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TW202448519A - 多彈頭抗體偶聯藥物及其製備方法和用途 - Google Patents

多彈頭抗體偶聯藥物及其製備方法和用途 Download PDF

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TW202448519A
TW202448519A TW113117406A TW113117406A TW202448519A TW 202448519 A TW202448519 A TW 202448519A TW 113117406 A TW113117406 A TW 113117406A TW 113117406 A TW113117406 A TW 113117406A TW 202448519 A TW202448519 A TW 202448519A
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家强 蔡
單愛林
鄧漢文
鄧春
宋帥
鄒鵬
肖亮
薛彤彤
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大陸商蘇州宜聯生物醫藥有限公司
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Abstract

本揭示涉及一種如式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物、其製備方法，以及其在預防和/或治療與細胞活動異常相關的疾病，包括但不限於在預防和/或治療腫瘤疾病中的用途。

Description

多彈頭抗體偶聯藥物及其製備方法和用途
本揭示要求申請日為2023/5/12的中國專利申請2023105357777、申請日為2023/11/21的中國專利申請2023115586664和申請日為2023/7/28的中國專利申請2023109434842的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本揭示屬於醫藥技術領域，涉及多彈頭抗體偶聯藥物、化合物、藥物連接體偶聯物及其製備方法，以及其在預防和/或治療與細胞活動異常相關的疾病，包括但不限於在預防和/或治療腫瘤疾病中的用途。
透過抗體偶聯藥物(Antibody Drug Conjugates, ADC)來提升細胞毒藥物的療效已經取得了很大的成功，目前已經有12個含有單一小分子毒素的ADC藥物在全球範圍內獲得批准上市。然而腫瘤具有高度異質性，單一作用機制的毒素治療作用有限；同時腫瘤在治療過程中也會產生耐藥，包括以PgP、ABCB1、ABCG2蛋白泵將毒素分子泵出細胞，從而逃避被殺滅。兩種含有不同毒素的ADC聯合給藥，雖然可能會克服這些問題，但其給藥極其不便，患者依從性差；同時使用同種抗體的ADC彼此會產生拮抗作用，治療效果大打折扣。因此，開發能夠克服抗耐藥的ADC非常具有吸引力，用於克服異質腫瘤細胞群體內對不同藥物敏感性。
為了提高ADC藥物的療效，目前已有專利揭示雙毒素ADC分子，多採用linker分枝技術(在linker上分出兩個乃至更多接頭)與相同的Drug偶聯，只是起到了增加DAR(Drug Antibody Ratio)值的作用，無法從機制上實現協同增效，而且目前沒有任何雙毒素ADC在臨床上獲得成功。因此，需要尋找能夠起到對抗腫瘤活性有協同作用的多毒素ADC存在難度。
由於每種毒素的作用機制、藥代性質、起效劑量、毒性劑量均有差異，這類雙毒素ADC中兩個不同毒素的大多數比例為1:1或其他固定比例，很顯然兩個毒素在藥效和毒理上不是合適的比例，達不到預期雙毒素的效果。如何透過新的偶聯技術靈活調整兩個或多個毒素的比例，讓兩個或多個毒素在相同的ADC劑量下能夠產生最佳藥效，同時降低毒性，讓ADC具有最佳安全窗，對腫瘤治療具有非常重要的意義。
已有的抗體偶聯藥物一般是透過ADC中的抗體和腫瘤細胞表面抗原結合，然後發生細胞內吞進入核內體(endosome)，再從核內體向溶酶體轉化，然後在溶酶體中水解酶的作用下將生物活性分子(毒素或payload)從ADC解離下來，解離下來的生物活性分子從溶酶體進入胞漿後毒殺腫瘤細胞，從毒殺腫瘤細胞後逃逸的生物活性分子可以進一步毒殺其周圍抗原不表達或低表達的腫瘤細胞(即所謂的旁觀者效應，by-stander effect)。在這整個過程中，任何一個環節的變化都可以使ADC產生耐藥性而失去治療效果，如治療過程中抗原表達發生變化，內吞減弱甚至失去內吞，核內體或溶酶體功能發生變化等等。因此尋找一種能在體內血液循環系統中穩定的ADC、同時這種ADC又能在腫瘤微環境中不需要細胞內吞而產生胞外裂解將毒素解離脫落來毒殺腫瘤，這種ADC將能克服傳統ADC存在的多種耐藥機制，因而在臨床治療上將具有非常重大的意義。
為了解決上述問題，本發明提供了一種多彈頭抗體偶聯藥物，以抗體或其抗原結合片段為原料，透過活性位點，偶聯合適數量的其他靶點的毒素-連接子(drug linker)，其中包含兩個或多個不同作用機制的生物活性分子，形成新的抗體偶聯物。
為此，在本揭示的第一方面，本揭示提供一種式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物， 式I 或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為抗體或其抗原結合片段； L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3可相同或不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，D 1、D 2和D 3可相同或不同；且當D 1、D 2和D 3相同時，L 1、L 2和L 3不同； n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時當n1、n2、n3中有一個為0時，另外兩個不為0。
在一些實施方案中，n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，且n1、n2、n3中有一個為0，另外兩個不為0。
在一些實施方案中，所述式I中與T相連的S原子並非另外再外接的硫原子，而是打開雙硫鍵後的T自身所含有巰基與連接子進行連接後形成的-S-。
在一些實施方案中，所述式I中與T相連的S原子均源自抗體T中的二硫鍵。
在一些實施方案中，T為抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv(例如，scFv)、dAb、互補決定區片段、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、全人抗體、前抗(Probody)、單克隆抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
在一些實施方案中，T為非工程化抗體。
在一些實施方案中，L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3可相同或不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，且D 1、D 2和D 3不同。
在一些實施方案中，L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，且D 1、D 2和D 3相同。
在一些實施方案中，n1選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數。
在一些實施方案中，n2選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數。
在一些實施方案中，n3選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3可相同或不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，且D 1、D 2和D 3不同； n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時當n1、n2、n3中有一個為0時，另外兩個不為0。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，且D 1、D 2和D 3相同； n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時當n1、n2、n3中有一個為0時，另外兩個不為0。
在一些實施方案中，L 1、L 2和L 3選自可裂解的連接子和不可裂解的連接子。
在一些實施方案中，L 1、L 2和L 3選自可在腫瘤微環境中裂解的連接子。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1、L 2和L 3中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3可相同或不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，且D 1、D 2和D 3不同； n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時當n1、n2、n3中有一個為0時，另外兩個不為0； 所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1和L 2中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1和D 2，L 1和L 2可相同或不同； D 1和D 2為藥物單元，且D 1和D 2不同； n1、n2各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時n1、n2兩個不為0； 所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1和L 3中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1和D 3，L 1和L 3可相同或不同； D 1和D 3為藥物單元，且D 1和D 3不同； n1、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時n1、n3兩個不為0； 所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1和L 2中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1和D 2，L 1和L 2可相同或不同； D 1和D 2為藥物單元，且D 1和D 2不同； n1、n2各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時n1、n2兩個不為0； n3為0； 所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1和L 3中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1和D 3，L 1和L 3可相同或不同； D 1和D 3為藥物單元，且D 1和D 3不同； n1、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時n1、n3兩個不為0； n2為0； 所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵。
在一些實施方案中，所述連接子包含胺基酸殘基或2-10個胺基酸殘基組成的短肽。優選地，所述連接子包含二肽、三肽或四肽。
在一些實施方案中，所述胺基酸殘基選自Val、Ala、Gly、Cit、Arg、Phe、Lys、Asn和經取代修飾的上述胺基酸殘基。
在一些實施方案中，所述二肽選自Val-Cit、Val-Ala、Ala-Ala、Val-Lys和經取代修飾的上述二肽。
在一些實施方案中，所述三肽選自Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Val-Lys-Gly、Ala-Lys-Gly、Gly-Lys-Gly、Val-Lys-Ala、Ala-Lys-Ala、Gly-Lys-Ala和經取代修飾的上述三肽。
在一些實施方案中，所述四肽選自Gly-Gly-Phe-Gly和Gly-Gly-Val-Ala和經取代修飾的上述四肽。
在一些實施方案中，所述連接子選自如下結構 ， 其中， La為接頭單元，其共價結合T和Lb; Lb為連接單元，其共價結合La和Lc; Lc為胺基酸殘基或2-10個胺基酸殘基組成的多肽、 、 或 ；所述的胺基酸殘基選自天然胺基酸殘基、非天然胺基酸殘基、經過取代修飾的胺基酸殘基或其立體異構體；其共價結合Lb和Ld； Ld為直接鍵或間隔單元，其共價結合Lc和藥物單元。 在一些實施方案中，La選自雜芳基、部分飽和的雜芳基、雜芳基聯芳基、雜芳基聯雜芳基、雜環基、氧代的雜環基、馬來醯亞胺、環烯基、烷基醯胺基、環烷基羰基、雜環烷基羰基、烯基醯胺基、 、 、 、 ，其中R p選自C1-6烷基、-(CH 2CH 2O) qH、-(CH 2CH 2O) q-C1-6烷基，q選自0-30之間的任意整數，1位和S原子相連，2位與Lb相連。
在一些實施方案中，L a選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ，1位和S原子相連，2位與Lb相連。
在一些實施方案中，La選自 、 、 ，1位和S原子相連，2位與Lb相連。
在一些實施方案中，La選自 和 ，1位和S原子相連，2位與Lb相連。
在一些實施方案中，La選自 ，1位和S原子相連，2位與Lb相連。
在一些實施方案中，Lb為 、 、 、 、 、 ；1位和La相連，2位和Lc相連； 其中， W選自-CR x1R x2-， R x1、R x2各自獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10環烷基、4-10元雜環基； 或者，R x1與R x2和與它們共同相連的碳原子一起，形成3-6元碳環或3-6元雜環； Y各自獨立地選自-O-、-CH 2-、-OCH 2CH 2-、-CH 2CH 2O-或一至多個上述基團的任意組合； X選自-CR x3R x4-和-NR x5-； R x3、R x4、R x5各自獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10環烷基、4-10元雜環基； 或者，R x3與R x4和與它們共同相連的碳原子一起，形成3-6元碳環或3-6元雜環； m1、m2各自獨立地選自0、1、2、3、4、5； m選自0-10之間的任意整數；優選地，m選自1、2、3、4、5、6、7、8。
在一些實施方案中，W選自-CH 2-。
在一些實施方案中，X選自-CR x3R x4-，R x3、R x4各自獨立地選自氫或甲基。
在一些實施方案中，Lb為 。
在一些實施方案中，Lb選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和La相連，2位和Lc相連。
在一些實施方案中，Lb選自 、 、 、 、 和 ，1位和La相連，2位和Lc相連。
在一些實施方案中，Lb選自 、 和 ，1位和La相連，2位和Lc相連。
在一些實施方案中，Lb選自 和 ，1位和La相連，2位和Lc相連。
在一些實施方案中，Lc為胺基酸殘基或2-10個胺基酸殘基組成的短肽。所述的胺基酸殘基選自天然胺基酸殘基、非天然胺基酸殘基、經過取代修飾的胺基酸殘基或其立體異構體。優選為二肽、三肽或四肽。
在一些實施方案中，Lc選自Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和經取代修飾的上述二肽、三肽或四肽。
在一些實施方案中，Lc選自 、 、 、 、 、 和 ，
其中，R 1、R 2各自獨立地選自氫、C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基)、C3-6環烷基(例如環丙基)；優選地，R 1、R 2同時為甲基、乙基或丙基，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Lc選自 、 和 ， 其中，R 1、R 2各自獨立地選自氫、C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基)、C3-6環烷基(例如環丙基)；優選地，R 1、R 2同時為甲基、乙基或丙基，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Lc為可在腫瘤微環境中裂解片段，優選 或 ，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Lc選自 、 、 和 ，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Lc選自 、 和 ，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Lc為可在腫瘤微環境中裂解片段，優選 或 ，1位與Lb相連，2位與Ld相連。
在一些實施方案中，Ld選自直接鍵、 、 、 、 、 、 和 ，1位與Lc相連，2位與藥物單元相連。
在一些實施方案中，Ld選自直接鍵、 和 ，1位與Lc相連，2位與藥物單元相連。
在一些實施方案中，L 1、L 2和L 3各自獨立地選自以下結構：
其中，1位和S原子相連，2位和藥物單元相連；R 1、R 2各自獨立地選自氫、C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基)、C3-6環烷基(例如環丙基)；優選地，R 1、R 2同時為甲基、乙基或丙基。
在一些優選的實施方案中，L 1、L 2和L 3各自獨立地選自以下結構：
其中，1位和S原子相連，2位和藥物單元相連；R 1、R 2各自獨立地選自H、C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基)、C3-6環烷基(例如環丙基)；優選地，R 1、R 2同時為甲基、乙基或丙基。
在一些優選的實施方案中，L 1、L 2和L 3各自獨立地選自以下結構：
其中，1位和S原子相連，2位和藥物單元相連。
在一些實施方案中，L 1為 ，優選為 。
在一些實施方案中，L 2為 或 ，優選為 。
在一些實施方案中，L 3為 或 ，優選為 。
在一些實施方案中，D 1、D 2、D 3為生物活性分子片段。
在一些實施方案中，所述的生物活性分子選自但不限於：放射性同位素，例如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32、Pb 212和Lu的放射性同位素；金屬配合物，例如金屬鉑配合物(例如奧沙利鉑)、金屬金配合物；糖肽類抗生素，例如博來黴素或平陽黴素；糖皮質激素類藥，例如潑尼松、潑尼松龍或地塞米松；鈣調磷酸酶抑制劑，例如環孢素、他克莫司；烷化劑，例如氮芥、苯丁酸氮芥、環磷醯胺、白消安、絲裂黴素C或美法侖；DNA拓撲異構酶抑制劑，包括拓撲異構酶I抑制劑，例如喜樹鹼類衍生物；拓撲異構酶II抑制劑，例如放線菌素D、阿黴素、多柔比星、多卡米星，柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、奈莫柔比星、PNU-159682或依託泊苷；干擾DNA合成藥物，例如甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他濱、巰嘌呤、噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、奈拉濱、Pyrrolobenzodiazepine dimers(PBD)類、杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物；作用於結構蛋白的藥物，包括微管蛋白抑制劑，例如長春花生物鹼類、長春新鹼、艾日布林及其衍生物、長春鹼、Tubulysins類、美登素類衍生物、MMAE/MMAF及其衍生物、紫杉醇、埃博黴素、多西他賽或卡巴他賽、考布他汀及其衍生物；腫瘤信號通路抑制劑，例如絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、天冬胺酸激酶抑制劑或組胺酸激酶抑制劑；蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米、伊沙佐米、卡非佐米；蛋白酶抑制劑，例如卡馬黴素A或卡馬黴素B；組蛋白去乙醯化酶抑制劑；腫瘤新生血管生成抑制劑；細胞週期蛋白抑制劑；核酸類藥物，例如反義寡核苷酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、microRNA、核酸適配體(Aptamer)、信使RNA(mRNA)；免疫調節劑，例如胸腺素、左旋咪唑、Toll樣受體調節劑、STING調節劑；毒素，諸如小分子毒素：鵝膏毒素(amatoxin)或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；甾體皂苷類物質；泰蘭司他丁及其類似物，例如thailanstatin A；BCL-xl/BCL2抑制劑；以及其它抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡或壞死的活性物質。
在一些實施方案中，D 1、D 2和D 3各自獨立地選自但不限於微管蛋白抑制劑，例如MMAE/MMAF及其衍生物、艾日布林及其衍生物、美登素類衍生物；拓撲異構酶抑制劑，例如喜樹鹼類衍生物；干擾DNA合成藥物，例如杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物。
在一些實施方案中，D 1、D 2和D 3各自獨立地選自MMAE/MMAF及其衍生物、艾日布林及其衍生物、喜樹鹼類衍生物、杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物。
在一些優選的實施方案中，所述喜樹鹼類衍生物選自以下結構：
。
在一些優選的實施方案中，所述喜樹鹼類衍生物選自以下結構：
。
在一些實施方案中，所述喜樹鹼類衍生物為 。
在一些實施方案中，D 1為喜樹鹼類衍生物。
在一些實施方案中，所述艾日布林衍生物選自以下結構： 、 。
在一些優選的實施方案中，所述艾日布林衍生物選自以下結構： 。
在一些實施方案中，所述杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物選自以下結構： 、 、 。
在一些優選的實施方案中，所述杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物選自以下結構： 。
在一些實施方案中，D 2為艾日布林及其衍生物、杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物。
在一些實施方案中，D 2為艾日布林及其衍生物。
在一些實施方案中，D 2為杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物。
在一些實施方案中，D 2為杜卡黴素及其衍生物。
在一些實施方案中，D 2為卡奇黴素及其衍生物。
在一些實施方案中，所述MMAE/MMAF及其衍生物選自以下結構：
。
在一些優選的實施方案中，所述MMAE/MMAF及其衍生物選自以下結構：
。
在一些優選的實施方案中，所述MMAE/MMAF及其衍生物為 。
在一些實施方案中，D 3為MMAE/MMAF及其衍生物。
在一些實施方案中，-L 1-D 1 、-L 2-D 2 、-L 3-D 3選自本揭示任一方案所述的L 1、L 2、L 3和D 1、D 2、D 3的任意組合。
在一些實施方案中，-L 1-D 1選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，-L 1-D 1選自下述結構片段： 、 、 、 和 。
在一些優選的實施方案中，-L 1-D 1選自下述結構片段： 、 和 。
在一些優選的實施方案中，-L 1-D 1為 。
在一些實施方案中，-L 2-D 2選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，-L 2-D 2選自下述結構片段： 、 、 和 。
在一些優選的實施方案中，-L 2-D 2優選為 。
在一些優選的實施方案中，-L 2-D 2選自下述結構片段： 。
在一些實施方案中，-L 3-D 3選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，-L 3-D 3選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些優選的實施方案中，-L 3-D 3選自下述結構片段： 、 、 和 。
在一些優選的實施方案中，-L 3-D 3為 。
在一些實施方案中，T選自結合如下靶標的抗體：表皮生長因子、整合素α5β6、整合素α4β7、0772P、5T4、ACTA2、ADGRE1、AGS-16、AIF1、AKR1C1、AKR1C2、ANGPTL4、ApoE、ASLG659、BAFF-R、BMPR1B、BNIP3、Brevican、C1QA、C1QB、CA6、pCAD、P-cadherin、CADM1、CCL5、CCR5、CDl lb、CD1 lc、CD19、CD20、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45 (PTPRC)、CD49D (ITGA4)、CD56、CD66e、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD80、CD138、CD223、CDCP1、CDH11、Claudin18.2、COL6A3、COL7A1、CRIPTO、CSF1R、CTGF、CTSD、CTSS、CXCL10、CXCL11、CXCR5、DDIT4、DLL3、DLL4、DR5、E16、EFNA4、B7H3、EGFR、EGFRvIII、EGLN、EGLN3、EMR2、Endothelin receoptor、ENPP3、EpCAM、EphB2R、ETBR、FGF2、FGFR2、FcRH1、FcRH2、GEDA、GPNMB、GZMB、Her2、Her3、HLA-DOB、HMOX1、IFNG、IFI6、IGF-1R、IGFBP3、IL10RA1、IL20Rα、IL-6、IRTA2、KISS1R、KRT33A、LOX、LRRC15、LUM、LY6E、LY64、LY86、LYPD3、MCPT8、MDP、Mesothelin、c-Met、MFI2、MMP10、MMP14、MMP16、MPF、MSG783、MS4A7、MUC 1、MUC16、NaPi2b、NaPi3b、NCA、Nectin 4、NOG、P2X5、PD-L1、PDK1、PDGFRA、PFKFB3、PGF、PGK1、PIK3AP1、PIK3CD、PLOD2、PSCA、PSCA hlg、PSMA、RNF43、ROR1、Sema5b、SERPINEl、SLC39A6、SLITRK6、SLTRK6、STAT1、STC2、STEAP1、STEAP2、TCF4、TENB2、TGF、TGFBR1、TGFB2、Tissue factor、TNFRSF21、TNFSF9、Trop-2、TrpM4、Tyro7、UPK1B、VEGFA和WNT5A。
在一些實施方案中，T為抗Her2的抗體或其抗原結合片段、抗B7H3的抗體或其抗原結合片段或抗Trop-2的抗體或其抗原結合片段。
在一些優選的實施方案中，T為抗Her 2的抗體，例如為曲妥珠單抗或帕妥珠單抗，優選為曲妥珠單抗。
在一些優選的實施方案中，T為抗B7H3的抗體，例如為1D1、1D1-01、2E3，2E3-02抗體、enoblituzumab，mirzotamab，omburtamab。
在一些實施方案中，T為抗Trop-2的抗體，例如為Sacituzumab。
在一些優選的實施方案中，所述式I所示的雙彈頭抗體偶聯物，或所述雙彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物； 其中， n1、n2各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n3為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 2為艾日布林及其衍生物； T、L 1、L 2的定義如本揭示中任一方案所述。
優選地，L 1和L 2中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子。
在一些優選的實施方案中，所述式I所示的雙彈頭抗體偶聯物，或所述雙彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物； 其中， n1、n2各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n3為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 2為杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物； T、L 1、L 2的定義如本揭示中任一方案所述。
優選地，L 1和L 2中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子。
在一些優選的實施方案中，n1+n2約等於8，n1/n2約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5。
在一些優選的實施方案中，n1+n2約等於7~8，例如約等於8；n1/n2約等於1~8，例如約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5。
在一些優選的實施方案中，n1+n2約等於4，n1/n2約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5或4。
在一些優選的實施方案中，所述式I所示的雙彈頭抗體偶聯藥物，或所述雙彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物； 其中， n1、n3各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n2為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 3為MMAE/MMAF及其衍生物； T、L 1、L 3的定義如本揭示中任一方案所述。
優選地，L 1和L 3中至少一個為可在腫瘤微環境中裂解的連接子。
在一些優選的實施方案中，n1+n3約等於8，n1/n3約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5。
在一些優選的實施方案中，n1+n3約等於7~8，例如約等於8；n1/n3約等於1~8，例如約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5；n1/n3優選約等於2.5~3.5，例如約等於3。
在一些優選的實施方案中，n1+n3約等於4，n1/n2約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5或4。
在一些優選的實施方案中，所述式I所示的雙彈頭抗體偶聯藥物，或所述雙彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物； 其中， n2、n3各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n1為0； D 2為艾日布林及其衍生物； D 3為MMAE/MMAF及其衍生物； T、L 2、L 3的定義如本揭示中任一方案所述。
在一些優選的實施方案中，n2+n3約等於8，n3/n2約等於1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物選自：
。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物選自： 、 、 、 、 、 ，其中T為抗Her 2的抗體，例如為曲妥珠單抗或帕妥珠單抗，優選為曲妥珠單抗。
在一些實施方案中，式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物選自： ，其中T為抗B7H3的抗體，例如為1D1、1D1-01、2E3，2E3-02抗體、enoblituzumab，mirzotamab，omburtamab。
本揭示還提供式I所示多彈頭抗體偶聯藥物或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物的製備方法，令人驚奇的發現，透過本揭示的製備方法能夠靈活調整兩個或多個毒素的比例。
所述方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和任選的Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2 、Lg-L 3-D 3的確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應； 其中： 當L 1、L 2、L 3的連接子中含有 時，Lg-L 1、Lg-L 2、Lg-L 3含有 ； 當L 1、L 2、L 3的連接子中含有 時，Lg為和T(SH)n反應時的離去基團；優選地，Lg選自鹵素、碸基、三級胺鹽基(Me3N+、Et3N+)、重氮鹽基、-OMs、MeSO 2-、CF 3SO 3-；更優選地，Lg選自F、MeSO2-； L 1、D 1、L 2、D 2、L 3、D 3、n1、n2、n3的定義如本揭示中任一方案所述。
在一些實施方案中，所述偶聯反應在水和/或有機溶劑中進行。
在一些實施方案中，所述有機溶劑選自N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、N-甲基吡咯烷酮、腈類(例如乙腈)、醇類(例如甲醇、乙醇)或其任意組合。
在一些實施方案中，所述方法進一步包括將偶聯產物進行純化的步驟。
在一些實施方案中，透過層析方法對所述偶聯產物進行純化。
在一些實施方案中，所述層析方法包括離子交換層析、疏水層析、反相層析或親和層析中的一種或多種。
在一些實施方案中，所述方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應；所述L 1、D 1、L 2、D 2、Lg、T的定義如本揭示中任一方案所述。
在一些實施方案中，所述Lg-L 1-D 1和Lg-L 2-D 2的確定比例為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5；優選1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5。
在一些實施方案中，所述方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n，在合適的溶劑中依次加入或同時加入確定比例的Lg-L 1-D 1和Lg-L 2-D 2進行偶聯反應。
在一些實施方案中，所述方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和Lg-L 1-D 1 、Lg-L 3-D 3確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應；所述L 1、D 1、L 3、D 3、Lg、T的定義如本揭示中任一方案所述。
在一些實施方案中，所述Lg-L 1-D 1和Lg-L 3-D 3的確定比例為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5；優選1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5。
在一些實施方案中，所述方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n，在合適的溶劑中依次加入或同時加入確定比例的Lg-L 1-D 1和Lg-L 3-D 3進行偶聯反應。
在一些實施方案中，Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2 、Lg-L 3-D 3選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 1-D 1選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 1-D 1選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 1-D 1選自任選的下列所示化合物， 、 和 。
在一些實施方案中，所述Lg-L 1-D 1為 。
在一些實施方案中，Lg-L 2-D 2選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 2-D 2選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 。
在一些實施方案中，Lg-L 2-D 2為 。
在一些實施方案中，Lg-L 2-D 2為 。
在一些實施方案中，Lg-L 3-D 3選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 3-D 3選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，Lg-L 3-D 3選自任選的下列所示化合物， 、 、 、 。
在一些實施方案中，Lg-L 3-D 3為 。
本揭示還提供藥物連接體偶聯物，或所述藥物連接體偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其結構如下： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
本揭示還提供藥物連接體偶聯物Lg-L 1-D 1、Lg-L 2-D 2、Lg-L 3-D 3的製備方法，其包括：將Lg-L 1-Lg 1、Lg-L 2-Lg 2、Lg-L 3-Lg 3和與之相對應的D 1、D 2、D 3反應， 例如： Lg-L 1-Lg 1+D 1→Lg-L 1-D 1； Lg-L 2-Lg 2+D 2→Lg-L 2-D 2； Lg-L 3-Lg 3+D 3→Lg-L 3-D 3； 其中，Lg、L 1、D 1、L 2、D 2、L 3、D 3定義如本揭示中任一方案所述，Lg 1、Lg 2、Lg 3各自獨立地選自羥基、鹵素、活化的羥基，如羥基、氯、溴、 、 、 、 或 。
具體地： 通式所示化合物12-9與艾日布林進行縮合反應得到目標化合物DL012。透過12-9的類似物與不同的藥物分子進行縮合反應可以獲得多種結構的藥物連接體偶聯物Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2 、Lg-L 3-D 3。 。
本揭示提供連接體Lg-L 1-Lg 1、Lg-L 2-Lg 2、Lg-L 3-Lg 3。本揭示還提供Lg-L 1-Lg 1、Lg-L 2-Lg 2、Lg-L 3-Lg 3的製備方法，其中，Lg、L 1、L 2、L 3、Lg 1、Lg 2、Lg 3的定義如本揭示中任一方案所述。
具體地： 通式所示化合物12-1透過取代、偶聯、水解、氧化得到通式所示化合物12-5，再經過縮合等反應獲得通式所示化合物12-9。透過類似的取代、偶聯、水解、氧化等反應可獲得12-5的類似物，再透過類似的縮合反應可以獲得各種結構的Lg-L 1-Lg 1、Lg-L 2-Lg 2、Lg-L 3-Lg 3。 。
本揭示提供藥物D 1、D 2、D 3。本揭示還提供藥物D 1、D 2、D 3的製備方法，其中，D 1、D 2、D 3的定義如本揭示中任一方案所述，例如：MMAE/MMAF及其衍生物、艾日布林及其衍生物、美登素類衍生物、喜樹鹼類衍生物等，可在一個或多個化學反應步驟中由母體化合物產生。
具體地： 通式所示化合物6-13透過與N-甲基羥乙胺縮合獲得目標化合物6-14。MMAE/MMAF、艾日布林、喜樹鹼等透過與不同的片段發生類似的縮合反應可以獲得各種結構的D 1、D 2、D 3。 。
本揭示提供了前述的藥物、或所述藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物用於製備抗體偶聯藥物的用途。
本揭示提供了前述的藥物、或所述藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物用於製備多彈頭抗體偶聯藥物的用途。
本揭示提供了前述的藥物連接體偶聯物、或所述藥物連接體偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物用於製備抗體偶聯藥物的用途。
本揭示提供了前述的藥物連接體偶聯物、或所述藥物連接體偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物用於製備多彈頭抗體偶聯藥物的用途。
本揭示提供了一種藥物組合物，其包含前述的多彈頭抗體偶聯藥物、或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物；以及任選的一種或多種藥用輔料。
本揭示提供了前述的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物；或者前述的藥物組合物在製備治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病(例如癌症疾病)的藥物中的用途。
本揭示提供了前述的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物；或者前述的藥物組合物，其用於治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病(例如癌症疾病)。
本揭示提供了預防和/或治療與細胞活動異常相關的疾病(例如癌症疾病)的方法，其包括：給予有需要的個體預防和/或治療有效量的前述的多彈頭抗體偶聯藥物，或所述的多彈頭抗體偶聯藥物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物；或者前述的藥物組合物。
在一些實施方案中，所述癌症疾病為實體腫瘤和/或血液腫瘤。
在一些實施方案中，所述癌症疾病選自食管癌(例如食管腺癌和食管鱗狀細胞癌)、腦瘤、肺癌(例如小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌)、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤(例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤)、前列腺癌或甲狀腺癌；優選選自胃癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和乳腺腺癌。
在一些具體實施方案中，所述癌症疾病選自HER2高表達或HER2低表達的腫瘤；所述HER2高表達的腫瘤優選乳腺腺癌，所述HER2低表達的腫瘤優選胃癌和/或乳腺癌。
在一些具體實施方案中，所述癌症疾病選自耐藥的腫瘤，所述耐藥是指包括單毒素ADC耐藥、單毒素ADC聯合用藥耐藥；所述耐藥的腫瘤選自食管癌(例如食管腺癌和食管鱗狀細胞癌)、腦瘤、肺癌(例如小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌)、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤(例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤)、前列腺癌或甲狀腺癌；優選的所述耐藥的腫瘤中ABCB1或ABCG2轉運體過表達；所述耐藥的腫瘤優選為對Enhertu耐藥的胃癌。 定義：
在本揭示中，除非另有說明，否則本揭示中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本揭示中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本揭示，下面提供相關術語的定義和解釋。
如本揭示所使用，術語“藥學上可接受的鹽”的例子是由形成藥學上可以接受的陰離子的有機酸形成的有機酸加合鹽，包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽、α-甘油磷酸鹽、烷基磺酸鹽或芳基磺酸鹽；優選地，所述烷基磺酸鹽為甲基磺酸鹽或乙基磺酸鹽；所述芳基磺酸鹽為苯磺酸鹽或對甲苯磺酸鹽。也可形成合適的無機鹽，包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽等。
藥學上可接受的鹽可使用本領域熟知的標準程序獲得，例如，透過將足量的鹼性化合物和提供藥學上可以接受的陰離子的合適的酸反應。
如本揭示所使用，術語“立體異構體”表示由於至少一個不對稱中心形成的異構體。在具有一個或多個(例如一個、兩個、三個或四個)不對稱中心的化合物中，其可產生外消旋混合物、單一對映異構體、非對映異構體混合物和單獨的非對映異構體。特定個別分子也可以幾何異構體(順式/反式)存在。類似地，本發明的化合物可以兩種或更多種處於快速平衡的結構不同的形式的混合物(通常稱作互變異構體)存在。互變異構體的代表性實例包括酮-烯醇互變異構體、苯酚-酮互變異構體、亞硝基-肟互變異構體、亞胺-烯胺互變異構體等。要理解，本揭示的範圍涵蓋所有這樣的以任意比例(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)的異構體或其混合物。
本揭示中可使用實線(——)、實楔形或虛楔形描繪本發明的化合物的碳-碳鍵。使用實線以描繪鍵連至不對稱碳原子的鍵欲表明，包括該碳原子處的所有可能的立體異構體(例如，特定的對映異構體、外消旋混合物等)。使用實或虛楔形以描繪鍵連至不對稱碳原子的鍵欲表明，存在所示的立體異構體。當存在於外消旋混合物中時，使用實及虛楔形以定義相對立體化學，而非絕對立體化學。除非另外指明，否則本發明的化合物意欲可以立體異構體(其包括順式及反式異構體、光學異構體(例如R及S對映異構體)、非對映異構體、幾何異構體、旋轉異構體、構象異構體、阻轉異構體及其混合物)的形式存在。本發明的化合物可表現一種以上類型的異構現象，且由其混合物(例如外消旋混合物及非對映異構體對)組成。
本揭示的化合物可以溶劑合物(優選水合物)的形式存在，其中本揭示的化合物包含作為所述化合物晶格的結構要素的極性溶劑，特別是例如水、甲醇或乙醇。極性溶劑特別是水的量可以化學計量比或非化學計量比存在。
本揭示在其範圍內進一步包括本發明的化合物的前藥。通常這樣的前藥會是所述化合物的官能團衍生物，其易於在體內轉化成期望的治療活性化合物。因此，在這些情況中，用於本揭示的治療方法的術語“給藥”應包括用所要求保護的化合物中的一種或多種的前藥形式來治療各種疾病或病症，但是在向個體給藥後所述前藥形式在體內轉化成上述化合物。例如，在“Design of Prodrug”,ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985中，描述了選擇和製備適合的前藥衍生物的常規方法。
本揭示中，所述藥用輔料是指生產藥品和調配處方時，使用的賦形劑和附加劑，是指除活性成分外，在安全性方面已進行了合理的評估，並且包含在藥物製劑中的物質。藥用輔料除了賦型、充當載體、提高穩定性外，還具有增溶、助溶、緩控釋等重要功能，是可能會影響到藥品的質量、安全性和有效性的重要成分。根據其來源可分為天然物、半合成物和全合成物。根據其作用與用途可分為：溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、濕潤劑、滲透壓調節劑、穩定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏著劑、抗氧劑、螯合劑、滲透促進劑、pH調節劑、緩衝劑、增塑劑、表面活性劑、發泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑等；根據其給藥途徑可分為口服、注射、黏膜、經皮或局部給藥、經鼻或口腔吸入給藥和眼部給藥等。同一藥用輔料可用於不同給藥途徑的藥物製劑，且有不同的作用和用途。
所述藥物組合物可根據給藥途徑製成各種適宜的劑型。例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、散劑、酊劑、糖漿劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、乳膏劑、糊劑、眼用製劑、丸劑、植入劑、氣霧劑、粉霧劑、噴霧劑等。其中，所述的藥物組合物或適宜的劑型可以含有0.01mg至1000mg的本揭示的化合物或其藥學上可接受的鹽或偶聯物，適宜含有0.1mg至800mg，優選含有0.5-500mg，優選含有0.5至350mg，特別優選1-250mg。
所述藥物組合物可以注射劑形式用藥，包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發油也可用作溶劑或懸浮介質，如單甘油酯或二甘油酯。所述藥物組合物可以輸液形式用藥。
本揭示使用的術語“治療”一般是指獲得需要的藥理和/或生理效應。該效應根據完全或部分地預防疾病或其症狀，可以是預防性的；和/或根據部分或完全穩定或治癒疾病和/或由於疾病產生的副作用，可以是治療性的。本揭示使用的“治療”涵蓋了對患者疾病的任何治療，包括：(a)預防易感染疾病或症狀但還沒診斷出患病的患者所發生的疾病或症狀；(b)抑制疾病的症狀，即阻止其發展；或(c)緩解疾病的症狀，即，導致疾病或症狀退化。
在本揭示中，術語“個體”包括人或非人動物。示例性人個體包括患有疾病(例如本揭示所述的疾病)的人個體(稱為患者)或正常個體。本揭示中術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如非哺乳動物(例如鳥類、兩棲動物、爬行動物)和哺乳動物，例如非人靈長類、家畜和/或馴化動物(例如綿羊、犬、貓、奶牛、豬等)。
本揭示中，術語“有效劑量”指被給藥後會在一定程度上緩解所治療病症的一種或多種症狀的多靶向配體‑藥物偶聯物、藥物連接體偶聯物、化合物或組合物的量。
本揭示中，術語“多彈頭抗體偶聯藥物”是指一種帶有2個或者3個不同毒素分子(payload)的抗體偶聯藥物ADC的藥物分子。這種雙彈頭或者三彈頭抗體偶聯藥物可以透過不同毒素(payload)的作用機理殺死腫瘤細胞，從而增加雙彈頭或者三彈頭抗體偶聯藥物的抗腫瘤效果，減少耐藥性的發生速度。
本揭示中，術語“藥物”指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
除非本揭示中另有說明，文中所用的化合物的“衍生物”是指具有與化合物相似的化學結構但還含有至少一個化合物中不存在的化學基團和／或缺少至少一個化合物中存在的化學基團的物質。衍生物所比較的化合物被稱為“母體”化合物。通常，“衍生物”可在一個或多個化學反應步驟中由母體化合物產生。
本揭示中，術語“連接子”是指將生物活性化合物片段(藥物分子、藥物單元)與藥代調控片段部分(抗體或其抗原結合片段)連接起來的片段。
本揭示中，術語“可在腫瘤微環境中裂解的連接子”是指連接子具有不需要細胞內吞即可在腫瘤微環境中裂解能力，從而將毒素在腫瘤微環境中解離脫落，例如 、 。
本揭示中，術語“藥代調控片段”取其最廣義的解釋，是指能夠調節分子的藥代動力學性質，如增加腫瘤暴露量，延長藥物作用時間，這種藥代調控片段包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體以及由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，腫瘤細胞表面受體的配體，包括小分子配體，C3-40個胺基酸殘基的肽，只要它們具有所需的生物學活性，聚乙二醇，長鏈脂肪烴。
本揭示中，語“短肽”是指由2~10個胺基酸組成的肽，又稱寡肽或低聚肽。
本揭示中，除非以其他方式明確指出，在本揭示中通篇採用的描述方式“各…獨立地選自”和“…各自獨立地選自”可以互換，均應做廣義理解，其既可以是指在不同基團中，相同或不同的符號之間所表達的具體選項之間互相不影響，也可以表示在相同的基團中，相同或不同的符號之間所表達的具體選項之間互相不影響。
本揭示中，對於通式中的“-S-”(S原子)本領域技術人員可以理解的是，連接子與打開二硫鍵(例如，透過還原劑TCEP還原二硫鍵可以打開二硫鍵，生成巰基-SH)後的T(如抗體)自身所含有巰基進行連接，也就是說，連接子與T之間的-S-並非另外再外接的硫原子。
本揭示中，對於“和S原子相連”，本領域技術人員可以理解的是，連接子與打開二硫鍵(例如，透過還原劑TCEP還原二硫鍵可以打開二硫鍵，生成巰基-SH)後的T(如抗體)自身所含有巰基進行連接，也就是說，連接子與T之間的-S-並非另外再外接的硫原子。例如，其中，-S-並非另外外接的硫原子，而是打開雙硫鍵後的T自身所含有巰基與連接子(例如 )的1位進行連接後形成的-S-。
在本說明書的各部分，本揭示化合物的取代基按照基團種類或範圍揭示。特別指出，本揭示包括這些基團種類和範圍的各個成員的每一個獨立的次級組合。例如，術語“C1-6烷基”特別指獨立揭示的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本揭示中，術語“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”及其在本文中的其它變體形式為包含性的(inclusive)或開放式的，且不排除其它未列舉的元素或方法步驟。
在本揭示中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-20%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%或10.0%等範圍內變動。
在本揭示中，術語“C1-6烷基”表示直鏈或支鏈的含有1-6個碳原子的烷基，包括例如“C1-3烷基”或“C1-4烷基”，甲基，乙基等，具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基。
在本揭示中，術語“C2-6烯基”是指含有至少一個雙鍵且碳原子數為2-6的直鏈、支鏈或環狀的烯基，包括例如“C2-4烯基”等。其實例包括但不限於：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基、環戊烯基、1,3-環戊二烯基、環己烯基、1,4-環己二烯基等。
在本揭示中，術語“C2-6炔基”是指含有至少一個三鍵且碳原子數為2-6的直鏈或支鏈的炔基，包括例如“C2-4炔基”等。其實例包括但不限於：乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、5-甲基-2-己炔基等。
在本揭示中，術語“鹵素”包括氟、氯、溴、碘。
在本揭示中，術語“C3-6環烷基”是指含有3-6個碳原子的飽和環狀烷基。任選地，環狀結構中的碳原子可以被氧代。包括環丙烷基(即環丙基)、環丁烷基(即環丁基)、環戊烷基(即環戊基)、環己基。
在本揭示中，術語“C1-6烷氧基”是指透過氧原子連接至母體分子部分的如上文所定義的烷基，包括例如“C1-3烷氧基”或“C1-4烷氧基”。具體實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
在本揭示中，術語“C1-6鹵代烷基”是指透過鹵素連接至母體分子部分的如上文所定義的烷基，包括例如“C1-3鹵代烷基”或“C1-4鹵代烷基”。具體實例包括但不限於氯代甲基、氟代乙基、溴代丙基等。
在本揭示中，術語“4-10元雜環”是指含有4-10個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環。術語“3-6元雜環”是指含有3-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環。術語“3-7元雜環”是指含有3-7個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環。術語“5-6元雜環”是指含有5-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環。任選地，環狀結構中的環原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代，包括但不限於吡咯烷、四氫呋喃、哌啶、哌嗪、四氫吡喃、吡咯烷酮等環。
在本揭示中，術語“3-10元碳環”是指有3-10個環原子為碳的環。任選地，環狀結構中的碳原子可以被氧代。例如3-6元碳環、3-7元碳環、5-8元碳環等，包括但不限於環戊烷、環己烷等。
在本揭示中，術語“4-10元雜環基”是指含有4-10個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如碳原子、氮原子或硫原子)的環狀基團。術語“4-6元雜環基”是指含有4-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環狀基團。術語“3-6元雜環基”是指含有3-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如碳原子、氮原子或硫原子)的環狀基團。任選地，環狀結構中的環原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。“4-8元雜環基”包括例如“4-8元含氮雜環基”、“4-8元含氧雜環基”、“4-7元雜環基”、“4-7元含氧雜環基”、“4-7元雜環基”、“4-6元雜環基”、“5-7元雜環基”、“5-6元雜環基”、“5-6元含氮雜環基”，包括但不限於氧代環丁烷基、吡咯烷基、四氫呋喃基、哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、高哌嗪基等。
在本揭示中，術語“芳基”是指具有芳香性的單環或多環烴基，例如6-10元芳基、5-8元芳基等。具體的實例包括但不限於苯基、萘基、蒽基、菲基等。所述“6-10元芳基”是指含有6-10個環原子的芳基。所述“C6-10芳基” 是指含有6-10個碳原子的芳基。
在本揭示中，術語“雜芳基”是指具有芳香性的環狀基團，其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子。任選地，環狀結構中的環原子(例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。具體實例包括但不限於5-10元雜芳基、5-6元雜芳基、5-10元含氮雜芳基、6-10元含氧雜芳基、6-8元含氮雜芳基、5-8元含氧雜芳基等，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、1,4-二氧雜環己二烯基、2 H-1,2-噁嗪基、4 H-1,2-噁嗪基、6 H-1,2-噁嗪基、4 H-1,3-噁嗪基、6 H-1,3-噁嗪基、4 H-1,4-噁嗪基、噠嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮雜環庚三烯基、1,3-二氮雜環庚三烯基、氮雜環辛四烯基等。本揭示用波浪線“~~”表示的結構式中的鍵意在表示，該結構表示順式或反式異構體，或任意比例的順式和反式異構體的混合物。
在本揭示中，術語“接頭單元”為抗體偶聯藥物或藥物連接體偶聯物或連接子的組成部分，其作用是將和靶點結合的抗體或其抗原結合片段與抗體藥物偶聯物的其餘部分相連。接頭單元能夠將T單元連接於Lb上，具體實例包括但不限於(其中1位與抗體或其抗原結合片段相連、2位與Lb或Lc相連)： 、 、 、 、 。
在本揭示中，術語“連接單元”為抗體偶聯藥物或藥物連接體偶聯物或連接子的組成部分，其作用是用來結合接頭單元與胺基酸殘基或由2-10個胺基酸殘基組成的短肽。連接單元存在時能夠將La連接於Lc。具體實例包括但不限於(其中1位與接頭單元相連、2位與Lc相連)： 、 、 、 、 和 。
在本揭示中，術語“間隔單元”為抗體偶聯藥物或藥物連接體偶聯物或連接子的組成部分，其作用是用來結合生物活性化合物片段與胺基酸殘基或由2-10個胺基酸殘基組成的短肽，或者其可提供附加的結構組成部分以進一步促進生物活性化合物從抗體偶聯藥物的其餘部分的釋放。間隔單元存在時能夠將藥物單元連接於Lc。具體實例包括但不限於(其中1位與Lc相連、2位與D相連)： 、 、 。
在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選為條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本揭示中，術語“抗體”取其最廣義的解釋，包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體以及由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，只要它們具有所需的生物學活性。在本揭示中，“抗體”和“免疫球蛋白”可以互換使用。
術語“非工程化抗體”是指不進行修飾以引入額外胺基酸或肽的抗體。
術語“抗體片段”包括完整抗體的一部分。在優選的實施方案中，抗體片段為抗原結合片段。
“抗原結合片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體例如VHH；雙價抗體或其片段；或駱駝科抗體。
在本揭示中，術語“單克隆抗體”指抗體來自一群基本均一的抗體，即構成該集群的各抗體完全相同，除了可能存在的少量天然突變。單克隆抗體具有針對抗原的一個決定簇(表位)的高特異性，而與其相對的多克隆抗體則包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體。除了特異性之外，單克隆抗體的優點還在於合成時可以不受其他抗體的污染。此處修飾語“單克隆”表示該抗體的特徵在於來自一個基本均一的抗體群，而不應理解成需由特殊方法製得。
在本揭示的部分實施方案中，單克隆抗體還特別包括嵌合抗體，即重鏈和/或輕鏈的一部分與某種、某類或某亞類抗體相同或同源，其餘部分則與另一種、另一類或另一亞類抗體相同或同源，只要它們具有所需的生物學活性(參見例如US 4,816,567；和Morrison等人，1984，PNAS，81: 6851-6855)。可用於本揭示的嵌合抗體包括靈長類化(primatized)抗體，其包含來自非人靈長類(例如古猴、猩猩等)的可變區抗原結合序列和人恆定區序列。
在本揭示中，非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指包含最少量非人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大多數人源化抗體是人接受者免疫球蛋白的高度變異區殘基被置換成具有所需特異性、親和力和功能的非人(例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)高度變異區殘基(供者抗體)。在一些實施方案中，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基也被置換成非人殘基。而且，人源化抗體還可以包含受者抗體或供者抗體中沒有的殘基。這些修飾是為了進一步優化抗體的性能。人源化抗體一般包含至少一個，通常是兩個可變區，其中所有或幾乎所有高度變異環(hypervanable loops)與非人免疫球蛋白的相對應，而FR則完全或幾乎完全是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恆定區(Fc，通常是人免疫球蛋白Fc)的至少一部分。有關細節參見例如Jones等人，1986，Nature，321: 522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332: 323-329；和Presta，1992，Curr Op Struct Bwl 2: 593-596。
完整抗體可根據重鏈恆定區的胺基酸序列分為不同的“類”。主要的五類是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中幾類還可以分為不同的“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗體不同類的重鏈恆定區分別稱為α、β、ε、γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞基結構和三維構型是本領域中公知的。
本揭示所用的單克隆抗體可以由許多方法生產。例如，用於本揭示的單克隆抗體可以透過雜交瘤方法，使用許多物種(包括小鼠、倉鼠、大鼠和人的細胞)獲得(參見例如Kohler等人，1975，Nature，256: 495)，或者透過重組DNA技術製得(參見例如US 4,816,567)，或者從噬菌體抗體庫中分離得到(參見例如Clackson等人，1991，Nature，352: 624-628；和Marks等人，1991，Journal of Molecular Biology，222: 581-597)。
在本揭示中，術語“多特異性抗體”包括例如三特異性抗體和四特異性抗體，前者是具有三種不同抗原結合特異性的抗體，而後者是具有四種不同抗原結合特異性的抗體。
在本揭示中，術語“完整抗體”指包含抗原結合可變區和輕鏈恆定區(CL)、重鏈恆定區(CH1、CH2和CH3)的抗體。恆定區可以是天然序列(例如人天然恆定區序列)或其胺基酸序列變體。完整抗體優選是具有一種或多種效應功能的完整抗體。
在本揭示中，術語“前抗(Probody)”是一種修飾的抗體，包括一種抗體或一種抗體片段，能專門與其靶點結合，能夠與掩蔽基團耦合，其中掩蔽基團指對抗體或抗體片段與其靶點的結合能力的裂解常數比沒有耦合掩蔽基團的抗體或抗體片段與其靶點的結合能力的裂解常數至少大100倍或1000倍、或者10000倍。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本揭示上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。凡基於本揭示上述內容所實現的技術均屬於本揭示的範圍。
有益效果：
本發明提供的具有多種毒素的抗體偶聯藥物，因不同毒素作用機制不同，會對抗腫瘤活性產生協同作用，體內和體外測試的不同腫瘤細胞中均具有顯著地抑制作用。
本發明提供的多彈頭抗體偶聯藥物，可以克服腫瘤的高度異質性問題，在多種腫瘤中顯示了顯著地抗腫瘤活性。特別是，在her2高表達(N87和SK-BR-3)細胞系和her2低表達(H358和MCF-7)細胞系中均顯示了良好的抑制作用。
本發明提供的多彈頭抗體偶聯藥物，利用其連接子在腫瘤微環境中的胞外裂解能力，可以和沒有細胞內吞能力的抗體組成抗體偶聯藥物，彌補傳統ADC需要內吞的缺陷，這類抗體偶聯藥物依然具有高抗腫瘤活性。
本發明提供的多彈頭抗體偶聯藥物，利用其連接子在腫瘤微環境中的胞外裂解能力以及其在腫瘤微環境中的富集能力，可以和沒有細胞內吞能力的抗體以及沒有腫瘤細胞外抗原結合能力的抗體組成抗體偶聯藥物，這類抗體偶聯藥物依然具有高抗腫瘤活性。
本發明提供的多彈頭抗體偶聯藥物，具有抗耐藥的作用，特別是為治療過程中產生的單毒素ADC或毒素引起的耐藥性問題提供了解決方案。特別是對喜樹鹼類ADC耐藥細胞系具有良好的抑制作用。
本發明的多彈頭抗體偶聯藥物製備方法可以靈活調整多種毒素之間的比例，使得不同作用機制的生物活性分子在相同的ADC劑量下能夠產生最佳藥效，同時降低毒性，讓ADC具有最佳安全窗。
本發明的多彈頭抗體偶聯藥物製備方法操作極其簡單，無需合成複雜的具有多分枝的linker，無需對抗體進行多次預處理，也無需針對不同位點進行多次偶聯及純化，成藥性強，節約成本，為藥物生產提供良好基礎。
以下透過具體實施方式的描述對本揭示作進一步說明，但這並非是對本揭示僅限制於以下實施例。本領域技術人員根據本揭示的教導，可以做出各種修改或改進，而不脫離本揭示的基本思想和範圍。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以透過市購獲得的常規產品。
本揭示中的縮寫具有以下含義：
DCM 二氯甲烷 FA 甲酸
DMF N,N-二甲基甲醯胺 ACN 乙腈
MTBE 甲基叔丁基醚 DIEA/DIPEA 二異丙基乙基胺
TEA 三乙胺 CDCl 3 氘代氯仿
DMSO 二甲基亞碸 Oxone 過硫酸氫鉀
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 PE 石油醚
EA 乙酸乙酯 TCEP 三(2-羧乙基)膦
THF 四氫呋喃 DEA 二乙胺
EEDQ 2-乙氧基-1-乙氧碳醯基-1,2-二氫喹啉 DMTMM 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽
TFA 三氟乙酸 DCC N,N'-二環己基碳醯亞胺
HOBT 1-羥基苯并三氮唑
製備方案
以下的實施例中記載的化合物的結構透過核磁共振( 1H NMR)或質譜(MS)來確定。
核磁共振( 1H NMR)的測定儀器使用Bruker 400 MHz核磁共振儀；測定溶劑為氘代甲醇(CD 3OD)、氘代氯仿(CDCl 3)或六氘代二甲基亞碸(DMSO-d 6)；內部標準物質為四甲基矽烷(TMS)。
實施例中使用的核磁共振(NMR)圖譜中的縮寫示於以下。
s：單峰(singlet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、dd：雙二重峰(double doublet)、qd：四二重峰(quartet doublet)、ddd：雙雙二重峰(double double doublet)、ddt：雙雙三重峰(double double triplet)、dddd：雙雙雙二重峰(double double double doublet)、m：多重峰(multiplet)、br：寬峰(broad)、J：偶合常數、Hz：赫茲、DMSO-d 6：氘化二甲基亞碸。δ值用ppm值表示。
質譜(MS)的測定儀器使用Agilent (ESI)質譜儀，型號為Agilent 6120B。 一、藥物連接體偶聯物的製備 實施例 1.1 ： 化合物 DL001 的製備
步驟一：將化合物1-1 (500 mg, 4.39 mmol)溶在超乾DCM(5 mL)中，在0℃下滴加三溴化硼(1.15 g, 4.6 mmol)，滴加完畢升至室溫，攪拌24小時，降溫至0℃向反應液中滴加甲醇(5 mL)淬滅反應，將反應液在室溫下繼續攪拌24小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉水溶液(30 mL)，然後用DCM萃取(30 mL ⅹ 3)，合併有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，蒸除溶劑即為1-2 (830 mg，產率92.5%)為棕色油狀液體。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 3.69 (s, 3H), 3.40 – 3.27 (m, 2H), 2.20 – 2.09 (m, 2H), 1.21 (s, 6H).
步驟二：將化合物1-2 (650 mg, 3.13 mmol)溶在DMF (10 mL)中，加入疊氮化鈉(1.02 g, 15.63 mmol)，升溫至80℃，攪拌過夜，然後降至室溫，向反應液中加入水(30 mL)，然後用MTBE 萃取(30 mL ⅹ 3)，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾即為目標化合物1-3(470 mg，產率88.9%)為淡黃色油狀液體。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 3.69 (s, 3H), 3.31 – 3.23 (m, 2H), 1.89 – 1.81 (m, 2H), 1.22 (s, 6H).
步驟三：將化合物1-3 (365 mg, 2.13 mmol)、5-乙炔基-2-(甲硫基)嘧啶(320 mg, 2.13 mmol)溶在叔丁醇(5 mL)和水(5 mL)中，加入維生素C鈉(84 mg, 0.43 mmol)，無水硫酸銅 (34 mg, 0.21 mmol)在室溫下攪拌1小時。向反應液中加入水(25 mL)，然後用EA萃取(30 mL ⅹ 3)，合併有機相，經無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，殘留物經矽膠管柱層析(PE:EA=3:1)純化，得到目標化合物1-4 (600 mg，產率88.2%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 322.1 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 8.95 (s, 2H), 7.85 (s, 1H), 4.53 – 4.39 (m, 2H), 3.69 (s, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.29 – 2.17 (m, 2H), 1.31 (s, 6H).
步驟四：將化合物1-4 (500 mg, 1.60 mmol)溶在THF (5 mL)和水(5 mL)中，加入氫氧化鋰(112 mg, 4.70 mmol)，在室溫下攪拌5小時。向反應液中加入1 N的鹽酸調pH= 3~4，會有大量的白色固體析出，過濾，濾餅即為目標化合物1-5(450 mg，產率93.5%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 308.0 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 12.43 (s, 1H), 9.06 (s, 2H), 8.76 (s, 1H), 4.55 – 4.31 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.15 – 2.04 (m, 2H), 1.20 (s, 6H).
步驟五：將化合物1-5 (1.5 g, 4.90 mmol)溶在THF (10 mL)和水(10 mL) 中，加入Oxone (15.0 g, 24.5 mmol)，在室溫下攪拌過夜。將反應液倒入水(200 mL)中，過濾，濾餅即為目標化合物1-6 (1.6 g，產率93.5%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 340.1 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.48 (s, 2H), 8.98 (s, 1H), 4.54 – 4.48 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 2.16 – 2.09 (m, 2H), 1.21 (s, 6H).
步驟六：將化合物1-6 (1.9 g, 5.32 mmol)溶於DMF (40 mL)中，再加入HATU(2.13 g, 5.32 mmol)和DIEA(1.7 g, 13.3 mmol)，反應液於室溫下攪拌30分鐘，將N2-(L-纈胺酸)-N6,N6-二甲胺基-L-賴胺酸 (1.45 g, 5.32 mmol)，加入到反應液中，繼續攪拌1小時。將反應液直接經反相層析(H 2O:ACN=5%-100%)純化，得到目標化合物1-7(1.5 g，產率44.5%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 595.5 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.51 (s, 2H), 9.05 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.45 – 4.35 (m, 2H), 4.13 (t, 1H), 4.07-4.09 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.23 (s, 6H), 2.19 – 2.06 (m, 4H), 1.73 – 1.57 (m, 2H), 1.45 – 1.36 (m, 2H), 1.31 – 1.27 (m, 1H), 1.22 (d, J = 9.6 Hz, 6H), 0.91 – 0.86 (m, 6H).
步驟七：將化合物1-7 (360 mg, 0.61 mmol)，4-胺基苯乙醇 (75 mg, 0.61 mmol)溶於DMF (5 mL)中，加入HATU(230 mg, 0.61 mmol)和DIEA(195 mg, 1.52 mmol)，反應液於室溫下攪拌1小時。將反應液直接經反相層析(H 2O:ACN=5%-100%)純化，得到目標化合物1-8(255 mg，產率60.1%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 700.4 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.93 (d, J = 87.4 Hz, 1H), 9.47 (s, 1H), 9.39 (s, 1H), 8.89 (d, J = 57.3 Hz, 1H), 8.54 – 8.16 (m, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 0.5H), 7.56 – 7.48 (m, 2H), 7.47 (d, J = 8.3 Hz, 0.5H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.10 – 5.04 (m, 1H), 4.44 – 4.36 (m, 4H), 4.21 – 4.09 (m, 1H), 3.45 (s, 3H), 2.75 – 2.65 (m, 2H), 2.23 – 2.04 (m, 4H), 1.83 – 1.63 (m, 2H), 1.59 – 1.51 (m, 2H), 1.42 – 1.35 (m, 1H), 1.35 – 1.16 (m, 12H), 0.94 – 0.87 (m, 6H).
步驟八：將化合物1-8 (250 mg, 0.36 mmol)，4-硝基苯基氯甲酸酯(288 mg, 1.43 mmol)溶在DCM (10 mL)中，加入TEA (72 mg, 0.72 mmol)，在室溫下攪拌3小時。將反應液濃縮，殘留物經反相層析(H 2O:ACN=5%-100%)純化，得到1-9 (120 mg，產率38.9%)為黃色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 865.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.04 (d, J = 73.3 Hz, 1H), 9.46 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 8.86 (d, J = 56.6 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 – 7.55 (m, 3H), 7.42 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 4.45 – 4.38 (m, 2H), 4.37 – 4.28 (m, 1H), 4.21 – 4.14 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.18 – 2.12 (m, 3H), 2.10 – 2.06 (m, 8H), 1.81 – 1.63 (m, 2H), 1.44 – 1.32 (m, 4H), 1.23 (d, J = 7.4 Hz, 7H), 0.94 – 0.88 (m, 6H).
步驟九：將化合物1-9 (36 mg, 0.041 mmol)，艾日布林(20 mg， 0.027 mmol)，溶於DMF (2 mL)。然後再加DIEA(7 mg, 0.054 mmol)加完後反應液室溫攪拌1小時。粗產品經製備層析(0.01% FA in water, ACN)純化，得到目標化合物DL001(21.8 mg，產率52.6%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 1455.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.01 (d, J = 69.6 Hz, 1H), 9.46 (s, 1H), 9.39 (s, 1H), 8.88 (d, J = 47.0 Hz, 1H), 8.50 (d, J = 7.3 Hz, 0.5H), 8.37 (s, 2H), 8.16 (d, J = 6.7 Hz, 0.5H), 7.67 – 7.46 (m, 3H), 7.23 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 4.99 (s, 1H), 4.90 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 4.83 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.55 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 4.43 – 4.33 (m, 3H), 4.26 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 4.21 – 4.14 (m, 2H), 4.11 (d, J = 10.6 Hz, 4H), 4.01 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 3.84 – 3.73 (m, 4H), 3.72 – 3.65 (m, 3H), 3.44 (s, 3H), 3.27 – 3.22 (m, 5H), 2.96 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.84 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 2.80 – 2.64 (m, 3H), 2.60 – 2.55 (m, 1H), 2.36 – 2.29 (m, 2H), 2.27 – 2.23 (m, 2H), 2.21 – 2.11 (m, 6H), 2.08 (d, J = 4.8 Hz, 6H), 2.06 – 2.03 (m, 1H), 2.03 – 1.95 (m, 2H), 1.94 – 1.88 (m, 4H), 1.74 – 1.60 (m, 7H), 1.56 – 1.45 (m, 3H), 1.38 – 1.28 (m, 6H), 1.24 – 1.20 (m, 6H), 1.03 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.97 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 0.92 – 0.86 (m, 6H)。 實施例 1.2 ： 化合物 DL002 的製備
步驟一： 將化合物2-1 (5.0 g，9.07 mmol)溶於DCM/無水甲醇(5/1) (50 mL)，加入對胺基苯甲醇(1.1 g，9.07 mmol)，EEDQ (4.5 g，18.2 mmol)，室溫攪拌反應2小時。反應液減壓濃縮後經矽膠層析管柱(DCM:無水甲醇=20:1)純化，得到化合物2-2 (3.1 g，產率：52.0%)為黃色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 657.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.05 (s, 1H), 8.15 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.50 – 7.39 (m, 3H), 7.32 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.11 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 5.4 Hz, 3H), 4.34 – 4.16 (m, 3H), 3.92 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.01 – 2.84 (m, 6H), 2.03 – 1.96 (m, 1H), 1.80 – 1.53 (m, 8H), 1.41 – 1.27 (m, 2H), 0.91 – 0.83 (m, 12H).
步驟二：將化合物2-2 (2.5 g，3.81 mmol)溶於DMF (35 mL)，加入DEA (557 mg，7.62 mmol)，室溫反應1h。反應液減壓濃縮除去DEA，得到化合物2-3 (1.65 g，粗產物)。 LCMS (ESI) [M+H] += 435.4；
步驟三：將化合物2-3 (1.65 g，3.81 mmol)溶於DMF (35 mL)，加入6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(1.02 g，3.81 mmol)，HATU (1.45 g，3.81mmol)，DIEA (1.23 g，9.53 mmol)，室溫反應2h。反應液經反相層析(0.05%TFA in water， ACN)純化，得到化合物2-4 ( 1.1 g，產率42.3%) 為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 685.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.88 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.09 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 4.39 – 4.33 (m, 1H), 4.24 – 4.18 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.56 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.45 – 2.29 (m, 7H), 2.03 – 1.96 (m, 2H), 1.87 – 1.78 (m, 2H), 1.76 – 1.68 (m, 1H), 1.67 – 1.58 (m, 1H), 1.45 – 1.26 (m, 8H), 0.90 – 0.78 (m, 12H).
步驟四：氮氣保護下，將化合物2-4 (510 mg，0.746 mmol)溶於超乾DCM (10 mL)，加入二(對硝基苯)碳酸酯 (453 mg，1.491 mmol)，DIEA (192 mg，1.491 mmol)，反應2h。反應液經反相層析(0.05%TFA in water，ACN)純化，得到化合物2-5 ( 300 mg，產率44.7%)，為淡黃色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 850.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.10 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.34 – 8.28 (m, 2H), 8.19 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.59 – 7.53 (m, 2H), 7.42 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.43 – 4.36 (m, 1H), 4.23 – 4.18 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 3.05 – 2.95 (m, 6H), 2.57 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.44 – 2.36 (m, 2H), 2.36 – 2.27 (m, 2H), 2.03 – 1.94 (m, 1H), 1.88 – 1.75 (m, 3H), 1.67 – 1.54 (m, 7H), 0.92 – 0.84 (m, 12H).
步驟五：將艾日布林(50 mg, 0.07 mmol)溶在DMF (1.5 mL)中，依次化合物2-5 (58 mg, 0.07 mmol)，DIEA (22 mg, 0.18 mmol) 於反應液中，反應液在室溫下攪拌2h。反應液直接經反相層析(0.05%TFA in water，ACN)純化，得目標化合物DL002 (52 mg，產率53 %)。 LCMS (ESI) [M+H] += 1441.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.02 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.98 (s, 1H), 8.17 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.06 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 5.05 (s, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.93 (d, J = 3.3 Hz, 2H), 4.83 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.65 – 4.62 (m, 1H), 4.57 – 4.53 (m, 1H), 4.43 – 4.35 (m, 2H), 4.30 – 4.24 (m, 2H), 4.21 – 4.17 (m, 2H), 4.11 – 4.09 (m, 3H), 4.04 – 4.00 (m, 2H), 3.84 – 3.73 (m, 4H), 3.72 – 3.64 (m, 2H), 3.57 – 3.46 (m, 4H), 3.41 (s, 3H), 3.28 – 3.22 (m, 4H), 3.05 – 2.94 (m, 9H), 2.84 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 2.79 – 2.63 (m, 3H), 2.60 – 2.53 (m, 4H), 2.44 – 2.36 (m, 2H), 2.35 – 2.29 (m, 3H), 2.28 – 2.23 (m, 2H), 2.21 – 2.11 (m, 2H), 2.02 – 1.97 (m, 2H), 1.94 – 1.91 (m, 3H), 1.85 – 1.79 (m, 2H), 1.69 – 1.57 (m, 11H), 1.36 – 1.27 (m, 5H), 1.03 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.91 – 0.83 (m, 12H). 實施例 1.3 ： 化合物 DL003 的製備
DL003按照WO2022170971的方法進行製備獲得。 實施例 1.4 ：化合物 DL004 的製備
步驟一：將化合物MMAE(108 mg，0.15 mmol)溶於DMF(2 mL)，依次加入化合物1-9(130 mg，0.15 mmol)，1-羥基苯并三唑(20.3 mg，0.15 mmol)，DIEA(58.2 mg，0.45 mmol)，室溫反應4 h。反應液直接經製備高效液相層析(0.1%FA in water，ACN)純化，得目標化合物DL004(55 mg產率：25.4%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=722.52 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.06 (s, 1H), 9.46 (s, 2H), 8.93 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.10 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.5 Hz, 0.5H), 7.88 (d, J = 8.7 Hz, 0.5H), 7.61 (d, J = 8.5 Hz, 0.5H), 7.56-7.50 (m, 2H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.35-7.08 (m, 7.5H), 5.09-4.94 (m, 2H), 4.76-4.38 (m, 6H), 4.29-4.16 (m, 2H), 4.08-3.91 (m, 3H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.24-2.82 (m, 15H), 2.45-1.27 (m, 31H), 1.25-1.19 (m, 6H), 1.05-0.75 (m, 30H). 實施例 1.5 ： 化合物 DL005 的製備
步驟一：將化合物5-1 (10 g, 20.2 mmol)溶在DCM/無水甲醇(5/1) (36 mL)中，加入對胺基苯甲醇(2.5 g, 20.2 mmol)，EEDQ (10 g, 40.4 mmol)，室溫攪拌2h。反應液濃縮後經管柱層析(DCM：甲醇=15:1) 純化，得目標化合物5-2 (7 g，產率57.9%)為白色固體。 LCMS (ESI) [M+H] += 601.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.09 (s, 1H), 8.18 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.79 – 7.72 (m, 2H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.48 – 7.39 (m, 3H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.47 – 4.40 (m, 3H), 4.34 – 4.28 (m, 1H), 4.25 – 4.20 (m, 2H), 3.96 – 3.90 (m, 1H), 3.02 – 2.92 (m, 2H), 2.69(s,3H), 2.68 (s, 3H), 2.07 – 1.96 (m, 1H), 1.83 – 1.73 (m, 1H), 1.71 – 1.60 (m, 3H), 1.42 – 1.29 (m, 2H), 0.90 – 0.85 (m, 6H).
步驟二：將化合物5-2 (3.5 g, 5.8 mmol) 溶在DMF (15 mL)中，加入DEA (852 mg, 11.7 mmol)，室溫攪拌1h。反應液經減壓濃縮後得化合物5-3 (2.2 g, crude)，直接用於下一步反應。 LCMS (ESI) [M+H] += 379.3；
步驟三：將6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(1.34 g，5 .02mmol )溶於DMF(10 mL)中，依次加入HATU ( 1.9 g，5.02 mmol)，DIEA (1.61 g，12.56 mmol)，於25℃下攪拌0.5 h，加入化合物5-3 (1.9 g，5 .02mmol )，在25℃下攪拌1 h。反應液經反相管柱(0.1%TFA in water，ACN)純化，得到目標化合物5-4 (2 g，產率：55.6%) 。 LCMS (ESI) [M+H] += 629.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.93 (s, 1H), 9.12 (s, 2H), 8.16 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.40 – 4.35 (m, 1H), 4.23 – 4.18 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 3.41 – 3.40 (m, 1H), 3.06 – 2.98 (m, 2H), 2.75(s,3H), 2.74 (s, 3H), 2.56 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.41 – 2.33 (m, 2H), 2.01 – 1.95 (m, 1H), 1.87 – 1.80 (m, 2H), 1.68 – 1.59 (m, 3H), 1.38 – 1.27 (m, 2H), 0.89 – 0.82 (m, 6H).
步驟四：將化合物5-4 (1.8 g，2.87 mmol)溶於DMF(10 mL)中，加入化合物二(對硝基苯)碳酸酯(1.74 g，5.74 mmol)、DIEA (740 mg，5.74 mmol)，於25℃攪拌2 h。LCMS檢測反應基本完全，將反應液經MTBE(80 mL)打漿，無水乙醚(100 mL)打漿，得到淡黃色固狀目標化合物5-5 (1.8 g，產率：79.1 %)。 LCMS (ESI) [M+H] += 794.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.08 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.31 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.44 – 4.36 (m, 1H), 4.25 – 4.17 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.90 – 2.79 (m, 2H), 2.68 – 2.57 (m, 6H), 2.58 – 2.54 (m, 2H), 2.42 – 2.31 (m, 2H), 2.05 – 1.92 (m, 1H), 1.88 – 1.78 (m, 2H), 1.77 – 1.62 (m, 2H), 1.61 – 1.53 (m, 2H), 1.41 – 1.26 (m, 2H), 0.89 – 0.82 (m, 6H).
步驟五：將化合物MMAE(108 mg，0.15 mmol)溶於DMF(2 mL)，化合物5-5(119 mg，0.15 mmol)，1-羥基苯并三唑(20.3 mg，0.15 mmol)，DIEA(58.2 mg，0.45 mmol)，22℃反應4 h。反應液直接經製備高效液相層析(0.1%FA in water，ACN)純化，得目標化合物DL005(75 mg，產率：36.4%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=686.98 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.07-9.86 (m, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.22 (s, 1H), 8.14-7.98 (m, 2H), 7.96-7.85 (m, 1.5H), 7.66-7.50 (m, 2.5H), 7.36-7.23 (m, 6H), 7.21-7.09 (m, 1H), 5.60-5.19 (m, 1H), 5.13-4.90 (m, 2H), 4.79-4.55 (m, 1H), 4.54-4.14 (m, 6H), 4.08-3.87 (m, 3H), 3.83-3.74 (m, 1H), 3.20-2.82 (m, 14H), 2.55 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.44-2.21 (m, 7H), 2.15-1.28 (m, 26H), 1.06-0.97 (m, 6H), 0.88-0.74 (m, 24H). 實施例 1.6 ： 化合物 DL006 的製備
步驟一：秤取化合物6-2(35.35 g, 143.53 mmol)，加入到NaHCO 3(24.12 g, 287.06 mmol)的水(250mL)溶液中，冰水浴下滴加6-1(50.0 g, 143.53 mmol)的THF(250 mL)溶液。滴加完畢後反應系統室溫下攪拌4h，反應液濃縮除去有機溶劑後，用鹽酸(4mol/L)調節pH=5，攪拌1h後抽濾，濾餅用DCM(700mL)打漿30mins後，抽濾，濾餅乾燥得目標產物6-3，65.0g，產率94.5%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.36 – 7.30 (m, 5H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 8 Hz, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.18-4.12 (m, 1H), 3.94-3.90 (m, 1H), 2.91-2.87 (m, 2H), 1.97-1.85 (m, 1H), 1.74 – 1.64 (m, 1H), 1.62 – 1.52 (m, 1H), 1.42 – 1.23 (m, 13H), 0.90 - 0.83 (m, 6H).
步驟二：秤取化合物6-3 (50.0g，104.26mmol)加入至THF(20mL)中，再加入濃鹽酸(17.2mL，206.40mmol)，60℃加熱反應1h，反應液冷卻至室溫，直接用於下步反應。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 12.59 (s, 1H), 8.19 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.96 (s, 3H), 7.40 – 7.34 (m, 5H), 8.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.06 (s, 2H), 4.22 - 4.17 (m, 1H), 3.96 – 3.92 (m, 1H), 2.80 - 2.77 (m, 2H), 2.04-2.00 (m, 1H), 1.63 – 1.57 (m, 4H), 1.41 - 1.39 (m, 2H), 0.93 - 0.87 (m, 6H).
步驟三：向步驟二獲得的溶液中加入THF(300mL)，冰水浴下加入氰基硼氫化鈉(19.7g，312.78mmol)，加入正丙醛(24.3g，417.04mmol)。升至室溫攪拌反應1h。加入鹽酸調節pH=4-5，攪拌30min。反應系統濃縮除去THF，加入水(200mL)和DCM(200mL)，收集有機相。水相加入60.0g無水硫酸鈉，用DCM(100mL)再次萃取。合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，濾除不溶物，濃縮得目標化合物6-5，38.0g, 兩步產率78.6%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.35 – 7.26 (m, 6H), 5.03 (s, 2H), 4.15 - 4.10 (m, 1H), 3.91 – 3.87 (m, 1H), 2.76 – 2.58 (m, 6H), 2.00 – 1.96 (m, 1H), 1.82 – 1.19 (m, 10H), 0.89 – 0.84(m, 12H).
步驟四：將化合物6-6 (5g,17.84mmol)加入至三氟乙醇(30 mL)中，氬氣保護，40℃攪拌溶解，然後加入HCl的DMF溶液(2.1 mL, 0.4mol/L)，40℃下攪拌2.5 h。反應液降至室溫後加入到120 mL的碳酸氫鈉水溶液中(1%，W/V)，攪拌，抽濾，濾餅乾燥得到目標化合物6-7，5.3g，產率 92.8%。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.88 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 7.54 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.40-7.32 (m, 5H), 5.07 (s, 2H), 4.70 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.03 (q, J = 9.4 Hz, 2H), 3.68 (d, J = 6.1 Hz, 2H).
步驟五：將化合物6-7(1.00 g，3.29 mmol)溶於THF(5 ml)，再加入5% Pd/C (50 mg)，氫氣置換後室溫反應3 h。反應液加入DMF(5mL)，過濾，濃縮除去THF後，得目標化合物6-8的DMF溶液，產率定量，直接用於下一步反應。
化合物6-8的HOBt鹽的核磁氫譜為： 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.18 (br, 1H), 7.79 – 7.71 (m, 1H), 7.49 – 7.41 (m, 1H), 7.25-7.18 (m, 2H), 4.74 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 4.06 (q, J = 9.4 Hz, 2H), 3.47 (s, 2H).
步驟六：將化合物6-5(1.52g，3.29 mmol)加入至步驟五得到的化合物6-8的DMF溶液中，控溫-10℃，加入DMTMM(1.16 g，3.98 mmol)反應1.5 h。向反應系統中加入EA(50 mL)，依次用飽和NaHCO 3水溶液(15mL*3)、飽和食鹽水(15 mL)洗滌，有機相無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液濃縮乾。所得殘餘物用EA溶解(3mL)，加入至正庚烷(30mL)中，攪拌析出固體，抽濾，濾餅為目標化合物6-9，1.55 g，產率74.9%。 LCMS (ESI) [M+H] += 632.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.85 – 8.73 (m, 1H), 8.37 – 8.26 (m, 1H), 8.03 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.40-7.32 (m, 6H), 5.10 – 5.01 (m, 2H), 4.73-4.66 (m, 2H), 4.29 – 4.20 (m, 1H), 4.02 (q, J = 9.4 Hz, 2H), 3.93 (dd, J = 13.8, 6.6 Hz, 1H), 3.85 – 3.67 (m, 2H), 2.38-2.32 (m, 6H), 2.02-1.96 (m, 1H), 1.75 – 1.51 (m, 2H), 1.46 – 1.23 (m, 8H), 0.90-0.82(m, 12H).
步驟七：將化合物6-9(4g，6.3mmol)溶解於100mL甲醇中，透過全自動微反應加氫儀，採用三氧化二鋁負載的氫氧化鈀為催化劑，設定程序：溫度50℃，壓力2.5Mpa，原料液體流速0.3ml/min，氫氣流速30ml/min。流出溶液減壓濃縮得目標化合物6-10，3.0 g，產率95.1%。 LCMS (ESI) [M+H] += 498.3. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.89 – 8.77 (m, 1H), 8.42 – 8.30 (m, 1H), 8.14 (s, 1H), 4.70 (p, J = 10.3 Hz, 2H), 4.28 (s, 1H), 4.02 (q, J = 9.4 Hz, 2H), 3.80 (dd, J = 15.7, 4.9 Hz, 1H), 3.75 – 3.67 (m, 1H), 3.20 (s, 1H), 3.11 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 2.35 (dd, J = 14.4, 7.3 Hz, 6H), 2.04 – 1.90 (m, 1H), 1.76 – 1.51 (m, 2H), 1.45 – 1.20 (m, 8H), 0.95 – 0.77 (m, 12H).
步驟八：將化合物6-10(50.0 g，100 mmol)溶解於350mL ACN中，降溫至10℃，加入DIPEA(3.25 g ，25 mmol)，滴加化合物6-11(由6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸與氯化亞碸製備而得，現制現用)(34.4 g，120 mmol)的ACN(150 mL)溶液。反應1h，向反應液中加入2-甲基四氫呋喃(2.1L)，析出固體，抽濾，濾餅乾燥得目標化合物6-12的鹽酸鹽，71.8 g，產率91.6%。 LCMS (ESI) [M+H] += 748.4 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.15 (s, 2H), 8.78 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 8.24 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.75-4.66 (m, 2H), 4.24-4.19 (m, 2H), 4.03 (q, J = 9.4 Hz, 2H), 3.78-3.76 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 2.58 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.46-2.29 (m, 8H), 2.03-1.95 (m, 1H), 1.89-1.81 (m, 2H), 1.73-1.66 (m, 1H), 1.62-1.56 (m, 1H), 1.41-1.36 (m, 6H), 1.31-1.25 (m, 2H), 0.89-0.83 (m, 12H).
步驟九：將化合物6-13(100.00 mg，0.13 mmol)溶於DMF(1 mL)中，取化合物N-甲基羥乙胺(9.76 mg，0.13 mmol)加入溶液中，攪拌下降溫至-5 ℃，然後加入DMTMM(53.96 mg，0.20 mmol)反應液攪拌反應2 h。反應液直接經製備高效液相層析(0.05%FA in water，ACN) 純化，得目標化合物6-14(57 mg，產率：54.6%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=402.56； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.55–8.44 (m, 0.5H), 8.32–8.17 (m, 0.5H), 8.13–7.98 (m, 1H), 7.32–7.08 (m, 5H), 5.25–4.80 (m, 2H), 4.78–4.40 (m, 3H), 3.99–3.49 (m, 6H), 3.25–3.14 (m, 8H), 3.09–2.62 (m, 10H), 2.38–1.29 (m, 17H), 1.01–0.69 (m, 21H).
步驟十：將化合物6-14(47.00 mg，0.057 mmol)溶於DMF(0.5 mL)中，加入6-12的鹽酸鹽(138.25 mg，0.17 mmol)，HCl-DMF(4 M，0.5 mL)25℃下反應液攪拌反應5 h；LCMS監測反應；反應液直接經製備高效液相層析(0.1%TFA in water，ACN) 純化，得目標化合物DL006(8 mg，產率：8.4%)。 LCMS (ESI) [M/3+H] +=484.85； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.65–9.49 (m, 1H), 9.20–9.05 (m, 3H), 8.99–8.89 (m, 1H), 8.72–8.61 (m, 1H), 8.58–8.46 (m, 0.5H), 8.37–8.25 (m, 0.5H), 8.24–8.18 (m, 1H), 8.14–8.07 (m, 1H), 7.99–7.90 (m, 1H), 7.29–7.16 (m, 5H), 5.09–4.54 (m, 6H), 4.29–4.16 (m, 2H), 4.03–3.97 (m, 1H), 3.79–3.72 (m, 3H), 3.33–3.18 (m, 10H), 3.10–2.98 (m, 12H), 2.91–2.68 (m, 11H), 2.46–2.20 (m, 7H), 2.16–1.95 (m, 3H), 1.89–1.58 (m, 14H), 1.55–1.26 (m, 6H), 1.05–0.78 (m, 35H). 實施例 1.7 ：化合物 DL007 的製備
步驟一：將化合物6-13(30 mg，0.040 mmol)溶於DMF(0.5 mL)，加入N-甲基羥丙胺(10.7 mg，0.12 mmol)，降至-5℃，加入DMTMM一水合物(15.3 mg，0.052 mmol)，反應1h。反應液直接經製備高效液相層析(0.1% TFA in water/ACN)純化，得目標化合物7-1(17 mg，產率：45.6%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=409.57 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.61 (s, 1H), 9.05-8.84 (m, 1H), 8.56 (d, J = 8.7 Hz, 0.5H), 8.36-8.22 (m, 0.5H), 7.33-7.16 (m, 5H), 5.16-4.83 (m, 1H), 4.79-4.56 (m, 2H), 4.05-3.92 (m, 1H), 3.84-3.69 (m, 2H), 3.37-3.21 (m, 8H), 3.11-2.99 (m, 5H), 2.87-2.74 (m, 9H), 2.50-1.97 (m, 6H), 1.93-1.20 (m, 9H), 1.09-0.73 (m, 25H).
步驟二：將化合物7-1(30 mg，0.035 mmol)溶於DMF(0.5 mL)，加入6-12的鹽酸鹽(87 mg，0.11 mmol)，HCl-DMF(4 M，0.5 mL)，室溫反應5 h。反應液直接經製備高效液相層析(0.1% TFA in water/ACN)純化，得目標化合物DL007的三氟乙酸鹽(13 mg，產率：23.8%)。 LCMS (ESI) [M/3+H] +=489.29 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.57 (s, 1H), 9.19-9.02 (m, 3H), 8.99-8.83 (m, 1H), 8.67-8.53 (m, 1H), 8.52-8.45 (m, 0.5H), 8.33-8.21 (m, 0.5H), 8.17 (t, 1H), 8.08 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.96-7.84 (m, 1H), 7.25-7.13 (m, 5H), 5.03-4.40 (m, 6H), 4.28-4.13 (m, 2H), 4.00-3.93 (m, 1H), 3.76-3.70 (m, 3H), 3.33-3.14 (m, 12H), 3.07-2.97 (m, 9H), 2.83-2.73 (m, 9H), 2.55 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.46-1.90 (m, 9H), 1.88-1.18 (m, 22H), 1.03-0.73 (m, 37H). 實施例 1.8 ：化合物 DL008 的製備
步驟一：將化合物9-1 (5 g, 8.8 mmol) 溶在DCM (30 mL)和甲醇(6 mL)混合液中，加入對胺基苄醇 (1.1 g, 8.8 mmol)、EEDQ (4.3 g, 17.6 mmol)，在室溫下攪拌2 h。反應液濃縮後經管柱層析(DCM:甲醇=20:1) 純化，得目標化合物8-1 (2.5 g，產率42.4%)。 LCMS (ESI) [M+H] += 673.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 )δ 9.94 (s, 1H), 8.04 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 7.5 Hz, 2H), 7.74 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 7.53 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.47 – 7.38 (m, 3H), 7.32 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 7.23 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 6.72 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.09 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 4.48 – 4.34 (m, 3H), 4.32 – 4.17 (m, 3H), 3.96 – 3.87 (m, 1H), 2.95 – 2.77 (m, 2H), 2.06 – 1.92 (m, 1H), 1.65 (d, J= 30.4 Hz, 2H), 1.41 – 1.35 (m, 2H), 1.33 (s, 9H), 1.24 (s, 2H), 0.92 – 0.82 (m, 6H).
步驟二：將化合物8-1 (3 g， 4.46 mmol)溶於DMF (15 mL)中，加入DEA (391 mg，5.36 mmol)，25 ℃攪拌1 h。反應液經旋轉蒸發濃縮，得到無色油狀目標化合物8-2 (2.0 g，產率：95.8 % )。 LCMS (ESI) [M+H] += 451.1；
步驟三：將6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (1.2 g，4.46 mmol )溶於DMF(15 mL)中，依次加入HATU ( 1.7 g，4.46 mmol)，DIPEA (1.4 g，11.15 mmol)，於25 ℃下攪拌0.5 h，加入8-2(2 g，4.46 mmol )，在25 ℃下攪拌1 h。反應液經反相管柱(ACN/H 2O含0.1%TFA=5%-60%)純化，得到目標化合物8-3 (1 g，產率：37.0%) 。 LCMS (ESI) [M+H] += 701.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.87 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.05 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.93 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.22 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 6.75 (t, J= 4.4 Hz, 1H), 5.08 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.42 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 4.38 – 4.30 (m, 1H), 4.21 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.92 – 2.84 (m, 2H), 2.55 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 2.43 – 2.38 (m, 1H), 2.37 – 2.32 (m, 1H), 2.03 – 1.96 (m, 2H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.73 – 1.54 (m, 2H), 1.52 – 1.38 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 0.88 – 0.83 (m, 6H).
步驟四：將化合物8-3 (1.0 g，1.43 mmol) 溶於DMF(10 mL)中，加入二(對硝基苯)碳酸酯 (869 mg，2.86 mmol)、DIPEA (369 mg，2.86 mmol)，於25 ℃攪拌2 h。向反應液中加入MTBE(80 mL)打漿1h，抽濾。濾餅用無水乙醚(80 mL)打漿1h，抽濾、乾燥得到目標化合物8-4(1.1 g，產率：89.4%)。 LCMS (ESI) [M+H-Boc] += 766.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 10.06 (s, 1H), 9.12 (s, 2H), 8.35 – 8.28 (m, 2H), 8.00 – 7.89 (m, 2H), 7.64 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.59 – 7.54 (m, 2H), 7.41 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 6.78 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.39 – 4.30 (m, 1H), 4.27 – 4.18 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.92 – 2.90 (m, 1H), 2.89 – 2.85 (m, 2H), 2.55 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 2.43 – 2.31 (m, 2H), 2.03 – 1.95 (m, 1H), 1.88 – 1.77 (m, 2H), 1.74 – 1.56 (m, 2H), 1.42 – 1.35 (m, 3H), 1.35 (s, 9H), 0.89 – 0.82 (m, 6H).
步驟五：將化合物8-4 (18 mg, 0.02 mmol) 溶在DMF (1.5 mL)中，依次加入艾日布林(15 mg, 0.02 mmol)，DIPEA (7 mg, 0.05 mmol)於反應液中，反應液在室溫下攪拌2小時。反應液直接經反相層析(ACN/H 2O含0.05%TFA=5%-50%) 純化，得目標化合物8-5 (20 mg，產率67 %)。 LCMS (ESI) [M+Na] += 1479.0；
步驟六：將化合物8-5 (20 mg, 0.02 mmol) 溶在DCM (8 mL)中，加入TFA (0.4 mL)，於反應液中，反應液在室溫下攪拌2小時。LCMS監測反應。反應液直接經反相層析(ACN/H 2O含0.05%TFA=5%-50%) 純化，得目標化合物DL008 (12.5 mg，產率67 %)。61.9% LCMS (ESI) [M+Na] += 1379.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.99 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.15 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.95 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.61 (s, 2H), 7.58 – 7.52 (m, 2H), 7.28 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 7.07 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 4.99 – 4.90 (m, 3H), 4.89 – 4.84 (m, 2H), 4.81 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.63 – 4.57 (m, 2H), 4.40 – 4.32 (m, 2H), 4.29 (d, J= 9.7 Hz, 1H), 4.20 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 4.09 – 4.02 (m, 1H), 4.03 – 3.98 (m, 1H), 3.88 – 3.72 (m, 2H), 3.72 – 3.68 (m, 1H), 3.62 – 3.58 (m, 1H), 3.55 – 3.51 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.02 – 2.94 (m, 4H), 2.80 – 2.73 (m, 4H), 2.55 (t, J= 7.4 Hz, 5H), 2.42 – 2.35 (m, 3H), 2.04 – 1.90 (m, 7H), 1.89 – 1.78 (m, 4H), 1.77 – 1.67 (m, 6H), 1.66 – 1.59 (m, 3H), 1.58 – 1.49 (m, 4H), 1.48 – 1.39 (m, 5H), 1.36 – 1.28 (m, 5H), 1.04 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 0.88 – 0.84 (m, 6H). 實施例 1.9 ： 化合物 DL009 的製備
步驟一：將化合物9-1(1.0 g，1.76 mmol)、N-羥基丁二醯亞胺(0.24 g, 2.11 mmol)和DCC(0.44 g, 2.11 mmol)溶於DMF(10 mL)中，氮氣保護下25℃攪拌反應16 h。反應液滴入甲叔醚(50 mL)有固體析出。過濾，得目標化合物9-2(1.1 g，產率：93.9%)。 LCMS (ESI) [M-Boc+H] +=565.36.
步驟二：將化合物9-2 (200 mg, 0.35 mmol)和甘胺酸(52.55 mg, 0.70 mmol)於DCM(2 mL)溶液中加入TEA(70.83 mg, 0.70 mmol)，室溫攪拌反應2 h。反應液管柱層析(MeOH：DCM =0%-10%)純化，得目標化合物9-3(90.0 mg，產率：47.9%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=525.26. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 7.95-7.97 (m, 1H), 7.88-7.90 (m, 2H), 7.72-7.75 (m, 2H), 7.57-7.61 (m, 1H), 7.39-7.43 (m, 2H), 7.30-7.34 (m, 2H), 6.69-6.71 (m, 1H), 4.22-4.30 (m, 4H), 3.96 – 3.83 (m, 1H), 3.47 (s, 2H), 3.35 (s, 2H), 2.84-2.86 (m, 2H), 1.98-2.03 (m, 1H), 1.62-1.66 (m, 1H), 1.49-1.50 (m, 1H), 1.36 – 1.23 (m, 13H), 0.83-0.87 (m, 6H).
步驟三：將艾日布林(25.0 mg，0.034 mmol)、9-3(25.49 mg, 0.041 mmol)和HATU(15.51 mg, 0.041 mmol)溶於DMF(1 mL)中，再加入DIEA(5.27 mg, 0.041 mmol)氮氣保護下25℃攪拌反應2 h。反應濃縮後，管柱層析(MeOH：DCM =0%-10%)純化，得目標化合物9-4(33.0 mg，產率：72.6%)。 LCMS (ESI) [(M-Boc)/2+H] +=619.03.
步驟四：將化合物9-4 (33 mg, 0.025 mmol)於DMF(1 mL)和DEA(0.05 mL)中，室溫攪拌反應1 h。反應液加入THF(10 mL)，濃縮半小時後，得目標化合物9-5(27.51 mg)的DMF溶液。 LCMS (ESI) [(M-56)/2+H] +=529.91.
步驟五：將化合物9-5的(27.51 mg，0.025 mmol)DMF(1 mL)中加入6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(8.05 mg，0.030 mmol)、HATU(11.41 mg，0.030 mmol)和DIEA(9.69 mg，0.075 mmol)，氮氣保護下25℃攪拌反應2 h得目標化合物9-6(33.69 mg)的DMF溶液。 LCMS (ESI) [(M-Boc)/2+H] +=633.04.
步驟六：將化合物9-6 (33.69 mg, 0.025 mmol)的 DMF(1 mL)中，加入4 M HCl-DMF(1 mL)，室溫攪拌反應1 h。反應液經製備高效液相層析(ACN：0.1%FA in H 2O =10%-50%)純化，得目標化合物DL009(10.0 mg，三步產率：31.6%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=633.10. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.10 – 8.00 (m, 2H), 7.89 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.69 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.73-6.71 (m, 1H), 6.30 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.02-4.98 (m, 2H), 4.90-4.88 (m, 1H), 4.78 – 4.72 (m, 2H), 4.71-4.68 (m, 2H), 4.40-4.36 (m, 1H), 4.17-4.12 (m, 2H), 3.88-3.81 (m, 4H), 3.70 – 3.60 (m, 6H), 3.39 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.12 – 2.98 (m, 3H), 2.89-2.84 (m, 2H), 2.76 – 2.61 (m, 4H), 2.55-2.54 (m, 3H), 2.39 – 2.29 (m, 4H), 2.22-2.20 (m, 2H), 2.00 – 1.94 (m, 1H), 1.86-1.89 (m, 6H), 1.69 – 1.45 (m, 8H), 1.38-1.33 (m, 13H), 1.23-1.19 (m, 3H), 0.99 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 0.85-0.81 (m, 6H). 實施例 1.10 ：化合物 DL010 的製備
步驟 一：將化合物2-1 (1.0 g, 1.81 mmol)，甘胺酸叔丁酯(0.26 g, 1.99 mmol)溶於DMF(10 mL)，控溫0℃，攪拌5分鐘，再加入DMTMM(0.6 g, 2.17 mmol)，繼續反應1 h。反應液加入50 mL DCM稀釋，用 50 mL2%NaHCO 3水洗滌兩次，有機相再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，經管柱層析(MeOH：DCM=0-10%)純化得化合物10-2 (1.0 g，產率：82.98%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=665.54；
步驟 二：將化合物10-2 (800.0 mg, 1.2 mmol)溶於DMF (4 mL)，加入DEA (0.2 mL， 1.94 mmol)，室溫反應1h。反應液減壓濃縮後得粗產物直接用於下一步。將以上粗產物(400.0 mg, 0.9 mmol)，6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (265 mg, 0.99 mmol)溶於DMF(5 mL)，控溫0℃，攪拌5分鐘，再加入DMTMM (274 mg, 0.99 mmol)，繼續反應1h。反應液加入30 mL DCM稀釋，用 30 mL2%NaHCO 3水洗滌兩次，有機相再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後減壓濃縮，經管柱層析(MeOH：DCM=0-10%)純化得化合物10-3 (0.3 g，產率：36.1%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=693.56；
步驟三：將化合物10-3 (300 mg, 0.43 mmol)，溶於HCl/二氧六環 (4N，10 mL)，常溫反應1 h。反應液減壓濃縮後得目標化合物10-4 (250 mg，產率：85.8%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=637.41；
步驟四：將化合物10-4(30.0 mg, 0.045 mmol)，艾日布林(33 mg, 0.045 mmol)，HATU(18.8 mg, 0.050 mmol)溶於DMF (2 mL)，再加入DIPEA(17 mg, 0.14 mmol)室溫反應1 h。反應液經製備高效液相層析(ACN：H 2O含0.05%FA=5%-50%) 純化，得目標化合物DL010 (18 mg，產率：28.67%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=675.47； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.14 (s, 2H), 8.30 (s, 1H), 8.08 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.01 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 7.91 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.73 – 7.67 (m, 1H), 5.08 (s, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.86 (s, 1H), 4.78 (s, 1H), 4.66 (s, 1H), 4.58 (t, J= 4.1 Hz, 1H), 4.31 – 4.17 (m, 4H), 4.13 (s, 3H), 4.05 (s, 1H), 3.82 – 3.78 (m, 2H), 3.73 – 3.68 (m, 3H), 3.59 – 3.50 (m, 4H), 3.43 (s, 3H), 3.28 (s, 3H), 3.16 – 3.01 (m, 3H), 2.89 – 2.85 (m, 1H), 2.82 – 2.69 (m, 2H), 2.62 – 2.56 (m, 3H), 2.42 – 2.27 (m, 13H), 2.17 – 2.13 (m, 1H), 2.05 – 1.91 (m, 7H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.77 – 1.61 (m, 7H), 1.59 – 1.45 (m, 3H), 1.41 – 1.35 (m, 9H), 1.31 – 1.19 (m, 3H), 1.05 – 1.01 (m, 4H), 0.89 – 0.82 (m, 12H). 實施例 1.11 ：化合物 DL011 的製備
步驟一：將化合物5-1(500 mg，1.01 mmol)和11-1(265 mg g, 2.02 mmol)溶於DMF，0℃下加入DMTMM(500 mg，2.02 mmol)室溫攪拌反應2h。反應液經製備高效液相層析(ACN：H 2O 含0.05%FA=10%-90%)純化，得目標化合物11-2(62.2 mg，產率：100%)。 LCMS (ESI) [M+H]+ = 609.44
步驟二：將化合物11-2(200 mg，0.33 mmol)溶於DMF(4 mL), 加入DEA(0.4 mL), 室溫攪拌反應1h，反應液真空濃縮10min除去大量DEA，然後加入化合物6-(2-(甲基磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸(106 mg，0.40 mmol)和DMTMM(117 mg，0.40 mmol)，室溫攪拌反應1h。反應液經液相層析(ACN：H 2O含0.1%FA=10%-90%)純化得11-3(120mg，產率：57.1%)。 LCMS (ESI) [M/3+1] += 637.41.
步驟三：將化合物11-3(50 mg，0.079 mmol)溶於4M HCl/DMF(2 mL)中，室溫攪拌反應1 h。將反應液真空濃縮，用DCM(5*3 mL)帶蒸後得11-4(45 mg，產率：92.3%)。 LCMS (ESI) [M+H] += 581.34.
步驟四：將11-4 (32.24 mg, 0.052 mmol)、艾日布林(29.20 mg, 0.040 mmol,)和DMTMM (0.89 mg, 0.0032 mmol )溶於DMF (1 mL )中，室溫攪拌1小時。反應液經製備高效液相層析(ACN：H2O含0.1%FA=10%-90%)純化得DL011(11.2 mg，產率：21.7%)。 LCMS (ESI) [M/3+1] +=647.44 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.15 (s, 2H), 8.28 (s, 1H), 8.11 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.06 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.94 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.72 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 5.08 (s, 1H), 5.03 (s, 1H), 4.86 (s, 1H), 4.78 (s, 1H), 4.69–4.65 (m, 1H), 4.59 (t, J= 4.2 Hz, 1H), 4.33–4.27 (m, 1H), 4.26–4.17 (m, 3H), 4.15–4.11 (m, 3H), 4.09–4.01 (m, 1H), 3.88– 3.75 (m, 3H), 3.75–3.67 (m, 4H), 3.63–3.51 (m, 7H), 3.44 (s, 3H), 3.29 (s, 3H), 3.17–3.10 (m, 2H), 3.09–3.02 (m, 1H), 2.87 (d, J= 10.0 Hz, 1H), 2.84–2.67 (m, 3H), 2.6 –2.57 (m, 2H), 2.44–2.36 (m, 2H), 2.35–2.27 (m, 3H), 2.26–2.21 (m, 3H), 2.15 (s, 6H), 2.06–1.92 (m, 7H), 1.90–1.79 (m, 2H), 1.75–1.64 (m, 6H), 1.60–1.50 (m, 2H), 1.43– 1.21 (m, 8H), 1.07 (d, J= 6.4 Hz, 3H), 0.87 (dd, J= 8.9, 6.7 Hz, 6H). 實施例 1.12 ：化合物 DL012 的製備
步驟一：將化合物12-1 (5.0 g, 50.9 mmol)溶於甲苯 (170 mL)，加入四丁基溴化銨(6.3 g, 19.6 mmol)，降溫至0 ℃，加入氫氧化鈉(61.2 g, 535.5 mmol)，再加入化合物溴乙酸叔丁酯(34.78 g, 178.32 mmol)，於室溫下反應過夜。向反應液中加入水(80 mL)，然後用EA(80 mL ⅹ 3)萃取三次，合併有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾即為化合物12-2。(10.2 g，產率87%) 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.67 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.57 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 2.57 – 2.54 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.83 – 1.76 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).
步驟二：將化合物12-2 (10 g, 50.5 mmol)溶於THF (100 mL)，加入12-3 (10.35 g, 50.5 mmol)，雙三苯基膦二氯化鈀( 3.5 g, 5.05 mmol)，碘化亞銅 (1.92 g, 10.1 mmol)，TEA ( 15.3 g, 151.5 mmol)，氮氣氛圍下70 ℃攪拌反應過夜。反應液冷卻、過濾，濾液減壓濃縮後經管柱層析(PE：EA=5:1) 純化得到化合物12-4 (5.2 g，產率31.9%)。 LCMS (ESI) [M+H] += 323.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.67 (s, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.57 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 2.57 – 2.54 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.83 – 1.76 (m, 2H), 1.42 (s, 9H).
步驟三：將化合物12-4 (1.0 g, 3.1 mmol) 溶於DCM (50 mL)中，加入TFA (3.54 g, 31 mmol)，室溫攪拌反應過夜。反應液直接減壓濃縮得到化合物12-5 (1.5 g，粗產物)。 LCMS (ESI) [M+H] += 267.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 8.67 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.59 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 2.58 – 2.53 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 1.84 – 1.77 (m, 2H).
步驟四：將化合物12-5 (1.5 g, 5.6 mmol)溶於THF (20 mL)和水(20 mL)中，加入Oxone (10.3 g, 16.8 mmol)，室溫攪拌反應2小時。反應液減壓濃縮除去THF，水相經EA萃取 (50 mL) 三次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後經反相層析(ACN/H 2O含0.05%HCl=5%-50%) 純化，得到化合物12-6 (0.4 g, 兩步產率：43.2%)。 LCMS (ESI) [M+H] += 299.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 12.60 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.60 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 2.63 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 1.87 – 1.80 (m, 2H).
步驟五：將化合物12-7的(200.0 mg，0.53 mmol)、12-6(158.10 g, 0.53 mmol)和DMTMM(161.33 mg, 0.58 mmol)溶於DMF(2 mL)中，氮氣保護下25℃攪拌反應2 h。反應液加入DCM(10 mL)，有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL*2)洗滌兩次。乾燥，濃縮，得目標化合物12-8(310 mg，產率：88.7%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=660.45.
步驟六：將化合物12-8 (310 mg, 0.47 mmol)和對硝基苯基氯甲酸酯 (189.47 mg, 0.94 mmol)於DMF(3 mL)溶液中加入DIPEA(182.23 mg, 1.41 mmol)，室溫攪拌反應2 h。反應液經反相管柱層析(ACN：0.1%FA H 2O =10%-50%)純化，得目標化合物12-9(120.0 mg，產率：31.0%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=825.46.
步驟七：將化合物12-9(80.0 mg，0.11 mmol)和艾日布林(99.81 mg, 0.12 mmol)溶於DMF(1 mL)中，0℃下再加入DIPEA(42.65 mg, 0.33 mmol)氮氣保護下0℃攪拌反應2 h。反應濃縮後，高效液相層析製備(ACN：0.1%TFA H2O =10%-60%)純化，得目標化合物DL012(53.0 mg，產率：77.1%)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=709.03. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.03 (s, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.08-7.06 (m, 1H), 5.05 – 4.93 (m, 4H), 4.83-4.75 (m, 2H), 4.63-4.54 (m, 2H), 4.40 – 4.25 (m, 3H), 4.20 – 3.96 (m, 8H), 3.83 – 3.73 (m, 6H), 3.50-3.46 (m, 4H), 3.40 (s, 3H), 3.26-3.22 (m, 4H), 3.04-2.97 (m, 4H), 2.85 – 2.62 (m, 6H), 2.34 – 2.12 (m, 6H), 2.07 – 1.86 (m, 9H), 1.75 – 1.16 (m, 18H), 1.04-0.96 (m, 4H), 0.87-0.79 (m, 6H). 實施例 1.13 ： 化合物 DL013 的製備
步驟一：將化合物13-1(500.0 mg，2.11 mmol)、13-2(388.55 g, 2.11 mmol)和雙三苯基膦氯化鈀(148.04 mg, 0.21 mmol)溶於DMF(2 mL)中，再加入TEA(640.53, 6.33 mmol)。氮氣保護下65℃攪拌3 h；反應液濃縮，直接管柱層析(0~50% EA in PE)純化，得目標化合物13-3(580 mg，產率：80.8%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=341.22.
步驟二：將化合物13-3(580.0 mg，1.70 mmol)溶於DCM(6 mL)和TFA(1 mL)中，室溫攪拌2 h；反應液濃縮，直接管柱層析(0~10% MeOH in DCM)純化，得目標化合物13-4(250 mg，產率：51.7%)。 LCMS (ESI) [M+H] +=285.13. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 9.11 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.71 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 2.84 (t, J = 8.0 Hz, 2H).
步驟三：於反應瓶中加入化合物13-4(284 mg，1.0 mmol)，DMF(1 mL)，DMTMM-H2O(295 mg，1.0 mmol)，室溫攪拌10 min。加入化合物12-7(380 mg，1.0 mmol)，反應30 min。反應液經製備高效液相層析(ACN：H 2O含0.05%HCl=5%-50%) 純化，凍乾後將固體溶於40 mL DCM，使用碳酸氫鈉水溶液(30 mL，wt=2%)水洗一次，40 mL水洗一次，過濾，分液，將濾出固體與DCM相混合，35℃水浴減壓濃縮乾，得目標化合物13-5(500 mg，產率：77.4 %)。 LCMS (ESI) [M+H] +=646.37；
步驟四：於反應瓶中加入化合物13-5(100 mg，0.15 mmol)，DCM(10 mL)，二(對硝基苯)碳酸酯(137 mg，0.45 mmol)，TEA(46 mg，0.45 mmol)，27℃攪拌16 h。加入6 mL DMF，室溫下水浴減壓濃縮掉DCM，經高效液相層析(ACN：H 2O含0.1%FA=5%-50%)純化，得目標化合物13-6 (40 mg，產率：31.9 %)。 LCMS (ESI) [M+H] +=811.59；
步驟五：於反應瓶中加入DMF(1 mL)，化合物13-6(23.4 mg，0.029 mmol)，艾日布林甲磺酸鹽(20 mg，0.024 mmol)，DIPEA(9.3 mg，0.072 mmol)，室溫反應1 h。反應液經高效液相層析(ACN：H 2O含0.1%FA=5%-50%) 純化，得目標化合物DL013 (16 mg，產率：46.8 %)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=701.48； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.02 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.34 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.63-7.47 (m, 3H), 7.34-7.21 (m, 2H), 7.07 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 5.97 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.08-4.88 (m, 4H), 4.83 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.66-4.61 (m, 1H), 4.58-4.50 (m, 2H), 4.45-4.36 (m, 1H), 4.36-4.30 (m, 1H), 4.29-4.22 (m, 1H), 4.21-4.13 (m, 1H), 4.13-4.07 (m, 3H), 4.06-3.97 (m, 3H), 3.84-3.64 (m, 5H), 3.57-3.45 (m, 3H), 3.38 (s, 3H), 3.31-3.29 (m, 1H), 3.27-3.21 (m, 4H), 3.07-2.92 (m, 4H), 2.90-2.81 (m, 3H), 2.80-2.64 (m, 2H), 2.61-2.52 (m, 1H), 2.35-2.11 (m, 6H), 2.05-1.84 (m, 7H), 1.77-1.12 (m, 17H), 1.08-0.92 (m, 4H), 0.86 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 0.79 (d, J= 6.8 Hz, 3H). 實施例 1.14 ： 化合物 DL014 的製備
步驟一：用DMF(2 mL)溶解14-1(120 mg，0.089 mmol)，加入DEA(0.2 mL)後在室溫下攪拌反應2小時。反應液用THF稀釋，旋轉蒸發三次除去DEA，得到14-2的DMF溶液直接用於下一步反應。 LCMS (ESI) [M/2+H] += 562.42.
步驟二：向14-2的DMF溶液(0.089mmol，2 mL)加入12-5(31.86 mg，0.11 mmol)，將反應降溫至-10℃後，加入DMTMM(29.55 mg，0.11 mmol)，反應在-10℃下反應2小時。反應液恢復至常溫後過用微孔濾膜濾除不溶物，清液經製備高效液相層析(ACN：H 2O含0.05%FA=5%-50%)純化，得目標化合物DL014(26.7 mg，兩步產率：21.3%) LCMS (ESI) [M/2+H] += 702.63. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.03 (s, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.33 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 8.28–7.94 (m, 1H), 7.89–7.54 (m, 3H), 7.47 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 7.38–7.11 (m, 8H), 5.97 (s, 1H), 5.39 (s, 3H), 5.33 (d, J= 4.9 Hz, 1H), 5.15–4.90 (m, 3H), 4.55–4.21 (m, 6H), 4.05–3.90 (m, 6H), 3.61 (t, J= 6.2 Hz, 3H), 3.39 (s, 3H), 3.23 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 3.19 (d, J= 9.3 Hz, 3H), 3.11 (s, 2H), 3.08–2.91 (m, 4H), 2.86 (d, J= 14.1 Hz, 3H), 2.64 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 2.40 (d, J= 15.8 Hz, 1H), 2.31–2.21 (m, 1H), 2.15–1.97 (m, 4H), 1.87 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 1.79–1.67 (m, 2H), 1.62–1.40 (m, 2H), 1.07–0.97 (m, 6H), 0.94–0.72 (m, 28H). 實施例 1.15 ：化合物 DL015 的製備
步驟一：於反應瓶中加入化合物5-1(300 mg，0.61 mmol)，對胺基苄醇(150 mg，0.22 mmol)，DCM(1.5 mL)，MeOH(0.5 mL)，EEDQ(302 mg，1.22 mmol)，27℃攪拌16 h， LCMS監測反應，反應液經製備高效液相層析(ACN：H 2O含0.05%HCl=5%-50%) 純化，製備液使用碳酸氫鈉水溶液(30 mL，wt=2%)調節pH=7~8，DCM(30 mL)萃取3次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥0.5 h，30℃水浴減壓濃縮乾，得目標化合物15-1(106 mg，產率：29.2 %)。 LCMS (ESI) [M+H] +=601.41
步驟二：於反應瓶中加入化合物15-1(100 mg，0.17 mmol)，THF(4 mL)，DEA(0.8 mL)，27℃攪拌2 h，LCMS監測反應。將反應液於40℃水浴減壓濃縮乾，加入DCM(4 mL)溶解後繼續濃縮乾，再重複一次，得到反應液濃縮物。將12-5(61 mg，0.20 mmol)溶於DMF(2 mL)，加入DMTMM-H 2O(60 mg，0.20 mmol)，27℃攪拌10 min，加入上述反應液濃縮物，反應30 min，LCMS監測反應，反應液經製備高效液相層析(ACN：H 2O含0.05%HCl=5%-50%) 純化，製備液使用碳酸氫鈉水溶液(30 mL，wt=2%)調節pH=7~8，DCM(20 mL)萃取4次，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥0.5 h，30℃水浴減壓濃縮乾，得目標化合物15-2(73 mg，產率：66.6 %)。 LCMS (ESI) [M+H] +=659.44
步驟三：於反應瓶中加入化合物15-2(73 mg，0.11 mmol)，DMF(4 mL)，二(對硝基苯)碳酸酯(134 mg，0.44 mmol)，DIPEA(71 mg，0.55 mmol)，27℃攪拌16 h，LCMS監測反應，經高效液相層析(ACN：H 2O含0.1%FA=5%-50%)純化，得目標化合物15-3甲酸鹽(50 mg，產率：51.9 %)。 LCMS (ESI) [M+H] +=824.44
步驟四：於反應瓶中加入DMF(1 mL)，化合物15-3(25 mg，0.029 mmol)，艾日布林甲磺酸鹽(20 mg，0.024 mmol)，DIPEA(9.3 mg，0.072 mmol)，26℃反應1 h，LCMS監測反應，反應液經高效液相層析(ACN：H 2O含0.1%TFA=5%-50%) 純化，得目標化合物DL015三氟乙酸鹽 (8 mg，產率：21.6 %)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=708.18 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.08 (s, 1H), 9.30 (s, 1H), 9.13 (s, 2H), 8.38 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.60 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.52 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.31 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.08 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 5.13-5.05 (m, 1H), 5.04-4.92 (m, 3H), 4.86 (s, 1H), 4.78 (s, 1H), 4.70-4.64 (m, 1H), 4.60-4.56 (m, 1H), 4.47-4.39 (m, 1H), 4.36-4.26 (m, 2H), 4.24-4.17 (m, 1H), 4.16-4.10 (m, 3H), 4.09-4.01 (m, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.88-3.75 (m, 2H), 3.75-3.68 (m, 1H), 3.65 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 3.57-3.51 (m, 3H), 3.30-3.25 (m, 4H), 3.07-2.97 (m, 4H), 2.90-2.84 (m, 1H), 2.81-2.74 (m, 7H), 2.70-2.64 (m, 2H), 2.63-2.54 (m, 3H), 2.36-2.14 (m, 6H), 2.08-1.86 (m, 10H), 1.82-1.61 (m, 9H), 1.58-1.46 (m, 3H), 1.39-1.19 (m, 8H), 1.11-0.94 (m, 4H), 0.89 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J= 6.8 Hz, 3H). 實施例 1.16 ： 化合物 DL016 的製備
步驟一：於反應瓶中加入DMF(1 mL)，化合物MMAE(20 mg，0.028 mmol)，化合物15-3(34.02 mg，0.042 mmol)，DIPEA(6.64 mg，0.084 mmol)，攪拌下加入HOBT(5.68 mg, 0.042 mmol)，室溫攪拌4小時。反應液經高效液相層析(ACN：H 2O含0.1%TFA=10%-60%) 純化，得目標化合物DL016的三氟乙酸鹽 (3.5 mg)。 LCMS (ESI) [M/2+H] +=702.09 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 10.07 (s, 1H), 9.32 (s, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.27-8.25 (m, 1H), 8.04 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62-7.56 (m, 2H), 7.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 – 7.17 (m, 7H), 7.19-6.98 (m, 1H), 5.06-4.96 (m, 2H), 4.75-6.50 (m, 1H), 4.56 – 4.35 (m, 3H), 4.31-4.26 (m, 2H), 4.06-3.92 (m, 4H), 3.78-3.76 (m, 3H), 3.40 (s, 3H), 3.25-3.15 (m, 7H), 3.16 – 2.93 (m, 6H), 2.88-2.83 (m, 3H), 2.75-2.73 (m, 6H), 2.66-2.62 (m, 2H), 2.43-2.38 (m, 1H), 2.35-2.19 (m, 1H), 2.18-1.91 (m, 4H), 1.91-1.84 (m, 2H), 1.82-1.57 (m, 7H), 1.57-1.43 (m, 2H), 1.40-1.18 (m, 4H), 1.11-0.93 (m, 7H), 0.92-0.72 (m, 25H). 實施例 1.17 ： 化合物 DL017 的製備
步驟一：將17-1 (50.0 mg, 0.098 mmol)溶於THF (3 mL)和DCM (3 mL)中，0℃攪拌15mins，加對硝基氯甲酸苯酯(59.26 mg, 0.29 mmol)和TEA (49.58 mg, 0.49 mmol)，20℃攪拌反應3h，補加對硝基氯甲酸苯酯(39.51 mg, 0.20 mmol)和TEA (19.83 mg, 0.20 mmol)。減壓濃縮，粗產物經反相管柱層析(ACN：H2O含0.05%甲酸=10%-90%)純化，得目標化合物17-2(66.0 mg)。 LCMS (ESI) [M+H]+ = 675.33.
步驟二：將化合物12-9(200 mg，0.24 mmol)溶於DMF(5 mL)，加入N-Boc-N，N’-二甲基乙二胺(50 mg，0.26 mmol)，DIPEA(37 mg，0.29 mmol)，18℃反應2h。反應液經製備高效液相層析(ACN：H2O含0.05%FA=5%-50%)純化，得目標化合物17-3 (170 mg)。 LCMS (ESI) [M+H]+ =874.57.
步驟三：將TFA(400 μL)溶於DCM(4 mL)，降至0℃，加入17-3(165 mg)，保持0℃反應2h。反應液經製備高效液相層析(ACN：H2O含0.05%FA=5%-50%)純化，得17-4的甲酸鹽 (87 mg)。 LCMS (ESI) [M/2+H]+ =387.91. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.14 (s, 1H), 9.13 (s, 2H), 8.42 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.67-7.58 (m, 2H), 7.52 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.38-7.22 (m, 2H), 6.08 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.47 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 4.46-4.37 (m, 1H), 4.37-4.30 (m, 1H), 3.98 (s, 2H), 3.64 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.47-3.36 (m, 5H), 3.10-2.94 (m, 2H), 2.93-2.79 (m, 5H), 2.66 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.52-2.37 (m, 5H), 2.08-1.98 (m, 1H), 1.95-1.85 (m, 2H), 1.78-1.55 (m, 2H), 1.53-1.29 (m, 2H), 0.95-0.75 (m, 6H).
步驟四： 將17-4(61.0 mg, 0.074 mmol)溶於DCM (5 mL)和DMF (0.5 mL)中，加17-2(50.0 mg, 0.074 mmol)和TEA (22.0 mg, 0.22 mmol)，20℃攪拌反應2h，減壓濃縮，粗產物經製備高效液相層析(ACN：H2O含 0.1%甲酸=10%-90%)純化，得目標化合物DL017 (46.9 mg)。 LCMS (ESI) [M+H]+ = 1309.74. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.59 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 10.03 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 9.10 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.08 (dt, J = 9.1, 4.7 Hz, 1H), 7.50 (qd, J = 17.8, 16.3, 9.3 Hz, 4H), 7.39 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 40.9, 8.1 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.00 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.03 (s, 1H), 4.98 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.72 (q, J = 8.3, 6.5 Hz, 1H), 4.67 – 4.57 (m, 1H), 4.38 (s, 1H), 4.31 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 4.08 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.60 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39 (m, 6H), 3.12 (s, 2H), 3.02 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 2.99 – 2.89 (m, 4H), 2.87 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.63 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.56 (s, 2H), 2.00 (dt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 1.87 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.77 – 1.19 (m, 8H), 0.83 (dd, J = 24.0, 6.6 Hz, 6H). 二、多彈頭抗體偶聯藥物的製備 實施例 2.1 ： HER2- ADC-001 的製備
將曲妥珠單抗共12.55mg，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；分別取抗體6倍莫耳當量的10mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體3倍莫耳當量的10mmol/L的溶解於DMSO中的DL001混勻後，加入上述抗體中，混勻後25℃靜置2小時，得到偶聯後樣。反應結束後使用30KDa的超濾管將樣品置換到pH為6.0的20mM組胺酸緩衝液中並去除低分子物質，最後將樣品濃縮以獲得HER2-ADC-001。
採用RP-LC/MS進行偶聯後樣品的DAR值測定LC/MS型號：
名稱 廠家 型號
UPLC AB SCIEX ExionLC
高分辨質譜儀 AB SCIEX X500B
液相參數
層析管柱 Xbridge Protein BEH SEC (2.5μm,4.6*150mm)
流速 0.3ml/min
柱溫 30℃
進樣量 1μl
樣品室溫度 8℃
流動相 流動相A: 0.1%FA in H 2O
流動相B: 0.1%FA in ACN
Time/min 0 5 7 7.1 10
A% 90 20 20 90 90
B% 10 80 80 10 10
質譜結果顯示，HER2-ADC-001樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL001比例分別為18.2%，55.3%，26.4%)、重鏈偶聯0~3個毒素分子(HC、DAR1、DAR2、DAR3-2*DL003-DL001、DAR3-DL003-2*DL001、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL001的比例分別為0%，0%，0%，16.2%，2.5%，70.0%，11.2%)，由此計算HER2-ADC-001樣品偶聯比(DAR值)為7.6，且每一莫耳抗體分別偶聯了6.00莫耳DL003和1.62莫耳DL001。即n1=6.00，n2=1.62。 實施例 2.2 ： HER2- ADC-002 的製備
方法一：將曲妥珠單抗共6.28 mg，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.45；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，30℃放置90分鐘；取抗體5.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體3.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL007混勻後，加入上述抗體中，混勻後30℃靜置3小時，得到偶聯後樣品HER2-ADC-002。
採用實施例2.1質譜檢測方法，結果顯示：HER2-ADC-002樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL007比例分別為(13.3%，47.6%，39.1%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL007、DAR3-DL003-2*DL007、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL007的比例分別為22.2%，1.2%，54.2%，22.5%)，由此計算HER2-ADC-002樣品偶聯比(DAR值)為7.7，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.1莫耳DL003和2.6莫耳DL007。即n1=5.1，n3=2.6。
方法二：將曲妥珠單抗共6.28 mg，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.45；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，30℃放置90分鐘；先加入抗體5.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003，在反應1h後加入抗體3.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL007，反應2h後，得到偶聯後樣品HER2-ADC-002。
採用實施例2.1質譜檢測方法，結果顯示：HER2-ADC-002樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL007比例分別為(12%，50.2%，37.8%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL007、DAR3-DL003-2*DL007、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL007的比例分別為5%，0%，66%，29%)，由此計算HER2-ADC-002樣品偶聯比(DAR值)為7.8，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.2莫耳DL003和2.6莫耳DL007。即n1=5.2，n3=2.6。 實施例 2.3 ： HER2- ADC-003 的製備
將曲妥珠單抗共25.1 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.47；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，30℃放置90分鐘；先加入抗體6.2倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003，在反應1h後加入抗體3.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL007反應2h後加入過量半胱胺酸，命名為HER2-ADC-003。採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-003樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-003樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DL003，DAR1-DL007比例分別為(7.6%，56.9%，35.5%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL007、DAR3-DL003-2*DL007、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL007的比例分別為14.9%，8.2%，67.4%，9.5%)，由此計算HER2-ADC-003樣品偶聯比(DAR值)為7.8，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.9莫耳DL003和1.9莫耳DL007。即n1=5.9，n3=1.9。 實施例 2.4 ： HER2- ADC-004 的製備
將曲妥珠單抗共14.0 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.47；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；取抗體的4.2倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL007和抗體4.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL002混勻後，加入上述抗體中，混勻後25℃靜置2小時，結束後採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到偶聯後樣品Her2-ADC-004.
質譜結果顯示，Her2-ADC-004樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL002，DAR1-DL007比例分別為(8.4%，47.7%，43.9%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL002-DL007、DAR3-DL002-2*DL007、DAR3-3*DL002、DAR3-3*DL007、DAR2-2*DL002、DAR2-2*DL007、DAR2-DL002-DL007的比例分別為34.2%，28.5%，22.0%，13.6%，0.5%，0.5%，0.6%)，由此計算Her2-ADC-004樣品偶聯比(DAR值)為7.8，且每一莫耳抗體分別偶聯了4.3莫耳DL002和3.5莫耳DL007。n2=4.3，n3=3.5。 實施例 2.5 ： HER2- ADC-005 的製備
將0.5 mL 曲妥珠單抗共12.35 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.56；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體6.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-005樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-005樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL012比例分別為(3.8%，65.7%，30.6%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL012、DAR3-DL003-2*DL012、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL012的比例分別為24.5%，4.8%，66.5%，4.2%)，由此計算HER2-ADC-005樣品偶聯比(DAR值)為7.9，且每一莫耳抗體分別偶聯了6.38莫耳DL003和1.54莫耳DL012。n1=6.38，n2=1.54。 實施例 2.6 ： HER2- ADC-006 的製備
將0.5 mL 曲妥珠單抗共12.35mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.56；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體7.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體4倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-006樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-006樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL012比例分別為(2.7%，77.7%，19.5%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL012、DAR3-DL003-2*DL012、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL012的比例分別為23.2%，2.6%，74.3%，0.0%)，由此計算HER2-ADC-006樣品偶聯比(DAR值)為7.9，且每一莫耳抗體分別偶聯了6.99莫耳DL003和0.96莫耳DL012。n1=6.99，n2=0.96。 實施例 2.7 ： HER2- ADC-007 的製備
將0.6 mL 曲妥珠單抗共14.82 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.44；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體5.6倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體2倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-007樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-007樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL012比例分別為(11.3%，59.3%，29.4%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL012、DAR3-DL003-2*DL012、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL012的比例分別為16.8%，2.0%，65.8%，15.4%)，由此計算HER2-ADC-007樣品偶聯比(DAR值)為7.8，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.85莫耳DL003和1.93莫耳DL012。n1=5.85，n2=1.93。 實施例 2.8 ： HER2- ADC-008 的製備
將0.7 mL 曲妥珠單抗共17.29 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.37；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體4.7倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003(0.073 mg)和抗體4.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012(0.087 mg)，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-008樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-008樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL012比例分別為(0.0%，36.0%，64.0%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL012、DAR3-DL003-2*DL012、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL012的比例分別為23.9%，7.4%，48.8%，19.9%)，由此計算HER2-ADC-008樣品偶聯比(DAR值)為8.0，且每一莫耳抗體分別偶聯了4.75莫耳DL003和3.25莫耳DL012。n1=4.75，n2=3.25。 實施例 2.9 ： HER2- ADC-009 的製備
將0.7 mL 曲妥珠單抗共17.29 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.37；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體5.4倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003(0.084 mg)和抗體4.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012(0.077 mg)，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-009樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-009樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL012比例分別為(2.5%，48.4%，49.1%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL012、DAR3-DL003-2*DL012、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL012的比例分別為21.5%，7.8%，57.1%，13.6%)，由此計算HER2-ADC-009樣品偶聯比(DAR值)為7.9，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.41莫耳DL003和2.54莫耳DL012。n1=5.41，n2=2.54。 實施例 2.10 ： HER2- ADC-010 的製備
將0.8 mL 曲妥珠單抗共19.76 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.43；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體6.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體4.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL014，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-010樣品，取樣檢測DAR值。
結果顯示，HER2-ADC-010樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子(LC，DAR1-DL003，DAR1-DL014比例分別為1.0 %，53.9%，45.1%)、重鏈偶聯3個毒素分子(DAR3-2*DL003-DL014、DAR3-DL003-2*DL014、DAR3-3*DL003、DAR3-3*DL014的比例分別為11.9%，2.6%，70.0%，15.6%)，由此計算HER2-ADC-010樣品偶聯比(DAR值)為8.0，且每一莫耳抗體分別偶聯了5.8莫耳DL003和2.2莫耳DL014。n1=5.8，n3=2.2。 實施例 2.11 ： HER2- ADC-011 的製備
將0.5mL曲妥珠單抗共12.35 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體3.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體1.6倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL014，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-011樣品，取樣檢測DAR值：每一莫耳抗體分別偶聯了3.0莫耳DL003和0.9莫耳DL014。n1=3.0，n3=0.9。 實施例 2.12 ： HER2- ADC-012 的製備
將0.5mL曲妥珠單抗共12.35 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體4.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體1.6倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL014，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-012樣品，取樣檢測DAR值：每一莫耳抗體分別偶聯了4.1莫耳DL003和1.3莫耳DL014。n1=4.1，n3=1.3。 實施例 2.13 ： HER2- ADC-013 的製備
將0.5mL曲妥珠單抗共12.35mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入混合後的抗體6.1倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003和抗體2.5倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-013樣品，取樣檢測DAR值:每一莫耳抗體分別偶聯了4.7莫耳DL003和0.9莫耳DL012。n1=4.7，n2=0.9。 實施例 2.14 ： HER2- ADC-014 的製備
將0.4mL曲妥珠單抗共11.52 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.45；加入抗體5.75倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；先加入抗體6.8倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003，25℃反應2 h；然後加入抗體3倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL017，25℃反應4 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.98的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-014樣品，取樣檢測DAR值:每一莫耳抗體分別偶聯了7.2莫耳DL003和0.8莫耳DL017。n1=7.2，n2=0.8。 實施例 2.15 ： HER2- ADC-015 的製備
將0.4mL曲妥珠單抗共11.52 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.45；加入抗體5.75倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；先加入抗體6.2倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003，25℃反應2 h；然後加入抗體3倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL017，25℃反應4 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.98的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-ADC-015樣品，取樣檢測DAR值:每一莫耳抗體分別偶聯了7.0莫耳DL003和1.0莫耳DL017。n1=7.0，n2=1.0。 實施例 2.16 ： B7H3 - ADC-001 的製備
將B7H3抗體(2E3-02)濃度17.2 mg/mL，共342.71 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入抗體6.0倍莫耳當量的溶於DMSO的DL003和抗體2.05倍莫耳當量的溶於DMSO的DL014混合物0.680g，25℃反應4h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.98的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到B7H3-ADC-001樣品，取樣檢測DAR值：每一莫耳抗體分別偶聯了5.96莫耳DL003和1.82莫耳DL014。n1=5.96，n3=1.82。 實施例 2.17 ： B7H3 - ADC-002 的製備
將 B7H3抗體(2E3-02)濃度17.2 mg/mL，共345.01mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入抗體6.25倍莫耳當量的溶於DMSO的DL003和抗體2.14倍莫耳當量的溶於DMSO的DL014混合物0.714g，25℃反應4h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.98的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到B7H3-ADC-002樣品，取樣檢測DAR值：每一莫耳抗體分別偶聯了6.21莫耳DL003和1.77莫耳DL014。n1=6.21，n3=1.77。 實施例 2.18 ： B7H3 - ADC-003 的製備
將 B7H3抗體(2E3-02)濃度17.2 mg/mL，共339.44mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.5；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置120分鐘；先加入抗體6.03倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL003，25℃反應1小時；然後再加入抗體3.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL014，25℃放置180分鐘後加入過量半胱胺酸，得到B7H3-ADC-003樣品，取樣檢測DAR值：每一莫耳抗體分別偶聯了6.0莫耳DL003和1.99莫耳DL014。n1=6.01，n3=1.99。 三、單毒素抗體偶聯 藥 物的製備 實施例 3.1 HER2-DL012-DAR2 的製備
將0.4 mL 曲妥珠單抗共9.88 mg，加入終濃度為1 mM的依地酸鈉溶液混勻，用0.5 M磷酸氫二鈉溶液調節樣品pH至7.45；加入抗體5.5倍莫耳當量的20 mmol/L的TCEP溶液，混勻，25℃放置90分鐘；加入抗體5.0倍莫耳當量的10 mmol/L的溶解於DMSO中的DL012(0.055 mg)，25℃反應2 h後加入過量半胱胺酸，採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液，得到HER2-DL012-DAR2樣品，DAR值1.8。 實施例 3.2 HER2-DL003-DAR8 的製備
取5.0 mL 曲妥珠單抗(16.1 mg/mL)，用0.10 mL 20 mM PB+100 mM依地酸二鈉溶液(pH 7.6)稀釋，以0.5 M Na 2HPO 4溶液調pH至7.46。取上述溶液1.0 mL加入20 mM TCEP(0.0278 ml，0.556 µmol)溶液混勻，室溫放置90 min。然後加入DL003(1.332 mg，10倍抗體物質莫耳數量)的DMSO(0.1213 mL)溶液，混勻，室溫靜置2 h，完畢後採用離心超濾管(Merck,Amicon Ultra-15)進行換液，緩衝液置換為pH5.9的20 mM His-Hcl緩衝溶液。得到HER2-DL003-DAR8，DAR值為8.0。 四、抗體偶聯藥物 (ADC) 的體外細胞活性測試 實施例 4.1 ： ADC 對 N87 腫瘤細胞的增殖抑制活性測試
實驗方法
復甦培養N87(1640+10%FBS)細胞，以5000/孔、100ul/孔的密度鋪於96孔平底盤，37℃培養箱培養過夜。次日，使用完全培養基稀釋待測ADC分子，使其最高濃度為1000nM，4倍稀釋10個點。加入100ul稀釋後的ADC-003至細胞培養孔(每孔2個平行)。37℃培養4天後，每孔加入50ul Cell titer glo受質，孵育5分鐘後檢測螢光值。其中，關鍵物料來源如下表1所示： 表1物料來源
名稱 廠家或來源 貨號
N87細胞 普諾賽 CL-0211
1640培養基 ADamas life C8016
胎牛血清 Cornning 35-081-CV
Cell titer glo受質 ADamas life RA-GL11-A
實驗結果： 表2 ADC對N87腫瘤細胞體外增殖抑制活性
編號 IC 50值
HER2-ADC-003 2.45nM
HER2-ADC-005 0.05nM
HER2-ADC-006 0.05nM
HER2-ADC-007 0.04nM
HER2-ADC-008 0.01nM
HER2-ADC-009 0.02nM
HER2-ADC-014 2.21nM
HER2-ADC-015 3.23nM
B7H3-ADC-003 0.80nM
如表2所示，本揭示的多彈頭ADC分子在N87腫瘤細胞系上均有明顯的增殖抑制活性。 實施例 4.2 ：多彈頭 ADC 對多種人腫瘤細胞系體外增殖抑制活性檢測
實驗方法
使用HER2高表達細胞系SKBR3及HER2低表達細胞系H358、MCF7檢測多彈頭ADC的細胞生長抑制活性。按照常規方法即37℃、5%CO2培養箱及細胞指定培養基培養H358(RPMI1640+10%FBS)、SKBR3 (RPMI1640+10%FBS)、MCF7(DMEM+10%FBS+5ug/ml胰島素)腫瘤細胞。使用胰酶透過常規方法對H358、SKBR3、MCF7腫瘤細胞進行消化，收集細胞並計數。使用對應完全培養基重新懸浮細胞，將5000細胞/孔加至96孔盤，100ul/孔。使用完全培養基稀釋待測藥物：多彈頭ADC的藥物濃度從2000nM起始，4倍稀釋10個濃度點。共100uL已稀釋的ADC加入至含100ul培養基及細胞的96孔盤，37℃ 5%CO2培養箱中培養4天。孵育結束後，各細胞孔加入50ul cell titer glow受質，室溫孵育5分鐘後檢測全波長螢光值。使用GraphPad軟體作劑量依賴的細胞增殖抑制圖並分析其半數抑制濃度(IC 50，nM)。其中關鍵物料來源如下表3所示： 表3物料來源
名稱 廠家或來源 貨號
SKBR3細胞 普諾賽 CL-0211
H358細胞 中國科學院細胞庫 TCHu151
MCF7細胞 ATCC HTB-22
RPMI1640 ADamas life C8016
DMEM ADamas life C8013
胰島素 YEASEN 40112ES60
2、實驗結果 表4 ADC對多種腫瘤細胞體外增殖抑制活性
                   細胞 ADC編號 H358 IC 50，nM SKBR3 IC 50，nM MCF7 IC 50，nM
HER2-ADC-005 0.96 0.05 0.02
HER2-ADC-006 0.68 0.05 0.03
HER2-ADC-007 0.65 0.04 0.02
HER2-ADC-008 0.41 0.01 /
HER2-ADC-009 0.32 0.02 /
註：“/”表示未測試
如表4所示，本揭示的多彈頭ADC分子在HER2高表達或HER2低表達的腫瘤細胞系上均有明顯的增殖抑制活性。 實施例 4.3 ：多彈頭 ADC 對 ABCB1/ABCG2 轉運體過表達的 N87 細胞體外增殖抑制活性檢測
1、實驗方法
使用人ABCB1或人ABCG2過表達的N87細胞(ATCC，由藥明康德改造)檢測多彈頭ADC、單毒素ADC的增殖抑制活性。按照常規方法即37℃、5%CO 2培養箱及細胞指定培養基(RPMI1640+10%FBS)培養人ABCB1及人ABCG2過表達的N87腫瘤細胞。使用胰酶透過常規方法對腫瘤細胞進行消化，收集細胞並計數。使用對應完全培養基重新懸浮細胞，將3000細胞/孔加至96孔盤，100ul/孔。ADC的樣品濃度梯度製備：使用完全培養基稀釋待測藥物，對於人ABCB1過表達N87細胞，各ADC藥物濃度從2000nM起始，5倍稀釋10個濃度點；對於人ABCG2過表達N87細胞，HER2-DL003-DAR8從2000nM起始，5倍稀釋10個濃度點，其他ADC藥物從200nM起始稀釋10個濃度點。共100uL已稀釋的ADC加入至含100ul培養基及細胞的96孔盤，37℃ 5%CO2培養箱中培養6-7天(毒素為7天，ADC為6天)。孵育結束後，各細胞孔加入75ul cell titer glow受質，室溫孵育10分鐘後檢測全波長螢光值。 使用GraphPad軟體作劑量依賴的細胞增殖抑制圖並分析其半數抑制濃度(IC 50，nM)。
2、實驗結果 表5 ADC對轉運體過表達腫瘤細胞體外增殖抑制活性
                       細胞 ADC編號 NCI N87 hABCB1 IC 50，nM NCI N87 hABCG2 IC 50，nM
HER2-ADC-007 54.6 0.02
HER2-DL012-DAR2(單毒素ADC)在人ABCB1過表達的N87腫瘤細胞丟失活性，HER2-DL003-DAR8(單毒素ADC)在人ABCG2過表達N87細胞失去活性，而多彈頭ADC分子在上述兩種轉運體過表達細胞中均保留良好活性(如表5所示)。由此可知，本揭示的多彈頭ADC能夠克服單毒素ADC的耐藥問題。 實施例 4.4 ：多彈頭 ADC 對 Enhertu 耐藥的 NCI-N87 腫瘤細胞體外活性抑制的檢測
1、實驗方法：
復甦培養對Enhertu耐藥的NCI-N87腫瘤細胞(RPMI 1640 + 10% FBS + 1μg/mL puromycin+100ng/ml Enhertu)(由藥明康德改造)細胞，以2E4/孔、135 µL/孔的密度鋪於96孔平底盤，37℃培養箱培養過夜。次日，使用無血清的培養基稀釋待測ADC分子，使其最高終濃度為300 nM，4倍稀釋，總共9個點。加入15 µL稀釋後的ADC樣品(10*)至細胞培養孔。37℃培養6天後，每孔加入75 µL CellTiter-Glo受質，用鋁箔紙包裹細胞盤以避光。將培養盤在軌道搖床上振搖2分鐘以誘導細胞裂解。將培養盤在室溫放置10分鐘以穩定發光信號，然後在2104 EnVision 讀盤器上檢測發光信號。
2、實驗結果： 表6 ADC對Enhertu耐藥的NCI-N87腫瘤細胞體外增殖抑制活性
ADC編號 IC 50值
HER2-ADC-007 1.85 nM
如表6所示，本揭示的雙毒素ADC分子在Enhertu耐藥的NCI-N87腫瘤細胞上具有明顯的增殖抑制活性。如圖1所示，本揭示的雙毒素ADC分子對Enhertu耐藥的NCI-N87腫瘤細胞的抑制率明顯高於單毒素ADC分子。 五、抗體偶聯藥物 (ADC) 的體內腫瘤活性測試 實施例 5.1 多彈頭 ADC 對 NCI-H358 移植瘤藥效測試
1. 實驗材料 受試藥物：HER2-ADC-007 陰性對照：生理鹽水 實驗細胞：NCI-H358人非小細胞肺癌細胞，購自ATCC； 實驗動物：Balb/c nu裸小鼠，雌性，5-6周齡，購自成都藥康生物科技有限公司。
2. 實驗方法
2.1. 細胞處理
NCI-H358細胞用含10 %FBS的1640培養基培養於15 cm直徑培養皿，達80-90 %左右融合度時用胰蛋白酶-EDTA消化，用PBS洗兩次，然後離心重新懸浮於預冷PBS中，細胞計數儀計數，PBS稀釋使細胞濃度為5×10 7/ml。
2.2. 腫瘤細胞移植
Balb/c nu小鼠實驗室環境適應3-5天，於右肋部皮下接種NCI-H358細胞，接種細胞量為5×10 6/隻，接種體積為0.2 ml(含50 % Matrigel)，待腫瘤生長至200 mm 3左右時用於試驗，依據瘤體積大小按照S型分組分為4組，每組5隻進行實驗。
2.3. 動物給藥與檢測
入組的荷瘤裸鼠，按以下方案尾靜脈給藥： 表7. NCI-H358移植瘤模型給藥方案
No. 組別 動物數量 給藥劑量 給藥途徑和週期
1 生理鹽水 5 / i.v., 10mL/kg QW×3
2 HER2-ADC-007 5 1mg/kg i.v., 10mL/kg QW×3
3 HER2-ADC-007 5 3 mg/kg i.v., 10mL/kg QW×3
4 HER2-ADC-007 5 10 mg/kg i.v., 10mL/kg QW×3
試驗終點記錄腫瘤體積大小、照片、重量。
2.4. 腫瘤體積及體重測定：
於實驗的1、4、8、11、15、18、22、25、29天測量腫瘤體積及體重，並計算TGI%。 腫瘤體積(V)計算公式為：V＝1/2×L長×L短2。 TGI計算公式為TGI(%)=(1-T/C)× 100%(T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積)。
實驗結果 表8. 多彈頭ADC對NCI-H358移植瘤模型腫瘤大小影響(腫瘤體積:mm 3)
分組 平均腫瘤體積 (mm 3)D1 平均腫瘤體積(mm 3)D29 TGI(%) D29
生理鹽水 197.83 1312.02 /
HER2-ADC-007 1mg/kg 196.86 128.20 90.18
HER2-ADC-007 3mg/kg 196.01 117.17 90.99
HER2-ADC-007 10mg/kg 196.36 54.74 95.80
如表8、圖2和圖3所示，本揭示的多彈頭ADC具有極強的體內抑制腫瘤的效果，TGI大於90%，最高可達95.80%。同時給藥期間，小鼠體重無明顯下降，且無其它明顯毒性。 六、抗體偶聯藥物 (ADC) 的偶聯效率測試
在製備B7H3-ADC-001過程中，10 min, 30min, 1h，2h，3h, 4h後分別取出0.2 mL樣品加入過量半胱胺酸，取樣檢測DAR值。結果顯示(見表9)，DL003偶聯反應在10min左右可以達到DAR6.0，反應速率較快，利用率接近100%；DL014偶聯反應在2h以上反應結束，達到DAR1.82，利用率約91%。 表9. 多毒素抗體偶聯藥物的偶聯效率
偶聯時間 DAR(B7H3-ADC-001) DAR(DL003) DAR(DL014)
10min 6.59 6.06 0.53
30min 7.15 6.02 1.13
1 h 7.53 6.05 1.48
2 h 7.70 5.95 1.76
3 h 7.77 6.02 1.75
4 h 7.78 5.96 1.82
從上述抗體偶聯藥物偶聯效率測試實驗結果可知，DL003在10分鐘基本偶聯完全，30分鐘之後趨於穩定，且利用率接近100%，另一個毒素連接子在偶聯2h之後趨於穩定。因此，本發明可以透過控制毒素-連接子投料的量的多少對多種毒素的比例進行精確控制，以達到合適比例的毒素-連接子。 七、抗體偶聯藥物 (ADC) 的穩定性測試
研究目的:
模擬ADC在腫瘤組織/腫瘤微環境裂解，對ADC在裸鼠腫瘤組織勻漿液、小鼠肌肉組織勻漿液、勻漿液基質生理鹽水、人、猴、大鼠以及小鼠血漿中的穩定性進行體外考察，在孵育系統中測定毒素釋放。將腫瘤組織勻漿液結果與肌肉組織、血漿穩定性結果進行對比，評估腫瘤組織/腫瘤微環境中毒素分子的釋放效率。
實驗步驟:
將組織勻漿，以生理鹽水稀釋備用；檢測各勻漿液中蛋白濃度，然後透過稀釋調整至各勻漿液的蛋白濃度相同，將配置好的ADC稀釋液加入到勻漿液或血液中37℃孵育，測定0 h、4 h、24 h、48h時毒素釋放情況。具體參見WO2022170971實施例6.11記載。
結果與討論：
從毒素分子釋放來看，本發明ADC在腫瘤組織勻漿液中可以釋放大量的毒素分子，而在正常組織勻漿液、血漿中無明顯釋放。提示本發明ADC的毒素linker具有腫瘤組織特異性釋放毒素分子的特點。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
圖1. Enhertu耐藥的NCI-N87腫瘤細胞體外增殖抑制率變化曲線
圖2. NCI-H358移植瘤模型腫瘤生長變化曲線
圖3. NCI-H358移植瘤模型小鼠體重變化曲線

Claims (12)

  1. 式I所示的多彈頭抗體偶聯藥物， 式I 或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物， 其中， T為非工程化抗體； L 1、L 2和L 3為連接子，其共價結合T和與之相對應的D 1、D 2和D 3，L 1、L 2和L 3可相同或不同； D 1、D 2和D 3為藥物單元，D 1、D 2和D 3可相同或不同；且當D 1、D 2和D 3相同時，L 1、L 2和L 3不同； n1、n2、n3各自獨立地選自0-8之間的任意數值，同時當n1、n2、n3中有一個為0時，另外兩個不為0； 與T相連的S原子並非另外再外接的硫原子，而是打開雙硫鍵後的T自身所含有巰基與連接子進行連接後形成的-S-。
  2. 如請求項1所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，滿足以下條件中的一種或多種： (1)  L 1、L 2和L 3選自可裂解的連接子和不可裂解的連接子； 優選地，L 1、L 2和L 3選自可在腫瘤微環境中裂解的連接子； 其中，所述連接子優選包含胺基酸殘基或2-10個胺基酸殘基組成的短肽，更優選包含二肽、三肽或四肽； (2)  D 1、D 2和D 3各自獨立地選自微管蛋白抑制劑，例如MMAE/MMAF及其衍生物、艾日布林及其衍生物、美登素類衍生物；拓撲異構酶抑制劑，例如喜樹鹼類衍生物；干擾DNA合成藥物，例如杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物； 優選地，D 1、D 2和D 3各自獨立地選自MMAE/MMAF及其衍生物、艾日布林及其衍生物、喜樹鹼類衍生物、杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物； 更優選地，D 1為喜樹鹼類衍生物； 更優選地，D 2為艾日布林及其衍生物、杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物； 更優選地，D 3為MMAE/MMAF及其衍生物； (3)  T為抗Her 2的抗體或其抗原結合片段、抗H7H3的抗體或其抗原結合片段或抗Trop-2的抗體或其抗原結合片段，優選為抗Her 2的抗體或其抗原結合片段； 所述抗Her 2的抗體例如為曲妥珠單抗或帕妥珠單抗，優選為曲妥珠單抗； 所述抗B7H3的抗體，例如為1D1、1D1-01、2E3，2E3-02抗體、enoblituzumab，mirzotamab，omburtamab； 所述抗Trop-2的抗體例如為Sacituzumab； (4)  所述式I中與T相連的S原子均源自抗體中的二硫鍵； (5)  n1選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數； (6)  n2選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數； (7)  n3選自0到1，1到2，2到3，3到4，4到5，5到6，6到7，7到8的整數或小數。
  3. 如請求項2所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，滿足下述條件中的一種或多種： (1)  所述喜樹鹼類衍生物選自以下結構：
    ； 優選選自以下結構： ； (2)  所述艾日布林衍生物選自以下結構： 和 ； 優選為 ； (3)  所述MMAE/MMAF及其衍生物選自以下結構：
    ； 優選選自以下結構： ； (4)  所述杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物選自以下結構： 、 、 ； (5)  D 1和D 2不同，n1、n2兩個不為0，n3為0；或者D 1和D 3不同，n1、n3兩個不為0，n2為0。
  4. 如請求項1-3任一項所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，L 1、L 2和L 3各自獨立地選自以下結構：
    其中，1位和S原子相連，2位和D 1、D 2、D 3相連；R 1、R 2各自獨立地選自H、C1-6烷基(例如甲基、乙基、丙基)、C3-6環烷基(例如環丙基)；優選地，R 1、R 2同時為甲基、乙基或丙基； 優選地，L 1、L 2和L 3各自獨立地選自以下結構：
    其中，1位和S原子相連，2位和D 1、D 2、D 3相連。
  5. 如請求項1-3任一項所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，滿足下述條件中的一種或多種： (1)  L 1為 ，優選為 ； (2)  L 2為 或 ，優選為 ； (3)  L 3為 或 ，優選為 。
  6. 如請求項1-3任一項所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，滿足下述條件中的一種或多種： (1)  -L 1-D 1選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ； 優選選自下述結構片段： 、 、 、 和 ； (2)  -L 2-D 2選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ； (3)  -L 3-D 3選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ； 優選選自下述結構片段： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
  7. 如請求項1-6任一項所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，滿足下述條件中的一種或多種： (1)  所述n1、n2各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n3為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 2為艾日布林及其衍生物； T、L 1、L 2如請求項1-6任一項所定義； (2)  所述n1、n3各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n2為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 3為MMAE/MMAF及其衍生物； T、L 1、L 3如請求項1-6任一項所定義； (3)  所述n2、n3各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n1為0； D 2為MMAE/MMAF及其衍生物； D 3為艾日布林及其衍生物； T、L 2、L 3如請求項1-6任一項所定義； (4)  所述n1、n2各自獨立地選自1-8之間的任意數值，n3為0； D 1為喜樹鹼類衍生物； D 2為杜卡黴素或卡奇黴素及其衍生物； T、L 1、L 2如請求項1-6任一項所定義。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其特徵在於，所述的偶聯藥物選自：
    。
  9. 一種如請求項1所述偶聯藥物或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物的製備方法，其包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和任選的Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2 、Lg-L 3-D 3的確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應； 其中： 當L 1、L 2、L 3的連接子中含有 時，Lg-L 1、Lg-L 2、Lg-L 3含有 ； 當L 1、L 2、L 3的連接子中含有 時，Lg為和T(SH)n反應時的離去基團；優選地，Lg選自鹵素、碸基、三級胺鹽基(Me3N+、Et3N+)、重氮鹽基、-OMs、MeSO 2-、CF 3SO 3-；更優選地，Lg選自F、MeSO 2-； L 1、D 1、L 2、D 2、L 3、D 3、n1、n2、n3的定義如請求項1-10任一項所定義； 較佳地，所述製備方法滿足以下條件中的一種或多種： (1)  偶聯反應在水和/或有機溶劑中進行；所述有機溶劑優選選自N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、N-甲基吡咯烷酮、腈類(例如乙腈)、醇類(例如甲醇、乙醇)或其任意組合； (2)  所述的製備方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和Lg-L 1-D 1 、Lg-L 2-D 2確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應，所述Lg-L 1-D 1和Lg-L 2-D 2的確定比例優選為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5，更優選1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5；所述的製備方法優選包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n，在合適的溶劑中依次加入或同時加入確定比例的Lg-L 1-D 1和Lg-L 2-D 2進行偶聯反應； 或者，所述的製備方法包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n和Lg-L 1-D 1 、Lg-L 3-D 3確定比例的混合物在合適的溶劑中進行偶聯反應，所述Lg-L 1-D 1和Lg-L 3-D 3的確定比例優選為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5，更優選1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7.5；所述的製備方法優選包括：打開鏈間雙硫鍵的抗體T(SH)n，在合適的溶劑中依次加入或同時加入確定比例的Lg-L 1-D 1和Lg-L 3-D 3進行偶聯反應。
  10. 藥物連接體偶聯物，或其立體異構體、前藥、藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其結構如下： 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
  11. 一種藥物組合物，其包含如請求項1-8中任一項所述的偶聯藥物、其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，以及任選的一種或多種藥用輔料。
  12. 一種如請求項1-8中任一項所述的偶聯藥物、其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，或者如請求項11所述的藥物組合物在製備治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病(例如癌症疾病)的藥物中的用途； 優選地，所述癌症疾病為實體腫瘤和/或血液腫瘤； 更優選地，所述癌症疾病選自食管癌(例如食管腺癌和食管鱗狀細胞癌)、腦瘤、肺癌(例如小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌)、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤(例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤)、前列腺癌或甲狀腺癌；優選選自胃癌、非小細胞肺癌、乳腺癌和乳腺腺癌； 或者所述癌症疾病選自HER2高表達或HER2低表達的腫瘤；所述HER2高表達的腫瘤優選乳腺腺癌，所述HER2低表達的腫瘤優選胃癌和/或乳腺癌； 或者所述癌症疾病選自耐藥的腫瘤，所述耐藥的腫瘤優選選自食管癌(例如食管腺癌和食管鱗狀細胞癌)、腦瘤、肺癌(例如小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌)、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤(例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤)、前列腺癌或甲狀腺癌；優選的，所述耐藥的腫瘤中ABCB1或ABCG2轉運體過表達；所述耐藥的腫瘤更優選為對Enhertu耐藥的胃癌。
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