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CN118845780A - 10-羟基喜树碱在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用 - Google Patents

10-羟基喜树碱在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用 Download PDF

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CN118845780A
CN118845780A CN202410906530.6A CN202410906530A CN118845780A CN 118845780 A CN118845780 A CN 118845780A CN 202410906530 A CN202410906530 A CN 202410906530A CN 118845780 A CN118845780 A CN 118845780A
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CN
China
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cells
hydroxycamptothecin
γδt
γδt cells
application
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CN202410906530.6A
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English (en)
Inventor
林坚
张子健
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Hainan University
Original Assignee
Hainan University
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Publication date
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    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
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Abstract

本发明公开了10‑羟基喜树碱在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用。本申请首次发现并验证了10‑羟基喜树碱可抑制γδT细胞的耗竭，增强γδT细胞的抗肿瘤功能，将10‑羟基喜树碱与γδT细胞治疗产品联合应用，可显著促进γδT细胞杀伤癌细胞如B细胞急性淋巴白血病细胞的功效。

Description

10-羟基喜树碱在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamptothecin)在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用。
背景技术
急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种淋巴前体细胞在其分化的不成熟阶段受阻导致恶性增殖而形成的血液肿瘤。ALL可以发生在淋巴细胞的T细胞或B细胞前体中，从而分为T-ALL或B-ALL；其中B-ALL约占ALL的绝大多数，严重威胁人类生存健康。并且临床特点及预后的异质性较大，使得其治疗效果差，急需探索新的有效临床治疗方案。
T细胞是癌症治疗的重要工具。大多数T细胞研究和临床应用都以αβT细胞(约占T细胞群体的70％)为主，但占所有T细胞0.5％～5％的γδT也在癌症免疫中发挥着重要作用。γδT细胞是免疫系统的天然监视细胞，在人体中不断巡逻，识别并靶向肿瘤细胞。γδT细胞还发挥着桥接先天免疫系统和适应性免疫系统的作用，独立于MHC的方式识别其靶细胞，从而减少同种异体反应和移植物抗宿主病的风险，是优质的异体现货型细胞产品的来源，在癌症治疗中具有巨大的潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了10-羟基喜树碱在增强γδT细胞抗肿瘤功能中的应用。
本发明为实现技术目的采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供了10-羟基喜树碱作为γδT细胞增强剂的应用。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞的抗肿瘤功能。
第二方面，本发明提供了10-羟基喜树碱在制备用于γδT细胞治疗的辅助剂中的应用。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞的抗肿瘤功能。
第三方面，本发明提供了10-羟基喜树碱联合γδT细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
在一些实施例中，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞杀伤癌细胞的能力。所述癌细胞包括但不限于B细胞急性淋巴白血病细胞。
在一些实施例中，所述γδT细胞主要包括原代γ9δ2T细胞和基于该细胞改造的细胞治疗产品。
本发明的有益效果在于：
本申请首次发现并验证了10-羟基喜树碱可抑制γδT细胞的耗竭，增强γδT细胞的抗肿瘤功能，将10-羟基喜树碱与γδT细胞治疗产品联合应用，可显著促进γδT细胞杀伤癌细胞如B细胞急性淋巴白血病细胞的功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表示10-羟基喜树碱可抑制γδT细胞耗竭。
图2表示10-羟基喜树碱可促进γδT细胞对B-ALL白血病细胞的杀伤。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
10-羟基喜树碱(10-Hydroxycamptothecin)，是一种从喜树中分离的DNA 拓扑异构酶I(DNA topoisomerase I)抑制剂，可显着诱导细胞凋亡，并可用于肝癌，胃癌，结肠癌和白血病的研究。本申请首次发现并验证了10-羟基喜树碱可增强γδT细胞的抗肿瘤功能。
实施例一10-羟基喜树碱抑制γδT细胞的耗竭
1.体外共孵育
(1)Raji-luci细胞培养：由10％的胎牛血清和1％P/S的培养基RPMI 1640在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天传代1次。
(2)计数取γδT细胞分到六孔板中，每孔2×106个细胞，2mL培养基。
(3)计数Raji-Luci细胞分入六孔板中，每孔2×105个细胞，1mL培养基，和γδT混匀；
(4)向上述孔中加入10-羟基喜树碱0.5μL，工作浓度为500nM，对照组加入等体积的DMSO。放入细胞培养箱共孵育24小时。
2.细胞孵育抗体
(1)细胞清洗液的配制：1×PBS中加入1％的FBS即为细胞清洗液，4℃保存可使用一周。
(2)取2×105个待测细胞，300g，离心3分钟，小心弃上清，用1mL细胞清洗液重悬细胞后分两管，每管50μL，每管加入1μL FITC anti-human PD1Antibod和AF700 anti humanCD7，4℃孵育30分钟。
(3)孵育结束后300g，离心3分钟，小心弃上清，用1mL细胞清洗液重悬细胞，300g，离心3分钟，小心弃上清，用300μL细胞清洗液重悬细胞。
(4)使用流式细胞仪检测FITC、PE和AF700。
(5)最后，通过分析CD7阳性细胞的PD-1和Tim-3的信号强度，表明γδT的耗竭水平。
如图1所示，加入10-Hydroxycamptothecin可使得γδT细胞的PD-1和TIM-3的表达量降低(向左偏移)，这表明10-Hydroxycamptothecin可抑制γδT的耗竭水平。
实施例二10-羟基喜树碱促进γδT杀伤癌细胞
对照组和实验组设计如下：
对照组(DMSO组)：传代培养的Raji-luci细胞(每孔5000个细胞，200μL培养基)中加入0.5μL DMSO；
γδT组：传代培养的Raji-luci细胞(每孔5000个细胞，100μL培养基)中加入γδT细胞(每孔20000个细胞，100μL培养基)，加入0.5μL DMSO；
10-Hydroxycamptothecin组：传代培养的Raji-luci细胞(每孔5000个细胞，100μL培养基)中加入0.5μL 10-Hydroxycamptothecin(工作浓度500nM)；
γδT+10-Hydroxycamptothecin组：传代培养的Raji-luci细胞(每孔5000个细胞，100μL培养基)中加入γδT细胞(每孔20000个细胞，100μL培养基)及0.5μL 10-Hydroxycamptothecin，工作浓度500nM。
具体步骤如下：
(1)Raji-luci细胞培养：由10％的胎牛血清和1％P/S的培养基RPMI 1640在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天传代1次，细胞使用时应控制在10代以内。
(2)计数取γδT细胞分到96孔U底板中，每孔20000个细胞，100μL培养基。
(3)计数Raji-Luci细胞分入96孔U底板中，每孔5000个细胞，100μL培养基，和γδT混匀。
(4)向上述孔中加入10-Hydroxycamptothecin使其工作浓度为500nM，非加药组加入等体积的DMSO。
(5)放入细胞培养箱共孵育24小时。
(6)加入荧光素钠盐5μL，放入培养箱孵育10min。
(7)使用酶标仪读取Luciferace荧光强度。
(8)通过计算与DMSO对照组的荧光强度比例得到Raji-Luci的存活细胞百分比，使用1减去存活细胞百分比即可得到特异性杀伤百分比(Specific Lysis％)。
如图2所示，γδT加10-Hydroxycamptothecin杀伤靶细胞能力明显大于单独的γδT组和单独的10-Hydroxycamptothecin组，这提示10-Hydroxycamptothecin可以增强γδT的杀伤能力。

Claims (10)

1.10-羟基喜树碱作为γδT细胞增强剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞的抗肿瘤功能。
4.10-羟基喜树碱在制备用于γδT细胞治疗的辅助剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞的抗肿瘤功能。
7.10-羟基喜树碱联合γδT细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够抑制γδT细胞的耗竭。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，10-羟基喜树碱能够增强γδT细胞杀伤癌细胞的能力。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述γδT细胞包括原代γ9δ2T细胞和基于该细胞改造的细胞治疗产品。
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