TW202434638A - 靶向ｂ７－ｈ３的抗體或抗體片段、以及其在嵌合抗原受體免疫細胞療法領域的用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種靶向B7-H3的抗體或抗體片段、基於此抗體或抗體片段的嵌合抗原受體和嵌合抗原受體-免疫細胞以及它們用於治療腫瘤的用途。具體而言，此抗體或抗體片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，VH包括：如SEQ ID NO:9的VH-CDR1、如SEQ ID NO:10的VH-CDR2和如SEQ ID NO:11 的VH-CDR3，並且，VL包括：如SEQ ID NO:12的VL-CDR1，如SEQ ID NO:13的VL-CDR2和如SEQ ID NO:14的VL-CDR3；或者VH包括如SEQ ID NO:15的VH-CDR1、如SEQ ID NO:16的VH-CDR2和如SEQ ID NO:17的VH-CDR3，並且，VL包括：如SEQ ID NO:18的VL-CDR1、如SEQ ID NO:19的VL-CDR2和如SEQ ID NO:20的VL-CDR3。

Description

靶向B7-H3的抗體或抗體片段、以及其在嵌合抗原受體免疫細胞療法領域的用途

本發明涉及一種靶向B7-H3的抗體或抗體片段、基於該抗體或抗體片段的嵌合抗原受體（CAR）和CAR-免疫細胞以及它們用於治療腫瘤的用途等。

作為一種免疫療法，單克隆抗體在治療惡性疾病方面表現出巨大的治療潛力，受到廣泛關注。諸如靶向B7-H1（PD-L1）/PD-1訊號路徑的抗PD-1、抗PD-L1的抗體療法，已經在腫瘤治療領域取得了突破性的應用。決定一個單克隆抗體療法成敗的關鍵是選擇合適的靶點或者免疫檢查點，再啟動以及加強受試者的自身免疫反應。

B7-H3（也被稱為CD276）是一個由316個胺基酸組成的I型跨膜蛋白。在人體中，根據膜外結構域的差異，B7-H3可以分成2Ig-B7-H3以及4Ig-B7-H3這兩種不同的形式。對於2Ig-B7-H3而言，其膜外端含有一對免疫球蛋白V區結構域（immunoglobulin variable (IgV)-like domain，IgV-結構域）和免疫球蛋白C區結構域（immunoglobulin constant (IgC)-like domain，IgC-結構域）。4Ig-B7-H3的膜外段則含有兩對IgV-及IgC-結構域。B7-H3屬於B7蛋白家族，正常組織都不表達或低表達B7-H3。但B7-H3卻在多種腫瘤組織表達（多達60%以上腫瘤表達B7-H3），其中包括胰腺癌（陽性率77.8%）、結直腸癌（陽性率63.8%）、胃癌（陽性率69.2%）、肺癌（陽性率69.5%）、前列腺癌（陽性率93%）、卵巢癌（陽性率73.1%）等，在多種罕見腫瘤中也高表達，因此也曾被稱之為「腫瘤相關抗原」，是一個具有巨大潛力的泛腫瘤通用型藥物靶點（參照引用文獻1）。

像B7蛋白家族的其它成員例如PD-L1等一樣，B7-H3也具有免疫檢查抑制分子的功能。利用中和性單克隆抗體（mAbs）阻斷B7-H3的結合能夠提高包括NK細胞以及CD8殺傷型T細胞的殺傷功能，促進其在腫瘤細胞的浸潤，降低腫瘤負荷，提高荷瘤小鼠的生存期（參照引用文獻2）。

因此，鑑於B7-H3在腫瘤組織中廣泛高表達而在健康組織中低表達以及B7-H3在腫瘤微環境中的功能，B7-H3的臨床治療潛力吸引了諸多的目光。已經有多個靶向B7-H3的臨床試驗開展。其中，有20多個臨床試驗是基於mAbs展開的，包括中和性抗體、抗體藥物偶聯物（antibody-drug conjugates，ADCs）、雙特異性抗體、抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）、NK細胞銜接器連接抗體等。

中和性抗體能夠被用來阻斷配體和受體的結合，阻斷訊號的轉導進而影響相關細胞功能。藉由中和性抗體阻斷B7-H3的訊號能夠釋放受B7-H3訊號影響的免疫細胞的功能，提高其抗腫瘤能力，在多種實體腫瘤，包括卵巢癌、黑色素瘤以及結直腸癌中均證明了其治療潛力（參照引用文獻3至5）。

ADCs偶聯抗體為特異性識別抗原的抗體與具有細胞毒性的小分子藥物偶聯在一起的藥物，具有特異性好、安全性好、殺傷腫瘤細胞高效的特點。有研究團隊在多種實體腫瘤模型中證明了靶向B7-H3的ADC藥物的有效性，並在靈長類動物中證明了其安全性（參照引用文獻6）。

雙特異性抗體為將兩個靶向不同靶點的抗體結合在一起，臨床上已經批准了同時靶向B7-H3和CD3的雙特異性抗體治療實體腫瘤（clinical trial No: NCT03406949）。此雙特異性抗體能夠將啟動的T細胞招募到B7-H3陽性的腫瘤組織處，説明T細胞識別和殺傷腫瘤細胞。

靶向B7-H3的ADCC在實體腫瘤中也取得了進展。有研究團隊設計了一個靶向B7-H3，並將Fc進行了工程化的單克隆抗體，能夠提高殺傷性免疫細胞藉由Fc受體完成對B7-H3陽性腫瘤細胞的殺傷作用。其安全性在靈長類動物中也得到了驗證（參照引用文獻7）。

將靶向B7-H3的抗體與NK細胞受體（CD16）抗體連接在一起能夠促進NK細胞對B7-H3陽性腫瘤細胞的識別和殺傷功能。也有團隊進一步進行了改造，在CD16抗體與B7-H3抗體的基礎上，又連接了一個白介素-15（IL15）蛋白，IL15能夠進一步促進NK細胞的活性。這種抗體-蛋白複合物在體外和模型動物實體腫瘤治療中取得了非常好的效果（參照引用文獻8）。

除此之外，靶向B7-H3的嵌合抗原受體T細胞免疫療法（PD -T）也在實體腫瘤中取得了一定進展，諸如腦膠質瘤（參照引用文獻9）、非典型畸胎瘤樣橫紋肌瘤（參照引用文獻10）、間變性腦膜瘤（參照引用文獻11）。

儘管目前全球已經開展了多個靶向B7-H3的免疫療法（包括B7-H3單克隆抗體和CAR-B7-H3-T療法等），也取得了一些早期積極的治療效果。但是該靶點免疫療法仍然存在抗體選擇範圍小，臨床治療效果有限等問題。仍需要進一步探索新抗體和新治療手段。

另外，CAR-T是一種在αβT細胞基礎上進行基因修飾的革命性的免疫療法，在過去10年取得了巨大的臨床進展。截止目前已經有6款CAR-T治療藥物通過FDA批准上市，在中國也有2款CAR-T藥物獲批上市。這8款CAR-T藥物均是靶向CD19或者BCMA，治療B細胞相關的惡性血液腫瘤，具有高回應率和疾病緩解率。然而，CAR-T療法也存在諸多弊端，比如在實體腫瘤中療效甚微，無法進行異體治療及現貨式供應，價格昂貴等等。

γδT細胞則能在一定程度上解決這些問題。從細胞類型上來分，γδT細胞是一種表達γδ T細胞受體（T cell receptor, TCR）的T細胞，其是一類特殊的免疫細胞，同時具有先天免疫和獲得性免疫的特徵，其識別抗原和病原體不依賴於主要組織相容性複合體（MHC），因此可以在未經任何修飾的前提下實現異體治療，而不會引發GvHD等反應。已經有很多研究報導γδT細胞具有廣譜抗腫瘤能力，且在實體腫瘤中具有更強的浸潤和抗腫瘤效果。CAR修飾的γδT細胞則能進一步提高γδT細胞的靶向性和腫瘤殺傷作用（參照引用文獻12及13），但尚未有將B7-H3抗體應用於CAR-γδT細胞的相關研究和報導。

[先前技術文獻]

引用文獻1. Kontos, F., et al., B7-H3: An Attractive Target for Antibody-based Immunotherapy. Clin Cancer Res, 2021. 27（5）: p. 1227-1235.

引用文獻2. Lee, Y.-H., et al., Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function. Cell research, 2017. 27（8）: p. 1034-1045.

引用文獻3. Cai, D., et al., Tumor-expressed B7-H3 mediates the inhibition of antitumor T-cell functions in ovarian cancer insensitive to PD-1 blockade therapy. Cell Mol Immunol, 2020. 17（3）: p. 227-236.

引用文獻4. Lee, Y.H., et al., Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function. Cell Res, 2017. 27（8）: p. 1034-1045.

引用文獻5. Lu, H., et al., B7-H3 inhibits the IFN-gamma-dependent cytotoxicity of Vgamma9Vdelta2 T cells against colon cancer cells. Oncoimmunology, 2020. 9（1）: p. 1748991.

引用文獻6. Scribner, J.A., et al., Preclinical Development of MGC018, a Duocarmycin-based Antibody-drug Conjugate Targeting B7-H3 for Solid Cancer. Mol Cancer Ther, 2020. 19（11）: p. 2235-2244.

引用文獻7. Loo, D., et al., Development of an Fc-enhanced anti-B7-H3 monoclonal antibody with potent antitumor activity. Clin Cancer Res, 2012. 18（14）: p. 3834-45.

引用文獻8. Vallera, D.A., et al., NK-Cell-Mediated Targeting of Various Solid Tumors Using a B7-H3 Tri-Specific Killer Engager In Vitro and In Vivo. Cancers, 2020. 12（9）.

引用文獻9. Tang, X., et al., Ad ministration of B7-H3 targeted chimeric antigen receptor-T cells induce regression of glioblastoma. Signal Transduct Target Ther, 2021. 6（1）: p. 125.

引用文獻10.    Theruvath, J., et al., Locoregionally ad ministered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors. Nat Med, 2020. 26（5）: p. 712-719.

引用文獻11.    Tang, X., et al., Bioactivity and safety of B7-H3-targeted chimeric antigen receptor T cells against anaplastic meningioma. Clinical & Translational Immunology, 2020. 9（6）: p. e1137.

引用文獻12.    Ang, W.X., et al., Electroporation of NKG2D RNA CAR Improves Vγ9Vδ2 T Cell Responses against Human Solid Tumor Xenografts. Molecular Therapy - Oncolytics, 2020. 17: p. 421-430.

引用文獻13.    Rozenbaum, M., et al., Gamma-Delta CAR-T Cells Show CAR-Directed and Independent Activity Against Leukemia. Frontiers in Immunology, 2020. 11.

為了解決上述問題，本發明提供了新的B7-H3抗體或抗體片段，並將其成功用於CAR-αβT及/或CAR-γδT細胞治療領域。為B7-H3靶點的臨床治療以及檢測帶來了新的選擇和可行性，進一步本發明還解決了CAR免疫細胞療法中對實體腫瘤療效甚微、無法進行異體治療和現貨式供應、以及價格昂貴等問題。

本發明第一方面提供了一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，上述重鏈可變區VH包括：如SEQ ID NO:9的胺基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:10的胺基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列VH-CDR3；上述輕鏈可變區VL包括：如SEQ ID NO:12的胺基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO:13的胺基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO:14的胺基酸序列所示的VL-CDR3。 SEQ ID NO:9：NYWIN SEQ ID NO:10：RIAPGTISTYYNEKFKG SEQ ID NO:11：QDNYFIN SEQ ID NO:12：SASSSISSSDLH SEQ ID NO:13：GTSNLAS SEQ ID NO:14：QQWFSYPFT

本發明第二方面提供了一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，上述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO:15的胺基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:16的胺基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列VH-CDR3；上述輕鏈可變區VL包括：如SEQ ID NO:18的胺基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO:19的胺基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO:20的胺基酸序列所示的VL-CDR3。 SEQ ID NO:15：RYDMS SEQ ID NO:16：TISDDGRHTYDRDSVKG SEQ ID NO:17：HRAITTARFDY SEQ ID NO:18：KASQDIYSNIG SEQ ID NO:19：HGTNLED SEQ ID NO:20：LQYVQFPYT

本發明第三方面提供了如第一方面和第二方面所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中，上述重鏈可變區VH選自SEQ ID NO:1所示胺基酸序列、在CDR區之外與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列、SEQ ID NO:2所示胺基酸序列、以及在CDR區之外與SEQ ID NO:2所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列中的任一種。 SEQ ID NO:1EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWINWIRQRPGQGLEWIGRIAPGTISTYYNEKFKGRATITEDTSTNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCARQDNYFINWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:2EFEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSRYDMSWVRQSPEKRLEWVATISDDGRHTYDRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCVRHRAITTARFDYWGQGTTVTVSSSR

本發明第四方面提供了如第一方面或第二方面所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中，上述輕鏈可變區VL選自SEQ ID NO:3所示胺基酸序列、在CDR區之外與SEQ ID NO:3所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列、SEQ ID NO:4所示胺基酸序列、在CDR區之外與SEQ ID NO:4所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列中的任一種。 SEQ ID NO:3DIVLTQSPASLSASLGEKVTITCSASSSISSSDLHWYQQKSGTSPRPWIYGTSNLASGVPPRFSGSGSGTSFSLTISSVEAEDVGTYYCQQWFSYPFTFGTGTKLEIK SEQ ID NO:4GCADIVMTQSPSSLSVSLGDTVSITCKASQDIYSNIGWLQQLPGQSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYSLTISGLESEDFADYYCLQYVQFPYTFGGGTKLEIKASG

本發明第五方面提供了一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包括：（i）SEQ ID NO:1所示的重鏈可變區VH和SEQ ID NO:3所示的輕鏈可變區VL，或者（ii）SEQ ID NO:2所示的重鏈可變區VH和SEQ ID NO:4所示輕鏈可變區VL。

本發明第六方面提供了如上述第一至第五方面中任一方面所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中，上述抗體或抗體片段為基因工程化改造的抗體或抗體片段。

本發明第七方面提供了如上述第一至第六方面中任一方面所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段為scFv。

本發明第八方面提供了一種嵌合抗原受體，其包含：上述第七方面所述的特異性結合B7-H3的抗體或抗體片段。

本發明第九方面提供了一種如本發明第八方面所述的嵌合抗原受體，其包含：上述第七方面的抗體或抗體片段、融合於所述抗體或抗體片段的羧基末端的跨膜區。

本發明第十方面提供了如上述第八或第九方面的嵌合抗原受體，其包含：上述第七方面所述的抗體或抗體片段、融合於所述抗體或抗體片段的羧基末端的跨膜區和融合於所述跨膜區的羧基末端的免疫活性細胞活化訊號轉導區。

本發明第十一方面提供了如上述第八至第十方面中任一方面所述的嵌合抗原受體，其還包含有膜蛋白、分泌蛋白、胞內蛋白、小分子藥物、以及細胞毒性藥物中的一種或兩種以上。

本發明第十二方面提供了一種核酸分子，其包含：編碼上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段或上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列。

本發明第十三方面提供了如上述第十二方面所述的核酸分子，其包含：（i）如SEQ ID NO:5所示的編碼重鏈可變區的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:7所示的編碼輕鏈可變區的核苷酸序列，或者，（ii）如SEQ ID NO:6所示的編碼重鏈可變區的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:8所示的編碼輕鏈可變區的核苷酸序列。 SEQ ID NO:5GAAGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCAGAACTGGTGAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGCTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCAATTGGATCAGACAGAGGCCAGGACAGGGACTCGAGTGGATTGGCAGAATCGCCCCAGGCACCATCAGCACCTACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACCATCACCGAGGATACCAGCACCAACACCGCCTACCTCCAGCTGTCTAGCCTGACAAGCGAGGACACAGCCGTGTACTTTTGCGCCAGGCAGGACAACTACTTCATCAATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACAGTGTCCAGC SEQ ID NO:6GAGTTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGTGGGCTAGTTAAACCCGGCGGCTCCTTGAAGCTGTCATGCGCTGCTTCTGGGTTTGCGTTCTCCCGCTACGACATGAGTTGGGTGCGCCAGAGCCCTGAAAAGCGCCTGGAGTGGGTCGCCACCATTAGCGATGACGGCAGACACACCTACGACAGGGATAGCGTAAAGGGTCGCTTCACCATCTCTCGTGACAACGCCAAGAACACGCTTTACCTGCAGATGTCCTCTCTGCGCTCGGAGGACACCGCGCTCTACTACTGCGTGCGACATCGCGCCATCACTACTGCACGGTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCACAGTCACCGTGTCGTCCTCCCGT SEQ ID NO:7GACATTGTTCTTACACAATCTCCGGCCAGCCTCTCTGCGAGCCTCGGGGAAAAGGTGACAATCACTTGTTCCGCATCATCAAGTATCTCCAGCTCTGACCTGCACTGGTATCAGCAGAAAAGTGGCACCAGTCCGAGGCCGTGGATCTATGGCACTAGCAATCTTGCGTCAGGAGTCCCACCCCGCTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACATCATTCAGTCTGACAATCTCTAGCGTCGAGGCGGAGGATGTCGGCACATATTACTGCCAACAGTGGTTTTCTTATCCTTTCACATTTGGTACGGGCACGAAACTGGAAATAAAA SEQ ID NO:8GGGTGCGCGGACATCGTGATGACCCAGAGTCCGTCGTCTCTGAGCGTCTCGCTCGGCGACACCGTGAGCATCACTTGTAAAGCTTCCCAGGACATCTACTCCAACATCGGTTGGCTACAACAGCTGCCCGGACAGTCCTTCAAGGGCCTGATTTACCACGGGACCAACCTGGAGGACGGCGTTCCTTCCCGCTTCAGCGGCTCCGGCTCCGGTACAGATTACTCTCTGACCATTTCTGGCCTTGAGAGCGAAGACTTTGCCGATTACTACTGCCTGCAGTACGTGCAGTTCCCCTATACCTTCGGCGGTGGCACTAAGTTGGAGATCAAGGCCTCAGGC

本發明第十四方面提供一種載體，其包含上述第十二或第十三方面所述的核酸分子。

本發明第十五方面提供如第十四方面所述的載體，其為慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體等。

本發明第十六方面提供一種細胞，其包含上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或者第十四方面或第十五方面所述的載體。

本發明第十七方面提供如第十六方面所述的細胞，其包括自體或異體的T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK-T細胞、MAIT細胞、造血幹細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、紅細胞，其中，上述T細胞包括αβT細胞、γδT細胞、調節性T細胞。

本發明第十八方面提供一種藥物組合物，其包含：選自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的載體、第十六或第十七方面所述的細胞中的任一種以上；或者，其包含：選自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的載體、第十六或第十七方面所述的細胞中的任意一種以上，以及可藥用載劑；或者，其包含：選自上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的載體、以及第十六或第十七方面所述的細胞中的任意一種以上，以及其他藥物活性試劑或藥物。

本發明第十九方面提供上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段、第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體、第十二或第十三方面所述的核酸分子、第十四或第十五方面所述的載體、或者第十六或第十七所述的細胞在製備治療或預防B7-H3陽性疾病藥物中的用途。

本發明第二十方面提供如第十九方面所述的用途，其中，上述B7-H3陽性疾病包括惡性/良性血液腫瘤、惡性/良性實體腫瘤、自身免疫病、細菌感染、病毒感染、寄生蟲感染、骨生長異常、同種異體移植、移植排斥等，所述自身免疫病包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化、乾燥症候群、以及僵直性脊椎炎等。

本發明第二十一方面提供如第二十方面所述的用途，其中，所述疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴細胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、結腸直腸癌、腎腫瘤、膀胱癌、胃腸道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宮內膜癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、甲狀腺癌、子宮癌、神經內分泌癌、頭頸癌、鼻咽癌、睪丸癌、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、皮膚纖維肉瘤突出症、梅克爾細胞癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、間皮瘤或骨髓發育不良症候群等。

本發明第二十二方面提供一種B7-H3的檢測方法，其包括：使用上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子來檢測B7-H3的步驟。

本發明第二十三方面提供一種B7-H3的檢測用試劑盒，其含有上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段或其標記物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其標記物。

本發明第二十四方面提供一種分離B7-H3陽性細胞的分離試劑盒，其含有上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段或其標記物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其標記物。

本發明第二十五方面提供一種體外增強細胞功能的方法，其包括：使細胞與上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段或其標記物、上述第八至第十一方面中任一方面所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者上述第十二或第十三方面所述的核酸分子或其標記物相接觸的步驟。

本發明第二十六方面提供上述第一至第七方面中任一方面所述抗體或抗體片段在製備用於檢測B7-H3蛋白的製品中的用途。

本發明第二十七方面提供上述第一至第七方面中任一方面所述的抗體或抗體片段在製備用於阻斷B7-H3蛋白的製品中的用途。

以下通過具體實施方式的描述並參照附圖，對本發明進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本發明所屬技術領域中具有通常知識者根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。

需要說明的是，除非另外定義，本說明書的技術用語或者科學用語應當為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的通常意義。另外，也應理解本申請書使用的用語僅是為了描述具體實施方式的目的，並不意欲是限制性的。

本說明書中的「特異性結合」意指本發明的抗原識別區不與或基本上不與目標抗原以外的任意多肽交叉反應。其特異性的程度可以通過免疫學技術來判斷，包括但不限於免疫印跡、免疫親和層析、流式細胞分析等。

本說明書中的「抗體」，指的是與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。抗體可為源於自然源或源於重組源的完整的免疫球蛋白，並可為完整免疫球蛋白的免疫反應部分。抗體通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發明中的抗體可以以多種形式存在，包括例如，Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv片段、由抗體片段形成的線性抗體、scFv抗體、ADCs偶聯抗體、多特異性抗體、單鏈抗體和人源化抗體。

本說明書中的「抗體片段」指的是完整抗體結構或序列中的一部分。

本說明書中的「重鏈」，指的是以自然發生構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。

本說明書中的「輕鏈」，指的是以自然發生構象存在於所有抗體分子的兩種類型的多肽鏈中較小的鏈。

本說明書中的「重鏈可變區（variable region of heavy chain，VH）」，指的是重鏈上靠近胺基端（N端）約110個胺基酸殘基，此段胺基酸殘基的組成和排列變化很大。

本說明書中的「輕鏈可變區（variable region of light chain，VL）」，指的是輕鏈上靠近胺基端（N端）約110個胺基酸殘基，此段胺基酸殘基的組成和排列變化很大。

本發明所述的「CDR」為互補決定區或互補決定簇，指在重鏈和輕鏈多肽的可變區內發現的非連續抗原結合位點。本發明使用Kabat編號規則對抗體可變區進行CDR和FR區域進行標註。

本說明書中的「同源性」指目標胺基序列或目標核苷酸序列與參考序列比較所顯示的胺基酸或核苷酸的高比例匹配性。本說明書中的同源性可使用標準軟體如BLAST或FASTA確定。

本說明書中，「80％以上同源性」是指同源性為80％以上，是指較佳為85％以上、更佳為88％以上、進一步較佳為90％以上、進一步更佳為93％以上、特佳為95％以上、特別更佳為98％以上、最較佳為100％的同源性。

本說明書中的「基因工程化改造的抗體或抗體片段」指的是通過基因工程化改造方式改造和修飾後的抗體或抗體片段。在本用語中提到的「基因工程化改造」，指的是利用基因拼接和DNA重組技術等方法，將不同來源的基因整合到一起並表達的技術。具體實例包括在抗體或抗體片段中插入其他蛋白或蛋白片段，或者將抗體或抗體片段的某部分替換為其他蛋白或蛋白片段，或者將不同抗體或抗體片段與其他蛋白或蛋白片段連接在一起形成一個更大的蛋白複合物。「人源化抗體」也是一種「基因工程化改造的抗體或抗體片段」，其指的是對非人源（諸如鼠源、兔源等）單克隆抗體用基因克隆以及DNA重組技術進行改造後重新表達的抗體。其特點是降低了對應鼠源抗體的免疫原性，但是保留了鼠源抗體的親和力和抗原結合的特異性。基本的實現方式是非人源抗體的恆定區部分或抗體的所有部分均採用人類抗體基因編碼。根據改造方式不同，人源化抗體包括嵌合抗體、改造型抗體和全人源化抗體等類型。

本說明書中的「恆定區」指的是抗體上靠近C端胺基酸序列相對穩定的區域。包括「輕鏈恆定區」和「重鏈恆定區」，分別指的是抗體輕鏈上靠近C端胺基酸序列相對穩定的區域和抗體重鏈上靠近C端胺基酸序列相對穩定的區域。

本說明書中的「scFv」是指這樣的抗體片段，即是包含通過接頭（linker）連接的重鏈可變區和輕鏈可變區的重組蛋白，接頭使得這兩個結構域相關聯，以最終形成抗原結合位點。scFv的大小一般是一個完整抗體的1/6。scFv較佳是由一條核苷酸鏈編碼的胺基酸序列。本發明使用的scFv可通過單獨或聯合使用本技術領域已知的常規技術，例如胺基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重組以及/或其他修飾方法作進一步修飾。根據一種抗體的胺基酸序列在其DNA序列中引入這種修飾的方法對本發明所屬技術領域中具有通常知識者來說是公知的（例如，Sambrook分子克隆：實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory（1989）N .Y.）。所述修飾較佳在核酸水平上進行。上述scFv還可以包括其衍生物。scFv能夠表達為單鏈多肽。scFv保留了其所源自的完整抗體的特異性。輕鏈和重鏈可以為任何順序，例如，VH-接頭-VL或VL-接頭-VH，只要保留scFv對靶抗原的特異性即可。在本說明書中，接頭可例舉如一段富含甘胺酸和絲胺酸的柔性接頭肽鏈。

本說明書中的「嵌合抗原受體（CAR）」是人工改造受體，能夠將識別腫瘤細胞表面抗原的特異性分子（如抗體）錨定在免疫細胞（如T細胞）上，使免疫細胞識別腫瘤抗原或病毒抗原和殺死腫瘤細胞或病毒感染的細胞。CAR通常依次包含任選的訊號肽、結合腫瘤細胞膜抗原的多肽（如單鏈抗體）、鉸鏈區、跨膜區和免疫活性細胞活化訊號轉導區，其中免疫活性細胞活化訊號轉導區又包括共刺激結構域和訊號轉導結構域。

其中，「鉸鏈區」是指介於抗原識別域和跨膜結構域之間的親水區。所述鉸鏈區可以使用各種不同抗體或抗原受體的鉸鏈區，特別是CD分子的鉸鏈區。在一個具體的實施方案中，所述鉸鏈區可以選自例如CD4、CD8α、CD28、IgG1、IgG4。在本發明的一個較佳實施方案中，採用了CD8α鉸鏈區。

其中，「跨膜區」只要包括能夠貫穿細胞膜的肽即可。較佳使用的跨膜區是CD分子的跨膜區。在一個實施方案中，所述跨膜區可以選擇例如CD4、CD8、CD28、CD3ζ、T細胞受體的α、β鏈、CD3ζ、CD3ε、CD45、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、EGFR（epidermal growth factor receptor，表皮生長因子受體）、NKG2D或GITR的跨膜區。在本發明的一個較佳實施方案中，採用了CD8α跨膜區。

其中「共刺激結構域」是指CAR增強記憶細胞的增殖、存活和/或發育的部分。本發明的CAR可包含一個或多個共刺激結構域。每個共刺激結構域包含例如以下任何一種或多種的共刺激結構域：CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD40、Myd88、HVEM、GITR、及Fc受體相關γ鏈（Fc Receptor-associated γ chain）等等。在本發明的一個較佳實施方案中，採用了CD28和4-1BB的組合。

其中「訊號轉導結構域」是指CAR轉導效應子功能訊號並指導細胞執行其特化功能的部分。轉導效應子功能訊號的結構域的示例包括但不限於CD3ζ、FcεRIγ。在本發明的一個較佳實施方案中，採用了CD3ζ結構域。

本說明書的「膜蛋白、分泌蛋白、胞內蛋白、小分子藥物、細胞毒性藥物」中，膜蛋白指的是蛋白全部或者某一部分插入在各種膜結構（包括細胞膜、粒線體膜、內質網膜、以及核膜等膜結構）中的蛋白；分泌蛋白指的是蛋白合成後，分泌到細胞外的蛋白；胞內蛋白指的是存在於細胞膜內部的所有蛋白，包括游離在細胞質中的游離蛋白，也包括各種胞內細胞器膜上的膜蛋白；小分子藥物指的是化學合成的藥物，其分子量小於1000，其可以通過連接臂和其他蛋白或者分子藥物連接在一起；細胞毒性藥物指的是對細胞或者特定細胞具有毒性作用的藥物，包括但不限於生物鹼性藥物（如紫杉醇）、代謝類藥物（如地西他濱）、抗生素類藥物（比如伊達比星）、烷化劑類藥物（如異環磷醯胺）以及鉑劑類（如順鉑）等，其也可以通過連接臂和其他蛋白或者分子藥物連接在一起。

本發明的嵌合抗原受體中，作為膜蛋白，可例舉如CD40L、CXCR5、CXCR3、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、以及NKG2D等；作為分泌蛋白，可例舉如IL2、IL15、IL4、IL7、IL10、IL18、IFNγ、 IL1β、以及抗體（如anti-PD1抗體，以及anti-CTLA4抗體等）；作為小分子藥物，可例舉如FITC及/或葉酸、雷帕黴素、Rimiducid、PROTAC化合物、以及Dasatinib等；作為細胞毒性藥物，可例舉如紫杉醇、長春瑞賓、多西他塞、羥基喜樹鹼、吉西他賓、阿糖胞苷、替加氟、甲胺蝶呤、表柔比星、吡柔比星、伊達比星、絲裂黴素、米托蒽醌、異環磷醯胺、達卡巴嗪、順鉑、以及奧沙利鉑等。

本說明書中的「核酸分子」指的是由去氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）聚合而成的生物分子化合物。其組成單元為核苷酸，核苷酸單體由五碳糖、磷酸基和含氮鹼基組成。

本說明書中的「編碼」在被應用至核酸序列時是指，「編碼」多肽的多核苷酸，以其天然狀態或者在通過本發明所屬技術領域中具有通常知識者熟知的方法操縱時，可以被轉錄和/或翻譯來產生用於該多肽和/或其片段的mRNA。

本說明書中的「載體」是指重組載體，其保留了感染和轉導不分裂和/或緩慢分裂的細胞並整合到靶細胞的基因組中的能力。在一些較佳實施方案中，所述載體衍生自或基於野生型病毒。在另一些進一步較佳的實施方案中，所述載體衍生自或基於野生型慢病毒。作為其示例，可例舉如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、單純孢疹病毒載體等。更具體而言，在本發明的一個較佳實施方案中，載體為慢病毒載體；在本發明的另一個較佳實施方案中，載體為逆轉錄病毒載體。

本說明書中的「自體或異體的」指的是「自體的細胞」或者「異體的細胞」。其中，「自體的細胞」是指源自於相同個體的細胞，該細胞隨後被重新施用到該個體；「異體的細胞」是指源自自體之外的細胞。

本發明中的細胞，可例舉如T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK-T細胞、MAIT細胞、造血幹細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、和紅細胞，其中的T細胞，可例舉如αβT細胞、γδT細胞、和調節性T細胞。在本發明的一個較佳實施方案中，採用了γδT細胞。

本發明的藥物組合物中含有本發明的抗體、CAR、核酸分子、載體、和細胞中任意一種，還可以進一步含有可藥用載劑。另外，本發明的藥物組合物也可以含有本發明的抗體、CAR、核酸分子、載體和細胞中任意兩種以上，例如，CAR和核酸分子，還可以進一步含有可藥用載劑。另外，本發明的藥物組合物也可以包含其他藥物活性試劑或藥物，如化療劑，可例舉如天冬醯胺酶、白消安（busulfan）、卡鉑（carboplatin）、順鉑、柔紅黴素（daunorubicin）、阿黴素（doxorubicin）、氟尿嘧啶、吉西他濱（gemcitabine）、羥基脲、甲胺蝶呤、紫杉醇（paclitaxel）、利妥昔單抗（rituximab）、長春鹼（vinblastine）、和長春新鹼（vincristine）等。在一個較佳的實施方案中，所述藥物組合物包含本發明的細胞。

另外，藥物組合物中的可藥用載劑可以是任何常規使用的藥學上可接受的載劑，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以根據化學-物理條件以及給藥路徑等條件，選擇合適的可藥用載劑。本說明書所述的可藥用載劑，可例舉如，運載劑（vehicle）、佐劑、賦形劑和稀釋劑等。可藥用載劑較佳是在化學上對活性試劑為惰性的載體和在使用條件下沒有有害副作用或毒性的載劑。

本說明書中的「治療或預防」指的是某種疾病發生後，通過某些手段能夠使疾病去除的方式或者通過某些手段避免疾病發生的方式。本說明書中的「治療」和「預防」不一定意味100%或完全的治療或預防。而是，有不同程度的治療或預防，本發明所屬技術領域中具有通常知識者承認其具有潛在的有利或治療效果。此外，本發明的方法提供的治療或預防可以包括治療或預防被治療或預防的疾病（例如癌症）的一種或多種病症或症狀。同樣，當用於本發明的目的時，「預防」可以包括延遲疾病或其症狀或病症的發作。

本發明的檢測用試劑盒為用於檢測B7-H3的試劑盒，在該試劑盒中，通常含有這種試劑盒中通常使用的成分、例如pH緩衝劑、穩定劑以及操作說明書、用於檢測B7-H3的說明書等附屬資料。

本發明的分離試劑盒為用於分離B7-H3陽性細胞的分離試劑盒，在該試劑盒中，通常含有這種試劑盒中通常使用的成分、例如pH緩衝劑、穩定劑以及操作說明書、用於分離B7-H3陽性細胞的說明書等附屬資料。

另外，本說明書中的「P2A切割肽」指的是一種來源於病毒的短肽（長度為18-25個胺基酸），通過被稱為「自我剪切」的肽，能使一條轉錄產物產生多種蛋白。其基本原理是通過使核糖體跳過2A原件C末端的甘胺酸和脯胺酸肽鍵的合成發揮作用，導致2A序列末端和下游產物分離。P2A多肽是其中一個多肽，其他多肽包括T2A、E2A和F2A，這4種2A肽來源於不同的病毒。

本說明書中的「截短型EGFR」簡寫為「EGFRt」，指的是截取了野生型EGFR的domain III及domain IV，該截短型EGFR無胞內訊號，不會向T細胞內傳遞其他的訊號，同時這兩個domain為西妥昔單抗的識別表位，在T細胞上表達該表位後，除了可以作為CAR-T的篩選標記之外，還同時為臨床研究增加一個安全開關。通過誘導劑（如西妥昔單抗）可以特異性結合EGFRt，借助抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用使CAR-T細胞發生凋亡，從而可以隨時清除體內的CAR-T細胞。

上文中的「抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用」，英文簡寫為ADCC，指的是抗體的Fab段結合腫瘤細胞的抗原表位，其Fc段與殺傷細胞（NK細胞、巨噬細胞等）表面的FcR結合，介導殺傷細胞直接殺傷靶細胞。

本說明書中的「柔性接頭肽鏈」是指長度為約1至100個胺基酸的寡肽或多肽區，其將本發明的CAR的任何結構域/區連接在一起。接頭可由柔性殘基（如甘胺酸和絲胺酸）組成，以便相鄰的蛋白質結構域相對於彼此自由移動，當期望確保兩個相鄰結構域在空間上不相互干擾時，可使用較長的接頭。本發明的一個較佳的實施方案中，採用了（GGGGS） ₃。

本說明書中的「轉導陽性率」指的是檢測外源基因在T細胞上的轉導比例，包括CAR在T細胞上的轉導率，體現CAR陽性T細胞占總T細胞的比例。

在本說明書中，「親和力」或「結合親和力」或「KD」通過測量平衡締合常數（ka）和平衡解離常數（kd）並計算kd與ka的商（KD=kd/ka）來確定。KD值越小說明親和力越強，KD值越大說明親和力越弱。

實驗材料與方法

1.腫瘤細胞系培養

本研究中用到六種貼壁腫瘤細胞，分別是293T、U87、HTB15、TJ905、RKO以及SKOV3細胞。其中293T細胞是人腎上皮細胞系，常被用來研究外源基因的表達以及病毒製備等。U87、HTB15、TJ905均為人腦膠質瘤細胞系，RKO為人結腸癌細胞系，SKOV3為人卵巢癌細胞系。除SKOV3之外，其他腫瘤細胞培養在DMEM完全培養基（DMEM培養基+10% FBS+1%雙抗）中。SKOV3培養在McCoy's 5a完全培養基（McCoy's 5a培養基+20% FBS+1%雙抗）中。

JurkatT細胞為人T淋巴細胞白血病細胞系，細胞培養在RPMI-1640完全培養基（RPMI-1640培養基+10% FBS+1%雙抗）中。

2.慢病毒生產

將1×10 ⁷293T細胞接種到多聚賴胺酸包被的10cm細胞培養皿中，培養基體積為10 mL。第二天將表達質粒（骨架來自pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP plasmid （Addgene, Plasmid #72263））、輔助質粒pspAx2 （Addgene, #12260） 以及輔助質粒pCMV-VSV-G （Addgene, Plasmid #8454）按照6μg、4μg、2μg的量混勻在300 μL opti-MEM培養基中，製成含有質粒的培養基；另外，在300 μL opti-MEM培養基中加入30μg PEI，充分混勻後，將該PEI溶液加入上述含有質粒的培養基中，立刻混勻，室溫靜置15 min，均勻加入至293T細胞培養皿中（此時為0 h）。8 h後，更換新的10 mL DMEM完全培養基。分別在48 h以及72 h收集培養基上清，其中48 h收集上清後再補加8 mL新鮮DMEM完全培養基。用Lenti-X™ Concentrator （Takara）對上清液進行濃縮得到病毒液，並用293T細胞對病毒液進行病毒滴度檢測。將病毒液分裝，至於-80℃條件長期保存。

3.原代細胞培養

（1）γδT細胞

準備外周血單个核細胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC），利用磷酸鹽緩衝生理鹽水（Phosphate buffered saline，PBS）進行兩次清洗。利用AO/PI細胞計數儀對細胞進行計數，活率檢測。

將PBMC細胞培養在RPMI1640培養基+10%FBS+1%雙抗+200 U/mL rhIL-2培養體系中，初始細胞密度為2×10 ⁶cells/mL。與此同時，加入5 μM唑來膦酸（ZOL）。48 h後進行一次等體積補液（不再加入ZOL），之後每隔48 h進行一次細胞密度調整（1×10 ⁶cells/mL）。

（2）αβT細胞

準備PBMC細胞，利用PBS進行兩次清洗。利用AO/PI細胞計數儀對細胞進行計數，活率檢測。

對6孔板進行抗體包被處理：將CD3、CD28抗體用opti-MEM培養基稀釋至200ng/mL，6孔板的每個孔均加入2 mL抗體稀釋液，4℃過夜或者37℃處理2h。

在臨向6孔板中加入PBMC細胞之前，將抗體稀釋液吸走，用2 mL PBS清洗一次。

之後加入PBMC，將PBMC細胞重懸在RPMI1640培養基+10%FBS+1%雙抗+200 U/mL rhIL-2培養體系中，細胞密度調整為2 ×10 ⁶cells/mL。之後每隔48 h使用RPMI1640培養基+10%FBS+1%雙抗+200 U/mL rhIL-2的培養體系進行一次細胞密度調整（調整為1×10 ⁶cells/mL）。

4.αβT細胞以及γδT細胞的病毒轉導

將1×10 ⁷TU慢病毒稀釋在200 μL PBS中，加入24孔板中。24孔板提前用RetroNectin進行包被。2000 g、32℃條件下離心2 h。離心之後，將病毒稀釋液吸走，用1 mL PBS進行清洗，共清洗3次，待加入細胞。

關於αβT細胞或γδT細胞的轉導，對體外啟動培養24 h後的αβT細胞或γδT細胞進行計數，將1×10 ⁶總細胞重懸於1 mL RPMI1640培養基+10%FBS+1%雙抗+200 U/mL rhIL-2培養體系之後，將其加入病毒處理的24孔板中。800g、32℃條件下離心10 min後置於細胞培養箱中培養。之後每隔兩到三天進行一次細胞計數，調整密度為1×10 ⁶cells/mL。

5.流式細胞染色分析

將待流式分析的細胞用PBS清洗一次。2×10 ⁵細胞用50 μL染色體系進行染色。將細胞重懸於染色體系後，置於4°C環境孵育 30 min。孵育結束後用流式緩衝液清洗兩次，用200 μL流式緩衝液重懸，進而進行上機分析。

染色體系配置為：50 μL流式緩衝液+抗體。

流式緩衝液配方為：PBS+1% FBS+2.5mM EDTA。

抗體使用量根據抗體濃度和實際情況決定，對於大多數抗體（濃度為0.5-1mg/mL）而言，1:50-1:100倍稀釋即可。

本實驗中用到的抗體主要有：anti-human CD3, anti-human αβTCR，anti-human γδTCR以及anti-human EGFR。

6.CD69表達檢測

將效應細胞與腫瘤細胞按照效靶比1:1進行孵育，在24孔板中進行孵育，加入0.5×10 ⁶效應細胞以及0.5×10 ⁶腫瘤細胞。孵育24h之後進行流式分析。

對於Jurkat T細胞，流式染色體系為：anti-human EGFR, anti-human CD69。對於αβT細胞，流式染色體系為：anti-human CD3, anti-human αβTCR, anti-human EGFR, anti-human CD69。

7.體外細胞殺傷實驗

體外細胞殺傷實驗基於Luciferase螢光檢測方法。待檢測腫瘤細胞穩定表達Luciferase螢光素酶。在24孔板中進行殺傷測試，根據實驗需求設置不同效靶比。若效靶比為1：1，則對腫瘤細胞和效應細胞分別進行計數，將兩種細胞用各自培養基重懸至0.5×10 ⁶cells/mL。在同一個孔中分別加入500 μL腫瘤細胞和500 μL效應細胞，充分混勻。另外設一個只有腫瘤細胞的對照孔，加入500 μL腫瘤細胞的培養基和500 μL培養效應細胞的培養基。置於細胞培養箱中培養，24h後檢測Luciferase螢光訊號。

殺傷效率（cytotoxicity%）= ×100%

8.B7-H3與CAR-B7-H3結合能力檢測

B7-H3與CAR-B7-H3結合能力通過流式方式進行檢測。具體方法是，將CAR-B7-H3穩定表達在Jurkat T細胞上。在100 μL流式緩衝液染色體系中，將不同濃度的biotin-B7-H3抗原（濃度範圍為0.03125 μg/mL到16 μg/mL）與1×10 ⁵CAR-B7-H3-Jurkat T細胞進行孵育，4℃孵育45 min。孵育完成後，500g離心5 min，棄上清，用500 μL流式緩衝液進行重懸後500g離心5 min，棄上清。用100 μL流式緩衝液重懸，同時加入0.5 μL螢光標記的streptavidin二抗以及0.5 μL螢光標記的anti-human EGFR抗體。4℃孵育30 min。孵育完成後，500g離心5 min，棄上清，用300 μL流式緩衝液進行重懸後，流式分析EGFR陽性群下streptavidin二抗的螢光訊號。

9.抗體親和力檢測

將B7-H3抗原蛋白配成100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.13 nM和1.56 nM梯度稀釋的7個濃度，96孔板上樣，選擇人Protein G探針，固定相為抗原，流動相為B7-H3抗體，將結合時間設定為180s，解離時間設定為300s。檢測人源單抗的結合常數及解離常數，計算親和力。

10.ELISA方法檢測B7-H3抗體與抗原的結合能力

將待檢測抗原包括B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H5用PBS均分別稀釋成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL這5個梯度濃度，將其鋪至酶標板（96孔板），每孔加入100 μL，室溫放置1 h。磷酸鹽緩衝生理鹽水加上吐溫20（Phosphate Buffered Saline with Tween 20，PBST）進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。之後分別加入0 μg/mL、2 μg/mL或4 μg/mL B7-H3抗體，用PBS稀釋，每孔加入100 μL。室溫放置1 h。用PBST洗滌三次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。用脫脂牛奶將HRP-anti-human Fc抗體以1:2000稀釋（抗體濃度為0.5mg/mL）稀釋，每孔加入100 μL，室溫放置1 h。用PBST洗滌三次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。避光加入TMB受質溶液，每孔加入100 μL，室溫避光放置40 min。每孔加入100 μL 2M硫酸終止反應，將酶標板置於酶標儀讀板，在450 nm處測OD值。

11.母本抗體阻斷實驗

於96孔酶標板加入100 μL 用PBS稀釋的10 µg/mL B7-H3蛋白，4℃過夜孵育，用PBST進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。分別加入100 μL 用PBS稀釋的0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 µg/mL的鼠源母本抗體反應1 h，用PBST進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。再加入100 μL 用PBS稀釋的2 µg/mL B7-H3抗體和2 µg/mL識別不同B7-H3抗原表位的8H9抗體進行孵育，通過ELISA進行檢測（參見實驗材料與方法第10項）。

實施例

以下具體的實施例對本發明提供的技術方案做進一步的描述，旨在僅僅示例本發明而非限制本發明的範圍

另外，實施例中的各種實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例中所用的各種試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。

實施例1：經人源化的1B4抗體親和力實驗

為了檢測人源化1B4抗體與抗原B7-H3的親和能力（人源化1B4抗體具有SEQ ID NO:1所示的重鏈可變區VH和SEQ ID NO:3所示的輕鏈可變區VL，其序列參見序列表或圖1-4）。將B7-H3抗原蛋白配成100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.13 nM和1.56 nM梯度稀釋的7個濃度，96孔板上樣，選擇人Protein G探針，固定相為抗原，流動相為1B4，將結合時間設定為180 s，解離時間設定為300 s。檢測人源單抗的結合常數及解離常數，計算親和力。

將結果示於圖5，結果顯示結合常數ka為2.81E+05，解離常數kd為7.38E-05，平衡解離常數KD為2.625E-10。

實施例2：母本抗體阻斷實驗

於96孔酶標板加入100 μL用PBS稀釋的10 µg/mL B7-H3蛋白，4℃過夜孵育，用PBST進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。分別加入100 μL 用PBS稀釋的0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 µg/mL的鼠源母本B7-H3抗體（m1B4或者m2Y31）反應1 h，用PBST進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。再加入100 μL 用PBS稀釋的2 µg/mL人源化B7-H3抗體（hu1B4或者hu2Y31）或100 μL 用PBS稀釋的2 µg/mL的識別不同B7-H3抗原表位的8H9抗體進行孵育，通過ELISA進行檢測。

將結果示於表1。

表1 母本抗體阻斷實驗結果

	OD值（450 nm）
hu1B4	8H9
m1B4	40 µg/mL	0.965	0.955	3.234	3.248
20 µg/mL	1.022	1.028	3.209	3.273
10 µg/mL	1.135	1.148	3.288	3.244
5 µg/mL	1.201	1.183	3.122	3.179
2.5 µg/mL	1.334	1.334	3.224	3.204
1.25 µg/mL	1.708	1.716	3.211	3.163
0.625 µg/mL	2.409	2.422	3.302	3.287
0 µg/mL	3.231	3.185	3.376	3.391
	OD值（450 nm）
hu2Y31	8H9
m2Y31	40 µg/mL	0.854	0.937	2.403	2.428
20 µg/mL	0.745	0.72	2.428	2.439
10 µg/mL	0.703	0.684	2.403	2.444
5 µg/mL	0.65	0.651	2.459	2.448
2.5 µg/mL	0.645	0.606	2.391	2.41
1.25 µg/mL	0.636	0.644	2.28	2.374
0.625 µg/mL	0.626	0.632	2.375	2.392
0 µg/mL	2.069	2.02	2.358	2.359

實驗顯示，無論是加入1B4還是2Y31母本抗體均能夠顯著降低對應人源化1B4或2Y31抗體與B7-H3抗原的結合能力，而對於識別不同表位的8H9抗體則沒有顯著影響。從結果可以看出，0.625 µg/mL的m1B4就可以阻斷hu1B4與抗原分子的結合，提示hu1B4和m1B4識別同一個位點。無論低濃度還是高濃度的m1B4均不能阻斷8H9與抗原分子的結合，進一步驗證1B4與8H9識別不同的位點。同樣，0.625 µg/mL的m2Y31就可以阻斷hu2Y31與抗原分子的結合，同樣提示hu2Y31和m2Y31識別同一個位點，而與8H9識別不同的位點。

實施例3：野生型U87腫瘤細胞及剔除B7-H3的U87腫瘤細胞（U87-B7-H3 CAS9）B7-H3表達水平測定

利用CRISPR-Cas9技術構建了一株剔除B7-H3的U87腫瘤細胞株。取100萬個的人膠質瘤細胞U87用PBS清洗一遍後用100 μLPBS重懸，之後按組別分別加入1μg的試劑（陰性對照為NC，陽性對照為B7-H3抗體8H9，實驗組分別為人源化1B4抗體、人源化2Y31抗體、母本鼠源1B4抗體、母本鼠源2Y31抗體），4℃孵育30 min，PBS清洗一遍，加入500 μL的PBS重懸，上機檢測其與B7-H3抗原結合能力。

除了用100萬個剔除B7-H3的U87細胞替換上述操作中的100萬個人膠質瘤細胞U87之外，其他過程進行上述同樣的操作。

將結果示於圖6，如圖6A所示，人源化1B4抗體結合膠質瘤細胞株U87細胞株的訊號（虛線峰）要顯著高於母本鼠源的1B4抗體（實線峰）。同時，將U87細胞株的B7-H3剔除之後，兩種抗體均沒有結合作用。說明1B4抗體對B7-H3抗原的特異性結合。

圖6B結果顯示，人源化2Y31抗體（hu2Y31）結合U87細胞株的訊號顯著高於母本鼠源的2Y31抗體（m2Y31），也要高於8H9抗體。所有抗體與B7-H3剔除U87腫瘤細胞均沒有結合訊號。說明2Y31抗體對B7-H3抗原具有特異性，且人源化抗體與B7-H3抗原的結合能力高於母本鼠源抗體。

實施例4：1B4抗體與B7-H3同家族其他蛋白的結合能力實驗

為了驗證1B4抗體與B7-H3蛋白結合的特異性，排除其與B7家族其他成員的結合，本專利利用ELISA方法進行了測試。將待檢測抗原包括B7-H1、B7-H3、B7-H4、B7-H5用PBS均分別稀釋成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、0.5mg/mL這5個梯度濃度，將其鋪在酶標板（96孔板），每孔加入100 μL，室溫放置1h。PBST進行洗滌兩次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。之後分別加入0 μg/mL、2 μg/mL或4 μg/mL B7-H3抗體，用PBS稀釋，每孔加入100 μL。室溫放置1h。用PBST洗滌三次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。用脫脂牛奶將HRP-anti-human Fc抗體以1:2000稀釋（抗體濃度為0.5mg/mL），每孔加入100 μL，室溫放置1 h。用PBST洗滌三次，每孔100 μL，加入後靜置5 min。避光加入TMB受質溶液，每孔加入100 μL，室溫避光放置40 min。每孔加入100 μL 2 M硫酸終止反應，將酶標板置於酶標儀讀板，在450 nm處測OD值。將結果示於表2。

表2  1B4抗體與B7-H3同家族其他蛋白的結合能力實驗結果（OD450）

	B7-H1		B7-H3		B7-H4		B7-H5
μg/mL	c=0.5mg/mL	c=2mg/mL	μg/mL	c=0.5mg/mL	c=2mg/mL	μg/mL	c=0.5mg/mL	c=2mg/mL	μg/mL	c=0.5mg/mL	c=2mg/mL
4	0.0506	0.0493	4	3.6722	3.6537	4	0.0471	0.0507	4	0.0494	0.0501
2	0.0472	0.0472	2	3.6925	3.6532	2	0.0491	0.0507	2	0.0500	0.0472
0	0.0460	0.0445	0	0.0410	0.0478	0	0.0486	0.0492	0	0.0476	0.0483
	c=1mg/mL	c=4mg/mL		c=1mg/mL	c=4mg/mL		c=1mg/mL	c=4mg/mL		c=1mg/mL	c=4mg/mL
4	0.0467	0.0490	4	3.6864	3.7618	4	0.0509	0.0481	4	0.0467	0.0481
2	0.0476	0.0487	2	3.7190	3.8095	2	0.0502	0.0477	2	0.0450	0.0431
0	0.0457	0.0400	0	0.0455	0.0467	0	0.0488	0.0485	0	0.0480	0.0451
	c=1.5mg/mL		c=1.5mg/mL		c=1.5mg/mL		c=1.5mg/mL
4	0.0414	4	3.7183	4	0.0491	4	0.0499
2	0.0462	2	3.7589	2	0.0500	2	0.0481

如表2所示，2 μg/mL的1B4抗體與0.5 mg/mL B7-H3抗原就有非常高的結合能力，其OD450值達到3.6以上，達到飽和值，進一步提高1B4抗體或 B7-H3抗原均不能進一步提高OD450值。而1B4與B7-H1、B7-H4以及B7-H5則沒有結合能力，無論是提高1B4抗體或B7-H3抗原濃度均不能提高OD450值，都處於基礎值0.04左右。說明1B4抗體與B7-H3蛋白結合具有特異性，其與B7家族其他成員沒有結合能力。

實施例5：CAR結構的構建

本實施例中用到的CAR結構為3代CAR結構，如圖7所示，具體結構為5’端為scFv序列，之後依次為CD8鉸鏈區、CD8跨膜區、CD28和4-1BB胞內共刺激結構域和CD3ζ訊號轉導結構域。其中scFv從5’端開始為抗體的重鏈可變區、GGGGS GGGGS GGGGS柔性連接多肽和抗體的輕鏈可變區。在CAR結構之後，通過一個P2A切割肽連接了一個截短型EGFR。

實施例6：表達CAR-B7-H3的Jurkat T細胞與B7-H3蛋白的結合能力的實驗

B7-H3與CAR-B7-H3結合能力通過流式方式進行檢測。具體方法是，將CAR-B7-H3穩定表達在Jurkat T細胞上。在100 μL流式緩衝液染色體系中，將不同濃度的biotin-B7-H3抗原（濃度範圍為0.03125 μg/mL到16 μg/mL）與1×10 ⁵CAR-B7-H3-Jurkat T細胞進行孵育，4℃孵育45 min。孵育完成後，500g離心5 min，棄上清，用500 μL流式緩衝液進行重懸後500 g離心5 min，棄上清。用100 μL流式緩衝液重懸，同時加入0.5 μL 螢光標記的streptavidin二抗，0.5 μL螢光標記的anti-human EGFR抗體。4℃孵育30 min。孵育完成後，500 g離心5 min，棄上清，用300 μL流式緩衝液進行重懸後，流式分析EGFR陽性群下streptavidin二抗的螢光訊號。

將結果示於圖8，從結果中看出，CAR-B7-H3（1B4）和CAR-B7-H3（2Y31）與B7-H3蛋白均有結合能力，其中CAR-B7-H3（1B4）與B7-H3的結合能力更高。

實施例7：表達CAR-B7-H3（1B4）的Jurkat T細胞的功能測定

利用基因編輯技術構建了一株B7-H3剔除的RKO腫瘤細胞株，利用1B4抗體，通過流式分析技術進行了驗證，結果如圖9所示，野生型RKO腫瘤細胞（深色峰，RKO WT）表達高水平的B7-H3，B7-H3剔除的RKO腫瘤細胞不表達B7-H3（淺色峰，RKO B7-H3 KO）。

之後進一步檢測了CAR-B7-H3的CD69訊號活化水平。將效應細胞（包括沒有表達CAR-B7-H3的JurkatT-control細胞以及表達了CAR-B7-H3的CAR-B7-H3-JurkatT細胞）與腫瘤細胞（RKO WT和RKO B7-H3 KO）按照效靶比1:1進行孵育。具體操作為在24孔板中進行孵育，加入0.5×10 ⁶效應細胞以及0.5×10 ⁶腫瘤細胞。孵育24 h之後進行流式分析。流式染色體系為：anti-human EGFR, anti-human CD69。

結果如圖10所示，可以看出，表達CAR-B7-H3（1B4）的Jurkat T （CAR-B7-H3-JurkatT）在受到野生型RKO （RKO WT）腫瘤細胞的刺激後，其CD69訊號顯著上調，而缺失B7-H3的RKO腫瘤細胞則未見CD69訊號的增強。此外，表達CAR-B7-H3（1B4）不會上調CD69的本底訊號，排除了其對T細胞的啟動毒性作用。

實施例8：表達CAR-B7-H3（1B4）的αβT細胞的CAR轉導陽性率以及功能測定

（1）CAR轉導陽性率

利用螢光標記的EGFR抗體對CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞進行標記染色，通過流式細胞儀進行檢測，結果如圖11A所示，可以看到EGFR陽性率為89.4%，也就是CAR轉導陽性率為89.4%。

（2）CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞的CD69表達水平

為了分析CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞的CD69表達水平，將效應細胞（包括沒有表達CAR-B7-H3的αβT-control細胞以及表達了CAR-B7-H3的CAR-B7-H3-αβT細胞）與腫瘤細胞（RKO WT和RKO B7-H3 KO）按照效靶比1:1進行孵育。具體操作為在24孔板中進行孵育，加入0.5×10 ⁶效應細胞以及0.5×10 ⁶腫瘤細胞。孵育24 h之後進行流式分析。流式染色體系為：anti-human CD3, anti-human αβTCR, anti-human EGFR, anti-human CD69。

結果如圖11B所示，RKO WT腫瘤細胞能夠顯著提高CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞中CD69的表達，而缺失B7-H3的RKO腫瘤細胞不影響CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞中CD69的表達。同時，αβT細胞表達CAR-B7-H3之後不會引起自身CD69本底訊號的上調。

（3）CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞對RKO腫瘤細胞的體外殺傷能力

體外細胞殺傷實驗基於Luciferase螢光檢測方法。待檢測腫瘤細胞（包括RKO WT和剔除B7-H3的RKO細胞（RKO B7-H3 KO））穩定表達Luciferase螢光素酶。在24孔板中進行殺傷測試，本實驗中設置不同效靶比，分別為0.5:1，1:1和3:1。對於效靶比0.5:1，對腫瘤細胞和效應細胞分別進行計數，將兩種細胞用各自培養基重懸，效應細胞重懸至0.25×10 ⁶細胞/mL，腫瘤細胞重懸至0.5×10 ⁶細胞/mL。對於效靶比為1：1，效應細胞和腫瘤細胞均重懸至0.5×10 ⁶細胞/mL。對於效靶比為3：1，效應細胞重懸至1.5×10 ⁶細胞/mL，腫瘤細胞重懸至0.5×10 ⁶細胞/mL。在同一個孔中分別加入500 μL腫瘤細胞和500 μL效應細胞，充分混勻。另外設一個只有腫瘤細胞的對照孔，加入500 μL腫瘤細胞的培養基和500 μL培養效應細胞的培養基。置於細胞培養箱中培養，24h後檢測Luciferase螢光訊號。

殺傷效率（cytotoxicity%）= ×100%

結果示於圖12，可以看出，相比對照組αβT細胞（αβT cell），表達CAR-B7-H3的αβT細胞對於RKO腫瘤細胞具有很好的體外殺傷效果，其殺傷能力隨著效靶比增加而逐漸升高，但是對缺失B7-H3的RKO腫瘤細胞沒有殺傷作用。由此也可以進一步驗證，CAR-B7-H3-αβT細胞對於RKO腫瘤細胞的殺傷效果是通過識別B7-H3進行的。

（4）CAR-B7-H3（1B4）-αβT細胞對膠質瘤細胞的體外殺傷能力

利用與（3）中相同的實驗方法，本專利進而檢測了表達CAR-B7-H3的αβT細胞對膠質瘤腫瘤細胞（包括HTB15和TJ905）的殺傷能力。

結果如圖13所示，可以看出，表達CAR-B7-H3的αβT細胞對膠質瘤腫瘤細胞（包括HTB15和TJ905）也有很強的殺傷效果，其殺傷能力隨著效靶比增加而逐漸升高。與之不同的是，不表達CAR-B7-H3的αβT（αβT）細胞則對這兩株膠質瘤腫瘤細胞無殺傷能力，由此也可以進一步驗證，CAR-B7-H3-αβT細胞對於兩株膠質瘤腫瘤細胞的殺傷效果是通過識別B7-H3進行的。

實施例9：表達CAR-B7-H3（1B4）的γδT細胞的CAR轉導陽性率以及功能測定

（1）CAR轉導陽性率

利用螢光標記的EGFR抗體對CAR-B7-H3（1B4）-γδT細胞進行標記染色，通過流式細胞儀進行檢測，結果示於圖14，可以看到EGFR陽性率為45.9%，也就是CAR轉導陽性率為45.9%。

（2）表達CAR-B7-H3（1B4）的CAR-αβT細胞以及CAR-γδT細胞對RKO WT腫瘤細胞的殺傷效果。

利用實施例8中（3）的實驗方法，進一步分析比較了表達CAR-B7-H3的CAR-αβT細胞以及CAR-γδT細胞對RKO WT腫瘤細胞的殺傷效果。

將結果示於圖15，可以看出，CAR-B7-H3-αβT細胞殺傷能力顯著高於未表達CAR-B7-H3的αβT細胞（如圖15A所示），CAR-B7-H3-αβT細胞對於B7-H3剔除的RKO腫瘤細胞的殺傷能力與未表達CAR-B7-H3的αβT細胞相當（如圖15B所示）；CAR-B7-H3-γδT細胞對於RKO腫瘤細胞的殺傷能力顯著高於未表達CAR-B7-H3的γδT細胞（如圖15A所示），CAR-B7-H3-γδT細胞對於B7-H3剔除的RKO腫瘤細胞的腫瘤殺傷能力與未表達CAR-B7-H3的γδT細胞相當（如圖15B所示）。這進一步驗證了，CAR-B7-H3-αβT細胞和CAR-B7-H3-γδT細胞通過識別B7-H3來增強對RKO腫瘤細胞的殺傷。

另外，也可以看出，在相同的轉導陽性率（通過在CAR-B7-H3-αβT細胞中加入不表達CAR的αβT細胞，從而將其轉導陽性率調低至與CAR- B7-H3-γδT細胞的轉導陽性率一致）和相同效靶比的條件下，CAR-B7-H3-γδT細胞對於RKO腫瘤細胞的殺傷能力要顯著高於CAR-B7-H3-αβT細胞。

而且，未表達CAR-B7-H3的γδT細胞對於RKO腫瘤細胞也有一定的殺傷能力（如圖15A所示），並且顯著高於未表達CAR-B7-H3的αβT細胞。進一步說明，γδT細胞的抗腫瘤能力高於αβT細胞。

實施例10：兩種不同抗體來源的CAR-γδT細胞的功能差異的考查

利用實施例8中（3）的實驗方法，進一步分析比較了表達CAR-B7-H3（1B4）以及CAR-B7-H3（2Y31）的γδT細胞對RKO WT腫瘤細胞的殺傷效果。

結果示於圖16，可以看出，無論是1B4還是2Y31抗體來源的scFv，CAR-B7-H3-γδT細胞均對SKOV3具有腫瘤殺傷能力，且殺傷能力顯著高於未修飾的γδT細胞。兩種不同抗體來源的CAR-B7-H3-γδT細胞對於SKOV3的殺傷能力無顯著差異。所有殺傷條件下，兩種不同抗體來源的CAR-B7-H3-γδT細胞的抗腫瘤能力均隨著效靶比的增加而增大。

實施例11：體內抗腫瘤能力實驗

本實驗採用腹腔成瘤的動物模型，每隻小鼠腹腔接種1×10 ⁶SKOV3腫瘤細胞（穩定表達Luciferase螢光素酶），其中，將1×10 ⁶SKOV3腫瘤細胞重懸於200 μL PBS中進行腹腔注射（將接種日作為接種第0天）。SKOV3腫瘤細胞接種第4天進行體重測量和腫瘤活體成像分析，根據體重和腫瘤大小資料隨機分成3組，分別為對照組、γδT細胞治療組以及CAR-B7-H3（1B4）-γδT細胞治療組。

在接種第5天進行細胞干預治療，其中，對照組每隻小鼠腹腔注射200 μL PBS，γδT細胞治療組每隻小鼠腹腔注射1×10 ⁶γδT細胞（重懸於200 μL PBS），CAR-B7-H3-γδT細胞治療組每隻小鼠腹腔注射1×10 ⁶CAR-B7-H3（1B4）-γδT細胞（重懸於200 μL PBS）。之後定期進行腫瘤活體成像分析，觀察小鼠生存情況，統計生存曲線。

對於腫瘤活體成像操作：將小鼠用異氟烷麻醉機進行麻醉，用胰島素注射器吸取100 μL luciferin受質（2mg）後注射至小鼠腹腔。10 min後，通過IVIS螢光成像儀進行成像，保存圖像，統計螢光值。

實驗結果

（1）腫瘤在小鼠體內生長情況

參考圖17及圖18可知，對於腹腔成瘤的SKOV3腫瘤模型，腹腔回輸CAR-B7-H3-γδT細胞能夠顯著抑制腫瘤的生長。未修飾的γδT細胞對腫瘤有一定抑制能力，但是效果不顯著。

（2）腫瘤模型小鼠的生存情況

參考圖19可知，對照組的荷瘤小鼠在85天左右全部死亡；γδT細胞治療組的小鼠的生存時間能夠延長10天左右，至95天；而CAR-B7-H3-γδT細胞治療組的小鼠的生存時間顯著增加，至125天時仍能夠維持80%的生存率。

無

圖1展示了1B4和2Y31抗體重鏈可變區的鹼基序列，其中，圖1A為1B4抗體重鏈可變區的鹼基序列（SEQ ID NO:5），圖1B為2Y31抗體重鏈可變區的鹼基序列（SEQ ID NO:6）。 圖2展示了1B4和2Y31抗體輕鏈可變區的鹼基序列，其中，圖2A為1B4抗體輕鏈可變區的鹼基序列（SEQ ID NO:7），圖2B為2Y31抗體輕鏈可變區的鹼基序列（SEQ ID NO:8）。 圖3展示了1B4和2Y31抗體重鏈可變區的胺基酸序列，其中，圖3A為1B4抗體重鏈可變區的胺基酸序列（SEQ ID NO:1），圖3B為2Y31抗體重鏈可變區的胺基酸序列（SEQ ID NO:2）。 圖4展示了1B4和2Y31抗體輕鏈可變區的胺基酸序列，其中，圖4A為1B4抗體輕鏈可變區的胺基酸序列（SEQ ID NO:3），圖4B為2Y31抗體輕鏈可變區的胺基酸序列（SEQ ID NO:4）。 圖5顯示了人源化1B4抗體親和力檢測結果。 圖6顯示了人源化改造後的抗體在膠質瘤細胞株U87以及 B7-H3剔除的U87細胞株上的結合結果，其中，對於圖6A來說，灰色峰代表陰性對照，實線峰代表母本鼠源抗體1B4在腫瘤細胞株上的結合，虛線峰代表人源化改造後的1B4抗體在腫瘤細胞株上的結合。對於圖6B來說，m2Y31代表母本鼠源抗體2Y31與腫瘤細胞株的結合，hu2Y31代表人源化抗體2Y31與腫瘤細胞株的結合。8H9為識別不同B7-H3抗原表位的抗體與腫瘤細胞的結合，NC為陰性對照。 圖7為CAR結構示意圖，其中，從胞外到胞內段分別是scFv（VH-（G4S）3-VL）、CD8鉸鏈區（CD8 Hinge）、跨膜區（CD8 TM）、共刺激訊號CD28和4-1BB以及CD3z訊號啟動結構域。其中，scFv包括一個重鏈的可變區和一個輕鏈的可變區，兩者之間由一個（GGGGS） ₃連接肽連接在一起。除此之外，在CAR結構區域的C端，通過P2A切割肽連接了一個截短型EGFR結構，該截短型EGFR結構可以作為CAR陽性細胞的篩選標記，同時為臨床研究增加一個安全開關。 圖8顯示了表達CAR-B7-H3的Jurkat T細胞與B7-H3蛋白的結合能力。 圖9顯示了利用1B4抗體檢測野生型結腸癌腫瘤細胞RKO（深色峰，RKO WT）表達高水平的B7-H3，而B7-H3剔除的RKO腫瘤細胞（淺色峰，RKO B7-H3 KO）不表達B7-H3。 圖10顯示了利用1B4抗體構建的CAR-Jurkat T細胞經過RKO WT或者RKO（B7-H3 KO）腫瘤細胞刺激後的CD69的表達水平。 圖11A顯示了表達CAR-B7-H3的αβT細胞的轉導陽性率（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）。 圖11B顯示了αβT細胞或者CAR-B7-H3-αβT細胞經過RKO WT或者RKO（B7-H3 KO）腫瘤細胞刺激後的CD69的表達水平。 圖12顯示了CAR-B7-H3-αβT細胞（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）對RKO腫瘤細胞的體外殺傷能力。 圖13顯示了CAR-B7-H3-αβT細胞（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）對膠質瘤細胞的體外殺傷能力。 圖14顯示了表達CAR-B7-H3的γδT細胞的轉導陽性率（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）。 圖15A顯示了表達CAR-B7-H3的CAR-αβT細胞以及CAR-γδT細胞對RKO WT腫瘤細胞的殺傷效果（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）。 圖15B顯示了表達CAR-B7-H3的CAR-αβT細胞以及CAR-γδT細胞對剔除B7-H3的RKO腫瘤細胞的殺傷效果（scFv為1B4抗體的輕鏈和重鏈序列）。 圖16顯示了表達CAR-B7-H3的CAR-γδT細胞對B7-H3陽性腫瘤細胞SKOV3的體外殺傷能力（scFv分別為1B4抗體或2Y31抗體的輕鏈和重鏈序列）。 圖17顯示了表達CAR-B7-H3的CAR-γδT細胞（scFv為1B4抗體輕鏈和重鏈序列）對SKOV3的體內抗腫瘤效果。 圖18顯示了SKOV3腫瘤在模型小鼠體內生長變化曲線。 圖19顯示了SKOV3腫瘤模型小鼠的生存曲線變化。

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Claims (27)

1. 一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL， 該重鏈可變區VH包括：如SEQ ID NO:9的胺基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:10的胺基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列VH-CDR3； 該輕鏈可變區VL包括：如SEQ ID NO:12的胺基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO:13的胺基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO:14的胺基酸序列所示的VL-CDR3。
2. 一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL， 該重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO:15的胺基酸序列所示的VH-CDR1、如SEQ ID NO:16的胺基酸序列所示的VH-CDR2和如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列VH-CDR3； 該輕鏈可變區VL包括：如SEQ ID NO:18的胺基酸序列所示的VL-CDR1，如SEQ ID NO:19的胺基酸序列所示的VL-CDR2和如SEQ ID NO:20的胺基酸序列所示的VL-CDR3。
3. 如請求項1或2所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中， 該重鏈可變區VH選自SEQ ID NO:1所示胺基酸序列、在CDR區之外與SEQ ID NO:1所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列、SEQ ID NO:2所示胺基酸序列、以及在CDR區之外與SEQ ID NO:2所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列中的任一種。
4. 如請求項1或2所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中， 該輕鏈可變區VL選自SEQ ID NO:3所示胺基酸序列、在CDR區之外與SEQ ID NO:3所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列、SEQ ID NO:4所示胺基酸序列、以及在CDR區之外與SEQ ID NO:4所示胺基酸序列具有80%以上、或85%以上、或88%以上、或90%以上、或93%以上、或95%以上、或98%以上同源性的胺基酸序列中的任一種。
5. 一種特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其包括： （i）SEQ ID NO:1所示的重鏈可變區VH和SEQ ID NO:3所示的輕鏈可變區VL，或者 （ii）SEQ ID NO:2所示的重鏈可變區VH和SEQ ID NO:4所示輕鏈可變區VL。
6. 如請求項1至5中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中，該抗體或抗體片段為基因工程化改造的抗體或抗體片段。
7. 如請求項1至6中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段，其中該抗體或抗體片段為scFv。
8. 一種嵌合抗原受體，其包含：如請求項7所述的特異性結合B7-H3的抗體或抗體片段。
9. 如請求項8所述的嵌合抗原受體，其包含：如請求項7所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、以及融合於該抗體或抗體片段的羧基末端的跨膜區。
10. 如請求項8或9所述的嵌合抗原受體，其包含：如請求項7所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、融合於該抗體或抗體片段的羧基末端的跨膜區和融合於該跨膜區的羧基末端的免疫活性細胞活化訊號轉導區。
11. 如請求項8至10中任一項所述的嵌合抗原受體，其還包含有膜蛋白、分泌蛋白、胞內蛋白、小分子藥物、以及細胞毒性藥物中的任一種或任兩種以上。
12. 一種核酸分子，其包含：編碼如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段或如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體的核苷酸序列。
13. 如請求項12所述的核酸分子，其包含： （i）如SEQ ID NO:5所示的編碼重鏈可變區的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:7所示的編碼輕鏈可變區的核苷酸序列，或者， （ii）如SEQ ID NO:6所示的編碼重鏈可變區的核苷酸序列，以及如SEQ ID NO:8所示的編碼輕鏈可變區的核苷酸序列。
14. 一種載體，其包含請求項12或13所述的核酸分子。
15. 如請求項14所述的載體，其為慢病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。
16. 一種細胞，其包含如請求項12或13所述的核酸分子或者如請求項14或15所述的載體。
17. 如請求項16所述的細胞，其包括自體或異體的T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK-T細胞、MAIT細胞、造血幹細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、紅細胞，該T細胞包括αβT細胞、γδT細胞、以及調節性T細胞。
18. 一種藥物組合物， 其包含：選自如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體、如請求項12或13所述的核酸分子、如請求項14或15所述的載體、或如請求項16或17所述的細胞中的任意一種以上，或者， 其包含：選自如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體、如請求項12或13所述的核酸分子、如請求項14或15所述的載體、或如請求項16或17所述的細胞中的任意一種以上，以及可藥用載劑，或者， 其包含：選自如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體、如請求項12或13所述的核酸分子、如請求項14或15所述的載體、或如請求項16或17所述的細胞中的任意一種以上，以及其他藥物活性試劑或藥物。
19. 一種如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體、如請求項12或13所述的核酸分子、如請求項14或15所述的載體、或者如請求項16或17所述的細胞在製備治療或預防B7-H3陽性疾病的藥物中的用途。
20. 如請求項19所述的用途，其中所述B7-H3陽性疾病包括惡性/良性血液腫瘤、惡性/良性實體腫瘤、自身免疫病、細菌感染、病毒感染、寄生蟲感染、骨生長異常、同種異體移植、移植排斥，所述自身免疫病包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化、乾燥症候群、以及僵直性脊椎炎。
21. 如請求項20所述的用途，其中所述B7-H3陽性疾病包括急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、急性淋巴細胞白血病、非霍金性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、結腸直腸癌、腎腫瘤、膀胱癌、胃腸道癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、子宮內膜癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、甲狀腺癌、子宮癌、神經內分泌癌、頭頸癌、鼻咽癌、睪丸癌、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、皮膚纖維肉瘤突出症、梅克爾細胞癌、膠質母細胞瘤、神經膠質瘤、肉瘤、以及間皮瘤或骨髓發育不良症候群。
22. 一種B7-H3的檢測方法，其包括：使用如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體、或者如請求項12或13所述的核酸分子，來檢測B7-H3的步驟。
23. 一種B7-H3的檢測用試劑盒，其含有如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段或其標記物、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者如請求項12或13所述的核酸分子或其標記物。
24. 一種分離B7-H3陽性細胞的分離試劑盒，其含有如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段或其標記物、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者如請求項12或13所述的核酸分子或其標記物。
25. 一種體外增強細胞功能的方法，其包括：使細胞與如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段或其標記物、如請求項8至11中任一項所述的嵌合抗原受體或其標記物、或者如請求項12或13所述的核酸分子或其標記物，相接觸的步驟。
26. 一種如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段在製備用於檢測B7-H3蛋白的製品中的用途。
27. 一種如請求項1至7中任一項所述的特異性結合B7-H3的分離的抗體或抗體片段在製備用於阻斷B7-H3蛋白的製品中的用途。