TW202434289A

TW202434289A - 具有酵素可切割基團之抗體藥物結合物(a2dcs)

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Publication number: TW202434289A
Application number: TW112144384A
Authority: TW
Inventors: 漢斯喬治里爾契; 路德維希貝翠克絲史特爾特; 安蘇菲萊布斯托克; 莎拉安娜莉耶莎裘漢尼斯; 珊卓拉伯恩特; 安妮特索莫; 克里斯托夫馬勒特; 西蒙尼格雷文; 烏爾斯海格曼
Original assignee: 德商拜耳廠股份有限公司
Priority date: 2022-11-17
Filing date: 2023-11-16
Publication date: 2024-09-01
Also published as: WO2024105205A1

Abstract

本申請案係關於抗體-2-藥物結合物(A2DC)、醫藥組合物、其製備方法及其用於治療、預防或控制人類及其他哺乳動物之包括過度增生性病症(諸如癌症)之疾病及病況的用途，該抗體-2-藥物結合物包含複數種視情況具有不同滲透性概況之紡錘體驅動蛋白抑制劑有效負載(payload)，在腫瘤微環境內可具有有利有效負載釋放特性。

Description

具有酵素可切割基團之抗體藥物結合物(A2DCS)

本申請案係關於抗體藥物結合物、醫藥組合物、其製備方法及其用於治療、預防或控制人類及其他哺乳動物之包括過度增生性病症(諸如癌症)之疾病及病況的用途。

在一個態樣中，本文提供一種式(I)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (I) 其中：AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)；X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-；L ¹及L ²各自獨立地為穩定連接子；R ^A為第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；R ^B為第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；其中R ^A及R ^B為不相同之基團；且a及b各自獨立地為1至50之整數。

在另一態樣中，本文提供一種式(II)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (II) 其中：AK ²為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體；L ³為穩定連接子；R ^C及R ^D各自獨立地為蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；且z為1至50之整數。

在另一態樣中，本文提供一種式(III)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (III) 其中：AK ³為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體或其抗原結合片段；L ⁴為穩定連接子；KSP ⁵為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑；P ⁵為蛋白酶可切割連接子；KSP ⁶為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑；且y為1至50之整數。

在一些實施例中，本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上適合之惰性無毒助劑。

在一些實施例中，本文提供一種用於治療或預防疾病之方法，該方法包含向有需要之患者投與本文所描述之抗體藥物結合物。

在一些實施例中，本文提供一種治療或預防過度增生性或血管生成性病症的方法，該方法包含向有需要之患者投與本文所描述之抗體藥物結合物。

以引用之方式併入

本說明書中所提及之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同各個別出版物、專利或專利申請案經具體且個別地指示以引用之方式併入一般。在以引用之方式併入之出版物及專利或專利申請案與本說明書中所含之揭示內容相矛盾之情況下，本說明書旨在替代及/或優先於任何此類相矛盾之材料。 交互參考

本申請案主張2022年11月17日申請之歐洲專利申請案第EP22306697.8號的權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，其在此以XML格式提交且特此以全文引用之方式併入。2023年11月15日創建之XML複本命名為59362-724.601 SL.xml且大小為151千位元組。背景

抗體藥物結合物(ADC)為一類新興藥物，其利用抗體改良細胞毒性或免疫腫瘤學有效負載對腫瘤細胞之靶向。在大多數情況下，在ADC內化至癌細胞中時會形成活性代謝物，其中藉由連接子之酵素切割或藉由抗體降解形成活性代謝物。同時的12種ADC之批准證實ADC改良癌症治療之潛力。

藥物抗體比(DAR)表徵連接至抗體之有效負載之數目。較高DAR通常會引起更高效有效負載遞送，因此可產生較高ADC效力。然而，歸因於大部分有效負載類別之高疏水性，DAR之增加通常導致ADC之物理化學特性不良。結果為ADC對於聚集體形成之敏感性增加，非腫瘤細胞中之較高非特異性吸收程度導致較強副作用，以及ADC之清除率較高且PK參數不良。

克服此等傾向之一種方法為採用高度親水性且多價之聚合物產生具有高藥物負載量而不會損害物理化學及藥物動力學特性之ADC (例如A. V. Yurkovetskiy in Cancer Research (2015), 75(16), 3365-3372)，但是其會對ADC增加另一層複雜性。

取決於待治療之腫瘤的ADC效能之另一關鍵態樣在於所釋放之有效負載之物理化學概況。

細胞可滲透有效負載之釋放可與旁觀者毒殺效應相關，認為該效應尤其有益於治療具有非均質目標表現之腫瘤(J. A. Costoplus, ACS Med Chem Lett, 2019, 10, 1393)。另一方面，此細胞可滲透代謝物概況可歸因於所釋放有效負載之再分佈或過早有效負載切割(其均會引起健康細胞損傷)而增加副作用。

相比之下，不可滲透有效負載之釋放可引起腫瘤細胞內部之活性藥物的細胞內留存及積聚，此對於效力可具有有益影響。同時，此概況可增加ADC之安全性，因為所釋放不可滲透有效負載不會誘發健康細胞損傷。然而，此類代謝物設計無法實現所釋放有效負載之任何旁觀者毒殺。因此，可能有益的是，組合由腫瘤相關蛋白酶釋放之兩種代謝物概況而以良好安全性實現最佳ADC效能。

紡錘體驅動蛋白(KSP，同義詞：Eg5、KIF11)為一種ATP依賴性馬達蛋白，參與細胞週期之G2/M期中中心體之分離(S. M. Myers等人, Fut. Med. Chem. 2016, 8, 463)。用小分子KSP抑制劑(KSPis)阻斷有絲分裂中之此必要事件產生高抗腫瘤效力，引起對此化合物類別之極大關注(H. B. El-Nassan, Eur. J. Med. Chem. 2013, 62, 614)。然而，將SMOL KSP抑制劑之臨床前效力轉化成具有可接受治療範圍之高效臨床方案仍然具有挑戰性。僅處於細胞週期之G2M期的增生細胞對於小分子KSP抑制劑(SMOL KSPi)敏感。因此，想要奏效，SMOL KSPi可能需要頻繁給藥，其通常導致諸如嗜中性球減少症之劑量限制性副作用。

近期，已將紡錘體驅動蛋白(KSP)之抑制劑描述為ADC中之一種新穎且高效的有效負載類別(H.-G. Lerchen, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 15243；WO2015/096982)。此等KSPi有效負載分子提供與可切割或不可切割連接化學物質相容的有效負載連接物之各種選項。

豆莢蛋白(legumain)為過度表現於實體腫瘤中之天冬醯胺醯基肽鏈內切酶，其與侵襲、轉移及不良存活率相關(Dall, E.及Brandstetter, H. (2016) Biochimie 2016, 22, 126−50)。

在WO2016/207089、WO2017/162663、WO2018/114798及WO2018/114578中，主張保護不同ADC，其由腫瘤相關蛋白酶豆莢蛋白活化以釋放活性KSPi有效負載。經切割KSPi有效負載之概況可針對不同物理化學特性經修改及調試，以實現不同程度之膜滲透性而不會破壞KSP目標之抑制。本發明之詳細描述

上文所描述之SMOL KSPi及尤其在專利申請案WO2015/096982、WO2016/207089、WO2017/162663、WO2018/114798及WO2018/114578中描述為ADC有效負載之彼等SMOL KSPi的概況允許高效抗體-2-藥物結合物(A2DC)之新穎設計。

本發明之抗體-2-藥物結合物係以式(I)、式(I')、式(II)、式(II')及式(III)描述： (I) (I') (II) (II') (III) 其中：各KSP (例如KSP ¹、KSP ²、KSP ³、KSP ⁴、KSP ⁵及KSP ⁶)為紡錘體驅動蛋白抑制劑；各R (例如R ^A、R ^B、R ^C及R ^D)獨立地為蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；各P (例如P ¹、P ²、P ³、P ⁴及P ⁵)為蛋白酶可切割連接子；各L (例如L ¹、L ²、L ³及L ⁴)為不可切割連接子；各AK (例如AK ¹、AK ²及AK ³)為抗體或其抗原結合片段，其中該抗體可為單株抗體或其片段； X ¹及X ²各自獨立地為氮或硫；且各a、b、y及z為1與50之間的整數。

在一些實施例中，化合物為式(I)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (I) 其中：AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)；X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-；L ¹及L ²各自獨立地為穩定連接子；R ^A為第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；R ^B為第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；其中R ^A及R ^B為不相同之基團；且a及b各自獨立地為1至50之整數。

在一些實施例中，R ^A為式(i)之第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑：(i) KSPi ¹-P ¹- ^#；其中KSPi ¹為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑，P ¹為第一蛋白酶可切割連接子；且 ^#為R ^A與L ¹之鍵；且R ^B為式(ii)第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑：(ii) ^##-P ²-KSPi ²；其中 ^##為L ²與R ^B之鍵；P ²為第二蛋白酶可切割連接子；KSPi ²為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑，且其中R ^A及R ^B為不相同之基團。

在一些實施例中，式(I)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽具有式(I')之結構： (I') 其中：AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)；X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-；L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、、、或， P ¹為第一蛋白酶可切割連接子；P ²為第二蛋白酶可切割連接子； KSPi ¹為：； KSPi ²為：； R ¹及R ⁶各自獨立地為鹵素；R ²及R ⁷各自獨立地為C _1-6烷基；m及n各自獨立地為1至5之整數；且a及b各自獨立地為1至50之整數。

在一些實施例中，P ¹為第一蛋白酶可切割連接子。在一些實施例中，P ²為第二蛋白酶可切割連接子。在一些實施例中，P ¹及P ²各自獨立地為組織蛋白酶或豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ¹及P ²各自獨立地為豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ¹及P ²各自獨立地為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-，(2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為式(I)化合物，其中：AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)；X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-； L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、、、或； R ^A為：； R ^B為：；其中：R ¹及R ⁶各自獨立地為鹵素；R ²及R ⁷各自獨立地為C _1-6烷基；R ³及R ⁸各自獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH；R ⁴、R ⁵、R ⁹及R ¹⁰各自獨立地為氫或C _1-6烷基；a及b各自獨立地為1至50之整數；m及n各自獨立地為1至5之整數；且p、q、r及s各自獨立地為0、1、2、3或4。

在一些實施例中，AK ¹為抗EGFR、抗Her2、抗TWEAKR、抗CD123或抗CXCR5。在一些實施例中，AK ¹為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。

在一些實施例中，X ¹及X ²各自為-NH-。在一些實施例中，X ¹及X ²各自為-S-。在一些實施例中，X ¹為-NH-且X ²為-S-。在一些實施例中，X ¹為-S-且X ²為-NH-。

在一些實施例中，L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、或。

在一些實施例中，L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、 , 或。

在一些實施例中，L ¹及L ²各自獨立地為：或。

在一些實施例中，各R ¹獨立地為鹵素。在一些實施例中，各R ¹為氯、氟或溴。在一些實施例中，各R ¹獨立地為氯或氟。在一些實施例中，各R ¹獨立地為氟。

在一些實施例中，各R ²獨立地為C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ²獨立地為C _3-6烷基。在一些實施例中，各R ²獨立地為正丙基、異丙基、正丁基、三級丁基或異丁基。在一些實施例中，各R ²獨立地為-C(CH ₃) ₃。

在一些實施例中，各R ³獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ³獨立地為C _1-3烷基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ³獨立地為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ³獨立地為甲基。在一些實施例中，各R ³獨立地為-CH ₂COOH。

在一些實施例中，各自R ⁴獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ⁴獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ⁴獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ⁴獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ⁴為氫。在一些實施例中，各R ⁴為甲基。

在一些實施例中，各R ⁵獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ⁵獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ⁵獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ⁵獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ⁵為氫。在一些實施例中，各R ⁵為甲基。

在一些實施例中，各R ⁶獨立地為鹵素。在一些實施例中，各R ⁶為氯、氟或溴。在一些實施例中，各R ⁶獨立地為氯或氟。在一些實施例中，各R ⁶獨立地為氟。

在一些實施例中，各R ⁷獨立地為C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ⁷獨立地為C _3-6烷基。在一些實施例中，各R ⁷獨立地為正丙基、異丙基、正丁基、三級丁基或異丁基。在一些實施例中，各R ⁷獨立地為-C(CH ₃) ₃。

在一些實施例中，各R ⁸獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ⁸獨立地為C _1-3烷基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ⁸獨立地為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ⁸獨立地為甲基。在一些實施例中，各R ⁸獨立地為-CH ₂COOH。

在一些實施例中，各R ⁹獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ⁹獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ⁹獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ⁹獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ⁹為氫。在一些實施例中，各R ⁹為甲基。

在一些實施例中，各R ¹⁰獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹⁰獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ¹⁰獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ¹⁰獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ¹⁰為氫。在一些實施例中，各R ¹⁰為甲基。

在一些實施例中，a及b各自獨立地為1至50之整數。在一些實施例中，a為1至25之整數。在一些實施例中，a為1至20之整數。在一些實施例中，a為1至15之整數。在一些實施例中，a為1至10之整數。在一些實施例中，a為1至5之整數。在一些實施例中，b為1至25之整數。在一些實施例中，b為1至20之整數。在一些實施例中，b為1至15之整數。在一些實施例中，b為1至10之整數。在一些實施例中，b為1至5之整數。

在一些實施例中，m為1至5之整數。在一些實施例中，m為1至4之整數。在一些實施例中，m為1至3之整數。在一些實施例中，m為1或2。在一些實施例中，m為2。在一些實施例中，m為1。

在一些實施例中，n為1至5之整數。在一些實施例中，n為1至4之整數。在一些實施例中，n為1至3之整數。在一些實施例中，n為1或2。在一些實施例中，n為2。在一些實施例中，n為1。

在一些實施例中，p為0、1、2、3或4。在一些實施例中，p為0、1、2或3。在一些實施例中，p為0、1或2。在一些實施例中，p為0或1。在一些實施例中，p為0。在一些實施例中，p為1。在一些實施例中，p為2。在一些實施例中，p為3。

在一些實施例中，q為0、1、2、3或4。在一些實施例中，q為0、1、2或3。在一些實施例中，q為0、1或2。在一些實施例中，q為0或1。在一些實施例中，q為0。在一些實施例中，q為1。在一些實施例中，q為2。在一些實施例中，q為3。

在一些實施例中，r為0、1、2、3或4。在一些實施例中，r為0、1、2或3。在一些實施例中，r為0、1或2。在一些實施例中，r為0或1。在一些實施例中，r為0。在一些實施例中，r為1。在一些實施例中，r為2。在一些實施例中，r為3。

在一些實施例中，s為0、1、2、3或4。在一些實施例中，s為0、1、2或3。在一些實施例中，s為0、1或2。在一些實施例中，s為0或1。在一些實施例中，s為0。在一些實施例中，s為1。在一些實施例中，s為2。在一些實施例中，s為3。

在一些實施例中，R ^A-L ¹-X ¹-片段為：或。

在一些實施例中，-X ²-L ²-R ^B片段為：或。

在一些實施例中，式(I)之抗體藥物結合物具有式(IA)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IA)。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為：、、、、或。

在一些實施例中，式(I)之抗體藥物結合物具有式(IB)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IB)。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為：或。

式(I)之抗體藥物結合物具有式(IC)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IC)。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為：、、或。

在一些實施例中，化合物為式(II)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (II) 其中：AK ²為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體；L ³為穩定連接子；R ^C及R ^D各自獨立地為蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；且z為1至50之整數。

在一些實施例中，式(II)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽具有式(II')之結構： (II') 其中：AK ²為經由半胱胺酸之硫原子連接、經由離胺酸之氮原子連接或經由其組合連接的抗體；L ³為穩定連接子；P ³及P ⁴各自獨立地為蛋白酶可切割連接子；KSPi ³及KSPi ⁴各自獨立地為紡錘體驅動蛋白抑制劑；且z為1與50之間的整數。

在一些實施例中，KSPi ³及KSPi ⁴各自獨立地為：或；其中：各R ¹¹為鹵素；且n為1至5之整數。

在一些實施例中，P ³及P ⁴各自獨立地為蛋白酶可切割連接子。在一些實施例中，P ³及P ⁴各自獨立地為組織蛋白酶或豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ³及P ⁴各自獨立地為豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ³及P ⁴各自獨立地為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-，(2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。

在一些實施例中，抗體結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ^C為； R ^D為或；其中：各R ¹¹為鹵素；各R ¹²為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-CONH ₂；各R ¹³為C _1-6烷基；各R ¹⁴為氫或C _1-6烷基；各R ¹⁵為氫或C _1-6烷基；各R ¹⁶為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH；各R ¹⁷為氫或C _1-6烷基；n為1至5之整數；且r、s及t各自獨立地為0、1、2、3或4。

在一些實施例中，AK ²為抗EGFR、抗Her2、抗TWEAKR、抗CD123或抗CXCR5。在一些實施例中，AK ²為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。

在一些實施例中，L ³為：、、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，各R ¹¹獨立地為鹵素。在一些實施例中，各R ¹¹為氯、氟或溴。在一些實施例中，各R ¹¹獨立地為氯或氟。在一些實施例中，各R ¹¹獨立地為氟。

在一些實施例中，各R ¹²獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹²獨立地為C _1-3烷基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹²獨立地為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹²獨立地為甲基。在一些實施例中，各R ¹²獨立地為-CH ₂COOH。

在一些實施例中，各R ¹³獨立地為C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹³獨立地為C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ¹³獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基。在一些實施例中，各R ¹³獨立地為甲基、正丙基或異丙基。在一些實施例中，各R ¹³為甲基。在一些實施例中，各R ¹³為異丙基。

在一些實施例中，各R ¹⁴獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹⁴獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ¹⁴獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ¹⁴獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ¹⁴為氫。在一些實施例中，各R ¹⁴為甲基。

在一些實施例中，各R ¹⁵獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹⁵獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ¹⁵獨立地為氫、甲基、乙基或丙基。在一些實施例中，各R ¹⁵獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ¹⁵獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ¹⁵為氫。在一些實施例中，各R ¹⁵為甲基。

在一些實施例中，各R ¹⁶獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶獨立地為C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹⁶為-C _1-6伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶為-C _1-5伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶為-C _1-4伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶獨立地為-C _1-3伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶為-C _1-2伸烷基-COOH。在一些實施例中，各R ¹⁶為-CH ₂COOH。

在一些實施例中，各R ¹⁷獨立地為氫或C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ¹⁷獨立地為氫或C _1-3烷基。在一些實施例中，各R ¹⁷獨立地為氫、甲基、乙基或丙基。在一些實施例中，各R ¹⁷獨立地為氫、甲基或乙基。在一些實施例中，各R ¹⁷獨立地為氫或甲基。在一些實施例中，各R ¹⁷為氫。在一些實施例中，各R ¹⁷為甲基。

在一些實施例中，t為0、1、2、3或4。在一些實施例中，t為0、1、2或3。在一些實施例中，t為0、1或2。在一些實施例中，t為0或1。在一些實施例中，t為0。在一些實施例中，t為1。在一些實施例中，t為2。在一些實施例中，t為3。

在一些實施例中，R ^C為：、、或。

在一些實施例中，R ^D為：、、、、、或。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為：、、、、、、、、、、、、、、或。

在一些實施例中，化合物為式(III)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (III) 其中：AK ³為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體或其抗原結合片段；L ⁴為穩定連接子；KSP ⁵為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑；P ⁵為蛋白酶可切割連接子；KSP ⁶為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑；且y為1至50之整數。

在一些實施例中，L ⁴為經取代或未經取代之C _1-60烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至60員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁴具有以下結構：或；其中#AK ³表示L ⁴與AK ³之鍵；且#表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為式(III)化合物，其中：KSPi ⁵為具有以下結構之第一紡錘體驅動蛋白抑制劑：； KSPi ⁶為具有以下結構之第二紡錘體驅動蛋白抑制劑：、或；其中：#表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵；##表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵；###表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵；各R ²¹獨立地為鹵素；各R ²²獨立地為C _1-6烷基；且n為1至5之整數。

在一些實施例中，P ⁵為蛋白酶可切割連接子。在一些實施例中，P ⁵為組織蛋白酶或豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ⁵為豆莢蛋白可切割連接子。在一些實施例中，P ⁵為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-，(2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。

在一些實施例中，P ⁵為具有以下結構之豆莢蛋白可切割連接子： -P ^5a-L ⁵-P ^5b- 其中：P ^5a及P ^5b各自獨立地為蛋白酶可切割連接子；且L ⁵為穩定連接子。

在一些實施例中，P ^5a及P ^5b各自獨立地為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-，(2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。

在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-60烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至60員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-50烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至50員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-40烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至40員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-30烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至30員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-20烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至20員雜烷基連接子。在一些實施例中，L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-10烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至10員雜烷基連接子。

在一些實施例中，P ⁵為具有以下結構之豆莢蛋白可切割連接子：、、、或。

在一些實施例中，AK ³為抗EGFR、抗Her2、抗TWEAKR、抗CD123或抗CXCR5。在一些實施例中，AK ³為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。

在一些實施例中，各R ²¹獨立地為鹵素。在一些實施例中，各R ²¹為氯、氟或溴。在一些實施例中，各R ²¹獨立地為氯或氟。在一些實施例中，各R ²¹獨立地為氟。

在一些實施例中，各R ²²獨立地為C _1-6烷基。在一些實施例中，各R ²²獨立地為C _1-4烷基。在一些實施例中，各R ²²獨立地為正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。在一些實施例中，各R ²²獨立地為三級丁基。

在一些實施例中，y為1至50之整數。在一些實施例中，y為1至25之整數。在一些實施例中，y為1至20之整數。在一些實施例中，y為1至15之整數。在一些實施例中，y為1至10之整數。在一些實施例中，y為1至6之整數。在一些實施例中，y為2至6之整數。

在一些實施例中，KSPi ⁵為：；且 KSPi ⁶為或；其中：#表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵；##表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵；且###表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵。

在一些實施例中，KSPi ⁵為：；且 KSPi ⁶為：或；其中：#表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵；##表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵；且###表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵。

在一些實施例中，抗體藥物結合物為：、、、、、、、、、、、、或。

本發明之抗體-2-藥物結合物係根據WO2016/207089、WO2017/162663、WO2018/114798中所描述之描述內容，藉由將2種不同有效負載連接子前驅物連續偶合至相同抗體，且單獨應用兩次而獲得。本發明之所得A2DC包含兩個皆連接至離胺酸殘基的不同有效負載連接子，或兩個皆連接至半胱胺酸殘基的不同有效負載連接子，或一個連接至離胺酸殘基之有效負載連接子及另一連接至半胱胺酸殘基之有效負載連接子。適合於有效負載連接子連接的半胱胺酸殘基可藉由還原鏈間二硫橋鍵或藉由工程改造半胱胺酸殘基至抗體中而獲得。

具有靶向多種目標之不同抗體的本發明A2DC組合不同有效負載特徵，從而產生有利概況： – 克服增加DAR而不會遭遇聚集體形成之巨大挑戰，尤其歸因於極性及親水性KSPi有效負載。 – 不可滲透有效負載通常歸因於腫瘤細胞中之細胞內積聚而增加效力，當腫瘤細胞顯示均質目標表現時，在活體內尤其有益。當兩種不可滲透KSPi有效負載連接至抗體，產生增加之DAR時，實現極高之效力。 – 可滲透有效負載呈現旁觀者效應，當腫瘤顯示非均質目標表現時尤其重要。 – 本發明之A2DC組合正面特徵，提供針對具有寬泛目標表現概況變化性之不同細胞有效且經顯示與處理不同目標之抗體相容的A2DC。

為了進一步改良A2DC及其代謝物之腫瘤選擇性，抗體結合物具備肽衍生物，其可由腫瘤相關酵素，諸如豆莢蛋白或組織蛋白酶釋放。因此，腫瘤選擇性不僅由選擇抗體決定，而且亦由肽衍生物之酵素切割(例如藉由腫瘤相關酵素豆莢蛋白)決定。

根據本發明，肽衍生物可存在於將抗體連接至KSP抑制劑的連接子中。此等抗體結合物為根據本發明之抗體-2-藥物結合物(A2DC)。

根據本發明使用之紡錘體驅動蛋白抑制劑具有該作用所必需之胺基。藉由用肽衍生物修飾此胺基，阻斷關於紡錘體驅動蛋白之作用且因此亦抑制細胞毒性效應之產生。然而，若此肽殘基可由腫瘤相關酵素(諸如豆莢蛋白)釋放，則可在腫瘤組織中以受控方式再建該效應。在此情況下，胺基之修飾並非連接子之部分。因此，本發明係關於具有紡錘體驅動蛋白抑制劑之非活性前驅物分子的結合子結合物，該等非活性前驅物分子僅在腫瘤中藉助於腫瘤相關溶酶體肽鏈內切酶豆莢蛋白處理以得到活性代謝物，因此能夠在腫瘤中以受控方式再次呈現其細胞毒性活性。具有KSP抑制劑，其中其自由胺基相應地經阻斷的結合子結合物亦根據本發明稱為APDC。APDC尤佳。

本發明之抗體-2-藥物結合物具有能夠釋放兩種活性代謝物的酵素可切割肽序列P ³及P ⁴，該等活性代謝物可根據所需物理化學概況以靈活方式定製。在式(II')之A2DC中，抗體連接係經由分支連接子L ³實現，而在式(III)之A2DC中，抗體連接係經由連接至KSPi ⁵之不可切割連接子L ⁴實現。 (II') (III)

A2DC可以多種方式連接至抗體，經由化學或酵素連接方案，較佳經由離胺酸殘基或經由半胱胺酸殘基。適合於有效負載連接子連接的半胱胺酸殘基可藉由還原鏈間二硫橋鍵或藉由工程改造半胱胺酸殘基至抗體中而獲得。

具有靶向多種目標之不同抗體的本發明A2DC組合不同有效負載特徵，從而產生有利概況： – 克服增加DAR而不會遭遇聚集體形成之巨大挑戰，尤其藉由利用極性及親水性KSPi有效負載及連接子組合物。 – 不可滲透有效負載通常歸因於腫瘤細胞中之細胞內積聚而增加效力，當腫瘤細胞顯示均質目標表現時，在活體內尤其有益。當兩種不可滲透KSPi有效負載連接至抗體，產生增加之DAR時，實現極高之效力。 – 可滲透有效負載呈現旁觀者效應，當腫瘤顯示非均質目標表現時尤其重要。 – 本發明之A2DC組合正面特徵，提供針對具有寬泛目標表現概況變化性之不同細胞有效的A2DC。顯示此A2DC與處理不同目標之抗體相容。

在本發明之一特定實施例中，兩種代謝物之釋放皆由腫瘤相關蛋白酶豆莢蛋白切割連接子而介導。或者，A2DC亦可經設計以由其他蛋白酶(諸如組織蛋白酶)或由醣苷酶(諸如ß-葡萄糖醛酸苷酶)介導有效負載釋放。

在一較佳實施例中，目標分子為選擇性癌症目標分子。在一尤佳實施例中，目標分子為蛋白質。在一個實施例中，目標分子為細胞外目標分子。在一較佳實施例中，細胞外目標分子為蛋白質。癌症目標分子為熟習此項技術者已知。下文列舉此等分子之實例。

癌症目標分子之實例為： (1) EGF受體(NCBI參考序列NP_005219.2)，SEQ ID NO: 213 (1210個胺基酸)。 (2)間皮素(SwissProt參考Q13421-3)，SEQ ID NO: 214 (622個胺基酸)。 (3) Her2 (NCBI參考序列NP_004439.2)，SEQ ID NO: 218 (4) TWEAKR (SEQ ID NO: 169蛋白)；SEQ ID NO: 170 (DNA) (5) CXC趨化介素受體CXCR5 (CD185；Gene ID 643)(SwissProt: P32302) (6)表面受體IL3RA (CD123；Gene ID: 3561)

在一些實施例中，本發明之抗體可為任何適合抗體。在一些實施例中，抗體包括但不限於GUCY2C (鳥苷酸環化酶C)、ROR1、HER3、FGFR4、EGFR/PD-L1雙特異性抗體及B7H4。

多株抗體可藉由一般熟習此項技術者已知之方法製備。單株抗體可藉由一般熟習此項技術者已知的方法製備(Köhler及Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975)。人類及人源化單株抗體可藉由一般熟習此項技術者已知的方法製備(Olsson等人, Meth Enzymol. 92, 3-16或Cabilly等人之美國專利第4,816,567號或Boss等人之美國專利第4,816,397號)。

一般熟習此項技術者瞭解用於製備人類抗體及其片段的多種方法，諸如藉助於轉殖基因小鼠(N Lonberg及D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93)或噬菌體呈現技術(Clackson等人, Nature. 1991年8月15日; 352(6336):624-8)。本發明之抗體可自重組抗體庫獲得，該重組抗體庫係由例如自許多健康志願者彙集之多種抗體之胺基酸序列組成。抗體亦可藉助於已知之重組DNA技術產生。抗體之核酸序列可藉由常規定序獲得或獲自公開可獲得之資料庫。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段(AK)包含下表中所示之抗體或抗體區(例如CDR，可變域)：

SEQ ID NO.	描述	序列
1	TPP-981 VH	QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQSPGKGLEWLGV IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT YYDYEFAYWG QGTLVTVSA
2	TPP-981 HCDR1	NYGVH
3	TPP-981 HCDR2	VIWSGGNTDY NTPFTS
4	TPP-981 HCDR3	ALTYYDYEFA Y
5	TPP-981 VL	DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA GTKLELK
6	TPP-981 LCDR1	RASQSIGTNI H
7	TPP-981 LCDR2	YASESIS
8	TPP-981 LCDR3	QQNNNWPTT
9	TPP-981 IgG HC	QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQSPGKGLEWLGV IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT YYDYEFAYWG QGTLVTVSAA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
10	TPP-981 IgG LC	DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TNIHWYQQRT NGSPRLLIKY ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA GTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
11	TPP-1015 VH	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
12	TPP-1015 HCDR1	DTYIH
13	TPP-1015 HCDR2	RIYPTNGYTR YADSVKG
14	TPP-1015 HCDR3	WGGDGFYAMD Y
15	TPP-1015 VL	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK
16	TPP-1015 LCDR1	RASQDVNTAV A
17	TPP-1015 LCDR2	SASFLYS
18	TPP-1015 LCDR3	QQHYTTPPT
19	TPP-1015 IgG HC	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
20	TPP-1015 IgG LC	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
31	TPP-2658 VH	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMIWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGSTHY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGGDTYFDYFDYW GQGTLVTVSS A
32	TPP-2658 HCDR1	PYPMI
33	TPP-2658 HCDR2	YISPSGGSTH YADSVKG
34	TPP-2658 HCDR3	GGDTYFDYFD Y
35	TPP-2658 VL	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS GYLNWYQQKP GKAPKLLIYQ ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYTSPFITFG QGTKVEIK
36	TPP-2658 LCDR1	RASQSISGYL N
37	TPP-2658 LCDR2	QASSLQS
38	TPP-2658 LCDR3	QQSYTSPFIT
39	TPP-2658 IgG HC	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMIWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGSTHY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGGDTYFDYFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYA STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
40	TPP-2658 IgG LC	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS GYLNWYQQKP GKAPKLLIYQ ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYTSPFITFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
61	TPP-7007 VH	QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFIIAWVKQA PGQGLEWIGE IYPGTGRTYY SEKFRGKATL TADTSTSTAY MELSSLRSED TAVYFCARRT IYYDYDGDYW GQGTLVTVSS
62	TPP-7007 HCDR1	DFIIA
63	TPP-7007 HCDR2	EIYPGTGRTY YSEKFRG
64	TPP-7007 HCDR3	RTIYYDYDGD Y
65	TPP-7007 VL	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAHNLELP WTFGQGTKVE IK
66	TPP-7007 LCDR1	RSSKSLLHSN GITYLY
67	TPP-7007 LCDR2	QMSNLAS
68	TPP-7007 LCDR3	AHNLELPWT
69	TPP-7007 IgG HC	QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DFIIAWVKQA PGQGLEWIGE IYPGTGRTYY SEKFRGKATL TADTSTSTAY MELSSLRSED TAVYFCARRT IYYDYDGDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
70	TPP-7007 IgG LC	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSKSLL HSNGITYLYW YLQKPGQSPQ LLIYQMSNLA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAHNLELP WTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
71	TPP-2090 VH	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMIWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGSTHY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG DTYFDYFDYW GQGTLVTVSS
72	TPP-2090 HCDR1	PYPMI
73	TPP-2090 HCDR2	YISPSGGSTH YADSVKG
74	TPP-2090 HCDR3	GGDTYFDYFD Y
75	TPP-2090 VL	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS GYLNWYQQKP GKAPKLLIYQ ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYTSPFITFG QGTKVEIK
76	TPP-2090 LCDR1	RASQSISGYL N
77	TPP-2090 LCDR2	QASSLQS
78	TPP-2090 LCDR3	QQSYTSPFIT
79	TPP-2090 IgG HC	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMIWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGSTHY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG DTYFDYFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
80	TPP-2090 IgG LC	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS GYLNWYQQKP GKAPKLLIYQ ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYTSPFITFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
81	TPP-170 VH	QVELVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYWIGWVRQA PGKGLEWMGI IDPGDSRTRY SPSFQGQVTI SADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSS
82	TPP-170 HCDR1	SYWIG
83	TPP-170 HCDR2	IIDPGDSRTR YSPSFQG
84	TPP-170 HCDR3	GQLYGGTYMD G
85	TPP-170 VL	DIALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTSSDIG GYNSVSWYQQHPGKAPKLMI YGVNNRPSGV SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC SSYDIESATP VFGGGTKLTV L
86	TPP-170 LCDR1	TGTSSDIGGY NSVS
87	TPP-170 LCDR2	GVNNRPS
88	TPP-170 LCDR3	SSYDIESATP V
89	TPP-170 IgG HC	QVELVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT SYWIGWVRQA PGKGLEWMGI IDPGDSRTRY SPSFQGQVTI SADKSISTAYLQWSSLKASD TAMYYCARGQLYGGTYMDGWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
90	TPP-170 IgG LC	DIALTQPASV SGSPGQSITI SCTGTSSDIG GYNSVSWYQQHPGKAPKLMI YGVNNRPSGV SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYYC SSYDIESATP VFGGGTKLTV LGQPKAAPSV TLFPPSSEEL QANKATLVCL ISDFYPGAVT VAWKGDSSPV KAGVETTTPS KQSNNKYAAS SYLSLTPEQW KSHRSYSCQV THEGSTVEKT VAPTECS
91	TPP-9476 VH	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV SCKASGGTFS DYYMKWVRQAPGQGLEWMGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTITADESTSTAY MELSSLRSEDTAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS
92	TPP-9476 HCDR1	DYYMK
93	TPP-9476 HCDR2	DIIPSNGATF YNQKFKG
94	TPP-9476 HCDR3	SHLLRASWFA Y
95	TPP-9476 VL	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCESSQSVL NSGNQKNYLTWYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIK
96	TPP-9476 LCDR1	ESSQSVLNSG NQKNYLT
97	TPP-9476 LCDR2	WASTRES
98	TPP-9476 LCDR3	QNDYSYPYT
99	TPP-9476 IgG HC	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV SCKASGGTFS DYYMKWVRQAPGQGLEWMGD IIPSNGATFY NQKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSED TAVYYCARSH LLRASWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
100	TPP-9476 IgG LC	DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCESSQSVL NSGNQKNYLTWYQQKPGQPP KLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
101	TPP-9574 VH	EVQLVESGGG LIQPGGSLRL SCAASGFTFS TSGMHWFRQAPGKGLEWVAY ISSSSGFVYA DAVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARSEA AFWGQGTLVT VSS
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110	TPP-9574 IgG LC	DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSQKSRL SRMGITPLNW YLQKPGQSPQ LLIYRMSNLA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCAQFLEYP PTFGQGTKLE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
111	TPP-6013 VH	QVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCSVTDYSIT SGYYWNWIRQFPGNKLEWMG YISYDGSNNY NPSLKNRISI TRDTSKNQFF LKLSSVTTED TATYYCSRGE GFYFDSWGQG TTLTVSS
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120	TPP-6013 IgG LC	DIMMSQSPSS LAVSVGEKFT MTCKSSQSLF FGSTQKNYLA WYQQKPGQSP KLLIYWASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLA ISSVMPEDLA VYYCQQYYNY PWTFGGGTKL EIKRTVAAPS VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 2中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 6中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 7中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 8中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 12中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 13中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 14中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 16中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 17中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 18中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 36中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 37中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 38中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 62中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 63中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 64中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 66中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 67中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 68中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 72中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 73中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 74中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 76中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 77中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 78中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 82中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 83中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 84中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 86中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 87中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 88中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 92中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 93中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 94中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 96中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 97中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 98中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 102中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 103中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 104中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 106中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 107中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 108中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 112中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；b)包含SEQ ID NO: 113中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；c)包含SEQ ID NO: 114中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；d)包含SEQ ID NO: 116中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；e)包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或f)包含SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 1至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 5至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 9至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 10至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 9中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 11至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 15至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 11中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 15中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 19至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 20至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 19中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 20中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 31至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 35至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 39至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 40至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 39中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 40中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 61至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 65至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 61中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 65中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 69至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 70至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 69中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 70中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 71至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 75至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 71中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 75中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 79至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 80至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 79中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 80中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 81至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 85至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 81中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 85中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 89至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 90至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 89中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 90中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 91至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 95至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 91中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 95中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 99至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 100至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 99中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 100中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 101至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 105至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 101中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 105中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 109至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 110至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 109中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 110中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 111至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含與SEQ ID NO: 115至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 111中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或b)包含SEQ ID NO: 115中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區。

在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含與SEQ ID NO: 119至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含與SEQ ID NO: 120至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含：a)包含SEQ ID NO: 119中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或b)包含SEQ ID NO: 120中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。

術語「一致性」係指兩種或更多種多肽分子或兩種或更多種核酸分子之序列之間的關係，藉由比對及比較該等序列所測定。相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或MEGALIGN (DNAStar, Inc.)軟體。熟習此項技術者可測定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。定義

除非另有定義，否則本文所使用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學術語意欲具有與一般熟習所主張主題所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，為了清楚及/或便於參考，本文定義具有通常所理解之含義的術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般理解之內容存在實質性差異。

在整個本申請案中，各種實施例可以範圍格式呈現。應理解，範圍格式中的描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明之範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定地揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之個別數值。舉例而言，諸如1至6之範圍之描述應視為已特定地揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍以及該範圍內之個別數字，例如1、2、3、4、5及6。不管範圍之廣度如何，此均適用。

如本說明書及申請專利範圍中所用，除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個參考物。舉例而言，術語「一樣本」包括複數個樣本，包括其混合物。

術語「測定」、「量測」、「評估」、「評定」、「檢定」及「分析」通常可在本文中互換使用以指量測之形式。該等術語包括測定要素是否存在(例如偵測)。此等術語可包括定量、定性或定量及定性測定。評定可為相對或絕對的。「偵測…之存在」可視上下文而定，包括除測定某物是否存在之外，測定其存在之量。

術語「受試者」、「個體」或「患者」通常在本文中互換使用。「受試者」可為含有所表現遺傳物質之生物性實體。生物性實體可為植物、動物或微生物，包括例如細菌、病毒、真菌及原蟲。受試者可為活體內獲得或活體外培養之生物性實體的組織、細胞及其後代。受試者可為哺乳動物。哺乳動物可為人類。受試者可經診斷或疑似處於疾病之高風險下。在一些情況下，受試者未必經診斷或疑似處於疾病之高風險下。

如本文所用，術語「約」某數字係指該數字加或減該數字之15%。術語「約」某範圍係指該範圍減其最低值之15%及加其最大值之15%。

如本文所用，術語「治療(treatment或treating)」在提及醫藥方案或用於在接受者中獲得有益或所要結果之其他干預方案時使用。有益或所需結果包括但不限於治療益處及/或預防益處。治療益處可指所治療之症狀或基礎病症的根除或改善。此外，治療益處亦可藉由根除或改善與基礎病症相關之生理學症狀中之一或多者，使得儘管受試者仍可能罹患基礎病症，但在受試者中觀測到改善來實現。預防作用包括延遲、預防或消除疾病或病況之出現；延遲或消除疾病或病況之症狀的發作；減緩、阻止或逆轉疾病或病況之進展；或其任何組合。對於預防益處，處於罹患特定疾病風險下之受試者或報導疾病之生理學症狀中之一或多者的受試者可進行治療，即使可能尚未診斷出此疾病。

癌症為大部分多樣化組織之細胞生長不可控的結果。在許多情況下，新細胞滲透至現有組織中(侵襲性生長)，或其轉移至遠端器官中。癌症出現於多種不同器官中且往往具有組織特異性過程。因此，術語「癌症」作為通用術語係描述不同器官、組織及細胞類型之一大類經定義之疾病。

術語「癌症目標分子」描述存在於一或多個癌細胞物種上的豐度大於存在於相同組織類型之非癌細胞上的豐度的目標分子。較佳地，相較於相同組織類型之非癌細胞，癌症目標分子選擇性地存在於一或多個癌細胞物種上，其中選擇性地描述癌細胞上之富集為相同組織類型之非癌細胞的至少兩倍(「選擇性癌症目標分子」)。癌症目標分子之使用允許使用根據本發明之結合物選擇性治療癌細胞。

在最廣泛意義上，「目標分子」應理解為意謂存在於目標細胞群體中且可為蛋白質(例如生長因子之受體)或非肽分子(例如糖或磷脂)的分子。其較佳地為受體或抗原。

術語「細胞外」目標分子描述連接至細胞的位於細胞外的目標分子，或位於細胞外的目標分子之部分，亦即可在完整細胞上結合於其細胞外目標分子的結合子。細胞外目標分子可錨定於細胞膜中或作為細胞膜之組分。熟習此項技術者瞭解用於鑑別細胞外目標分子的方法。對於蛋白質，此可藉由測定跨膜域及蛋白質在膜中之定向來進行。此等資料通常寄存於蛋白質資料庫(例如SwissProt)中。

根據本發明，術語「抗體」以其最廣泛含義理解且包含免疫球蛋白分子，例如完整或經修飾之單株抗體、多株抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。免疫球蛋白分子較佳包含具有四條多肽鏈的分子：兩條重鏈(H鏈)及兩條輕鏈(L鏈)，其通常藉由二硫橋鍵連接。各重鏈包含重鏈可變域(縮寫為VH)及重鏈恆定域。重鏈恆定域可例如包含三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含可變域(縮寫為VL)及恆定域。輕鏈恆定域包含一域(縮寫為CL)。VH及VL域可進一步細分成具有高變性之區域，亦稱為互補決定區(縮寫為CDR)，及具有低序列可變性之區域(構架區，縮寫為FR)。通常，各VH及VL區域係由三個CDR及至多四個FR組成。舉例而言，自胺基端至羧基端依以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可獲自任何適合物種，例如兔、駱馬、駱駝、小鼠或大鼠。在一個實施例中，抗體屬於人類或鼠類來源。抗體可為例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

術語「單株」抗體係指自實質上均質抗體群體獲得之抗體，亦即該群體之個別抗體除天然存在之可能少數突變之外其他一致。單株抗體以高特異性識別單一抗原結合位點。術語單株抗體並非係指特定製備方法。

視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，抗體可歸類成不同類別。存在五種主要類別的完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干種可分成其他子類。(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之重鏈恆定域稱為[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]及[my/μ]。抗體之三維結構與次單元結構均已知。

術語「完整」抗體係指包含抗原結合域與輕鏈及重鏈恆定域的抗體。恆定域可為天然存在之域或其具有多個經修飾胺基酸位置之變異體，且亦可經醣基化。

術語「經修飾之完整」抗體係指胺基端或羧基端藉助於共價鍵(例如肽鍵)與不來源於抗體之另一多肽或蛋白質融合的完整抗體。此外，抗體可經修飾，使得反應性半胱胺酸在限定位置引入以促進與發毒團偶合(參見Junutula等人, Nat Biotechnol. 2008年8月; 26(8):925-32)。

「胺基酸修飾」或「突變」在本文意謂多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失。本文中之較佳胺基酸修飾為取代。「胺基酸取代」或「取代」在本文意謂將蛋白質序列中之給定位置處的胺基酸更換成另一胺基酸。舉例而言，取代Y50W描述位置50處之酪胺酸經更換成色胺酸的親本多肽之變異體。多肽之「變異體」描述具有與參考多肽(通常原生或「親本」多肽)實質上一致之胺基酸序列的多肽。多肽變異體可在原生胺基酸序列中之特定位置處具有一或多個胺基酸更換、缺失及/或插入。

術語「人類」抗體係指可自人類獲得之抗體或作為合成人類抗體之抗體。「合成」人類抗體為基於人類抗體序列之分析，可經由電腦模擬而部分地或完全地自合成序列獲得的抗體。人類抗體可由例如自人類來源之抗體序列庫分離的核酸編碼。此類抗體之實例可見於Soderlind等人, Nature Biotech. 2000, 18:853-856中。此類「人類」及「合成」抗體亦包括已藉由經PNGaseF去醣基化或藉由使重鏈之N297 (Kabat編號)突變成任何其他胺基酸而產生的無醣基化變異體。

術語「人源化」或「嵌合」抗體描述由序列之非人類及人類部分組成的抗體。在此等抗體中，人類免疫球蛋白(受體)之一部分序列經非人類免疫球蛋白(供體)之序列部分置換。在許多情況下，供體為鼠類免疫球蛋白。在人源化抗體的情況下，受體CDR胺基酸經供體胺基酸置換。有時，構架胺基酸亦經供體之對應胺基酸置換。在一些情況下，人源化抗體含有既不存在於受體中、亦不存在於供體中的胺基酸，該等胺基酸係在抗體最佳化期間引入。在嵌合抗體的情況下，供體免疫球蛋白之可變域與人類抗體之恆定區融合。此類「人源化」及「嵌合」抗體亦包括已藉由經PNGaseF去醣基化或藉由使重鏈之N297 (Kabat編號)突變成任何其他胺基酸而產生的無醣基化變異體。

如本文所用之術語「互補決定區(CDR)」係指結合於抗原所需的抗體可變域之彼等胺基酸。通常，各可變區具有三個CDR區，稱為CDR1、CDR2及CDR3。各CDR區可含有根據Kabat定義之胺基酸及/或根據Chotia定義之高變環胺基酸。根據Kabat之定義包含例如可變輕鏈/域(VL)之約胺基酸位置24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)之區以及可變重鏈/域(VH)之約胺基酸位置31-35 (CDR1)、50-65 (CDR2)及95-102 (CDR3)之區(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。根據Chotia之定義包含例如可變輕鏈(VL)之約胺基酸位置26-32 (CDR1)、50-52 (CDR2)及91-96(CDR3)之區以及可變重鏈(VH)之約胺基酸位置26-32 (CDR1)、53-55 (CDR2)及96-101 (CDR3)之區(Chothia及Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987))。在一些情況下，CDR可包含來自根據Kabat及Chotia定義之CDR區的胺基酸。

術語抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」定義為抗體/免疫球蛋白之片段(例如IgG之可變域)，其仍然包含抗體/免疫球蛋白之抗原結合域。抗體之「抗原結合域」通常包含抗體之一或多個高變區，例如CDR、CDR2及/或CDR3區。然而，抗體之「構架」或「骨架」區在抗體結合於抗原期間亦可起作用。構架區形成CDR之骨架。較佳地，抗原結合域至少包含可變輕鏈之胺基酸4至103及可變重鏈之胺基酸5至109，更佳包含可變輕鏈之胺基酸3至107及可變重鏈之胺基酸4至111，尤佳包含完整可變輕鏈及重鏈，亦即VL之胺基酸1至109及VH之胺基酸1至113 (根據WO97/08320編號)。

本發明之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」非定論性地含有Fab、Fab′、F(ab')2及Fv片段、雙功能抗體(diabody)、單域抗體(DAb)、線性抗體、個別抗體鏈(單鏈Fv，縮寫為scFv)；以及多特異性抗體，諸如由例如抗體片段形成之二特異性及三特異性抗體，C. A. K Borrebaeck編(1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press；R. Kontermann及S. Duebel編(2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag。除「多特異性」或「多功能性」抗體之外的抗體為具有相同結合位點的彼等抗體。多特異性抗體可對抗原之不同抗原決定基具有特異性或可對超過一種抗原之抗原決定基具有特異性(參見例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人, 1991, J. Immunol. 14760 69；美國專利第4,474,893號、第4,714,681號、第4,925,648號、第5,573,920號、第5,601,819號；或Kostelny等人, 1992, J. Immunol. 148 1547 1553)。F(ab')2或Fab分子可構築成使得Ch1與CL域之間的分子間二硫鍵相互作用之數目可減少或完全阻止。

「抗原決定基」係指能夠特異性結合於免疫球蛋白或T細胞受體之蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈或其組合)組成，且通常具有特定的3維結構特性以及特定電荷特性。

「功能片段」或「抗原結合抗體片段」可藉助於共價鍵(例如肽鍵)，經由其胺基端或羧基端與不來源於抗體之另一多肽或蛋白質融合。此外，抗體及抗原結合片段可藉由在限定位置引入反應性半胱胺酸來修飾，以便有助於與發毒團偶合(參見Junutula等人, Nat Biotechnol. 2008年8月; 26(8):925-32)。

「經分離」抗體或結合子已純化以移除細胞之其他成分。可干擾診斷或治療用途之細胞之污染成分為例如酵素、激素或細胞之其他肽或非肽成分。較佳抗體或結合子為已純化者，相對於抗體或結合子，其純化程度大於95重量%(例如藉由洛瑞法(Lowry method)、UV-Vis光譜法或藉由SDS毛細管凝膠電泳所測定)。此外，抗體已純化至可測定胺基端或內部胺基酸序列之至少15個胺基酸之程度或已純化至均質的程度，均質性藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下測定(可藉助於庫馬斯藍染色(Coomassie Blue staining)或較佳藉由銀著色確定偵測)。然而，抗體通常藉由一或多個純化步驟製備。

術語「特異性結合」或「特異性地結合」係指結合於預定抗原/目標分子的抗體或結合子。抗體或結合子的特異性結合通常描述具有至少10 ⁻ ⁷M之親和力(以Kd值形式；亦即其較佳具有小於10 ⁻ ⁷M之Kd值)的抗體或結合子，該抗體或結合子對預定抗原/目標分子的親和力為非特異性抗原/目標分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)的至少兩倍，該非特異性抗原/目標分子不為預定抗原/目標分子或緊密相關的抗原/目標分子。抗體或結合子之特異性結合不排除抗體或結合子與複數種抗原/目標分子(例如不同物種之異種同源物)的結合。抗體較佳具有至少10 ^-7M之親和力(以Kd值形式；換而言之，其較佳具有小於10 ^-7M之Kd值)，較佳至少10 ^-9M、更佳在10 ^-9M至10 ^-11M範圍內之親和力。Kd值可例如藉助於表面電漿子共振光譜法測定。

烷基為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈飽和單價烴基(C ₁-C ₁₀烷基)，一般具有1至6個碳原子(C ₁-C ₆烷基)，較佳1至4個碳原子(C ₁-C ₄烷基)且更佳1至3各碳原子(C ₁-C ₃烷基)。

較佳實例包括：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、二級丁基、三級丁基、異戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基及1,2-二甲基丁基。

雜烷基為具有1至10個碳原子且可一次或超過一次間雜有以下基團中之一或多者的直鏈及/或分支鏈烴鏈：-O-、-S-、-C(═O)-、-S(═O)-、-S(═O) ₂-、-NR ^y-、-NR ^yC(═O)-、-C(═O)-NR ^y-、-NR ^yNR ^y-、-S(═O)2-NR ^yNR ^y-、-C(═O)-NR ^yNR ^y-、-CR ^x═N-O-，且其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NH-C(═O)-NH ₂、-C(═O)-OH、-OH、-NH ₂、-NH-C(═NNH ₂)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。

在此上下文中，R ^y在各情況下為-H、苯基、C ₁-C ₁₀烷基、C ₂-C ₁₀烯基或C ₂-C ₁₀炔基，其又可在各情況下經-NH-C(═O)-NH ₂、-C(═O)-OH、-OH、-NH ₂、-NH-C(═NNH ₂)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。

在此上下文中，R ^x為-H、C ₁-C ₃烷基或苯基。

烯基為具有一個或兩個雙鍵及2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C ₂-C ₁₀烯基)，尤其2或3個碳原子(C ₂-C ₃烯基)之直鏈或分支鏈單價烴鏈，其中如將顯而易見的，當烯基含有超過一個雙鍵時，雙鍵可彼此分離或彼此結合。烯基為例如乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙-2-烯-1-基(或「烯丙基」)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或「異丙烯基」)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-異丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-異丙基丙-2-烯基、1-異丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-異丙基丙-1-烯基、1-異丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、戊-1,4-二烯基或己-1,5-二烯基。更特定言之，該基團為乙烯基或烯丙基。

炔基為具有一個參鍵且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C ₂-C ₁₀炔基)，尤其2或3個碳原子(C ₂-C ₃炔基)之直鏈或分支鏈單價烴鏈。C ₂-C ₆炔基為例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-異丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。更特定言之，炔基為乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。

本文所用之部分標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所描述之主題。實例

以下說明性實例代表本文所描述之刺激、系統及方法之實施例且不意謂以任何方式限制。第I部分：式I化合物及合成抗體 -2- 藥物結合物 (A2DC) 之製備及表徵 B-1. 用於表現抗體之通用方法

如Tom等人, Methods Express: Expression Systems之第12章，Micheal R. Dyson及Yves Durocher編, Scion Publishing Ltd, 2007所描述，將編碼所用抗體(例如TPP-981、TPP-1015、TPP-7007、TPP-2658、TPP-2090、TPP-9476及TPP-9574)之蛋白質序列(胺基酸序列)的DNA序列插入至短暫表現載體中。 B-2 用於在哺乳動物細胞中表現抗體之通用方法

如Tom等人, Methods Express: Expression Systems之第12章，Micheal R. Dyson及Yves Durocher編, Scion Publishing Ltd, 2007所描述，在暫時哺乳動物細胞培養物中產生抗體，例如TPP-981、TPP-1015、TPP-7007、TPP-2658、TPP-2090、TPP-9476及TPP-9574。 B-3 用於自細胞上清液純化抗體之通用方法

自細胞培養物上清液獲得抗體，例如TPP-981、TPP-1015、TPP-7007、TPP-2658、TPP-2090、TPP-9476及TPP-9574。藉由細胞離心澄清細胞上清液。接著藉由在MabSelect Sure (GE Healthcare)層析管柱上進行親和力層析來純化細胞上清液。為此目的，以DPBS(pH 7.4)(Sigma/Aldrich)中平衡管柱，施加細胞上清液，且用約10個管柱體積之DPBS(pH 7.4) + 500 mM氯化鈉洗滌管柱。於50 mM乙酸鈉(pH 3.5) + 500 mM氯化鈉中溶離抗體，接著藉由在DPBS(pH 7.4)中於Superdex 200管柱(GE Healthcare)上進行凝膠過濾層析來進一步純化。

藉由標準層析法(蛋白質A層析、製備型凝膠過濾層析(SEC-尺寸排阻層析))自市售產品純化市售抗體。 用於半胱胺酸偶合之通用程序

將以下抗體用於在A2DC實例部分中描述之例示性偶合方案中：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP-981) 實例e：抗Her2 mAb (TPP-1015) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-7007) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-2658) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-2090) 實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476) 實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574)

為獲得硫醇親核試劑，可藉由下文所描述之實例中亦採用之目前先進技術方法還原抗體。或者，自由半胱胺酸殘基可經位點特異性工程改造至抗體中。與部分『ADC前驅物分子』中所描述之親電子劑的偶合反應通常在氬氣下如部分『A2DC實例』中之通用程序所描述進行。

在生物測試中，在需要時，視情況藉由再稀釋將最終A2DC樣本的濃度調節至0.5至15 mg/ml之範圍。測定實施例中所陳述的A2DC溶液中之各別蛋白質濃度。此外，使用本文所描述的方法測定抗體負載量(藥物/mAb比)。

視連接子而定，實例中所示的A2DC亦可以連接至抗體之水解開鏈丁二醯胺形式、以較低或較高的含量存在。

特定言之，經由連接子子結構與抗體之硫醇基連接的KSP-I-A2DC可視情況亦在藉由再緩衝且於pH 8下攪拌約20至24 h而偶合之後水解，以獲得經由開鏈丁二醯胺連接的A2DC。

#1表示連至抗體的硫橋鍵，且#2表示與經修飾之KSP抑制劑的連接點。

此類連接子經由水解開鏈丁二醯胺連接至抗體的A2DC顯示針對逆邁克爾反應(retro-Michael reaction)之去結合的較高穩定性，且可如以下流程中所示及通用程序A中所描述來製備(Lerchen等人, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 15243)：

連至抗體之其他潛在水解敏感性噻烷基丁二醯胺橋鍵可含有以下連接子子結構，其中#1表示連至抗體之硫醚鍵且#2表示與經修飾之KSP抑制劑的連接點：

在實例中所描述之結構式中，AK ₁可意謂：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP-981)，部分還原實例e：抗Her2 mAb (TPP-1015)，部分還原實例k-7007：抗TWEAKR mAb (TPP-7007)，部分還原實例k-2658：抗TWEAKR mAb (TPP-2658)，部分還原實例k-2090：抗TWEAKR mAb (TPP-2090)，部分還原實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476)，部分還原實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574)，部分還原其中 § ¹表示連至丁二醯亞胺基團或連至任何異構性水解開鏈丁二醯胺之鍵或由其所產生之伸烷基，且 S S表示部分還原抗體之半胱胺酸殘基中的硫原子。 用於離胺酸偶合之通用程序

將以下抗體用於在A2DC實例部分中描述之例示性偶合方案中：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP981) 實例e：抗Her2 mAb (TPP1015) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-7007) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-2658) 實例k：抗TWEAKR mAb (TPP-2090) 實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476) 實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574)

在實例中所描述之結構式中，AK ₂可意謂：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP981) 實例e：抗Her2 mAb (TPP1015) 實例k-7007：抗TWEAKR mAb (TPP-7007) 實例k-2658：抗TWEAKR mAb (TPP-2658) 實例k-2090：抗TWEAKR mAb (TPP-2090) 實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476) 實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574) 其中 § ²表示連至羰基的鍵，且 NH表示抗體之離胺酸殘基中的側鏈胺基。 A2DC 之分析性表徵 藉由 SEC-UV 進行之藥物負載量測定及純度評定

使用尺寸排阻層析(SEC)測定各A2DC之藥物抗體比(DAR)及純度。使用50 μL之A2DC溶液進行分析。在於260 nm及280 nm下監測的1200 HPLC系統上進行SEC分析。在室溫下，用等度梯度，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)以0.5 mL/min之流動速率操作Superdex 200 10/300 GL管柱(GE Healthcare)。自單體、二聚體及聚集物質之UV峰之積分結果測定二聚體及聚集體含量。為了計算DAR，使用以下等式計算260 nm (A _drug)及280 nm (A ₂₈₀)下的SEC峰曲線下面積(聚集物、二聚體及單體之總和)： (Ab =抗體，D =藥物，ldrug =藥物相關波長(對於KSP發毒團，260 nm)，ε =吸收係數，A =特定波長下之吸收)

對於發毒團，使用實驗測定之吸收係數。對於所有抗體，使用一組常見吸收係數(參見下表)。 抗體及藥物之吸收係數 .

波長(nm)
抗體	KSP
280	ε _Ab ²⁸⁰	0.2284	ε _drug ²⁸⁰	0.010
260	ε _Ab ²⁶⁰	0.1163	ε _drug ²⁶⁰	0.014

A2DC 濃度之測定

藉由量測280 nm下之吸收來測定各A2DC之濃度(C _A2DC)。使用各別抗體之吸收係數計算濃度。考慮發毒團在280 nm下之吸收率，使用以下等式校正濃度： C _A2DC=初始濃度/ (1 + DAR _UV* [ε _{drug 280 nm}/ ε _{Antibody 280 nm}]) 其中初始濃度=僅使用抗體之消光係數計算的濃度，DAR _UV=藉由UV吸收測定的各別A2DC之藥物負載量，ε _{drug 280 nm}=藥物在280 nm下之消光係數，且ε _{Antibody 280 nm}=抗體在280 nm下之消光係數)。 藉由質譜法 進行的 A2DC 之表徵

針對抗體及發毒團物質之屬性檢查以及用於DAR測定之替代方法，已藉由質譜分析表徵ADC及A2DC。

使用由以下組成之HPLC及ESI-Q-TOF之組合進行分子量分析：例如用於樣本去鹽及分離之I-class HPLC (Waters)，及用於MS分析的配備有儀器控制及獲取軟體HyStar 3.2、ESI Compass 1.7及Maximum Entropy Deconvolution Option的Impact HD質譜儀(Bruker Daltonik, Bremen)。

層析系統及條件：管柱：Acquity UPLC BEH300C4 1.7 µm，1.0×50 mm；管柱溫度：70℃；流量：200 µl/min；移動相溶液A：0.1%甲酸、94.9%水、5% ACN；移動相溶液B：0.1%甲酸、 9.9%水、10% ACN及80% 2-丙醇。

完整抗體之二元梯度概況：2min 5% B，2.5min 50% B，3.5min 50% B，5min 95% B，5.1min 5% B，5.6min 95% B，5.7min 5% B，6.2min 95% B，6.3min 5% B，7.5min 5% B

還原抗體之二元梯度概況：2min 5% B，4min 30% B，5min 50% B，7.5min 50% B，8.5min 95% B，8.6min 5% B，9.1min 95% B，9.3min 5% B，9.8min 95% B，9.9min 5% B，12min 5% B

對於 Cys 偶合之 ADC 及 A2DC，已在去醣基化及還原之後量測個別結合物物質之分子量之測定。用20 mM磷酸鈉(pH 6.5)稀釋約160 pmol之結合物，最終體積25 µl。添加1 µl PNGase F，且在37℃，於平緩振盪(Thermomixer)下培育樣本過夜。在60℃，藉由使樣本沸騰5 min，用20µl 5M Gu*HCl (鹽酸胍於50 mM三乙基碳酸氫銨)使10 µl之去醣基化樣本變性。為了還原蛋白質，添加溶解於水中之0.5 µl之255 mM DTT且在60℃培育混合物約10 min。用2 µl之10%甲酸/水酸化經冷卻樣本，接著如上文所描述藉由質譜法進行分析。為進行DAR測定，將TIC (總離子層析圖)中相對於信號的所有光譜相加，且基於輕鏈及重鏈之MaxEnt解迴旋來計算不同結合物物質之分子量。根據藉由以HC負載量及LC負載量之總和之兩倍進行積分而測定的峰面積，計算具有發毒團之抗體的平均負載量，而HC負載量為所有重鏈(HC)峰之發毒團數目加權積分結果之總和除以HC峰之單個加權積分結果之總和，且LC負載量為輕鏈(LC)峰之發毒團數目加權積分結果之總和除以所有LC峰之單個加權積分結果之總和。對於A2DC，分別計算各發毒團物質之DAR。總DAR計算為兩種發毒團物質之個別DAR之總和。

對於 Lys 偶合之 ADC 及 A2DC ，已在去醣基化之後量測個別結合物物質之分子量的測定。用20 mM磷酸鈉(pH 6.5)稀釋約160 pmol之結合物，最終體積25 µl。添加1 µl PNGase F，且在37℃，於平緩振盪(Thermomixer)下培育樣本過夜。用2 µl 之10%甲酸/水酸化5 µl去醣基化樣本，接著用0.1%甲酸/水稀釋至1 pmol/µl的濃度。如上文所描述藉由質譜法分析3 µl。為了進行DAR測定，將TIC (總離子層析圖)中相對於信號的所有光譜相加，且基於具有不同數目個發毒團之完整抗體之MaxEnt解迴旋來計算不同結合物物質之分子量。藉由用發毒團數目加權峰面積之總和除以未加權峰面積之總和，計算DAR。對於A2DC，分別計算各發毒團物質之DAR。總DAR計算為兩種發毒團物質之個別DAR之總和。

對於由 Cys 及 Lys 偶合之發毒團之組合構成的 A2DC，在去醣基化及還原之後量測個別結合物物質之分子量。用20 mM磷酸鈉(pH 6.5)稀釋約160 pmol之結合物，最終體積25 µl。添加1 µl PNGase F，且在37℃，於平緩振盪(Thermomixer)下培育樣本過夜。在60℃下，藉由20 µl 5M Gu*HCl (鹽酸胍於50 mM三乙基碳酸氫銨)及約5 min沸騰使10 µl之去醣基化樣本變性。為了還原蛋白質，添加0.5 µl溶解於水中之255 mM DTT且在60℃培育混合物約10 min。用2 µl之10%甲酸/水酸化經冷卻樣本，接著如上文所描述藉由質譜法進行分析。如關於Cys偶合之ADC所描述，進行DAR測定。針對各個別發毒團及/或兩種發毒團之組合，計算輕鏈及重鏈之平均負載量。藉由對輕鏈及重鏈兩者之平均負載量求和兩次來計算總DAR。檢查 A2DC 之抗原結合

偶合已發生之後，檢查結合於目標分子的能力。熟習此項技術者熟悉可用於此目的之各種方法；例如結合物之親和力可使用ELISA技術或表面電漿子共振分析(BIA-core™量測)來檢查。熟習此項技術者可使用習用方法量測結合物濃度，例如藉由蛋白質測定對抗體結合物進行量測(亦參見Doronina等人; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784及Poison等人, Blood 2007; 1102:616- 623)。 A2DCS 中採用之較佳抗體及抗原結合片段 表 1：抗體之蛋白質序列：

抗體 TPP-XXX	抗原	SEQ ID NO: VH	SEQ ID NO: H-CDR1	SEQ ID NO: H-CDR2	SEQ ID NO: H-CDR3	SEQ ID NO: VL	SEQ ID NO: L-CDR1	SEQ ID NO: L-CDR2	SEQ ID NO: L-CDR3	SEQ ID NO: IgG重鏈	SEQ ID NO: IgG輕鏈
TPP-981	EGFR	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
TPP-1015	HER2	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
TPP-2658	TWEAKR	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
TPP-7007	TWEAKR	61	62	63	64	65	66	67	68	69	70
TPP-2090	TWEAKR	71	72	73	74	75	76	77	78	79	80
TPP-170	間皮素	81	82	83	84	85	86	87	88	89	90
TPP-9476	CD123	91	92	93	94	95	96	97	98	99	100
TPP-9574	CXCR5	101	102	103	104	105	106	107	108	109	110

TPP-981、TPP-1015、TPP-2658、TPP-7007、TPP-2090、TPP-170、TPP-9476及TPP-9574為包含上表中給出之CDR序列(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)、重鏈(VH)可變區或輕鏈(VL)可變區中之一或多者的抗體。較佳地，抗體包含重鏈(VH)之指定可變區及/或輕鏈(VL)之指定可變區。較佳地，抗體包含重鏈(IgG重鏈)之指定區及/或輕鏈(IgG輕鏈)之指定區。

TPP-981為抗EGFR抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 2所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 3所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 4所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 6所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 7所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 8所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-1015為抗HER2抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 12所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 13所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 14所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 16所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 17所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 18所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-2658為抗TWEAKR抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 32所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 33所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 34所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 36所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 37所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 38所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-7007為抗TWEAKR抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 62所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 63所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 64所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 66所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 67所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 68所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-2090為抗TWEAKR抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 72所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 73所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 74所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 76所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 77所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 78所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-170為抗間皮素抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 82所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 83所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 84所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 86所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 87所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 88所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-9476為抗CD123抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 92所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 93所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 94所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 96所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 97所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 98所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-9574為抗CXCR5抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 102所示的重鏈可變CDR1序列(H-CDR1)、SEQ ID NO: 103所示的重鏈可變CDR2序列(H-CDR2)及SEQ ID NO: 104所示的重鏈可變CDR3序列(H-CDR3)的重鏈(VH)可變區，及包含SEQ ID NO: 106所示的輕鏈可變CDR1序列(L-CDR1)、SEQ ID NO: 107所示的輕鏈可變CDR2序列(L-CDR2)及SEQ ID NO: 108所示的輕鏈可變CDR3序列(L-CDR3)的輕鏈(VL)可變區。

TPP-981為抗EGFR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 1表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 5表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-1015為抗HER2抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 11表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 15表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-2658為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 31表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 35表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-7007為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 61表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 65表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-2090為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 71表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 75表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-170為抗間皮素抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 81表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 85表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-9476為抗CD123抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 91表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 95表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-9574為抗CXCR5抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 101表示之重鏈(VH)可變區及由SEQ ID NO: 105表示之輕鏈(VL)可變區。

TPP-981為抗EGFR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 9表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 10表示之輕鏈區域。

TPP-1015為抗HER2抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 19表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 20表示之輕鏈區域。

TPP-2658為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 39表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 40表示之輕鏈區域。

TPP-7007為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 69表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 70表示之輕鏈區域。

TPP-2090為抗TWEAKR抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 79表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 80表示之輕鏈區域。

TPP-170為抗間皮素抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 89表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 90表示之輕鏈區域。

TPP-9476為抗CD123抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 99表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 100表示之輕鏈區域。

TPP-9574為抗CXCR5抗體，其較佳包含由SEQ ID NO: 109表示之重鏈區域及由SEQ ID NO: 110表示之輕鏈區域。縮寫及字首語 A431NS 人類腫瘤細胞株 A549 人類腫瘤細胞株 ABCBl ATP結合卡匣子家族B成員I (同義詞為P-gp及MDRl) abs. 絕對值 Ac 乙醯基 ACN 乙腈 ADC 抗體藥物結合物 A2DC 抗體2藥物結合物 aq. 水溶液 ATP 三磷酸腺苷 BCRP 乳癌抗藥性蛋白，流出物轉運蛋白 BEP 四氟硼酸2-溴-l-乙基吡啶鎓 Boc 三級丁氧羰基 br. 寬峰(NMR中) Ex. 實例 BxPC3 人類腫瘤細胞株 ca. 約 C-DAR 半胱胺酸藥物與抗體比(連接至半胱胺殘基之連接子) Cl 化學電離(MS中) D 雙重峰(NMR中) D 天 TLC 薄層層析 DCI 直接化學電離(MS中) DCM 二氯甲烷 Dd 雙重雙重峰(NMR中) DMAP 4-N,N-二甲胺基吡啶 DME 1,2-二甲氧基乙烷 DMEM 達爾伯克氏必需基本培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(用於細胞培養之標準化培養基) DMF N,N-二甲基甲醯胺 DMSO 二甲亞碸 DAR 藥物抗體比 DPBS、D-PBS、PBS 杜氏磷酸鹽緩衝鹽溶液PBS=DPBS=D-PBS，pEl 7.4，來自Sigma，第D8537號。組成：0.2 g KCl；0.2 g KH2PO4 (無水)；8.0 g NaCl；1.15 g Na2HPO4 (無水)；用H2O補足I I Dt 雙重三重峰(NMR中) DTT DL-二硫蘇糖醇 d. Th. 理論(化學產率) EDC N'-(3-二甲基胺基丙基)-N-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 EGFR 表皮生長因子受體 EI 電子衝擊電離(MS中) ELISA 酶聯免疫吸附分析 eq. 當量 ESI 電灑游離(MS中) ESI-MicroTofq ESI-MicroTofq (質譜儀名稱，其中Tof=飛行時間且q=四級桿) FCS 胎牛血清 Fmoc (9H-茀-9-基甲氧基)羰基 sat. 飽和 GTP 鳥苷-5'-三磷酸酯 h 小時 HATU 六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-N,N,N',N'-四甲基HCT-116 人類腫瘤細胞株 HEPES 4-(2-羥乙基)哌𠯤-l-乙烷-磺酸 HOAc 乙酸 HOAt 1-羥基-7-氮雜苯并三唑 HOBt 1-羥基-1H-苯并三唑水合物 HOSu N-羥基丁二醯亞胺 HPLC 高壓高效液相層析 HT29 人類腫瘤細胞株 IC50 半數抑制濃度 i.m. 肌肉內，投與至肌肉中 i.v. 靜脈內，投與至靜脈中 K-DAR 離胺酸藥物與抗體比(連接至離胺酸殘基之連接子) KPL-4 人類腫瘤細胞株 KU-19-19 人類腫瘤細胞株 LC-MS 液相層析偶合質譜法 LLC-PKl 細胞，路易斯肺癌豬腎細胞株 L-MDR 人類MDRl轉染之LLC-PKl細胞 LoVo 人類腫瘤細胞株 m 多重峰(NMR中) Me 甲基 MDRl 多重抗藥性蛋白I MeCN 乙腈 min 分鐘 MS 質譜法 MTT 溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓 NCI-H292 人類腫瘤細胞株 NCI-H520 人類腫瘤細胞株 NMM N-甲基𠰌啉 NMP N-甲基-2-吡咯啶酮 NMR 核磁共振光譜法 NMRI 來源於Naval Medical Research Institute之小鼠品系裸小鼠實驗動物 NSCLC 非小細胞肺癌 PBS 磷酸鹽緩衝鹽溶液 Pd/C 鈀/活性碳 P-gp P-醣蛋白，一種轉運蛋白 PNGaseF 用於切割糖之酵素 Quant 全收量(產率) quart 四重峰(NMR中) quint 五重峰(NMR中) RT 室溫 Rt 滯留時間(HPLC中) s 單峰(NMR中) s.c. 皮下，在皮膚下投與 SCC-4 人類腫瘤細胞株 SCC-9 人類腫瘤細胞株 SCID 小鼠，患有嚴重合併性免疫缺失病的測試小鼠 SK-HEP-I 人類腫瘤細胞株 t 三重峰(NMR中) TBAF 氟化四正丁基銨 TCEP 參(2-羧乙基)膦 TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-l-基)氧基 tert 三級 TFA 三氟乙酸 THF 四氫呋喃 T3P® 2,4,6-三氧化2,4,6-三丙基-l,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷 UV 紫外光光譜法 v/v (溶液)體積比 Z 苯甲氧羰基 786-0 人類腫瘤細胞株 胺基酸縮寫Ala =丙胺酸 Arg = 精胺酸 Asn = 天冬醯胺酸 Asp = 天冬胺酸 Cys = 半胱胺酸 Glu = 麩胺酸 Gln = 麩醯胺酸 Gly = 甘胺酸 His = 組胺酸 Ile = 異白胺酸 Leu = 白胺酸 Lys = 離胺酸 Met = 甲硫胺酸 Nva = 正纈胺酸 Phe = 苯丙胺酸 Pro = 脯胺酸 Ser = 絲胺酸 Thr = 蘇胺酸 Trp = 色胺酸 Tyr = 酪胺酸 Val = 纈胺酸程序

視連接子及偶合程序而定，實施例之結構式中所示的ADC及A2DC (經由順丁烯二醯亞胺基團與抗體之半胱胺酸側鏈偶合)主要存在於在各種情況下所示的開環或閉環形式中。然而，製備可包含小比例的各別其他形式。偶合反應在氬氣下進行。

實驗程序中指示的抗體或ADC之濃度可不同，而不會對結果產生重大影響。亦可在偶合反應中使用1至20 mg/mL範圍內之抗體或ADC濃度，較佳在偶合反應中之濃度範圍為5至15 mg/mL。亦可添加過量前驅物分子，其可能脫離程序中給定之內容，此接著可對DAR產生影響。可使用過量的2至20當量有效負載前驅物，較佳在4至15當量範圍內。 通用程序 ： 半胱胺酸偶合及硫代丁二醯亞胺環之後續開環

通常，在氬氣下，將0.029 mg TCEP於0.05 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於0.5 ml PBS中之5 mg各別抗體中(c=10 mg/ml)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.05 mL DMSO中的過量2至20當量、較佳2至10當量、通常7當量(0.000233 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5 ml之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 8)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 8)溶離。在pH 8下，在氬氣下於RT攪拌溶離液過夜。此後藉由超速離心濃縮且用PBS 緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 通用程序 ： 半胱胺酸偶合

通常，在氬氣下，將0.029 mg TCEP於0.05 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於0.5 ml PBS中之5 mg各別抗體中(c=10 mg/ml)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.05 mL DMSO中的過量2至20當量、較佳2至10當量、通常7當量(0.000233 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 ml之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。此後藉由超速離心濃縮且用PBS 緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 通用程序：離胺酸偶合

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體通常於0.5 mL PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液(c = 10 mg/mL)(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml與30 mg/ml之間的範圍內)中，添加溶解於0.5 mL DMSO中的過量2至10當量、較佳2至5當量、通常5當量(0.00165 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT攪拌30至60 min之後，添加溶解於0.05 mL DMSO中的相同量之ADC前驅物分子，且再繼續在RT攪拌30至60 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約0.300 mL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 應用於合成 A2DC 之 ADC 前驅物分子

將以下有效負載連接子前驅物分子用於A2DC中，且合成已描述於WO2016/207089、WO2017/162663、WO2018/114798及WO2018/114578中。新穎且有利之A2DC可根據本文所揭示之式及實例自此項技術中已知的有效負載、連接子、抗體及/或前驅物分子之特定組合獲得。供 ADC 形成不可滲透代謝物之前驅物 中間物 R1 LEE14057-6-1

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 0.93 min；MS (ESIpos)：m/z = 1195 [M+H] ⁺。 中間物 R2

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= R _t= 0.92 min；MS (ESIpos)：m/z = 1181 [M+H] ⁺。 中間物 R3 LEE14526-1-1

N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 3.2 min；MS (ESIpos)：m/z = 1177 [M+H] ⁺。 中間物 R4 LEE14741-1-1

N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= R _t= 0.96 min；MS (ESIpos)：m/z = 1163 [M+H] ⁺。 中間物 R5

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]-2-[(N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-α-天冬胺醯基-L-天冬醯胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸 LC-MS (方法1)：R _t= R _t= 0.9 min；MS (ESIpos)：m/z = 1154 [M+H] ⁺。 中間物 R6

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} (乙醇醯基)胺基]-2-[(N ²-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-天冬醯胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

LC-MS (方法1)：R _t= 0.92 min；MS (ESIpos)：m/z = 1039 [M+H] ⁺。供 ADC 形成可滲透代謝物之前驅物 中間物 Q1

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 1.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 937 [M+H] ⁺。 中間物 Q2

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= R _t= 1.01 min；MS (ESIpos)：m/z = 937 [M+H] ⁺。 中間物 Q3

N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 1.05 min；MS (ESIpos)：m/z = 919 [M+H] ⁺。 中間物 Q4

LC-MS (方法1)：R _t= R _t= 1.05 min；MS (ESIpos)：m/z = 919 [M+H] ⁺。 中間物 Q5

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-D-α-天冬醯胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 0.98 min；MS (ESIpos)：m/z = 981 [M+H] ⁺。 中間物 Q6

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-α-天冬醯胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 1.03 min；MS (ESIpos)：m/z = 981 [M+H] ⁺。 中間物 Q7

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-α-天冬胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 1.04 min；MS (ESIpos)：m/z = 910 [M+H] ⁺。 中間物 Q8

N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} (乙醇醯基)胺基]丙基}-N2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：Rt = 1.03 min；MS (ESIpos)：m/z = 795 [M+H]+。 中間物 Q9

N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-α-天冬胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

LC-MS (方法1)：R _t= 1.07 min；MS (ESIpos)：m/z = 892 [M+H] ⁺。 有效負載連接子中間物 ：

有效負載連接子前驅物分子R1-R6及Q1-Q9之合成已描述於WO2016/207089、WO2017/162663、WO2018/114798及WO2018/114578中。 A2DC 合成部分 I ：

對於例示於實例I-1至I-14中之A2DC之合成，有效負載連接子前驅物分子R1至R6及Q1至Q9隨後偶合至各別抗體。前驅物分子可以不同方式彼此組合，以用於合成A2DC，以實現各別A2DC之所需生物學概況。實例I-1： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R1。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.14 mg)中間物Q1，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。 合成程序 A* ：

向處於氬氣氛圍下的20 mg各別抗體於2 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.63 mg)中間物R1。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.56 mg)中間物Q1，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。用PBS緩衝液將所獲得之溶液稀釋至14 mL之體積，接著藉由超速離心濃縮至2 mL，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至14 mL之體積，且再次濃縮至2 mL之最終體積。用個別抗體獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
1c-9476	CD123	9476	A	3.01	2.1	0.6	1.5	98.8
1e-1015	HER-2	1015	A	1.92	5.3	nd	nd	100
1k-7007	TWEAKR	7007	A	2.48	3.0	1.2	1.8	94
1k-7007*	TWEAKR	7007	A*	9.92	2.2	1.0	1.2	96
1m-170	間皮素	170	A	0.87	4.6	nd	nd	98.7
1m-170*	間皮素	170	A*	3.67	3.8	1.4	2.4	98.7
1x-9574	CXCR5	9574	A	1.02	5.4	nd	nd	100

實例I-2： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R2。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.14 mg)中間物Q2，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。 合成程序 A* ：

向處於氬氣氛圍下的30 mg各別抗體於2.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 12 mg/mL)中添加溶解於125 µL DMSO中的4 Eq (1.28 mg)中間物R2。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於125 µL DMSO中的4 Eq (0.77 mg)中間物Q2，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至5 mL之體積，施加至2 PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且各自用3.5 mL PBS緩衝液溶離。收集所獲得之溶液，且藉由超速離心濃縮，得到2 mL，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至14 mL之體積，再次濃縮，得到3 mL之最終體積。用個別抗體獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAK TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
2e-1015	HER-2	1015	A	2.03	3.1	2.1	1.0	100
2g-981	EGFR	981	A	2.19	2.3	nd	nd	100
2k-7007	TWEAKR	7007	A	2.16	2.7	1.8	0.9	100
2k-7007*	TWEAKR	7007	A*	8.9	3.0	1.8	1.2	100
2m-170	間皮素	170	A	1.83	2.5	1.6	0.9	98.1

實例I-3： 合成程序 B ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µl PBS緩衝液中的0.026 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加各自溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R3及4 Eq (0.13 mg)中間物Q3，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。 合成程序 B* ：

向處於氬氣氛圍下的30 mg各別抗體於3 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於300 µl PBS緩衝液中的0.17 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加各自溶解於300 µL DMSO中的4 Eq (0.94 mg；0.0008 mmol)中間物R3及4 Eq (0.74 mg)中間物Q3，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至5 mL之體積，分成份，且施加至兩個PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且各自用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將合併之溶液濃縮至2 mL且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至14 mL之體積，且再次濃縮至約3 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
3c-9476	CD123	9476	B	2.06	3.6	nd	nd	100
3e-1015	HER-2	1015	B	2.0	3.3	1.6	1.7	100
3g-981	EGFR	981	B	2.09	3.5	nd	nd	100
3k-7007	TWEAKR	7007	B	2.0	2.8	1.3	1.5	100
3m-170	間皮素	170	B	0.51	2.6	nd	nd	97.8
3x-9574*	CXCR5	9574	B*	9.04	3.4	nd	nd	100

實例I-4： 合成程序 B ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µl PBS緩衝液中的0.029 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R4及4 Eq (0.13 mg)中間物Q4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
4e-1015	HER-2	1015	B	2.29	4.3	nd	nd	100
4g-981	EGFR	981	B	2.1	3.8	nd	nd	100
4k-7007	TWEAKR	7007	B	1.99	2.8	1.6	1.2	100
4m-170	間皮素	170	B	1.56	3.6	nd	nd	96.7
4x-9574	CXCR5	9574	B	1.82	2.8	nd	nd	100

實例I-5： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R2。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.13 mg)中間物Q5，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約300 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
5c-9476	CD123	9476	A	1.95	3.0	1.6	1.4	100
5e-1015	HER-2	1015	A	1.82	5.2	4.0	1.2	97.5
5g-981	EGFR	981	A	1.93	4.1	nd	nd	100
5k-7007	TWEAKR	7007	A	2.15	2.9	1.6	1.3	100
5m-170	間皮素	170	A	1.04	5.6	nd	nd	98.2

實例I-6： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.14 mg)中間物Q6。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R1，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約300 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
6e-1015	HER-2	1015	A	1.97	3.8	2.0	1.8	100
6g-981	EGFR	981	A	1.93	4.4	nd	nd	100
6k-7007	TWEAKR	7007	A	1.91	3.5	1.9	1.6	100
6m-170	間皮素	170	A	1.1	5.4	2.6	2.8	96.8
6x-9574	CXCR5	9574	A	1.03	4.5	2.5	2.0	100

實例I-7： 合成程序 A ：向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.12 mg)中間物Q7。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.16 mg)中間物R5，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約50 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
7e-1015	HER-2	1015	A	1.68	4.7	nd	nd	100
7g-981	EGFR	981	A	1.86	4.1	nd	nd	97.9
7k-7007	TWEAKR	7007	A	1.98	3.1	nd	nd	100
7m-170	間皮素	170	A	1.82	3.0	nd	nd	97.9
7x-9574	CXCR5	9574	A	1.58	4.6	nd	nd	100

實例I-8： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體於0.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.14 mg)中間物R6。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的4 Eq (0.11 mg)中間物Q8，且再繼續在RT攪拌30 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約50 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之ADC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	左側DAR	右側DAR	單體%
8c-9476	CD123	9476	A	1.92	3.3	nd	nd	100
8e-1015	HER-2	1015	A	2.05	4.3	nd	Nd	89.2
8g-981	EGFR	981	A	2.19	3.5	nd	nd	100
8k-7007	TWEAKR	7007	A	2.35	4.1	nd	nd	86.7
8m-170	間皮素	170	A	2.48	4.2	1.6	2.6	95.5

實例I-11： 以半胱胺酸偶合開始之 合成程序 A ：向處於氬氣氛圍下之10 mg各別抗體於1 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於100 µl PBS緩衝液中的0.057 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的7 Eq (0.55 mg)中間物R4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定半胱胺酸DAR (C-DAR)，其最後亦表示A2DC之C-DAR。將250 µL ADC中間物用於後續離胺酸偶合：

用PBS緩衝液將250 µL所獲得之半胱胺酸連接之ADC溶液稀釋至約550 µL之體積。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µL DMSO中的10 Eq (0.31 mg)中間物Q2，且在RT攪拌溶液2小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約100 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。 以半胱胺酸偶合開始 之合成程序 A* ：

向處於氬氣氛圍下的20 mg各別抗體於1.5 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 13.4 mg/mL)中添加溶解於200 µl PBS緩衝液中的0.12 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於200 µL DMSO中的7 Eq (1.1 mg)中間物R4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至5 mL之體積，施加至兩個PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用xmL PBS緩衝液溶離。合併所獲得之溶液且藉由超速離心濃縮至200 µL，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.2 mL之體積。此ADC批料用於後續離胺酸偶合，且在此之前，自一小份等分試樣測定半胱胺酸DAR (C-DAR)。

向在氬氣氛圍下的2.2 mL所獲得半胱胺酸連接之ADC於處於pH 7.2之PBS緩衝液的溶液中添加溶解於200 µL DMSO中的10 Eq (1.23 mg)中間物Q2，且在RT攪拌溶液2小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至5 mL之體積。將其分成份，且施加至兩個PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且各自用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將合併之溶離液濃縮至約1 mL之體積，接著用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至14 mL之體積，且再次濃縮至2 mL之體積。

所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DAR	K-DAR	C- DAR	單體%
11m-170a	間皮素	170	A	0.79	8.8	4.6	4.2	97.4
11m-170a*	間皮素	170	A*	4.47	8.8	3.9	4.9	97.5
11k-7007a	TWEAKR	7007	A	1.62	9.6	3.6	3.20	95.5
11k-2090a*	TWEAKR	2090	A*	4.83	7.4	3.6	3.8	98.8
11k-2658a*	TWEAKR	2658	A*	5.56	8.7	4.6	4.1	98.5
11e-1015a	HER-2	1015	A	1.6	7.2	3.5	3.7	98.0
11x-9574a	CXCR5	9574	A	0.54	7.3	3.0	4.3	97.7

以離胺酸偶合開始之合成程序 B

向在氬氣氛圍下的10 mg各別抗體於1 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 10 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的5 Eq (0.31 mg)中間物Q2。在RT攪拌1 h之後，添加溶解於50 µL DMSO中的另外5 Eq (0.31 mg)中間物Q2，且再繼續在RT攪拌一小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定離胺酸DAR (K-DAR)，其最後亦表示A2DC之K-DAR。將250 µL此ADC中間物用於後續半胱胺酸偶合：

用PBS緩衝液(pH 7.2)將250 µL此半胱胺酸連接之ADC中間物稀釋至500 µL之體積(c = 10 mg/mL)。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µl PBS緩衝液中的0.029 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的7 Eq (0.27 mg)中間物R4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，且施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，用PBS緩衝液溶離。藉由超速離心將溶離液濃縮至100 µL，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DRA	K-DAR	C- DAR	單體%
11m-170b	間皮素	170	B	0.74	5.8	1.7	4.1	97.6
11k-7007b	TWEAKR	7007	B	1.53	4.8	1.7	3.1	88.9
11e-1015b	HER-2	1015	B	1.23	6.2	3.3	2.8	82.3
11x-9574b	CXCR5	9574	B	0.77	5.7	2.5	3.2	100

實例I-12： 以半胱胺酸偶合開始之合成程序 A

向處於氬氣氛圍下之10 mg各別抗體於800 µL PBS緩衝液中之溶液(c = 12.5 mg/mL)中添加溶解於100 µl PBS緩衝液中的0.057 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於100 µL DMSO中的7 Eq (0.43 mg)中間物Q4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定半胱胺酸DAR (C-DAR)，其最後亦表示A2DC之C-DAR。將250 µL ADC中間物用於後續離胺酸偶合：

用PBS緩衝液將250 µL所獲得的半胱胺酸連接之ADC的溶液稀釋至550 µL之體積。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µL DMSO中的10 Eq (0.4 mg)中間物R2，且在RT攪拌溶液2小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約100 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DRA	K-DAR	C- DAR	單體%
12m-170a	間皮素	170	A	0.14	14.1	11.2	2.9	96.6
12k-7007a	TWEAKR	7007	A	1.07	12.7	8.3	4.4	95.8
12e-1015a	HER-2	1015	A	1.27	12.3	6.4	5.9	89.9
12x-9574a	CXCR5	9574	A	1.08	8.5	5.6	2.9	95.4

以離胺酸偶合開始之合成程序 B

向處於氬氣氛圍下的10 mg各別抗體於0.9 mL PBS緩衝液中之溶液(c = 11.1 mg/mL)中添加溶解於50 µL DMSO中的5 Eq (0.4 mg)中間物R2。在RT攪拌1 h之後，添加溶解於50 µL DMSO中的另外5 Eq (0.4 mg)中間物R2，且再繼續在RT攪拌一小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定離胺酸DAR (K-DAR)，其最後亦表示A2DC之K-DAR。將250 µL此ADC中間物用於後續半胱胺酸偶合：

用PBS緩衝液(pH 7.2)將250 µL此離胺酸連接之ADC中間物稀釋至500 µL之體積(c = 10 mg/mL)。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µl PBS緩衝液中的0.029 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於50 µL DMSO中的7 Eq (0.22 mg)中間物Q4，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，且施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，用PBS緩衝液溶離。藉由超速離心將溶離液濃縮至100 µL，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DRA	K-DAR	C- DAR	單體%
12m-170b	間皮素	170	B	0.42	7.4	5.3	2.1	98
12k-2658b	TWEAKR	2658	B	1.23	8.3	6.1	2.2	98.8
12e-1015b	HER-2	1015	B	1.25	6.2	3.0	2.2	97.7
12x-9574b	CXCR5	9574	B	1.19	7.0	2.2	4.8	98.5

實例I-13： 合成程序：

向處於氬氣氛圍下之10 mg各別抗體於800 µL PBS緩衝液中之溶液(c = 12.5 mg/mL)中添加溶解於100 µl PBS緩衝液中的0.057 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於100 µL DMSO中的7 Eq (0.55 mg)中間物R3，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定半胱胺酸DAR (C-DAR)，其最後亦表示A2DC之C-DAR。將250 µL ADC中間物用於後續離胺酸偶合：

用PBS緩衝液將250 µL所獲得的半胱胺酸連接之ADC的溶液稀釋至550 µL之體積。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µL DMSO中的10 Eq (0.31 mg)中間物Q1，且在RT攪拌溶液2小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約100 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總DRA	K-DAR	C- DAR	單體%
13m-170	間皮素	170	A	0.58	8.9	4.9	4.0	95
13k-7007	TWEAKR	7007	A	1.57	8.7	5.9	2.8	78.7
13e-1015	HER-2	1015	A	0.78	11.8	7.6	4.2	86.6
13x-9574	CXCR5	9574	A	0.39	4.5	2.5	2.0	97.2

實例I-14： 合成程序 A ：

向處於氬氣氛圍下之10 mg各別抗體於800 µL PBS緩衝液中之溶液(c = 12.5 mg/mL)中添加溶解於100 µl PBS緩衝液中的0.057 mg TCEP。在RT攪拌30 min之後，添加溶解於100 µL DMSO中的7 Eq (0.42 mg)中間物Q9，且再繼續在RT攪拌90 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心濃縮所獲得之溶液，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至500 µL之體積。將此樣本分成份，且測定半胱胺酸DAR (C-DAR)，其最後亦表示A2DC之C-DAR。將250 µL ADC中間物用於後續離胺酸偶合：

用PBS緩衝液將250 µL所獲得的半胱胺酸連接之ADC的溶液稀釋至550 µL之體積。在氬氣氛圍下，添加溶解於50 µL DMSO中的10 Eq (0.39 mg)中間物R5，且在RT攪拌溶液2小時。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)，且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約100 µL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至2.5 mL之體積。所獲得之A2DC批料之特徵如下表所示。

實例 I-	目標	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	總 DRA	K-DAR	C-DAR	單體 %
14m-170	間皮素	170	A	0.79	10.5	6.8	3.7	98.5
14g-981	EGFR	981	A	1.40	7.9	4.5	3.4	98.6
14k-7007	TWEAKR	7007	A	1.83	6.9	4.0	2.9	100
14e-1015	HER-2	1015	A	1.6	8.4	5.0	3.4	98.9
14x-9574	CXCR5	9574	A	1.68	7.4	4.3	3.1	99.1

生物學表徵 CTG 分析

使用C-I下所列之生長培養基，根據標準方法培育細胞。如下進行測試：用胰蛋白酶(0.05%)及EDTA (0.02%)於PBS (Biochrom AG #L2143)中之溶液分離細胞，沉澱(pelleting)，再懸浮於培養基中，計數且接種於具有白色底部之96孔培養盤(Costar #3610)(75 pl/孔，每孔細胞數目如下：NCI-H292：2500個細胞/孔，BxPC3 2500個細胞/孔，LoVo 3000個細胞/孔)中，且在培育箱中在37℃及5%二氧化碳下培育。24 h之後，向細胞中添加含有抗體藥物結合物之25 pi培養基(四倍濃縮)，使得細胞上之抗體藥物結合物最終濃度達到3×10 ^-7M至3×10 ^-11M (一式三份)。接著在培育箱中在37℃及5%二氧化碳下培育細胞。在一並行培養盤上，在藥物處理開始時(第0天)，使用Cell Titer Glow (CTG)發光細胞活力分析(Promega #G7573及#G7571)測定細胞活性。為此目的，每批細胞中添加100 pi受質，接著用鋁箔覆蓋培養盤，在盤振盪器上以180 rpm振盪2分鐘，在實驗台上靜置8分鐘，接著使用光度計(Victor X2, Perkin Elmer)量測。受質偵測活細胞中之ATP含量，產生發光信號，其強度與細胞活力成正比。與抗體藥物結合物一起培育72 h之後，接著亦使用上文所描述之Cell Titer Glow發光細胞活力分析來測定此等細胞的活力。根據所量測數據，使用DRC (劑量反應曲線)分析試算表及4參數擬合來計算相較於第0天之生長抑制之IC50。DRC分析試算表為Bayer Pharma AG及Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook套件平台(IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK)上所開發的biobook試算表。

下表2及表3列舉此分析中之代表性實施例的IC50值：表 2 ： TWEAKR-A2DC

實例編號 (I-)	EO-PROLIF-NCI-H292 ADC CTG 72H IC50 - [mol/l] ( 平均值)	EO-Prolif-BXPC3 ADC CTG 72h IC50 - [mol/l] ( 平均值)	EO-PROLIF-LoVo ADC CTG 72H IC50 - [mol/l] ( 平均值)
1k-7007*	1.01 E-10	1.02 E-10	＜ 3.00 E-11
1k-7007	1.74 E-10	1.66 E-10	＜ 3.00 E-11
2k-7007*	1.27 E-10	2.15 E-10	＜ 3.00 E-11
2k-7007	2.19 E-10	2.92 E-10	9.14 E-11
3k-7007	1.86 E-10	2.68 E-10	4.90 E-11
4k-7007	2.45 E-10	3.20 E-10	6.92 E-11
5k-7007	1.04 E-10	1.67 E-10	＜ 3.00 E-11
8k-7007	1.62 E-10	1.94 E-10	3.81 E-11
6k-7007	2.18 E-10	2.15 E-10	6.47 E-11
7k-7007	1.98 E-10	2.45 E-10	7.45 E-11
11k-7007a	8.17 E-11	1.97 E-10	＜ 3.00 E-11
11k-7007b	8.35 E-11	1.83 E-10	＜ 3.00 E-11
12k-2658b	1.38 E-10	2.54 E-10	5.89 E-11
12k-7007a	3.04 E-10	4.95 E-10	＜ 3.00 E-11
13k-7007	1.08 E-10	1.98 E-10	3.94 E-11
14k-7007	8.01 E-11	1.48 E-10	＜ 3.00 E-11

所報導之活性數據係關於本發明實驗部分中所描述之實施例，其中指示藥物/mAB比。該等值可能因藥物/mAB比不同而偏離。IC50值為若干個獨立實驗或個別值之平均值。抗體藥物結合物之作用對於包含各別連接子及發毒團之各別同型對照為選擇性的。表 3 ： CXCR5-A2DC

實例編號 (I-)	EO-PROLIF-Rec-1_ ADC_CTG_72h IC50 - [mol/l] ( 平均值)
1x-9574	＜ 3.00 E-11
3x-9574*	6.63 E-9
4x-9574	＞ 3.00 E-7
6x-9574	7.26 E-9
11x-9574a	1.68 E-8
11x-9574b	1.84 E-8
13x-9574	＜ 3.00 E-11
14x-9574	5.29 E-11

MTT 分析

使用C-I下所列之生長培養基，根據標準方法培育細胞。如下進行測試：用Accutase於PBS緩衝液(來自Biochrom AG #L2143)中之溶液分離細胞。使細胞沉澱且再懸浮於培養基中。在進行細胞計數之後，將限定數目之細胞接種至具有白色底部之96孔培養盤中(來自Costar #3610)(NCI H292：2500個細胞/孔；SK-HEP-1：1000個細胞/孔；KPL-4：1200個細胞/孔)，總體積100 µL。接著在培育箱中在37℃及5%二氧化碳下培育細胞48 h，在此培育之後，將培養基更換為新鮮培養基。然後，添加抗體藥物結合物，以10 ^-5M至10 ^-13M之濃度範圍添加至細胞(一式三份)，最終體積為10 µL，之後在37℃及5% CO2下培育。96 h之後，使用MTT分析(ATCC, Manassas, Va., USA, 目錄號30-1010K)偵測細胞增殖。為此目的，將MTT試劑添加至細胞中，之後培育4 h。藉由添加清潔劑來溶解細胞過夜。在570 nm Infinite M1000 pro, Tecan)偵測染料形成。使用DRC (劑量反應曲線)，用所量測數據計算生長抑制之IC50。未經測試物質處理、但在其他方面相同地經處理之細胞的增殖定義為100%值。

所報導之活性數據係關於本發明實驗部分中所描述之實施例，其中指示藥物/mAB比。該等值可能因藥物/mAB比不同而偏離。IC50值為若干個獨立實驗或個別值之平均值。抗體藥物結合物之作用對於包含各別連接子及發毒團之各別同型對照為選擇性的。結果彙總於下表(4、5、6、7)中。表 4 ： 間皮素 -A2DC 之平均 IC50 值之彙總

實例 (I-)	細胞毒性分析 -HT29 mesoIC50 [mol/l]
1m-170	4.75 E-09
1m-170*	1.20 E-09
2m-170	8.20 E-09
3m-170	1.26 E-09
4m-170	4.35 E-10
5m-170	6.94 E-10
8m-170	2.96 E-09
6m-170	8.49 E-10
7m-170	2.44 E-09
11m-170a	1.17 E-10
11m-170a*	1.14 E-10
11m-170b	4.75 E-10
12m-170a	1.81 E-10
12m-170b	1.27 E-10
13m-170	4.99 E-11
14m-170	3.94 E-11

表 5 ： EGFR-A2DC 之平均 IC50 值之彙總

實例 (I-)	細胞毒性分析- NCI H292 IC50 [mol/l]	細胞毒性分析- SK-Hep1 IC50 [mol/l]
2g-981	7.31 E-11	8.92 E-08
3g-981	2.59 E-11	2.97 E-09
4g-981	6.24 E-10	2.36 E-7
5g-981	1.45 E-12	1.15 E-08
8g-981	1.36 E-12	4.51 E-08
6g-981	6.20 E-12	7.20 E-10
7g-981
14g-981

表 6 ： HER2-A2DC 之平均 IC50 值之彙總

實例編號 (I-)	細胞毒性分析 KPL4 IC50 [mol/l]
1e-1015	1.82 E-10
2e-1015	2.67 E-10
3e-1015	2.17 E-10
4e-1015	3.39 E-10
5e-1015	3.17 E-10
8e-1015	2.50 E-10
6e-1015	7.88 E-11
7e-1015	2.82 E-10
11e-1015a	1.13 E-10
12e-1015a	1.73 E-10
12e-1015b	3.00 E-10
14e-1015	1.73 E-10

表 7 ： CD123-A2DC 之平均 IC50 值之彙總

實例編號 (I-)	細胞毒性分析- MOLM13 IC50 [mol/l]	細胞毒性分析 MV-4-11 IC50 [mol/l]
1c-9476	1.78 E-09	6.59 E-09
3c-9476	8.50 E-08	2.45 E-08
5c-9476	5.00 E-7	5.00 E-7
8c-9476	5.00 E-7	5.00 E-7

內化分析

內化是一個能在表現抗原之癌細胞中經由抗體藥物結合物(ADC)提供特異性及有效細胞毒性有效負載的關鍵過程。經由特異性抗體及同型對照抗體之螢光標記來監測此過程。首先，使螢光染料與抗體之離胺酸結合。使用兩倍莫耳濃度過量之CypFier 5E單NFiS酯(批次357392，GE Fiealthcare)在pH 8.3下進行結合。偶合之後，藉由凝膠層析(Zeba自旋去鹽管柱，40K，Thermo Scientific，編號87768；溶離緩衝液：DULBECCO'S PBS，Sigma-Aldrich，編號D8537)純化反應混合物，以消除過量染料及調節pH。使用VIVASPIN 500管柱(Sartorius stedim biotec)濃縮蛋白質溶液。藉由分光光度分析(來自NanoDrop)及後續計算(D/P=A _dyee _protein: (A ₂₈₀-0.16A _dye)e _dye)測定抗體之染料負載量。

在此所檢測之抗體及同型對照的染料負載量具有相當數量級。在細胞結合分析中，證實偶合不會引起抗體親和力發生變化。

將經標記之抗體用於內化分析。在開始處理之前，將細胞(2×10 ⁴/孔)於100 µli培養基中接種於96孔MTP (粗，黑色，透明底部，編號4308776，來自Applied Biosystems)中。在37℃/5% CO ₂下培育18 h之後，置換培養基，且以不同濃度(10、5、2.5、1、0.1 pg/ml)添加經標記之抗體。對經標記之同型對照(陰性對照)應用相同處理方案。所選培育時間為0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、6 h及24 h。使用InCe- IlAnalyzer 1000 (來自GE Healthcare)進行螢光量測。此後經由量測參數顆粒計數/細胞及總顆粒密度/細胞來進行動力學評估。結合於受體之後，檢測抗體之內化能力。為此目的，選擇具有不同受體表現量之細胞。觀測到抗體經標靶介導的特異性內化，而同型對照則未顯示內化。自 A2DC 形成之 代謝物的量化

為了量化自A2DC釋放之A2DC代謝物，將癌細胞與來自實例6之A2DC一起培育72 h。在各時間點收集細胞溶解物及對應上清液，且藉由LC-MS對活性有效負載代謝物進行量化。為了校準，在細胞均質物(對於細胞溶解物)或細胞培養基(對於上清液)中加入0.6至1000 µg/L活性代謝物8。使用耦接至三重四極桿質譜儀API 4500 (AB Sciex)之HPLC分析樣本。 活體內活性測試 小鼠中之實驗腫瘤之生長抑制 / 消退

將表現抗體藥物結合物之抗原的人類(NCI-H292)或小鼠(CT26、MC38)腫瘤細胞皮下接種至免疫抑制小鼠(例如NMRi裸小鼠或SCID小鼠)或免疫勝任小鼠(例如Balb/c或C57Bl/6小鼠)之肋腹。自細胞培養物中分離一百萬至一千萬個細胞，離心且再懸浮於培養基或培養基/基質膠中。細胞懸浮液注射於小鼠皮下。幾天內，腫瘤生長。在形成腫瘤之後開始處理，腫瘤尺寸大約40 mm ²。為檢測對較大腫瘤之效果，處理可在腫瘤尺寸為50-100 mm ²時開始。A2DC處理係以腹膜內或經由至小鼠尾靜脈之靜脈內(i.v.)途徑進行。A2DC以5 ml/kg之體積投與。

處理方案視抗體之藥物動力學而定。就根據本發明之結合物而言，作為標準，持續2或3週每週一次或兩次進行處理。對於高效化合物，可採用具有單次處理之方案。然而，亦可繼續處理，或稍後可繼續進行具有三個處理日之第二週期。作為標準，每個處理組使用8隻動物。除投與活性物質之組以外，根據相同方案，一個組僅用緩衝液處理，作為對照組。在實驗期間，使用測徑規定期量測腫瘤的二維面積(長度/寬度)。腫瘤面積係以長度×寬度測定。處理組之平均腫瘤面積與對照組之平均腫瘤面積的比係以T/C _area陳述。

在攜帶高度表現抗原之NCI-H292腫瘤的小鼠(NMRI，雌性)中，以5 mg/kg之劑量測試A2DC實例I-1k-7007*與TWEAK受體之結合。處理每週進行一次，持續三次，且將實例I-1k-7007*與同型結合物以及媒劑(PBS)進行比較。在第一次給藥後不久開始，觀測到實例I-1k-7007*之強效腫瘤抑制，其持續約40天，之後腫瘤再生長。與媒劑相比，同型結合物僅展現輕微功效。( 圖 3)

除此異種移植模型以外，亦研究同基因(小鼠)腫瘤模型CT26及MC38，如免疫組織化學所證實，其皆表現TWEAK受體。在單次處理時以兩個不同劑量(2.5及5 mg/kg)將A2DC實例I 11k-2658*腹膜內注射於攜帶CT26腫瘤之小鼠(Balb/c，雌性)中，觀測腫瘤生長持續約3週。因此，可展現實例I-11k-2658*之較強劑量依賴性腫瘤生長抑制。在用5 mg/kg處理三次之攜帶MC38腫瘤之小鼠中發現11k-2658*之類似較強功效。( 圖 4)

在所有研究中，A2DC化合物耐受良好，不影響嚙齒動物之體重或行為。在大體屍體剖檢中不存在可疑發現。

來源於不同腫瘤模型中之研究的T/C _area比之彙總在下文列於表8中。表 8 ： 來源於不同腫瘤模型之 T/C 比之彙總

A2DC 實例(I-)	腫瘤模型	劑量	T/C _area( 天)
1k-同型	NCI-H292	5 mg/kg, q7dx3	0.65 (d22)
1k-7007*	NCI-H292	5 mg/kg, q7dx3	0.09 (d22)
11k-2658*	CT26	2.5 mg/kg, SD	0.30 (d17)
11k-2658*	CT26	5 mg/kg, SD	0.15 (d17)
11k-2658*	MC38	5 mg/kg, q3dx3	0.26 (d18)

SD：單次劑量第II部分：式II及III化合物以及合成抗體 -2- 藥物結合物 (A2DC) 之製備及表徵

適用於本發明之第II部分的抗體包括但不限於第I部分之表1中所揭示之彼等抗體。 用於在哺乳動物細胞中表現抗體之通用方法

如Tom等人, Methods Express: Expression Systems之第12章，Micheal R. Dyson及Yves Durocher編, Scion Publishing Ltd, 2007所描述，在暫時哺乳動物細胞培養物中產生抗體，例如TPP-2658、TPP-2090、TPP-7007、TPP-1015、TPP-170、TPP-6013、TPP-9476、TPP-9574及TPP-981。 用於自細胞上清液純化抗體之通用方法

自細胞培養物上清液獲得抗體，例如TPP-2658、TPP-2090、TPP-7007、TPP-1015、TPP-170、TPP-6013、TPP-9476、TPP-9574及TPP-981。藉由細胞離心澄清細胞上清液。接著藉由在MabSelect Sure (GE Healthcare)層析管柱上進行親和力層析來純化細胞上清液。為此目的，在DPBS(pH 7.4) (Sigma/Aldrich)中平衡管柱，施加細胞上清液，且用約10個管柱體積之DPBS(pH 7.4) + 500 mM氯化鈉洗滌管柱。於50 mM乙酸鈉(pH 3.5) + 500 mM氯化鈉中溶離抗體，接著藉由在DPBS(pH 7.4)中於Superdex 200管柱(GE Healthcare)上進行凝膠過濾層析來進一步純化。

此類連接子經由水解開鏈丁二醯胺連接至抗體的A2DC顯示針對逆邁克爾反應之去結合的較高穩定性，且可如以下流程中所示及通用程序A中所描述來製備(Lerchen等人, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 15243)：

在實例中所描述之結構式中，AK ₁可意謂：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP981)，部分還原實例e：抗Her2 mAb (TPP1015)，部分還原實例k-7007：抗TWEAKR mAb (TPP-7007)，部分還原實例k-2658：抗TWEAKR mAb (TPP-2658)，部分還原實例k-2090：抗TWEAKR mAb (TPP-2090)，部分還原實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476)，部分還原實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574)，部分還原其中 § ¹表示連至丁二醯亞胺基團或連至任何異構性水解開鏈丁二醯胺之鍵或由其所產生之伸烷基，且 S S表示部分還原抗體之半胱胺酸殘基中的硫原子。 用於離胺酸偶合之通用程序

在實例中所描述之結構式中，AK ₂可意謂：實例a：抗EGFR mAb (西妥昔單抗)(TPP981) 實例e：抗Her2 mAb (TPP1015) 實例k-7007：抗TWEAKR mAb (TPP-7007) 實例k-2658：抗TWEAKR mAb (TPP-2658)

實例k-2090：抗TWEAKR mAb (TPP-2090) 實例c：抗CD123 mAb (TPP-9476) 實例x：抗CXCR5 mAb (TPP-9574) 其中 § ²表示連至羰基的鍵，且 NH表示抗體之離胺酸殘基中的側鏈胺基。 A2DC 之分析性表徵 藉由 SEC-UV 進行之藥物負載量測定及純度評定

A2DC 濃度之測定

對於 Cys 偶合之 A2DC，已在去醣基化及還原之後量測個別結合物物質之分子量之測定。用20 mM磷酸鈉(pH 6.5)稀釋約160 pmol之結合物，最終體積25 µl。添加1 µl PNGase F，且在37℃，於平緩振盪(Thermomixer)下培育樣本過夜。在60℃下，藉由20 µl 5M Gu*HCl (鹽酸胍於50 mM三乙基碳酸氫銨)及約5 min沸騰使10 µl之去醣基化樣本變性。為了還原蛋白質，添加溶解於水中之0.5 µl之255 mM DTT且在60℃培育混合物約10 min。用2 µl之10%甲酸/水酸化經冷卻樣本，接著如上文所描述藉由質譜法進行分析。為進行DAR測定，將TIC (總離子層析圖)中相對於信號的所有光譜相加，且基於輕鏈及重鏈之MaxEnt解迴旋來計算不同結合物物質之分子量。根據藉由以HC負載量及LC負載量之總和之兩倍進行積分而測定的峰面積，計算具有發毒團之抗體的平均負載量，而HC負載量為所有重鏈(HC)峰之發毒團數目加權積分結果之總和除以HC峰之單個加權積分結果之總和，且LC負載量為輕鏈(LC)峰之發毒團數目加權積分結果之總和除以所有LC峰之單個加權積分結果之總和。

對於 Lys 偶合之 A2DC，已在去醣基化之後量測個別結合物物質之分子量的測定。用20 mM磷酸鈉(pH 6.5)稀釋約160 pmol之結合物，最終體積25 µl。添加1 µl PNGase F，且在37℃，於平緩振盪(Thermomixer)下培育樣本過夜。用2 µl 之10%甲酸/水酸化5 µl去醣基化樣本，接著用0.1%甲酸/水稀釋至1 pmol/µl的濃度。如上文所描述藉由質譜法分析3 µl。為了進行DAR測定，將TIC (總離子層析圖)中相對於信號的所有光譜相加，且基於具有不同數目個發毒團之完整抗體之MaxEnt解迴旋來計算不同結合物物質之分子量。藉由對發毒團數目加權峰面積求和及除以未加權峰面積之總和來計算DAR。檢查 A2DC 之抗原結合

偶合已發生之後，檢查結合於目標分子的能力。熟習此項技術者熟悉可用於此目的之多種方法；例如結合物之親和力可使用ELISA技術或表面電漿子共振分析(BIA-core™量測)來檢查。熟習此項技術者可使用習用方法量測結合物濃度，例如藉由蛋白質測定對抗體結合物進行量測(亦參見Doronina等人; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784及Poison等人, Blood 2007; 1102:616- 623)。分析方法(LC-MS)

方法1 (LC-MS)：儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50×1 mm；移動相A：1 L水+ 0.25 mL 99%濃度甲酸，移動相B：1 L乙腈+ 0.25 mL 99%濃度甲酸；梯度：0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A；烘箱：50℃；流動速率：0.40 ml/min；UV偵測：208-400 nm。

方法2 (LC-MS)：系統MS：Thermo Scientific FT-MS；系統UHPLC+：Thermo Scientific UltiMate 3000；管柱：Waters，HSST3，2.1×75 mm，C18 1.8 µm；溶離劑A：1 l水+ 0.01%甲酸；溶離劑B：1 l乙腈+ 0.01%甲酸；梯度：0.0 min 10% B → 2.5 min 95% B → 3.5 min 95% B；烘箱：50℃；流量：0.90 ml/min；UV-偵測：210 nm/ Optimum Integration Path 210-300 nm

方法3 (LC-MS)：儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 50×1 mm；溶離劑A：1 l水+ 0.25 ml 99%ige甲酸，溶離劑B：1 l乙腈+ 0.25 ml 99%ige甲酸；梯度：0.0 min 95% A → 6.0 min 5% A → 7.5 min 5% A，烘箱：50℃；流量：0.35 ml/min；UV偵測：210 nm。

方法4 (LC-MS)：系統MS：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；系統HPLC：Agilent 1200SL；管柱：Agilent，POROSHELL 120，3×150 mm，SB - C18 2.7 µm；溶離劑A：1 l水+ 0.1%三氟乙酸；溶離劑B：1 l乙腈+ 0.1%三氟乙酸；梯度：0.0 min 2% B → 0.3 min 2% B → 5.0 min 95% B → 10.0 min 95% B；烘箱：40℃；流量：0.75 ml/min；UV偵測：210 nm

方法5 (LC-MS)：系統MS：Waters TOF儀器；系統UPLC：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters，HSST3，2.1×50 mm，C18 1.8 µm；溶離劑A：1 l水+ 0.01%甲酸；溶離劑B：1 l乙腈+ 0.01%甲酸；梯度：0.0 min 2% B → 0.5 min 2% B → 7.5 min 95% B → 10.0 min 95% B；烘箱：50℃；流量：1.00 ml/min；UV偵測：210 nm

方法6 (LC-MS)：系統MS: Waters TOF儀器；系統UPLC：Waters Acquity I-CLASS；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µm 50×1 mm；溶離劑A：1 l水+ 0.100 ml 99%ige甲酸，溶離劑B：1 l乙腈+ 0.100 ml 99%ige甲酸；梯度：0.0 min 90% A →1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A 烘箱：50℃；流量：0.40 ml/min；UV偵測：210 nm。連接子中間物 中間物 1

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸(750 mg，3.36 mmol)於DMF (25 mL)中之溶液中補充N-甲基-L-丙胺酸三級丁酯鹽酸鹽(723 mg，3.70 mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.6 mL，9.1 mmol)及HATU (1.66 g, 4.37 mmol)，且在室溫下攪拌反應物30分鐘。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到1.14 g產物。LC-MS (方法1)：Rt = 1.01 min；MS (ESIpos)：m/z = 364 (M+H) ⁺ 中間物 2

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸

將三級丁基-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸酯(1.14 g，3.11 mmol)稀釋於二氯甲烷(20 mL)中。添加三氟乙酸(20 mL)且在室溫攪拌反應物1小時。減壓濃縮混合物，且將殘餘物稀釋於乙腈/水中並凍乾，得到1.16 g產物。LC-MS (方法1)：Rt = 0.68 min；MS (ESIpos)：m/z = 308 (M+H) ⁺。 中間物 3

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸(592 mg，1.92 mmol)於DMF (32 mL)中之溶液補充L-天冬醯胺酸三級丁酯(398 mg，2.11 mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.0 mL，5.8 mmol)及HATU (949 mg，2.50 mmol)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到898 mg產物。LC-MS (方法1)：Rt = 0.75 min；MS (ESIpos)：m/z = 478 (M+H) ⁺。 中間物 4

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸

將三級丁基-N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸酯(2.81 g，5.88 mmol)稀釋於二氯甲烷(66 mL)中。添加三氟乙酸(33 mL)且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到848 mg產物。LC-MS (方法1)：Rt = 0.57 min；MS (ESIpos)：m/z = 422 (M+H) ⁺ 中間物 5

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸

如WO2017/162663中所描述製備標題化合物。 中間物 6

L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸

如WO2017/162663中所描述製備標題化合物。 中間物 7

N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸

向L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸(270 mg，984 µmol)於DMF (20 ml)中之溶液中添加1-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮(306 mg，1.18 mmol)及 N, N-二異丙基乙胺(210 µl，1.2 mmol])，且在室溫攪拌反應物4小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到247 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.77 min；MS (ESIpos)：m/z = 419 (M+H) ⁺ 中間物 8

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-天冬胺酸4-苯甲酯1-三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(719 mg，2.24 mmol；CAS3401-36-3)及L-天冬胺酸4-苯甲酯1-三級丁酯(700 mg，2.04 mmol)於DMF (9 mL)中之溶液中添加 N, N-二異丙基乙胺(1.2 ml，7.1 mmol)。在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到988 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.11 min；MS (ESIpos)：m/z = 485 (M+H) ⁺ 中間物 9

(2S)-4-(苯甲基氧基)-2-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧丁酸

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-天冬胺酸4-苯甲酯1-三級丁酯(988 mg，1.96 mmol)於二氯甲烷(2.0 ml)中之溶液中添加三氟乙酸(2.0 ml)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，得到870 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.86 min；MS (ESIpos)：m/z = 429 (M+H) ⁺ 中間物 10

(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-[2-(苯甲基氧基)-2-側氧基乙基]-5-甲基-3,6,9-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十二烷-12-酸三級丁酯

將 N, N-二異丙基乙胺(1.9 ml，11 mmol；CAS-RN:[7087-68-5])緩慢添加至(2S)-4-(苯甲基氧基)-2-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧丁酸(988 mg，2.21 mmol)、L-天冬醯胺酸三級丁酯(511 mg，2.65 mmol)及HATU(1.01 g，2.65 mmol；CAS-RN:148893-10-1)於DMF (10 ml)中之溶液中，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到988 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.93 min；MS (ESIpos)：m/z = 599 (M+H) ⁺ 中間物 11

(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-[2-(苯甲基氧基)-2-側氧基乙基]-5-甲基-3,6,9-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十二烷-12-酸

將(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-[2-(苯甲基氧基)-2-側氧基乙基]-5-甲基-3,6,9-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十二烷-12-酸三級丁酯(989 mg，1.65 mmol)溶解於二氯甲烷(5.0 ml)及三氟乙酸(5.0 ml)之混合物中，且在室溫攪拌反應物1小時。減壓濃縮混合物，且將殘餘物稀釋於二乙醚中。濾出固體，得到850 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.76 min；MS (ESIpos)：m/z = 543 (M+H) ⁺ 中間物 12

(2S)-2-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-三級丁氧基-5-側氧基戊醯基]胺基}戊二酸1-苯甲酯5-三級丁酯

向L-麩胺酸1-苯甲酯5-三級丁酯-鹽酸(100 mg，303 µmol)及(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-三級丁氧基-5-側氧基戊酸(102 mg，303 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加HATU (138 mg，364 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(160 µl，910 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到166 mg產物。LC-MS (方法2)：R _t= 2.44 min；MS (ESIpos)：m/z = 613 (M+H) ⁺ 中間物 13

(4S)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-{[(2S)-1-(苯甲基氧基)-4-羧基-1-側氧基丁-2-基]胺基}-5-側氧基戊酸

將(2S)-2-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-三級丁氧基-5-側氧基戊醯基]胺基}戊二酸1-苯甲酯5-三級丁酯(166 mg，271 µmol)溶解於三氟乙酸(5.0 ml)及二氯甲烷(10 ml)之混合物中，且在室溫攪拌反應物1小時。減壓濃縮混合物，且將殘餘物稀釋於乙腈/水中並凍乾，得到134 mg產物。LC-MS (方法2)：Rt = 1.44 min；MS (ESIpos)：m/z = 501 (M+H) ⁺ 中間物 14

N-(三級丁氧羰基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸

向N-甲基-L-丙胺酸(500 mg，4.85 mmol)於DMF (50 ml)中之溶液中添加N-(三級丁氧羰基)-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1.53 g，5.33 mmol)及 N, N-二異丙基乙胺(1.7 ml，9.7 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物14小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2.1 g產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.63 min；MS (ESIpos)：m/z = 275 (M+H) ⁺ 中間物 15

N-[(苯甲基氧基)羰基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-β-丙胺酸(755 mg，3.38 mmol)及D-麩胺酸二-三級丁酯-鹽酸(1.00 g，3.38 mmol)於DMF (20 ml)中之溶液中添加HATU (1.67 g，4.39 mmol；CAS-148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(1.2 ml，6.8 mmol；CAS-7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且將殘餘物溶解於二氯甲烷及水中。濃縮有機相，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到1.4 g產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.07 min；MS (ESIpos)：m/z = 465 (M+H) ⁺ 中間物 16

β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(1.44 g，3.10 mmol)於甲醇/DCM (200 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(100 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物凍乾，得到1.01 g標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.61 min；MS (ESIpos)：m/z = 331 (M+H) ⁺ 中間物 17

N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(80.7 mg，225 µmol)及溴乙酸酐(61.3 mg，236 µmol)於二氯甲烷(9.8 ml)中之溶液中添加 N, N-二異丙基乙胺(120 µl，670 µmol)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型管柱層析純化殘餘物，得到70 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.91 min；MS (ESIpos)：m/z = 451 (M+H) ⁺ 中間物 18

N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

將N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(69.5 mg，154 µmol)溶解於DCM/TFA之混合物(2 ml，1:1)中，且在室溫攪拌反應物1小時。減壓濃縮混合物，且將殘餘物稀釋於乙腈/水中並凍乾。藉由製備型HPLC純化粗產物，得到45 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.19 min；MS (ESIpos)：m/z = 339 (M+H) ⁺ 中間物 19

N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸三級丁酯

向N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺酸(1.92 g，6.16 mmol)及N-甲基-L-丙胺酸三級丁酯-鹽酸(1.33 g，6.78 mmol)於DMF (30 ml)中之溶液中添加HATU (3.05 g，8.01 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(2.9 ml，17 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物15 min。添加水(5 mL)及0.1% TFA之混合物，且將反應物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2.6 g產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.23 min；MS (ESIpos)：m/z = 453 [M+H] ⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (0.59), 0.008 (0.45), 1.175 (0.50), 1.190 (2.41), 1.207 (2.21), 1.229 (2.37), 1.247 (2.34), 1.320 (0.41), 1.338 (0.50), 1.354 (2.74), 1.374 (16.00), 2.681 (0.79), 2.914 (4.60), 4.200 (0.60), 4.216 (0.69), 4.247 (1.71), 4.262 (0.76), 4.491 (0.51), 4.820 (0.60), 4.839 (0.61), 7.306 (0.73), 7.325 (1.76), 7.343 (1.15), 7.397 (1.19), 7.415 (1.97), 7.434 (0.88), 7.550 (0.56), 7.569 (0.55), 7.699 (0.71), 7.717 (1.25), 7.734 (0.67), 7.880 (2.10), 7.898 (1.96)。 中間物 20

N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸

將N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸三級丁酯(2.63 g，5.81 mmol)溶解於二氯甲烷(25 ml)中，且添加TFA (9.0 ml，120 mmol；CAS-RN:76-05-1)。在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮且高真空乾燥，得到2.9 g粗產物，其不經進一步純化即用於後續步驟中。LC-MS (方法1)：R _t= 0.90 min；MS (ESIpos)：m/z = 397 [M+H] ⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.017 (0.52), 1.036 (0.52), 1.110 (0.45), 1.179 (9.09), 1.197 (8.91), 1.262 (8.31), 1.280 (8.15), 1.358 (2.00), 1.375 (2.23), 2.328 (0.44), 2.366 (0.40), 2.523 (1.62), 2.670 (1.28), 2.689 (0.62), 2.709 (3.41), 2.731 (0.89), 2.890 (1.19), 2.909 (16.00), 4.184 (1.02), 4.200 (2.62), 4.218 (3.17), 4.253 (5.43), 4.268 (2.48), 4.274 (2.25), 4.455 (0.43), 4.473 (1.29), 4.491 (1.86), 4.509 (1.29), 4.528 (0.44), 4.927 (0.76), 4.945 (2.18), 4.963 (2.13), 4.981 (0.68), 7.307 (3.01), 7.325 (7.17), 7.344 (4.71), 7.396 (4.68), 7.415 (7.65), 7.433 (3.40), 7.557 (1.94), 7.576 (1.91), 7.702 (3.07), 7.720 (5.18), 7.738 (2.46), 7.879 (8.13), 7.898 (7.54)。 中間物 21

N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸三級丁酯

向N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸(2.30 g，5.81 mmol)及L-天冬醯胺酸三級丁酯(1.20 g，6.39 mmol)於DMF (25 ml)中之溶液中添加HATU (2.87 g，7.55 mmol；CAS-RN:[148893-10-1])及N,N-二異丙基乙胺(2.7 ml，16 mmol；CAS-RN:[7087-68-5])，且在室溫攪拌反應物15 min。藉由添加水(5 mL)及0.1% TFA來淬滅反應物，且將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到3.4 g產物。LC-MS (方法2)：R _t= 1.83 min；MS (ESIpos)：m/z = 567 [M+H] ⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (2.08), 0.008 (1.62), 1.193 (2.42), 1.209 (3.20), 1.224 (1.97), 1.330 (2.14), 1.342 (1.21), 1.374 (16.00), 2.477 (0.78), 2.518 (1.19), 2.688 (0.59), 2.847 (3.65), 4.203 (0.84), 4.219 (0.77), 4.259 (0.88), 4.273 (1.08), 4.290 (0.59), 4.413 (0.43), 4.430 (0.50), 4.446 (0.51), 4.463 (0.55), 4.481 (0.43), 5.019 (0.52), 5.036 (0.50), 5.754 (3.73), 6.933 (0.63), 7.307 (0.97), 7.325 (2.23), 7.344 (1.63), 7.356 (0.71), 7.396 (1.46), 7.415 (2.36), 7.433 (1.04), 7.603 (0.61), 7.622 (0.61), 7.701 (0.97), 7.719 (1.51), 7.736 (0.70), 7.879 (2.74), 7.898 (2.59)。 中間物 22

L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸三級丁酯

向N-{[(9H-茀-9-基)甲氧基]羰基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸三級丁酯(150 mg，220 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加DBU (75 µl，500 µmol；CAS-RN:6674-22-2)，且在室溫攪拌反應物1小時。粗產物不經進一步純化即使用。 中間物23

N-(2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}乙基)-N ²,N ⁶-雙(三級丁氧羰基)-L-離胺醯胺

如WO2016/207089 L108中所描述來製備。 中間物 24

N-(2-胺基乙基)-N ²,N ⁶-雙(三級丁氧羰基)-L-離胺醯胺

如WO2016/207089 L108中所描述來製備。 中間物 25

N ²,N ⁶-雙(三級丁氧羰基)-N-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]乙基}-L-離胺醯胺

向N-(2-胺基乙基)-N2,N6-雙(三級丁氧羰基)-L-離胺醯胺(50.0 mg，129 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(38.9 mg，154 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(45 µl，260 µmol；CAS-7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到51 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.78 min；MS (ESIpos)：m/z = 526 [M+H] ⁺。 中間物 26

N-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]乙基}-L-離胺醯胺

向N2,N6-雙(三級丁氧羰基)-N-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]乙基}-L-離胺醯胺(51.0 mg，97.0 µmol)於二氯甲烷(5.0 ml)中之溶液中添加三氟乙酸(1.0 ml)，且在室溫攪拌反應物2.5 h。減壓濃縮混合物，且將殘餘物稀釋於乙腈/水中並凍乾，得到33 mg產物。 中間物 27

N-(三級丁氧羰基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯

將N-(三級丁氧羰基)-L-纈胺酸(500 mg，2.3 mmol)溶解於10 ml N,N-二甲基甲醯胺中，接著添加L-丙胺酸苯甲酯鹽酸鹽(496 mg，2.3 mmol)、六氟磷酸2-(7-氮雜-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(875 mg，2.3 mmol)及乙基二異丙胺(446 mg，3.5 mmol)。在室溫攪拌反應混合物2 h。用水淬滅反應物。藉由過濾收集固體，且用水洗滌濾液。使濾液乾燥後，獲得550 mg產物。 中間物 28

L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯

將N-(三級丁氧羰基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯(550 mg，1.45 mmol)溶解於20 ml二氯甲烷中，接著添加2 ml三氟乙酸。在室溫攪拌反應混合物5小時。將混合物真空蒸發，且與二氯甲烷共蒸餾3次，得到550 mg (粗)產物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。 中間物 29

1-({N ²-[(苯甲基氧基)羰基]-N-(17,17-二甲基-15-側氧基-3,6,9,12,16-五氧雜十八烷-1-基)-L-麩醯胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸三級丁酯

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩胺酸(50.0 mg，178 µmol)及1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸三級丁酯(126 mg，391 µmol)於DMF (3.0 ml)中之溶液中添加HATU (162 mg，427 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N, N-二異丙基乙胺(120 µl，710 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。藉由製備型HPLC純化混合物，得到156 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06 min；MS (ESIpos)：m/z = 888 [M+H] ⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.391 (16.00), 2.390 (0.77), 2.406 (1.62), 2.421 (0.81), 3.162 (0.41), 3.177 (0.45), 3.380 (0.71), 3.395 (0.45), 3.482 (5.36), 3.493 (7.85), 3.562 (1.41), 3.578 (2.15), 3.593 (1.16), 5.012 (0.70), 7.355 (1.17)。 中間物 30

1-({N ²-[(苯甲基氧基)羰基]-N-(14-羧基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-L-α-麩醯胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸

向1-({N2-[(苯甲基氧基)羰基]-N-(17,17-二甲基-15-側氧基-3,6,9,12,16-五氧雜十八烷-1-基)-L-α-麩醯胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸三級丁酯(152 mg，171 µmol)於二氯甲烷(10 ml)中之溶液中添加TFA (530 µl，6.9 mmol；CAS-RN:76-05-1)，且在室溫攪拌反應物12小時。將混合物減壓濃縮至乾燥且與二氯甲烷共蒸餾(3次)，得到131 mg標題產物。LC-MS (方法2)：R _t= 1.15 min；MS (ESIpos)：m/z = 776 [M+H] ⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: -0.008 (1.74), 0.008 (1.13), 1.073 (0.60), 1.091 (1.22), 1.108 (0.59), 2.418 (1.74), 2.434 (3.65), 2.450 (2.06), 2.523 (1.10), 3.164 (0.88), 3.179 (0.98), 3.193 (0.51), 3.357 (0.45), 3.367 (0.89), 3.375 (1.06), 3.382 (1.59), 3.392 (1.23), 3.397 (1.03), 3.486 (10.96), 3.497 (16.00), 3.577 (2.46), 3.593 (4.43), 3.609 (2.60), 3.681 (1.66), 3.928 (0.51), 3.943 (0.47), 5.013 (1.44), 7.356 (2.43), 7.890 (0.48)。 中間物 31

(2S,5S,8S,27S,48S,51S,54S)-2,54-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-27-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,6,8,48,50,51-六甲基-4,7,10,26,30,46,49,52-八側氧基-13,16,19,22,34,37,40,43-八氧雜-3,6,9,25,31,47,50,53-八氮雜戊五十烷-1,55-二酸二-三級丁酯

向1-({N2-[(苯甲基氧基)羰基]-N-(14-羧基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-L-麩醯胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸(38.8 mg，50.0 µmol)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加HATU (45.7 mg，120 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(35 µl，200 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌混合物10 min。添加L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸三級丁酯(37.9 mg，110 µmol)於DMF (1 ml，反應混合物參見中間物22)中之溶液，且攪拌該流份10 min。添加水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到24 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.77 min；MS (ESIneg)：m/z = 1426 [M-H] ^-。 中間物 32

(2S,5S,8S,27S,48S,51S,54S)-2,54-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-27-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,6,8,48,50,51-六甲基-4,7,10,26,30,46,49,52-八側氧基-13,16,19,22,34,37,40,43-八氧雜-3,6,9,25,31,47,50,53-八氮雜戊五十烷-1,55-二酸

將(2S,5S,8S,27S,48S,51S,54S)-2,54-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-27-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,6,8,48,50,51-六甲基-4,7,10,26,30,46,49,52-八側氧基-13,16,19,22,34,37,40,43-八氧雜-3,6,9,25,31,47,50,53-八氮雜戊五十烷-1,55-二酸二-三級丁酯(24.4 mg，17.1 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(3 ml)中。添加氯化鋅(14.0 mg，102 µmol)，且在50℃攪拌反應物。攪拌1小時之後，添加氯化鋅(14.0 mg，102 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。再次添加氯化鋅(14.0 mg，102 µmol)，且在50℃再攪拌反應物一小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(29.9 mg，102 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加2 ml水/0.1% TFA。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到15 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.59 min；MS (ESIneg)：m/z = 1314 [M-H] ^-。 中間物 33

N-(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯

將2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸(5 g，13.7 mmol，CAS-RN:756525-91-4)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(42 ml)中，添加L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯(5.3 g，13.7 mmol)、HATU (5.2 g，13.7 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及乙基二異丙胺(2.6 g 20.5 mmol)。在室溫攪拌反應混合物2小時。用水淬滅反應物，且用乙酸乙酯萃取混合物。有機相經硫酸鈉乾燥，過濾，且蒸發至乾燥。藉由使用二氯甲烷/甲醇(20:1/v:v)之管柱層析純化粗物質，得到5.0 g產物。 中間物 34

N-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯

將N-(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯(8.00 g，12.8 mmol)溶解於二氯甲烷(200 ml)中，添加三氟乙酸(20 ml)，且在室溫攪拌反應混合物5小時。將混合物真空蒸發且與二氯甲烷共蒸餾3次，得到8.0 g (粗)產物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。 中間物 35

(2S,5S,24S,45S,48S)-24-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸二苯甲酯

將N-(三級丁氧羰基)-L-麩胺酸(1.55 g，6.25 mmol；CAS-RN:2419-94-5)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(50 ml)中，接著添加N-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯(8.00 g，12.5 mmol)、HATU (4.76 g，12.5 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及乙基二異丙胺(2.4 g, 18.8 mmol)。在室溫攪拌反應混合物2 h。用水淬滅反應物，且用乙酸乙酯萃取混合物。有機相經硫酸鈉乾燥，過濾，且蒸發至乾燥。藉由使用二氯甲烷/甲醇(20:1/v:v)之管柱層析純化粗物質，得到3.0 g產物。LC-MS：R _t= 1.49 min；MS (ESIpos)：m/z = 402 [M+H] ⁺ 中間物 36

(2S,5S,24S,45S,48S)-24-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸

將(2S,5S,24S,45S,48S)-24-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸二苯甲酯(100 mg，79.2 µmol)溶解於甲醇(10 ml)中。添加鈀/活性碳10% (20 mg)。在氫氣惰性氛圍下，在室溫攪拌反應混合物2 h。接著過濾粗物質，用甲醇洗滌且蒸發至乾燥，得到70 mg產物。 中間物 37

(2S,5S,24S,45S,48S)-24-胺基-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸

將(2S,5S,24S,45S,48S)-24-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸(70.0 mg，64.7 µmol)溶解於二氯甲烷(10 ml)中，添加三氟乙酸(0.5 ml)，且在室溫攪拌反應混合物2小時。將混合物真空蒸發，且與二氯甲烷共蒸餾3次，得到70 mg產物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。 中間物 38

(2S,5S,24S,45S,48S)-24-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸

將1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(562 mg，1.82 mmol；CAS-RN:55750-63-5)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(50 ml)中，添加(2S,5S,24S,45S,48S)-24-胺基-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸(2.00 g，1.82 mmol)及乙基二異丙胺(354 mg，2.7 mmol)。在室溫攪拌反應混合物2 h。將反應物用水淬滅且蒸發至乾燥。藉由製備型HPLC純化粗物質，得到879 mg產物。LC-MS : R _t= 1.00 min；MS (ESIpos)：m/z = 1175 [M+H] ⁺ 中間物 39

(2S,5S,8S,13S,16S)-8-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸二苯甲酯

將N-(三級丁氧羰基)-L-麩胺酸(173 mg，701 µmol；CAS-RN:2419-94-5)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10 ml)中，添加L-纈胺醯基-L-丙胺酸苯甲酯(550 mg，1.40 mmol)、HATU (533 mg，1.40 mmol；CAS-RN:[148893-10-1])及乙基二異丙胺(272 mg，2.10 mmol)，且在室溫攪拌反應混合物2 h。用水淬滅反應物。濾出固體且用水洗滌殘餘物。將濾液蒸發至乾燥，得到400 mg產物。 中間物 40

(2S,5S,8S,13S,16S)-8-胺基-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸二苯甲酯

將(2S,5S,8S,13S,16S)-8-[(三級丁氧羰基)胺基]-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸二苯甲酯(400 mg，521 µmol)溶解於10 ml二氯甲烷中，添加1.5 ml三氟乙酸。在室溫攪拌反應混合物5小時。將混合物真空蒸發，且與二氯甲烷共蒸餾3次，得到400 mg粗產物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。 LC-MS方法5：R _t= 0.97 min；MS (ESIpos)：m/z = 668 [M+H] ⁺ 中間物 41

(2S,5S,8S,13S,16S)-8-胺基-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸

將(2S,5S,8S,13S,16S)-8-胺基-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸二苯甲酯(200 mg，256 µmol)溶解於15 ml甲醇中。添加鈀/活性碳10% Pd (50 mg)，且在氫氣惰性氛圍下，在室溫攪拌反應混合物2 h。接著過濾混合物，且用甲醇洗滌固體。將濾液減壓蒸發至乾燥，得到100 mg產物。 中間物 42

(2S,5S,8S,13S,16S)-8-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸

將1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1.14 g，3.69 mmol；CAS-RN:55750-63-5)溶解於50 ml N,N-二甲基甲醯胺中，添加(2S,5S,8S,13S,16S)-8-胺基-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸(1.50 g, 3.08 mmol)及乙基二異丙胺(398 mg，3.1 mmol)。在室溫攪拌反應混合物12小時。反應物藉由水淬滅且蒸發至乾燥。藉由製備型HPLC純化粗物質兩次，得到260 mg產物。LC-MS：R _t= 1.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 682 [M+H] ⁺。 中間物 43

N ²,N ⁶-雙[(苯甲基氧基)羰基]-N-{2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}-L-離胺醯胺

向N2,N6-雙[(苯甲基氧基)羰基]-L-離胺酸(30.0 mg，72.4 µmol)及(2-胺基乙基)胺基甲酸三級丁酯(13 µl，80 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加HATU (33.0 mg，86.9 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(38 µl，220 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且將殘餘物溶解於乙腈/水/二㗁烷之混合物中，且藉由製備型HPLC純化，得到35 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 557 [M+H] ⁺。 中間物 44

N-{2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}-L-離胺醯胺

向N2,N6-雙[(苯甲基氧基)羰基]-N-{2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}-L-離胺醯胺(35.0 mg，62.9 µmol)於乙醇(10 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(5 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到21 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.16 min；MS (ESIpos)：m/z = 289 [M+H] ⁺。 KSPi中間物 中間物 45

(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺

如WO2006/002326中所描述製備標題化合物。 中間物 46

N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺

如WO2015/096982中所描述製備標題化合物。 中間物 47

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(三級丁氧羰基)胺基]丁酸

如WO2016/207089中所描述製備標題化合物。 中間物 48

N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯

如WO2018/114798中所描述製備標題化合物。 中間物 49

N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N ²-[(苯甲基氧基)羰基]-D-α-麩醯胺苯甲酯

如WO2016/207089中所描述製備標題化合物。 中間物 50

N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

如WO2018/114798中所描述製備標題化合物。 中間物 51

(3R,10S,13S,16S,35S,56S,59S,62S,69R)-10,62-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-35-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,59-二甲基-5,9,12,15,18,34,38,54,57,60,63,67-十二側氧基-16,56-二(丙-2-基)-21,24,27,30,42,45,48,51-八氧雜-4,8,11,14,17,33,39,55,58,61,64,68-十二氮雜七十一烷-1,3,69,71-四甲酸四三級丁酯

向(2S,5S,24S,45S,48S)-24-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-2,48-二甲基-4,7,23,27,43,46-六側氧基-5,45-二(丙-2-基)-10,13,16,19,31,34,37,40-八氧雜-3,6,22,28,44,47-六氮雜四十九烷-1,49-二酸(20.0 mg，17.0 µmol)及N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(28.1 mg，34.0 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加HATU (15.5 mg，40.8 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(12 µl，68 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。將乙酸乙酯添加至混合物中，且用鹽水(20 ml)洗滌混合物3次。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾，且蒸發至乾燥。藉由管柱層析純化粗物質，得到32 mg產物。LC-MS (方法4)：R _t= 7.71min；MS (ESIpos)：m/z = 1418[M+2Na] ²⁺。 中間物 52

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸

如WO2015/096982中所描述製備標題化合物。 中間物 53

[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸2-(三甲基矽基)乙酯

向(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸(400 mg，608 µmol)於DMF (67 ml)中之溶液中添加N-甲基-β-丙胺醯胺(68.3 mg，669 µmol)、HATU (277 mg，730 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(320 µl，1.8 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到368 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.30 min；MS (ESIpos)：m/z = 742 [M+H] ⁺。 中間物 54

(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-N-[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]丁醯胺

將[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸2-(三甲基矽基)乙酯(368 mg，496 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(8 ml)中。添加氯化鋅(406 mg，2.98 mmol)，且在50℃攪拌反應物2小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(870 mg，2.98 mmol；CAS-RN:60-00-4)，接著添加2 ml水/0.1% TFA，且攪拌混合物幾分鐘。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到306 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.83 min；MS (ESIpos)：m/z = 598 [M+H] ⁺。 中間物 55

(2R)-2-{[(5S,8S,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-14-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,7,8-三甲基-3,6,9,12,15,19-六側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十九烷-19-基]胺基}戊二酸二苯甲酯

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備標題化合物。 中間物 56

L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備標題化合物。 中間物 57

N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(36.0 mg，30.1 µmol)於DMF (8.5 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(10 µl，60 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20小時。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到31 mg產物。LC-MS (方法4)：R _t= 1.12 min；MS (ESIpos)：m/z = 1416 [M+H] ⁺。 中間物 58

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備標題化合物。 中間物 59

N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(31.0 mg，21.9 µmol)於甲醇/DCM (25 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(8.2 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到28 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.84 min；MS (ESIpos)：m/z = 1282 [M+H] ⁺。 中間物 60

(8S,11S,14S,17S,24R)-14-(2-胺基-2-側氧基乙基)-17-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-24-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-2,2,8,11-四甲基-6,9,12,15,18,23-六側氧基-5-氧雜-7,10,13,16,19,22-六氮雜-2-矽雜二十七烷-27-酸苯甲酯

向N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(苯甲基氧基)羰基]-D-α-麩醯胺苯甲酯(213 mg，208 µmol)及N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸(122 mg，291 µmol)於DMF(15 ml)中之溶液中添加HATU (158 mg，416 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(110 µl，620 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到202 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.37 min；MS (ESIpos)：m/z = 1309 [M+H] ⁺。 中間物 61

N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-({2-[(D-α-麩胺醯基)胺基]乙基}胺基)-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向(8S,11S,14S,17S,24R)-14-(2-胺基-2-側氧基乙基)-17-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-24-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-2,2,8,11-四甲基-6,9,12,15,18,23-六側氧基-5-氧雜-7,10,13,16,19,22-六氮雜-2-矽雜二十七烷-27-酸酯(202 mg，154 µmol)於甲醇(20 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(20 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到127 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 1085 [M+H] ⁺。 中間物 62

N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-({2-[(D-α-麩胺醯基)胺基]乙基}胺基)-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(127 mg，117 µmol)及1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(41.3 mg，164 µmol)於DMF (14 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(61 µl，350 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到107 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.13 min；MS (ESIpos)：m/z = 1223 [M+H] ⁺。 中間物 63

L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

將N-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(107 mg，87.5 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(10 ml)中。添加氯化鋅(71.6 mg，525 µmol；CAS-RN:7646-85-7)，且在50℃攪拌反應物5小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(153 mg，525 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加乙腈/水。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到77 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.81 min；MS (ESIpos)：m/z = 1078 [M+H] ⁺。 中間物 64

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺)(180 mg，151 µmol)及1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(148 mg，453 µmol)於DMF (15 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(79 µl，450 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到159 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.93 min；MS (ESIpos)：m/z = 1290 [M+H] ⁺。 中間物 65

(3R,10S,13S,16S,19S,27S,39S,42S,45S,48S,55R)-13,45-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,48-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-27-(三級丁氧羰基)-55-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-16,17,19,39,42-五甲基-5,9,12,15,18,21,25,33,37,40,43,46,49,54-十四側氧基-4,8,11,14,17,20,26,32,38,41,44,47,50,53-十四氮雜五十七烷-1,3,57-三甲酸

向N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(24.9 mg，19.4 µmol)於DMF (8.3 ml)中之溶液中添加N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(25.0 mg，19.4 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(10 µl，58 µmol；CAS-RN7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到32 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.11 min；MS (ESIpos)：m/z = 1228 [M+2H] ²⁺. 中間物 66

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備化合物。 中間物 67

N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備化合物。 中間物 68

N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備化合物。 中間物 69

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(N ²-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-天冬醯胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備化合物。 中間物 70

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

向N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(N2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-天冬醯胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(38.0 mg，36.6 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加N6-[(苯甲基氧基)羰基]-L-離胺酸三級丁酯(14.8 mg，43.9 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(13 µl，73 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到32 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS (ESIpos)：m/z = 1260 [M+H] ⁺。 中間物 71

N-{(2S)-2-{[N ²-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸

向N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(32.0 mg，25.4 µmol)於甲醇/DCM (25 ml,1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(10 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到29 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.85 min；MS (ESIpos)：m/z = 1126 [M+H] ⁺。 中間物 72

(3R,10S,13S,21S,33S,36S,39S,42S,49R)-13,39-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,42-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-(三級丁氧羰基)-49-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-33,36-二甲基-5,9,12,15,19,27,31,34,37,40,43,48-十二側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,41,44,47-十二氮雜五十一烷-1,3,51-三甲酸

向N-{(2S)-2-{[N ²-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(18.0 mg，16.0 µmol)於DMF (7.0 ml)中之溶液中添加N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(20.6 mg，16.0 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(8.4 µl，48 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到14 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.10 min；MS (ESIpos)：m/z = 1151 [M+2H] ²⁺。 中間物 73

N-{3-[2-(2-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(80.0 mg，61.2 µmol)及1,1'-{氧基雙[(乙烷-2,1-二基)氧基(1-側氧基丙烷-3,1-二基)氧基]}二(吡咯啶-2,5-二酮)(81.7 mg，184 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(43 µl，240 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。添加水/0.1% TFA (1 ml)之混合物，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到56 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.16 min；MS (ESIpos)：m/z = 1407 [M+H] ⁺。 中間物 74

L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

如Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1893−1898中所描述製備標題化合物。 中間物 75

N-(3-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(100 mg，76.6 µmol)及1,1'-{氧基雙[(1-側氧基丙烷-3,1-二基)氧基]}二(吡咯啶-2,5-二酮)(81.8 mg，230 µmol)於DMF (3.0 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(53 µl，310 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。添加水/0.1% TFA (1 ml)，藉由製備型HPLC純化混合物，得到63 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.94 min；MS (ESIneg)：m/z = 1317 [M-H] ^-。 中間物 76

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(100 mg，121 µmol)及N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(43.9 mg，133 µmol；CAS-RN:42002-18-6)於DMF (3.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(63 µl，360 µmol；CAS-RN:[7087-68-5])，且在室溫攪拌反應物3天。添加水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到89 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.39 min；MS (ESIpos)：m/z = 1040 [M+H] ⁺。 中間物 77

將N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(89.2 mg，85.8 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(3 ml)中。添加氯化鋅(70.1 mg，515 µmol)，且在50℃攪拌反應物。攪拌1小時之後，添加氯化鋅(70.1 mg，515 µmol)且在50℃攪拌反應物。一小時之後，再添加氯化鋅(70.1 mg，515 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(150 mg，515 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物幾分鐘。過濾反應物，且用乙腈洗滌固體。減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到37 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.78 min；MS (ESIpos)：m/z = 828 [M+H] ⁺。 中間物 78

(8S,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-14-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-3,7,10,13-四側氧基-2,6,9,12-四氮雜十六烷-16-酸苯甲酯

向(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-N-[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]丁醯胺(100 mg，141 µmol)於DMF (15 ml)中之溶液中添加(5S,8S,11S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-[2-(苯甲基氧基)-2-側氧基乙基]-5-甲基-3,6,9-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10-三氮雜十二烷-12-酸(98.6 mg，155 µmol)、HATU (64.1 mg，169 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(73 µl，420 µmol；CAS-RN:[7087-68-5])，且在室溫攪拌反應物60 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到112 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.16 min；MS (ESIpos)：m/z = 1122 [M+H] ⁺。 中間物 79

L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向(8S,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-14-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-3,7,10,13-四側氧基-2,6,9,12-四氮雜十六烷-16-酸苯甲酯(112 mg，99.8 µmol)於甲醇/DCM (20 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(20 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到80 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.80 min；MS (ESIpos)：m/z = 898 [M+H] ⁺。 中間物 80

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(80.0 mg，89.1 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(72.7 mg，223 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(47 µl，270 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到57 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.91 min；MS (ESIpos)：m/z = 1109 [M+H] ⁺。 中間物 81

N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(57.0 mg，51.4 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加N ⁶-[(苯甲基氧基)羰基]-L-離胺酸三級丁酯(20.7 mg，61.7 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(18 µl，100 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到58 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.10 min；MS (ESIpos)：m/z = 1331 [M+H] ⁺。 中間物 82

N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺

向N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(58.0 mg，43.6 µmol)於甲醇/DCM (10 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(9.5 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到52 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.86 min；MS (ESIneg)：m/z = 1194 [M-H] ^-。 中間物 83

(3S,6S,14S,26S,29S,32S,35S,42R)-3-{[(2S)-4-胺基-1-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基}-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-32-(2-胺基-2-側氧基乙基)-35-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-14-(三級丁氧羰基)-42-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-6,26,29-三甲基-5,8,12,20,24,27,30,33,36,41-十側氧基-4,7,13,19,25,28,31,34,37,40-十氮雜四十五烷-1,45-二酸

向N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(26.4 mg，22.1 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(19.0 mg，14.7 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(5.1 µl，29 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到15 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS (ESIneg)：m/z = 1183 [M-2H] ^2-。 中間物 84

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(125 mg，214 µmol)於DMF (17 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸(96.2 mg，236 µmol)、HATU (244 mg，643 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(150 µl，860 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到122 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.17 min；MS (ESIpos)：m/z = 860 [M+H] ⁺。 中間物 85

L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(122 mg，142 µmol)於甲醇/DCM (30 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(10 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到120 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.85 min；MS (ESIpos)：m/z = 726 [M+H] ⁺。 中間物 86

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(35.0 mg，48.2 µmol)於DMF (4.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(23.6 mg，72.3 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(17 µl，96 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到30 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 937 [M+H] ⁺。 中間物 87

N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(18.5 mg，17.6 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N ⁶-[(苯甲基氧基)羰基]-L-離胺酸三級丁酯-鹽酸(6.56 mg，17.6 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(6.1 µl，35 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到11 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.20 min；MS (ESIpos)：m/z = 1158 [M+H] ⁺。 中間物 88

N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向N-(5-{[(2S)-6-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(11.2 mg, 9.67 µmol)於甲醇/DCM (10 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(4 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到10 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.88 min；MS (ESIpos)：m/z = 1124 [M+H] ⁺。 中間物 89

N-(5-{[(1S)-5-胺基-1-羧基戊基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺三氟乙酸鹽

將N-(5-{[(2S)-6-胺基-1-三級丁氧基-1-側氧基己-2-基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(9.90 mg，9.67 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(4 ml)中。添加氯化鋅(7.90 mg，58.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物3小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(16.9 mg，58.0 µmol；CAS-RN:60-00-4)，接著添加2 ml水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到12 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.83 min；MS (ESIpos)：m/z = 968 [M+H] ⁺。 中間物 90

向三氟乙酸—N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(370 mg，367 µmol)及N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(133 mg，404 µmol；CAS-RN:42002-18-6)於DMF (6.8 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(190 µl，1.1 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1.5小時。添加水/0.1% TFA，藉由製備型HPLC純化混合物，得到310 mg產物。LC-MS (方法2)：R _t= 2.54 min；MS (ESIpos)：m/z = 1108 [M+H] ⁺。 中間物 91

將N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} (羥基乙醯基)胺基]-2-{[N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(1.02 g，917 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(20 ml)中。添加氯化鋅(750 mg，5.50 mmol)，且在50℃攪拌反應物30 min。添加10 ml水/乙腈(1:1)、TFA (100 µl)及乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(1.61 g，5.50 mmol；CAS-RN:60-00-4)，且攪拌混合物幾分鐘。過濾混合物，減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化，得到745 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.05 min；MS (ESIpos)：m/z = 1008 [M+H] ⁺。 中間物 92

(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-12-(2-胺基-2-側氧基乙基)-15-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-2,2,6,8,9-五甲基-4,7,10,13,16,20-六側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十烷-20-基]胺基}戊二酸二苯甲酯

向N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(212 mg，189 µmol)及N-(三級丁氧羰基)-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺酸(62.2 mg，227 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加HATU (86.2 mg，227 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(99 µl，570 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到166 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.32 min；MS (ESIpos)：m/z = 1265 [M+H] ⁺。 中間物 93

(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12,13-二甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯

將(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-12-(2-胺基-2-側氧基乙基)-15-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-2,2,6,8,9-五甲基-4,7,10,13,16,20-六側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十烷-20-基]胺基}戊二酸二苯甲酯(213 mg，168 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(7 ml)中。添加氯化鋅(138 mg，1.01 mmol)，且在50℃攪拌反應物1.5小時。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(295 mg，1.01 mmol；CAS-RN:60-00-4)，且攪拌混合物幾分鐘，之後添加水/0.1% TFA。將混合物過濾並減壓濃縮，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到189 mg產物。LC-MS (方法3)：R _t= 3.56 min；MS (ESIpos)：m/z = 1164 [M+H] ⁺。 中間物 94

(2R)-2-{[(10S,13S,16S,19S,22S)-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-10-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-2,2,13,15,16-五甲基-4,11,14,17,20,23,27-七側氧基-3-氧雜-5,12,15,18,21,24-六氮雜二十七烷-27-基]胺基}戊二酸二苯甲酯

向(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12,13-二甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯(30.0 mg，23.5 µmol)及N ²-[(苯甲基氧基)羰基]-N ⁶-(三級丁氧羰基)-L-離胺酸(10.7 mg，28.2 µmol)於DMF (6.0 ml)中之溶液中添加HATU (10.7 mg，28.2 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(12 µl，70 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物60 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到32 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.39 min；MS (ESIpos)：m/z = 1525 [M+H] ⁺。 中間物 95

N ⁶-(三級丁氧羰基)-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向(2R)-2-{[(10S,13S,16S,19S,22S)-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-10-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-2,2,13,15,16-五甲基-4,11,14,17,20,23,27-七側氧基-3-氧雜-5,12,15,18,21,24-六氮雜二十七烷-27-基]胺基}戊二酸二苯甲酯(49.0 mg，32.1 µmol)於甲醇(10 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(5 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物3小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到39 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.87 min；MS (ESIpos)：m/z = 1212 [M+H] ⁺。 中間物 96

[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基甲酸苯甲酯

向N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺(1.00 g，1.71 mmol)於N,N-二異丙基乙胺(600 µl，3.4 mmol；CAS-RN:7087-68-5)中之溶液中添加N2-[(苯甲基氧基)羰基]-L-天冬醯胺酸4-硝基苯酯(1.19 g，3.08 mmol)及DMF (50 ml)，且在室溫攪拌反應物20小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到975 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.21min；MS (ESIpos)：m/z = 718 [M+H] ⁺。 中間物 97

N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基甲酸苯甲酯(975 mg，1.36 mmol)於甲醇/DCM (97 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(95 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到763 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.82 min；MS (ESIpos)：m/z = 584 [M+H] ⁺。 中間物 98

(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(763 mg，1.31 mmol)於DMF (75 ml)中之溶液中添加(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-三級丁氧基-4-側氧丁酸(549 mg，1.70 mmol)、HATU (746 mg，1.96 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(460 µl，2.6 mmol；CAS-RN:[7087-68-5])，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到914 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.28 min；MS (ESIpos)：m/z = 889 [M+H] ⁺。 中間物 99

(3S)-3-胺基-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(914 mg，1.03 mmol)於甲醇/DCM (75 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(50 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到814 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.89 min；MS (ESIpos)：m/z = 755 [M+H] ⁺。 中間物 100

(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3S)-3-胺基-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(841 mg，1.11 mmol)於DMF (64 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸(323 mg，1.45 mmol)、HATU (635 mg，1.67 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(390 µl，2.2 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到964 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.25 min；MS (ESIpos)：m/z = 960 [M+H] ⁺。 中間物 101

(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(964 mg，1.00 mmol)於甲醇/DCM (73 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(49 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到788 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.88 min；MS (ESIpos)：m/z = 826 [M+H] ⁺。 中間物 102

L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺—三氟乙酸(1/1)

將(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(109 mg，132 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(11 ml)中。添加氯化鋅(108 mg，792 µmol)，且在50℃攪拌反應物4小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(231 mg，792 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，接著添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到72 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.83 min；MS (ESIpos)：m/z = 770 [M+H] ⁺ 中間物 103

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(34.0 mg，38.5 µmol)於DMF (6.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(50.2 mg，154 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(20 µl，120 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到13 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.00 min；MS (ESIpos)：m/z = 981 [M+H] ⁺ 中間物 104

(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13-{4-[(三級丁氧羰基)胺基]丁基}-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸

向N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-α-天冬胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(20.5 mg，20.9 µmol)及N ⁶-(三級丁氧羰基)-L-離胺醯基-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(32.5 mg，23.2 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(12 µl，70 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物4小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到13 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.21 min；MS (ESIneg)：m/z = 1037 [M-2H] ^2- 中間物 105

(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-13-(4-胺基丁基)-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸

將(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13-{4-[(三級丁氧羰基)胺基]丁基}-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸(12.5 mg，6.01 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5 ml)中。添加氯化鋅(4.9 mg，36.1 µmol)，且在50℃攪拌反應物5小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.5 mg，36.1 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到11 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.03 min；MS (ESIneg)：m/z = 1176 [M-H] ^- 中間物 106

(2R)-2-{[(5S,8R,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-14-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,8-二甲基-3,6,9,12,15,19-六側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十九烷-19-基]胺基}戊二酸二苯甲酯

向N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(120 mg，119 µmol)於DMF (15 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸(74.6 mg，143 µmol)、HATU (67.9 mg，179 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(62 µl，360 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到62 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.33 min；MS (ESIpos)：m/z = 1284 [M+H] ^2-+ 中間物 107

L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向(2R)-2-{[(5S,8R,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-14-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,8-二甲基-3,6,9,12,15,19-六側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十九烷-19-基]胺基}戊二酸二苯甲酯(78.4 mg，61.0 µmol)於甲醇/DCM (25 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(15 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到64 mg標題產物。

LC-MS (方法1)：R _t= 0.78 min；MS (ESIneg)：m/z = 968 [M-H] ^- 中間物 108

N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(69.0 mg，71.1 µmol)及1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(58.0 mg，178 µmol)於DMF (6.9 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(37 µl，210 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1.5小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到75 mg產物。LC-MS (METHOD 5)：R _t= 4.03 min；MS (ESIpos)：m/z = 1181 [M+H] ⁺ 中間物 109

(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(769 mg，1.32 mmol)於DMF (76 ml)中之溶液中添加(2R)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-三級丁氧基-4-側氧丁酸(554 mg，1.71 mmol)、HATU (751 mg，1.98 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(460 µl，2.6 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到820 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.29 min；MS (ESIpos)：m/z = 889 [M+H] ⁺ 中間物 110

(3R)-3-胺基-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(820 mg，922 µmol)於甲醇/DCM (60 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(40 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到685 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.85 min；MS (ESIpos)：m/z = 755 [M+H] ⁺ 中間物 111

(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3R)-3-胺基-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(685 mg，907 µmol)於DMF (52 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺酸(263 mg，1.18 mmol)、HATU (518 mg，1.36 mmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(320 µl，1.8 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到753 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.25 min；MS (ESIpos)：m/z = 960 [M+H] ⁺ 中間物 112

(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯

向(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(753 mg，784 µmol)於甲醇/DCM (50 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(40 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到618 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.92 min；MS (ESIpos)：m/z = 826 [M+H] ⁺ 中間物 113

(9S,12S,15R)-15-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-9-[(三級丁氧羰基)胺基]-12-甲基-3,10,13-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,11,14-三氮雜十七烷-17-酸三級丁酯

向(3R)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(150 mg，182 µmol)於DMF (15 ml)中之溶液中添加N6-[(苯甲基氧基)羰基]-N2-(三級丁氧羰基)-L-離胺酸(72.5 mg，191 µmol)、HATU (138 mg，363 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(95 µl，540 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物15 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到141 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.32 min；MS (ESIpos)：m/z = 1188 [M+H] ⁺ 中間物 114

(6S,9S,12R)-12-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-6-(4-胺基丁基)-2,2,9-三甲基-4,7,10-三側氧基-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十四烷-14-酸三級丁酯

向(9S,12S,15R)-15-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-9-[(三級丁氧羰基)胺基]-12-甲基-3,10,13-三側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,11,14-三氮雜十七烷-17-酸三級丁酯(141 mg，119 µmol)於甲醇/DCM (30 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(20 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到131 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.94 min；MS (ESIpos)：m/z = 1054 [M+H] ⁺ 中間物 115

(2R)-2-{[(6S,9S,12R,15S,27S,30S,33R,36S,43R)-9,36-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-43-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-27-[(三級丁氧羰基)胺基]-33-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-42-(羥基乙醯基)-12,15,30,44,44-五甲基-5,8,11,14,17,21,28,31,34,37-十側氧基-4,7,10,13,16,22,29,32,35,38,42-十一氮雜四十五烷-1-醯基]胺基}戊二酸

向(6S,9S,12R)-12-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-6-(4-胺基丁基)-2,2,9-三甲基-4,7,10-三側氧基-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十四烷-14-酸三級丁酯(69.6 mg，66.0 µmol)及N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(78.0 mg，66.0 µmol)於DMF (8.0 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(58 µl，330 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到79 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.24 min；MS(ESIneg)：m/z = 1058 [M-2H] ^2- 中間物 116

(2R,5S,8S,20S,23R,26S,29S,36R)-8-胺基-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-26-(2-胺基-2-側氧基乙基)-29-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,20,23-三甲基-4,7,14,18,21,24,27,30,34-九側氧基-3,6,13,19,22,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,36,38-三甲酸

將(2R)-2-{[(6S,9S,12R,15S,27S,30S,33R,36S,43R)-9,36-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-43-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-27-[(三級丁氧羰基)胺基]-33-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-42-(羥基乙醯基)-12,15,30,44,44-五甲基-5,8,11,14,17,21,28,31,34,37-十側氧基-4,7,10,13,16,22,29,32,35,38,42-十一氮雜四十五烷-1-醯基]胺基}戊二酸(79.0 mg，37.3 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(10 ml)中。添加氯化鋅(40.6 mg，298 µmol)，且在50℃攪拌反應物8小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(87.1 mg，298 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且用水/乙腈稀釋混合物。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到54 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.46 min；MS(ESIpos)：m/z = 982 [M+2H] ²⁺ 中間物 117

向N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(200 mg，194 µmol)及N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(70.1 mg，213 µmol；CAS-RN:42002-18-6)於DMF (12 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(100 µl，580 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物4.5小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到183 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.34 min；MS(ESIpos)：m/z = 1108 [M+H] ⁺ 中間物 118

將N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N2-(三級丁氧羰基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(350 mg，316 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(30 ml)中。添加氯化鋅(258 mg，1.89 mmol)，且在50℃攪拌反應物3小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(554 mg，1.89 mmol；CAS-RN:60-00-4)，之後添加5 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到284 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.01 min；MS(ESIpos)：m/z = 1008 [M+H] ⁺ 中間物 119

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯

向N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(23.0 mg，20.5 µmol)、2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸(8.99 mg，24.6 µmol)及HATU (8.57 mg，22.5 µmol；CAS-RN:148893-10-1)於DMF (2.3 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(11 µl，61 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到21 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.31 min；MS(ESIpos)：m/z = 1356 [M+H] ⁺ 中間物 120

N-{(2S)-2-{[N ²-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯

將N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} (羥基乙醯基)胺基]-2-{[N ²-(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(21.0 mg，15.5 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(8 ml)中。添加氯化鋅(12.7 mg，93.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(27.2 mg，93.0 µmol；CAS-RN:60-00-4)，之後添加4 ml水/乙腈(1:1)及TFA (20 µl)，且攪拌混合物10分鐘。濾出所得固體，且減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到17 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.00 min；MS(ESIpos)：m/z = 1255 [M+H] ⁺ 中間物 121

(4S)-5-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-側氧基戊酸三級丁酯

向N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(50.0 mg，85.7 µmol)及1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基) N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩胺酸5-三級丁酯(44.7 mg，103 µmol)於DMF (4.0 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(45 µl，260 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物12小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到51 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.29 min；MS(ESIpos)：m/z = 903 [M+H] ⁺ 中間物 122

N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-α-麩胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺

將(4S)-5-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-側氧基戊酸三級丁酯(51.0 mg，56.5 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(6 ml)中。添加氯化鋅(46.2 mg，339 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(99.0 mg，339 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加4 ml水及TFA (50 µl)，且攪拌混合物10分鐘。濾出所得固體，且減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到45 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.10 min；MS(ESIpos)：m/z = 847 [M+H] ⁺ 中間物 123

(2R)-2-{[(6S,9S,30S,33S,40R)-9,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-40-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-30-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-39-(羥基乙醯基)-41,41-二甲基-5,8,11,27,31,34-六側氧基-14,17,20,23-四氧雜-4,7,10,26,32,35,39-七氮雜四十二烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯

向N-{(2S)-2-{[N ²-(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)-L-天冬醯胺醯基]胺基}-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(17.0 mg，12.4 µmol)及N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-α-麩胺醯基-N ¹-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(10.6 mg，12.4 µmol)於DMF (4.0 ml)中之溶液中添加HATU (5.66 mg，14.9 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(6.5 µl，37 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到20 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.45 min；MS(ESIpos)：m/z = 1042 [M+2H] ²⁺ 中間物 124

(2R)-2-{[(6S,9S,30S,33S,40R)-30-胺基-9,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-40-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-39-(羥基乙醯基)-41,41-二甲基-5,8,11,27,31,34-六側氧基-14,17,20,23-四氧雜-4,7,10,26,32,35,39-七氮雜四十二烷-1-醯基]胺基}戊二酸

向(2R)-2-{[(6S,9S,30S,33S,40R)-9,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-40-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-30-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-39-(羥基乙醯基)-41,41-二甲基-5,8,11,27,31,34-六側氧基-14,17,20,23-四氧雜-4,7,10,26,32,35,39-七氮雜四十二烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯(20.0 mg，99%純度，9.47 µmol)於甲醇/DCM (10 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(2 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到11 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.02 min；MS(ESIneg)：m/z = 1767 [M-H] ^- 中間物 125

(3R,10S,13S,16S,19S)-10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-19-[(三級丁氧羰基)胺基]-13-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-4-(羥基乙醯基)-2,2,16-三甲基-9,12,15,18-四側氧基-4,8,11,14,17-五氮雜二十二烷-22-酸苯甲酯

向(3S)-4-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺基}-3-{[(2S)-2-胺基丙醯基]胺基}-4-側氧基丁酸三級丁酯(30.0 mg，36.3 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加(2S)-5-(苯甲基氧基)-2-[(三級丁氧羰基)胺基]-5-側氧基戊酸(17.2 mg，50.8 µmol)、HATU (27.6 mg，72.6 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(19 µl，110 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到38 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.32 min；MS(ESIpos)：m/z = 1146 [M+H] ⁺ 中間物 126

(3R,10S,13S,16S,19S)-10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-19-[(三級丁氧羰基)胺基]-13-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-4-(羥基乙醯基)-2,2,16-三甲基-9,12,15,18-四側氧基-4,8,11,14,17-五氮雜二十二烷-22-酸

向(3R,10S,13S,16S,19S)-10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-19-[(三級丁氧羰基)胺基]-13-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-4-(羥基乙醯基)-2,2,16-三甲基-9,12,15,18-四側氧基-4,8,11,14,17-五氮雜二十二烷-22-酸苯甲酯(38.0 mg，33.2 µmol)於甲醇/DCM (13 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(8 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾。藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到12 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.17 min；MS(ESIpos)：m/z = 1055 [M+H] ⁺ 中間物 127

(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-12-(2-胺基-2-側氧基乙基)-15-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-2,2,6,9-四甲基-4,7,10,13,16,20-六側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十烷-20-基]胺基}戊二酸二苯甲酯

向N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(100 mg,89.1 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加N-(三級丁氧羰基)-L-丙胺醯基-L-丙胺酸(27.8 mg，107 µmol)、HATU (40.7 mg，107 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(62 µl，360 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到96 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.30 min；MS(ESIpos)：m/z = 1250 [M+H] ⁺ 中間物 128

(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12-甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯

將(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-12-(2-胺基-2-側氧基乙基)-15-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-2,2,6,9-四甲基-4,7,10,13,16,20-六側氧基-3-氧雜-5,8,11,14,17-五氮雜二十烷-20-基]胺基}戊二酸二苯甲基酯(96.0 mg，76.8 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5 ml)中。添加氯化鋅(62.8 mg，461 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(135 mg，461 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，接著添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到69 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.01 min；MS(ESIpos)：m/z = 1151[M+H] ⁺ 中間物 129

(2S,5S,8S,13S,16S,19S,22S,29R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-8-[(三級丁氧羰基)胺基]-5,13,16-三甲基-4,7,11,14,17,20,23,27-八側氧基-3,6,12,15,18,21,24,28-八氮雜三十一烷-1,29,31-三甲酸29,31-二甲苯酯1-三級丁酯

向(3R,10S,13S,16S,19S)-10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-19-[(三級丁氧羰基)胺基]-13-(2-三級丁氧基-2-側氧基乙基)-4-(羥基乙醯基)-2,2,16-三甲基-9,12,15,18-四側氧基-4,8,11,14,17-五氮雜二十二烷-22-酸(32.4 mg，27.7 µmol)於DMF (8.1 ml)中之溶液中添加(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12-甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯(35.0 mg，27.7 µmol)、HATU (21.1 mg，55.4 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(14 µl，83 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到40 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.51 min；MS(ESIpos)：m/z = 1094[M+2H] ²⁺ 中間物 130

(6R,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S)-27-胺基-33-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-16-(2-胺基-2-側氧基乙基)-13-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-6-[(苯甲基氧基)羰基]-19,22,30-三甲基-3,8,12,15,18,21,24,28,31-九側氧基-1-苯基-2-氧雜-7,11,14,17,20,23,29,32-八氮雜三十五烷-35-酸

將(2S,5S,8S,13S,16S,19S,22S,29R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-8-[(三級丁氧羰基)胺基]-5,13,16-三甲基-4,7,11,14,17,20,23,27-八側氧基-3,6,12,15,18,21,24,28-八氮雜三十一烷-1,29,31-三甲酸29,31-二苯甲酯1-三級丁酯(39.6 mg，18.1 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(4 ml)中。添加氯化鋅(14.8 mg，109 µmol)，且在50℃攪拌反應物2小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(31.7 mg，109 µmol；CAS-RN:60-00-4)，之後添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到25 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.27min；MS(ESIpos)：m/z = 1016 [M+2H] ²⁺ 中間物 131

(2S,5S,8S,13S,16S,19S,22S,29R)-8-胺基-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,13,16-三甲基-4,7,11,14,17,20,23,27-八側氧基-3,6,12,15,18,21,24,28-八氮雜三十一烷-1,29,31-三甲酸

向(6R,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S)-27-胺基-33-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-16-(2-胺基-2-側氧基乙基)-13-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-6-[(苯甲基氧基)羰基]-19,22,30-三甲基-3,8,12,15,18,21,24,28,31-九側氧基-1-苯基-2-氧雜-7,11,14,17,20,23,29,32-八氮雜三十五烷-35-酸(25.0 mg，11.7 µmol)於甲醇/DCM (12 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(2 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到20 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06min；MS(ESIneg)：m/z = 923 [M-2H] ^2- 中間物 132

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯

向(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12-甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯(20.0 mg，15.8 µmol)於DMF (4.4 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩胺酸(2.22 mg，7.91 µmol)、HATU (9.02 mg，23.7 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(6.9 µl，40 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2.5小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到12 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.53 min；MS(ESIpos)：m/z = 1273 [M+2H] ²⁺ 中間物 133

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-22-胺基-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯(12.0 mg，4.71 µmol)於甲醇/DCM (8 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(9 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到10 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.94 min；MS(ESIneg)：m/z = 1024 [M-2H] ^2- 中間物 134

(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸四苯甲酯

向N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(70.0 mg，62.4 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩胺酸(8.77 mg，31.2 µmol)於DMF中之溶液、HATU (35.6 mg，93.6 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(27 µl，160 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1.5小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到50 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.58 min；MS(ESIpos)：m/z = 1131 [M+2H] ²⁺ 中間物 135

(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-16-胺基-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸四苯甲酯(50.0 mg，22.1 µmol)於甲醇/DCM (20 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(18 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物1小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到39 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.99 min；MS(ESIpos)：m/z = 1767 [M+H] ⁺ 中間物 136

(3R,10S,13S,18S,21S,26S,29S,36R)-13,26-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,29-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,9,12,15,20,24,27,30,34-九側氧基-4,8,11,14,19,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,3,18,36,38-五甲酸五苯甲酯

向N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二苯甲酯(40.0 mg，35.6 µmol)及(4S)-4-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5-{[(2S)-1-(苯甲基氧基)-4-羧基-1-側氧基丁-2-基]胺基}-5-側氧基戊酸(8.92 mg，17.8 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加HATU (17.6 mg，46.3 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(19 µl，110 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到29 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.60 min；MS(ESIpos)：m/z = 1241 [M+2H] ²⁺ 中間物 137

N-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]-L-麩醯胺醯基-L-γ-麩胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向(3R,10S,13S,18S,21S,26S,29S,36R)-13,26-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,29-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,9,12,15,20,24,27,30,34-九側氧基-4,8,11,14,19,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,3,18,36,38-五甲酸五苯甲酯(28.5 mg，11.5 µmol)於甲醇(15 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(3 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到21 mg標題產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.00 min；MS(ESIpos)：m/z = 1896 [M+H] ⁺ 中間物 138

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[(三級丁氧羰基)胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯

向N-(三級丁氧羰基)-L-麩胺酸(2.71 mg，11.0 µmol)及(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12,13-二甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二苯甲酯(28.0 mg，21.9 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加HATU (9.99 mg，26.3 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(7.6 µl，44 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。添加水/0.1% TFA，濾出所得固體，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到20 mg產物。 中間物 139

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-22-胺基-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯

將(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[(三級丁氧羰基)胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯(20.3 mg，7.99 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(3 ml)中。添加氯化鋅(6.54 mg，48.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物。攪拌3小時之後，添加氯化鋅(6.54 mg，48.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(28.0 mg，95.9 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物10 min。添加水/0.1% TFA，且濾出固體。減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到34 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 5.75 min；MS(ESIpos)：m/z = 1015 [M+H] ²⁺ 中間物 140

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-22-胺基-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯(16.5 mg，6.46 µmol)及2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸(2.83 mg，7.75 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加HATU (2.95 mg，7.75 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(4.5 µl，26 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到11 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 6.98 min；MS (ESIpos)：m/z = 1394 [M+2H] ²⁺ 中間物 141

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯

將(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯(10.8 mg，3.87 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(2 ml)中。添加氯化鋅(3.17 mg，23.2 µmol)，且在50℃攪拌反應物。在攪拌1.5小時之後，添加氯化鋅(3.17 mg，23.2 µmol l)，且在50℃攪拌反應物1.5小時。再次添加氯化鋅(3.17 mg，23.2 µmol)，且在50℃攪拌反應物直至完成。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(20.4 mg，69.7 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物10 min。添加水/0.1% TFA，且濾出固體。減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到6 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 5.67 min；MS (ESIpos)：m/z = 1344 [M+2H] ²⁺ 中間物 142

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四苯甲酯(23.0 mg，8.21 µmol)於乙酸乙酯/乙醇(2 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物3小時。濾出固體且減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到17 mg標題產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.23 min；MS (ESIpos)：m/z = 1163 [M+2H] ²⁺ 中間物 143

(2R)-2-{[(5S,8S,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-14-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,7,8-三甲基-3,6,9,12,15,19-六側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十九烷-19-基]胺基}戊二酸二-三級丁酯

向N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(321 mg，388 µmol)於DMF (20 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-L-天冬醯胺酸(254 mg，99%純度，466 µmol)、HATU(221 mg，583 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(200 µl，1.2 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物5 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到363 mg產物。LC-MS (方法2)：R _t= 2.49 min；MS (ESIpos)：m/z = 1230[M+H] ⁺ 中間物 144(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12,13-二甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二-三級丁酯

向(2R)-2-{[(5S,8S,11S,14S)-11-(2-胺基-2-側氧基乙基)-14-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,7,8-三甲基-3,6,9,12,15,19-六側氧基-1-苯基-2-氧雜-4,7,10,13,16-五氮雜十九烷-19-基]胺基}戊二酸二-三級丁酯(363 mg，295 µmol)於乙醇(30 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(30 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物2小時。濾出固體且減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到206 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06 min；MS (ESIpos)：m/z = 1096[M+H] ⁺ 中間物 145

(3R,10S,13S,16S,19S,22R,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[3-(2-溴乙醯胺基)丙醯胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四-三級丁酯

向N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(2.66 mg，7.30 µmol)及(2R)-2-{[(6S,9S,12S,15S)-15-胺基-9-(2-胺基-2-側氧基乙基)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-12,13-二甲基-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1-醯基]胺基}戊二酸二-三級丁酯(20.0 mg，18.2 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加HATU (6.94 mg，18.2 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(6.4 µl，36 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。將混合物減壓濃縮至乾燥，且將殘餘物與2 mg因此合成的另一批料合併。藉由製備型HPLC純化混合物，得到12 mg產物。

LC-MS (方法4)：R _t= 7.73 min；MS (ESIpos)：m/z = 1270[M+2Na] ²⁺ 中間物 146

(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-38-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸四-三級丁酯

向(2S,5S,8S,27S,48S,51S,54S)-2,54-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-27-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-5,6,8,48,50,51-六甲基-4,7,10,26,30,46,49,52-八側氧基-13,16,19,22,34,37,40,43-八氧雜-3,6,9,25,31,47,50,53-八氮雜戊五十烷-1,55-二酸(13.4 mg，10.2 µmol)及N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(16.8 mg，20.4 µmol)於DMF (1.2 ml)中之溶液中添加HATU (9.29 mg，24.4 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(11 µl，61 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物。在攪拌20 min之後，添加N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(16.8 mg，20.4 µmol)、HATU (9.29 mg，24.4 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(11 µl，61 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且攪拌反應物直至完成。添加水/0.1% TFA (1 ml)，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到4 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 6.62 min；MS (ESIpos)：m/z = 1466 [M+2H] ²⁺ 中間物 147

(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-38-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-38-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸四-三級丁酯(4.10 mg，1.30 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(2 ml)中。添加氯化鋅(1.06 mg，7.78 µmol)，且在50℃攪拌反應物。在1小時之後，再添加氯化鋅(1.06 mg，7.78 µmol)，且在50℃再攪拌反應物一小時。重複此程序4次直至反應完成。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(2.27 mg，7.78 µmol；CAS-RN:60-00-4)，之後添加水/0.1% TFA，且攪拌混合物幾分鐘。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到2.2 mg產物。 中間物 148

(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-38-胺基-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-38-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸-三氟乙酸(1/2) (2.20 mg，0.749 µmol)於乙醇(5 ml)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(1 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物3小時。濾出固體，用乙醇洗滌殘餘物若干次，且減壓濃縮濾液，得到2 mg粗產物。 中間物 149

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯

向(2S,5S,8S,13S,16S)-8-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-2,16-二甲基-4,7,11,14-四側氧基-5,13-二(丙-2-基)-3,6,12,15-四氮雜十七烷-1,17-二酸(10.0 mg，14.7 µmol)及N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(24.3 mg，29.4 µmol)於DMF (1.5 ml)中之溶液中添加HATU (13.4 mg，35.3 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(10 µl，59 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。將乙酸乙酯添加至混合物中，且用飽和氯化銨溶液(3次)、飽和碳酸氫鈉溶液(3次)及鹽水(20 ml)(3次)洗滌混合物。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾，且蒸發至乾燥，得到32 mg粗產物。LC-MS (方法4)：R _t= 8.10 min；(ESIpos)：m/z = 1171[M+2Na] ²⁺ 中間物 150

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-({N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(500 mg，605 µmol)及N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(234 mg，726 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加HATU (276 mg，726 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(320 µl，1.8 mmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物10 min。添加水/0.1% TFA (1 ml)，藉由製備型HPLC純化混合物，得到564 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.43 min；MS (ESIpos)：m/z = 1130 [M+H] ⁺ 中間物 151

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(L-纈胺醯基-L-丙胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯

向N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-({N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丁醯基]-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(564 mg，499 µmol)於乙酸乙酯/乙醇(60 ml，1:1)中溶液中添加10%鈀/活性碳(56 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物4小時。濾出固體，用乙酸乙酯/乙醇洗滌固體，且減壓濃縮濾液，得到502 mg標題產物。LC-MS (方法2)：R _t= 2.02 min；MS (ESIpos)：m/z = 996 [M+H] ⁺ 中間物 152

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯

向N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(L-纈胺醯基-L-丙胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二-三級丁酯(150 mg，151 µmol)於DMF (10 ml)中之溶液中添加N-[(苯甲基氧基)羰基]-L-麩胺酸(21.2 mg，75.3 µmol)、HATU (85.9 mg，226 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(66 µl，380 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物30 min。添加水/0.1% TFA，過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到121 mg產物。LC-MS (方法4)：R _t= 8.37 min；MS (ESIpos)：m/z = 1141 [M+2Na] ²⁺ 中間物 153

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-19-胺基-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯

向(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-{[(苯甲基氧基)羰基]胺基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯(122 mg，54.3 µmol)於甲醇/DCM (8 ml，1:1)中之溶液中添加10%鈀/活性碳(12 mg)。在室溫且在標準氫氣壓力下氫化混合物12小時。濾出固體且用甲醇/DCM洗滌殘餘物。減壓濃縮濾液。將剩餘殘餘物溶解於乙腈/水中且凍乾，得到97 mg標題產物。LC-MS (方法5)：R _t= 6.10 min；MS (ESIpos)：m/z = 1052 [M+2H] ²⁺ 中間物 154

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-[(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)胺基]-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯

向(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-19-胺基-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯(97.6 mg，44.0 µmol)及2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-酸(19.3 mg，52.8 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加HATU (20.1 mg，52.8 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及 N,N-二異丙基乙胺(23 µl，130 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20 min。藉由添加水/0.1 TFA (1 ml)來淬滅反應物，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到85 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 6.90 min；MS (ESIpos)：m/z = 1226 [M+2H] ²⁺ 中間物 155

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-19-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-[(2,2-二甲基-4,20-二側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜二十烷-20-基)胺基]-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯(85.6 mg，34.9 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5 ml)中。添加氯化鋅(28.6 mg，210 µmol)，且在50℃攪拌反應物。在攪拌2小時之後，添加氯化鋅(28.6 mg，210 µmol)，且在50℃攪拌反應物2小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(61.2 mg，210 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物10分鐘，之後添加水/TFA (0.1%)。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到41 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.54 min；MS (ESIpos)：m/z = 1064 [M+2H] ²⁺ 中間物 156

(3R,10S,13S,21S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-({2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-5,9,12,15,19,27,31,34,37,41-十側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,42-十氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向N-{2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}-L-離胺醯胺(4.56 mg，11.5 µmol)及N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-[(N2-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-天冬醯胺醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(30.0 mg，28.9 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(6.0 µl，35 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2天。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到12 mg產物。 中間物 157

(3R,10S,13S,21S,33S,36S,43R)-21-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,9,12,15,19,27,31,34,37,41-十側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,42-十氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

將(3R,10S,13S,21S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-({2-[(三級丁氧羰基)胺基]乙基}胺甲醯基)-5,9,12,15,19,27,31,34,37,41-十側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,42-十氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(12.3 mg，5.76 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(4 ml)中。添加氯化鋅(4.71 mg，34.5 µmol)，且在50℃攪拌反應物2.5小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.1 mg，34.5 µmol；CAS-RN:60-00-4)，之後添加乙腈及水。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到11 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 0.93 min；MS (ESIpos)：m/z = 1019 [M+2H] ²⁺A2DC前驅物分子 中間物 158

(3R,10S,13S,16S,19S,27S,39S,42S,45S,48S,55R)-13,45-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,48-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-55-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-16,17,19,39,42-五甲基-5,9,12,15,18,21,25,33,37,40,43,46,49,54-十四側氧基-4,8,11,14,17,20,26,32,38,41,44,47,50,53-十四氮雜五十七烷-1,3,27,57-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,19S,27S,39S,42S,45S,48S,55R)-13,45-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,48-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-27-(三級丁氧羰基)-55-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-16,17,19,39,42-五甲基-5,9,12,15,18,21,25,33,37,40,43,46,49,54-十四側氧基-4,8,11,14,17,20,26,32,38,41,44,47,50,53-十四氮雜五十七烷-1,3,57-三甲酸(32.5 mg，13.2 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(4 ml)中。添加氯化鋅(5.41 mg，39.7 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(11.6 mg，39.7 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到22 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.04 min；MS (ESIpos)：m/z = 1200 [M+2H] ²⁺。 中間物 159

(3R,10S,13S,21S,33S,36S,39S,42S,49R)-13,39-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,42-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-49-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-33,36-二甲基-5,9,12,15,19,27,31,34,37,40,43,48-十二側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,41,44,47-十二氮雜五十一烷-1,3,21,51-四甲酸

將(3R,10S,13S,21S,33S,36S,39S,42S,49R)-13,39-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,42-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-(三級丁氧羰基)-49-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-33,36-二甲基-5,9,12,15,19,27,31,34,37,40,43,48-十二側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,41,44,47-十二氮雜五十一烷-1,3,51-三甲酸(14.2 mg，6.17 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(2 ml)中。添加氯化鋅(5.05 mg，37.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物4小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.8 mg，37.0 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到8 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.05 min；MS (ESIpos)：m/z = 1123 [M+2H] ²⁺。 中間物 160

(3R,10S,13S,16S,19S,35S,38S,41S,44S,51R)-13,41-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,44-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-51-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-16,19,35,38-四甲基-5,9,12,15,18,21,33,36,39,42,45,50-十二側氧基-24,27,30-三氧雜-4,8,11,14,17,20,34,37,40,43,46,49-十二氮雜五十三烷-1,3,53-三甲酸

向N-{3-[2-(2-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(18.4 mg，88%純度，10.6 µmol)及L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(11.5 mg，10.6 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(7.4 µl，42 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物12小時。添加水/0.1% TFA (1 ml)，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到12 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.82 min；MS (APCI)：m/z = 2261 [M] 中間物 161

(3R,10S,13S,23S,26S,29S,32S,39R)-13,29-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,32-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-39-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-23,26-二甲基-5,9,12,15,21,24,27,30,33,38-十側氧基-18-氧雜-4,8,11,14,22,25,28,31,34,37-十氮雜四十一烷-1,3,41-三甲酸

向N-(3-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(15.0 mg，10.5 µmol)及N-{(2S)-2-(L-天冬醯胺醯基胺基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸(9.86 mg，10.5 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(5.5 µl，31 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物12小時。添加水/0.1% TFA (1 ml)，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到9 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.94 min；MS (ESIpos)：m/z = 2031 [M+H] ⁺ 中間物 162

(3R,10S,13S,16S,19S,29S,32S,35S,38S,45R)-13,35-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,38-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-45-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-16,19,29,32-四甲基-5,9,12,15,18,21,27,30,33,36,39,44-十二側氧基-24-氧雜-4,8,11,14,17,20,28,31,34,37,40,43-十二氮雜四十七烷-1,3,47-三甲酸

向N-(3-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}丙醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(15.0 mg，10.5 µmol)及L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(11.3 mg，10.5 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加 N,N-二異丙基乙胺(5.5 µl，31 µmol；CAS-RN:[7087-68-5])，且在室溫攪拌反應物12小時。添加水/0.1% TFA (1 ml)，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到15 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.85 min；MS (ESIpos)：m/z = 2173 [M+H] ⁺ 中間物 163

(2S,5S,13S,25S,28S,31S,34S,41R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基}-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-31-(2-胺基-2-側氧基乙基)-34-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-41-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-5,25,28-三甲基-4,7,11,19,23,26,29,32,35,40-十側氧基-3,6,12,18,24,27,30,33,36,39-十氮雜四十三烷-1,13,43-三甲酸

將(3S,6S,14S,26S,29S,32S,35S,42R)-3-{[(2S)-4-胺基-1-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[3-(甲基胺基)-3-側氧基丙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基}-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-32-(2-胺基-2-側氧基乙基)-35-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-14-(三級丁氧羰基)-42-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-6,26,29-三甲基-5,8,12,20,24,27,30,33,36,41-十側氧基-4,7,13,19,25,28,31,34,37,40-十氮雜四十五烷-1,45-二酸(14.6 mg，6.16 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(1.8 ml)中。添加氯化鋅(5.04 mg，37.0 µmol)，且在50℃攪拌反應物2小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.8 mg，37.0 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加2 ml水/0.1% TFA。減壓濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到12 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.03 min；MS (ESIpos)：m/z = 1157 [M+2H] ²⁺ 中間物 164

(4R,11S,14S,17S,20S,32S)-14-(2-胺基-2-側氧基乙基)-32-{[(3R,10S,13S,16S)-10-(2-胺基-2-側氧基乙基)-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-(羥基乙醯基)-2,2,13,16-四甲基-9,12,15,18,22-五側氧基-4,8,11,14,17-五氮雜二十二烷-22-基]胺基}-11-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-4-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]-17,20-二甲基-5,10,13,16,19,22,26-七側氧基-6,9,12,15,18,21,27-七氮雜三十三烷-1,33-二酸

向N-(5-{[(1S)-5-胺基-1-羧基戊基]胺基}-5-側氧基戊醯基)-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}-L-天冬醯胺(6.00 mg，5.54 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N ¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-{[2-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩胺醯基}胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-天冬醯胺(7.15 mg，5.54 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.9 µl，17 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到6 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.10 min；MS (ESIpos)：m/z = 1071 [M+2H] ²⁺ 中間物 165

(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13-[4-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)丁基]-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸

向(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-13-(4-胺基丁基)-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸(5.00 mg，2.39 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(1.95 mg，5.97 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.2 µl，7.2 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到1.6 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.13 min；MS (ESIneg)：m/z = 1083 [M-2H] ^2- 中間物 166

(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13-(4-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}丁基)-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸

向(2S,5S,13S,16S,19S,22S,25S,32R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-13-(4-胺基丁基)-22-(2-胺基-2-側氧基乙基)-25-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,16,18,19-四甲基-4,7,11,14,17,20,23,26,30-九側氧基-3,6,12,15,18,21,24,27,31-九氮雜三十四烷-1,32,34-三甲酸(4.40 mg，2.10 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(810 µg，2.6 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.73 µl，4.2 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2.8 mg產物。

LC-MS (方法1)：R _t= 1.15 min；MS (ESIneg)：m/z = 1084 [M-2H] ^2- 中間物 167

(2R,5S,8S,20S,23R,26S,29S,36R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-26-(2-胺基-2-側氧基乙基)-29-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-8-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)-5,20,23-三甲基-4,7,14,18,21,24,27,30,34-九側氧基-3,6,13,19,22,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,36,38-三甲酸

向(2R,5S,8S,20S,23R,26S,29S,36R)-8-胺基-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-26-(2-胺基-2-側氧基乙基)-29-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,20,23-三甲基-4,7,14,18,21,24,27,30,34-九側氧基-3,6,13,19,22,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,36,38-三甲酸(9.00 mg，4.33 µmol)於DMF (2.5 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(2.12 mg，6.50 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.5 µl，8.7 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到8 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS(ESIneg)：m/z = 1086 [M-2H] ^2- 中間物 168

(2R,5S,8S,20S,23R,26S,29S,36R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-26-(2-胺基-2-側氧基乙基)-29-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-8-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-5,20,23-三甲基-4,7,14,18,21,24,27,30,34-九側氧基-3,6,13,19,22,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,36,38-三甲酸

向(2R,5S,8S,20S,23R,26S,29S,36R)-8-胺基-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-26-(2-胺基-2-側氧基乙基)-29-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,20,23-三甲基-4,7,14,18,21,24,27,30,34-九側氧基-3,6,13,19,22,25,28,31,35-九氮雜三十八烷-1,36,38-三甲酸(54.0 mg，26.0 µmol)及1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(12.8 mg，41.6 µmol)於DMF (6.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(23 µl，130 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物12小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到46 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS(ESIneg)：m/z = 1077 [M-2H] ^2- 中間物 169

(2R)-2-{[(6S,9S,30S,33S,40R)-9,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-40-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-30-{3-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]丙醯胺基}-39-(羥基乙醯基)-41,41-二甲基-5,8,11,27,31,34-六側氧基-14,17,20,23-四氧雜-4,7,10,26,32,35,39-七氮雜四十二烷-1-醯基]胺基}戊二酸

向(2R)-2-{[(6S,9S,30S,33S,40R)-30-胺基-9,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-40-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-6-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-39-(羥基乙醯基)-41,41-二甲基-5,8,11,27,31,34-六側氧基-14,17,20,23-四氧雜-4,7,10,26,32,35,39-七氮雜四十二烷-1-醯基]胺基}戊二酸(5.00 mg，94%純度，2.64 µmol)及1-(2-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.46 mg，7.93 µmol)於DMF (940 µl)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(1.4 µl，7.9 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2小時。添加TFA直至pH達到3至4。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2 mg產物。LC-MS (方法4)：R _t= 6.25 min；MS (ESIpos)：m/z = 1964.9 [M+H]+ 中間物 170

(2S,5S,8S,13S,16S,19S,22S,29R)-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-8-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)-5,13,16-三甲基-4,7,11,14,17,20,23,27-八側氧基-3,6,12,15,18,21,24,28-八氮雜三十一烷-1,29,31-三甲酸

向(2S,5S,8S,13S,16S,19S,22S,29R)-8-胺基-2-{[(2S)-4-胺基-1-({3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丙基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]胺甲醯基}-19-(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,13,16-三甲基-4,7,11,14,17,20,23,27-八側氧基-3,6,12,15,18,21,24,28-八氮雜三十一烷-1,29,31-三甲酸(20.0 mg,10.2 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(9.96 mg,30.5 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(7.1 µl，41 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物4小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到19 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.14 min；MS(ESIneg)：m/z = 1029 [M-2H] ^2- 中間物 171

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-22-胺基-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(5.00 mg，2.44 µmol)於DMF (1.4 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(1.19 mg，3.66 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(0.85 µl，4.9 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物2小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到3 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.05 min；MS(ESIneg)：m/z = 1029 [M-2H] ^2- 中間物 172

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-22-胺基-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,19,27,30-四甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(19.0 mg，9.26 µmol)於DMF (7.6 ml)中之溶液中添加1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(3.57 mg，11.6 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(3.2 µl，19 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到19 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06 min；MS(ESIpos)：m/z = 1122 [M+2H] ²⁺ 中間物 173

(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-16-胺基-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸(5.00 mg，2.83 µmol)於DMF (2.5 ml)中之溶液中添加1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1.09 mg，3.54 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.99 µl，5.7 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物20小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到3 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS(ESIneg)：m/z = 978 [M-2H] ^2- 中間物 174

(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,21S,24S,31R)-16-胺基-13,21-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,24-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,9,12,15,19,22,25,29-八側氧基-4,8,11,14,20,23,26,30-八氮雜三十三烷-1,3,31,33-四甲酸(15.0 mg，8.49 µmol)於DMF (7.5 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(8.31 mg，25.5 µmol)及 N,N-二異丙基乙胺(4.4 µl，25 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物4小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到11 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.12 min；MS(ESIpos)：m/z = 1978 [M+H] ⁺ 中間物 175

N-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]-N ²-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-麩醯胺醯基-L-γ-麩胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

向N-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]-L-麩醯胺醯基-L-γ-麩胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(5.00 mg，2.64 µmol)於DMF (4.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(2.15 mg，6.59 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.8 µl，11 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物18小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06 min；MS(ESIneg)：m/z = 1052 [M-2H] ^2- 中間物 176

N-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]-N ²-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-麩醯胺醯基-L-γ-麩胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺

將N-[(2S)-4-胺基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基)-1,4-二側氧基丁-2-基]-L-麩醯胺醯基-L-γ-麩胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(5.00 mg，2.64 µmol)、1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1000 µg，4.0 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(1.4 µl，7.9 µmol；CAS-RN:7087-68-5)於DMF (4.0 ml)中之混合物在室溫攪拌18小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 1.06 min；MS(ESIneg)：m/z = 1015 [M-2H] ^2-。 中間物 177

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-({21-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-17,21-二側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十一烷-1-醯基}胺基)-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(5.00 mg，2.05 µmol)及1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(1.67 mg，5.12 µmol)於DMF (500 µl)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(1.4 µl，8.2 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。添加水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到3 mg產物。 中間物 178

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-{[22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十二烷-1-醯基]胺基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(5.00 mg，2.05 µmol)及1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(690 µg，2.3 µmol)於DMF (500 µl)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(1.8 µl，10 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。添加水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到3 mg產物。 中間物 179

(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-{[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]胺基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,22S,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-22-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(5.00 mg，2.05 µmol)及1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(570 µg，2.3 µmol)於DMF (500 µl)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(0.71 µl，4.1 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物3小時。添加水/0.1% TFA，且過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到3 mg產物。

LC-MS (方法4)：R _t= 5.78 min；MS (ESIpos)：m/z = 1254[M+2Na] ²⁺ 中間物 180

(3R,10S,13S,16S,19S,22R,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[3-(2-溴乙醯胺基)丙醯胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,19S,22R,27S,30S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-22-[3-(2-溴乙醯胺基)丙醯胺基]-16,17,19,27,29,30-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,28,31,34,37,41-十二側氧基-4,8,11,14,17,20,26,29,32,35,38,42-十二氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸四-三級丁酯(12.2 mg，4.89 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(4 ml)中。分批添加氯化鋅(總計53.3 mg，391 µmol)，且在50℃攪拌反應物24小時。此後，添加4 mL乙腈/水、50 µL TFA及乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(121 mg，416 µmol；CAS-RN:[60-00-4])且攪拌混合物幾分鐘。減壓濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到7 mg (63%)產物。LC-MS (方法2)：R _t= 1.95 min；MS (ESI-)：m/z = 1134 [M-2H] ^2- 中間物 181

(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-38-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,38S,59S,62S,65S,68S,75R)-38-胺基-13,65-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,68-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-16,17,19,59,61,62-六甲基-5,9,12,15,18,21,37,41,57,60,63,66,69,73-十四側氧基-24,27,30,33,45,48,51,54-八氧雜-4,8,11,14,17,20,36,42,58,61,64,67,70,74-十四氮雜七十七烷-1,3,75,77-四甲酸)(7.80 mg，2.67 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(2.3 µl，13 µmol；CAS-RN:7087-68-5)於DMF (1000 µl)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(2.3 µl，13 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物4小時。添加水/0.1% TFA (0.5 ml)，藉由製備型HPLC純化混合物，得到5 mg產物。LC-MS (方法5)：R _t= 4.82 min；MS (ESIpos)：m/z = 1384 [M+2H] ²⁺ 中間物 182

(3R,10S,13S,16S,19S,27S,39S,42S,45S,48S,55R)-13,45-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,48-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-27-({2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]乙基}胺甲醯基)-16,17,19,39,41,42-六甲基-5,9,12,15,18,21,25,33,37,40,43,46,49,53-十四側氧基-4,8,11,14,17,20,26,32,38,41,44,47,50,54-十四氮雜五十七烷-1,3,55,57-四甲酸

向N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}-L-丙胺醯基-N-甲基-L-丙胺醯基-N ¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-[(3-{[(1R)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}-L-天冬醯胺(10.0 mg，8.37 µmol)於DMF (2.0 ml)中之溶液中添加N-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺基]乙基}-L-離胺醯胺(2.48 mg，4.18 µmol)於DMF中之溶液及N,N-二異丙基乙胺(1.8 µl，10 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物。在攪拌22小時之後，在超音波浴中處理反應物2小時，之後在室溫攪拌12小時並在超音波浴中處理2小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2 mg產物。LC-MS (方法1)：R _t= 10.2 min；MS (ESIpos)：m/z = 1243 [M+2H] ²⁺ 中間物 183

(3R,10S,13S,16S,35S,56S,59S,62S,69R)-10,62-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-35-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,59-二甲基-5,9,12,15,18,34,38,54,57,60,63,67-十二側氧基-16,56-二(丙-2-基)-21,24,27,30,42,45,48,51-八氧雜-4,8,11,14,17,33,39,55,58,61,64,68-十二氮雜七十一烷-1,3,69,71-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,35S,56S,59S,62S,69R)-10,62-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-35-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,59-二甲基-5,9,12,15,18,34,38,54,57,60,63,67-十二側氧基-16,56-二(丙-2-基)-21,24,27,30,42,45,48,51-八氧雜-4,8,11,14,17,33,39,55,58,61,64,68-十二氮雜七十一烷-1,3,69,71-四甲酸四-三級丁酯(31.2 mg，11.2 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(3 ml)中。添加氯化鋅(9 mg，67.1 µmol)，且在50℃攪拌反應物。在攪拌1小時之後，添加氯化鋅(9 mg，67.1 µmol)，且在50℃再攪拌反應物一小時。為驅使反應完成，再添加氯化鋅(9 mg，67.1 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(19.6 mg，67.1 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物幾分鐘，之後添加水/0.1% TFA。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到10 mg產物。LC-MS (方法4)：R _t= 5.96 min；MS (ESIpos)：m/z = 1306 [M+2Na] ²⁺ 中間物 184

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸

將(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸四-三級丁酯(30.6 mg，13.3 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(3 ml)中。添加氯化鋅(10.9 mg，79.9 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時。再添加氯化鋅(10.9 mg，79.9 µmol)，且在50℃攪拌反應物1小時，重複此步驟直至反應完成。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4 mg，79.9 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，且攪拌混合物幾分鐘，之後添加水/0.1% TFA。過濾混合物，且藉由製備型HPLC純化濾液，得到15 mg產物。 LC-MS (方法4)：R _t= 6.19 min；ESIpos)：m/z = 1058 [M+2Na] ²⁺ 中間物 185

(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-19-({21-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-17,21-二側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十一烷-1-醯基}胺基)-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸

向(3R,10S,13S,16S,19S,24S,27S,30S,37R)-19-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-10,30-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-13,27-二甲基-5,9,12,15,18,22,25,28,31,35-十側氧基-16,24-二(丙-2-基)-4,8,11,14,17,23,26,29,32,36-十氮雜三十九烷-1,3,37,39-四甲酸(10.0 mg，4.46 µmol)及1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(3.64 mg，11.2 µmol)於DMF (1.0 ml)中之溶液中添加N,N-二異丙基乙胺(3.1 µl，18 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物1小時。添加水/0.1% TFA，且藉由製備型HPLC純化混合物，得到63 mg產物。

LC-MS (方法5)：R _t= 5.19min；MS (ESIpos)：m/z = 1169 [M+2H] ²⁺ 中間物 186

(3R,10S,13S,21S,33S,36S,43R)-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-21-{[2-({5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基}胺基)乙基]胺甲醯基}-5,9,12,15,19,27,31,34,37,41-十側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,42-十氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸

向(3R,10S,13S,21S,33S,36S,43R)-21-[(2-胺基乙基)胺甲醯基]-13,33-雙(2-胺基-2-側氧基乙基)-10,36-雙{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]乙基}-5,9,12,15,19,27,31,34,37,41-十側氧基-4,8,11,14,20,26,32,35,38,42-十氮雜四十五烷-1,3,43,45-四甲酸(11.0 mg，5.40 µmol)於DMF (5.0 ml)中之溶液中添加1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二(吡咯啶-2,5-二酮)(4.41 mg，13.5 µmol)及N,N-二異丙基乙胺(3.8 µl，22 µmol；CAS-RN:7087-68-5)，且在室溫攪拌反應物6小時。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到2 mg產物。

LC-MS (方法1)：R _t= 1.04 min；MS (ESIneg)：m/z = 1122 [M+2H] ^2-A2DC合成部分II： 通用程序 A ： 半胱胺酸偶合及硫代丁二醯亞胺環之後續開環

通常，在氬氣下，將0.029 mg TCEP於0.05 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於0.5 ml PBS中之5 mg各別抗體中(c=10 mg/ml)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.05 mL DMSO中的過量2至20當量、較佳2至10當量、通常7當量(0.000233 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至2.5 ml之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 8)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 8)溶離。在pH 8下，在氬氣下於RT攪拌溶離液過夜。此後藉由超速離心濃縮且用PBS 緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 通用程序 A* ： 半胱胺酸偶合及硫代丁二醯亞胺環之後續開環

通常，在氬氣下，將0.172 mg TCEP於0.25 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於3 ml PBS中之30 mg各別抗體中(c=10 mg/ml)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.25 mL DMSO中的過量2至10當量、通常7當量(0.0014 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用預先調節至pH 8的PBS緩衝液將混合物稀釋至5至10 mL之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 8)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用pH為8之PBS緩衝液溶離。用PBS緩衝液(pH 8)將溶離液進一步稀釋至7.5 mL之體積，且在pH 8下，在氬氣下於RT攪拌過夜。隨後將混合物傳遞通過用PBS緩衝液(pH 7.2)平衡之PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。此後藉由超速離心濃縮且用PBS 緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至20 mL之體積。 通用程序 B ： 半胱胺酸偶合

通常，在氬氣下，將0.029 mg TCEP於0.05 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於0.5 ml PBS中之5 mg各別抗體中(c=10 mg/ml)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.05 mL DMSO中的過量2至20當量、較佳2至10當量、通常7當量(0.000233 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 ml之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。此後藉由超速離心濃縮且用PBS 緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 通用程序 B* ： 半胱胺酸偶合

通常，在氬氣下，將0.115 mg TCEP於0.2 ml PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液添加至溶解於1.35 ml PBS中之20 mg各別抗體中(c=14.8 mg/mL)。(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml至30 mg/ml之範圍內)。在RT攪拌混合物30 min，隨後添加溶解於0.2 mL DMSO中的過量2至10當量、通常7當量(0.000933 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT再攪拌90 min之後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 ml之體積，接著傳遞通過用PBS緩衝液(pH 7.2)平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25，GE Healthcare)，且用PBS緩衝液(pH 7.2)溶離。此後藉由超速離心濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約14 mL之體積，且再次藉由超速離心濃縮至約1至20 mL之最終體積。 通用程序 C ： 離胺酸偶合

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體通常於0.5 mL PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液(c = 10 mg/mL)(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml與30 mg/ml之間的範圍內)中，添加溶解於0.5 mL DMSO中的過量2至10當量、較佳2至5當量、通常5當量(0.00165 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT攪拌30至60 min之後，添加溶解於0.05 mL DMSO中的相同量之ADC前驅物分子，且再繼續在RT攪拌30至60 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約0.300 mL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至約1至5 mL之體積。 通用程序 C* ： 離胺酸偶合

向處於氬氣氛圍下的5 mg各別抗體通常於0.5 mL PBS緩衝液(pH 7.2)中之溶液(c = 10 mg/mL)(抗體溶液之濃度亦可不同於標準程序，在1 mg/ml與30 mg/ml之間的範圍內)中，添加溶解於0.5 mL DMSO中的過量2至10當量、較佳2至5當量、通常5當量(0.00165 mmol)之各別中間物(ADC前驅物分子)。在RT攪拌30至60 min之後，添加溶解於0.05 mL DMSO中的相同量之ADC前驅物分子，且再繼續在RT攪拌30至60 min。隨後，用PBS緩衝液(pH 7.2)將混合物稀釋至2.5 mL之體積，施加至PD-10管柱(Sephadex® G-25 GE Healthcare)且用3.5 mL PBS緩衝液溶離。接著藉由超速離心將所獲得之溶液濃縮至約0.300 mL之體積，且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋至1至20 mL之體積。實例II-1

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物158偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物158偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
1e-1015	HER-2	158	1015	A	1.45	2.6	99.2
1g-981	EGFR	158	981	A	1.63	2.4
1k-7007	TWEAKR	158	7007	A	1.72	3.2
1m-170	間皮素	158	170	A	1.36	3.1	96.3
1x-9574	CXCR5	158	9574	A	0.75	2.9

實例II-2

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物159偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物159偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
2e-1015	HER-2	159	1015	A	1.46	2.5	98.7
2g-981	EGFR	159	981	A	1.70	2.3	99.1
2k-7007	TWEAKR	159	7007	A	1.75	2.0
2m-170	間皮素	159	170	A	1.15	2.9	97.1
2x-9574	CXCR5	159	9574	A	1.08	2.3
2x-9574	CXCR5	159	9574	A*	1.59	2.5

實例II-3

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物160偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物160偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
3c-9476	CD123	160	9476	A	1.57	3.2	99.1
3e-1015	HER-2	160	1015	A	1.51	3.7	100
3g-981	EGFR	160	981	A	1.63	3.2	98.9
3k-7007	TWEAKR	160	7007	A	1.66	3.1	100
3x-9574	CXCR5	160	9574	A	0.59	3.7	100

實例II-4

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物161偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物161偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
4c-9476	CD123	161	9476	A	1.64	3.5	98.8
4e-1015	HER-2	161	1015	A	1.58	3.9	100
4g-981	EGFR	161	981	A	1.60	3.9	100
4k-7007	TWEAKR	161	7007	A	1.58	3.5	99
4x-9574	CXCR5	161	9574	A	0.27	4.0	97.1

實例II-5

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物162偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物162偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
5c-9476	CD123	162	9476	A	1.57	3.4	99
5e-1015	HER-2	162	1015	A	1.54	3.5	100
5g-981	EGFR	162	981	A	1.63	3.4	98.8
5k-7007	TWEAKR	162	7007	A	1.59	3.2	100
5x-9574	CXCR5	162	9574	A	0.48	3.7	100

實例II-6

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物163偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物163偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
6e-1015	HER-2	163	1015	A	1.65	2.5	100
6g-981	EGFR	163	981	A	1.72	2.2	99.1
6k-7007	TWEAKR	163	7007	A	1.68	2.0	100
6m-170	間皮素	163	170	A	0.77	3.5	97.7
6m-170*	間皮素	163	170	A*	4.09	4.3	92.3

實例II-6a 代謝物1

自實例6中之A2DC釋放的此異構性不可滲透代謝物1之合成已描述於WO2018/114804中。實例II-6b 代謝物2

根據以下程序合成自實例6中之A2DC釋放的此可滲透代謝物2的合成。

步驟 1：向(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸(40.0 mg，60.8 µmol)於DMF (7 ml)中之溶液中添加3-胺基-N-甲基丙醯胺*HCl (10.1 mg，73.0 µmol)、HATU (27.7 mg，73.0 µmol；CAS-RN:148893-10-1)及N,N-二異丙基乙胺(32 µl，182 µmol；CAS-RN:7087-68-5]，且在室溫攪拌反應物1 h。將混合物減壓濃縮至乾燥，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到37.5 mg (83%產率，100%純度)之{(2S)-1-[(3-甲基胺基-3-側氧基丙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基甲酸2-(三甲基矽基)乙酯。

LC-MS (方法6)：Rt = 1.32min；MS (ESIpos)：m/z = 741 (M+H) ⁺

步驟 2：將{(2S)-1-[(3-甲基胺基-3-側氧基丙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基甲酸2-(三甲基矽基)乙酯(37.5 mg，50.5 µmol)溶解於2,2,2-三氟乙醇(5 ml)中。添加氯化鋅(41.3 mg，303 µmol)，且在50℃攪拌反應物2.5小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(88.6 mg，303 µmol；CAS-RN:[60-00-4])，之後添加乙腈及水，且攪拌混合物幾分鐘。過濾混合物且減壓濃縮濾液，且藉由製備型HPLC純化殘餘物，得到26 mg (70.5%產率，97.5%純度)之(2S)-2-胺基-N-(3-甲基胺基-3-側氧基丙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(羥基乙醯基)胺基]丁醯胺-三氟乙酸。

LC-MS (方法6)：Rt = 0.77 min；MS (ESIpos)：m/z = 598 (M+H) ⁺實例II-7

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物164偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物164偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
7c-9476	CD123	164	9476	A	2.19	2.9	98.6
7e-1015	HER-2	164	1015	A	2.10	3.2	97.6
7g-981	EGFR	164	981	A	1.98	3.3	94.3
7k-7007	TWEAKR	164	7007	A	2.16	2.8	98.2
7x-9574	CXCR5	164	9574	A	0.8	2.2	100

實例II-8

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物165偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物165偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
8e-1015	HER-2	165	1015	C	1.23	1.3	98.5
8g-981	EGFR	165	981	C	1.22	1.2	98.4
8k-7007	TWEAKR	165	7007	C	1.70	2.4	97.7
8c-9476	CD123	165	9476	C	1.43	3.3	97.7

實例II-9

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物166偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物166偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
9e-1015	HER-2	166	1015	B	1.87	2.8	98.2
9g-981	EGFR	166	981	B	2.13	2.7	96.9
9k-7007	TWEAKR	166	7007	B	2.12	2.9	100
9c-9476	CD123	166	9476	B	2.33	2.8	100

實例II-10

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物167偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物167偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
10e-1015	HER-2	167	1015	C	0.81	4.0	94.8
10g-981	EGFR	167	981	C	2.07	3.7	100
10k-7007	TWEAKR	167	7007	C	2.37	4.2	100

實例II-11

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物169偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物169偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
11e-1015	HER-2	168	1015	B	2.2	3.2	100
11m-170	間皮素	168	170	B	1.19	3.8	97.9
11m-170*	間皮素	168	170	B*	6.58	4.7	96.6
11k-7007	TWEAKR	168	7007	B	1.43	3.0	100
11k-2658	TWEAKR	168	2658	B	2.32	4.2	100
11k-2658*	TWEAKR	168	2658	B*	7.8	3.6	98.8
11k-2090*	TWEAKR	168	2090	B*	7.97	1.3	85.8

實例II-12

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
12e-1015	HER-2	169	1015	A	1.73	2.7	95.3
12x-9574	CXCR5	169	9574	A	0.52	3.3	95.5
12k-7007	TWEAKR	169	7007	A	1.93	1.5	100

實例II-13

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物170偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物170偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
13e-1015	HER-2	170	1015	C	0.7	2.4	97.2
13g-981	EGFR	170	981	C	1.3	2.3	97.6
13k-7007	TWEAKR	170	7007	C	1.86	2.8	93.2
13c-9476	CD123	170	9476	C	1.31	3.3	96.4

實例II-14

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物171偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物171偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
14e-1015	HER-2	171	1015	C	0.67	3.8	100
14g-981	EGFR	171	981	C	2.4	3.1	91.0
14k-7007	TWEAR	171	7007	C	2.37	2.7	94.5
14c-9476	CD123	171	9476	C	2.5	4.5	94.8
14x-9574	CXCR5	171	9574	C	0.41	2.9	100

實例II-15

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物172偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物172偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
15m-170	間皮素	172	170	B	1.42	3.6	95.8
15e-1015	HER-2	172	1015	B	1.92	3.1	100
15g-981	EGFR	172	981	B	2.25	3.2	100
15k-7007	TWEAR	172	7007	B	2.22	3.3	100
15x-9574	CXCR5	172	9574	B	0.93	1.6	100
15x-9574	CXCR5	172	9574	B*	3.86	1.7	96.7
15c-9476	CD123	172	9476	B	2.16	3.0	100

實例II-16

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物173偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物173偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
16e-1015	HER-2	173	1015	B	2.19	3.1	100
16g-981	EGFR	173	981	B	2.21	3.0	100
16k-7007	TWEAKR	173	7007	B	2.24	2.6	100
16x-9574	CXCR5	173	9574	B	1.04	2.8	100
16c-9476	CD123	173	9476	B	2.25	2.8	100

實例II-17

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物174偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物174偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
17e-1015	HER-2	174	1015	C	1.77	3.4	95.1
17g-981	EGFR	174	981	C	2.99	3.9	100
17k-7007	TWEAKR	174	7007	C	2.86	3.3	93.8
17x-9574	CXCR5	174	9574	C	0.5	2.6	83.5
17c-9476	CD123	174	9476	C	2.89	2.8	98.2

實例II-18

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物175偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物175偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/m]	DAR	單體%
18e-1015	HER-2	175	1015	C	1.22	4.4	99.5
18k-7007	TWEAKR	175	7007	C	1.47	3.1	100
18x-9574	CXCR5	175	9574	C	1.24	3.2	96.7

實例II-19

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物176偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物176偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
19e-1015	HER-2	176	1015	A	1.99	2.9	100
19k-7007	TWEAKR	176	7007	A	1.63	2.6	100
19x-9574	CXCR5	176	9574	A	0.38	2.5	100

實例II-20

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物178偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物178偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
20e-1015	HER-2	177	1015	C	1.96	2.5	100
20g-981	EGFR	177	981	C	2.06	2.1	100
20k-7007	TWEAKR	177	7007	C	2.05	2.0	99.1
20x-9574	CXCR5	177	9574	C	1.1	2.8	100

實例II-21

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
21e-1015	HER-2	178	1015	B	1.97	3.5	96.1
21g-981	EGFR	178	981	B	2.2	3.6	99
21k-7007	TWEAKR	178	7007	B	2.17	3.5	98.3
21c-9476	CD123	178	9476	B	2.0	3.4	96.5

實例II-22

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物179偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物179偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
22e-1015	HER-2	179	1015	A	1.66	3.2	96.9
22g-981	EGFR	179	981	A	1.71	3.0	96.3
22k-7007	TWEAKR	179	7007	A	1.96	3.1	96.4
22c-9476	CD123	179	9476	A	1.68	3.1	96.9

實例II-23

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物180偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物180偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
23k-7007	TWEAKR	180	7007	B	1.71	2.4	87.7
23x-9574	CXCR5	180	9574	B	0.71	2.0	100

實例II-24

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物181偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物181偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
24e-1015	HER-2	181	1015	B	2.06	3.5	100
24g-981	EGFR	181	981	B	2.17	3.5	100
24k-7007	TWEAKR	181	7007	B	2.03	3.3	100
24c-9476	CD123	181	9476	B	2.12	3.3	100

實例II-25

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物182偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物182偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
25e-1015	HER-2	182	1015	A	1.2	4.5	100
25k-7007	TWEAKR	182	7007	A	1.57	3.0	100
25x-9574	CXCR5	182	9574	A	0.46	3.0	100

實例II-26

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物183偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物183偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
26m-170	間皮素	183	170	B	1.46	4.0	98.4
26k-2658	TWEAKR	183	2658	B	2.45	3.9	100
26x-9574	CXCR5	183	9574	B	1.29	3.1	94.6
26k-7007	TWEAKR	183	7007	B*	15.12	4.0	96.4
26c-9476	CD123	183	9476	B*	14.19	3.4	89.2

實例II-27

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物184偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物184偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
27k-2658	TWEAKR	184	2658	B	4.49	4.0	100
27x-9574	CXCR5	184	9574	B	0.34	1.6	96.7
27c-6013	CD123	184	6013	B	2.34	3.9	100

實例II-28

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物185偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物185偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
28g-981	EGFR	185	981	C	2.01	2.7	98.9
28e-1015	HER-2	185	1015	C	1.81	2.7	100
28x-9574	CXCR5	185	9574	C	1.01	3.5	100
28k-7007	TWEAKR	185	7007	C	2.07	2.2	100
28c-9476	CD123	185	9476	C	2.08	3.6	98.4

實例II-29

如表格中所指示，使用上文所描述之通用程序中之一者，藉由使中間物186偶合至不同抗體來合成ADC。使中間物186偶合至不同抗體而獲得的ADC批料的特徵展示於下表中：

實例II-	目標	中間物	mAb TPP-	程序	C [mg/mL]	DAR	單體%
29g-981	EGFR	186	981	C	2.64	3.9	97.2
29e-1015	HER-2	186	1015	C	2.08	3.8	97.1
29x-9574	CXCR5	186	9574	C	1.14	3.6	100
29k-7007	TWEAKR	186	7007	C	2.70	3.9	97.7
29c-9476	CD123	186	9476	C	2.47	4.5	95.9

生物學表徵 CTG 分析

所報導之活性數據係關於本發明實驗部分中所描述之實施例，其中指示藥物/mAB比。該等值可能因藥物/mAB比不同而偏離。IC50值為若干個獨立實驗或個別值之平均值。抗體藥物結合物之作用對於包含各別連接子及發毒團之各別同型對照為選擇性的。

以下表9a至表9f列出來自此分析的代表性實施例之IC50值：表 9a ： TWEAKR-A2DC

實例編號 (II-)	EO-PROLIF-NCI-H292 ADC CTG 72HIC50 - [mol/l] (平均值)	EO-Prolif-BXPC3 ADC CTG 72hIC50 - [mol/l] (平均值)	EO-PROLIF-LoVo ADC CTG 72HIC50 - [mol/l] (平均值)
1k-7007	6.35 E-11	6.14 E-11	＜ 3.00 E-11
2k-7007	9.79 E-11	1.02 E-10	＜ 3.00 E-11
3k-7007	6.18 E-11	7.67 E-11	3.00 E-11 ^*
4k-7007	5.78 E-11	1.73 E-10	＜ 3.00 E-11
5k-7007	4.34 E-11	8.46 E-11	＜ 3.00 E-11
6k-7007	1.17 E-10	1.39 E-10	＜ 3.00 E-11
7k-7007	1.49 E-10	1.98 E-10	＜ 3.00 E-11
8k-7007	9.82 E-11	1.78 E-10	＜ 3.00 E-11
9k-7007	1.18 E-10	1.82 E-10	＜ 3.00 E-11
10k-7007	4.25 E-11 ^*	7.12 E-11 ^*	3.00 E-11 ^*
11k-2090*	5.28 E-10	9.28 E-10	2.13 E-10
11k-2658	2.76 E-10	3.11 E-10	4.64 E-11
11k-7007	3.31 E-11	6.10 E-11	＜ 3.00 E-11
12k-7007	9.31 E-11	1.78 E-10	＜ 3.00 E-11
13k-7007	9.03 E-11	2.23 E-10	＜ 3.00 E-11
14k-7007	6.52 E-11	1.30 E-10	＜ 3.00 E-11
15k-7007	6.72 E-11	1.33 E-10	＜ 3.00 E-11
16k-7007	8.48 E-11	1.27 E-10	＜ 3.00 E-11
17k-7007	4.10 E-11	7.50 E-11	＜ 3.00 E-11
19k-7007	5.87 E-11	9.17 E-11	＜ 3.00 E-11
20k-7007	8.02 E-11	1.77 E-10	＜ 3.00 E-11
21k-7007	6.85 E-11	6.83 E-11	＜ 3.00 E-11
22k-7007	7.71 E-11	7.89 E-11	＜ 3.00 E-11
23k-7007	7.91 E-11	7.02 E-11	＜ 3.00 E-11
24k-7007	＜ 3.00 E-11	＜ 3.00 E-11	＜ 3.00 E-11
25k-7007	＜ 3.00 E-11	＜ 3.00 E-11	＜ 3.00 E-11
26k-2658	1.23 E-10	1.60 E-10	＜ 3.00 E-11
26k-7007*	5.87 E-11	1.21 E-10	＜ 3.00 E-11
27k-2658	3.01 E-10	4.79 E-10	8.01 E-11
28k-7007	7.66 E-11	2.33 E-10	＜ 3.00 E-11
29k-7007	7.59 E-11	8.75 E-11	3.00 E-11 ^*

表 9b ：間皮素 -A2DC

實例編號 (II-)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] HT29 meso (平均值)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] H322 (平均值)
1m-170		2.13 E-9
2m-170		2.20 E-9
6m-170	5.71 E-10	3.72 E-9
6m-170*	2.84 E-10
11m-170	1.27 E-10	5.73 E-9
11m-170*	1.05 E-8
15m-170	1.01 E-10	3.48 E-9
26m-170	4.94 E-10	2.36 E-9

表 9c ： EGFR-A2DC

實例編號 (II-)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] H292 (幾何平均值)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] SKHep-1 (平均值)
4g-981	7.24 E-12	4.12 E-12
7g-981	5.87 E-13	4.40 E-12
8g-981	1.00 E-12	1.87 E-12
9g-981	1.58 E-12	1.92 E-11
10g-981	5.74 E-13	2.35 E-12
13g-981	1.84 E-12	2.88 E-12
14g-981	1.00 E-11	1.00 E-11
15g-981	1.00 E-11	7.16 E-12
16g-981	1.00 E-13	2.07 E-12
17g-981	1.86 E-13	5.27 E-13
20g-981	1.00 E-11	3.58 E-12
21g-981	1.14 E-13	1.00 E-12
22g-981	1.32 E-13	1.03 E-12
24g-981	2.04 E-12	2.16 E-11
29g-981	2.59 E-13	1.00 E-12

表 9d ： HER2-ADC

實例編號 (II-)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] KPL4 (平均值)
1e-1015	1.93 E-11
2e-1015	1.56 E-11
3e-1015	2.37 E-11
4e-1015	1.64 E-10
5e-1015	9.62 E-11
6e-1015	8.36 E-11
7e-1015	2.08 E-10
8e-1015	2.34 E-10
9e-1015	1.55 E-10
10e-1015	1.23 E-10
11e-1015	9.53 E-11
12e-1015	1.23 E-10
13e-1015	4.23 E-10
14e-1015	9.63 E-11
15e-1015	5.22 E-11
16e-1015	7.15 E-11
17e-1015	1.02 E-10
19e-1015	3.09 E-11
20e-1015	9.45 E-11
21e-1015	8.23 E-11
22e-1015	5.68 E-11
24e-1015	6.81 E-12
25e-1015	2.83 E-11
28e-1015	1.74 E-10
29e-1015	3.42 E-11

表 9e ： CXCR5-A2DC

實例編號 (II-)	EO-PROLIF-Rec-1_ADC_CTG_72hIC50 - [mol/l] (平均值)
1x-9574	3.17 E-12
2x-9574*	6.29 E-12
2x-9574	3.04 E-12
3x-9574	＜ 3.00 E-12
4x-9574	＜ 3.00 E-12
5x-9574*	＜ 3.00 E-12
5x-9574	＜ 3.00 E-12
6x-9574*	3.41 E-12 ^*
7x-9574	＜ 3.00 E-11
12x-9574	8.09 E-12
14x-9574	＜ 3.00 E-11
15x-9574*	9.83 E-12 ^*
15x-9574	＜ 3.00 E-11
16x-9574	＜ 3.00 E-11
17x-9574	8.02 E-11
19x-9574	5.51 E-10
20x-9574	＜ 3.00 E-11
23x-9574	＜ 3.00 E-11
25x-9574	＜ 3.00 E-11
26x-9574	2.10 E-11 ^*
27x-9574	3.27 E-11 ^*
28x-9574	3.91 E-11
29x-9574	7.24 E-12

表 9f ： CD123-A2DC

實例編號 (II-)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] MOLM-13 (平均值)	細胞毒性分析IC50 [mol/l] MV-4-11 (平均值)
3c-9476
4c-9476	4.18 E-9	8.57 E-8
5c-9476	8.66 E-11	2.48 E-11
7c-9476	2.07 E-8	7.93 E-9
8c-9476	5.36 E-9	2.69 E-10
9c-9476	1.39 E-8	2.36 E-9
13c-9476	9.29 E-10	9.39 E-11
14c-9476	1.50 E-9	3.07 E-11
15c-9476	2.70 E-10	7.67 E-11
16c-9476	5.00 E-7	5.00 E-7
21c-9476	1.01 E-9	1.83 E-10
22c-9476	5.24 E-9	1.26 E-9
24c-9476	1.21 E-9	3.13 E-10
26c-9476*	3.92 E-11	5.36 E-11
27c-6013	1.50 E-11	2.14 E-11
28c-9476	6.50 E-10	3.47 E-10
29c-9476	5.00 E-7	5.00 E-7

MTT 分析

使用C-I下所列之生長培養基，根據標準方法培育細胞。如下進行測試：用Accutase於PBS (來自Biochrom AG #L2143)中之溶液分離細胞，沉澱(pelletizing)，再懸浮於培養基中，計數且接種於具有白色底部之96孔培養盤(來自Costar #3610)(NCI H292：2500個細胞/孔；SK-HEP-1：1000個細胞/孔；KPL-4：1200個細胞/孔；總體積100 pi)中。接著在培育箱中在37℃及5%二氧化碳下培育細胞。48 h之後，置換培養基。接著將濃度為10 ^-5M至10 ^-13M的含抗體藥物結合物之10 pi培養基吸取至細胞上(重複三次)，且接著在培育箱中在37℃及5%二氧化碳下培育分析物。96 h之後，使用MTT分析(ATCC, Manassas, Va., USA, 目錄號30-1010K)偵測細胞增殖。為此目的，將MTT試劑與細胞一起培育4小時，之後藉由添加清潔劑來溶解細胞過夜。在570 nm (Infinite MlOOO pro, Tecan)偵測所形成的染料。使用DRC (劑量反應曲線)，用所量測數據計算生長抑制之IC50。未經測試物質處理、但在其他方面相同地經處理之細胞的增殖定義為100%數字。表 10 ：與 各別同型對照 A2DC 相比較的指定 實例 11e ：

高效力曲妥珠單抗-A2DC；相對於同型對照A2DC具有格外高之效力及選擇性。

實例	DAR	KPL 4 EC50 [nM]	SKOV 3 EC50 [nM]	NCI N87 EC50 [nM]	SK-BR3 EC50 [nM]
II-11e-1015	3.2	0.1	0.006	0.04	0.003
同型對照A2DC	3.7	500	500	500	500

表 11 ： 指定實例 11m-170 ： A2DC 保留可滲透 ADC 組分之旁觀者毒殺 ： 相比同型對照 A2DC 以及 A2DC 中之各別 ADC 組分， A2DC 對 間皮素轉染之 HT29 細胞、 HT29 野生型及共培養物具有效力

實例	DAR	HT29/Meso ⁺ EC50 [nM]	HT29/Meso ^- EC50 [nM]	HT29 混合物 Meso ⁺/Meso ^- EC50 [nM]
II-11m-170	3.8	0.8	＞300	5
具有可滲透代謝物之參考ADC	6.1	1	226	2
具有不可滲透代謝物之參考ADC	7.3	32	＞300	＞300

表 12 ： 指定實例 15m-170 ： A2DC 對於 間皮素轉染之 HT29 細胞的效力高於各別 ADC ，且亦取決於 目標表現。

實例	DAR	HT29/Meso ⁺ EC50 [nM]	HT29/Meso ^- EC50 [nM]	HT29 混合物 Meso ⁺/Meso ^- EC50 [nM]
II-15m-170	3.6	0.1	＞300	58
具有不可滲透代謝物之參考ADC	4.9	5.4	＞300	＞300

內化分析

內化為能夠經由抗體藥物結合物(ADC)特異性且有效提供細胞毒性有效負載於表現抗原之癌細胞中的關鍵過程。經由特異性抗體及同型對照抗體之螢光標記來監測此過程。首先，使螢光染料與抗體之離胺酸結合。使用兩倍莫耳濃度過量之CypFier 5E單NFiS酯(批次357392，GE Fiealthcare)在pH 8.3下進行結合。偶合之後，藉由凝膠層析(Zeba自旋去鹽管柱，40K，Thermo Scientific，編號87768；溶離緩衝液：DULBECCO'S PBS，Sigma-Aldrich，編號D8537)純化反應混合物，以消除過量染料及調節pH。使用VIVASPIN 500管柱(Sartorius stedim biotec)濃縮蛋白質溶液。藉由分光光度分析(來自NanoDrop)及後續計算(D/P=A _dyeε _protein: (A ₂₈₀-0.16A _dye)ε _dye)測定抗體之染料負載量。

在此所檢測之抗體及同型對照的染料負載量具有類似數量級。在細胞結合分析中，證實偶合不會引起抗體親和力發生變化。

將經標記之抗體用於內化分析。在開始處理之前，將細胞(2×10 ⁴/孔)於100 pi培養基中接種於96孔MTP (粗，黑色，透明底部，編號4308776，來自Applied Biosystems)中。在37℃/5% CO2下培育18 h之後，置換培養基，且添加不同濃度(10、5、2.5、1、0.1 pg/ml)的經標記之抗體。對經標記之同型對照(陰性對照)應用相同處理方案。所選培育時間為0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、6 h及24 h。使用InCeIlAnalyzer 1000 (來自GE Healthcare)進行螢光量測。此後經由量測參數顆粒計數/細胞及總顆粒密度/細胞來進行動力學評估。

結合於受體之後，檢測抗體之內化能力。為此目的，選擇具有不同受體表現量之細胞。觀測到抗體之目標介導之特異性內化，而同型對照未顯示內化。自 A2DC 形成之 代謝物的量化

為了量化自A2DC釋放之A2DC代謝物，將癌細胞與來自實例6之A2DC一起培育72 h。在各時間點收集細胞溶解物及對應上清液，且藉由LC-MS對活性有效負載代謝物進行量化。為了校準，在細胞均質物(對於細胞溶解物)或細胞培養基(對於上清液)中加入0.6至1000 µg/L活性代謝物8。使用耦接至三重四極桿質譜儀API 4500 (AB Sciex)之HPLC分析樣本。

為了展現各別代謝物之形成，在此分析中研究A2DC實例II-6，且偵測作為參考之實例II 6a及6b中所描述之代謝物。在細胞流份中偵測到具有低細胞滲透性之代謝物(實例II-6a)，且在上清液中亦偵測到可滲透代謝物(實例II-6b)。結果展示於圖 5中。 小鼠中之實驗腫瘤之生長抑制 / 消退

將表現抗體藥物結合物之抗原的鼠類腫瘤細胞皮下接種至免疫勝任小鼠(例如Balb/c或C57Bl/6小鼠)之肋腹。自細胞培養物中分離一百萬至一千萬個細胞，離心且再懸浮於培養基或培養基/基質膠中。細胞懸浮液注射於小鼠皮下。幾天內，腫瘤生長。在形成腫瘤之後開始處理，腫瘤尺寸大約40 mm ²。為檢測對較大腫瘤之效果，處理可僅在腫瘤尺寸為50-100 mm ²時起始。腹膜內或經由至小鼠尾靜脈之靜脈內(i.v.)途徑，進行A2DC處理。A2DC以5 ml/kg之體積投與。

研究同基因(小鼠)腫瘤模型CT26及MC38，如免疫組織化學所證實，其皆表現TWEAK受體。在單次處理時以兩個不同劑量(2.5及5 mg/kg)將A2DC實例II-11k-2658*腹膜內注射於攜帶CT26腫瘤之小鼠(Balb/c，雌性)中，且觀測腫瘤生長持續約3週。因此，可展現11k-2658之較強劑量依賴性腫瘤生長抑制。在用5 mg/kg處理三次之攜帶MC38腫瘤之小鼠中發現實例II-11k-2658*之類似較強功效。(圖X1)

在兩個研究中，A2DC化合物耐受良好，不影響嚙齒動物之體重或行為。在大體屍體剖檢中不存在可疑發現。

下文列出來源於此等研究的T/C _area比之彙總。( 表 13)。表 13 ： 來源於不同腫瘤模型之 T/C 比之彙總

A2DC 實例 (II-)	腫瘤模型	劑量	T/C _area( 天 )
11k-2658*	CT26	2.5 mg/kg, SD	0.30 (d17)
11k-2658*	CT26	5 mg/kg, SD	0.15 (d17)
11k-2658*	MC38	5 mg/kg, q3dx3	0.26 (d18)

儘管本文已展示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，此類實施例僅藉助於實例提供。在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到許多變化形式、變化及替代。應理解，在實踐本發明時可採用本文描述的本發明實施例的各種替代方案。以下申請專利範圍旨在限定本發明之範疇，且因此涵蓋此申請專利範圍及其等效者之範疇內的方法及結構。

圖 1展示相比同型對照A2DC以及A2DC中之各別ADC組分，A2DC對間皮素轉染之HT29細胞及HT29野生型細胞的效力(實例I-11m)。

圖 2展示A2DC保留可滲透ADC組分之旁觀者毒殺：相比A2DC中之各別ADC組分，A2DC (實例I-6m)對間皮素轉染之HT29細胞、HT29野生型及共培養物之效力。

圖 3展示用A2DC處理之後，NCI-H292異種移植體之腫瘤生長。

圖 4展示用A2DC處理之後，CT26 (同基因模型)之腫瘤生長。

圖 5展示在間皮素轉染之HT29細胞與實例II-6m之A2DC一起培育之後，在細胞內及細胞外的不同代謝物之分析。

圖 6展示在用A2DC處理之後，CT26 (同基因模型)之腫瘤生長。

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Claims

一種式(I)、式(II)或式(III)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (I) (II) (III) 其中： AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)； AK ²及AK ³各自獨立地為經由半胱胺酸之硫原子或經由離胺酸之氮原子連接的抗體或其抗原結合片段； X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-； L ¹、L ²、L ³及L ⁴各自獨立地為穩定連接子； R ^A為第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團； R ^B為第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；其中R ^A及R ^B為不相同之基團； R ^C及R ^D各自獨立地為蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑； P ⁵為蛋白酶可切割連接子； KSP ⁵為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑； KSP ⁶為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑；且 a、b、y及z各自獨立地為1至50之整數。
如請求項1之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，該抗體藥物結合物具有式(I)結構： (I) 其中： AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)； X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-； L ¹及L ²各自獨立地為穩定連接子； R ^A為第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團； R ^B為第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；其中R ^A及R ^B為不相同之基團；且 a及b各自獨立地為1至50之整數。
如請求項1或2之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ^A為式(i)之第一蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑： (i) KSPi ¹-P ¹- ^#；其中 KSPi ¹為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑， P ¹為第一蛋白酶可切割連接子；且 ^#為R ^A與L ¹之鍵；且 R ^B為式(ii)之第二蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑： (ii) ^##-P ²-KSPi ²；其中 ^##為L ²與R ^B之鍵； P ²為第二蛋白酶可切割連接子； KSPi ²為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑，且其中R ^A及R ^B為不相同之基團。
如請求項1至3中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，該抗體藥物結合物具有式(I')之結構： (I') 其中： AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)； X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-； L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、、、或， P ¹為第一蛋白酶可切割連接子； P ²為第二蛋白酶可切割連接子； KSPi ¹為：； KSPi ²為：； R ¹及R ⁶各自獨立地為鹵素； R ²及R ⁷各自獨立地為C _1-6烷基； m及n各自獨立地為1至5之整數；且 a及b各自獨立地為1至50之整數。
如請求項1之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中P ¹及P ²各自獨立地為豆莢蛋白(legumain)可切割連接子。
如請求項1之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中P ¹及P ²各自獨立地為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-， (2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。
如請求項1之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： AK ¹為抗體或其抗原結合片段(例如經由半胱胺酸之硫原子連接的抗體、經由離胺酸之氮原子連接的抗體或經由半胱胺酸之硫原子及經由離胺酸之氮原子兩者連接的抗體)； X ¹及X ²各自獨立地為-NH-或-S-； L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、、、或； R ^A為：； R ^B為：；其中： R ¹及R ⁶各自獨立地為鹵素； R ²及R ⁷各自獨立地為C _1-6烷基； R ³及R ⁸各自獨立地為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH； R ⁴、R ⁵、R ⁹及R ¹⁰各自獨立地為氫或C _1-6烷基； a及b各自獨立地為1至50之整數； m及n各自獨立地為1至5之整數；且 p、q、r及s各自獨立地為0、1、2、3或4。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中X ¹及X ²各自為-NH-。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中X ¹及X ²各自為-S-。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中X ¹為-NH-且X ²為-S-。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中X ¹為-S-且X ²為-NH-。
如請求項1至11中任一項之抗體藥物結合物，其中AK ¹為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。
如請求項1至12中任一項之抗體藥物結合物，其中L ¹及L ²各自獨立地為：、、、、、、或。
如請求項1至13中任一項之抗體藥物結合物，其中L ¹及L ²各自獨立地為：或。
如請求項1至14中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹獨立地為氟。
如請求項1至15中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²為-C(CH ₃) ₃。
如請求項1至16中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ³獨立地為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-COOH。
如請求項1至17中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ³獨立地為甲基或-CH ₂COOH。
如請求項1至18中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ³為甲基。
如請求項1至18中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ³為-CH ₂COOH。
如請求項1至20中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ⁴為氫或甲基。
如請求項1至21中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ⁵為甲基。
如請求項1至22中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ⁶獨立地為氟。
如請求項1至23中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ⁷為-C(CH ₃) ₃。
如請求項1至24中任一項之抗體藥物結合物，其中R ⁸為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-COOH。
如請求項1至25中任一項之抗體藥物結合物，其中R ⁸為甲基或-CH ₂COOH。
如請求項1至26中任一項之抗體藥物結合物，其中R ⁸為甲基。
如請求項1至26中任一項之抗體藥物結合物，其中R ⁸為-CH ₂COOH。
如請求項1至28中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ⁹為氫或甲基。
如請求項1至29中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁰為甲基。
如請求項1至30中任一項之抗體藥物結合物，其中a為1至25之整數。
如請求項1至31中任一項之抗體藥物結合物，其中a為1至10之整數。
如請求項1至32中任一項之抗體藥物結合物，其中b為1至25之整數。
如請求項1至33中任一項之抗體藥物結合物，其中b為1至10之整數。
如請求項1至34中任一項之抗體藥物結合物，其中m為1至3之整數。
如請求項1至35中任一項之抗體藥物結合物，其中m為2。
如請求項1至36中任一項之抗體藥物結合物，其中n為1至3之整數。
如請求項1至37中任一項之抗體藥物結合物，其中n為2。
如請求項1至38中任一項之抗體藥物結合物，其中p為0、1或2。
如請求項1至39中任一項之抗體藥物結合物，其中p為0或1。
如請求項1至40中任一項之抗體藥物結合物，其中p為0。
如請求項1至40中任一項之抗體藥物結合物，其中p為1。
如請求項1至42中任一項之抗體藥物結合物，其中q為0、1或2。
如請求項1至43中任一項之抗體藥物結合物，其中q為0或1。
如請求項1至44中任一項之抗體藥物結合物，其中q為0。
如請求項1至44中任一項之抗體藥物結合物，其中q為1。
如請求項1至46中任一項之抗體藥物結合物，其中r為0、1或2。
如請求項1至47中任一項之抗體藥物結合物，其中r為0。
如請求項1至47中任一項之抗體藥物結合物，其中r為1。
如請求項1至49中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0、1或2。
如請求項1至50中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0或1。
如請求項1至51中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0。
如請求項1至51中任一項之抗體藥物結合物，其中s為1。
如請求項1至53中任一項之抗體藥物結合物，其中該R ^A-L ¹-X ¹-片段為：或。
如請求項1至54中任一項之抗體藥物結合物，其中該-X ²-L ²-R ^B片段為：或。
如請求項1至55中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物具有式(IA)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IA)。
如請求項56之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物為：、、、、或。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物具有式(IB)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IB)。
如請求項58之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物為：或。
如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物具有式(IC)之結構，或其醫藥學上可接受之鹽： (IC)。
如請求項60之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物為：、、或。
一種式(II)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (II) 其中： AK ²為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體； L ³為穩定連接子； R ^C及R ^D各自獨立地為蛋白酶可切割紡錘體驅動蛋白抑制劑基團；且 z為1至50之整數。
如請求項62之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，該抗體藥物結合物具有式(II')之結構： (II') 其中： AK ²為經由半胱胺酸之硫原子連接、經由離胺酸之氮原子連接或經由其組合連接的抗體； L ³為穩定連接子； P ³及P ⁴各自獨立地為蛋白酶可切割連接子； KSPi ³及KSPi ⁴各自獨立地為紡錘體驅動蛋白抑制劑；且 z為1與50之間的整數。
如請求項63之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中KSPi ³及KSPi ⁴各自獨立地為：、或；其中：各R ¹¹為鹵素；且 n為1至5之整數。
如請求項63之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中P ³及P ⁴各自獨立地為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-， (2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。
如請求項63之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R ^C為； R ^D為或；其中：各R ¹¹為鹵素；各R ¹²為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-CONH ₂；各R ¹³為C _1-6烷基；各R ¹⁴為氫或C _1-6烷基；各R ¹⁵為氫或C _1-6烷基；各R ¹⁶為C _1-6烷基或-C _1-6伸烷基-COOH；各R ¹⁷為氫或C _1-6烷基； n為1至5之整數；且 r、s及t各自獨立地為0、1、2、3或4。
如請求項62至66中任一項之抗體藥物結合物，其中AK ²為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗間皮素(mesothelin) mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。
如請求項62至67中任一項之抗體藥物結合物，其中L ³為、、、、、、、、、、、、或。
如請求項62至68中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹¹獨立地為氟或氯。
如請求項62至69中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹¹為氟。
如請求項62至70中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹²獨立地為甲基、乙基、丙基或-C _1-3伸烷基-CONH ₂。
如請求項62至71中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹²獨立地為甲基或-CH ₂CONH ₂。
如請求項62至72中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹²為甲基。
如請求項62至72中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹²為-CH ₂CONH ₂。
如請求項62至74中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹³獨立地為甲基、乙基、正丙基或異丙基。
如請求項62至75中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹³為甲基。
如請求項62至75中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹³為異丙基。
如請求項62至77中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁴獨立地為氫、甲基、乙基或丙基。
如請求項62至78中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁴獨立地為氫或甲基。
如請求項62至78中任一項之抗體藥物結合物，其中R ¹⁴為氫。
如請求項62至78中任一項之抗體藥物結合物，其中R ¹⁴為甲基。
如請求項62至81中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁵獨立地為氫、甲基、乙基或丙基。
如請求項62至82中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁵為甲基。
如請求項62至83中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁶獨立地為-C _1-6伸烷基-COOH。
如請求項62至84中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁶獨立地為-C _1-3伸烷基-COOH。
如請求項62至85中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁶為-CH ₂COOH。
如請求項62至86中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁷獨立地為C _1-6烷基。
如請求項62至87中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁷獨立地為甲基、乙基或丙基。
如請求項62至88中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ¹⁷為甲基。
如請求項62至89中任一項之抗體藥物結合物，其中n為1至3之整數。
如請求項62至90中任一項之抗體藥物結合物，其中n為2。
如請求項62至91中任一項之抗體藥物結合物，其中r為0、1或2。
如請求項62至92中任一項之抗體藥物結合物，其中r為0或1。
如請求項62至93中任一項之抗體藥物結合物，其中r為0。
如請求項62至93任一項之抗體藥物結合物，其中r為1。
如請求項62至95中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0、1或2。
如請求項62至96中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0或1。
如請求項62至97中任一項之抗體藥物結合物，其中s為0。
如請求項62至97中任一項之抗體藥物結合物，其中s為1。
如請求項62至99中任一項之抗體藥物結合物，其中t為0、1或2。
如請求項62至100中任一項之抗體藥物結合物，其中t為0或1。
如請求項62至101中任一項之抗體藥物結合物，其中t為0。
如請求項62至101中任一項之抗體藥物結合物，其中t為1。
如請求項62至103中任一項之抗體藥物結合物，其中R ^C為：、、或。
如請求項62至104中任一項之抗體藥物結合物，其中R ^D為：、、、、、或。
如請求項62至105中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物為：、、、、、、、、、、、或。
一種式(III)之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽： (III) 其中： AK ³為經由硫原子連接或經由氮原子連接的抗體或其抗原結合片段； L ⁴為穩定連接子； KSP ⁵為第一紡錘體驅動蛋白抑制劑； P ⁵為蛋白酶可切割連接子； KSP ⁶為第二紡錘體驅動蛋白抑制劑；且 y為1至50之整數。
如請求項107之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L ⁴為經取代或未經取代之C _1-60烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至60員雜烷基連接子。
如請求項107或108之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L ⁴具有以下結構：或；其中 #AK ³表示L ⁴與AK ³之鍵；且 #表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵。
如請求項107至109中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： KSPi ⁵為具有以下結構之第一紡錘體驅動蛋白抑制劑：； KSPi ⁶為具有以下結構之第二紡錘體驅動蛋白抑制劑：或其中： #表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵； ##表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵； ### 表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵；各R ²¹獨立地為鹵素；各R ²²獨立地為C _1-6烷基；且 n為1至5之整數。
如請求項107至110中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中P ⁵為包含胺基酸序列(1)至(8)中之一或多者的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-， (2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。
如請求項107至110中任一項之抗體藥物結合物，其中P ⁵為具有以下結構之豆莢蛋白可切割連接子： -P ^5a-L ⁵-P ^5b- 其中： P ^5a及P ^5b各自獨立地為蛋白酶可切割連接子；且 L ⁵為穩定連接子。
如請求項112之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中P ^5a及P ^5b各自獨立地為選自胺基酸序列(1)至(8)的豆莢蛋白可切割連接子： (1) -(L-Asn)(NMe-L-Ala)(L-Ala)-， (2) -(L-Asn)(L-Ala)(L-Ala)-， (3) -(L-Asn)(D-Ala)(L-Ala)-， (4) -(L-Asn)(L-Asp)(L-Ala)-， (5) -(L-Asn)(D-Asp)(L-Ala)-， (6) -(L-Asn)(D-Ser)(L-Ala)-， (7) -(L-Asn)(L-Ala)-，或 (8) -(L-Asn)-。
如請求項112之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L ⁵為穩定連接子，其為經取代或未經取代之C _1-60烷基連接子，或經取代或未經取代之1員至60員雜烷基連接子。
如請求項107至114中任一項之抗體藥物結合物，其中P ⁵為具有以下結構之豆莢蛋白可切割連接子：、、、或。
如請求項107或115之抗體藥物結合物，其中AK ³為抗EGFR mAb、抗Her2 mAb、抗TWEAKR mAb、抗間皮素mAb、抗CD123 mAb或抗CXCR5 mAb。
如請求項107至116中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²¹獨立地為氟或氯。
如請求項107至117中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²¹為氟。
如請求項107至118中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²²獨立地為C _1-4烷基。
如請求項107至119中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²²獨立地為正丁基、異丁基、二級丁基或三級丁基。
如請求項107至120中任一項之抗體藥物結合物，其中各R ²²為三級丁基。
如請求項107至121中任一項之抗體藥物結合物，其中各n獨立地為1至3之整數。
如請求項107至122中任一項之抗體藥物結合物，其中各n為2。
如請求項107至123中任一項之抗體藥物結合物，其中y為1至25之整數。
如請求項107至124中任一項之抗體藥物結合物，其中y為1至10之整數。
如請求項107至124中任一項之抗體藥物結合物，其中y為1至6之整數。
如請求項107至126中任一項之抗體藥物結合物，其中y為2至6之整數。
如請求項107至127中任一項之抗體藥物結合物，其中： KSPi ⁵為：；且 KSPi ⁶為：、或；其中： # 表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵； ## 表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵；且 ###表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵。
如請求項107至127中任一項之抗體藥物結合物，其中： KSPi ⁵為；且 KSPi ⁶為或；其中： # 表示L ⁴與KSPi ⁵之鍵； ## 表示KSPi ⁵與P ⁵之鍵；且 ###表示P ⁵與KSPi ⁶之鍵。
如請求項107至129中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體藥物結合物為：、、、、、或。
如請求項1至61中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中AK為抗體或其抗原結合片段，其包含： a)包含SEQ ID NO: 2中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 6中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 7中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 8中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； b)包含SEQ ID NO: 12中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 13中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 14中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 16中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 17中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 18中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； c)包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 36中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 37中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 38中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； d)包含SEQ ID NO: 62中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 63中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 64中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 66中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 67中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 68中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； e)包含SEQ ID NO: 72中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 73中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 74中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 76中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 77中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 78中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； f)包含SEQ ID NO: 82中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 83中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 84中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 86中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 87中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 88中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； g)包含SEQ ID NO: 92中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 93中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 94中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 96中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 97中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 98中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； h)包含SEQ ID NO: 102中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 103中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 104中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 106中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 107中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 108中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； i)包含SEQ ID NO: 112中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 113中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 114中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 116中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； j)包含與SEQ ID NO: 1至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 5至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； k)包含SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； l)包含與SEQ ID NO: 9至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 10至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； m)包含SEQ ID NO: 9中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； n)包含與SEQ ID NO: 11至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 15至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； o)包含SEQ ID NO: 11中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 15中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； p)包含與SEQ ID NO: 19至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 20至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； q)包含SEQ ID NO: 19中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 20中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； r)包含與SEQ ID NO: 31至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 35至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； s)包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； t)包含與SEQ ID NO: 39至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 40至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； u)包含SEQ ID NO: 39中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 40中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； v)包含與SEQ ID NO: 61至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 65至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； w)包含SEQ ID NO: 61中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 65中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； x)包含與SEQ ID NO: 69至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 70至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； y)包含SEQ ID NO: 69中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 70中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； z)包含與SEQ ID NO: 71至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 75至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； aa)包含SEQ ID NO: 71中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 75中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； bb)包含與SEQ ID NO: 79至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 80至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； cc)包含SEQ ID NO: 79中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 80中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； dd)包含與SEQ ID NO: 81至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 85至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ee)包含SEQ ID NO: 81中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 85中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ff)包含與SEQ ID NO: 89至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 90至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； gg)包含SEQ ID NO: 89中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 90中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； hh)包含與SEQ ID NO: 91至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 95至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ii)包含SEQ ID NO: 91中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 95中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； jj)包含與SEQ ID NO: 99至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 100至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； kk)包含SEQ ID NO: 99中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 100中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； ll)包含與SEQ ID NO: 101至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 105至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； mm)包含SEQ ID NO: 101中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 105中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； nn)包含與SEQ ID NO: 109至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 110至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； oo)包含SEQ ID NO: 109中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 110中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； pp)包含與SEQ ID NO: 111至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 115至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； qq)包含SEQ ID NO: 111中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 115中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； rr)包含與SEQ ID NO: 119至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 120至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈；或 ss)包含SEQ ID NO: 119中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 120中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
如請求項62至106中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中AK ²為抗體或其抗原結合片段，其包含： a)包含SEQ ID NO: 2中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 6中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 7中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 8中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； b)包含SEQ ID NO: 12中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 13中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 14中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 16中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 17中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 18中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； c)包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 36中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 37中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 38中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； d)包含SEQ ID NO: 62中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 63中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 64中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 66中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 67中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 68中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； e)包含SEQ ID NO: 72中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 73中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 74中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 76中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 77中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 78中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； f)包含SEQ ID NO: 82中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 83中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 84中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 86中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 87中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 88中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； g)包含SEQ ID NO: 92中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 93中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 94中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 96中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 97中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 98中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； h)包含SEQ ID NO: 102中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 103中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 104中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 106中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 107中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 108中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； i)包含SEQ ID NO: 112中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 113中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 114中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 116中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； j)包含與SEQ ID NO: 1至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 5至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； k)包含SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； l)包含與SEQ ID NO: 9至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 10至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； m)包含SEQ ID NO: 9中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； n)包含與SEQ ID NO: 11至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 15至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； o)包含SEQ ID NO: 11中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 15中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； p)包含與SEQ ID NO: 19至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 20至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； q)包含SEQ ID NO: 19中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 20中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； r)包含與SEQ ID NO: 31至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 35至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； s)包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； t)包含與SEQ ID NO: 39至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 40至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； u)包含SEQ ID NO: 39中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 40中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； v)包含與SEQ ID NO: 61至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 65至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； w)包含SEQ ID NO: 61中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 65中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； x)包含與SEQ ID NO: 69至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 70至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； y)包含SEQ ID NO: 69中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 70中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； z)包含與SEQ ID NO: 71至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 75至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； aa)包含SEQ ID NO: 71中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 75中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； bb)包含與SEQ ID NO: 79至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 80至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； cc)包含SEQ ID NO: 79中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 80中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； dd)包含與SEQ ID NO: 81至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 85至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ee)包含SEQ ID NO: 81中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 85中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ff)包含與SEQ ID NO: 89至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 90至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； gg)包含SEQ ID NO: 89中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 90中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； hh)包含與SEQ ID NO: 91至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 95至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ii)包含SEQ ID NO: 91中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 95中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； jj)包含與SEQ ID NO: 99至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 100至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； kk)包含SEQ ID NO: 99中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 100中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； ll)包含與SEQ ID NO: 101至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 105至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； mm)包含SEQ ID NO: 101中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 105中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； nn)包含與SEQ ID NO: 109至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 110至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； oo)包含SEQ ID NO: 109中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 110中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； pp)包含與SEQ ID NO: 111至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 115至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； qq)包含SEQ ID NO: 111中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 115中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； rr)包含與SEQ ID NO: 119至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 120至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈；或 ss)包含SEQ ID NO: 119中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 120中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
如請求項107至130中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中AK ³為抗體或其抗原結合片段，其包含： a)包含SEQ ID NO: 2中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 3中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 6中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 7中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 8中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； b)包含SEQ ID NO: 12中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 13中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 14中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 16中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 17中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 18中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； c)包含SEQ ID NO: 32中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 33中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 34中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 36中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 37中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 38中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； d)包含SEQ ID NO: 62中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 63中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 64中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 66中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 67中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 68中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； e)包含SEQ ID NO: 72中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 73中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 74中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 76中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 77中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 78中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； f)包含SEQ ID NO: 82中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 83中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 84中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 86中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 87中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 88中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； g)包含SEQ ID NO: 92中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 93中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 94中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 96中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 97中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 98中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； h)包含SEQ ID NO: 102中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 103中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 104中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 106中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 107中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 108中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； i)包含SEQ ID NO: 112中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；包含SEQ ID NO: 113中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區2 (HCDR2)；包含SEQ ID NO: 114中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區3 (HCDR3)；包含SEQ ID NO: 116中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)；包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區2 (LCDR2)；及/或包含SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區3 (LCDR3)； j)包含與SEQ ID NO: 1至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 5至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； k)包含SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； l)包含與SEQ ID NO: 9至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 10至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； m)包含SEQ ID NO: 9中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 10中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； n)包含與SEQ ID NO: 11至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 15至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； o)包含SEQ ID NO: 11中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 15中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； p)包含與SEQ ID NO: 19至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 20至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； q)包含SEQ ID NO: 19中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 20中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； r)包含與SEQ ID NO: 31至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 35至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； s)包含SEQ ID NO: 31中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 35中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； t)包含與SEQ ID NO: 39至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 40至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； u)包含SEQ ID NO: 39中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 40中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； v)包含與SEQ ID NO: 61至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 65至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； w)包含SEQ ID NO: 61中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 65中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； x)包含與SEQ ID NO: 69至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 70至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； y)包含SEQ ID NO: 69中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 70中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； z)包含與SEQ ID NO: 71至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 75至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； aa)包含SEQ ID NO: 71中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 75中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； bb)包含與SEQ ID NO: 79至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 80至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； cc)包含SEQ ID NO: 79中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 80中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； dd)包含與SEQ ID NO: 81至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 85至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ee)包含SEQ ID NO: 81中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 85中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ff)包含與SEQ ID NO: 89至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 90至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； gg)包含SEQ ID NO: 89中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 90中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； hh)包含與SEQ ID NO: 91至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 95至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； ii)包含SEQ ID NO: 91中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 95中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； jj)包含與SEQ ID NO: 99至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 100至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； kk)包含SEQ ID NO: 99中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 100中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； ll)包含與SEQ ID NO: 101至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 105至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； mm)包含SEQ ID NO: 101中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 105中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； nn)包含與SEQ ID NO: 109至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 110至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； oo)包含SEQ ID NO: 109中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 110中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈； pp)包含與SEQ ID NO: 111至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含與SEQ ID NO: 115至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； qq)包含SEQ ID NO: 111中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區；及/或包含SEQ ID NO: 115中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區； rr)包含與SEQ ID NO: 119至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含與SEQ ID NO: 120至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈；或 ss)包含SEQ ID NO: 119中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及/或包含SEQ ID NO: 120中所列之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項1至133中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之賦形劑。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至133中任一項之抗體藥物結合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上適合之惰性無毒助劑。
一種治療疾病之方法，該方法包含向有需要患者投與如請求項1至133中任一項之抗體藥物結合物。
一種治療過度增殖性及/或血管生成性病症之方法，該方法包含向有需要患者投與如請求項1至133中任一項之抗體藥物結合物，或如請求項134之醫藥組合物。