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TW202442678A - 包含抗-baff抗體的雙特異性結合蛋白及其用途 - Google Patents

包含抗-baff抗體的雙特異性結合蛋白及其用途 Download PDF

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TW202442678A
TW202442678A TW112151433A TW112151433A TW202442678A TW 202442678 A TW202442678 A TW 202442678A TW 112151433 A TW112151433 A TW 112151433A TW 112151433 A TW112151433 A TW 112151433A TW 202442678 A TW202442678 A TW 202442678A
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雪明 錢
怡 顧
李紅俊
姚新來
張一陶
吳亞東
孫迪
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大陸商蘇州創勝醫藥集團有限公司
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Abstract

本揭露涉及雙特異性結合蛋白，其從胺基端到羧基端包含：(a)第一部分，為抗BAFF抗體或其抗原結合片段，和(b)第二部分，其為抗MASP2 scFv或截短的TACI多肽。此外，本發明涉及編碼這類雙特異性結合蛋白的核酸分子，以及包含這類核酸分子的載體和宿主細胞。本發明進一步涉及生產該雙特異性結合蛋白的方法，以及涉及該雙特異性結合蛋白在治療自體免疫性疾病中的用途。

Description

包含抗-BAFF抗體的雙特異性結合蛋白及其用途
本發明總體上涉及用於靶向B細胞和/或補體介導的途徑的雙特異性結合蛋白。此外，本發明涉及編碼這類雙特異性結合蛋白的核酸分子，以及包含這類核酸分子的載體和宿主細胞。本發明還涉及產生本發明的雙特異性結合蛋白的方法，以及使用這些雙特異性結合蛋白治療自體免疫性疾病的方法。
系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種致殘且潛在地致命的自體免疫性疾病。SLE中多個細胞因子、信號通路和免疫細胞失調。
SLE的主要治療方法主要依賴皮質類固醇和免疫抑制劑，它們有一系列不可避免的副作用。因此，尋找新的治療靶點以獲得療效好且副作用小的更好治療具有重要意義。
B細胞活化因子(BAFF，也稱為BLyS)是TNF家族的成員，具有膜形式和可溶性形式(Karpusas M,Cachero T,Qian F,Boriack-Sjodin A,Mullen C,Strauch K等人，Crystal structure of extracellular human BAFF,a TNF family member that stimulates B lymphocytes.J Mol Biol.(2002)315：1145-54.doi：10.1006/jmbi.2001.5296)。BAFF藉由與三種不同的受體即BAFF-R、TACI和BCMA結合，在 B細胞的存活和分化中發揮重要作用(Smulski C,Eibel H.BAFF and BAFF-Receptor in B Cell Selection and Survival.Front Immunol.(2018)9：2285.doi：10.3389/fimmu.2018.02285)。貝利尤單抗(Belimumab)是一種完全人源化的IgG1單株抗體，其與可溶性BAFF結合並阻斷BAFF與三種受體的結合，從而減少幼稚B細胞和瞬態B細胞。
然而，針對單一靶點(即BAFF)的單特異性抗體如貝利尤單抗在臨床應用中有一些侷限性。患者在接受單特異性抗體治療後可能出現耐藥性或無反應。隨著對自體免疫性疾病的研究，人們認識到，疾病的發生和發展往往涉及多個信號轉導途徑，而單靶點免疫療法通常不足以在自體免疫性疾病中發揮治療作用。
由於多特異性結合蛋白如雙特異性結合蛋白可以同時特異性結合參與不同信號通路的不同分子，因此這些優勢擴大了多特異性結合蛋白如雙特異性結合蛋白的應用。
然而，產生適用於自體免疫性疾病如SLE的雙特異性結合蛋白的任務絕非微不足道，而是必然碰到涉及與雙特異性結合蛋白的功效、毒性、適用性和可生產性相關的許多挑戰。
考慮到與適用於自體免疫性疾病如SLE的雙特異性結合蛋白相關的困難，仍然需要新的、改進的這類分子。
發明概述
本發明提供了雙特異性結合蛋白，將其設計為用於靶向自體免疫性疾病如SLE中的兩個重要分子，從而將好的療效和可生產性與低毒性和有利的藥物代謝動力學特性相結合。
在第一方面，本發明提供了一種雙特異性結合蛋白，其從胺基端到羧基端包含：
(a)第一部分，為抗BAFF抗體或其抗原結合片段，包含：
(i)重鏈可變結構域(VH)，包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；和
(ii)輕鏈可變結構域(VL)，包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
其中，
CDR-H1包含NNAIN(SEQ ID NO：6)的序列；
CDR-H2包含GIIPMFGTAKYSQNFQG(SEQ ID NO：7)的序列；
CDR-H3包含SRDLLLFPHHALSP(SEQ ID NO：8)的序列；
CDR-L1包含QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：9)的序列；
CDR-L2包含GKNNRPS(SEQ ID NO：10)的序列；和
CDR-L3包含SSRDSSGNHWV(SEQ ID NO：11)的序列；
其中CDR是根據Kabat編號來定義的；和
(b)第二部分，其為抗MASP2 scFv或截短的TACI多肽，其中該抗MASP2 scFv包含：
(i)重鏈可變結構域(VH)，包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；和
(ii)輕鏈可變結構域(VL)，包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
其中，
CDR-H1包含DYYIN(SEQ ID NO：16)的序列；
CDR-H2包含WIFPGSESAYHSEKFKA(SEQ ID NO：17)的序列；
CDR-H3包含GDRSGPFAY(SEQ ID NO：18)的序列；
CDR-L1包含KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO：19)的序列；
CDR-L2包含LVSKLDS(SEQ ID NO：20)的序列；和
CDR-L3包含VQVTHFPFT(SEQ ID NO：21)的序列；
其中CDR是根據Kabat編號來定義的；
其中該截短的TACI多肽是SEQ ID NO：24所示的人TACI胞外區或其片段或變體，
其中該第一部分的重鏈的羧基端與該第二部分的胺基端共價連接。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈從胺基端到羧基端包含第一部分的重鏈、接頭肽和第二部分，且每條輕鏈是第一部分的輕鏈。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白是雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體，其中該抗BAFF抗體或其抗原結合片段包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由SEQ ID NO：4的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；並且該抗MASP2 scFv包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列或由SEQ ID NO：14的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序 列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列或由SEQ ID NO：15的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些實施方案中，雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體中的抗BAFF抗體和/或抗MASP2 scFv是嵌合的、人源化的或人抗BAFF抗體和/或抗MASP2 scFv。
在一些實施方案中，雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條輕鏈的恆定結構域衍生自人κ或λ輕鏈恆定結構域，且每條重鏈的恆定結構域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定結構域。較佳地，雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體中的每條重鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列或由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體中的每條輕鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由SEQ ID NO：2的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體具有一個或多個以下特徵：
(1)與人BAFF和人MASP2結合，其中以小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD結合人BAFF，並以小於約10x 10-8M、5x 10-8M、1x 10-8M或5x 10-9M的KD結合人MASP2，如藉由生物膜干涉法測量的；
(2)與人BAFF和人MASP2結合，其中以約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50結合人BAFF，並以約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50結合人MASP2，如藉由ELISA測量的；
(3)在表達BCMA的細胞中，中和BAFF活性，IC50為約250nM或更低、200nM或更低、170nM或更低或140nM或更低；
(4)阻斷補體因子C4的激活，IC50為約10nM或更低、8nM或更低、6nM或更低或4nM或更低；
(5)在體內消耗B細胞。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白是包含抗BAFF抗體或其抗原結合片段和截短的TACI多肽或其片段或變體的融合蛋白，其中該抗BAFF抗體或其抗體結合片段包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由SEQ ID NO：4的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；並且該截短的TACI多肽或其片段或變體包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或由SEQ ID NO：25的胺基酸序列組成，或其片段或者變體，如SEQ ID NO：26所示的片段。
在一些實施方案中，融合蛋白中的抗BAFF抗體是嵌合的、人源化的或人抗BAFF抗體；並且融合蛋白中的截短的TACI多肽包含SEQ ID NO：25 的胺基酸序列或由SEQ ID NO：25的胺基酸序列組成，或其片段或者變體，如SEQ ID NO：26所示的片段。
在一些實施方案中，融合蛋白包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條輕鏈的恆定結構域衍生自人κ或λ輕鏈恆定結構域，且每條重鏈的恆定結構域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定結構域。較佳地，融合蛋白中的每條重鏈包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列或由SEQ ID NO：22的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且融合蛋白中的每條輕鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由SEQ ID NO：2的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些實施方案中，本發明的融合蛋白具有一個或多個以下特徵：
(1)與人BAFF和人APRIL結合，其中以小於約1x 10-12M的KD結合人BAFF，並以小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD結合人APRIL，如藉由生物膜干涉法測量的；
(2)與人BAFF和人APRIL結合，其中以約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50結合人BAFF，並以約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50結合人APRIL，如藉由ELISA測量的；
(3)在表達BCMA的細胞中，中和BAFF活性，IC50為約50nM或更低、35nM或更低、20nM或更低或10nM或更低；
(4)在體內消耗B細胞。
在第二方面，本發明提供了編碼本發明的雙特異性結合蛋白中的任何一個或多個多肽鏈的多核苷酸。
在第三方面，本發明提供了一種載體，較佳表達載體，其包含編碼本發明的雙特異性結合蛋白中的任何一個或多個多肽鏈的多核苷酸。
在第四方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含本發明的多核苷酸或載體。例如，宿主細胞是哺乳動物細胞，較佳CHO細胞或HEK293細胞；以及宿主細胞是原核細胞、較佳大腸桿菌細胞。
在第五方面，本發明提供了一種生產本發明的雙特異性結合蛋白的方法，包括：(i)在允許生產雙特異性結合蛋白的條件下培養本發明的宿主細胞，和(ii)從培養物中回收雙特異性結合蛋白。
在第六方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含第一方面的雙特異性結合蛋白、核酸。
在第七方面，本發明提供了一種治療或預防自體免疫性疾病的方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的第六方面的醫藥組成物。較佳地，個體是哺乳動物，更佳地是人。
在一些實施方案中，自體免疫性疾病選自系統性紅斑狼瘡(SLE)、IgAN、類風濕性關節炎(RA)、視神經脊髓炎/視神經脊髓炎譜系疾病(NOD/NMOD)、多發性硬化症(MS)、視神經脊髓炎、舍格倫綜合症(Sjogren's Syndrome)、ANCA相關血管炎、重症肌無力、Devic病。
圖1是構建的雙特異性抗體Blm129的示意圖。
圖2顯示雙特異性抗體Blm129的SEC-HPLC純度。
圖3是構建的雙功能融合蛋白BlmTAC的示意圖。
圖4顯示雙功能融合蛋白BlmTAC的SEC-HPLC純度。
圖5顯示藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定的雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC與人BAFF的結合。
圖6顯示藉由ELISA測定的雙特異性結合蛋白BlmTAC與人APRIL的結合。
圖7顯示藉由ELISA測定的雙特異性結合蛋白Blm129與人MASP2的結合。
圖8顯示雙特異性結合蛋白Blm129同時與人BAFF和人MASP2結合。
圖9顯示在基於細胞的報告基因測定法中雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC中和BAFF活性。使用抗HEL-hIgG1抗體作為同種型對照。
圖10顯示雙特異性結合蛋白Blm129以劑量依賴性方式阻斷補體因子C4的活化。
圖11顯示雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC對B細胞的體內藥效學作用。
圖12顯示Blm129和BlmTAC施用後，針對對照組歸一化的B細胞體內消耗率。
圖13A顯示靜脈施用BlmTAC後對血液中B細胞的PD影響。
圖13B顯示靜脈施用BlmTAC後對脾臟中B細胞的PD影響。
圖14A顯示BlmTAC施用後，針對對照組歸一化的血液中B細胞的消耗率。
圖14B顯示BlmTAC施用後，針對對照組歸一化的脾臟中B細胞的消耗率。
圖15顯示Balb/c小鼠的平均藥物血漿濃度-時間曲線。
發明詳述
I.定義
除非本文另有定義，否則與本揭露相關使用的科學和技術術語應具有本領域具有通常知識者通常理解的含義。如果本揭露與任何詞典或外部定義之間存在任何潛在的歧義，則以本文提供的定義為准。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，複數術語應包括單數。在本申請中，除非另有說明，否則“或”的使用是指“和/或”。此外，術語“包括”以及其他形式如單數三人稱形式和過去式的使用不具有限制性。此外，術語如“元件”或“組分”包含含有一個單位的元件和組分，以及包含含有多於一個亞單位的元件和組分，除非另有特別說明。
與數值組合使用的術語“約”旨在涵蓋從比指定數值小5%的下限到比指定數值大5%的上限的範圍內的數值。
如本文所用，術語“結合蛋白”在其最廣義上是指特異性結合靶分子的蛋白質。
術語“雙特異性”是指結合蛋白能夠特異性結合至少兩種不同的靶分子。在某些實施方案中，雙特異性結合蛋白能夠同時結合兩種不同的靶分子，特別是參與兩種不同信號通路。
在談及抗體、結合蛋白或肽與第二化學物質的相互作用時，術語“特異性結合”是指相互作用取決於第二化學物質上存在特定結構(例如，抗原決定簇或表位)。例如，抗體識別並結合特定的蛋白質結構，而不是通常地與蛋白質結合。一般而言，如果抗體對表位“A”具有特異性，則在含有標記的“A”和抗體的反應中，含有表位A(或游離的、未標記的A)的分子的存在將減少與抗體結合的標記的A的量。
關於雙特異性結合蛋白中的部分，如本文所用，術語“第一”和“第二”在存在多於一個部分時用來便於區分各部分。
“BAFF受體(BAFF-R)”是TNF受體超家族的非典型代表。該家族的成員通常以幾個胞外富含半胱胺酸的結構域(CRD)為特徵，這些結構域用於配體結合以及用於受體單體不依賴於配體地組裝成二聚體、三聚體或多聚體。與大多數其他TNF-R家族成員不同，BAFF-R只含有一個部分CRD用於配體結合和自組裝。BAFF-R在除漿細胞和位於生髮中心暗區的成中心細胞外的所有人外周B細胞亞群的表面上表達。BAFF-R與作為單一配體的TNF樣分子BAFF結合。
“TACI(T細胞激活劑和鈣調節配體相互作用物)”由活化的B細胞、邊緣區B細胞、轉換的記憶B細胞和漿細胞表達。與BAFF-R相比，TACI一方面作為誘餌受體，另一方面觸發免疫球蛋白類別轉換重組，具有不同的功能。
“BCMA(B細胞成熟抗原)”在活化的B細胞中上調，並由長壽漿細胞組成型表達，支持它們的存活。
如本文所用，重鏈和輕鏈的所有恆定區和結構域的胺基酸位置是根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat編號系統進行編號的，並在本文中稱為“根據Kabat編號”。具體地，Kabat編號系統(參見Kabat等人，1991的647-660頁)用於κ和λ同種型的輕鏈恆定結構域CL，並且Kabat EU索引編號系統(參見Kabat等人，1991的661-723頁)用於重鏈恆定結構域(CH1、鉸鏈區、CH2和CH3)，在本文中藉由參考“根據Kabat EU索引編號”來進一步闡明。
關於人免疫球蛋白輕鏈和重鏈序列的一般信息也在Kabat等人，1991中給出。
“分離的蛋白質”或“分離的多肽”是指蛋白質和多肽的來源或衍生源與天然狀態下伴隨的天然締合組分不締合、基本上不含來自同一物種的其他蛋白質、由來自不同物種的細胞表達或不在自然界中存在的蛋白質或多肽。化學合成的或在不同於其天然來源細胞的細胞系統中合成的多肽可以從其天然締合組分中“分離”出來。還可以使用本領域熟知的蛋白質純化技術藉由分離使蛋白質基本上不含天然締合組分。
術語“抗體”廣義地指由四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈組成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其任何功能片段、突變體、變體或衍生物，其保留Ig分子必需的表位結合特徵。這類突變體、變體或衍生的抗體形式是本領域已知的，並且在下文中討論了非限制性實施方案。
在全長抗體中，每條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域組成：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈由輕鏈 可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，中間穿插著更保守的區域，稱為構架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基末端到羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH結構域的第一、第二和第三CDR通常稱為CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；同樣，VL結構域的第一、第二和第三CDR通常稱為CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。免疫球蛋白分子可以是任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區，其可以由木瓜蛋白酶消化完整抗體產生。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白的Fc區通常包含兩個恆定結構域，即CH2結構域和CH3結構域，並且視需要地包含CH4結構域，例如，在IgM和IgE抗體的Fc區的情況下。IgG、IgA和IgD抗體的Fc區包含鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域。相反地，IgM和IgE抗體的Fc區缺乏鉸鏈區，但包含CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域。在Fc區中具有胺基酸殘基替換以改變抗體效應子功能的變體Fc區是本領域已知的(參見例如Winter等人，美國專利號5648260和5624821)。
術語“抗原結合部分”、“抗原結合片段”和“功能性片段”在抗體的上下文中可互換使用，並且指抗體的一個或多個片段，其保留特異性結合抗原的能力，即，結合與衍生該部分或片段的全長抗體相同的抗原(例如BAFF)。已經表明抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來執行。包含在術語抗體的“抗原結合部分”內的結合片段的實例包括(i)Fab片段，為由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含藉由鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個 Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Nature,341：544-546(1989)；PCT公開號WO90/05144)，其包含單個可變結構域；和(vi)分離的互補性決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH是由單獨的基因編碼的，但它們可以使用重組方法藉由合成的接頭連接在一起，該合成的接頭使VL和VH能夠製備為單條蛋白鏈，其中VL區和VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))，scFv中的VL區和VH區可以是任何順序，例如VH-接頭-VL或VL-接頭-VH；參見例如，Bird等人，Science,242：423-426(1988)；和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85：5879-5883(1988))。這樣的單鏈抗體也旨在包含在術語抗體的“抗原結合部分”和以上給出的等效術語中。
免疫球蛋白恆定(C)結構域是指重鏈恆定結構域(CH)或輕鏈恆定結構域(CL)。鼠和人IgG重鏈恆定結構域和輕鏈恆定結構域胺基酸序列是本領域已知的。
術語“單株抗體”或“mAb”是指從基本上同質的抗體群體中獲得的抗體，即，組成該群體的單個抗體是相同的，除了可能存在少量的天然存在突變之外。單株抗體是高度特異的，針對單個抗原決定簇(表位)。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製備物不同，每個mAb針對抗原上的單個決定簇。修飾語“單株”不應被解釋為需要藉由任何特定方法生產抗體。
與本申請的抗體或結合蛋白的輕鏈恆定結構域CL、重鏈恆定結構域CH和Fc區相關的術語“人序列”是指該序列屬於或來自人免疫球蛋白序列。本揭露的人序列可以是天然人序列或其變體，包括一個或多個(例如，至多20、15、10個)胺基酸殘基變化。
術語“嵌合抗體”是指包含來自一個物種的重鏈可變區序列和輕鏈可變區序列和來自另一物種的恆定區序列的抗體，例如具有與人恆定區連接的鼠重鏈可變區和輕鏈可變區的抗體。
術語“人源化抗體”是指包含來自非人物種(例如小鼠)的重鏈可變區和輕鏈可變區序列的抗體，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已被改變為更“類似於人的VH和/或VL序列”，即更類似於人種系可變序列。一種類型的人源化抗體是CDR移植抗體，其中將來自非人物種(例如，小鼠)的CDR序列引入人VH和VL構架序列中。人源化抗體是與目的抗原免疫特異性結合的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，且其包含基本上具有人抗體胺基酸序列的構架區和恆定區，但基本上具有非人抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)。如本文所用，術語“基本上”在CDR的上下文中是指具有與非人抗體CDR的胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一的胺基酸序列的CDR。人源化抗體包含基本上所有的可變結構域(Fab,Fab',F(ab')2,Fv)中的至少一個、通常是兩個可變結構域中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白(即供體抗體)的CDR區，並且所有或基本所有構架區是人免疫球蛋白共有序列的構架區。在一個實施方案中，人源化抗體還包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常屬於人免疫球蛋白。在一些實施方案中，人源化抗體包含輕鏈以及至少重鏈的可變結構域。該抗體還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區。在一些實施方案中，人源化抗體僅包含人源化輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗體僅包含人源化重鏈。在具體實施方案中，人源化抗體僅包含輕鏈的人源化可變結構域和/或人源化重鏈。
人源化抗體可以選自免疫球蛋白的任何類，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同種型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗體可以包含來自多於一個類或同種型的序列，並且可以使用本領域熟知的技術來選擇特定的恆定結構域以優化期望的效應子功能。
人源化抗體的構架區和CDR區不需要精確對應於親本序列，例如，供體抗體CDR或接受體構架可以藉由取代、插入和/或缺失至少一個胺基酸殘基而被誘變，從而使該位點的CDR或構架殘基不對應於供體抗體或共有構架。然而，在一個示例性實施方案中，這種突變不是廣泛的。通常，至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的人源化抗體殘基將對應於親本FR和CDR序列的那些殘基。在特定構架位置的回復突變以恢復在供體抗體中該位置出現的相同胺基酸，通常用於保留特定的環結構或正確地定向CDR序列以與靶抗原接觸。
術語“CDR”是指抗體可變結構域序列中的互補決定區。在重鏈和輕鏈的每個可變區中都有三個CDR，它們被命名為CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。本文使用的術語“CDR集”是指出現在能夠結合抗原的單個可變區中的三個CDR的組。根據不同的系統，這些CDR的確切邊界已經被不同地定義。Kabat描述的系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，馬裡蘭州貝塞斯達(1987)和(1991))不僅提供了適用於抗體的任何可變區的明確的殘基編號系統，而且還提供了定義三個CDR的精確殘基邊界。
術語“Kabat編號”，就抗體的重鏈CDR和輕鏈CDR而言，其在本領域中是公認的，是指對抗體或其抗原結合部分的重鏈可變區和輕鏈可變區中比其他胺基酸殘基更可變(即，高變)的胺基酸殘基進行編號的系統。參見Kabat 等人，Ann.NY Acad.Sci.,190：382-391(1971)；和Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242(1991)。
在過去二十年中，重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列的廣泛公共數據庫的增長和分析導致了對可變區序列中的構架區(FR)和CDR序列之間的典型邊界的理解，並使本領域具有通常知識者能夠根據Kabat編號、Chothia編號或其他系統準確地確定CDR。參見例如Martin，“抗體可變結構域的蛋白質序列和結構分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)”，Kontermann和Dübel編輯，Antibody Engineering(Springer-Verlag,Berlin,2001)，第31章，第432-433頁。
本文中使用的術語"kon"(也稱為"Kon","kon")是指結合蛋白(如抗體)與抗原結合以形成本領域已知的結合複合物(如抗體/抗原複合物)的結合速率常數。"kon"也已知為術語“結合速率常數”或“ka”，本文中可互換使用。該值表示抗體與其靶抗原的結合速率，或者表示抗體與抗原之間的複合物形成速率，如下式所示：
抗體("Ab")+抗原("Ag")→Ab-Ag。
本文中所用的術語"koff"(也稱為"Koff","koff")是指結合蛋白(如抗體)從結合複合物(如抗體/抗原複合物)解離的解結合速率常數或“解離速率常數”，如本領域所知。該值表示抗體從其靶抗原解離的速率，或者表示Ab-Ag複合物隨時間分離為游離抗體和抗原的速率，如下式所示：
Ab+Ag←Ab-Ag。
本文中使用的術語"KD"(也稱為"Kd")旨在指“平衡離解常數”，是指在平衡時滴定測量中獲得的值，或藉由解離速率常數(koff)除以結合速率常數(kon)獲得的值。結合速率常數(kon)、解離速率常數(koff)和平衡解離常數(KD)用於表示抗體對抗原的結合親和力。測定結合和解離速率常數的方法在本領域是眾所周知的。使用基於螢光的技術提供了高靈敏度和在平衡時檢查生理緩衝液中的樣品的能力。可以使用其他實驗方法和儀器，如WAVEsystem(光柵耦合的干涉測量法，GCI)測定法(Creoptix AG，瑞士)、BIAcore®(生物分子相互作用分析)測定法(BIAcore International AB，瑞典烏普薩拉)等。使用例如Octet® RED96系統(Pall FortéBio LLC)的生物膜干涉法(BLI)是另一種親和測定技術。此外，還可以使用自Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)可獲得的KinExA®(動力學排除測定法(Kinetic Exclusion Assay))測定。
術語“分離的核酸”是指藉由人類干預與自然界中發現的全部或部分多核苷酸不結合的多核苷酸(例如，基因組的、cDNA或合成來源，或其某些組合)；有效地連接到其在自然界中不連接的多核苷酸；或者在自然界中不作為一個較大序列的一部分出現。
本文中使用的術語“載體”是指能夠運輸與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質粒”，它指的是可以連接額外DNA節段的圓形雙鏈DNA環。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA節段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入其的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導它們有效地連接的基因的表達。此類載體 在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。一般地，在重組DNA技術中使用的表達載體通常是質粒的形式。在本說明書中，“質粒”和“載體”可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本揭露旨在包括其他形式的表達載體，例如具有同等功能的病毒載體(例如，複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
術語“有效地連接”是指所描述的組件處於允許它們以其預期方式發揮作用的關係的並置。與編碼序列“有效地連接”的控制序列以這樣的方式連接，即，編碼序列的表達是在與控制序列相容的條件下實現的。“有效地連接的”序列既包括與目的基因相鄰的表達控制序列，也包括反式或以一定的距離作用以控制目的基因的表達控制序列。本文使用的術語“表達控制序列”是指影響與其連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。表達控制序列包括合適的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，例如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高轉譯效率的序列(即，Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及根據需要，增強蛋白質分泌的序列。這種控制序列的性質根據宿主生物的不同而不同；在原核生物中，這種控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，這種控制序列通常包括啟動子和轉錄終止序列。術語“控制序列”旨在包括其存在對表達和加工必需的組分，還可以包括其存在有利的額外組分，例如前導序列和融合伴侶序列。
本文中定義的“轉化”是指外源DNA進入宿主細胞的任何過程。轉化可以在自然或人工條件下使用本領域已知的各種方法進行。轉化可以依賴於將外源核酸序列插入原核或真核宿主細胞的任何已知方法。該方法是基於被轉 化的宿主細胞來選擇的，並且可以包括但不限於轉染、病毒感染、電穿孔、脂質轉染和粒子轟擊。這種“轉化的”細胞包括穩定轉化的細胞，其中插入的DNA能夠作為自主複製的質粒或作為宿主染色體的一部分進行複製。它們還包括在有限的時間期間瞬時表達插入的DNA或RNA的細胞。
術語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)是指引入外源DNA的細胞。在一個實施方案中，宿主細胞包含編碼抗體的兩種或多種(例如，多種)核酸，例如美國專利號7262028中描述的宿主細胞。這樣的術語不僅指特定的對象細胞，而且指這樣的細胞的子代。由於突變或環境影響，某些修飾可能會在後代中發生，因此，事實上，這樣的子代可能與親本細胞不相同，但仍包括在本文所用術語“宿主細胞”的範圍內。在一個實施方案中，宿主細胞包括選自任何生命王國的原核細胞和真核細胞。在另一實施方案中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物和動物細胞。在另一實施方案中，宿主細胞包括但不限於原核細胞系大腸桿菌；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆蟲細胞系Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母。
如本文所用，術語“有效量”是指這樣的治療量，該治療量足以減少或改善疾病或其一種或多種症狀的嚴重程度和/或持續時間；防止疾病發展；導致疾病消退；防止與疾病相關的一種或多種症狀的復發、出現或進展；檢測疾病；或增強或改善另一種療法(例如預防劑或治療劑)的預防或治療效果。
根據本揭露的抗體、其功能片段和結合蛋白可以藉由使用本領域可獲得的用於純化抗體和結合蛋白的多種方法和材料中的一種或多種來純化(用於預期用途)。此類方法和材料包括但不限於親和層析(例如，使用與蛋白A、蛋白G、蛋白L或抗體的特定配體、其功能片段或結合蛋白綴合的樹脂、粒子或 膜)、離子交換層析(例如使用離子交換粒子或膜)、疏水相互作用層析(“HIC”；例如使用疏水粒子或膜”)、超濾、納濾、滲濾、尺寸排阻層析(“SEC”)、低pH處理(以滅活污染病毒)及其組合，以獲得預期用途的可接受純度。滅活污染病毒的低pH處理的非限制性實例包括用0.5M磷酸在18℃-25℃將包含抗體、其功能片段或本揭露的結合蛋白的溶液或懸浮液的pH降低至pH 3.5，持續60至70分鐘。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成、組織培養和轉化(例如電穿孔、脂轉染)。酶反應和純化技術可以根據製造商的說明書或如本領域中通常該實施或如本文所述進行。上述技術和方法通常可以根據本領域熟知的常規方法來執行，並且如在本說明書中引用和討論的各種一般和更具體的參考文獻中所描述的。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港，1989年)。
“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(如奶牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(如，人和非人靈長類動物，如猴子)、兔和齧齒動物(如小鼠和大鼠)。特別地，個體或受試者是人。
術語“醫藥組成物”是指一種製備物，其形式為允許所含的活性成分的生物學活性有效，並且不含有對服用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的額外組分。
“可藥用載體”是指醫藥組成物中除活性成分之外的對受試者無毒的成分。可藥用載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，“治療”(及其語法變體，如“進行治療”或“治療的”)是指試圖改變被治療個體的疾病的自然病程的臨床干預，並且可以用於預防或在 臨床病理過程中進行。所期望的治療效果包括但不限於，預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任何直接或間接病理後果、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態、以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白用於延緩疾病的發展或減緩疾病的進展。
II.BAFFxMASP2雙特異性結合蛋白
B細胞在自體免疫中的致病作用包括產生致病性自身抗體和藉由產生細胞因子和趨化因子調節免疫應答。
在B細胞分化、成熟和類別轉換中，B細胞活化因子(BAFF)(也稱為B淋巴細胞刺激因子(BLyS))起著重要作用。BAFF與三種不同的受體結合，即，BAFF-R、TACI和BCMA。BAFF的過度表達促進了B淋巴細胞的存活和分化為產生Ig的漿細胞，並在SLE和其他自體免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡(SLE)的發病中發揮作用。
貝利尤單抗是一種完全人源化的免疫球蛋白G1 λ(IgG1λ)單株抗體(mAb)，其與可溶性BAFF結合並阻斷BAFF與BAFF-R、TACI和BCMA的結合，從而減少幼稚B細胞和瞬態B細胞。貝利尤單抗是唯一一種被批准用於SLE的生物製劑，也是第一種稱為B淋巴細胞刺激因子特異性抑制劑的藥物。
此外，認為自體免疫性疾病是一種自身抗體發展並固定在自體抗原上，導致補體激活，進而導致炎症和組織損傷的疾病。補體介導免疫複合物的沉積，從而進一步導致牽涉到沉積位點和沉積位點的損傷，阻斷補體介導的途徑並降低免疫應答是減輕牽涉SLE器官的一種方法(Trouw L,Pickering M,Blom A.The complement system as a potential therapeutic target in rheumatic disease.Nat Rev Rheumatol.(2017)13：538-47.doi：10.1038/nrrheum.2017.125)。
目前，人們普遍認為補體系統可以藉由三種不同的途徑激活：經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑。經典途徑通常由與外來顆粒(即抗原)結合的宿主抗體組成的複合物觸發，因此需要事先暴露於抗原以產生特異性抗體反應。由於經典途徑的激活取決於宿主先前的適應性免疫反應，因此經典途徑是獲得性免疫系統的一部分。相反地，凝集素途徑和旁路途徑都獨立於適應性免疫，是先天免疫系統的一部分。
在凝集素途徑中，人甘露聚糖結合的凝集素(MBL)藉由其膠原樣結構域與獨特的C1r/C1s樣絲胺酸蛋白酶，稱為MBL相關的絲胺酸蛋白酶(MASP)，形成特異性和高親和力相互作用。到目前為止，已經描述了三種MASP，它們是MASP-1、MASP-2和MASP-3。但是，已經顯示單獨的MBL-MASP-2複合物足以活化補體(Vorup-Jensen等人，J.Immunol.7(55：2093-2100,(2000))。此外，只有MASP-2以高速率切割C2和C4(Ambrus等人，J.Immunol.770：1374-1382,(2003))。因此，MASP-2是負責活化C4和C2以產生C3轉化酶C4b2a的蛋白酶，因此是潛在的藥物靶點。
Transcenta發明的一種MASP-2抑制性抗體，命名為mAb 129C10，有效抑制MASP-2依賴性補體激活。
在一個實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白一方面能夠特異性結合人BAFF，從而阻斷BAFF與其三種受體BAFF-R、TACI和BCMA的結合，另一方面能夠特異性結合人MASP-2，從而阻斷補體激活。
在一些實施方案中，根據本申請的BAFF x MASP2雙特異性結合蛋白包含：
a)特異性結合BAFF的第一抗原結合位點；和
b)特異性結合MASP2的第二抗原結合位點。
在一個實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白包含衍生自任何抗BAFF抗體或其抗原結合片段的一組六個CDR，為CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以形成雙特異性結合蛋白的BAFF結合位點。在一些進一步的實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白包含衍生自任何抗BAFF抗體或其抗原結合片段的VH/VL對，以形成雙特異性結合蛋白的BAFF結合位點。
在一個實施方案中，如本文所述的雙特異性結合蛋白進一步包含衍生自任何抗MASP2抗體或其抗原結合片段的一組六個CDR，為CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以形成雙特異性結合蛋白的MASP2結合位點。在一些進一步的實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白包含衍生自任何抗MASP2抗體或其抗原結合片段的VH/VL對，以形成雙特異性結合蛋白的MASP2結合位點。
在一個實施方案中，根據本申請的雙特異性BAFF/MASP2結合蛋白中的BAFF結合位點和MASP2結合位點是人源化的，分別包含人源化VH/VL序列。
在一個實施方案中，根據本申請的BAFF x MASP2雙特異性結合蛋白採用圖1所示的形式，其中雙特異性結合蛋白的Fab片段形成特異性結合BAFF的第一抗原結合位點；並且雙特異性結合蛋白的scFv結構域形成特異性結合MASP2的第二抗原結合位點。
在一些實施方案中，根據本發明的雙特異性結合蛋白使用抗BAFF單株抗體(mAb)部分和抗MASP2 scFv部分之間的接頭。在一個實施方案 中，根據本發明的雙特異性結合蛋白中的抗MASP2 scFv部分包含第44位和第100位之間的一對二硫鍵。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與BAFF結合，其中該結合效力由約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50反映，如藉由ELISA測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠結合MASP2，其中該結合效力由約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50反映，如藉由ELISA測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與BAFF結合，其中該結合效力藉由小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD反映，如藉由生物膜干涉法測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與MASP2結合，其中該結合效力藉由小於約10x 10-8M、5x 10-8M、1x 10-8M或5x 10-9M的KD反映，如藉由生物膜干涉法測量的；
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠結合BAFF和MASP2兩者。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白阻斷BAFF與其受體BCMA的結合，並在與在細胞表面表達BCMA的細胞接觸時抑制細胞內信號傳導。細胞內信號傳導的抑制可以藉由檢測NF-κB的水平來確定，例如，使用實施例6中所述的基於報告基因的方法。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠降低NF-κB的量，在可比較的測定法中，與不存在本發明的雙特異性結合蛋白、或與存在對 照分子(例如同種型對照)的情況下，培養細胞表面表達BCMA的細胞後，檢測到的NF-κB水平相比較，本發明的雙特異性結合蛋白降低NF-κB水平1倍以上，例如，降低NF-κB水平>1.1倍、>1.2倍、>1.3倍、>1.4倍、>1.5倍、>1.6倍、>1.7倍、>1.8倍、>1.9倍、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍、>20倍、>30倍、>40倍、>50倍、>60倍、>70倍、>80倍、>90倍或>100倍。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠阻斷補體因子C4的激活，其IC50為約10nM或更低、8nM或更低、6nM或更低或4nM或更低，如藉由ELISA測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠在體內消耗B細胞。具體地，本發明的雙特異性結合蛋白能夠減少表達CD19和CD45的B細胞，並且能夠減少表達CD19和CD21的B細胞。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠減少表達CD19和CD45的B細胞的數量，在可比較的測定法中，施用本發明的雙特異性結合蛋白或施用對照分子(例如生理鹽水)後，本發明的雙特異性結合蛋白降低體內表達CD19和CD45的B細胞的數量1倍以上，例如降低>1.1倍、>1.2倍、>1.3倍、>1.4倍、>1.5倍、>1.6倍、>1.7倍、>1.8倍、>1.9倍、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍、>20倍、>30倍、>40倍、>50倍、>60倍、>70倍、>80倍、>90倍或>100倍。
III.BAFFxAPRIL雙特異性結合蛋白
本發明進一步提供了一種BAFF/APRIL雙特異性結合蛋白，其結構如圖3所示，能夠與BAFF和APRIL結合，作為雙靶向蛋白，它能夠同時抑 制BAFF和APRIL這兩種細胞因子，更有效地降低免疫反應，實現治療自體免疫性疾病的目的。
B細胞活化因子(BAFF)是TNF家族的成員，其與受體BAFF-R、TACI和BCMA結合。
增殖誘導配體(APRIL)也是TNF家族的成員，與BAFF具有高同源性，並與受體TACI和BCMA結合。
BAFF和APRIL是由抗原呈遞細胞表達的細胞因子，在B淋巴細胞的發育和免疫介導的疾病的致病過程中起著至關重要的作用。
在一些實施方案中，根據本申請的BAFF x APRIL雙特異性結合蛋白包含：
a)特異性結合BAFF的第一抗原結合位點；和
b)第二部分，其為特異性結合配體BAFF和APRIL的截短的TACI多肽。
在一個實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白包含衍生自任何抗BAFF抗體或其抗原結合片段的一組六個CDR，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，以形成雙特異性結合蛋白的BAFF結合位點。在一些進一步的實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白包含衍生自任何抗BAFF抗體或其抗原結合片段的VH/VL對，以形成雙特異性結合蛋白的BAFF結合位點。
在一個實施方案中，本文所述的雙特異性結合蛋白進一步包含衍生自截短的TACI多肽(TACI,Uniprot ID：O14836)的第二部分，其特異性結合TACI配體BAFF和APRIL。在一些進一步的實施方案中，本文所述的雙特異性 結合蛋白包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或其片段或變體，條件是該片段或變體特異性結合BAFF和APRIL兩者。
在一個實施方案中，根據本申請的BAFF x APRIL雙特異性結合蛋白採用圖3所示的形式，其中雙特異性結合蛋白的Fab片段形成特異性結合BAFF的第一抗原結合位點；並且雙特異性結合蛋白的截短的TACI多肽形成特異性結合BAFF和APRIL兩者的捕獲阱。
在一些實施方案中，根據本發明的雙特異性結合蛋白使用抗BAFF單株抗體(mAb)部分和截短的TACI多肽之間的接頭。在一個實施方案中，根據本發明的雙特異性結合蛋白中的截短的TACI多肽包含TACI的第二CRD結構域(69aa-108aa)。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與BAFF結合，其中該結合效力由約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50反映，如藉由ELISA測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與APRIL結合，其中該結合效力由約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50反映，如藉由ELISA測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與BAFF結合，其中該結合效力由小於約1x 10-12M的KD反映，如藉由生物膜干涉法測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與APRIL結合，其中該結合效力由小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD反映，如藉由生物膜干涉法測量的。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠與BAFF和APRIL兩者結合。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白阻斷BAFF與其受體BCMA的結合，並在與在細胞表面表達BCMA的細胞接觸時抑制細胞內信號傳導。細胞內信號傳導的抑制可以藉由檢測NF-κB的水平來確定，例如，使用實施例6中所述的基於報告基因的方法檢測NF-κB。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠降低NF-κB的量，在可比較的測定法中，與不存在本發明的雙特異性結合蛋白、或與存在對照分子(例如同種型對照)的情況下，培養細胞表面表達BCMA的細胞後，檢測到的NF-κB水平相比較，本發明的雙特異性結合蛋白降低NF-κB水平1倍以上，例如，降低NF-κB水平>1.1倍、>1.2倍、>1.3倍、>1.4倍、>1.5倍、>1.6倍、>1.7倍、>1.8倍、>1.9倍、>2倍、>3倍、>4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍、>20倍、>30倍、>40倍、>50倍、>60倍、>70倍、>80倍、>90倍或>100倍。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠在體內消耗B細胞。具體地，本發明的雙特異性結合蛋白能夠減少表達CD19和CD45的B細胞，並且能夠減少表達CD19和CD21的B細胞。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性結合蛋白能夠減少表達CD19和CD45的B細胞的數量，在可比較的測定法中，施用本發明的雙特異性結合蛋白或施用對照分子(例如生理鹽水)後，本發明的雙特異性結合蛋白降低體內表達CD19和CD45的B細胞的數量1倍以上，例如降低>1.1倍、>1.2倍、>1.3倍、>1.4倍、>1.5倍、>1.6倍、>1.7倍、>1.8倍、>1.9倍、>2倍、>3倍、 >4倍、>5倍、>6倍、>7倍、>8倍、>9倍、>10倍、>20倍、>30倍、>40倍、>50倍、>60倍、>70倍、>80倍、>90倍或>100倍。
IV.醫藥組成物
本發明還提供包含本發明的雙特異性結合蛋白(即，主要活性成分)和可藥用載體的醫藥組成物。
本發明的醫藥組成物可以進一步包含至少一種額外的活性成分。在一些實施方案中，這種額外的成分包括但不限於預防劑和/或治療劑、檢測劑。
在一個實施方案中，醫藥組成物包含一種或多種額外的預防劑或治療劑，即，除本發明的抗體或結合蛋白之外的用於治療或減輕疾病的藥劑。在一個實施方案中，已知額外的預防劑或治療劑可以用於、已經用於或目前正在用於疾病或其一種或多種症狀的預防、治療、管理或改善。
包含本發明蛋白質的醫藥組成物用於但不限於診斷、檢測或監測疾病；治療、管理或改善疾病或其一種或多種症狀；和/或研究。在一些實施方案中，組成物可以進一步包含載體、稀釋劑或賦形劑。賦形劑通常是為除主要活性成分外(即，除本發明的雙特異性結合蛋白外)的、向組成物提供所需特徵的任何化合物或化合物的組合。
V.核酸、載體和宿主細胞
在另一方面，本揭露提供了編碼本發明的雙特異性結合蛋白的一個或多個胺基酸序列的分離的核酸。可以將這樣的核酸插入載體中，用於實施多種遺傳分析或用於表達、表徵或改善本文所述的抗體或結合蛋白的一個或多個性質。載體可以包含編碼本發明的雙特異性結合蛋白的一個或多個胺基酸序列的一種或多種核酸分子，其中該一種或多種核酸分子有效地連接到合適的轉錄 序列和/或轉譯序列，該合適的轉錄序列和/或轉譯序列允許該雙特異性結合蛋白在攜帶該載體的特定宿主細胞中表達。用於選殖或表達編碼本文所述結合蛋白的胺基酸序列的核酸的載體的實例包括但不限於pcDNA及其衍生物。
本發明還提供表達或能夠表達載體的宿主細胞，該載體包含編碼本發明的雙特異性結合蛋白的一個或多個胺基酸序列的核酸。用於本發明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。一種示例性的原核宿主細胞是大腸桿菌。用作本發明的宿主細胞的真核細胞包括原生生物細胞、動物細胞、植物細胞和真菌細胞。示例性真菌細胞是酵母細胞，包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根據本發明，用作宿主細胞的示例性動物細胞包括但不限於哺乳動物細胞、禽細胞和昆蟲細胞。示例性哺乳動物細胞包括但不限於CHO細胞、HEK細胞和COS細胞。
VI.生產方法
在另一方面，本發明提供了一種生產本發明的雙特異性結合蛋白的方法，包括在足以使宿主細胞表達本發明的雙特異性結合蛋白的條件下，在培養基中培養包含編碼該雙特異性結合蛋白的表達載體的宿主細胞。
藉由本文揭露的方法產生的雙特異性結合蛋白可以分離並用於本文所述的多種組成物和方法。
VII.治療方法和醫療用途
在一些實施方案中，本發明提供了在有需要的受試者中治療自體免疫性疾病的方法，該方法包括向受試者施用本文揭露的雙特異性結合蛋白。自體免疫性疾病可以是自體抗體損害自體組織的疾病或病狀。
在一些實施方案中，用本文所述的方法和雙特異性結合蛋白治療的自體免疫性疾病包括系統性紅斑狼瘡(SLE)、IgAN、類風濕性關節炎(RA)、視神經脊髓炎/視神經脊髓炎譜系疾病(NOD/NMOD)、多發性硬化症(MS)、視神經脊髓炎、舍格倫綜合症(Sjogren's Syndrome)、ANCA相關血管炎、重症肌無力、Devic病。
在一些實施方案中，待治療的自體免疫性疾病是SLE。在一些實施方案中，疾病是對化合物如IFN-β-1a、IFN-β-1b、抗CD52抗體(阿侖單抗，Alemtuzumab)、那他珠單抗(Natalizumab)或抗CD20劑(利妥昔單抗、奧瑞利珠單抗(ocrelizumab)、奧法妥木單抗(ofatumumab))的常規免疫抑制療法表現出耐藥性或難治性的SLE。
本文所述的治療方法可以進一步包括向有需要的受試者施用額外的活性成分，該額外的活性成分與本文所述用於治療目的的雙特異性結合蛋白合適地組合存在。在本發明的治療方法中，可以將額外的活性成分摻入包含本發明的雙特異性結合蛋白的組成物中，並且將該組成物施與需要治療的受試者。在另一個實施方案中，本發明的治療方法可以包括向需要治療的受試者施用本文所述的雙特異性結合蛋白的步驟，以及在向受試者施用本發明的雙特性結合蛋白的步驟之前、同時或之後向該受試者施用額外的活性成分的單獨步驟。
實施例
提供以下實施例以說明但不限制所要求保護的發明。
實施例1.抗BAFF/抗MASP2雙特異性抗體的構建和表達
產生了一種命名為Blm129的雙特異性抗體，其靶向B細胞活化因子(BAFF)和MBL相關的絲胺酸蛋白酶2(MASP2)(圖1)。該雙特異性抗體包含 抗BAFF單株抗體(mAb)部分和抗MASP2 scFv部分，重鏈序列如SEQ ID NO：1所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：2所示。使用貝利尤單抗的序列(具有如SEQ ID NO：3所示的重鏈和如SEQ ID NO：2所示的輕鏈)作為該抗BAFF mAb部分；同時使用129C10的序列作為該抗MASP2 scFv部分，其中該129C10是一種具有中和活性並由Transcenta開發的人源化抗MASP2 mAb。
此外，為了提高該抗MASP2 scFv部分的穩定性，藉由將VH的第44位胺基酸和VL的第100位胺基酸突變為半胱胺酸來形成一對二硫鍵。
基因合成編碼Blm129的重鏈和輕鏈的DNA序列，並分別選殖入名為pcDNA3.1(+)(Invitrogen，目錄號V79020)的表達載體中，獲得編碼Blm129的重鏈的質粒和編碼Blm129的輕鏈的質粒。使用來自Qiagen的Plasmid Maxi-prep System大量製備所獲得的這兩個質粒。
為了表達雙特異性抗體Blm129，根據製造商的方案，使用Invitrogen的ExpiFectamineTM CHO試劑，用分別編碼Blm129重鏈和輕鏈的兩個質粒共轉染Expi-CHO細胞。在第10天收穫細胞上清液，並使用Mabselect SuRe親和層析和尺寸排阻層析(SEC)純化。藉由SDS-PAGE和SEC-HPLC評估，獲得95.9%的純度(圖2)。
還表達了抗MASP2的單株抗體129C10(即，抗MASP2 mAb)用作陽性對照。
實施例2.抗BAFF/TACI雙功能分子的構建和表達
產生了雙功能融合蛋白BlmTAC，其包含BAFF mAb部分以及跨膜激活劑和CAML相互作用物(TACI，Uniprot ID：O14836)的第二CRD結構域(富含半胱胺酸的結構域)(69-108aa)(圖3)，其中該TACI的第二CRD結構域(69- 108)用作BAFF和增殖誘導配體(APRIL)的捕獲阱(trap)。BlmTAC中重鏈的序列如SEQ ID NO：22所示，且BlmTAC中輕鏈的序列如SEQ ID NO：2所示。BlmTAC的表達和純化操作與Blm129相似。藉由SDS-PAGE和SEC-HPLC評估，獲得98.4%的純度(圖4)。
也表達和純化了作為Blm129和BlmTAC的類似物的貝利尤單抗(貝利尤單抗也稱為“貝利尤單抗類似物”)和作為Blm129和BlmTAC的類似物的泰他西普(泰他西普也稱為“泰他西普類似物”)，用作陽性對照，這兩種藥物的序列來自IMGT/mAb數據庫。
實施例3.Blm129和BlmTAC與BAFF、APRIL和MASP2的ELISA結合
藉由ELISA法評估雙特異性抗體的結合活性。
首先，製備了MASP2-his蛋白。具體地，在全長人MASP-2基因(Uniprot ID：O00187)的C末端與6個his標簽融合，插入pcDNA3.1(+)載體中，並藉由測序證實該構建體。用ExpiFectamine CHO轉染試劑盒將該表達構建體轉染入ExpiCHO-s細胞中。在ExpiCHO表達培養基中培養ExpiCHO-s細胞。轉染後14天，收集上清液。離心和過濾後，將上清液裝載到HisTrap柱(Cytiva，目錄號：29048586)上，然後用GE AKTA純化系統純化。洗滌後，用250mM咪唑緩衝液沖提MASP2-his蛋白，並藉由透析去除沖提的蛋白中的咪唑。
接下來，將人BAFF-his(ACRO Biosystems，目錄號：BAF-H5248)、APRIL-his(ACRO Biosystems，目錄號：APL-52D1)或製備的MASP2-his固定在ELISA板上，將雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC或對照蛋白(貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物)在PBS中連續稀釋並加入至ELISA板中孵育1h。接 下來，加入山羊pAb抗人IgG-HRP(Abcam，批號GR3256019-10)和TMB，以檢測OD450nm處的結合活性。最後，藉由GraphPad Prism分析數據。
如圖5所示，Blm129以高親和力與人BAFF結合，EC50為約0.04517nM；BlmTAC也以高親和力與人BAFF結合，EC50為約0.02799nM；作為對照，貝利尤單抗類似物以EC50約0.01847nM與人BAFF結合，泰他西普類似物以EC50約0.1000nM與人BAFF結合。
如圖6所示，BlmTAC以高親和力與人APRIL結合，EC50為約0.4067nM；作為陽性對照，泰他西普類似物以EC50約0.5613nM與人APRIL結合。
如圖7所示，Blm129以高親和力與人MASP2結合，EC50為約0.2461nM；作為陽性對照，129C10以EC50約0.2493nM與人MASP2結合。
實施例4.雙特異性結合蛋白與BAFF、APRIL和MASP2的動力學結合
將在1×動力學緩衝液(1×PBS,pH 7.4,0.02%吐溫20,0.1% BSA)中的100nM雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC或對照蛋白(貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物)加載到4個預濕蛋白A生物傳感器上，並與多個濃度的人BAFF、APRIL或MASP2溶液孵育。均在30℃收集所有結合數據。具體地，實驗操作包括以下5個步驟：(1)基線採集(60s)；(2)裝載雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC或對照蛋白(貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物)到蛋白A生物傳感器上(60s)；(3)第二次基線採集(60s)；(4)測定抗原結合kon(90s)；和(5)測定抗原解離koff(150s)。使用1×動力學緩衝液稀釋的四個不同抗原濃度，包括100nM、33.3nM、11.1nM和0nM。在1×動力學緩衝液中實施基線和解離步驟。koff對kon的比值確定KD。在再生緩衝液(10mM甘胺酸HCL，pH 1.7)中再生生物傳感 器5s，然後在中和緩衝液(1×PBS,pH 7.4,0.02%吐溫20,0.1% BSA)中實施中和5s。重複該實驗3次。
如下表1所示，Blm129以高親和力結合人BAFF和MASP2，並且BlmTAC以高親和力結合人BAFF和APRIL。
表1.生物膜干涉法(BLI)測定各抗體與人BAFF、APRIL和MASP-2的結合親和力
Figure 112151433-A0202-12-0036-1
實施例5.雙特異性結合蛋白Blm129與人BAFF和MASP2的同時結合
使用實施例3製備的1μg/ml人MASP2-his在4℃過夜包被ELISA板。然後加入300μl封閉緩衝液在室溫封閉1小時。1小時後，加入100μl濃度範圍為200nM至0.01nM(5倍系列稀釋液)的Blm129或對照mAb(貝利尤單抗類似物和129C10)，並在室溫孵育1小時。使用0.5% PBS+吐溫20洗滌3次，然後向每個孔中加入0.5μg/ml人BAFF-Fc-生物素(Acro Biosystems，目錄號：BAF-H82F3)。1h後，加入100μl HRP綴合的鏈黴親和素(1：5000)。室溫孵育1小時後，加入TMB底物試劑混合物(InnoReagents,TMB-S-003)，並在室溫溫育 5分鐘，藉由加入0.1M H2SO4停止反應。藉由微孔板讀數儀讀取OD450nm處的值。
如圖8所示，包含抗BAFF臂和抗MASP2臂的Blm129可以同時結合人BAFF和MASP2。
實施例6.在基於細胞的報告基因測定法中雙特異性結合蛋白中和BAFF活性
在該測定法中，HEK-293-BCMA-NFkB-螢光素酶細胞購自Cobior(目錄號：CBP74072)，這些細胞是藉由用人BCMA基因和NF-κB誘導型螢光素酶構建體穩定轉染HEK293細胞而產生的。BAFF與其受體BCMA的結合觸發級聯反應，導致NF-κB的活化和隨後的螢光素酶的產生，這可以藉由ONE-Glo監測。因此，使用中和抗體可以阻斷BAFF介導的螢光素酶的產生。
簡言之，使用含有10% FBS的DMEM培養基製備濃度為50nM的人BAEF蛋白溶液，然後將25μl加入96孔板中。雙特異性結合蛋白Blm129和BlmTAC或對照蛋白(貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物)用作樣品。製備樣品稀釋溶液，並向96孔板中加入每種稀釋液25μl。將含有BAFF和作為拮抗劑的蛋白質樣品的板在37℃預孵育30min。收集對數生長期的HEK-293-BCMA-NFkB-螢光素酶細胞，並將細胞以密度為3×104個/孔(100μl/孔)接種到96孔板中。將該96孔板於37℃、5% CO2培養5小時。向每個孔中加入100μl ONE-Glo®試劑，並混合內容物。將該板在室溫孵育10分鐘以穩定發光信號。使用分光光度計測定發光。藉由GraphPad Prism 9分析數據。
如圖9所示，Blm129和BlmTAC可以以劑量依賴性方式阻斷BAFF誘導的NFκB信號通路。BlmTAC最有效地阻斷BAFF誘導的NFκB信號 通路，IC50為8.740nM。與貝利尤單抗類似物相比較，出乎意料的是，Blm129在阻斷BAFF誘導的NFκB信號通路方面顯著地更有效。
實施例7.評估Blm129對補體因子C4活性的影響
MASP-2是凝集素途徑的關鍵組分，它切割補體因子C4和C2，產生C3轉化酶C4bC2a。C3的活化最終導致膜攻擊複合物(MAC)的形成。為了測試抑制MASP-2的抗體是否可以減少凝集素途徑的活化，在Blm129和129C10存在下評估C4的活性。
用10μg/ml甘露聚糖包被ELISA板，每孔100μl，4℃過夜。用PBS+0.1%吐溫20洗滌3次後，用封閉緩衝液(10mM Tris-HCl+0.1%人血清白蛋白+140mM NaCl)封閉該板1小時。用含有2%人血清(Quidel,A113)的測定緩衝液(0.1%人血清白蛋白+20mM Tris-HCl+2mM CaCl2+140mM NaCl+1mM MgCl2+0.05%吐溫20)連續稀釋Blm129或129C10，並在冰上孵育45分鐘。從甘露聚糖包被的板去除封閉緩衝液，並加入抗體-血清混合物。將該板在37℃孵育1h。活化的補體組分應沉積在板的底表面上，而失活的組分仍可溶於緩衝液中。用洗滌緩衝液洗滌該板3次後，藉由HRP連接的抗C4c抗體(Quidel-A211)監測補體因子C4的活性。
如圖10所示，Blm129和129C10以劑量依賴的方式阻斷補體因子C4的活化，IC50分別為2.474nM和0.1558nM。
實施例8.Blm129和BlmTAC的體內藥效學(PD)作用
1.藉由一週三次皮下注射處理後B細胞消耗的效果
為了更好地瞭解Blm129和BlmTAC的體內功效，自杭州紫苑實驗動物有限公司(Hangzhou Ziyuan Experimental Animal Co.Ltd)購買雌性BALB/c 小鼠，保持在飼養條件下：溫度20-26℃；相對濕度40-70%；光照12小時，暗處12小時。在實驗開始的當天(D0)，將小鼠隨機分為5組，每組12隻動物，並藉由皮下注射分別施用生理鹽水或10mg/kg Blm129、BlmTAC、貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物，一週三次。分別於處理後的D7、D14、D18從眼底靜脈採集血液樣品。在D7、D14、D18的每個時間點，每組處死4隻小鼠，收穫各組相應的脾臟，然後按照廠家的說明書用溫和的MACS解離劑(Miltenyi Biotec,130-093-235)解離脾臟。然後，加入裂解緩衝液(eBioscience,00-4300-54)以除去紅細胞。分離單個脾細胞和外周血淋巴細胞，用於B細胞表型分型，在CytoFLEX(Beckman Coulter)上藉由流式細胞術表型分型抗CD45、CD19和CD21染色的細胞。使用數據分析軟體(Cytoflex和GraphPad Prism)計算血液和脾臟樣品中CD45+免疫細胞和CD21+CD19+ B細胞占CD19+ B細胞的百分比。藉由統計分析(Student t檢驗)對Blm129和BlmTAC施用組與對照組進行比較，如果p值<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(#)，則差異顯著。
如表2、圖11和圖12所示，結果表明，在施用期間，在血液和脾臟樣品中，與生理鹽水組相比較，用Blm129、BlmTAC和基準物(貝利尤單抗類似物或泰他西普類似物)處理可以顯著降低CD19+/CD45+ B細胞的比例和表達CD21+(也稱為補體C3d受體)的CD19+ B細胞的比例，這些細胞在B細胞活化和成熟中起作用。與貝利尤單抗類似物和泰他西普類似物的組相比，Blm129對B細胞消耗表現出更強的效力，BlmTAC也表現出類似的活性。
表2.Blm129和BlmTAC處理BALB/c小鼠後，血液和脾臟的B細胞表型分型(平均值±S.E.M.,n=4)
Figure 112151433-A0202-12-0040-2
2.一週一次靜脈注射處理後的B細胞亞群和表型分析
B細胞發育發生在骨髓中，其中一連串的表面生物標誌物表達促進B細胞分化和成熟，從原B細胞到前B細胞、再到未成熟B細胞、到進入外周的成熟B細胞。因此，如實施例8.1中該，進一步研究BlmTAC的體內活性，以鑑定對BALB/c小鼠中的B細胞亞群的影響，該B細胞亞群用抗CD19(總B細胞)、IgM(未成熟B細胞)，IgD(成熟B細胞)和CD27(記憶B細胞)、CD138(漿母細胞/漿細胞)、CD21(表達C3d受體的B細胞)和CD23(表達Fcε RII的B細胞)。簡言之，將小鼠隨機分為3組，並藉由靜脈注射分別施用生理鹽水或10mg/kg BlmTAC、泰他西普類似物，一週一次。分別於處理後的D7、D14和D21從眼底靜脈採集新鮮血液樣品。處死動物(n=4隻/組)，收穫各組相應的脾臟，然後按照廠家的說明書用溫和的MACS解離劑(Miltenyi Biotec,130-093-235)解離脾臟。然後，加入裂解緩衝液(eBioscience,00-4300-54)以除去紅細胞。分離單個脾細胞和外周血淋巴細胞，用於B細胞表型分型，在CytoFLEX(Beckman Coulter)上藉由流式細胞術表型分型抗CD19、IgM、IgD、CD138、CD21和CD23染色的細胞。使用數據分析軟體(Cytoflex和GraphPad Prism)分別計算血液和脾臟樣品中CD19+ B細胞占免疫細胞的百分比、IgM+/CD19+、IgD+/CD19+、CD138+/CD19+、CD23+/CD19+和CD21+CD19+ B細胞的百分比。藉由統計分析(Student t檢驗)對BlmTAC組或泰他西普類似物組與對照組進行比較，如果p值<0.05(*/#),<0.01(**/##),<0.001(***/###)，則差異顯著。
如圖13A及圖13B和圖14A及圖14B所示，結果表明，在施用期間，在血液和脾臟樣品中，與生理鹽水組相比較，用BlmTAC和基準物(泰他西普類似物)處理在B細胞活化和成熟中發揮作用，可以顯著降低CD19+總B細胞比例、降低表達IgD+的CD19+成熟B細胞、表示CD23+的CD19+ B細胞和 表達CD21+(也稱為補體C3d受體)的CD19+ B細胞，其中該CD23是FcεRII生物標誌物，其調節參與過敏和自體免疫性疾病的IgE水平；儘管BlmTAC和基準物(泰他西普類似物)處理對IgM+/CD19+未成熟B細胞和CD138+/CD19+漿母細胞/漿細胞沒有抑制作用。此外，在血液樣本中檢測到BlmTAC和泰他西普類似物施用後CD27+/CD19+記憶B細胞的減少。與泰他西普類似物組相比較，BlmTAC對成熟的B細胞消耗表現出更大的效力和持久的作用。
實施例9.Blm129和BlmTAC在Balb/c小鼠中的單劑量藥物代謝動力學(PK)研究
在Balb/c小鼠單次靜脈內施用後，對Blm129、BlmTAC和作為基準物的貝利尤單抗類似物、泰他西普類似物的PK特性進行了表徵和頭對頭比較。將16隻雌性小鼠隨機分為4組(4隻動物/組)，分別施用13.5mg/kg Blm129、10mg/kg BlmTAC、10mg/kg貝利尤單抗類似物或5mg/kg泰他西普類似物一次，以10mL/kg的劑量體積靜脈推注。在施用前(0分鐘)和施用後5分鐘、30分鐘、2小時、8小時、24小時、48小時、D4、D7、D10、D14、D21採集各組血漿，並藉由部分驗證的ELISA測定法進行PK分析。用人IgG特異性抗IgG抗體[R10z8e6](Abcam,ab124055)預包被微孔板的孔。封閉後，將標準品(STD)、質量控制(QC)樣品、基質空白樣品和測試樣品加入孔中。洗滌後，將山羊抗人IgG(HRP)(Abcam,ab98624)加入微孔板的孔中。將四甲基聯苯胺(TMB)加入微孔板的孔中，在HRP存在下產生比色信號(藍色)。一旦顯色，將終止液加入每個孔中以停止反應。使用設置為450nm和620nm的微孔板讀數儀測量光密度(OD)。藉由與用4參數邏輯模型回歸的同時分析的標準曲線進行比較，將QC和測試樣品的光密度(OD)值轉換為濃度。平均血漿濃度如表3所示，平均血漿濃度-時間曲線如圖15所示。使用Phoenix軟體藉由非房室分析(NCA)計算和評估相關的 PK參數(表4)。結果表明，Blm129的半壽期(T1/2)和BlmTAC的半壽期(T1/2)大致相同，比泰他西普類似物的半壽期長。
表3.Balb/c小鼠單次注射後的血漿藥物濃度(平均值±S.E.M.，n=4)
Figure 112151433-A0202-12-0043-3
表4.Balb/c小鼠單次注射後的PK參數
Figure 112151433-A0202-12-0043-5
等效物
雖然已經討論了本發明的具體實施方案，但上述說明是闡述性的而非限制性的。本發明的許多變化對本領域具有通常知識者來說將在閱讀本說明書和下面的申請專利範圍後變得顯而易見。本發明的全部範圍應藉由參考申請專利範圍及其等效物的全部範圍和說明書以及這些變化來確定。
示例性序列
Figure 112151433-A0202-12-0044-6
Figure 112151433-A0202-12-0045-7
Figure 112151433-A0202-12-0046-10
Figure 112151433-A0202-12-0047-11
TW202442678A_112151433_SEQL.xml

Claims (16)

  1. 一種雙特異性結合蛋白，其從胺基端到羧基端包含：
    (a)第一部分，為抗BAFF抗體或其抗原結合片段，包含：
    (i)重鏈可變結構域(VH)，包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；和
    (ii)輕鏈可變結構域(VL)，包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
    其中，
    CDR-H1包含NNAIN(SEQ ID NO：6)的序列；
    CDR-H2包含GIIPMFGTAKYSQNFQG(SEQ ID NO：7)的序列；
    CDR-H3包含SRDLLLFPHHALSP(SEQ ID NO：8)的序列；
    CDR-L1包含QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：9)的序列；
    CDR-L2包含GKNNRPS(SEQ ID NO：10)的序列；和
    CDR-L3包含SSRDSSGNHWV(SEQ ID NO：11)的序列；
    其中CDR是根據Kabat編號來定義的；和
    (b)第二部分，其為抗MASP2 scFv或截短的TACI多肽，其中該抗MASP2 scFv包含：
    (i)重鏈可變結構域(VH)，包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；和
    (ii)輕鏈可變結構域(VL)，包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
    其中，
    CDR-H1包含DYYIN(SEQ ID NO：16)的序列；
    CDR-H2包含WIFPGSESAYHSEKFKA(SEQ ID NO：17)的序列；
    CDR-H3包含GDRSGPFAY(SEQ ID NO：18)的序列；
    CDR-L1包含KSSQSLLYSNGKTYLN(SEQ ID NO：19)的序列；
    CDR-L2包含LVSKLDS(SEQ ID NO：20)的序列；和
    CDR-L3包含VQVTHFPFT(SEQ ID NO：21)的序列；
    其中CDR是根據Kabat編號來定義的；
    其中該截短的TACI多肽是SEQ ID NO：24所示的人TACI胞外區或其片段或變體，
    其中該第一部分的重鏈的羧基端與該第二部分的胺基端共價連接。
  2. 如請求項1所述的雙特異性結合蛋白，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條重鏈從胺基端到羧基端包含第一部分的重鏈、接頭肽和第二部分，且每條輕鏈是第一部分的輕鏈。
  3. 如請求項1或請求項2所述的雙特異性結合蛋白，其中該抗BAFF抗體和/或該抗MASP2 scFv是嵌合的、人源化的或人抗BAFF抗體和/或抗MASP2 scFv，並且其中該截短的TACI多肽包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列組成、或其片段或變體，例如SEQ ID NO：26所示的片段。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性結合蛋白，其是雙特異性抗BAFF X抗MASP2抗體，其中該抗BAFF抗體或其抗原結合片段包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由SEQ ID NO：4的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；並且該抗MASP2 scFv包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：14的胺 基酸序列或由SEQ ID NO：14的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列或由SEQ ID NO：15的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
  5. 如請求項4所述的雙特異性結合蛋白，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條輕鏈的恆定結構域衍生自人κ或λ輕鏈恆定結構域，且每條重鏈的恆定結構域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定結構域；
    較佳地，其中每條重鏈包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列或由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且每條輕鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由SEQ ID NO：2的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
  6. 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白是包含抗BAFF抗體或其抗原結合片段和截短的TACI多肽或其片段或變體的融合蛋白，其中該抗BAFF抗體或其抗體結合片段包含或由以下組成：(a)VH，包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由SEQ ID NO：4的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；和(b)VL，包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列； 並且該截短的TACI多肽或其片段或變體包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列或由SEQ ID NO：25的胺基酸序列組成，或其片段或者變體，如SEQ ID NO：26所示的片段。
  7. 如請求項6所述的雙特異性結合蛋白，其包含兩條重鏈和兩條輕鏈，其中每條輕鏈的恆定結構域衍生自人κ或λ輕鏈恆定結構域，且每條重鏈的恆定結構域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定結構域；
    較佳地，其中每條重鏈包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列或由SEQ ID NO：22的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且每條輕鏈包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列或由SEQ ID NO：2的胺基酸序列組成，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
  8. 如請求項1至5中任一項所述的雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白具有一個或多個以下特徵：
    (1)與人BAFF和人MASP2結合，其中以小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD結合人BAFF，並以小於約10x 10-8M、5x 10-8M、1x 10-8M或5x 10-9M的KD結合人MASP2，如藉由生物膜干涉法測量的；
    (2)與人BAFF和人MASP2結合，其中以約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50結合人BAFF，並以約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50結合人MASP2，如藉由ELISA測量的；
    (3)在表達BCMA的細胞中，中和BAFF活性，IC50為約250nM或更低、200nM或更低、170nM或更低或140nM或更低；
    (4)阻斷補體因子C4的激活，IC50為約10nM或更低、8nM或更低、6nM或更低或4nM或更低；
    (5)在體內消耗B細胞。
  9. 如請求項1至3和6至7中任一項所述的雙特異性結合蛋白，其中該雙特異性結合蛋白具有一個或多個以下特徵：
    (1)與人BAFF和人APRIL結合，其中以小於約1x 10-12M的KD結合人BAFF，並以小於約10x 10-9M、5x 10-9M、1x 10-9M或5x 10-10M的KD結合人APRIL，如藉由生物膜干涉法測量的；
    (2)與人BAFF和人APRIL結合，其中以約0.1nM或更低、0.08nM或更低、0.06nM或更低或0.05nM或更低的EC50結合人BAFF，並以約1nM或更低、0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50結合人APRIL，如藉由ELISA測量的；
    (3)在表達BCMA的細胞中，中和BAFF活性，IC50為約50nM或更低、35nM或更低、20nM或更低或10nM或更低；
    (4)在體內消耗B細胞。
  10. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項所述的雙特異性結合蛋白。
  11. 一種載體，其包含如請求項10所述的核酸分子。
  12. 一種宿主細胞，其包含如請求項10所述的核酸分子或如請求項11所述的載體。
  13. 一種製備如請求項1至9中任一項所述的雙特異性結合蛋白的方法，包括：
    在允許生產雙特異性結合蛋白的條件下培養如請求項12所述的宿主細胞；和
    從培養物中回收雙特異性結合蛋白。
  14. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項所述的雙特異性結合蛋白、如請求項10所述的核酸、如請求項11所述的載體或如請求項12所述的宿主細胞。
  15. 一種治療或預防自體免疫性疾病的方法，包括向有需要的受試者施用治療有效量的如請求項14所述的醫藥組成物，較佳地該受試者是人。
  16. 如請求項15所述的方法，其中該自體免疫性疾病選自系統性紅斑狼瘡(SLE)、IgAN、類風濕性關節炎(RA)、視神經脊髓炎/視神經脊髓炎譜系疾病(NOD/NMOD)、多發性硬化症(MS)、視神經脊髓炎、舍格倫綜合症、ANCA相關血管炎、重症肌無力、Devic病。
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