作用，而其他血管活性劑在與控制組比較時顯示不受影響。嬅榦腩肉輸液的「Ρ-Μ7：>作爾間钿對上述的選擇性實驗作CP-597之靜脈内輸液（0.1 Mg /kg/mi η)。在完成該選擇性實驗之後，停止CP-597之輸液，在最先30分鐘内Μ每5分鐘一次並於到逹1小時內Μ 每15分鐘一次測試對缓激肽（0.2及0.4 nmol)之反應。在停止輸液後1小時，對緩激肽的反應仍然有100%的抑制作用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 覦ifn暇以戊巴比妥麻醉Sprague-Dawley公鼠，插管於股動脈 Μ記錄血壓。再將插管插於股靜脈中用Μ化合物小九劑的注射或連績輸液。將股動脈導管接於Gould壓力轉換器以記錄血壓並顯示於Grass多重作圖記錄器上。在平衡階段之後，開始個別的實驗步驟。本紙張尺度適用_國國家標準（〔呢）八4規格（210/297公釐> _ 54 一經濟部中央標準扃員工消費合作社印製 408183 A7 B7 五、發明説明（） w τnp-5a7^ 在血壓平衡之後，测試對乙醢臛鹼（20 tiffiol)、正腎上腺素（1 nmol)、P物質（2 pnol>、血管收縮肽（20 pmol) 、血管收縮肽Ϊ (2 pmol)、及缓激肽（20 pmol i.a.)所產生的反應。然後給這些動物施MCP-597 (1.0 mg/kg s.c.) 。在作毎一種血管栝性劑之皮下注射之後30分鐘時再作測試，再與預先的拮抗劑反應作比較。在這一硏究中，對緩激狀的反應潁示出拮抗作用，而其他血管活性劑在與控制組比較時顳示不受影嚮。瘅餺腑肉小丸酬沣射的ΠΡ-；^7：>作用間朋在血壓平衡之後，測試對緩激肽（10及20 Pinol i. a.〉所產生的反應，當作控制組反應。然後Μ靜脈内小九劑作 CP-597給藥（3、10或30 mg/kg)，每隔5分鐘測試對緩激肽的反應，直到反應回到控制組的程度。對於3 wg/ kg，約50¾抑制之反應，在30分鐘時回復到控制組的程度。對於10及30 <ig/kg，具100%抑制反應，在60分鐘時回到50 %控制組程度，在90分鐘時完全回復反應。崁下CP-597:>作用間期在中央動脲血壓平衡之後，對這些動物施Μ緩激呔（ 10及10 pmol i.a.> Μ建立控制組反應。然後對這些動物作CP-597 (1及3 mg/kg s.c.)之皮下注射。在CP-597注射之後30分鐘及之後每隔30分鐘，以緩激呔測試這些動物，直到反應回復到控制組程度。對於1 s_c，注射後3小時仍反應出100%抑制。對於3 mg/ kg s. c . *注本紙張尺度適用令國國家標準（〇阳）八4規格（2丨〇乂297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 408133 A7 B7 五、發明説明（) 射後5小時仍反應出100%抑制。活體内生物性數據彙整於表3。表3實施例5 (CP-597)之活體内生物性數據實驗物種劑量 (n) 結果 ΒΚϋ EDs〇 0.01, 0.03, 0.10 Mg/kg/min (3) EDn 〇 = 0.051 ug/kg/min (29.2 praol/kg/min) BKi ED5〇兔 1， 3, 10 ug/kg/min (4) EDs〇 = 2.9 ug/kg/roin (L7 nmol/kg/min) 作用間期 (靜脲内輪液> 兔 0·1 wg/kg/min (3) 在60分鐘時100%抑制選擇性（靜脯内輸液）兔 0.1 wg/kg/min (3) 只有BKb阻隔作用間期 (皮下）鼠 1 mg/kg (2) 在3小時100%抑制作用間期 ’（皮下）鼠 3 mg/kg (3) 在5小時100%抑制作用間期 (靜脈内小九劑）鼠 3.0 iig/kg/min 10 jig/kg/min 30 ug/kg/min (3) ⑶ (3) 50%抑制；在30分鐘時100 %回復 100%抑制；在60分鐘時50 %回復，在90分鐘時100% 回復 100%抑制；在60分鐘時50 %回復，在90分鐘時100% 回復 ---\-----C裝—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） 468133 A7 _B7_ 五、發明説明（）在表1中顯示可以得到高效力的緩激肽拮抗劑，其包括在該緩激肽順序中8號位宣之N-取代的甘胺酸。在實施例中，化合物5、8、13、15、及17皆係具高效力的拮抗劑*表示可作為有效的藥劑。在使用鼠子官的官能組織分析中顯示化合物4、 7、 11及12係激動劑。本技蕤的專業人士將了解這些激動劑亦具有當作心臓保護劑的價值。而且，本技藝中從事發展缓激狀拮抗劑的專業人士亦會了解那些在某種组鏰上係激動劑的化合物可以在另一種组織上係掊抗劑。例如，Stewart 所揭示含有D-Phe在緩激肽順序中7號位置之缓激肽拮抗劑。含有D-Phe在6號位置及7號位置之Stewart拮抗劑（ p據天竺鼠迺腸數據），如NPC-360 ,顯示係鼠子官上的激動劑；（參見美國專利第4,693,933號，及J. Stewart，經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) 緩激肽拮抗劑；基礎及臨床硏究，P. 60, 1991)。事實上，相似的現象伴隨出現於該說明書中所選擇的化合物。例如*化合物12顯示在鼠子官組織上係激動劑，但在天竺鼠迺腸上具有極端緊密結合常數（Ki=0.2微微莫耳的天竺鼠迴腸）之拮抗活性。具有高程度組織選擇性之化合物可當作雙重作用的藥劑，在某種組織上具有想要的拮抗活性，但在其他組織上具有想要的激動活性。這種情形特別適用於心臓保護劑的發展。本發明之最佳化告·物係含有在？號位置的芳香族D-胺基酸及在8號位置的N-取代甘胺酸，其中該取代基係中等大小的環烷基或苯基。這些類似物在許多組織類型上產生本紙張尺度逋用t國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 408133 at B7 五、發明説明（） BKa的拮抗话性。在芳香環或環烷基上引入亞甲基單元可增高在許多組織類型上激動活性的傾向。相同的情形*如果在8號位置存在如Oi c之空間受限性殘基，則在7號位置的N-苄基甘胺酸或環取代N-苄基甘胺酸可產生中等效力的掊抗劑。如果在甘胺酸的N-取代部份增加亞甲基間隔， | 則這種幾何上的增長預期會在許多組織上產生激動劑。相似的情形，如果在8號位置的空間受限性殘基Μ如Leu、，或N-Chg之非受限性殘基取代，則預期在許多組織上顳示較弱的激動活性。卜取代甘胺酸殘基之選擇性替位，特別那些在8號位置者，之真正價值在於該取代基之適當選擇在該化合物與緩激肽受體結合時具有巨大的效用，在此可產生有效力的拮抗劑或高緊密結合力的激動劑。經濟部令央標準局貝工消費合作社印製 N-取代甘胺酸餘基之引入可以發展出高度效力且具有良好藥劑性質之分子。由N-取代甘胺酸之引入所獲致的一項最重要的性質是對酶性減損的穩定性。表2中顯示具有 N-取代甘胺酸殘基在8號位置的較佳化合物如化合物5在選擇的組織上表現極端有效的受體結合力。這些頬似物比緩激呔或如揭示於共同擁有美國專利申請案序列第07/859,582 號實施例1中緩激肽拮抗劑CP-127之藥物更具有效力。更重要的是，在表2中顯示化合物5對重要酶糸統降解作用之穩定性。胜肽藥物會很快被胜肽酶所降解。特別是與缓激呔相近的分子會很快被胺基胜呔酶、羧基胜肽酶 (CP>、及如中性肽鍵内切酶（NEP)及血管收縮狀轉化酶<ACE) 58 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210x297公釐）經濟部中央標準局5工消費合作社印製 A7 __408133 b7_ 五、發明説明（）之肽鍵內切酶所降解。在人髏血漿中富含由羧基胜肽N、及胺基胜肽酶Μ之作用所產生的胜肽酶活性。在本說明書中所述的製備液表現出如下所述的蛋白酶之強力活性：

链铬豬肺鼠铬鼠_ NEP ACE NEP ACE ACE CP-M ACE NEP Mcpr i η CP-M 呔鍵内切酶-24,16 在表2中棄整的穩定性分析數據係活髏外測試的結果。在栝的動物之血漿或腎或肺組織中個別化合物之真實穩定性可能有差別。但是，活體外之分析係可重複比較許多化合物之方法，不會如活髏内的實驗會犧牲很多動物。因此，這種對血漿及組織製備液的綜合檢驗可得到胜呔藥物可能遇到的胜肽對蛋白酶活性之穩定性的廣泛篩選。在所有這些測試中，化合物5具有超過6小時的半生期，顯示其高度的效力。在比較時，缓激肽表現顯著不穩定。同時亦顯示化合物5比CP-127更具穩定性，其他由Sc i os-Nova所發展的如MPC17761及NPC17731之參考化合物，其含有脯胺酸殘基在7號位置及0U在8號位置*在重要的分析中表現較低的穩定性。在表3中的數據可確定活體外與活體内測試之間的關係。化合物5在活兔中表現對缓激呔在BK*受體上的作用具有令人意外的阻隔效力（EDa。0.051 ug/kg/mi η)。而且，化合物5在活兔中表現出柑當的BKt阻隔活性（2.9以本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I--^-----0袭-- (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) -訂經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 408133 A7 __408· b7_ 五、發明説明（） /kg/mi r〇。這兩項分析與緩激呔在毒性休克中的低血壓效應有極高度的關聯，因此預期其用於治療SIS /敗血症時將表現出療效。上述的化合物不但在活動物中具有效力，而且該化合物表現出較長的作用閭期（兔，在60分鐘時 100%抑制，i.v.)。事實上已經發現在皮下劑量（3 ms . * /kg，鼠）之後可逵到5小時完全阻隔撖動劑效應之效力。這種由胜肽衍生型的激動物所表現的穩定性係非比尋常，顯示含有N-取代甘胺酸的激動劑極適合當作藥劑。最後，對於使用兔及鼠血壓模式所進行的硏究，顯示其對低血麽效應的阻隔作用係與對缓檄肽受髏的阻隔作用有關。其他如乙醯膝驗、正腎上腺素、P物質、血管收縮肽、及血管收縮呔E之血管活性劑其活性並未受到化合物 5的影響。本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） - ~ 60 ~ (請先閱讀背面之注項再填寫本頁)

408133 A7 B7 五、發明説明（）參考錢 1.Stewart，J.及 Vavrek, R.,美國專利第 4,801.613 號。 2_51^抑1^,<1.及¥3¥。!£,{^,美國專利第 4,693,993號。 3. Breipohl, G., Henke, S., Knolle, J. Hock, F-» 及Scholken, B.,歐洲專利申請案编號0 455 133 A2。 4. Kyle, D,, PCT 申請案编號 PCT/US92/ 10469。 5. Kyle, D., PCT 申請案編號 PCT/US92/ 03031。 G.Kyle, D·, PCT 申請案编號 PCT/US92/ 03033。 7. Young, D•等人，含有N-苄基甘胺酸之緩激呔類似物之合成，P357 ,第十三屆美國胜肽硏討會，Edmonton, Alberta，6月 20日，1993年。 8. Young, D.等人，使用N-苄基甘胺酸製備生物活性胜肽之胜肽-Peptoid類似物，P323,第十Η屆美國胜呔硏討會，Edmonton, Alberta，6月 20日，1993 年。 9. Young, D.等人，使用卜苄基甘胺酸替代芳香族胺基酸殘基，第十一屆美國胜呔硏討會，P. 155 (1990)。經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先間讀背面之注^^項再填寫本頁) 10. Farmer, S.G·及Burch, R.M.,缓激呔受體之藥理，闊於緩激狀措抗劑，R.M. Burch, ed.，Marcel,Dekker, Inc.,紐約，pp.卜31, (1991〉。 11. Griesbacher, T., Lembeck, F,，緩激肽拮抗劑對由緩激呔引起的血漿外滲、靜脈縊痕、前列線素E2釋放、及Nociceptor剌激及對兔子Iris Sphincter肌肉之收縮之效應，Br. J. Pharmacol., 92:333-340 (1987) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 61 408133 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製五、發明説明（） 12.Taiwo, Υ,Ο.及Levine, J.D.,花生四烯酸代謝物調節的缓激呔之鑑定及正腎上腺素疼痛過敏，Brain Res.， 458:402-406 (1988) 13.Steranka., I.R.等人，緩激呔當作疼痛調節劑：侷限於感覺神經元上的受髖，及具鎮痛作用的拮抗劑，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:3245-3249 (1988) 〇 14_Dray， A.， Bettaney， J., Forster, Ρ·及Perkins, M.N.,缓激肽引發的傳人纖維剌激係由蛋白質激酶C ，所調節，Neurosci. Lett. , 91: 30卜307 (1988)。 15.Sterankan, L.R., Farmer, S.G.及 Burch, R.M., B2 緩激呔受體之拮抗劑，FASEB J., 32019-2025 (1989) Ο 16. H a 1 e y, J. , D i c k e n s ο η, A. Η.,及 S c h a c; t e r, Μ,,緵激呔在老鼠中化學Nociception中角色之電子生理證據 » Neurosci. Lett., 97:198-202 (1989)° 17 . Marc eau , F. , Lussi.er, A., Regoli, D, , Giroud, J.p.,激肽之藥理：其與組織受損及發炎的關係，Gen. Pharmacol., 14:209-229 (1983)。 18. Proud, D., Kaplan, A.P.,激肽之形成：在炎性失調中之機制及角色，Annu. Rev. Immunol., 6:49-84 ( 1988)。 19. Colinan，R.W., Wong, P.Y.,在病理症狀中的血管舒緩素-激肽糸統*鬨於緩瀲呔、胰激肽及血管舒缓素* 實驗藥學手冊，Vol. 25, Erdos, E.G, ed. Springer 本纸張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁)

A7 B7 408133 五、發明説明（）

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Claims

六、申請專利範圍第84102476號專利再審查案申請專利範圍修正本 mi. 修正曰期：88年10月一種緩激肽拮抗肽，其係_由下式界定：請先閱讀背之注意事項再填寫本 J Z'-Z°-A1-B2-C3-D4-E5-F6-G7-H8-I9 其中： Z為氫、乙醯基、金鋼烧基羧基或金鋼燒基乙醯基’ 或為從缺； Z0為一直接鍵結、氫、D-或L-精胺酸、D-或L-離胺酸、D-或L-鳥胺酸或δ-Gpa，或為從缺； A1為D-或L-精胺酸、D-或L-離胺酸、d_或l-鳥胺酸或 δ-Gpa ; B2為脯胺酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸； C3為羥基脯胺酸、脯胺酸、肌胺酸或甘胺酸； D4為甘胺酸、丙胺酸或噻吩丙胺酸； E5為苯丙胺酸、2-氫化茚甘胺酸或嗔吩丙胺酸； F6為絲胺酸或半胱胺酸；經濟部智慧財產局員工消費合作社印M G7為DTic、2-氫化茚甘胺酸、D-笨丙胺酸或一擇自於NBng、DNBng或DCpg之N-取代甘胺酸殘基； H8為八氫吲嘌-2-羰基或一擇自於N-(環己基）甘胺酸、N-(環戊基）甘胺酸、N-(苯基）甘胺酸或（Ci-Cd 烷基取代N-(環己基）甘胺酸所構成之群組中的N-取代甘胺酸殘基；以及 I9為從缺或精胺酸；本紙張尺度遶用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

六、申請專利範圍第84102476號專利再審查案申請專利範圍修正本 mi. 修正曰期：88年10月一種緩激肽拮抗肽，其係_由下式界定：請先閱讀背之注意事項再填寫本 J Z'-Z°-A1-B2-C3-D4-E5-F6-G7-H8-I9 其中： Z為氫、乙醯基、金鋼烧基羧基或金鋼燒基乙醯基’ 或為從缺； Z0為一直接鍵結、氫、D-或L-精胺酸、D-或L-離胺酸、D-或L-鳥胺酸或δ-Gpa，或為從缺； A1為D-或L-精胺酸、D-或L-離胺酸、d_或l-鳥胺酸或 δ-Gpa ; B2為脯胺酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸； C3為羥基脯胺酸、脯胺酸、肌胺酸或甘胺酸； D4為甘胺酸、丙胺酸或噻吩丙胺酸； E5為苯丙胺酸、2-氫化茚甘胺酸或嗔吩丙胺酸； F6為絲胺酸或半胱胺酸；經濟部智慧財產局員工消費合作社印M G7為DTic、2-氫化茚甘胺酸、D-笨丙胺酸或一擇自於NBng、DNBng或DCpg之N-取代甘胺酸殘基； H8為八氫吲嘌-2-羰基或一擇自於N-(環己基）甘胺酸、N-(環戊基）甘胺酸、N-(苯基）甘胺酸或（Ci-Cd 烷基取代N-(環己基）甘胺酸所構成之群組中的N-取代甘胺酸殘基；以及 I9為從缺或精胺酸；本紙張尺度遶用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8r 1 六、申請專利範圍設定條件：G7與Η8中至少一者為一個N-取代甘胺酸殘基。 2. 如申請專利範圍第1項之緩激肽拮抗肽，其中：一 G7為 DTic ;及 H8 為 NChg、NCpg 或 NPhg。 3. 如申請專利範圍第2項之緩激肽拮抗肽，其具有下式： D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg。 4. 如申請專利範圍第2項之緩激肽拮抗肽，其具有下式： <5 -Gpa-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg β 5. 如申請專利範圍第2項之緩激肽拮抗肽，其具有下式： D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NPhg-Arg。 6. 如申請專利範圍第1項之緩激肽拮抗肽，其具有下式： D-Arg-Arg-Hyp-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NCpg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Igl-Ser-DTic-NChg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-DTic-NChg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-NBng-Oic; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-NChg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DCpg-NChg-Arg; D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-NPhg-Arg; -2- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· ^---r----訂----------線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α8 Β8 C8, DS 408133 六、申請專利範圍 D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DNBng-Oic-Arg; 或 δ-Gpa-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DTic-NChg-Arg。 7· 一種用於缓和疼痛之藥學組成物，其包含有一可有效減低該疼痛之量的如申請專利範圍第i項之缓激肽拮抗肽β 8. 一種用於緩和氣喘病狀之藥學組成物，其包含有一有效量的如申請專利範圍第1項之緩激肽拮抗肽。 9_ 一種用於治療炎性内臟疾病之藥學組成物，其包含有一有效量的如申請專利範圍第1項之缓激肽拮抗版。 10. —種用於治療發炎反應之藥學組成物，其包含有一可有效減低該發炎反應之量的如申請專利範圍第1項之緩激肽拮抗肽。 11 一種用於治療頭部外傷之藥學組成物，其包含有一可有效減低與該頭部外傷相關之大腦水腫之量的如申請專利範圍第1項之緩激肽拮抗肽。 12. —種用於治療心血管功能障礙之藥學組成物，其包含有一有效治療量之如申請專利範圍第1項之緩激肽括抗版。 13. 如申請專利範圍第12項之組成物，其中該心血管功能障礙包括局部缺血、管損害或心血管組織彳員害。 (請先閱讀背面之生意事項再填窝本頁) <r/i—訂---------線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製