CN115227811B - 一种水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水痘‑带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法，所述方法包括病毒生产、细胞破碎、超滤膜浓缩以及分子筛层析的步骤，期间进行适时的病毒保护以及温度调节。采用本发明的制备方法，活疫苗产量高、安全风险低。

Description

一种水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程药物和疫苗制造领域，更具体地，本发明涉及一种新型的水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒是一种具有高度传染性的疱疹病毒，既可引发水痘，也可引发带状疱疹(HZ)；前者通常见于儿童期和年轻成年人，后者则是潜伏病毒再活化和复制导致。水痘是一种常见、多发、有高度接触传播性的儿童急性传染病，发热的同时伴全身水疱性发疹。带状疱疹(HZ)是由潜伏在感觉神经节的水痘-带状疱疹病毒复发感染导致的一种急性感染性皮肤疾病。当抵抗力低下或劳累、感染、感冒时，病毒可再次生长繁殖，并沿神经纤维移至皮肤，使受侵犯的神经和皮肤产生强烈的炎症。常见的严重并发症有疱疹感染后神经痛(PHN)和眼病带状疱疹。

现有的水痘-带状疱疹病毒疫苗类型较少，在韩国获得许可的疫苗是从一种来自当地的特定分离株开发而来；除此之外，所有的配方都基于日本Takahash分离的VZV-Oka株。鉴于此类病毒疫苗制备工艺难度高，全球仅有2种批准上市的带状疱疹疫苗，其一为默克公司的Zostavax疫苗，于2006年获得上市许可，实质为高剂量VZV-Oka株减毒活疫苗。另一为葛兰素史克(GSK)公司的亚单位佐剂疫苗(HZ/SU)，结合了VZV糖蛋白gE和含有刺激先天性免疫反应激活的AS01B佐剂以增强特异性抗体和细胞介导的反应，以期诱导更强烈和更持久的免疫反应；但是，该亚单位疫苗的副反应比较强。

因重组亚单位疫苗的副反应较强，减毒活疫苗的规模化生产、工艺优化显得更为迫切。

目前，病毒减毒活疫苗生产原液的纯化工艺中，主要采用超声破碎、离心、过滤制备减毒活疫苗原液，在减毒活疫苗原液及成品溶液的过滤处理中，主要采用滤柱过滤和布式滤囊过滤两种方法。尽管这两种方法在实际生产中的应用已较成熟和稳定，但所获得的病毒减毒活疫苗原液还存在一些亟待改善的方面，主要是细胞/病毒培养过程中的杂质依然不能有效去除。尽管可采用MRC-5细来生产病毒，该细胞为人源细胞，但对人体来说，依然是外源性物质，产生较多副反应。目前，包括默克在内的已上市疫苗，只是采用离心或过滤的方式去除较大的细胞碎片，均存在该潜在的安全性问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种水痘-带状疱疹病毒疫苗原液的制备方法，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗为活疫苗，所述方法包括：

(1)以水痘-带状疱疹病毒感染病毒生产细胞以生产病毒，收获包含病毒感染细胞的细胞液；在细胞液中添加组合试剂1；所述组合试剂1包括：人血白蛋白、谷氨酸钠和蔗糖；

(2)对(1)中细胞液进行超声破碎，获取上清液；进行超滤浓缩，获得浓缩液；

(3)在(2)的浓缩液中加入组合试剂2；所述组合试剂2包括：谷氨酸钠和蔗糖，进行分子筛层析，获得水痘-带状疱疹病毒疫苗原液。

在一种或多种实施方式中，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗为减毒的活疫苗。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述病毒生产细胞为MRC-5细胞。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，所述人血白蛋白在细胞液中的终浓度为1.5～10‰(如2‰、3‰、4‰、5‰、6‰、7‰、8‰或9‰)；较佳地2～6‰；更佳地2.5～5‰。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，所述谷氨酸钠在细胞液中的终浓度为0.1～1‰(如0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、0.6‰、0.7‰、0.8‰)；较佳的0.2-0.6‰。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，所述蔗糖在细胞液中的终浓度为10～100‰(如20‰、30‰、40‰、50‰、60‰、70‰、80‰)；较佳的30-70‰。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，(2)中，进行所述超滤浓缩时，温度为1～10℃；较佳地2～8℃(如3℃、4℃、5℃、6℃或7℃)。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，(2)中，进行所述分子筛层析时，温度为1～10℃；较佳地2～8℃(如3℃、4℃、5℃、6℃或7℃)。

在一种或多种实施方式中，(1)中，所述组合试剂1中，(2)中，采用中空纤维膜进行所述超滤浓缩；较佳地，采用100KD中空纤维膜进行所述超滤浓缩。

在一种或多种实施方式中，进行所述超滤浓缩后，浓缩的倍数为5-40倍(如12、15、25或35倍)；较佳地10-20倍。

在一种或多种实施方式中，所述组合试剂1、组合试剂2中，所述谷氨酸钠在细胞液中的终浓度为0.1～1‰(如0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、0.6‰、0.7‰、0.8‰)；较佳的0.2-0.6‰。

在一种或多种实施方式中，所述组合试剂1、组合试剂2中，所述蔗糖在细胞液中的终浓度为(如20‰、30‰、40‰、50‰、60‰、70‰、80‰)；较佳的30-70‰。

在一种或多种实施方式中，(3)中，进行分子筛层析时，设置洗脱线性流速0.45～0.9cm/min；较佳地，设置洗脱线性流速0.5～0.8cm/min；较佳地，设置洗脱线性流速0.55～0.7cm/min(如0.6cm/min、0.65cm/min)。

在一种或多种实施方式中，(3)中，进行分子筛层析时，采用Sepharose 4FF凝胶层析柱。

在一种或多种实施方式中，(2)中，超滤浓缩时，使用中空纤维膜进行浓缩。

在一种或多种实施方式中，所述方法的病毒回收率超过50％；较佳地超过55％；更佳地超过60％。

在一种或多种实施方式中，所述方法的蛋白去除率超过98％；较佳地超过98.5％；更佳地超过99％。

在一种或多种实施方式中，MRC-5细胞的细胞生长液为含5～10％血清的HDC培养液。

在一种或多种实施方式中，MRC-5细胞使用细胞工厂恒温培养(温度37±1℃)。

在一种或多种实施方式中，(1)中，以水痘-带状疱疹病毒感染病毒生产细胞以MOI0.001～0.01接种病毒。

在一种或多种实施方式中，MRC-5细胞在感染病毒后，利用细胞维持液进行继续培养，维持液为含2～5％血清的HDC培养液。

在一种或多种实施方式中，待病毒接种后，细胞的CPE达到70±5％时收获细胞，洗涤细胞，消化。

在一种或多种实施方式中，将含有病毒的上清液采用100KD中空纤维膜进行超滤浓缩，浓缩倍数10-20倍，即为病毒浓缩液。

在一种或多种实施方式中，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗原液包括成品或半成品。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人致力于优化水痘-带状疱疹病毒活疫苗的纯化工艺。不同于其它类型的疫苗(例如灭活疫苗，蛋白疫苗等)，本发明所需制备的疫苗为病毒活疫苗。尽管在其它类型的病毒疫苗制备中可能无需考虑，但对于病毒活疫苗而言，如何保持病毒的高活性是至关重要的。在病毒活疫苗的整个制备和纯化工艺中，一方面需要尽可能地避免或减少病毒失活；另一方面则是尽可能地达到高的蛋白去除率。

为此，本发明人进行了深入的过程研究和实验分析，包括工艺流程、过程处理、添加物及添加时机的选择、温度条件的选择等，提供了一种新型水痘和带状疱疹疫苗原液的纯化方法，包括病毒生产、细胞破碎、超滤膜浓缩以及分子筛层析的步骤，期间进行适时的病毒保护以及温度调节。

如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“病毒生产细胞”是指适用于进行水痘-带状疱疹病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养基中培养，感染水痘-带状疱疹病毒后，可为水痘-带状疱疹病毒提供适当的组装环境。所述的细胞较佳地为MRC-5细胞。

如本文所用，除非另外说明，“细胞生长液”为使得MRC-5细胞(感染前)生长、传代的培养液，较佳地为含5～10％血清的HDC培养液。

如本文所用，除非另外说明，“细胞维持液”为用于培养感染病毒后的MRC-5细胞，使得病毒能够在细胞内被扩繁的培养液，较佳地为含2～5％血清的HDC培养液。

如本文所用，“传代”通常包括：使水痘-带状疱疹病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。

根据本领域一般的考虑，由于所需制备及纯化的为病毒活疫苗，会在获得病毒收集液后进行浓缩、直接备于后续应用。然而，本发明人观测到，超滤浓缩工艺后虽然可以显著地降低病毒液体积且保留或一定程度提高病毒滴度、病毒回收率较高，病毒浓缩液中仍然有较多的杂蛋白，蛋白去除率难以满足要求。

为了解决蛋白去除率低的问题，本发明人进行了深入研究分析，确定通过在过程中适时利用添加剂进行活性保护并引入层析工艺的方案。常规实践中一般认为层析工艺会导致活病毒的活性丧失，故本领域中未见有在病毒活疫苗制备工艺的下游纯化中应用层析技术的。为了解决活病毒的活性丧失的问题，本发明人进行了上游工艺的优化，应用有效的添加成分(如含或不含人血白蛋白的组合试剂)，适时加入后，可较为有效地获得改进的效果。

本发明人找到了配合上述纯化过程的辅助保护试剂，在经水痘-带状疱疹病毒感染、收集细胞液的阶段(细胞破碎前)，在病毒收集液中添加如表3中的含有人血白蛋白的添加成分；进而再进行细胞超声破碎、离心去除杂质(超滤前)，与不添加时(病毒滴度为5.2LgPFU/ml)相比，适时添加人血白蛋白使得病毒滴度有提高(5.5-5.8LgPFU/ml)。超滤浓缩约10倍后，再制备的纯化液，病毒滴度可达6.6LgPFU/ml，比之不添加人血白蛋白提高显著。进一步地进行层析，此过程尽管在传统上并认为会导致病毒失活，但本发明在工艺优化后，比之超滤浓缩后病毒滴度有一定损失、但仍然维持高位，可达6.1LgPFU/ml(病毒回收率有降低)。这样的滴度仍然可保证后期配制出适宜滴度的疱疹和水痘疫苗。在保证滴度的情况下，优化工艺后蛋白质的去除率令人意外地升至99％以上，保证了疫苗的纯度。

本发明中优化了人血白蛋白的添加时机，含有人血白蛋白的试剂在病毒收集后添加。在收获病毒收集液(感染病毒的细胞液)后、超声破碎前添加含有人血白蛋白的试剂，最终可以最好的病毒活性、蛋白去除率令人满意。在分子筛层析前后的样液中添加“谷氨酸钠+蔗糖”而无需再加入人血白蛋白；并且前期添加的少量人血白蛋白在层析过程中恰好被去除。如此，这一技术方案可以最大限度地保护病毒活性，且最大限度地去除蛋白。

配合本发明的工艺，本发明人设计了组合试剂1和组合试剂2。所述组合试剂1包括：人血白蛋白、谷氨酸钠和蔗糖。所述组合试剂2包括：谷氨酸钠和蔗糖。组合试剂1被应用于收获细胞液后、细胞破碎前这一时机的添加。组合试剂2被应用于分子筛层析前后添加。

本发明中，优化了人血白蛋白的添加浓度，尽管在细胞收集液中添加不同浓度人血白蛋白，在超声破碎后病毒液、浓缩液、纯化液、原液中均可测定到病毒滴度明显高于不添加人血白蛋白，但在本发明的优选方式中，所述人血白蛋白在细胞液中的终浓度为1.5～10‰；较佳地2～6‰；更佳地2.5～5‰。从成本等方面考虑，3‰的人血白蛋白是尤为优选的。

本发明中，也优化了纯化过程的温度条件，水痘-带状疱疹病毒减毒株制备疫苗原液过程中，在超滤浓缩阶段以及层析阶段，降低温度有利于保存病毒活性，2～8℃的病毒回收率高。因而，在本发明的优选方式中，采用低温(2～8℃)超滤层析的方式进行超滤层析，明显地提高了病毒的滴度。

对于活病毒而言，一项重要的检测指标为病毒滴度，其受温度的影响较大，而本发明的温度条件的控制有效保证了病毒滴度。

从以上结果数据可知，使用不同洗脱线性流速进行层析，洗脱线性流速的提高有利于大大缩短单次层析时间、且病毒损失小，病毒回收率显著增加。然而，洗脱线性流速的提高也使得蛋白去除率有所下降。

本发明中，也分析了分子筛层析，通过将洗脱线性流速进行适当调控，可比较显著地提升病毒回收率。因而，在本发明的优选方式中，设置洗脱线性流速0.45～0.9cm/min；较佳地，设置洗脱线性流速0.5～0.8cm/min；较佳地，设置洗脱线性流速0.55～0.7cm/min。

本发明的技术方案的主要优异效果在于：

(1)采用本发明的纯化方法处理，经超滤浓缩、柱层析纯化病毒液，结合分阶段加入组合试剂1/组合试剂2，制备获得病毒原液。以蛋白质含量为考察指标，则计算得到本发明中纯化环节蛋白质去除率可达到99％以上；以病毒滴度为考察指标，则计算得到本发明中纯化环节最终病毒回收率可超过50％。以产量为考察指标，原对照组每个10层细胞工厂制得的1000ml，5.2LgPFU/ml病毒总量为1.58×10⁸PFU/层，进行工艺优化，现制得的10层细胞工厂260ml，6.1LgPFU/ml，病毒总量为3.2×10⁸PFU/层，产量提高1倍。

(2)本发明的生产工艺，几乎可以完全去除细胞碎片，只留下纯病毒，纯化疫苗的安全性和免疫原性更高，把体内副反应降到最低。解决了现有的水痘-带状疱疹病毒疫苗存在较高的安全性风险的问题。

(3)本发明的生产工艺，改变了现有技术中常规认为的分子筛层析剪切力大、不适合活病毒纯化的技术偏见。

(4)本发明的生产工艺，可良好地配合水痘减毒活疫苗生产实践，操作过程易于控制，耗时短，适于规模化的活病毒疫苗生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例通用方法

1、细胞复苏

将来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含5～10％新生牛血清的HDC培养液，使用1层细胞工厂恒温培养(温度37±1℃)。

2、细胞传代

弃去瓶内液体，加入0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，消化完成后加入细胞培养液，按1:2或1:4比例进行传代，补加入5～10％新生牛血清的HDC培养液，恒温培养(温度37±1℃)。

3、病毒接种

待所述传代培养过程中，细胞长满单层90％以上时，取水痘-带状疱疹病毒工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01，维持液为2～5％新生牛血清的HDC培养液，恒温培养(温度36±1℃)。

4、病毒收集

待病毒接种后，细胞的CPE达到70％时收获细胞，加入PBS洗涤细胞表面，然后加入EDTA消化液常温消化，优选地消化完成后加入如表3的处理试剂；摇晃至细胞全部脱落，放置-60℃以下保存。

5、超声破碎

将细胞收集液化冻后超声破碎感染细胞，经离心后去除细胞碎片，收集含有病毒的上清液。

6、超滤浓缩

将含有病毒的上清液采用100KD中空纤维膜进行超滤浓缩，浓缩倍数10-20倍，即为病毒浓缩液。优选地进行低温控制，如后续实施例中所述。

7、分子筛层析

将含有病毒的浓缩液用Sepharose 4FF层析柱采用分子筛层析方法进行纯化，制备原液。优选地在层析前后加入处理试剂，如后续实施例中所述。优选地进行低温控制，如后续实施例中所述。

实施例1、纯化程序的过程优化

1、材料与装置

应用细胞工厂培养技术培养MRC-5细胞后接种病毒培养，制备水痘-带状疱疹病毒(VZV毒株)病毒收集液。所用的细胞、病毒毒株培养基以及添加物如表1。

表1

所用的设备及材料如表2。

表2

2、方法

(1)细胞接种

将MRC-5细胞复苏、传代至细胞工厂(使用1层细胞工厂在37±1℃恒温培养)培养，长满后细胞量达1×10E+8个/层。

(2)细胞培养、病毒培养

细胞培养一定的代次后，按相同MOI接种VZV毒株至MRC-5细胞，进行病毒培养。

(3)病毒收集

获取细胞工厂中水痘-带状疱疹病毒感染的细胞，用EDTA消化病毒感染的细胞，并加入不同浓度的处理试剂，配方如下表3，获得病毒收集液(感染病毒的细胞液)，可放置-60℃以下保存。

表3

(4)超声破碎

将上一步骤获得的病毒收集液化冻后用超声波匀质机进行超声破碎，破碎后病毒细胞悬液进行离心，离心后取上清液，进行超滤浓缩，并检测病毒滴度和蛋白质含量。

(5)超滤浓缩

经4℃低温超声破碎离心后的病毒收集液，使用中空纤维膜进行浓缩，浓缩倍数为约10-20倍，即得病毒浓缩液。检测病毒滴度和蛋白质含量。

(6)分子筛层析

前述获得的病毒浓缩液，加入组合试剂1“谷氨酸钠+蔗糖”的组合试剂2(PBS+0.4‰谷氨酸钠+50‰蔗糖)。使用Sepharose 4FF凝胶层析柱4℃低温进行分离纯化，洗脱线性流速0.3cm/min，收集第一峰。得到纯化液即获得病毒原液。

3、结果

不同处理试剂下，超滤前后、层析后液量和病毒滴度结果如表4。病毒回收率和蛋白去除率结果如表5。

表4、各阶段结果

表5

4、结论

本领域以往的技术中，制备及纯化病毒活疫苗时，会在获得病毒收集液后进行浓缩、直接备于后续应用。然而，本发明人观测到，超滤浓缩工艺后虽然可以显著地降低病毒液体积且保留或一定程度提高病毒滴度、病毒回收率较高，病毒浓缩液中仍然有较多的杂蛋白，蛋白去除率难以满足要求(表4-5)。

为了解决蛋白去除率低的问题，本发明人进行了深入研究分析，确定通过在过程中适时利用添加剂进行活性保护并引入层析工艺的方案。本发明人观测到层析工艺会导致活病毒的活性丧失，为了解决这一问题，本发明人进行了上游工艺的优化，应用有效的添加成分(人血白蛋白)并在特定节点适时加入。在经水痘-带状疱疹病毒感染、收集细胞液的阶段(细胞破碎前)，在病毒收集液中添加如表3中的含有人血白蛋白的添加成分；进而再进行细胞超声破碎、离心去除杂质(超滤前)，与不添加时(病毒滴度为5.2LgPFU/ml)相比，适时添加人血白蛋白使得病毒滴度有提高(5.5-5.8LgPFU/ml)。超滤浓缩约10倍后，再制备的纯化液，病毒滴度可达6.6LgPFU/ml，比之不添加人血白蛋白提高显著。进一步地进行层析，此过程尽管在传统上并认为会导致病毒失活，但本发明在工艺优化后，比之超滤浓缩后病毒滴度有一定损失、但仍然维持高位，可达6.1LgPFU/ml(病毒回收率略有降低)。这样的滴度仍然可保证后期配制出适宜滴度的疱疹和水痘疫苗。

在保证滴度的情况下，优化工艺后蛋白质的去除率令人意外地升至99％以上(表5)，保证了疫苗的纯度。

因此，优选的纯化过程为：收集病毒液，超声破碎，超滤浓缩后得病毒浓缩液，经分子筛层析，制得原液。

本发明人考察了在细胞收集液中分别加入1‰、3‰、5‰不同浓度人血白蛋白后制备的超声破碎后病毒液、浓缩液、纯化液、原液中的病毒滴度，结果呈现明显高于不添加人血白蛋白。由于3‰、5‰浓度的人血白蛋白的病毒滴度结果接近，基于成本/收益方面考虑，选择添加3‰浓度的人血白蛋白相对更有优势。

关于添加时机，含有人血白蛋白的试剂在病毒收集后添加，本发明人考察了多个阶段添加效果后发现，在收获病毒收集液(感染病毒的细胞液)后、超声破碎前添加含有人血白蛋白的试剂，最终可以最好的病毒活性、蛋白去除率令人满意。在分子筛层析前后的样液中添加“谷氨酸钠+蔗糖”而无需再加入人血白蛋白；并且前期添加的少量人血白蛋白在层析过程中恰好被去除。如此，这一技术方案可以最大限度地保护病毒活性，且最大限度地去除蛋白。

实施例2、纯化程序的温度条件优化

1、材料与装置

应用细胞工厂培养技术培养MRC-5细胞后接种病毒培养，制备水痘-带状疱疹病毒(VZV毒株)病毒收集液。所用的细胞、病毒毒株培养基以及添加物同表1。

所用的设备及材料同表2。

2、方法

(1)细胞接种

将MRC-5细胞复苏、传代至细胞工厂培养，长满后细胞量达1×10E+8个/层。

(2)细胞培养、病毒培养

细胞培养一定的代次后，按相同MOI接种VZV毒株至MRC-5细胞，进行病毒培养。

(3)病毒收集

将细胞工厂中水痘-带状疱疹病毒感染的细胞，用EDTA消化病毒感染的细胞，并加入组合试剂1“3‰人血白蛋白+PBS+0.4‰谷氨酸钠+50‰蔗糖”(表3，编号3)，可放置-60℃以下保存。

(4)超声破碎

将上一步骤获得的病毒收集液化冻后用超声波匀质机进行超声破碎，破碎后病毒细胞悬液进行离心。

(5)超滤浓缩

经超声破碎离心后的病毒收集液，使用中空纤维膜进行浓缩，浓缩倍数为10-20倍，即得病毒浓缩液。

超滤浓缩时，比较不同温度处理对于后续过程的影响：实验组超滤浓缩温度为4℃，对照组超滤浓缩温度为室温。

(6)分子筛层析

前述获得的病毒浓缩液，加入含“谷氨酸钠+蔗糖”的组合试剂2(PBS+0.4‰谷氨酸钠+50‰蔗糖)。使用Sepharose 4FF凝胶层析柱进行分离纯化，洗脱线性流速0.3cm/min，收集第一峰，得到纯化液即获得病毒原液。

在进行分子层析时，比较不同温度的情况：在其它处理条件相同的条件下，实验组放置4℃预冷，层析温度设置4℃；对照组放置室温，层析温度为室温。

3、结果

超滤浓缩机层析时设置不同温度，超滤后和层析后病毒滴度结果如表6。病毒回收率如表7。

表6

表7

4、结论

水痘-带状疱疹病毒减毒株制备疫苗原液过程中，在超滤浓缩阶段以及层析阶段，降低温度有利于保存病毒活性，4℃的病毒回收率高。因而，采用低温(2～8℃)超滤层析的方式进行超滤层析，能明显的提高病毒的滴度。

实施例3、纯化过程中层析条件的优化

1、材料与装置

应用细胞工厂培养技术培养MRC-5细胞后接种病毒培养，制备水痘-带状疱疹病毒(VZV毒株)病毒收集液。所用的细胞、病毒毒株培养基以及添加物同表1。

所用的设备及材料同表2。

2、方法

(1)细胞接种

将MRC-5细胞复苏、传代至细胞工厂培养，长满后细胞量达1×10E+8个/层。

(2)细胞培养、病毒培养

细胞培养一定的代次后，按相同MOI接种VZV毒株至MRC-5细胞，进行病毒培养。

(3)病毒收集

获取细胞工厂中水痘-带状疱疹病毒感染的细胞，用EDTA消化病毒感染的细胞，并加入组合试剂1“3‰人血白蛋白+PBS+0.4‰谷氨酸钠+50‰蔗糖”(表3，编号3)，可放置-60℃以下保存。

(4)超声破碎

将上一步骤获得的病毒收集液化冻后用超声波匀质机进行超声破碎，破碎后病毒细胞悬液进行离心。

(5)超滤浓缩

经超声破碎离心后的病毒收集液，使用中空纤维膜进行浓缩，浓缩倍数为10-20倍，即得病毒浓缩液。

(6)分子筛层析

前述获得的病毒浓缩液，加入含“谷氨酸钠+蔗糖”的组合试剂2(PBS+0.4‰谷氨酸钠+50‰蔗糖)。使用Sepharose 4FF凝胶层析柱进行分离纯化，采用不同的洗脱线性流速，收集第一峰。得到纯化液即获得病毒原液。

不同的洗脱线性流速分别设置为如下：0.3cm/min，0.6cm/min或0.9cm/min。

3、结果

不同洗脱线性流速下，层析后蛋白质含量、病毒滴度结果如表8。层析后病毒回收率和蛋白去除率结果如表9。

表8、各阶段结果

表9

*病毒滴度单位为lg PFU/ml，表中的计算值按照未开Lg计算。

4、结论

从以上结果数据可知，使用不同洗脱线性流速进行层析，洗脱线性流速的提高有利于大大缩短单次层析时间、且病毒损失小，病毒回收率显著增加。然而，洗脱线性流速的提高也使得蛋白去除率有所下降。

通过将洗脱线性流速提高至0.6cm/min，病毒回收率可达75.9％，显著高于洗脱流速0.3cm/min的病毒回收率51.9％；可见，通过提高线性流速病毒回收率提高了46.2％。但是，继续提高洗脱线性流速至0.9cm/min，病毒回收率未见提高，可能是流速过大后剪切力造成病毒损失。

洗脱线性流速从0.3cm/min提高至0.6cm/min、0.9cm/min，蛋白回收率从99.1％降低至98.7％及98.4％。蛋白去除率呈降低趋势，但降低幅度相对较小。

同时也发现，洗脱线性流速在0.9cm/min进行上样时，上样柱压过大，易于导致层析柱使用寿命及柱效降低，增加装柱频次，不适用于批量生产。

因此，上样洗脱流速为0.6cm/min左右进行上样，可明显提高病毒滴度、减少纯化所需时间，且蛋白去除率仍然较为理想。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (13)

1.一种水痘-带状疱疹病毒疫苗原液的制备方法，其特征在于，所述水痘-带状疱疹病毒疫苗为活疫苗，所述方法包括：

(1) 以水痘-带状疱疹病毒感染病毒生产细胞以生产病毒，收获包含病毒感染细胞的细胞液；在细胞液中添加组合试剂1；所述组合试剂1由人血白蛋白2～6‰、谷氨酸钠0.2-0.6‰、蔗糖30-70‰以及PBS组成；

(2) 对(1)中细胞液进行超声破碎，获取上清液；进行超滤浓缩，获得浓缩液；

(3) 在(2)的浓缩液中加入组合试剂2；所述组合试剂2由谷氨酸钠0.2-0.6‰、蔗糖30-70‰以及PBS组成；进行分子筛层析，获得水痘-带状疱疹病毒疫苗原液；进行分子筛层析时，设置洗脱线性流速0.5～0.8 cm/min。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述病毒生产细胞为MRC-5细胞。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述组合试剂1中，

所述人血白蛋白在细胞液中的终浓度为2.5～5‰；或

所述谷氨酸钠在细胞液中的终浓度为0.3-0.5‰；或

所述蔗糖在细胞液中的终浓度为40～60‰。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，进行所述超滤浓缩时，温度为2～8℃。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，采用中空纤维膜进行所述超滤浓缩。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，(2)中，采用100KD中空纤维膜进行所述超滤浓缩。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，进行所述超滤浓缩后，浓缩的倍数为5-40倍。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，(2)中，进行所述超滤浓缩后，浓缩的倍数为10-20倍。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，进行所述分子筛层析时，温度为2～8℃。

10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，所述组合试剂2中，

所述谷氨酸钠在细胞液中的终浓度为0.3-0.5‰；或

所述蔗糖在细胞液中的终浓度为40-60‰。

11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，进行分子筛层析时，设置洗脱线性流速0.55～0.7 cm/min。

12. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，进行分子筛层析时，采用Sepharose4FF凝胶层析柱。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的病毒回收率超过50%，蛋白去除率超过98%。