TW205570B - A method for stabilizing live vaccine - Google Patents

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Λ 6 Π 6 (赞年丨π曰 五、發明説明（1) 發明之背景 發明之領域 本發明有關一種活疫苗之安定化方法，該安定化之活疫 苗具有卓越貯存安定性及卓越耐熱性。特定言之，本發明 有關一種水痘病毒疫苗之安定化方法，其包括在該疫苗中 加入不致不含Ca2+離子及Mg 2+離子或能遮蓋鈣離子及镁離 子之安定劑，藉此使該疫苗大體不含Ca2+離子及Mg 2+離子 者。本發明又有關包括選自明膠及明膠衍生物中之至少一 種安定劑，安定劑大體不含Ca2+離子及Mg 2+離子，可用於 將包括水痘病毒做病毒組分之活疫苗安定化者。 相關技術之討論 自1 9 7 4年開始，W Η 0 (世界衛生組織）開始進行全球擴大 防疫計畫（ΕΡΙ),因此對貯存安定性及耐熱性二者皆卓越的 各種疫苗之需求增多。欲求滿足此種需求，於世界許多地 方撤底進行研究，意圖開發安定性更為改良之疫苗。研究 结果，開發數型可用於熱帶及寒帶地區之周圍溫度之疫苗 ，且付諸實用。此等已知的改良疫苗之例，包含百曰咳類 毒素，及三合一 DPI (白喉-百曰喉-破傷風）疫苗偽使用前 述類毒素（美國第4,849,358號專利案）；及凍晶乾燥鈍化 的日本腦炎疫苗[Fields”病毒學”，第二販，第1卷，782-783頁，Raven出販社出販（美國，纽約）199 0年]。 然而，仍有多種型式之疫苗迄今仍未能滿意地改良安定 性。例如，就活病毒疫苗而言，例如麻痰，德國麻疹，腮 腺炎及水痘，其熱安定度已經藉凍晶乾燥改良至某種程度 ,但仍未臻滿意。特別用於活疫苗中之水痘病毒之熱安定 (請先閲請背而之注意事項#项寫本頁、 裝- 訂- 經濟部屮央榣準局员工消费合作社印製 本紙張尺度遑用中國a家《毕(CNS)T4規格(210x297公修正员 81. 7. 2ϋ,00(ΗΜΠ) Λ 6 Η 6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（2 ) 度極低，因而通常必須將病毒保存於-6β·〇或以下之溫f 。一般而言，羼於疤瘆科（對細胞結合棰為敏感）之病毒· 如水痘病毒之熱安定度極差。由於對熱不安定，故棰難 以開發水痘病毒疫苗用之谋意的安定薄I。如此，不僅就活 水痘病毒而言，同時也就包括水痘病毒及其它病毒，例如 麻疹、徳团麻疹及腮腺炎之混合活疫苗而言，極為難以 獲得具有卓越耐熱性的含水痘病毒之活病毒疫苗。 疫苗常用之安定薄物料中值得一提者，例如有胺基酸， 如麩胺酸銷、精胺酸、離胺酸及半胱胺酸；單醸，如葡萄 糖、半乳糖、果糖及甘露糖；雙醣，如蔗糖、麥芽糖及乳 耱；糖酵，如山梨糖酵及甘露耱酵；多醣，如寡醣、澱粉 、鐵維素及其衍生物；人血淸白蛋白及牛血清白蛋白；明 謬及明睡衍生物，如水解明謬；及做為抗氧化_之抗壞血酸 。此等物料描述於出販品，例如"凍晶乾燥及保護性物料" ，作者Nei, 1-176頁，東京大學出販學會出販，日本1972 年及”真空技術演講會U):真空乾燥"作者Ota等人，176-182 頁，Nikkan. k〇gyo S h i n b u η 公司出版，日本 19 6 4 年。 然而，此等物料之安定功效於各別使用時通常較差。因 此通常偽合併使用。舉例言之，曾提謙一種4組分混合的 安定薄，其中4類组分分別灌自胺基酸、醣、糖酵及蛋白 脒者合併使用，因而可得協同或加成性增高的安定化功效。 如前所述，活水痘疫苗之熱安定度棰差。即使廣泛用於 它型活病毒疫苗中做安定籣的按基酸、釀、糖酵、明謬及 明膠衍生饬加入活水疸疫苗内，也無法獲得滿意的安定度 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木页) 裝- 訂_ 線< 本紙張尺度遑用中國明家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 4 經濟部中央橾準局员工消費合作社印製 20邮ύ Λ 6 ------Π6_ 五、發明説明（3 ) 。Sifc,其中添加有此等習知安定繭之活水痘疫苗於室溫 胃18#存時•疫苗的感染力價可能下降。換言之，不僅於 包S水痘病毒做單一病秦組分之活水疽疫苗之例中，同時 於包括水痘病毒及其它病毒（例如麻疹、徳國麻疹、腮 »&、小兒麻痺及流行性怒冒活病毒）之混合（多價）活疫 S之例中，卽使加入習知安定劑（其可將活水痘疫苗以外 它活病毐疫苗有效安定化者）也無法達成有效安定度 。因此，極為雜以提供一種含有水痘病毒之安定活疫苗。

Xft,習知當将，可將麻疹、徳國麻疹及腮腺炎有效安 定化的明繆及/或明繆衍生物如水解明匾加入含水痘病毒 之活疫苗内時，道遇疫苗安定度甚至更為下降的問題。邸 使僅使用明隳及/或明騵衍生物例如水解明膠以外之安定 劑，有醑含活水痘病毒之混合疫苗也常遭遇駸重問題。舉 例言之，當使用水痘病毒以外之病毒，例如由培餐糸統收 獾的麻疹病毒製鼸活疫苗時，疫苗之安定度可藉著單獨 添加明騵及明謬衍生物以外之習知安定劑而予維持。雖然 如此，當由培餐糸統收獲的活水痘病毒加入前述疫苗内時 ，所生成之混合疫苗中之水痘病毒之安定度可能下降，因 此混合疫苗無法呈現含活水痘病毒之混合疫苗之谋意的功 效。 ' 發明之概述 此種情況下，發明人進行徹底深入的研究，意圈解決前 述困難問題，並提供一種包括減毒活水痘病毒做病毒成分 之安定的活疫苗。结果，發明人出乎意外地發現，當螯合

本紙張尺度边用中Η B家標準(CNS) T4規格(210x297公D (請先閲讀背面之注意事項再填寫本1C) 裝· -線. 5 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 Λ 6 Η 6 五、發明説明（4) 31如乙二胺四乙酸（EDTA)加入活水痘疫苗内時[此種疫苗 無論存在有、或不存在有明醪及/或明暖衍生物例如水解 明應（此乃傳統上視為將它型活病毒疫苗安定化有效者）其 安定度差]，含水疽病#疫苗之安定度大為改菩。發明人 進一步研究為何添加EDTA可改良安定度之緣故。結果，出 乎意外的發現活水痘病赛疫苗之安定度與是否存在有Ca2+ 離子及Mg2+離子有两，以及活水痘病毒疫苗安定化之必要 霈求為：水痘疫苗中實質不含Ca2+及Mg 2+。趣於各種活疫 苗例如小兒麻痺病毒疫苗之安定度、可S著Ca2+離子及Mg2+ 離子之存在而改菩，故此種發現乃極為出人意外者。 多種情況下，當準備繁殖病毒用之細胞培養時，將Ca2+ 離子及M g2+離子引進其中。也己知近年來廣泛用做各種疫 苗之代表性安定劑成分的明腰，含約0.IX或以下之Ca2+離 子；水解明睡商品含約0.1XCa2+離子及約0.01XMg2+ _子。 此等Ca2+離子及M g2+離子為害含水痘病毒之活疫苗安定 度的確切機轉尚未闉述。但推定由於此等特定離子的促進 作用，將使得活水痘病毒對熱鈍化，因而降低疫苗之感染 力價；以及藉著此等特定離子作用•將誘使水痘病毒顆粒 凝集，使得疫苗變得不安定。 由於EDTA具有撖烈性質，故未曾考慮使用Et)TA作為疫苗 之有利添加劑。然而，於發明人研究期間，出人意外地發 現EDTA加入含水疽病毒及安定劑之活疫苗内，可大為增進 疫苗安定度。其原因相倍在於£1)以可做為從培養細胞及安 定劑衍生而得之Ca2+雔子及Ms 2+離子之整合_ •因而遮蓋 本紙張尺度遑用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公；《：) q (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本 裝· 線- ^05b'/〇 Λ 6 B 6 五、發明説明（5 ) 此等離子之故。 基於前述新穎發現，因而完成本發明。 因此，提供一種含有減毒水痘病毒及安定剤、且具有高 安定度之活疫苗，乃本發明之一目的。 本發明之另一目的，傈提供一種具有卓越安定度的安定 化活疫苗，其中包括減毒活水痘病毒，以及做為安定剤之 選自明膠及明膠衍生物如水解明膠中之至少一者；此等安 定剤過去營被認為用於將活水痘病毒疫苗以外之活疫苗安 定化時極為有效，但對於活水痘疫苗之安定化反而有不良 影響。 本發明又一目的，像提供一種包括水痘病毒之活疫苗的 安定劑，此等安定劑包括選自經處理之明膠及經處理之明 謬衍生物中之至少一者，其獲得方式係將明膠商品及明膠 衍生物如水解明睡商品（明膠及明謬衍生物事實上未耸用 作含水痘病毒之活病毒之安定薄ί )接受處理，而遮蓋或去 除其中所含的Ca2+離子及Mg2+離子。 由下述之詳細說明及附随之申請專利範圍將更明瞭本發 明之前述目的及其它目的、特點及優點。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木页) 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 明 說 節 細 之 明 發 括髖 包組 中重 其毒 ，減 苗及 疫毒 活病 的痘 定水 安活 種毒 1 減 供自 提選 像括 要包 主其 9 4. 明分 發成 本毒 據病 依種 者自 子選 毒離括 病2+包 .痘Mg毒 水及病 種子痘 一 離水 少2+活 至ca毒 之含減 中不之 毒髖明 病大發 痘苗本 水疫 該 中 其 劑 定 安 種 1 及 減 及 毒 病 痘 水 活 毒 減 本紙張尺度逍用中B國家標準(CNS)甲4規格(210x297公*) 7 Λ 6 Π 6 經濟部中央楳準局员工消費合作社印製 五、發明説明（6) 毒活重組醱水痘病毒中之至少一種水痘病毒，其可藉習知 方法製備。OKa種条（美國第3,985,6 1 5號專利案，病毒託 存编號ATCC VR-795)為一種眾所周知的減毒活水痘病毒， 其待別可用於生産活水痘疫苗。減毒活重組《水痘病毒之 製法係將OKa種条之基因組DNA與外來基因重組而得。重組 可藉習知方法方便地進行。至於其中病毒基因與外來基因 重組方法之細節，可參考歐洲專利申請公告案第 0 334 530 A1號。此種病赛種条（OKa種糸）可有利地用於 本發明，但本發明之水痘病毒並非只限於此種条。 要求本發明之活疫苗大醱不含Ca2+離子與Mg 2+離子，文 中使用之"大體不含Ca2+離子與Mg2+離子”一詞，代表使用 螯合劑進行比色滴定方法，大體無法檢測得Ca 2+離子及Mg 2+ 離子。 當疫苗中含有培養細胞衍生而得之Ca2+離子及Mg2+雔子 時，可藉加入螯合劑與離子生成螯合物而遮蓋此等離子。 至於螯合劑，可使用生成螯合物之水溶性物料。可生成 螯合物之水溶性螯合薄f之例，包含多胺基羧酸類，如乙二 胺四乙酸（後文稱為” EDTA")及其鹽；氧羧鹽類如掙櫬酸及 其鹽；及縮合磷酸鹽類，如超磷酸鹽。 特別描述EDTA,有多種EDTA及其鹽之商品，包含舆Ca, C 〇 , K , N a , L i , H i , B a , B i , M g , H n , L a 及銨所生成之 鹽。其中Ca鹽及Mg鹽不佳。較佳鹽為Ha鹽及K鹽。此外， 由添加EDTA可減少pH變化之觀點看來，也較好使用EDTA二 銷鹽或EDTA三納鹽。又愎，EDTA類似物之水溶性乙二酵四 (請先閲讀背面之注意事項#填寫本頁) 裝. 訂' 線. 私紙張尺度逍用中國國家標準(CNS)肀4規格(210x297公釐） 8 Λ 6 Η 6 五、發明説明（7 ) 乙酸及其鹽，可用做本發明之螯合劑。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫木") 至於本發明使用之安定劑，值得一提者有習知安定劑， 如蔗糖、乳糖、山梨糖酵、麩胺酸鈉、半胱胺酸、明腠及 明膠衍生物，如水解明膠。蓮自明謬及明腰衍生物中之至 少一者，特別可用做安定劑成分。 本發明中，明睡及明膠衍生物可各別使用或合併使用。 至於明膠，值得一提者有日本藥典描述之純明膠。 明睡衍生物之例包含水解明謬及其化學衍生物。”水解 明膠”一詞，代表經由將明膠進行水解割裂而降解所得的 水解多肽，或經由將前述水解多肽聚合而得之多肽。水解 明膠為水溶性，分子量約為35,000或以下。 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 至於本發明有用之明謬衍生物之示例，值得一提者有商 業上可得之産品，例如Gelysate(美國BBL公司裂造及發售 之水解明願商品名）及Phiysi.ogel, Heoplasnagel, Gelifundo)及Haemaccel (徳國赫司特公司.製造及發售之水 解明腰或其化學衍生物之商品名）。此等明謬衍生物之細 節描述於”生物學標準化之發展"Vol. 48, PP.207-234, Karger(1981)。本發明中，較好使用商品名為Geiysate之 水解明謬。 就穩定的活疫苗内之濃度而言，各別明腰及明醪衍生物 之用董分別由約0.02-約1.0!C(w/v)及由約0.5-約10X(w/v)。 商業上可得的明謬及明膠衍生物，特別水解明謬通常含 有Ca2+離子及/或Mg 2+離子。因此，當就此使用此等明騵 及明謬衍生物商品時，較好於活疫苗内添加螯合劑，例如 本紙張尺度边用中BB家楳準(CNS)甲4規格(210x297公*) 〇[>b 'ί Λ 6 B 6 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 前述EDTA或其鹽。 本發明使用的螯合剤數量並無待別限制，只要數Μ不小 於疫苗内存在的Ca 2 +離子及Mg 2+離子轉成螯合物（藉此遮 蓋此等離子）所需的數量即可。螯合劑用量，以於安定的 活疫苗内禳度表示通常為約0.001-^0.1X(w/y)。 至於懸浮病毒抗原用之溶液，可使用依據後文參考例4 所用之方法製備的0.005-0.0 1M PBS(—）。 同時，培養基199(參見參考例10)及MEM(最低必需培養 基）（參見參考例1),其製備中未曾添加Ca及Mg化合物者； 可用做懸浮病毒抗原用之溶液。 至於穩定活疫苗内各安定劑成分之濃度，值得一提者有 例如約0.01至約5.0«(w/v)麩胺酸納，約0.02至約1.05! (w/v)半胱胺酸，約0.5至約10XU/V)蔴糖，約0.5至約103； (w/v)乳糖，約0.2至約6.0J!U/V)山梨耱酵，約0.02至約 1.03i(W/v)明膠，約0.5至約10XU/V)明膠衍生物如水解明 膠，及約0.0 0 1至約0 . 1J! ( w / v )螯合劑如E D T A或其鹽，係以 於安定的活疫苗内之濃度表示。 添加安定劑後之最後pH,較好為6.5至7.5。藉注射投予 疫苗時，由缓解疼痛及出現傷害之戡點看來，較好疫苗之 滲透壓偽在等張黏附近。 ， 以下為用來》得本發明之安定化活疫苗之安定劑之調配 薄I之四較佳例： (1) 一種安定劑，包括約0.01至約5X(w/v)麩胺酸納，約 0.5至約1 0 X (* / v ) Μ糖，約0.0 2至約13； ( » / v )明騵，及約 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木") 本紙張尺度遑用中a Β家標準(CNS)甲4規格(210x297公*) 10 ^ 五、發明説明（9) 0.5至約10X(w/v)之水解明騵，供以於安定化活疫苗内多 «度表示； (2) —種安定劑，包括約0.01至約5%(v/v)猫胺酸納，約 0.5至約10X(w/v)蔗糖，約0.02至約1Χ(»/ν)明睡，約0.5 至約10%(w/v)之水解明膠，及約0.001至約0.1Χ(“ν)螯合 薄I ,供以於安定化活疫苗内之潢度表示" (3) —種安定劑包括約0.5至約10X(w/v)乳糖，約0.2至 約6.0X(w/v)山梨糖酵，約0.02至約1.0XU/V)半胱胺酸， 約0.01至约5.03：(w/v)麩胺酸納，約0.02至約1.0!K(W/V)明 膠及約0.5至約1ΘΧ(«/ν)水解明膠，像以於安定化活疫苗 内之濃度表示；及 (4) 一種安定劑包括約0.5至約10% (w/v)乳糖•約0.2至 約6.0% (»/v)山梨糖酵，約0.02至約1.0%(»/v)半胱胺酸， 約0.01至約5.0%(w/v)麩胺酸銷，約8.0 2至約1.03{(«/〇明 謬，約0.5至約103!(*/v)水解明匾，及約0.001至約0.1!K(w /v)螯合劑，偽以於安定化活疫苗内之禳度表示。 下文中將解説實施本發明之範例程序。 (1)大體不含Ca2+離子及Mg2+離子之病毐懸浮液之製備： 經濟部中央檁準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫木頁) 就水痘病毒而言，例如水痘病毒之培餐方式俱使用寄主 细胞培養，並於培餐完成後，由培餐容器中抛棄培餐，基。 然後，加入终濃度為0.05X(»/v)之EDTA三銷鹽帶0.01M§j| 酸馥-缓衝鹽水（PBS)(-)，然後由培餐容器内壁面卸下感 染细胞。《後，進行低速雄心而收集怒染细胞。懸浮水痘 病毒用之溶液，其中含有前述安定_溶解於其中者，加入 本紙張尺度遑用中Η Η家樣準(CNS)肀4規格(210X297公¢) 11 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（10) 收集得之感染細胞内以將其懸浮。随後，利用均化器或超 音波將感染細胞破壊，並去除細胞碎屑，而製得病毒懸浮 液。 至於其它病毒，例如麻疹、徳國麻瘆及腮腺炎病’毒，病 毒懸浮液之製法為於培養期間或培養完成後，含ca2+離子 及Mg2+離子之培養基以培養基199或MEM置換，後二者偽未 添加Ca及Mg化合物而製備者。 例如，就麻疹病毒而言，病毒懸浮液之製法，偽使用後 文參考例4製備之PBS(-)洗滌感染細胞，去除Ca2+離子及 Mg2+離子；將感染細胞懸浮於各別不含Ca2+離子及Mg2+離 子之培養基199或MEM内：並將所得懸浮液冷凍-解凍，进 而進行低速離心而收集上清液作病毒懸浮液。 至於德國麻疹及腮腺炎病毒，病毒懸浮液之製法，例如 利用分皤膜濃縮含病毒之培養基；將所得濃缩培養基進行 超離心而收集病毒；及將病毒懸浮於不含Ca2+離子及ΜΘ+ 離子之培養基199或MEM内。 可將安定剤加入如此所得之病毒懸浮液内。 (2) 病毒懸浮液之製備，懸浮液中由培養細胞衍生而得 之Ca2+離子及Mg2+離子已被轉成整合物而遮蓋此等離子者： 例如，可將螯合劑加入病毒懸浮液内而將此等金》離子 轉成螯合物並遮蓋該等離子。 (3) 明謬及水解明睡之製備，其中Ca2+離子及Mgjt離子 已被轉成螯合物而遮蓋該等離子者； 例如，螯合劑加入明膠溶液或水解明騵溶液内，將此等 Λ 6 η 6 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木页) 裝· 訂- 本紙張尺度逍用中B B家標準（CNS)甲4規格（210x297公*) 12 經濟部中央標準局兵工消費合作社印製 Λ 6 η 6 五、發明說明αι) 金羼離子轉成螯合物並遮蓋該等離子。此等經螯合劑處理 之明®及經螯合剤處理的水解明謬極可用做活水疽疫苗之 安定劑使用。 (4) 大«不含Ca2+離子及Ms2+雔子之純明膠及純水解明 謬之製備： 可藉習知方法進行純化反應，例如使用S自渗析庳理· 凝驂過濾處理，陽離子交換樹脂處理及螯合樹脂處理中之 至少一種處理方法。舉例言之，將前述明膠及水解明醪， 其中前述各金屬_子被蝥合劑遮蓋者或否，進行《謬過濾 處理；或將明踴溶液或水解明睡溶液進行滲析處理；可獲 得前述大體不含金屬離子之純明膠及純水解明謬。如此所 得之纯明暖及纯水解明睡在用作活水痘疫苗之安定劑上極 為有用。 (5) 安定化活水痘疫苗之製褙： 水痘病毒偽使用人燹套染色體细胞培養，所得培餐物例 如藉離心純化而得水痘病毒部分。如此所得之病毒部分内 加入疫苗安定薄，將所生成之混合物稀釋，因而毎劑安定 化活疫苗中之病毒含量變成1,000PFU(溶®斑生成單位）或 以上，藉此獲得安定化活水痘疫苗。如此製得之活疫苗整 分接受安全度，有效度輿均勻度試驗，因而證實其適合做疫 苗使用。此等試驗係依據日本衛生福利部195號公報提供 之生物學産物之最低要求（1989年）進行，（參見）例如”凍 晶乾燥減毒活水痕疫苗”見生物學産物之最低要求）。 涅實適合做疫苗後即可付諸使用。凍晶乾嫌疫苗之製法 f紙張尺度遑用中B a家«準(CNS)肀4規格(210x297公釐） (請先閲讀背面之注意卞項再蜞寫本頁) 裝· 線· 13 05^Λ) Λ 6η 6 經濟部中央櫺準局员工消費合作社印製 五、發明説明（12) 偽將疫苗於容積約3-30·义之小瓶或安瓿内凍晶乾燥，_ 小瓶或安瓿進行流腥密閉式密封，及貯存於5¾或以下之 溫度。如此製妥之疫苗可依據標籤指示使用。舉例言之， 凍晶乾燥疫苗可恰於使用前藉無菌蒸脯水重新諝製，所得 溶液以毎劑0.5·文之剤量藉皮下注射接種。 如前所述，麻疹、德國麻疹、腮腺炎等病毒，比起水痘 病毒，相當具有熱安定性。此等麻疹、德國麻疹及腮腺炎 疫苗之安定劑之配方彼此類似；已知_類、胺基酸類、糖 酵類，明膠及明膠衍生物可有效將此等病毒疫苗安定化。 然而，此等習知安定劑無法有效用於含水痘病毒及/或重 組體水痘病毒之活疫苗。 相反地，本發明之安定劑不僅用於單獨含水痘病毒及/ 或重組醱水痘病毒之水痘疫苗有效，同時用於含水痘病毒 及/或重組釅水痘病毒及至少一種水痘病棄以外之病毒（例 如麻疹、德國麻疹、腮腺炎、流行性感冒、日本腦炎及肝 炎病毒）之混合（多價）疫苗也有效。 此等混合疫苗之例包括含水痘、麻疹、德國麻痊及腮腺 炎病毒之四價活疫苗（參見日本特許公開案說明窨第58-5169號）〇 依據本發明可提供各式安定的疫苗，例如凍晶乾燥疫苗 、凍晶乾燥混合疫苗、液體疫苗，及液體混合疫苗，其貯 存性及熱安定性極為卓越者。 以混合的活疫苗之製備為例，各別活疫苗之散裝物料經 稀釋及混合，因而使得每劑活疫苗之各病赛含量變成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 裝- 線< 本紙張尺度遑用中國Η家楳準(CNS)甲4規格(210x297公I) 14 經濟部中央櫺準局貝工消费合作社印製 ^_Η6_ 五、發明説明（13) 1,000至5,00 0，？11或以上，或5,0001>(：1〇5〇(組嫌培養慼爭 劑量中間值）或以上，因而獲得混合的活疫苗之终産物。 如前述，本發明之安定化活水痘疫苗包括由減毒水痘病 毒及/或減毒重組體水痘病毒所組成的病毒成分，及大體 不含Ca2+離子及Mg 2+離子之一種安定劑者，具有卓越貯存 性及卓越耐熱性。 安定化活疫苗除水痘病毒外，又包括至少一種減毒活病 毒，例如麻疹、德國麻瘘、腮腺炎、日本腦炎、流行性感 冒，及E型肝炎病毒。 本發明安定劑包括明謬及/或明膠衍生物如水解明腰， 各別大體不含Ca2+離子及M g2+離子者，極為可用於將活疫 苗安定化，此活疫苗中包括水痘病毒及/或重組體水痘病 毒作病毒成分者。 本發明對於世界衛生組嫌之擴大防疫計畫之全球免疫接 種推廣與免疫接種成本之下降方面有極大貢獻。因此，本 發明對於流行病學之預防及人類在健康及衛生上之促進有 其貢獻。 本發明之較佳具體例 現在將參照如下參考例及實施例進一步說明本發明之細 節，此等例不得視為限制本發明之範園。 ' 參考例1 人燹套染色《_維母細胞MRC-5之培餐： 人雙套染色體纖維母细胞MRC-5你於37T使用MEM (美國 ,GIBCO公司裂造及發售）培養，俥》得細胞的生長舆維持 本紙张尺度遑用中B B家樣準(CNS)甲4規格(210X297公；«：) (請先閲讀背面之注意爭項再填寫本頁) 裝. -線· 15 Λ 6 Η 6 經濟部中央標準局员工消f合作社印製 五ν發明説明（14) 。恰在培養基之使用前，將7X(w/v)HaHC0^水溶液加入培 養基内調整pH。用作生長培養基，pH諝整為7.0,而用作 維持培養基，則pH調整為7.5。又復，培養基内補充胎牛 血淸商品培養至终灕度為1 0 X ( w / y )做生長培養基，及3 X (w/v)做維持培養基。 參考例2 水痘病毒之培養： 水痘病毒OKa種糸之種子病毒（WHO技術報導条列· Ho. 275, PP.1 02-1 24, 1985: ATCC VR-795),以 Μ0Ι(感染重 複數）0.03,接種於參考例1所得之MRC-5細胞培養基内， 接著於37Ό培養2日。參考例1所述之維持培養基用作本培 養之培養基。病毒感染期間，病毒感染區域随箸病毒之增 生逐漸擴大。藉顯微鏡觀察，發現病毒感染細胞圔化。如 此，测知感染細胞為所讚之CPE(细胞致病效應）。因此對 呈現CPE之感染細胞擴大進行顯微鏡觀察，可測知病毒生 長程度。對細胞培養單層全區觀察到CPE時，中止细胞培 養。使用培餐面積為210(:1112之Roux瓶作培養容器。 參考例3 麻痊、腮腺炎及德國麻疹病毒之培養：以大腥類似參考 例1及2所述方式，使用MEM分別培養雞胚細胞及《I &胚細 胞；麻疹病毒及腮腺炎病毒於雞胚細胞内培餐，而德國麻 疹僳於《ti胚細胞内培養。 參考例4 M/100 PBS( -)[不含Ca2+離子及Mg2+雔子之磷酸鹽缓衝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 本紙張尺度通用中a B家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 16 Λ 6 Π 6 五、發明説明（15) 鹽水]之製傭： 8.0g NaC义，0.2g KCJl, 2.9g Na2HP04· 12 H2〇及 0.2g KH2P〇4溶解於蒸皤水中，使所得PBS(-)總體積變為1,000 B义。所得PBS(-)之pH約為7.4。 參考例5 懸浮病毒用液（A)之製備： 5 0 8：蔗糖，1.0g L-麩胺酸納及0.1g EDTA之三納鹽，依 此顒序，加入於參考例4所得之800<〇义 PBS(-)而獲得溶 液。分別將50njL蒸皤水加入2.0s明膠内及100B义蒸餾水 加入25g水解明膠（美國BBL公司製造、發售）内所得混合物 各別於壓熱鍋内加熱，獲得溶液。如上所得各溶液彼此混 合，且將蒸脯水加入其中而將结龌積調整至1,0001«义。随 後，所得混合物進行過濾滅菌，接著將混合物整分進行無 菌度試驗，證實混合物為無菌。懸浮病毒用劑（A)之1升之 組成示於下表1 : (請先W讀背面之注意事項再填寫本好) 裝· 訂 線- 經濟部中央櫺準局员工消费合作社印製 表紙張尺度边用中B B家標準(CNS)肀4規格(210x297公;«：) 17 A 6 Η 6 發明説明（16) 表 1 NaC义 6 · 4 g KCJI 0 . 16g Ha2HP04 * 12H2 0 2. 3g KH2P〇 4 0 . 16g 蔗糖 5 θ . Θ g L-麩胺酸納 1 . 0 g 明踴 2 . 0g *水解明謬 25 . 0g *EDTA之三鈉鹽 0 . lg 〈註 >:標有記號*之成分可參考參考例8 參考例6 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本页) 裝- 訂_ 經濟部中央標準局EX工渭費合作社印製 懸浮病毒用液（Β)之製備： 以大體類似參考例5之方式，使用下表2所示之各成分， 製備懸浮病毒用液（Β)。舉例言之，明膠及水解明膠溶解 於蒸皤水而得溶液。其它成分溶解於800b文 PBS(-)而得 溶液。隨後將各溶液混合，並將蒸餾水加入其中使得所得 混合物之總體積變為1,800·义。接著混合物進行過濾滅菌 。滅菌後之過濾液用作愍浮病毒用液（B)。 線. 私紙張尺度逍用中Η B家標準(CNS)甲4規格(210x297公*) 18 ..τ ： · f" l * 五、發明説明（17) 表 2 經濟部中央櫺準局貝工消費合作社印製

HaCJl KC义 Na2HP0 4 ♦ 12H2 〇 KH2P〇 4 乳糖 D-山梨糖醇半胱胺酸 L-麩胺酸銷 明膠 水解明膠 EDTA之三鈉鹽 6 . 4g 0 . 1 6 g 2 . 3g 0 . 16g 5 0.0-g s ' 〇0 β σο 6 δ 0 ο 0 5 0 1 • · · « · · 0 2 11 τ 5 0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 裝· 參考例7 懸浮病毒用液（C)之製備： 以大體類似參考例6所述之相同方式，製備各成分濃度 皆為懸浮病毒用液（B)之二倍之一種溶液。製妥之溶液用 作懸浮病毒用液（C)。 參考例8 液劑1-8之製備： 大體重後參考例5所述之相同方式，但水解明醪及EDTA 三銷鹽（參考例5中皆標以記號）之滇度U/文），如下，表3所 示改變。 各紙»尺度边用中B國家楳準(CNS)甲4規格(210X297公釐） 訂- 線. 19

U Λ 6 Β6 經濟部中央櫺準局员工消費合作社印製 五、發明説明（18) 表 3 水解明膠 EDTA三鈉鹽 (g /儿） (s/义） 液 劑 1 Θ Θ 液 劑 2 10 Θ 液 劑 3 25 Θ 液 劑 4 50 0 液 剤 5 Θ 0 . 1 液 劑 6 10 0 . 1 液 劑 7 25 0 . 1 液 劑 8 50 0 . 2 參 考 例 9 不 含 Ca 2+ 離 子 及 Mg 2+離 子 之 純 水 解 明 膠 之 製 備 ； 於 120g 水 解 明 膠 (美國BBL公 司 製 造 發 售 )内加入180 B文 蒸 皤 水 9 所 得 混 合 物 於歷 力 鍋 内 加 熱 » 而 溶 解 水 解 明 膠 〇 随 後 * 將 蒸 餾 水 加 入 其中 調 整 總1 體 積 為 3 θ Θ m 文 $ 因 而 播 得 40% ( W / V )水 解 明 睡 水 溶液 〇 如 此 製 妥 之 水 解 明 膠溶 液 倒 入 m 維 樹 脂 9 亦 即 S p e c t Γ a / Ρο I Γ* (分 段 分 子 量 1 , ΘΘΘ ! 日本F u η a k 0 S hi 蕖 物 公 司 製 造 發 售 ), 製之滲析管内， 並於室溫滲析48小時， 滲析偽使用 蒸 皤 水 做 外 液 〇 滲 析 完成 後 » 所 得 m 析 産 物 進 行 螯 合 計 畫 滴 定 而 證 實 未 測 得 任 何C a 2+ 離 子 及 Mg2+ 離 子 > 代 表 此 等 離 子 大 醱 被 去 除 〇 證 實 後， 將 滲 析 産 物 進 行 過 濾 滅 菌 〇 所 得 無 菌 過 濾 産 物 用 作 純 水解 明 膠 * 用 於 活 疫 苗 内 做 安 定 劑 成 各紙张尺度遑用中B國家標準(CNS)肀4規格(210x297公龙） (請先閲讀背面之注意事項再填窩本頁) t

T 20 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 A 6 15 6 五、發明説明（19) 份。 前述螯合計畫滴定法之進行方式，偽使用EDTA二納鹽做 蝥合剤，並使用Eriochrone Black Τ做金靥指示劑進行比 色滴定。比色滴定中，當檢定条統顔色由紫红轉為藍色時 ，終止滴定。 參考例10 水痘病毒溶菌斑之檢定法： 一条列10倍稀釋的受試含病毒液體，各別接種於培養在^ 培養皿内之MRC-5細胞單層内，接箸於含有5S!(w/v)二氣化 碩之培育器内於37*0培育。維持培養基大體以如參考例1 之相同方式製備，但使用培養基199 (美國DIFC0公司製造 發售）做基礎培養基。以终濃度0.8iKU/V)將瓊脂加入維持 培養基内而製得固體培養基。製妥之固體培養基舖於感染 细胞的單層上方。進行受感染的培養细胞之染色，其中以 終濃度0.01X(w/v),將中性红加入前述固髏培養基所製得 之培養基舖於感染細胞上方。然後計算出現的溶藺斑數目 。溶菌斑數目，亦邸PFU (溶菌斑生成單位），代表活疫苗 之病毒含董，活疫苗力價以PFU表示。例如，接種1βΑ_104 倍稀釋的疫苗，接著培養，可生成10溶菌斑時，溶菌斑總 數估’計為104PFU/n义，偽由10Χ104計算而得；總數通常 以5.Θ表示，偽以105之常用對數表示。 參考例11 麻疹、德國麻疹及聰腺炎活疫苗之力價測定： 就麻疹疫苗及徳國麻疹疫苗之力價而言，麻疹病毒之溶 本紙張尺度逍用中B躕家楳準(CNS) Ή規格(2〗0乂297公；«·) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 裝· 線. 21 ο ...y— ύ ο 66 五、發明説明（20) (請先閲讀背面之注意事項再填筠本頁) 豳斑檢定法偽使用Vero細胞，而徳國麻疹病毒像使用Μ-ΐ 3細胞； 各 別之使 用方式 大龌如 參考例 10所述 來測定 力價。 至於腮腺炎疫苗，其力價傲以腮腺炎病毒之TCID50表示 ,且使用Vero细胞檢定。TCID5〇之決定方式如下：一糸列 10倍稀釋之受試疫苗溶液，各別接種入於試管内培餐的 Vero細胞層内，試管容積為5·义，接着於37C培育， TCID 50係基於疫苗之稀釋倍數決定，於該倍數時，可於50X 感染細胞以顯撖鏡戡察到CPE(參見"翳用徽生物學綜覽”， 第13版，344 -345頁，LangteU學出版社，1976年）。例如 將10+倍稀釋的疫苗溶液，接種於含一細胞層之10根試管 内並於其中培餐。此例中，培養後，當於10根試管中之5 根（50X)觀察到CPE時，依雄Log 1041：(：1〇5〇表示為4.0。 實施例1 活疫苗之貯存安定度試驗（安定_之有效度試驗）： 於20Roux瓶（各別之培養面積為210 c#)内，於MRC-5细 胞培養中，接種水痘病毒〇Ka種条種子病骞，接箸以大» 經濟部中央標準局貝工消費合作社印31 如參考例2所述方法進行培養。培餐完成後，拋棄培餐後 之培養基。各Roux瓶内之想染細胞以200bJI PBS(->洗滌 二次。接著將201«义0.05X(w/v)EDTA三銷鹽置於各Roux瓶 之感染細胞上，以吸管由Roux瓶之内壁表面吸下細胞並懸 浮於液《内，獲得感染細胞懸浮液。將如此所得之感染细 胞懸浮液匯集在一起。如此，緦計可獲得400»义感染細胞 懸浮掖。所得想浮液分成S籲等賸稹之整分並置於8根離心 管（T1至T8)内，而製妥8根離心管内各含50_义數量之感染 本紙張尺度边用中《家樣準(CNS)T4規格(210x297公*) 22 經濟部中央櫺準局员工消t合作社印製 乙0細ϋ Λ 6 __Η6_ 五、發明説明（21) 細胞懸浮液。感染細胞懸浮液於各離心管内，以2，000γρ· 於4tJ離心10分鐘，而將懸浮液分成上淸液及細胞，拋棄 上清液，獲得離心管底部之感染細胞九粒。參考例8製妥 之液劑1-8置於離心管内，因而液劑编號柑當於離心管编 號，換言之，20bJI整分之液劑1置於離心管Tl, 20mJl整 分之液分子2置於離心管T2等，藉此再度懸浮感染細胞。 然後所得懸浮液進行一週期冷凍一解凍。隨後，懸浮液於 冰水浴中進行超離心（20KHz, 150bA, 0.3秒/ b儿），接著 於l,000rpm, 4C離心10分鐘，而將懸浮液分成細胞及上 清液。含病毒之上淸液與細胞分離，經收集而製妥8類具 有不同的安定劑组成物之活疫苗。 各型活疫苗以每小瓶0.5πι义之數量，分配入容積為3ra；L 之小瓶内，接著進行凍晶乾燥，小瓶内填充氮氣，並以橡 皮塞將小瓶氣密式封閉。疫苗小瓶貯存於.37¾。貯存中毎 隔一週任意取5小瓶，進行安定劑之有效度試驗。恰於試 驗前，將0.7m儿注射用蒸觴水加入凍晶乾燥的疫苗内，重 新調製而得疫苗完全溶解於其中之一種溶液。藉參考例10 所述之溶菌斑檢定法，對所得溶液進行有效度試驗。各類 疫苗之力價以PFU表示，结果摘述於下表4。以液劑7之安 定化功效最為卓越。 * 私紙張尺度遑用中Η B家樣準(CNS)肀4規格(210x297公龙） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本页) 裝· 線. 23 Λ 6 Η6 五、發明説明（2¾ 表 活水痘疫苗之貯存安定 (安定涮之功效試驗） 度試 驗 安定剤 液劑编號 力價 =10g (PFU/«Jl ) 凍晶乾燥前 凍晶乾燥後於37Ϊ：之貯存日數 0 7 14 21 28 1 5 . 3 4.3 3.5 2 . 7 2.5 2.1 2 5 . 1 4 . 6 3.7 3.3 3.2 3.2 3 5 . 0 4.6 3.9 3.6 3.4 3.2 4 5 . Θ 4.5 3.7 3.3 3 . 1 3.0 5 5 . 2 4.4 3.4 2.8 2.4 2.2 6 5 . 3 4.7 4.0 3.6 3.5 3.3 7 5 . 4 4.8 4.3 4.1 4.0 3.8 8 5 . 3 4.7 4.2 4 . 1 3.8 3.6 實施例2 (請先閲讀背面之注意事項#填寫本页) 裝· 訂_ 線. 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 含減毒活水痘病毒作活性成分之穩定活疫苗的製備： 於20Roux瓶（各別之培餐面稹為210cnf)内，於NRC-5細 胞培餐中接種水痘病毒OKa種糸種子病毒，接著以大鼸如 參考例2所述方法進行培養。培養完成後，抛索培餐後之 培餐基。#Roux級内之感染细胞以200_JLPBS(-)洗嗛二 次。接著将20·儿0.05XU/v)EDTA三銷鹽置於各Roux瓶之 感染細胞上，以吸管由Roux瓶之内壁表面吸下細胞並驗浮 於液臞内，獲得感染细胞懸浮掖。將如此所得之想染細胞 懸浮液匯集在一起。然後匯集懸浮液於2,000rp·於4C離 本紙張尺度遑用中B B家標準(CNS) TM規格(21QX297公釐） 24 · Λ ί «S ^ i ^ ^ Λ 6 Β6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（23) 心10分鐘，而將懸浮液分離為上清液及细胞。抛粢上$液 ，收集感染細胞九粒。收集之細胞再度懸浮於100nJl液劑 (A)中俾懸浮病毒，液劑（A)像於參考例5製備。然後所得 懸浮液進行一次冷凍-解凍遇期，随後於冰水浴中進行超 離心（20KHz, 150bA, 0.3秒 /nil),接著於 l，000rpm,於 4Ϊ：離心10分鐘，而將懸浮液分離成細胞及上淸液。收集 與细胞分離之含病毒之上清液。 收集得之上淸液用做活疫苗之散装物料。30nJL如此所 得之散裝物料採樣，進行試驗，而其餘70Bjl活疫苗散裝 物料與液劑（A)混合而懸浮疫毎（液劑（A)傜於參考例5製備 ),因而製得140D文最终散装之活疫苗。30bJI如此製得之 最终散裝活疫苗採樣進行試驗，而其餘則以每小瓶0.5»义 數量分配入容積為3·^之小瓶内，接著進行凍晶乾燥。随 後，瓶内《充入氰氣，以搛皮塞進行氣密式密封。疫苗小 瓶貯存於4X；使用小雁内貯存的凍晶乾燥疫苗時，將 0.7m义注射用蒸皤水加入疫苗内使之完金溶解，隨後使用 疫苗。如此可以溶液形式提供疫苗供使用。 如上所得之活疫苗散裝物料樣品，如上所得之活疫苗最 最後散裝樣品及20疫苗小瓶進行安定度，有效度與均勻度 試驗俥S實其適合供疫苗使用。試驗供依雄曰_本衛生福利 部第195號公報中之生物學産物之最低要求（1988)中之”凍 晶乾嫌的滅毒活水疽疫苗”進行。試驗结果發現，小瓶内 前述疫苗之病毒含*為2X10 PFU/0.5iJL,且疫苗通遇所 有試驗。结果歸结：該疫苗適合做活疫苗使用。又復，以 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 裝· 訂_ 線· 本紙張尺度遑用中Η B家楳準(CNS)甲4規格(210X29’^·*：) 25 經濟部中央梂準局员工消費合作社印褽 Λ 6 B 6 五、發明説明（24) 大體類似實施例1之方式，對疫苗進行貯存試驗。試驗@ 果顯示此疫苗之安定度等於或高於葙液剤7所得者。如此 ，證》活疫苗為卓越穩定的活疫苗。 實施例3 四價活疫苗之貯存試驗： 使用液劑（B)(參考例6所得者）懸浮病毒，以大體類似於 實施例2所述之方式製備活水痘疫苗之散裝物料（V)。 另外，以大體類似參考例3所述之相同方式，各別培餐 麻疹、德國麻疹及腮腺炎病毒。 至於麻疹病毒，於培養完成後，抛棄培養基。感染細胞 以PBS(—)洗滌，去除Ca2+離子及Mg2+離子。随後，將1/ 20倍體積之培養基199(美國，DIFC0公司製造發售），或不 含Ca2+離子及M g2+離子二者之MEM,舖於怒染細胞上，藉 吸管從培養容器内壁表面上吸下細胞並懸浮於液劑，如此 獲得感染細胞懸浮液。然後所得懸浮液進行一週期的冷凍 -解凍，隨後進行低速離心（於2,000^1«,於41〇,10分鐘） ，而將懸浮液分離成細胞及上清液。收集含病毒之上淸液 作麻疹病毒懸浮液。 至於徳國麻疹及腮腺炎病毒，於培餐完成後，含病毒之 培餐基進行低速離心（於2,000γρβ,於4t：, 10分鐘）而得 上淸液。然後利用纖維素膜（分段分子量：300千道耳頓， 美画Millipore公司製造發舍）將上淸液濃缩成1/20倍《積 。所得濃缩培《基進行超離心（4C, 20,000rPB,臈腺炎 病毒90分鐘，徳國麻疹病毒18分鐘）而將病毒九粒與上淸 冬紙張尺度遑用中國B家楳準(CNS)甲4規格(210x297公*) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) 裝· 訂- 26 五、發明説明（25) 液分雄。抛棄上淸液而将病毒懸浮於培餐基ug,或不争 Ca2+雄子及MS2+離子之MEM,而得德國麻疹與聰腺炎病毒 之病毒懸浮液。 各病毒懸浮液與等讎積病毒懸浮用液（c)(參考例7所得） 混合，因而製得麻疹、德國麻疹及腮腺炎之三類活疫苗散 裝物料如下： (1) 麻疹（Ml),徳國麻疹U1)及腮腺炎（MU1)之活疫苗散 裝物料之製法，你將等《積病毒懸浮用液（c)加入使用培 餐基199所製得之各病毒懸浮液内。 (2) 麻疹（M2),德國麻疹（R2)及腿腺炎（M112)活疫苗之散 裝物料之製法，係將EDTA三銪鹽加入使用培餐基199製得 之各別病毒懸浮液内，使得终濃度變成0.15Χ(ϊ/ν)，且又 於其中加入等《積病毒懸浮用液（c)。 (3) 麻疹（M3)，徳國麻疹（R3)及腮腺炎（MU3)活疫苗之散 装物料之製法，偽將等《稹病毒懸浮用液（C)加入使用不 含Ca2+離子及Ng2+雄子之MEM所製得之各別病毐想浮液内° 隨後，依據下表5所指示之配方混合活疫苗之散裝物料 ,而製得三種最终疫苗之散裝物料。 (請先閲讀背面之注意亊項再填寫木頁) 裝. -線- 經濟部中央櫟準局员工消费合作社印製 冬紙張尺度逡用中國β家揉準(CNS) T4規格(210x297公龙) 27 Αβ 五、發明説明（26) 表 5 最 编 終散 裝 號 活疫苗之混合比 (π文） 500 100 200 200 1 V Ml R1 MU1 2 V M2 R2 MU2 3 V M3 R3 MU3 随 後 9 將 各 散 裝 疫 苗 分 裝 入 小 瓶 内 * 小 瓶 容積 各 為 3 mil 1 分 裝 數 量 為 每 瓶 0 . 5 w 义 « 分 裝 方 式 大 體 如 實施 例 1所述 〇 各 小 瓶 内 之 疫 苗 進 行 凍 晶 乾 燥 〇 凍 晶 乾 燥 後， 疫 苗於37 進 行 安 定 劑 功 效 性 試 驗 > 俥 證 實 少 量 分 裝 的四 價 疫苗之 安 定 度 〇 有 效 試 驗 偽 以 溶 菌 斑 檢 定 法 (水痘、 麻疹及德國 麻 疹 病 毒 ), 及TC ID5〇測定< :腮 腺 炎 病 毒 ), 如參考例1 0及 11所 述 者 進 行 〇 結 果 示 於 下 表 6〇 最終散裝编號3之 安定化 四 價 活 疫 苗 最 為 卓 越 〇 (請先間讀背面之注意事項再填寫木页) 經濟部中央櫺準局员工消費合作社印製 本紙張尺度逡用中Β «家捸準(CHS)甲4規格(210x297公龙) 28 5 rL> ο ία 66 ΛΒ 五、發明説明（27) 表 6 安定化四價活疫苗貯存 安定度之試驗結果 經濟部中央標準局员工消費合作社印¾. 最終散裝疫苗 (含安定劑） 力 價=log(PFU/n儿 )或 T C I D 50 凍晶乾燥前 凍 B 0 晶乾燥後 數 7 ，於37 υ之貯存 14 21 28 1號 水 痘 5.0 3 .6 3.0 2.7 2.2 2.1 麻 疹 6.1 5 • 6 5.2 4.9 4.9 4.8 德 國 麻 疹 4.8 4 5 4.3 A.2 4.1 4.1 腮 腺 炎 6.1 5 7 5.2 A.9 4.9 4.7 2號 水 痘 5.1 4 2 3.6 3.3 3.2 3.0 麻 疹 6.1 5 6 5,1 5.0 4.8 4.7 德 國 麻 痊 4.8 4 5 4.4 4.2 4.2 4.1 聰 腺 炎 6.1 5 6 5.1 4.9 4.8 4.7 3號 水 痘 5.1 4 6 4.1 3.9 3.7 3.6 麻 疹 6.1 5 6 5.2 5.0 4'. 9 4.8 德 國 麻 疹 4.8 4 5 4.3 4.2 4.2 4.1 腮 腺 炎 6.1 5 7 5.2 5.0 4.8 4.6 (請先閲讀背而之注意事項再填寫木页) 本紙張尺度逍用中B B家標準(CNS)甲4規格(210x297公釐) 29 Λ 6 _Π6_ 五、發明説明（28) 實施例4 純水解明膠之疫苗安定功效試驗。 製備病毒懸浮用液（Α1),其組成大體如參考例5所述之 病毒懸浮用液（Α)相同，但刪除EDTA三鈉鹽。 又復，製備病毒愍浮用液（Α2),其組成大體如參考例5 所述之病毒懸浮用液（Α)相同，但使用參考例9所得之純水 解明膠以取代水解明膠，並去除EDT Α三銷鹽。分別使用病 毒懸浮用液（A), (A1)及（A2).以大體如實施例2所述之相 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央楳準局员工消費合作社印製 同 方 式 製 備 凍 晶 乾 燥 的 活 水 痘 疫 苗 〇 如 此 所 得之 活 疫 苗 各 別 進 行 於 37 t： 之 貯 存 安 定 度 試 驗 〇 試 驗 結 果 示於 下 表 7。 發 現 病 毒 懸 浮 用 液 (A2) 之 病 毒 安 定 化 功 效 等 於液 劑 (A) 〇 換 之 > 證 實 當 使 用 不 含 Ca2 + 離 子 及 Mg 2+ 離 子之 純 水 解 明 膠 作 為 安 定 劑 之 一 種 成 分 時 ί 可 無 需 使 用 EDTA 三 鈉 鹽 0 表 7 純 水 解 明 膠 之 水 痘 疫 苗 安 定 化 功 效 安 定 劑 力 價 = 1 〇 g (PFU/ »JL ) 凍晶乾燥前 凍 晶 乾 燥 後 t 於 37Ό 之 貯 存 病 毒 懸 浮 用 液 曰 數 Θ 7 14 21 28 A 5 . 4 4 .9 4 . 5 4 .3 4.2 8 .9 A1 5 . 1 4 .6 3 . 9 3 .6 3.3 3 .1 A2 5 . 3 4 • 9 4 . 4 4 .1 4.0 3 .8 實 施 例 5 含 有 減 毒 重 組 體 水 痘 病 毒 作 活 性 成 分 之 安 定化 活 疫 苗 之 本紙張尺度逍用中a國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 裝. 線. 30 Λ 6 15 6 五、發明説明（29) 製備： 重複大體如實施例2之相同程序，但使用減毒重組體水 痘病毒rVH17-5 OKa種条[ECACC(歐洲動物細胞培養收集會 )新增编號V92041523](傑經由將B型肝炎病毒基因與減毒 水痘病毒OKa種条之基因組DNA接合而製備）作種子病毒， 因而製得重組體水痘病毒疫苗。如此所得之疫苗如實施例 2進行相同的安全度、有效度、均勻度與貯存試驗。結果 發現，此疫苗適合用作活疫苗且具有卓越安定度。如此證 實，活疫苗是一種可與實施例2所得疫苗相比擬的卓越穩 定的活疫苗。 (請先閲請背面之注意事項再填寫本！) 裝- 訂 線 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 本紙張尺度逍用中Η Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公龙) 31

Claims (1)

1. A7 B7 C7D7 82. 缦濟部中央標準局霣工消費合作社印製 六、申請專利範圍 1. 一種活疫苗之安定化方法，該活疫苗包括選自減毒活 水痘病毒及減毒重組水痘病毒中之至少一種水痘病毒所組 成之病毒成份，該法包括在該活疫苗中加入安定劑，其特 徵為該安定劑大體不含Ca2+離子及Mg2+離子或能遮蓋Ca2+ 離子及Mg2+離子，藉此使疫苗大體不含Ca2+離子及Mg2+離 子。 * 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所述安定劑為選 自明膠、明膠衍生物及螯合劑中之至少一者。 3 .如申請專利範圍第2項之方法，其中所述明膠及明膠 衍生物之數量，以安定化活疫苗内之濃度表示，分別為約 0.02 至約 1.03；(w/v)及約 0.5至約 10%U/v)。 4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中所述明膠衍生物 為水解明膠。 5. 如申請專利範圍第2項之方法，其中所述螯合劑之數 量，以安定化活疫苗内之濃度表示，為約0.001至約0.1¾ (w / v )。 6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中所述安定劑包括 約0 . 0 1至約5 % U / v )麩胺酸納，約0 . 5至約1 0 5 ( w / v )蔗糖， 約0.02至約l%(W/v)明膠，及約0.5至約10；UW/V)之水解明 膠，其中量係以安定化活疫苗内之濃度表示。 7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中所述安定劑包括 約0.01至約5!S(w/v)麩胺酸鈉，約0.5至約10S!(w/v)蔗糖， 約0.02至約l%(w/v)明膠，約0.5至約10!S(w/v)之水解明膠 ，及約0 . 0 0 1至約0 . U U / v )螯合劑，其中量偽以安定化活 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 乂 -裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 申請專利範圍 A7 B7 C7 D7 括 包 劑 .定 安 述 所 中 其 法 方 之 項 4 第 〇 圍 示範 表利 度專 濃請 之申 内如 苗 8 疫 約 至 約 至 11. ¢41 約 ^ 0 0胺 約胱 , 半 糖V) 乳 W 醇 糖 梨 山 約 至 Η 示 約表 至度 5濃 之 内 苗 疫 活 /V化 (W定 05安 1 以 約係 至量 2 3 0 中 0 其 約 - ,0 納明 酸解 胺水 麩V) 約 及 膠 明 括醇 包糖 劑梨 定山 安V) 述W/ 所Η 中0 6 其約 法’2Μ 方 0 之約 項 ， 4 0 第 L 圍)# 範 / 利(W 專05 請I 串 如 約 至 V I / 約 0 ( 至 0 ^ 2 0 8" 1 0 及 ^'T^''1 么'·'么'', 至 ，膠 02鈉明 0 酸解 約胺水 ,麩V) 約 酸 胺 胱 半 約 至 W/偽 % 量 0 J 1 中 約其 至 ， 5劑 ^合 約 S 螯， \—/膠/V 明(W V 11 / . W 0 %(約 0至 示 表 度 濃 之 内 苗 疫 活 化 定 安 以 第 圍 範 利 專 請 申 如 述 所 中 其 法 方 之 項 9 或 7 5 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) —裝. 訂 合 螯 生 衍 膠 明 及 膠 明 述 所 中 其 〇 ，子 法離 。方2+ ¾之Mg 其項及 或m2子^ ^ 0 J 圍4. sfca2 ® U纟一一二 乙 i 體 為 大 1 IH M? 劑 .物 專 If Φ 如 含 不 體 大 膠 明 利a2+ 第 圍 範 或 2+ S Μ 及 子 離 解 水 述 所 中 其 法 方 之 〇 項子 隹 法 方 之 項 1X 11 第 圍 範 熳濟部t夹揉準局Λ工消费合作社印製 物 生 衍 _ 明 及0 明 之 子 J 離 利2+ 專 WJ 0 ^ 申及 . 離 3 + 12 a 含 不 體 大 述 所 中 其 合 螯 經 為 別 分 衍 衍 膠 明明 的的 J-1 mc 理理 處處 劑經 合 及 螯膠 經明 及的 以理 物處 産經 化述 純所 其 ， 或物 , 産 膠化 明純 的其 理或 處物 劑生 子而 離子 2+離 Mg等 及該 子蓋 離遮 2+此 ca0 含 ， 別物 各生 理衍 處II 劑明 合 及 螯瘳 用明 使之 偽者 別 一 分少 , 至 物之 生中 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）2 經濟部中央標準局B工消费合作社印製 A7 y B7 W V C7 _ D7_ 六、申請專利範園 製得者。 1 4 .如申請專利範圍第1 1項之方法，其中所述大體不含 C a 2+離子及M g 2+離子之明膠及明膠衍生物分別為經純化的 明膠及經純化的明膠衍生物，其各別之獲得方式偽將各別 含有C a2+離子及M g2+離子中之至少一者的明膠及明膠衍生 物接受滲析處理、凝膠過濾處理、陽離子交換樹脂處理及 螯合樹脂處理中之至少一種處理，？§此大體去除所有Ca2+ 離子及Mg2+離子。 1 5 .如申請專利範圍第1 1 , 1 3或1 4項之方法，其中所述 明膠衍生物為水解明膠。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所述病毒成分又 包括至少一種水痘病毒以外之減毒活病毒。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中所述至少一種 水痘病毒以外之減毒活病毒，偽選自麻疹、德國麻疹、腮 腺炎、日本腦炎、流行性感冒及肝炎之減毒活病毒中之任 一者。 1 8 .如申請專利範圍第1 6項之方法，其中所述病毒成分 又包括麻疹、德國麻疹及腮腺炎之減毒活病毒。 19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該安定化活疫苗 傜呈液體産物或凍晶乾燥産物形式。 20. —種供活疫苗用之安定劑，該活疫苗包括選自減毒 活水痘病毒及減毒重組體水痘病毒中之至少一種水痘病毒 作病毒成分，所述安定劑包括選自明膠及明膠衍生物中之 至少一者，各別大體不含C a2+離子及M g2+離子者。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公；Ϊ ) 3 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝‘ 訂 A7

   ®濟部中夬標準局員工消費合作社印製 C7 D7 六、申請專利範圍 2 1 ..如申請專利範圍第2 0項所述之安定劑，其中所述大 體不含C a2+離子及M g2+離子之明膠及明膠衍生物。分別為 經螯合劑處理的明或其純化産物以及經螯合劑處理的 明膠衍生物或其纯化産物，所述經處理的明膠及經處理的 明膠衍生物，分別偽使用螯合劑處理各別含Ca2+離子及Mg2+ 離子中之至少一者的明膠及明膠衍生物，藉此遮蓋該等離 子而製得者。 22. 如申請專利範圍第21項所述之安定劑，其中所述螯 合劑為乙二胺四乙酸或其鹽。 23. 如申請專利範圍第20項之安定劑，其中所述大體不 含C a 2+離子及M g2+離子之明膠及明膠衍生物，分別為經純 化的明膠、及經純化的明膠衍生物，其各別之獲得方式偽將 各別含有Ca2+離子及Mg 2+離子中之至少一者的明膠及明膠 衍生物接多滲析處理、凝膠過濾處 '理、陽離子交換樹脂處 理及螯合樹脂處理中之至少一種處理，藉此大證去除所有 的Ca 2+離子及Mg 2+離子者。 24 .如申請專利範圍第23項之安定劑，其中所述螯合樹 脂含有乙二胺四乙酸或其鹽。 2 5 .如申請專利範圍第2 0至2 4項之任一項之安定劑，其 中所述明膠衍生物為水解明膠。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A —裝. 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）4