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TW202430642A - 免疫原組合物及其用途 - Google Patents

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TW202430642A
TW202430642A TW112147806A TW112147806A TW202430642A TW 202430642 A TW202430642 A TW 202430642A TW 112147806 A TW112147806 A TW 112147806A TW 112147806 A TW112147806 A TW 112147806A TW 202430642 A TW202430642 A TW 202430642A
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艾德法特 維傑 巴德卡
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Abstract

本發明係關於包含編碼來源於流行性感冒之抗原之RNA分子的組合物，其中該RNA可調配於脂質奈米粒子(LNP)中，且其中該組合物進一步包括來源於呼吸道融合性病毒(RSV)之多肽抗原及/或編碼來源於RSV之抗原的RNA分子，其中該RSV RNA可調配於LNP中。本發明進一步關於該等RNA分子、RNA-LNP及組合物用於預防流行性感冒及RSV感染誘發之疾病的用途。

Description

免疫原組合物及其用途
本發明係關於用於製備、製造核糖核酸疫苗之組合物及方法以及核糖核酸疫苗之治療用途，該等核糖核酸疫苗包含編碼一或多種流行性感冒抗原(諸如血球凝集素(HA))及/或以下抗原中之任一者的聚核苷酸分子：神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)；其中該組合物、方法及用途進一步包括來源於呼吸道融合性病毒(RSV)多肽之抗原及/或編碼RSV抗原之聚核苷酸分子。
流行性感冒病毒為正黏液病毒科(orthomyxoviridae)之成員，且基於其核蛋白(NP)與基質(M)蛋白之間的抗原差異而分為三種類型(A、B及C)。使用傳統疫苗治療及預防流行性感冒及其他感染之一個挑戰為疫苗廣度有限，僅提供針對緊密相關之亞型的保護。此外，完成現行標準流行性感冒病毒疫苗生產過程所需之時長抑制了在大流行性情形下適應性疫苗之快速開發及生產。需要改良之抗流行性感冒免疫原組合物。
呼吸道融合性病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)為感染肺及呼吸通道之呼吸道病毒。RSV為全世界嬰兒中嚴重病毒性下呼吸道疾病之主要原因及老年人中呼吸道疾病之重要原因。然而，尚無疫苗經批准用於預防RSV感染。
RSV為副黏液病毒科(Paramyxoviridae)之一員。其基因體由編碼11種蛋白質(包括九種結構蛋白(三種醣蛋白及六種內部蛋白)及兩種非結構蛋白)之單股、反義RNA分子組成。結構蛋白包括三種跨膜表面醣蛋白：附著蛋白G、融合蛋白F及疏水性小(SH)蛋白。存在兩種RSV亞型：A及B。其主要在G醣蛋白方面不同，而兩種亞型之間的F醣蛋白之序列更保守。成熟F醣蛋白具有三個一般域：胞外域(ED)、跨膜域(TM)及胞質尾(CT)。CT含有單棕櫚醯化半胱胺酸殘基。人類RSV之F醣蛋白最初自mRNA轉譯為單個574胺基酸多肽前驅物(稱為「F0」或「F0前驅物」)，其在N端含有訊息肽序列(胺基酸1-25)。在轉譯後，訊息肽在內質網中被訊息肽酶移除。F0前驅物之剩餘部分(亦即殘基26-574)可在兩個多鹼基位點(a.a. 109/110及136/137)處被細胞蛋白酶(特定而言弗林蛋白酶(furin))裂解，從而移除稱為pep27 (胺基酸110-136)之27胺基酸插入序列且產生稱為F1 (C端部分；胺基酸137-574)及F2 (N端部分；胺基酸26-109)的兩個連接片段。F1在其N端處含有疏水性融合肽，及兩個七肽(heptad)重複區域(HRA及HRB)。HRA在融合肽附近，且HRB在TM域附近。F1及F2片段透過兩個二硫鍵連接在一起。無訊息肽序列之未裂解的F0蛋白或F1-F2異二聚體二者中之一者可形成RSV F原聚體。三種此類原聚體組裝形成最終RSV F蛋白複合物，其為三種原聚體之同源三聚體。亞型A及B之F蛋白在胺基酸序列方面約90%一致。A亞型之F0前驅多肽的一示例序列提供於SEQ ID NO: 1 (A2病毒株；GenBank GI: 138251；Swiss Prot P03420)中，且B亞型之F0前驅多肽的一示例序列提供於SEQ ID NO: 2 (18537病毒株；GenBank GI: 138250；Swiss Prot P13843)中。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2皆為574胺基酸序列。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之訊息肽序列亦已報導為胺基酸1-25 (GenBank及UniProt)。在兩個序列中，TM域為大致胺基酸530至550，但可替代地報導為525-548。胞質尾始於胺基酸548或550且結束於胺基酸574，其中棕櫚醯化半胱胺酸殘基位於胺基酸550處。RSV F蛋白為探究RSV疫苗之初級抗原。RSV F蛋白三聚體介導病毒粒子膜與宿主細胞膜之間的融合，且亦促進合胞體之形成。在與宿主細胞膜融合之前的病毒粒子中，最大F分子群體形成棒棒糖形狀結構，其中TM域錨定於病毒套膜中。此構形稱為融合前構形。融合前RSV F被單株抗體(mAb) D25、AM22及MPE8識別，寡聚狀態之間無區別。融合前F三聚體被mAb AM14特異性識別。在RSV進入細胞期間，F蛋白透過中間延伸結構自融合前狀態(其在本文中可稱為「F前」)重排為融合後狀態(「F後」)。在此重排期間，融合前分子之C端捲曲螺旋解離成其三個組成股，接著其圍繞球狀頭部捲繞且接合三個額外螺旋以形成融合後六螺旋束。若融合前RSV F三聚體經受愈來愈苛刻的化學或物理條件(諸如高溫)，則其發生結構變化。起初，喪失三聚結構(至少在分子內局部)且接著重排為融合後形式，且接著域發生變性。為了防止病毒進入，F特異性中和抗體可能必須在病毒套膜與細胞膜融合之前結合病毒粒子上之F的融合前構形或可能結合延伸之中間物。因此，F蛋白之融合前形式視為較佳作為期望疫苗抗原之構形。已提供RSV F蛋白之突變體以增加融合前穩定性(參見例如PCT申請案第WO2017/109629號)且為有前景的疫苗候選者。併入F蛋白抗原之RSV疫苗已在研發中。臨床研究已顯示，一些基於F蛋白次單元的疫苗候選者為安全的且具有免疫原性，但保護性功效及保護持久性方面需要提高。
因此，需要改良的免疫原組合物以保護免受RSV感染及流行性感冒侵襲。
本發明尤其描述滿足此等未滿足需求之組合物及其方法。在一個態樣中，本發明提供一種包括一或多個RNA之組合物，各RNA包含編碼一或多種與流行性感冒相關之抗原性多肽的核苷酸序列，其中本文揭示之組合物進一步包含一或多種與呼吸道融合性病毒(RSV)相關之抗原性多肽。在一些實施例中，組合物包含一或多種各編碼RSV多肽之RNA。在一些實施例中，組合物包含一或多種RSV多肽。在一些實施例中，組合物包含一或多種各編碼RSV F蛋白、其變異體、或RSV F蛋白或其變異體之免疫原片段的RNA。在一些實施例中，組合物包含一或多種RSV F蛋白、其免疫原變異體、或RSV F蛋白或其變異體之免疫原片段。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：(i)一或多種各編碼RSV亞型A病毒之多肽(例如F蛋白、其變異體、或F蛋白或其變異體之免疫原片段)的RNA，及一或多種各編碼RSV亞型B病毒之多肽(例如F蛋白、其變異體、或F蛋白或其變異體之免疫原片段)的RNA；或(ii) RSV亞型A病毒之一或多種多肽(例如F蛋白、其變異體、或F蛋白或其變異體之免疫原片段)及RSV亞型B病毒之一或多種多肽(例如F蛋白、其變異體、或F蛋白或其變異體之免疫原片段)。在一些實施例中，RSV F蛋白、變異體或免疫原片段呈融合前構形穩定。在一些實施例中，組合物包含或描述RSVpreF (亦稱為Abrysvo TM)及Arexvy TM。
在一些實施例中，組合物包含：一或多種RNA，各RNA編碼第一傳染原之多肽；及第二傳染原之一或多種多肽。在一些實施例中，組合物包含流行性感冒病毒之一或多種多肽。在一些實施例中，組合物包含一或多種流行性感冒病毒之一或多種多肽(例如，兩種或更多種流行性感冒病毒株之一或多種多肽(例如，在相關地區中普遍或已預測在相關地區中普遍之四種或更多種流行性感冒病毒株之一或多種多肽))。在一些實施例中，組合物包含市售流行性感冒病毒疫苗(例如重組市售流行性感冒病毒疫苗或不活化流行性感冒病毒疫苗)。在一些實施例中，市售流行性感冒病毒疫苗為Flublok或Fluzone。在一些實施例中，組合物包含一或多種來源於RSV之多肽。在一些實施例中，組合物包含一或多種與第一RSV亞型相關之多肽及一或多種與第二RSV亞型相關之多肽。在一些實施例中，組合物包含一或多種RSV F蛋白、其變異體、或RSV F蛋白或其變異體之免疫原片段。在一些實施例中，組合物包含RSV F蛋白，其包含一或多個使F蛋白之融合前構形穩定之突變。在一些實施例中，組合物包含Arexvy TM或ABRYSVO TM。
在一些實施例中，組合物包含：一或多種RNA，各RNA編碼一或多種來源於流行性感冒病毒之多肽、其變異體或其免疫原片段；及一或多種RSV F融合前穩定蛋白。在一些實施例中，組合物包含有包含融合前穩定F蛋白之RSV疫苗(例如本文所描述之RSV疫苗(例如Arexvy TM或ABRYSVO TM))。
在一些實施例中，組合包含流行性感冒疫苗及RSV疫苗，各疫苗提供於單獨容器(例如單獨小瓶及/或注射器)中。在一些實施例中，組合包含：(a)提供於單一容器中之流行性感冒疫苗及提供於單獨容器中之RSV疫苗。
在一些實施例中，組合包含有包含融合前穩定F蛋白之RSV疫苗(例如本文所描述之RSV疫苗(例如RSVpreF或ABRYSVO TM))。
在一個態樣中，本發明提供一種組合物，其包括：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其包括編碼第一抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中該第一RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中；及(ii)呈融合前構形之第一RSV F蛋白三聚體。在一些實施例中，RNA-LNP元件與RSV多肽元件呈組合形式，例如呈摻合物形式存在於組合物中，使得超過一種元件混合在一起以形成組合。出於本發明之目的，「摻合物」係指兩種或更多種化合物在投與之前或之後或同時的任何時間的混合物。在一些實施例中，組合物進一步包括(iii)包括編碼第二抗原之開放閱讀框架的第二RNA聚核苷酸，該第二抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段。在一些實施例中，抗原包括血球凝集素(HA)、或其免疫原片段或變異體。在一些實施例中，抗原各自包括來自流行性感冒病毒之不同亞型的HA或其免疫原片段。在一些實施例中，組合物進一步包括第三RNA聚核苷酸，其包括編碼包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段之抗原的開放閱讀框架。在一些實施例中，第三抗原來自與第一及第二抗原之流行性感冒病毒株不同的流行性感冒病毒株。在一些實施例中，第一、第二及第三RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。在一些實施例中，組合物進一步包括第四RNA聚核苷酸，其包括編碼第四抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段。在一些實施例中，第四抗原來自流行性感冒病毒，但來自與第一、第二及第三抗原不同的流行性感冒病毒株。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。在一些實施例中，RNA聚核苷酸以約相等比率存在。
在一些實施例中，RNA聚核苷酸中之任一者包括經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。在一些實施例中，各RNA聚核苷酸包括5'端帽、5' UTR、3' UTR及3'聚腺苷酸化尾。在一些實施例中，5'端帽包括： 。在一些實施例中，5' UTR包括SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，3' UTR包括SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，3'聚腺苷酸化尾包括SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，RNA聚核苷酸具有大於約85%之完整性。在一些實施例中，RNA聚核苷酸具有大於85%之純度。在一些實施例中，脂質奈米粒子包括20-60 mol%可離子化陽離子脂質、5-25 mol%中性脂質、25-55 mol%膽固醇及0.5-5 mol%經聚合物修飾之脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包括： 。在一些實施例中，經PEG修飾之脂質包括： 。在一些實施例中，第一抗原為來自A型流行性感冒亞型H1之HA或其免疫原片段或變異體且第二抗原為來自與第一抗原不同之H1病毒株之HA或其免疫原片段或變異體。在一些實施例中，第一及第二抗原為來自A型流行性感冒亞型H3或其免疫原片段或變異體之HA且其中兩種抗原來源於H3流行性感冒病毒之不同病毒株。在一些實施例中，第一及第二抗原為來自A型流行性感冒亞型H1之HA或其免疫原片段或變異體且第三及第四抗原來自A型流行性感冒亞型H3或其免疫原片段或變異體，且其中第一及第二抗原來源於H1病毒之不同病毒株且第三及第四抗原來自H3流行性感冒病毒之不同病毒株。在一些實施例中，至少第一及第二RNA聚核苷酸調配於單一脂質奈米粒子中。在一些實施例中，第一、第二及第三RNA聚核苷酸調配於單一脂質奈米粒子中。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。在一些實施例中，RNA聚核苷酸中之各者調配於單一LNP中，其中各單一LNP囊封編碼一種抗原之RNA聚核苷酸。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；且第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中；且第三RNA聚核苷酸調配於第三LNP中。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中；第三RNA聚核苷酸調配於第三LNP中；且第四RNA聚核苷酸調配於第四LNP中。在一些實施例中，本文所描述之組合物中之任一者用於引發個體中針對流行性感冒之免疫反應。
在一些實施例中，第一RSV F蛋白為亞型A之F蛋白。在一些實施例中，第一RSV F蛋白包括相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 103C、148C、190I及486S之組合，較佳A103C、I148C、S190I及D486S；(2) 54H、55C、188C及486S之組合，較佳T54H、S55C、L188C及D486S；(3) 54H、103C、148C、190I、296I及486S之組合，較佳T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S；(4) 54H、55C、142C、188C、296I及371C之組合，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C；(5) 55C、188C及486S之組合，較佳S55C、L188C及D486S；(6) 54H、55C、188C及190I之組合，較佳T54H、S55C、L188C及S190I；(7) 55C、188C、190I及486S之組合，較佳S55C、L188C、S190I及D486S；(8) 54H、55C、188C、190I及486S之組合，較佳T54H、S55C、L188C、S190I及D486S；(9) 155C、190I、290C及486S之組合，較佳S155C、S190I、S290C及D486S；(10) 54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S之組合，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S；(11) 54H、155C、190I、290C及296I之組合，較佳T54H、S155C、S190I、S290C及V296I；及(12) 155C、190F、290C及207L之組合，較佳S155C、S190F、S290C及V207L。在一些實施例中，第一RSV F蛋白包括相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 215P及486N之組合，較佳S215P及D486N；(2) 66E、215P及486N之組合，較佳K66E、S215P及D486N；(3) 66E、76V、215P及486N之組合，較佳K66E、I76V、S215P及D486N；及(4) 66E、67I、76V、215P及486N之組合，較佳K66E、N67I、I76V、S215P及D486N。
在一些實施例中，第一RSV F蛋白包括三聚域。在一些實施例中，組合物進一步包括呈融合前構形之第二RSV F蛋白三聚體。在一些實施例中，第二RSV F蛋白為亞型B之F蛋白。
在一些實施例中，第二RSV F蛋白包括相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 103C、148C、190I及486S之組合，較佳A103C、I148C、S190I及D486S；(2) 54H、55C、188C、486S之組合，較佳T54H、S55C、L188C及D486S；(3) 54H、103C、148C、190I、296I及486S之組合，較佳T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S；(4) 54H、55C、142C、188C、296I及371C之組合，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C；(5) 55C、188C及486S之組合，較佳S55C、L188C及D486S；(6) 54H、55C、188C及190I之組合，較佳T54H、S55C、L188C及S190I；(7) 55C、188C、190I及486S之組合，較佳S55C、L188C、S190I及D486S；(8) 54H、55C、188C、190I及486S之組合，較佳T54H、S55C、L188C、S190I及D486S；(9) 155C、190I、290C及486S之組合，較佳S155C、S190I、S290C及D486S；(10) 54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S之組合，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S；(11) 54H、155C、190I、290C及296I之組合，較佳T54H、S155C、S190I、S290C及V296I；及(12) 155C、190F、290C及207L之組合，較佳S155C、S190F、S290C及V207L。
在一些實施例中，第二RSV F蛋白包括相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 215P及486N之組合，較佳S215P及D486N；(2) 66E、215P及486N之組合，較佳K66E、S215P及D486N；(3) 66E、76V、215P及486N之組合，較佳K66E、I76V、S215P及D486N；及(4) 66E、67I、76V、215P及486N之組合，較佳K66E、N67I、I76V、S215P及D486N。在一些實施例中，第二RSV F蛋白包括三聚域。在一些實施例中，第一RSV F蛋白三聚體為亞型A；其中該組合物進一步包括呈融合前構形之第二RSV F蛋白三聚體，該第二RSV F蛋白三聚體為亞型B。在一些實施例中，組合物進一步包括濃度在約20 mM與約250 mM之間的氯化鈉；(iii)濃度在約5 mg/mL與約100 mg/mL之間的蔗糖、甘露糖醇及甘胺酸中之至少一者；及(iv)緩衝劑；其中該組合物之pH值介於約7與約8之間。
在一些實施例中，LNP呈液態且第一RSV F蛋白三聚體經凍乾。在一些實施例中，LNP呈液態且第一RSV F蛋白三聚體為水溶液。在一些實施例中，組合物之重量莫耳滲透濃度為最多500 mOsm/kg。在一些實施例中，組合物較佳具有介於200 mOsm/kg與400 mOsm/kg之間、較佳介於240-360 mOsm/kg之間且更佳處於290-310 mOsm/kg範圍內的重量莫耳滲透濃度。
在一些實施例中，藉由片段分析儀量測，各RNA具有至少50%完整性。在一些實施例中，各LNP具有至少80%囊封效率，持續至少4小時。在一些實施例中，組合物進一步包括濃度在約20 mM與約250 mM之間的氯化鈉；(iii)濃度在約5 mg/mL與約100 mg/mL之間的蔗糖、甘露糖醇及甘胺酸中之至少一者；及(iv)緩衝劑；其中該組合物之pH值介於約7與約8之間。在一些實施例中，RNA聚核苷酸經純化且實質上不含污染物，包括短流產性RNA物種、長流產性RNA物種、雙股RNA (dsRNA)、殘留質體DNA、殘留活體外轉錄酶、殘留溶劑及/或殘留鹽。在一些實施例中，RSV多肽經純化且實質上不含污染物。在一些實施例中，組合物較佳無菌。組合物較佳為無熱原質的，例如每劑含有＜1 EU (內毒素單位，標準量度)且較佳為每劑＜0.1 EU。組合物較佳不含麩質。人類疫苗通常以約0.5 ml之劑量體積投與，不過可向兒童投與一半劑量(亦即，約0.25 ml)。較佳地，本文中所揭示之組合物不進一步包括以下各者中之任一者：水包油乳液、細胞介素誘導劑或苯并㖠啶化合物、QS-21、CpG序列及3dMPL (亦稱為3去-O-醯化單磷醯基脂質A或3-O-去醯基-4'-單磷醯基脂質A)。在一些較佳實施例中，組合物不進一步包括QS-21或含皂素佐劑。在其他較佳實施例中，組合物不進一步包括含鋁化合物，例如氫氧化鋁及AlPO 4。
在一個態樣中，本文揭示一種組合物，其包括：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其包括編碼第一抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中該第一RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中；(ii)第二RNA聚核苷酸，其包括編碼第二抗原之開放閱讀框架，該第二抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段；(iii)第三RNA聚核苷酸，其包括編碼包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段之抗原之開放閱讀框架；(iv)第四RNA聚核苷酸，其包括編碼第四抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段；及(v)包括編碼至少一種呼吸道融合性病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原片段之至少一個開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RSV抗原性多肽與選自SEQ ID NO: 1至6之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些實施例中，RNA聚核苷酸包括編碼至少一種呼吸道融合性病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原片段之至少一個開放閱讀框架，包括SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16中之任一者中所示之序列。在一些實施例中，RSV抗原性多肽來源於RSV亞型A及/或RSV亞型B。在一些實施例中，該RNA聚核苷酸中之各者包括5'帽、5' UTR、3' UTR及poly-A尾。在一些實施例中，該RNA聚核苷酸中之任一者包括至少一個選自由以下組成之群的經修飾之核苷酸：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。
在一些實施例中，該RNA聚核苷酸中之各者囊封於脂質奈米粒子(LNP)中。在一些實施例中，LNP包括陽離子脂質、聚合物脂質、中性脂質及類固醇或類固醇類似物。
在一些態樣中，本文揭示一種引起個體中針對流行性感冒之免疫反應的方法，其包括投與有效量之任一本文所描述之組合物。在一些態樣中，本文揭示一種引起個體中針對流行性感冒及RSV之免疫反應的方法，其包括投與有效量之任一本文所描述之組合物。在一些態樣中，本文揭示一種預防、治療或改善個體之與流行性感冒及/或RSV相關聯之感染、疾病或病狀的方法，其包括向個體投與有效量之任一本文所描述之組合物。在一些實施例中，個體小於約1歲、約1歲或更大、約5歲或更大、約10歲或更大、約20歲或更大、約30歲或更大、約40歲或更大、約50歲或更大、約60歲或更大、約70歲或更大、或更大。在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射投與任一本文所描述之組合物。
相關申請案之交叉參考本申請案主張以下申請案中之各者的優先權，其中各者之揭示內容以全文引用之方式併入本文中：2022年12月11日申請之美國臨時專利申請案63/431743；2023年1月16日申請之美國臨時專利申請案63/480,099；2023年2月13日申請之美國臨時專利申請案63/484,746；2023年4月15日申請之美國臨時專利申請案63/496,395；2023年6月13日申請之美國臨時專利申請案63/507,755；2023年9月29日申請之美國臨時專利申請案63/587,036；及2023年11月24日申請之美國臨時專利申請案63/602,567。
意外地，本案發明人發現，流感modRNA-LNP組合物可與水性RSV次單元組合物組合調配(例如與水性RSV次單元組合物混合及/或結合)，且所得組合相容且維持相應抗原之穩定性達至少4小時。儘管在RSV次單元組分存在下調配，但流感抗原由囊封mRNA之LNP表現。作為該發現之結果，醫療專業人員可選擇以單次劑量投與不同比率之RSV與流感抗原，同時與在不存在第二抗原下呈獨立調配物投與時相應抗原之穩定性相比，維持抗原穩定性。在一些實施例中，RSV次單元組合物經凍乾且隨後在與流感modRNA-LNP組合物混合及/或結合之前用緩衝溶液復原。
本發明之實施例提供RNA (例如mRNA)疫苗，其包括編碼流行性感冒病毒抗原之聚核苷酸。如本文所提供之流行性感冒病毒RNA疫苗可用於誘導平衡的免疫反應，包含細胞及體液免疫，而無許多與DNA疫苗接種相關之風險。
在一些實施例中，病毒為A型流行性感冒或B型流行性感冒病毒株或其組合。
在一個態樣中，本發明係關於一種免疫原組合物，其包括：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其具有編碼第一抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段；及(ii)第二RNA聚核苷酸，其具有編碼第二抗原之開放閱讀框架，該第二抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中第一及第二RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中。在一些實施例中，第一及第二抗原包括血球凝集素(HA)、或其免疫原片段或變異體。在一些實施例中，第一抗原包括來自與第二抗原之流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段不同亞型之流行性感冒病毒的HA。在一些實施例中，組合物進一步包括(iii)第三抗原，其包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中第三抗原來自流行性感冒病毒但來自與第一及第二抗原兩者不同的流行性感冒病毒株。在一些實施例中，第一、第二及第三RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，組合物進一步包括(iv)第四RNA聚核苷酸，其具有編碼第四抗原之開放閱讀框架，該抗原包括至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中第四抗原來自流行性感冒病毒但來自與第一、第二及第三抗原不同的流行性感冒病毒株。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，RNA聚核苷酸以所需比率在單一容器中混合且隨後調配至脂質奈米粒子中。本案發明人意外地發現，以已知比率在單一LNP方法中調配之不同RNA聚核苷酸之初始輸入產生囊封呈與輸入比率大約相同之比率的不同RNA聚核苷酸的LNP。鑒於製造方法在將RNA聚核苷酸囊封至LNP中時有利於一種RNA聚核苷酸與另一種之可能性，結果為出人意料的。此類實施例在本文中可稱為「預混物」。因此，在一些實施例中，第一及第二RNA聚核苷酸調配於單一脂質奈米粒子中。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。在一些實施例中，第一、第二、第三、第四及第五RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。在一些實施例中，第一、第二、第三、第四、第五及第六RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。在一些實施例中，第一、第二、第三、第四、第五、第六及第七RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。在一些實施例中，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七及第八RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第二RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第二RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第三RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第三RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第四RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第四RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第五RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第五RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第六RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第六RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第七RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第七RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，RNA聚核苷酸之混合物中第一RNA聚核苷酸與第八RNA聚核苷酸之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸與第八RNA聚核苷酸之莫耳比大於1:1。
在替代實施例中，編碼特定抗原之各RNA聚核苷酸調配於個別LNP中，以使得各LNP囊封編碼相同抗原之RNA聚核苷酸。此類實施例在本文中可稱為「後混物」。因此，在一些實施例中，第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中；第三RNA聚核苷酸調配於第三LNP中；第四RNA聚核苷酸調配於第四LNP中；第五RNA聚核苷酸調配於第五LNP中；第六RNA聚核苷酸調配於第六LNP中；第七RNA聚核苷酸調配於第七LNP中；且第八RNA聚核苷酸調配於第八LNP中。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第二LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第二LNP之莫耳比大於1:1。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第三LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第三LNP之莫耳比大於1:1。
在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第四LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第四LNP之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第五LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第五LNP之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第六LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第六LNP之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第七LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第七LNP之莫耳比大於1:1。在一些實施例中，在調配至LNP中之前，LNP之混合物中第一LNP與第八LNP之莫耳比為約1:50、約1:25、約1:10、約1:5、約1:4、約1:3、約1:2、約1:1、約2:1、約3:1、約4:1、或約5:1、約10:1、約25:1或約50:1。在一些實施例中，第一LNP與第八LNP之莫耳比大於1:1。
在一些實施例中，抗原性多肽編碼血球凝集素蛋白或其免疫原片段。在一些實施例中，血球凝集素蛋白為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其免疫原片段。在一些實施例中，血球凝集素蛋白不包含頭域。在一些實施例中，血球凝集素蛋白包含頭域之一部分。在一些實施例中，血球凝集素蛋白不包含細胞質域。在一些實施例中，血球凝集素蛋白包含細胞質域之一部分。在一些實施例中，經截短之血球凝集素蛋白包含跨膜域之一部分。
一些實施例提供流行性感冒疫苗，其包含調配於陽離子脂質奈米粒子內之一或多種具有編碼血球凝集素蛋白之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸以及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，血球凝集素蛋白係選自H1、H7及H10。在一些實施例中，RNA聚核苷酸進一步編碼神經胺糖酸苷酶(NA)蛋白。在一些實施例中，血球凝集素蛋白來源於A型流行性感冒病毒或B型流行性感冒病毒之病毒株或其組合。在一些實施例中，流行性感冒病毒係選自H1N1、H3N2、H7N9及H10N8。
在一些實施例中，病毒為A型流行性感冒或B型流行性感冒病毒株或其組合。在一些實施例中，A型流行性感冒或B型流行性感冒病毒株與鳥類、豬、馬、狗、人類或非人類靈長類動物相關。在一些實施例中，抗原性多肽編碼血球凝集素蛋白或其片段。在一些實施例中，血球凝集素蛋白為H7或H10或其片段。在一些實施例中，血球凝集素蛋白包含頭域(HA1)之一部分。在一些實施例中，血球凝集素蛋白包含細胞質域之一部分。在一些實施例中，經截短之血球凝集素蛋白。在一些實施例中，蛋白質為經截短之血球凝集素蛋白，其包含跨膜域之一部分。在一些實施例中，病毒係選自由H7N9及H10N8組成之群。蛋白質片段、功能蛋白域及同源蛋白質亦被視為在相關多肽之範疇內。舉例而言，本文提供長度為參考蛋白質之10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大於100個胺基酸的任何蛋白質片段(意謂比參考多肽序列短至少一個胺基酸殘基但其他方面相同的多肽序列)。
在一些實施例中，流行性感冒RNA組合物包括編碼抗原性融合蛋白之RNA。因此，所編碼之一或多種抗原可包括兩種或更多種接合在一起之蛋白質(例如蛋白質及/或蛋白質片段)。或者，蛋白質抗原進行融合之蛋白質不促進針對自身之強免疫反應，而是促進針對流行性感冒抗原之強免疫反應。在一些實施例中，抗原性融合蛋白保留各初始蛋白質之功能特性。
一些實施例提供預防或治療流行性感冒病毒感染之方法，其包含向個體投與本文所描述之任一疫苗。在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應。在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含B細胞反應。在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應及B細胞反應兩者。在一些實施例中，產生抗原特異性免疫反應之方法涉及單次投與疫苗。在一些實施例中，藉由皮內、肌肉內注射、皮下注射、鼻內接種或經口投與向個體投與疫苗。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)聚核苷酸或其一部分可編碼作為抗原的流行性感冒病毒株之一或多種多肽或其片段。
本發明進一步提供RNA分子(例如RNA聚核苷酸)，其包含至少一個編碼呼吸道融合性病毒(RSV)抗原之開放閱讀框架(ORF)。在一些態樣中，RSV抗原為RSV多肽。在一些態樣中，RSV多肽為RSV F多肽。在一些態樣中，RSV多肽包含表30之胺基酸序列。在一些態樣中，RNA分子包含由表31之至少一個DNA核酸序列轉錄的ORF。在一些態樣中，RNA分子包含有包含表32之RNA核酸序列的ORF。在一些態樣中，RNA分子包含5'帽、5' UTR、3' UTR及poly-A尾中之至少一者。在其他態樣中，RNA分子包含5'帽、3' UTR及poly-A尾中之至少一者。本發明提供一種包含經修飾之核苷酸之RNA分子。本發明提供免疫原組合物，其包含編碼本文所描述之RSV多肽之RNA分子中的任一者，該等RNA分子與一或多種脂質複合、囊封於其中或與其一起調配且形成脂質奈米粒子(RNA-LNP)。本發明進一步提供一種免疫原組合物，其包含有包含本文所描述之至少一種RNA核酸之RNA分子中的任一者，該等RNA分子與一或多種脂質複合、囊封於其中或與其一起調配且形成RNA-LNP。本發明進一步提供一種經由向個體投與有效量之本文所描述之RNA分子、RNA-LNP或免疫原組合物來預防個體之感染、疾病或病狀(例如RSV感染相關呼吸道疾病，包括肺炎及支氣管炎)的方法。本發明進一步提供一種本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或免疫原組合物作為疫苗之用途。
藉由參考以下對本發明之實施例以及其中包括之實例的詳細描述，可更容易地理解本發明。應理解，本發明不限於特定的製造方法，其當然可有所變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅出於描述具體實施例之目的，且不意欲為限制性的。
本文中所提供的本發明之例示性實施例(E)包括。
本文中所用之章節標題僅出於組織目的且不應被視為限制所描述之主題。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利申請案、專利公開案、UniProtKB寄存編號，均以引用之方式併入本文中，如同具體地且單獨地指出各個別參考文獻以全文引用之方式併入本文中一般。
I. 定義之實例除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常瞭解之含義。
在整個本申請案中，術語「約」係根據其在細胞及分子生物學領域中之普通及一般含義使用，以指示與其結合使用之一或多個值之±10%偏差。
本文中值的範圍之敍述僅意欲充當個別地提及處於該範圍內之每一單獨值的簡寫方法。除非本文中另外指示，否則每一個別值均併入本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。
當與術語「包含」結合使用時，字組「一(a)」或「一(an)」之使用可意謂「一個」，但其亦與「一或多個」、「至少一個」及「一個或多於一個」之含義相符。
片語「及/或」意謂「及」或「或」。舉例而言，A、B及/或C包括：單獨的A、單獨的B、單獨的C、A與B之組合、A與C之組合、B與C之組合或A、B及C之組合。換言之，「及/或」作為包括性或操作。
片語「基本上全部」定義為「至少95%」；若一組中之基本上全部成員具有某一特性，則該組之至少95%成員具有該特性。在一些態樣中，基本上全部意謂等於以下中之任一者、以下中之至少任一者或在以下中之任兩者之間：該組之95%、96%、97%、98%、99%或100%成員具有該特性。
組合物及其使用方法可「包含以下」、「基本上由以下組成」或「由以下組成」：在整個本說明書中所揭示之成分或步驟中之任一者。在整個本說明書中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含(comprising)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放性的，且應理解為暗示包括所陳述步驟或要素或者步驟或要素之群，但不排除包括任何其他步驟或要素或者步驟或要素之群。經考慮，本文在術語「包含」之上下文中描述的態樣亦可在術語「由…………組成」或「基本上由…………組成」的上下文中實施。「基本上由」所揭示之成分或步驟中之任一者「組成」的組合物及方法將申請專利範圍之範疇限制於不實質影響所主張發明之基本及新穎特徵的指定材料或步驟。詞語「由……組成(consisting of)」(及由……組成之任何形式，諸如「由……組成(consist of)」及「由……組成(consists of)」)意謂包括且限於接在片語「由……組成」後面的任何內容。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。
在整個本說明書中對「一個態樣」、「一態樣」、「一特定態樣」、「一相關態樣」、「某一態樣」、「一額外態樣」或「另一態樣」或其組合之提及意謂結合該態樣描述之特定特徵、結構或特性包括在本發明之至少一個態樣中。因此，前述片語在整個本說明書中各處之出現未必皆指代同一態樣。此外，特定特徵、結構或特性可在一或多個態樣中以任何合適方式組合。
術語「抑制(inhibiting)」、「降低(decreasing)」或「減小(reducing)」或此等術語之任何變化形式包括任何可量測的降低(例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%降低)或完全抑制以達成所需結果。術語「改良/提高(improve)」、「促進(promote)」或「增加(increase)」或此等術語之任何變化形式包括任何可量測的增加(例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%增加)以達成蛋白質或分子之所需結果或產生。
如本文所用，術語「參考」、「標準」或「對照」描述相對於其進行比較的值。舉例而言，將藥劑、個體、群體、樣品或相關值與參考、標準或對照藥劑、個體、群體、樣品或相關值進行比較。參考、標準或對照可與藥劑、個體、群體、樣品或相關值之相關測試或測定實質上同時及/或一起進行測試及/或測定，及/或可在與評定下之藥劑、個體、群體、樣品或相關值相當之條件或情況下測定或表徵。
術語「經分離」可指實質上不含起源來源之細胞材料、細菌材料、病毒材料或培養基(當藉由重組DNA技術產生時)、或化學前驅物或其他化學物質(當以化學方式合成時)的核酸或多肽。此外，經分離化合物係指可以經分離化合物形式向個體投與之化合物；換言之，若化合物黏附至管柱或嵌入於瓊脂糖凝膠中，則其不可簡單地視為「經分離」。此外，「經分離核酸片段」或「經分離肽」為天然不以片段形式存在及/或通常不呈功能狀態及/或透過人工干預自天然狀態改變或移除的核酸或蛋白質片段。舉例而言，天然存在於活動物中之DNA並非「經分離的」，但合成DNA或自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之DNA為「經分離的」。經分離核酸可以實質上經純化之形式存在，或可存在於非原生環境(諸如已遞送核酸至其中之細胞)中。
如本文所用，「核酸」為包含核酸組分之分子，且係指DNA或RNA分子。其可與術語「聚核苷酸」互換使用。核酸分子為包含核苷酸單體或由核苷酸單體組成之聚合物，該等核苷酸單體藉由糖/磷酸酯主鏈之磷酸二酯鍵彼此共價連接。核酸亦可涵蓋經修飾之核酸分子，諸如鹼基經修飾、糖經修飾或主鏈經修飾等DNA或RNA分子。核酸可以各種形式存在，諸如：併入序列之經分離之區段及重組載體或編碼多肽(諸如抗原或抗體之一或兩條鏈、或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體)之重組聚核苷酸；足夠用作雜交探針之聚核苷酸；用於鑑別、分析、突變或擴增編碼多肽之聚核苷酸的PCR引子或定序引子；用於抑制本文前文所描述之聚核苷酸、mRNA、saRNA、modRNA及互補序列之表現的反義核酸。核酸可編碼抗體可結合之抗原決定基。
術語「抗原決定基」係指被免疫球蛋白(例如抗體或受體)結合組分特異性識別之部分體。在一些態樣中，抗原決定基包含抗原上之複數個化學原子或基團。在一些態樣中，當抗原採用相關三維構形時，此類化學原子或基團為表面暴露的。在一些態樣中，當抗原採用此類構形時，此類化學原子或基團在空間中物理上彼此接近。在一些態樣中，當抗原採用替代構形(例如線性化)時，至少一些此類化學原子或基團物理上彼此分離。
核酸可為單股或雙股，且可包含RNA及/或DNA核苷酸以及其人工變異體(例如肽核酸)。在一些情況下，核酸序列可編碼具有額外異源編碼序列之多肽序列，例如以實現多肽之純化、運輸、分泌、轉譯後修飾，或實現治療益處，諸如靶向或功效。可向經修飾之多肽編碼序列中添加標籤或其他異源多肽，其中「異源」係指與經修飾多肽不同的多肽。
術語「聚核苷酸」係指可為重組的或已自總基因體核酸分離的核酸分子。術語「聚核苷酸」內包括寡核苷酸(100個殘基或更少殘基長度的核酸)、重組載體(包括例如質體、黏質體、噬菌體、病毒)及其類似者。在某些態樣中，聚核苷酸包括與其天然存在之基因或蛋白質編碼序列實質上分離的調控序列。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股的，且可為RNA、DNA (基因體、cDNA或合成的)、其類似物或其組合。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於聚核苷酸內。
在某些態樣中，存在與本文揭示之序列具有實質上一致性之聚核苷酸變異體；使用本文所描述之方法(例如使用標準參數之BLAST分析)，相較於本文提供之聚核苷酸序列包含等於以下中之任一者、以下中之至少任一者、以下中之至多任一者或以下中之任兩者之間的序列一致性的彼等聚核苷酸變異體：70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高。在某些態樣中，經分離聚核苷酸將包含編碼在整個序列長度上與本文所描述之胺基酸序列具有至少90%一致性之多肽的核苷酸序列；或與該經分離聚核苷酸互補之核苷酸序列。在一些態樣中，經分離聚核苷酸將包含編碼在整個序列長度上與本文所描述之胺基酸序列具有至少95%一致性之多肽的核苷酸序列；或與該經分離聚核苷酸互補之核苷酸序列。
與編碼序列本身之長度無關，核酸區段可與其他核酸序列(諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外限制酶位點、多個選殖位點、其他編碼區段及其類似者)組合，使得其整體長度可顯著變化。核酸可具有任何長度。其可例如等於以下中之任一者、以下中之至少任一者、以下中之至多任一者或在以下中之任兩者之間：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000個或更多個核苷酸之長度；及/或可包含一或多個額外序列(例如調控序列)；及/或可為較大核酸(例如載體)之一部分。因此考慮可使用幾乎任何長度之核酸片段，其中總長度受製備簡易性及預期重組核酸方案中之用途限制。
就此而言，術語「基因」用於指編碼蛋白質、多肽或肽之核酸(包括恰當轉錄、轉譯後修飾或定位所需之任何序列)。如熟習此項技術者將理解，此術語涵蓋基因體序列、表現卡匣、cDNA序列及較小的經工程改造之核酸區段，其表現或可經調適以表現蛋白質、多肽、域、肽、融合蛋白及突變體。編碼全部或一部分多肽之核酸可含有編碼全部或一部分此類多肽之連續核酸序列。亦考慮特定多肽可由含有變化之核酸編碼，該等核酸具有略微不同的核酸序列，但仍編碼相同或實質上類似的多肽。
如本文所用，術語核酸序列之「表現」係指自核酸序列產生任何基因產物。在一些態樣中，基因產物可為轉錄物。在一些態樣中，基因產物可為多肽。在一些態樣中，核酸序列之表現涉及以下中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2)加工RNA轉錄物(例如藉由剪接、編輯等)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及/或(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
一般而言，術語「經工程改造」係指已人工操控之態樣。舉例而言，當未以自然界中之次序連接在一起之兩個或更多個序列藉由人工操控以在經工程改造之聚核苷酸中彼此直接連接時，及/或當聚核苷酸中之特定殘基為非天然存在的及/或透過人工作用使得與在自然界中其未連接之實體或部分連接時，聚核苷酸被視為「經工程改造」。
如本文所用，術語「DNA」意謂包含諸如去氧腺苷單磷酸、去氧胸苷單磷酸、去氧鳥苷單磷酸及去氧胞苷單磷酸單體之核苷酸的核酸分子，該等核苷酸由糖部分(去氧核糖)、鹼基部分及磷酸部分構成，且藉由特徵性主鏈結構聚合。主鏈結構通常藉由第一相鄰單體之核苷酸之糖部分(例如去氧核糖)與第二相鄰單體之磷酸部分之間的磷酸二酯鍵形成。單體之特定次序(例如連接至糖/磷酸主鏈之鹼基之次序)被稱為DNA序列。DNA可為單股或雙股的。在雙股形式中，第一股之核苷酸通常例如藉由A/T鹼基配對及G/C鹼基配對與第二股之核苷酸雜交。DNA可含有全部或大部分去氧核糖核苷酸殘基。如本文所用，術語「去氧核糖核苷酸」意謂在β-D-呋喃核糖基之2'位置處缺乏羥基的核苷酸。在無任何限制之情況下，DNA可涵蓋雙股DNA、反義DNA、單股DNA、經分離DNA、合成DNA、以重組方式產生之DNA及經修飾之DNA。
如本文所用，術語「RNA」意謂包含諸如腺苷單磷酸、尿苷單磷酸、鳥苷單磷酸及胞苷單磷酸單體之核苷酸的核酸分子，該等核苷酸沿著所謂的主鏈彼此連接。主鏈藉由第一相鄰單體之糖(例如核糖)與第二相鄰單體之磷酸部分之間的磷酸二酯鍵形成。RNA可例如在細胞內藉由DNA序列之轉錄獲得。在真核細胞中，轉錄通常在細胞核或粒線體內進行。在活體內，DNA之轉錄可產生未成熟RNA，其被加工成信使RNA (mRNA)。例如在真核生物體中對未成熟RNA之加工包含各種轉錄後修飾，諸如剪接、5'加帽、聚腺苷酸化、自細胞核或粒線體輸出。加工成熟信使RNA且提供可轉譯成肽或蛋白質之胺基酸序列的核苷酸序列。成熟mRNA可包含5'帽、5' UTR、開放閱讀框架、3' UTR及poly-A尾序列。RNA可包含全部或大部分核糖核苷酸殘基。如本文所用，術語「核糖核苷酸」意謂在β-D-呋喃核糖基之2'位置處具有羥基的核苷酸。在一個態樣中，RNA可為與編碼肽或蛋白質之RNA轉錄物相關的信使RNA (mRNA)。如熟習此項技術者已知，mRNA一般含有5'非轉譯區(5' UTR)、多肽編碼區及3'非轉譯區(3' UTR)。在無任何限制之情況下，RNA可涵蓋雙股RNA、反義RNA、單股RNA、經分離RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA及經修飾之RNA (modRNA)。
「經分離RNA」定義為可為重組的或已自總基因體核酸分離的RNA分子。經分離RNA分子或蛋白質可呈實質上經純化之形式存在，或可存在於非原生環境(諸如宿主細胞)中。
「經修飾RNA」或「modRNA」係指與天然存在之RNA相比具有一或多個核苷酸之至少一個添加、缺失、取代及/或改變的RNA分子。此類改變可指將非核苷酸材料添加至內部RNA核苷酸，或添加至RNA之一或多個5'及/或3'端。在一個態樣中，此類modRNA含有至少一個經修飾核苷酸，諸如核苷酸之鹼基之改變。舉例而言，經修飾核苷酸可置換一或多個尿苷及/或胞苷核苷酸。舉例而言，此等置換可針對RNA序列中之尿苷及/或胞苷的每個例項進行，或可僅針對所選擇尿苷及/或胞苷核苷酸進行。RNA中標準核苷酸之此類改變可包括非標準核苷酸，諸如化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。舉例而言，RNA序列中之至少一個尿苷核苷酸可經N1-甲基假尿苷置換。其他此類經改變之核苷酸為熟習此項技術者已知的。此類經改變之RNA分子被視為天然存在之RNA之類似物。在一些態樣中，RNA藉由使用DNA模板進行活體外轉錄而產生，其中DNA係指含有去氧核糖核苷酸之核酸。在一些態樣中，RNA可為複製子RNA (複製子)，尤其自複製RNA或自擴增RNA (saRNA)。
如本文中所考慮，不受任何限制，RNA可用作治療及/或預防哺乳動物(包括人類)之多種病狀的治療模式。本文所描述之方法包含向哺乳動物(諸如人類)投與本文所描述之RNA。舉例而言，在一個態樣中，使用RNA之此類方法包括編碼抗原之RNA疫苗以誘導穩定中和抗體及隨附/伴隨的T細胞反應，從而達成保護性免疫接種。在一些態樣中，投與最小疫苗劑量以誘導穩固中和抗體及隨附/伴隨的T細胞反應，從而達成保護性免疫接種。在一個態樣中，所投與之RNA為活體外轉錄之RNA。舉例而言，此類RNA可用於編碼至少一種意欲在該哺乳動物中產生免疫反應之抗原。病原性抗原為來源於與傳染病相關之病原體的肽或蛋白質抗原。
在具體態樣中，病原性物質為來源於RSV之肽或蛋白質抗原。可用本文所揭示之RNA治療之病狀及/或疾病包括但不限於由病毒感染引起及/或受其影響之彼等病狀及/或疾病。此類病毒包括但不限於RSV。
如本文所用，「預防(Prevent)」或「預防(prevention)」當結合疾病、病症及/或病狀之出現使用時，係指減少出現疾病、病症及/或病狀之風險及/或延遲該疾病、病症或病狀之一或多個特徵或症狀之發作。當疾病、病症或病狀之發作已延遲預定時段時，可認為預防完成。
如將自上下文理解，疾病、病症及/或病狀之「風險」係指特定個體將出現該疾病、病症及/或病狀之可能性。在一些態樣中，風險表示為百分比。在一些態樣中，風險為、至少為或至多為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%直至100%。在一些態樣中，風險表示為相對於與參考樣品或參考樣品組相關之風險的風險。在一些態樣中，參考樣品或參考樣品組具有已知的患疾病、病症、病狀及/或事件之風險。在一些態樣中，參考樣品或參考樣品組來自與特定個體類似之個體。在一些態樣中，風險可反映例如可使個體傾向於罹患(或不患)特定疾病、病症及/或病狀的一或多種遺傳屬性。在一些態樣中，風險可反映一或多種表觀遺傳事件或屬性及/或一或多種生活方式或環境事件或屬性。易患：「易患」疾病、病症及/或病狀之個體為出現該疾病、病症及/或病狀之風險高於一般公眾成員之個體。在一些態樣中，易患疾病、病症及/或病狀之個體可能尚未診斷患有該疾病、病症及/或病狀。在一些態樣中，易患疾病、病症及/或病狀之個體可能展現該疾病、病症及/或病狀之症狀。在一些態樣中，易患疾病、病症及/或病狀之個體可能不展現該疾病、病症及/或病狀之症狀。在一些態樣中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將出現該疾病、病症及/或病狀。在一些態樣中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將不出現該疾病、病症及/或病狀。
術語「蛋白質」、「多肽」或「肽」在本文中作為同義詞使用且係指胺基酸單體之聚合物，例如包含至少兩個胺基酸殘基之分子。多肽可包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述各者之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。蛋白質包含一或多種肽或多肽，且可摺疊成蛋白質發揮其生物功能可能需要的3維形式。
如本文所用，術語「野生型」或「WT」或「原生」係指在生物體中天然存在之分子的內源性形式。在一些態樣中，採用蛋白質或多肽之野生型形式，然而在本發明之其他態樣中，使用經修飾之蛋白質或多肽來產生免疫反應。上文所描述之術語可互換地使用。
「經修飾之蛋白質」或「經修飾之多肽」或「變異體」係指化學結構，尤其其胺基酸序列相對於野生型蛋白質或多肽改變的蛋白質或多肽。在一些態樣中，經修飾/變異蛋白質或多肽具有至少一種經修飾之活性或功能(認識到蛋白質或多肽可具有多種活性或功能)。尤其考慮，經修飾/變異蛋白質或多肽可在一種活性或功能方面改變，但在其他態樣中保留野生型活性或功能，諸如免疫原性。當在本文中特定提及蛋白質時，其一般係指原生(野生型)或重組(經修飾)蛋白質。蛋白質可自原生生物體直接分離，藉由重組DNA/外源性表現方法產生或藉由固相肽合成(SPPS)或其他活體外方法產生。在特定態樣中，存在併有編碼多肽(例如抗原或其片段)之核酸序列的經分離之核酸區段及重組載體。術語「重組」可與多肽或特定多肽之名稱結合使用，且此一般係指由已經活體外操控之核酸分子產生的多肽或作為此類分子之複製產物的多肽。
提及胺基酸序列(肽或蛋白質)時之術語「片段」係指胺基酸序列之一部分，亦即表示在N端及/或C端處縮短之胺基酸序列的序列。在C端處縮短之片段(N端片段)可例如藉由轉譯缺乏開放閱讀框架之3'端的截短開放閱讀框架而獲得。在N端處縮短之片段(C端片段)可例如藉由轉譯缺乏開放閱讀框架之5'端的截短開放閱讀框架而獲得，只要截短開放閱讀框架包含用以起始轉譯之起始密碼子即可。胺基酸序列之片段包含例如來自胺基酸序列之胺基酸殘基的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。在本發明中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之序列一致性的序列：5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少70%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少80%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少85%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少90%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少95%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少97%之序列一致性的序列。在一個態樣中，多肽、DNA核酸或RNA核酸序列之片段係指與其所來源之多肽、DNA核酸或RNA核酸序列具有至少99%之序列一致性的序列。
如本文在分子(例如核酸、蛋白質或小分子)之上下文中所使用，術語「變異型」係指顯示與參考分子之顯著結構一致性但在結構上與該參考分子不同，例如與參考實體相比存在或不存在一或多個化學部分或在一或多個化學部分之含量方面不同的分子。在一些態樣中，變異體亦在功能上與其參考分子不同。一般而言，特定分子是否恰當地視為參考分子之「變異體」係基於其與參考分子之結構一致性的程度。如熟習此項技術者將瞭解，任何生物或化學參考分子均具有某些特徵結構元件。按照定義，變異體為與參考分子共有一或多個此類特徵結構元件但在至少一個態樣上與參考分子不同的不同分子。在一些態樣中，由於胺基酸或核苷酸序列中之一或多個差異及/或作為多肽或核酸之共價組分(例如與多肽或核酸主鏈連接)之化學部分(例如碳水化合物、脂質、磷酸酯基)中之一或多個差異，變異多肽或核酸可能與參考多肽或核酸不同。在一些態樣中，變異多肽或核酸展示與參考多肽或核酸至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之總體序列一致性：85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%。在一些態樣中，變異多肽或核酸不與參考多肽或核酸共有至少一個特徵序列元件。在一些態樣中，參考多肽或核酸具有一或多種生物活性。在一些態樣中，變異多肽或核酸共有參考多肽或核酸之生物活性中之一或多者。在一些態樣中，變異多肽或核酸缺乏參考多肽或核酸之生物活性中之一或多者。在一些態樣中，變異多肽或核酸與參考多肽或核酸相比展現一或多種生物活性水平之降低。在一些態樣中，若相關多肽或核酸之胺基酸或核苷酸序列與參考多肽或核酸之胺基酸或核苷酸序列一致但具有特定位置處之少數序列改變，則將其視為參考多肽或核酸之「變異體」。較佳地，變異多肽或核酸序列與參考多肽或核酸序列相比具有至少一個修飾，例如1個至約20個修飾。在一個態樣中，變異多肽或核酸序列與參考多肽或核酸序列相比具有1個至約10個修飾。在一個態樣中，變異多肽或核酸序列與參考多肽或核酸序列相比具有1個至約5個修飾。在一個態樣中，變異多肽或核酸序列與參考多肽或核酸序列相比具有1個至約4個修飾。通常，與參考相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%或約2%之殘基經取代、插入或缺失。通常，相對於參考，變異多肽或核酸包含極少數目(例如，少於約5個、約4個、約3個、約2個或約1個)經取代、插入或缺失之功能性殘基(例如，參與特定生物活性之殘基)。在一些態樣中，與參考相比，變異多肽或核酸包含約10個、約9個、約8個、約7個、約6個、約5個、約4個、約3個、約2個或約1個經取代之殘基。在一些態樣中，與參考相比，變異多肽或核酸包含少於約25個、約20個、約19個、約18個、約17個、約16個、約15個、約14個、約13個、約10個、約9個、約8個、約7個、約6個且通常少於約5個、約4個、約3個或約2個添加或缺失。在一些態樣中，與參考相比，變異多肽或核酸包含不超過約5個、約4個、約3個、約2個或約1個添加或缺失，且在一些態樣中，不包含添加或缺失。
在一些態樣中，參考多肽或核酸為自然界中存在之「野生型」或「WT」或「原生」序列，包括對偶基因變異。野生型多肽或核酸序列具有未經有意修飾之序列。出於本發明之目的，胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)之「變異體」包含胺基酸插入變異體、胺基酸添加變異體、胺基酸缺失變異體及/或胺基酸取代變異體。核苷酸序列之「變異體」包含核苷酸插入變異體、核苷酸添加變異體、核苷酸缺失變異體及/或核苷酸取代變異體。術語「變異體」包括所有突變體、剪接變異體、轉譯後經修飾之變異體、構形、同功異型物、對偶基因變異體、物種變異體及物種同源物，尤其天然存在之上述物質。術語「變異體」尤其包括胺基酸或核酸序列之片段。
可藉由突變向核酸中引入改變，從而引起該核酸所編碼之多肽(例如，抗原或抗體或抗體衍生物)之胺基酸序列的改變。突變可使用此項技術中已知的任何技術引入。在一個態樣中，使用例如定點突變誘發方案來改變一或多個特定胺基酸殘基。在另一態樣中，使用例如隨機突變誘發方案來改變一或多個隨機選擇之殘基。在一些態樣中，無論以何種方式進行，可針對所需特性來表現及篩選突變多肽。
可在不顯著改變核酸所編碼之多肽的生物活性的情況下將突變引入核酸中。舉例而言，吾人可進行在非必需胺基酸殘基處引起胺基酸取代的核苷酸取代。或者，可將選擇性改變核酸所編碼之多肽的生物活性的一或多個突變引入核酸中。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性。定量改變之實例包括增加、降低或消除活性。定性改變之實例包括改變抗體之抗原特異性。
「序列相似性」指示一致的或表示保守胺基酸取代之胺基酸之百分比。兩個胺基酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的胺基酸之百分比。兩個核酸序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的核苷酸之百分比。
術語「一致%」、「一致性%」或類似術語意欲尤其指待比較之序列之間進行最佳比對中一致之核苷酸或胺基酸的百分比。該百分比純粹為統計學的，且兩個序列之間的差異可能但未必隨機分佈於所比較之序列的整個長度上。兩個序列之比較通常藉由在最佳比對之後相對於比較區段或「窗口」比較序列來進行，以便鑑別相應序列之局部區域。用於比較之最佳比對可手動地或藉助於Smith及Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482之局部同源性演算法、藉助於Neddleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443之局部同源性演算法、藉助於Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444之相似性搜尋演算法、或藉助於使用該等演算法之電腦程式(在Wisconsin遺傳學套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N及TFASTA，Genetics Computer Group)進行。在一些態樣中，使用可在United States National Center for Biotechnology Information (NCBI)網站獲得的BLASTN或BLASTP演算法測定兩個序列之一致性百分比。
一致性百分比係藉由測定所比較之序列對應的相同位置之數目，將此數值除以所比較之位置數(例如，參考序列中之位置數)且將此結果乘以100來獲得。
在一些態樣中，針對參考序列之整個長度的至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之區域給出相似性或一致性程度：約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。舉例而言，若參考核酸序列由200個核苷酸組成，則針對至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸給出一致性程度：約100個、約120個、約140個、約160個、約180個或約200個核苷酸，在一些態樣中，連續核苷酸。在一些態樣中，針對參考序列之整個長度給出相似性或一致性程度。
同源胺基酸序列可展現胺基酸殘基之至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性：40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%。在一個態樣中，同源胺基酸序列展現胺基酸殘基之至少95%一致性。在一個態樣中，同源胺基酸序列展現胺基酸殘基之至少98%一致性。在一個態樣中，同源胺基酸序列展現胺基酸殘基之至少99%一致性。
胺基酸序列(肽或蛋白質)之片段或變異體可為「功能片段」或「功能變異體」。術語胺基酸序列之「功能片段」或「功能變異體」係指展現出與其所來源之胺基酸序列相同或類似之一或多種功能特性的任何片段或變異體，例如其為功能上等效的。關於抗原或抗原序列，一種特定功能為由片段或變異體所來源之胺基酸序列呈現的一或多種免疫原性活性。如本文所用，術語「功能片段」或「功能變異體」尤其係指包含如下胺基酸序列之變異分子或序列，該胺基酸序列與親體分子或序列之胺基酸序列相比具有一或多個胺基酸之變化且仍能夠實現親體分子或序列之一或多種功能，例如誘導免疫反應。在一個態樣中，親體分子或序列之胺基酸序列中之修飾未顯著影響或改變該分子或序列之特徵。
野生型RSV F蛋白之術語「突變體」、RSV F蛋白之「突變體」、「RSV F蛋白突變體」或「經修飾之RSV F蛋白」係指相對於野生型F蛋白呈現所引入突變且針對野生型F蛋白具有免疫原性的多肽。
「來源於」指定胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)之胺基酸序列(肽、蛋白質或多肽)係指第一胺基酸序列之來源。較佳地，來源於特定胺基酸序列之胺基酸序列具有與該特定序列或其片段一致、基本上一致或同源的胺基酸序列。來源於特定胺基酸序列之胺基酸序列可為該特定序列或其片段之變異體。舉例而言，一般技術者應理解，可改變適用於本文中之抗原，使得其在序列上與其所來源之天然存在之序列或原生序列不同，同時保留原生序列之所需活性。
在本發明中，載體係指核酸分子，諸如人工核酸分子。載體可用於併入核酸序列，諸如包含開放閱讀框架之核酸序列。載體包括但不限於儲存載體、表現載體、選殖載體、轉移載體。載體可為RNA載體或DNA載體。在一些態樣中，載體為DNA分子。在一些態樣中，載體為質體載體。在一些態樣中，載體為病毒載體。通常，表現載體將含有所需編碼序列及在特定宿主生物體(例如細菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動物)中或在活體外表現系統中表現可操作地連接之編碼序列所必需的適當其他序列。選殖載體通常用以工程改造及擴增某一所需片段(通常DNA片段)，且可缺乏表現一或多種所需片段所需要的功能性序列。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指與一或多種醫藥學上可接受之載劑一起調配之活性劑。醫藥組合物可為免疫原組合物。在一些態樣中，活性劑以適合投與之單位劑量的量存在於治療方案中，其在向相關群體投與時顯示出統計學上顯著之達成預定治療作用的機率。在一些態樣中，醫藥組合物可專門調配用於非經腸投與，呈例如無菌溶液或懸浮液、或持續釋放調配物形式，例如藉由皮下、肌肉內、靜脈內或硬膜外注射。
如本文所用，術語「疫苗接種」係指投與意欲產生針對例如疾病相關(例如致病)介質(例如病毒)之免疫反應的免疫原組合物。在一些態樣中，疫苗接種可在暴露於疾病相關介質之前、期間及/或之後投與，且在某些態樣中，在暴露於該介質之前、期間及/或之後不久投與。在一些態樣中，疫苗接種包括在時間上適當間隔開地多次投與疫苗組合物。在一些態樣中，疫苗接種產生針對傳染原之免疫反應。在一些態樣中，疫苗接種產生針對腫瘤之免疫反應；在一些此類態樣中，疫苗接種為「個人化」的，因為其部分或完全針對經測定在特定個體之腫瘤中存在的一或多種抗原決定基(例如其可為或包括一或多種新抗原決定基)。
免疫反應係指生物體中之體液反應、細胞反應或體液反應及細胞反應兩者。免疫反應可藉由包括但不限於以下之分析量測：量測特異性識別蛋白質或細胞表面蛋白之抗體之存在或量的分析、量測T細胞活化或增殖的分析、及/或量測在一或多種細胞介素之活性或表現方面之調節的分析。
如本文所用，術語「組合療法」係指個體同時暴露於兩種或更多種治療方案(例如，兩種或更多種治療劑)之彼等情況。在一些態樣中，兩種或更多種方案可同時投與；在一些態樣中，此類方案可依序投與(例如第一方案之全部「劑量」在投與第二方案之任何劑量之前投與)；在一些態樣中，此類藥劑以重疊給藥方案投與。在一些態樣中，組合療法之「投與」可涉及向接受組合中之一或多種其他藥劑或一或多種治療模式(modality)之個體投與一或多種藥劑或一或多種模態。出於清楚起見，組合療法不需要個別藥劑以單一組合物形式一起投與(或甚至必須同時)，但在一些態樣中，兩種或更多種藥劑或其活性部分可以組合式組合物形式或甚至以組合式化合物形式(例如作為單一化學複合物或共價實體之一部分)一起投與。
熟習此項技術者將瞭解術語「給藥方案」可用以指個別地向個體投與之一組單位劑量(通常超過一個)，其通常間隔一定時段。在一些態樣中，既定治療劑具有推薦的給藥方案，其可涉及一或多次劑量。在一些態樣中，給藥方案包含複數個劑量，該等劑量中之各者在時間上與其他劑量分開。在一些態樣中，個別劑量彼此間隔相同長度之時段；在一些態樣中，給藥方案包含複數個劑量及隔開個別劑量之至少兩個不同時段。在一些態樣中，給藥方案內之所有劑量均具有相同單位劑量的量。在一些實施例中，給藥方案內之不同給藥具有不同的量。在一些態樣中，給藥方案包含第一給藥量之第一次給藥，接著為不同於第一給藥量之第二給藥量的一或多次額外給藥。在一些態樣中，給藥方案包含第一給藥量之第一次給藥，接著為與第一給藥量相同之第二給藥量的一或多次額外給藥。在一些態樣中，給藥方案在跨越相關群體投與時與所需或有益結果相關(例如為治療性給藥方案)。
II. 流行性感冒組合物可存在個人處於感染超過一種流行性感冒病毒株之風險下的情形。RNA (例如mRNA)治療性疫苗由於多種因素而尤其適合於組合疫苗接種方法，該等因素包括但不限於製造速度、快速調整疫苗適應察覺到的地理位置威脅的能力及其類似因素。此外，因為疫苗利用人體產生抗原性蛋白質，所以疫苗能夠產生更大、更複雜的抗原性蛋白質，允許人類個體中之正確摺疊、表面表現、抗原呈遞等。為避免超過一種流行性感冒病毒株，可投與組合疫苗，其包括編碼第一流行性感冒病毒或生物體之至少一種抗原性多肽蛋白質(或其抗原性部分)的RNA (例如mRNA)且進一步包括編碼第二流行性感冒病毒或生物體之至少一種抗原性多肽蛋白質(或其抗原性部分)的RNA。RNA (例如mRNA)可共調配於例如單一脂質奈米粒子(LNP)中或可調配於單獨LNP中以用於共投與。
本發明之一些實施例提供流行性感冒病毒(流感病毒)疫苗(或組合物或免疫原組合物)，其包括至少一種具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽或其免疫原片段(例如能夠誘導針對流行性感冒之免疫反應的免疫原片段)之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。
在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為HA之經界定之抗原性子域中的一者，稱為HA1、HA2或HA1與HA2之組合，及至少一種選自神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)及非結構蛋白2 (NS2)之抗原性多肽。
在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為包含來自HA1及/或HA2之抗原性序列的HA或其衍生物，及至少一種選自NA、NP、M1、M2、NS1及NS2之抗原性多肽。
在一些實施例中，至少一種抗原性多肽為包含來自HA1及/或HA2之抗原性序列的HA或其衍生物，及至少兩種選自NA、NP、M1、M2、NS1及NS2之抗原性多肽。
在一些實施例中，疫苗包含至少一種具有編碼流行性感冒病毒蛋白或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。
在一些實施例中，疫苗包含至少一種具有編碼多種流行性感冒病毒蛋白或其免疫原片段之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。
在一些實施例中，疫苗包含至少一種具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如至少一種HA1、HA2或兩者之組合)之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸。
在一些實施例中，疫苗包含：至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個HA1、HA2或兩者之組合：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)的開放閱讀框架；及至少一種其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼選自獲自流行性感冒病毒之NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白之蛋白質的開放閱讀框架。
在一些實施例中，疫苗包含：至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)的開放閱讀框架；及至少兩種其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼兩種選自獲自流行性感冒病毒之NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白之蛋白質的兩個開放閱讀框架。
在一些實施例中，疫苗包含：至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)的開放閱讀框架；及至少三種其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼三種選自獲自流行性感冒病毒之NP蛋白、NA蛋白、M蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白之蛋白質的三個開放閱讀框架。
在一些實施例中，疫苗包含：至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)的開放閱讀框架；及至少四種其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼四種選自獲自流行性感冒病毒之NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白之蛋白質的四個開放閱讀框架。
在一些實施例中，疫苗包含：至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)的開放閱讀框架；及至少五種其他RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼五種選自獲自流行性感冒病毒之NP蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白及NS2蛋白之蛋白質的五個開放閱讀框架。
在一些實施例中，疫苗包含至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其具有編碼HA蛋白或其免疫原片段(例如以下中之任一者或以下任何或所有之組合的至少一個：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及/或H18)、獲自流行性感冒病毒之NP蛋白或其免疫原片段、NA蛋白或其免疫原片段、M1蛋白或其免疫原片段、M2蛋白或其免疫原片段、NS1蛋白或其免疫原片段及NS2蛋白或其免疫原片段的開放閱讀框架。
本發明之一些實施例提供以下新穎流行性感冒病毒多肽序列：H1HA10-摺疊子_ΔNgly1；H1HA10TM-PR8 (H1 A/Puerto Rico/8/34 HA)；H1HA10-PR8-DS (H1 A/Puerto Rico/8/34 HA；pH1HA10-Cal04-DS (H1 A/California/04/2009 HA)；來自California 04之Pandemic H1HA10；pH1HA10-鐵蛋白；HA10；來自California 04之Pandemic H1HA10；來自California 04病毒株之Pandemic H1HA10/無摺疊子且具有K68C/R76C突變進行三聚；來自A/Puerto Rico/8/34病毒株之H1HA10，無摺疊子且具有Y94D/N95L突變進行三聚；來自A/Puerto Rico/8/34病毒株之H1HA10，無摺疊子且具有K68C/R76C突變進行三聚；H1N1 A/Viet Nam/850/2009；H3N2 A/Wisconsin/67/2005；H7N9 (A/Anhui/1/2013)；H9N2 A/Hong Kong/1073/99；H10N8 A/JX346/2013。
本發明之一些實施例提供流行性感冒病毒(流感)疫苗，其包括至少一種具有編碼上述新穎流行性感冒病毒多肽序列之至少一種流行性感冒抗原性多肽或免疫原片段(例如能夠誘導針對流行性感冒之免疫反應的免疫原片段)之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，流行性感冒疫苗包含至少一種編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA (例如mRNA)聚核苷酸，該至少一種流行性感冒抗原性多肽包含與上述新穎流行性感冒病毒序列之胺基酸序列至少75% (例如75%與100%之間的任何數目，包括端值，例如70%、80%、85%、90%、95%、99%及100%)一致的經修飾之序列。經修飾之序列可與上述新穎流行性感冒病毒序列之胺基酸序列至少75% (例如，75%與100%之間的任何數值，包括端值，例如70%、80%、85%、90%、95%、99%及100%)一致。
本發明之一些實施例提供一種經分離核酸，其包含編碼上述新穎流行性感冒病毒多肽序列之序列；包含該核酸之表現載體；及包含該核酸之宿主細胞。本發明亦提供一種產生上述新穎流行性感冒病毒序列中之任一者之多肽的方法。方法可包括在培養基中在允許上述新穎流行性感冒病毒序列之核酸表現的條件下培養宿主細胞，及自所培養細胞或細胞培養基純化新穎流行性感冒病毒多肽。本發明亦提供針對新穎流行性感冒病毒序列之抗體分子，包括全長抗體及抗體衍生物。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗之開放閱讀框架經密碼子最佳化。在一些實施例中，編碼流行性感冒多肽或其片段之開放閱讀框架經密碼子最佳化。一些實施例提供流行性感冒疫苗之用途，該流行性感冒疫苗包括至少一種具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架的核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其中開放閱讀框架中之尿嘧啶的至少80% (例如85%、90%、95%、98%、99%、100%)具有化學修飾，視情況其中疫苗調配於脂質奈米粒子中。在一些實施例中，開放閱讀框架中100%尿嘧啶具有化學修飾。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之5-位置中。在一些較佳實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗進一步包含佐劑。
在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種附接至細胞受體之流行性感冒抗原性多肽。
在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種引起病毒與細胞膜融合之流行性感冒抗原性多肽。
在一些實施例中，至少一種RNA聚核苷酸編碼至少一種引起病毒與所感染細胞之結合的流行性感冒抗原性多肽。
本發明之一些實施例提供一種疫苗，其包括具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架、至少一種5'端帽及至少一種化學修飾的至少一種核糖核酸(RNA) (例如mRNA)聚核苷酸，該疫苗在脂質奈米粒子內調配。
在一些實施例中，5'端帽為7mG(5')ppp(5')NlmpNp。在一些較佳實施例中，5'帽包含： 。在一些實施例中，至少一種化學修飾係選自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之5-位置中。在一些實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，化學修飾為N1-乙基假尿苷。
在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG修飾之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質為可離子化陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。在一些實施例中，陽離子脂質係選自由以下組成之群：2,2-二亞油基-4-二甲胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、二亞油基-甲基-4-二甲基胺基丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基) 9-((4-(二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一-12,15-二烯-1-胺(L608)及N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基環丙基]十七烷-8-胺(L530)。
本發明之一些實施例提供一種疫苗，其包括具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，其中開放閱讀框架中至少80% (例如85%、90%、95%、98%、99%)之尿嘧啶具有化學修飾，視情況其中該疫苗調配於脂質奈米粒子(例如脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG修飾之脂質、固醇及非陽離子脂質)中。
在一些實施例中，開放閱讀框架中100%尿嘧啶具有化學修飾。在一些實施例中，化學修飾位於尿嘧啶之5-位置中。在一些實施例中，化學修飾為N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，開放閱讀框架中100%尿嘧啶在尿嘧啶之5-位置中具有N1-甲基假尿苷。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)聚核苷酸之開放閱讀框架編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼至少兩種、至少五種或至少十種抗原性多肽。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼至少100種抗原性多肽。在一些實施例中，開放閱讀框架編碼1-100種抗原性多肽。
在一些實施例中，疫苗包含至少兩種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，各具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含至少五種或至少十種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，各具有編碼至少一種抗原性多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含至少100種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，各具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架。在一些實施例中，疫苗包含2-100種RNA (例如mRNA)聚核苷酸，各具有編碼至少一種抗原性多肽之開放閱讀框架。
本文亦提供前述段落中之任一者的流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗，其調配於奈米粒子(例如脂質奈米粒子)中。
在一些實施例中，奈米粒子具有50-200 nm之平均直徑。在一些實施例中，奈米粒子為脂質奈米粒子。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質、經PEG修飾之脂質、固醇及非陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含約20-60%陽離子脂質、0.5-15%經PEG修飾之脂質、25-55%固醇及25%非陽離子脂質之莫耳比。在一些實施例中，陽離子脂質為可離子化陽離子脂質且非陽離子脂質為中性脂質，且固醇為膽固醇。
在一些實施例中，奈米粒子具有小於0.4 (例如小於0.3、0.2或0.1)之多分散性值。
在一些實施例中，奈米粒子在中性pH值下具有淨中性電荷。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗為多價的。
本發明之一些實施例提供在個體中誘導抗原特異性免疫反應之方法，其包含以有效產生抗原特異性免疫反應之量向個體投與如本文所提供之RNA (例如mRNA)疫苗中之任一者。在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗為流行性感冒疫苗。在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗為包含流行性感冒疫苗之組合的組合疫苗(廣譜流行性感冒疫苗)。
在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應。
在一些實施例中，產生抗原特異性免疫反應之方法包含向個體投與單次劑量(無加強劑量)之本發明之流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。
在一些實施例中，方法進一步包含向個體投與第二(加強)劑量之流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。可投與額外劑量之流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。
在一些實施例中，在第一劑量或第二(加強)劑量之疫苗之後，個體展現至少80% (例如至少85%、至少90%或至少95%)之血清轉化率。血清轉化為特異性抗體出現且在血液中變得可偵測的時段。在出現血清轉化之後，可在抗體之血液測試中偵測到病毒。在感染或免疫接種期間，抗原進入血液，且免疫系統作為反應開始產生抗體。在血清轉化之前，抗原本身可為或可不為可偵測的，但抗體視為不存在的。在血清轉化期間，存在抗體，但其尚不可被偵測到。在血清轉化之後的任何時間，可在血液中偵測到抗體，指示先前或當前感染。
在一些實施例中，藉由皮內注射、肌肉內注射或藉由鼻內投與向個體投與流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。在一些實施例中，藉由肌肉內注射向個體投與流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。
本發明之一些實施例提供在個體中誘導抗原特異性免疫反應之方法，其包含以在個體中有效產生抗原特異性免疫反應之量向個體投與流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗。在一些實施例中，可藉由在向個體投與本發明之任何流行性感冒RNA (例如mRNA)疫苗之後分析抗體力價(與流行性感冒抗原性多肽結合之抗體的力價)來測定個體中之抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加了至少1個對數。在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加了1-3個對數。
在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加至少2倍。在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加至少5倍。在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加至少10倍。在一些實施例中，相對於對照，個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價增加2-10倍。 在一些實施例中，對照為在尚未投與本發明之RNA (例如mRNA)疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。在一些實施例中，對照為在已投與減毒或不活化流行性感冒之個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價，或其中對照為在已投與重組或純化的流行性感冒蛋白質疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。在一些實施例中，對照為已投與流行性感冒病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。
本發明之RNA (例如mRNA)疫苗以有效量(有效誘導免疫反應之量)投與至個體。在一些實施例中，有效量為相當於重組流行性感冒蛋白質疫苗之標準護理劑量減少至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍的劑量，其中個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價等效於投與標準護理劑量之重組流行性感冒蛋白質疫苗、經純化之流行性感冒蛋白質疫苗、減毒流行性感冒疫苗、不活化流行性感冒疫苗或流行性感冒VLP疫苗之對照個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。在一些實施例中，有效量為相當於重組流行性感冒蛋白質疫苗之標準護理劑量減少2-1000倍的劑量，其中個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價等效於投與標準護理劑量之重組流行性感冒蛋白質疫苗、經純化之流行性感冒蛋白質疫苗、減毒流行性感冒疫苗、不活化流行性感冒疫苗或流行性感冒VLP疫苗之對照個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。
在一些實施例中，對照為已投與包含流行性感冒結構蛋白之病毒樣粒子(VLP)疫苗之個體中產生的抗抗原性多肽抗體力價。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗係以在個體中產生抗原特異性免疫反應的有效量調配。
在一些實施例中，有效量為25 μg至1000 μg或50 μg至1000 μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為100 μg之總劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與25 μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與100 μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與400 μg之劑量。在一些實施例中，有效量為總計兩次向個體投與500 μg之劑量。
在一些實施例中，RNA(例如mRNA)疫苗之功效(或有效性)大於60%。在一些實施例中，疫苗之RNA (例如mRNA)聚核苷酸為至少一種流行性感冒抗原性多肽。
在一些實施例中，RNA (例如mRNA)疫苗之功效(或有效性)為至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%。
在一些實施例中，疫苗使個體對流行性感冒免疫長達2年。在一些實施例中，疫苗使個體對流行性感冒免疫超過2年、超過3年、超過4年或5-10年。
在一些實施例中，個體為約5歲或更小。舉例而言，個體年齡可在約1歲至約5歲之間(例如約1、2、3、5或5歲)，或年齡在約6個月至約1歲之間(例如約6、7、8、9、10、11或12個月)。在一些實施例中，個體為約12個月或更小(例如12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2個月或1個月)。在一些實施例中，個體為約6個月或更小。
在一些實施例中，個體為足月出生(例如約37-42週)。在一些實施例中，個體早產，例如在妊娠約36週或更早(例如約36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26或25週)出生。舉例而言，個體可能在妊娠約32週或更早出生。在一些實施例中，個體在妊娠約32週至約36週之間早產。在此類個體中，RNA (例如mRNA)疫苗可在以後生活中投與，例如在約6個月至約5歲或更大時投與。
在一些實施例中，個體為年齡在約20歲至約50歲(例如約20、25、30、35、40、45或50歲)之間的年輕人。
在一些實施例中，個體為約60歲、約70歲或更大(例如約60、65、70、75、80、85或90歲)老年個體。
在一些實施例中，個體已暴露於流行性感冒(例如沙眼披衣菌(C. trachomatis))；個體感染流行性感冒(例如沙眼披衣菌)；或個體處於感染流行性感冒(例如沙眼衣原體)之風險下。
在一些實施例中，個體已暴露於β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)；個體已感染β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)；或個體處於感染β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)之風險下。
在一些實施例中，個體已接受至少一次劑量之針對β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)的免疫原組合物，該免疫原組合物例如選自COMIRNATY®、Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273 COVID-19疫苗及Janssen COVID-19疫苗中之任一者；個體已接受至少兩次劑量之針對β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)之免疫原組合物；個體正在接受至少一次劑量之針對β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)之免疫原組合物，該免疫原組合物例如選自COMIRNATY®、Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273 COVID-19疫苗及Janssen COVID-19疫苗中之任一者；或正在對個體投與針對β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)之免疫原組合物，該免疫原組合物例如選自COMIRNATY®、Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗、Moderna mRNA-1273 COVID-19疫苗及Janssen COVID-19疫苗中之任一者，該個體伴隨、同時或在本文揭示之針對流行性感冒之任一免疫原組合物之12-48小時內，處於感染β冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)之風險下。
在一些實施例中，個體免疫功能不全(具有受損免疫系統，例如患有免疫病症或自體免疫病症)。
在一些實施例中，本文所描述之核酸疫苗經化學修飾。在其他實施例中，核酸疫苗未經修飾。
其他態樣提供用於對個體進行疫苗接種的組合物及方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多種具有編碼第一病毒抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，且其中佐劑不與疫苗共同調配或共同投藥。
在其他態樣中，本文揭示一種用於對個體進行疫苗接種的組合物或方法，其包含向個體投與核酸疫苗，該核酸疫苗包含一或多個具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中向個體投與10 μg/kg與400 μg/kg之間的劑量的核酸疫苗。在一些實施例中，RNA聚核苷酸之劑量為每劑量1至5 μg、5至10 μg、10至15 μg、15至20 μg、10至25 μg、20至25 μg、20至50 μg、30至50 μg、40至50 μg、40至60 μg、60至80 μg、60至100 μg、50至100 μg、80至120 μg、40至120 μg、40至150 μg、50至150 μg、50至200 μg、80至200 μg、100至200 μg、120至250 μg、150至250 μg、180至280 μg、200至300 μg、50至300 μg、80至300 μg、100至300 μg、40至300 μg、50至350 μg、100至350 μg、200至350 μg、300至350 μg、320至400 μg、40至380 μg、40至100 μg、100至400 μg、200至400 μg或300至400 μg。在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與核酸疫苗。在一些實施例中，在第零天向個體投與核酸疫苗。在一些實施例中，在第二十一天向個體投與第二劑量的核酸疫苗。
在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為25微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為100微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為50微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為75微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與給個體之核酸疫苗中包括劑量為150微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為400微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，在投與個體之核酸疫苗中包括劑量為200微克的RNA聚核苷酸。在一些實施例中，RNA聚核苷酸在局部淋巴結中之累積量比遠端淋巴結中高100倍。在其他實施例中，核酸疫苗經化學修飾；且在其他實施例中，核酸疫苗不經化學修飾。
本發明之態樣提供一種核酸疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，其中RNA聚核苷酸不包括穩定元件，其中佐劑不包括在疫苗中。在一些實施例中，穩定元件為組蛋白莖-環。在一些實施例中，穩定元件為GC含量相對於野生型序列增加的核酸序列。
本發明之態樣提供核酸疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥之調配物形式存在，對於可接受百分比之人類個體而言，其賦予對第一抗原優於血清保護標準之抗體力價。在一些實施例中，藉由本發明之mRNA疫苗產生之抗體力價為中和抗體力價。在一些實施例中，中和抗體力價大於蛋白質疫苗。在其他實施例中，藉由本發明之mRNA疫苗產生的中和抗體力價大於輔助蛋白質疫苗。在其他實施例中，藉由本發明之mRNA疫苗產生的中和抗體力價為1,000-10,000、1,200-10,000、1,400-10,000、1,500-10,000、1,000-5,000、1,000-4,000、1,800-10,000、2000-10,000、2,000-5,000、2,000-3,000、2,000-4,000、3,000-5,000、3,000-4,000或2,000-2,500。中和力價通常表示為達成斑塊數目減少50%所需的最高血清稀釋度。
亦提供核酸疫苗，其包含一或多種具有編碼第一抗原性多肽之開放閱讀框架的RNA聚核苷酸，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥之調配物形式存在，其所引起的高抗體力價持續時間比由具有穩定化元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA疫苗所引起的抗體力價長。在一些實施例中，RNA聚核苷酸經調配以在單次投藥一週之內產生中和抗體。在一些實施例中，佐劑係選自陽離子肽及免疫刺激性核酸。在一些實施例中，陽離子肽為魚精蛋白。在一些較佳實施例中，凍乾組合物不包含魚精蛋白。
態樣提供核酸疫苗，其包含一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中RNA聚核苷酸以用於向宿主活體內投藥之調配物形式存在，使得宿主中的抗原表現量顯著超過由具有穩定元件或用佐劑調配且編碼第一抗原性多肽的mRNA疫苗產生的抗原表現量。
其他態樣提供核酸疫苗，其包含一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，其中該疫苗具有的RNA聚核苷酸比未經修飾之mRNA疫苗產生等效抗體力價所需的RNA聚核苷酸少至少10倍。在一些實施例中，RNA聚核苷酸以25-100微克的劑量存在。
本發明之態樣亦提供疫苗使用單元，其包含10 μg與400 μg之間的一或多種具有開放閱讀框架、包含至少一個化學修飾或視情況不含經修飾之核苷酸的RNA聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，該開放閱讀框架編碼第一抗原性多肽，該疫苗使用單元經調配用於遞送至人類個體。在一些實施例中，疫苗進一步包含陽離子脂質奈米粒子。
本發明之態樣提供在一名個體或一群個體中創建、維持或恢復對病毒株之抗原記憶的方法，其包含向該個體或群體投與增強抗原記憶之核酸疫苗，該核酸疫苗包含(a)至少一種RNA聚核苷酸，該聚核苷酸包含至少一個化學修飾或視情況不含化學修飾及兩個或更多個經密碼子最佳化之開放閱讀框架，該等開放閱讀框架編碼一組參考抗原性多肽，及(b)視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，經由選自由肌肉內投與、皮內投與及皮下投與組成之群的途徑向個體投與疫苗。在一些實施例中，投與步驟包含使個體之肌肉組織與適合於注射組合物之裝置接觸。在一些實施例中，投與步驟包含與電穿孔組合，使個體之肌肉組織與適合於注射組合物之裝置接觸。
在一些態樣中，提供在個體中誘導抗原特異性免疫反應之方法。該方法包括以有效產生抗原特異性免疫反應之量向個體投與流行性感冒RNA組合物。在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應或B細胞反應。在一些實施例中，抗原特異性免疫反應包含T細胞反應及B細胞反應。在一些實施例中，產生抗原特異性免疫反應之方法涉及單次投與疫苗。在一些實施例中，方法進一步包括向個體投與加強劑量之疫苗。在一些實施例中，藉由皮內或肌肉內注射向個體投與疫苗。
在本發明之例示性實施例中，有效疫苗產生大於1:40、大於1:100、大於1:400、大於1:1000、大於1:2000、大於1:3000、大於1:4000、大於1:500、大於1:6000、大於1:7500、大於1:10000之抗體力價。在例示性實施例中，在疫苗接種之後10天、疫苗接種之後20天、疫苗接種之後30天、疫苗接種之後40天或疫苗接種之後50天或更多天產生或達到抗體力價。在例示性實施例中，在向個體投與之單次劑量之疫苗之後產生或達到力價。在其他實施例中，在多次劑量後，例如在第一次及第二次劑量(例如加強劑量)後產生或達到力價。在本發明之例示性態樣中，抗原特異性抗體以μg/ml為單位量測或以IU/L (國際單位/公升)或mIU/ml (毫國際單位/毫升)為單位量測。在本發明之例示性實施例中，有效疫苗產生＞0.5 μg/ml、＞0.1 μg/ml、＞0.2 μg/ml、＞0.35 μg/ml、＞0.5 μg/ml、＞1 μg/ml、＞2 μg/ml、＞5 μg/ml或＞10 μg/ml。在本發明之例示性實施例中，有效疫苗產生＞10 mIU/ml、＞20 mIU/ml、＞50 mIU/ml、＞100 mIU/ml、＞200 mIU/ml、＞500 mIU/ml或＞1000 mIU/ml。在例示性實施例中，在疫苗接種之後10天、疫苗接種之後20天、疫苗接種之後30天、疫苗接種之後40天或疫苗接種之後50天或更多天產生或達到抗體含量或濃度。在例示性實施例中，在向個體投與之單次劑量之疫苗之後產生或達到該含量或濃度。在其他實施例中，在多次劑量後，例如在第一次及第二次劑量(例如加強劑量)後產生或達到含量或濃度。在例示性實施例中，藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)測定或量測抗體含量或濃度。在例示性實施例中，藉由中和分析，例如藉由微量中和分析測定或量測抗體含量或濃度。
III. 呼吸道融合性病毒 (RSV)在一些態樣中，本發明提供野生型RSV F蛋白之突變體，其中該突變體展示胺基酸序列中相對於對應野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的突變且針對野生型RSV F蛋白或針對包含野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。相對於野生型RSV F蛋白，突變體中之胺基酸突變包括胺基酸取代、缺失或添加。
在一些實施例中，本發明提供野生型RSV F蛋白之突變體，其中所引入之胺基酸突變為野生型RSV F蛋白中之一對胺基酸殘基突變為一對半胱胺酸(「經工程改造之二硫鍵突變」)。所引入之半胱胺酸殘基對允許在半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵，使蛋白質之構形或寡聚狀態(諸如融合前構形)穩定。特定的此類突變對之實例包括：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，諸如S55C及L188C；S155C及S290C；T103C及I148C；及L142C及N371C。
在一些實施例中，野生型RSV F蛋白之突變體包含F1多肽及F2多肽，其中該突變體包含至少一個相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的胺基酸突變，其中所引入之胺基酸突變為選自由以下組成之群的一對半胱胺酸：(1) 55C及188C；(2) 103C及148C；及(3) 142C及371C，且其中胺基酸位置根據SEQ ID NO: 1編號。在一些實施例中，突變體進一步包含至少一個空腔填充突變及至少一個靜電突變，其中該空腔填充突變係選自由以下組成之群：(1)位置62、155、190或290處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(3)位置151處之胺基酸經A或H取代；(4)位置147或298處之胺基酸經I、L、H或M取代；及(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495處之胺基酸經I、Y或H取代，且其中該靜電突變係選自由以下組成之群：(1)位置82、92或487處之胺基酸經D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399處之胺基酸經F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489處之胺基酸經H、S、N、T或P取代；及(4)位置106或339處之胺基酸經F、Q、N或W取代。
在一些實施例中，野生型呼吸道融合性病毒(RSV) F蛋白之突變體包含F1多肽及F2多肽，其中該突變體包含至少一個相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的胺基酸突變，且其中所引入之胺基酸突變包含：(i)該對半胱胺酸突變155C及290C；及(ii)一或多個選自由以下組成之群的空腔填充突變：1)位置190處之胺基酸經I取代；2)位置54處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；3)位置296處之胺基酸經I、Y、H取代，且其中胺基酸位置根據SEQ ID NO: 1編號。在一些實施例中，空腔填充突變係選自由以下組成之群：(1)位置190處之胺基酸經I取代；(2)位置54處之胺基酸經H取代；及(3)位置296處之胺基酸經I取代。在一些實施例中，突變體呈三聚體形式。在一些實施例中，突變體相較於對應野生型RSV F蛋白具有增加的穩定性，其中藉由突變體與抗體AM14之結合來量測穩定性。在一些實施例中，野生型RSV為亞型A或亞型B。在一些實施例中，空腔填充突變係選自由以下組成之群：54H、190I及296I。在一些實施例中，突變體進一步包含靜電突變。在一些實施例中，靜電突變係選自由以下組成之群：(1)位置82、92或487處之胺基酸經D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399處之胺基酸經F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489處之胺基酸經H、S、N、T或P取代；及(4)位置106或339處之胺基酸經F、Q、N或W取代。在一些實施例中，野生型RSV F蛋白之突變體包含F1多肽及F2多肽，其中該突變體包含至少一個相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的胺基酸突變，且其中所引入之胺基酸突變包含：(i)該對半胱胺酸突變155C及290C；(ii)空腔填充突變；及(iii)靜電突變，其中該空腔填充突變係選自由以下組成之群：1)位置62處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；2)位置190處之胺基酸經I取代；3)位置54、58、189、219或397處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(4)位置151處之胺基酸經A或H取代；(5)位置147或298處之胺基酸經I、L、H或M取代；及(6)位置164、187、192、207、220、296、300或495處之胺基酸經I、Y、H取代，其中該靜電突變為486S，且其中胺基酸位置根據SEQ ID NO: 1編號。在一些實施例中，突變體包含選自由以下組成之群的胺基酸突變之組合：(1) 155C、290C及54H之組合；(2) 155C、290C、296I之組合；(3) 155C、290C、54H及296Y之組合；(4) 155C、290C及190I之組合；(5) 155C、290C、54H及190I之組合；(6) 155C、290C、54H、496S之組合；(7) 155C、290C、190I及486S之組合；(7) 155C、290C、296I；及486S之組合；(9) 155C、290C、54H、190I及486S之組合；(10) 155C、290C、54H、296I及486S之組合；(11) 155C、290C、190I、296I及485S之組合；(12) 155C、290C、54H、190I、296I及486S之組合；(13) 155C、290C、190I及296I之組合；及(14) 155C、290C、54H、190I及296I之組合。在一些實施例中，野生型RSV F蛋白之突變體包含F1多肽及F2多肽，其中該突變體包含至少一個相對於野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的胺基酸突變，且其中所引入之胺基酸突變包含：(i)該對半胱胺酸突變155C及290C；(ii)至少一個空腔填充突變；及(iii)HRB區中之至少一對半胱胺酸突變，其中該空腔填充突變係選自由以下組成之群：1)位置62處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；2)位置190處之胺基酸經I取代；3)位置54、58、189、219或397處之胺基酸經I、Y、L、H或M取代；(4)位置151處之胺基酸經A或H取代；(5)位置147或298處之胺基酸經I、L、H或M取代；及(6)位置164、187、192、207、220、296、300或495處之胺基酸經I、Y、H取代，其中HRB區中之至少一對半胱胺酸突變係選自由以下組成之群：(1) 508C及509C；(2) 515C及516C；及(3) 522C及523C，且其中胺基酸位置根據SEQ ID NO: 1編號。在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)本文所描述之RSV F蛋白突變體及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物之F1多肽及F2多肽來源於RSV亞型B之F蛋白。在一些實施例中，醫藥組合物之F1多肽及F2多肽來源於RSV亞型A之F蛋白。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含如本文所描述之野生型RSV F蛋白之第二突變體，其中第二突變體之F1多肽及F2多肽來自RSV亞型B之F蛋白。在一些實施例中，醫藥組合物為疫苗。在一些實施例中，本發明提供一種核酸分子(例如如下所描述)，其包含編碼根據技術方案1之RSV F蛋白突變體之胺基酸序列的核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明提供一種預防個體中之RSV感染之方法，其包含向個體投與有效量之本文所描述之醫藥組合物。在一些實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(i)如本文所描述之RSV F蛋白突變體及(ii)醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，本發明提供一種預防個體中之RSV感染之方法，其包含向個體投與有效量之如本文所描述之醫藥組合物。
本發明提供RNA分子(例如RNA聚核苷酸)，其包含至少一個編碼呼吸道融合性病毒(RSV)多肽之開放閱讀框架。本發明進一步提供一種免疫原組合物，其包含至少一種編碼RSV多肽之RNA分子，該RNA分子與一或多種脂質複合、囊封於其中或與其一起調配，且形成脂質奈米粒子(LNP)。本文所揭示之免疫原組合物中所包括之RSV多肽可為呈融合前構形之任何RSV F蛋白。
術語「融合前構形」係指(i)當RSV F蛋白或突變體呈單體或三聚體形式時可由抗體D25或AM22特異性結合，或(ii)當RSV F蛋白突變體呈三聚體形式時可由抗體AM14特異性結合之RSV F蛋白或其突變體所採用的結構構形。融合前三聚體構形為融合前構形之子集。
術語「融合後構形」係指不由D25、AM22或AM14特異性結合之RSV F蛋白所採用的結構構形。原生F蛋白在病毒套膜與宿主細胞膜融合之後採用融合後構形。當自膜提取時，當表現為胞外域時，或在儲存後，RSV F蛋白亦可在融合事件之情形之外呈現融合後構形，例如在應力條件(諸如加熱及低重量莫耳滲透濃度)下。術語「AM14」係指WO 2008/147196 A2 (其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之抗體。術語「AM22」係指WO 2011/043643 A1 (其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之抗體。術語「D25」係指WO 2008/147196 A2 (其在此以全文引用之方式併入本文中)中所描述之抗體。
在一些實施例中，RSV F蛋白為亞型A之RSV F蛋白。在一些實施例中，RSV F蛋白為亞型B之RSV F蛋白。在一些實施例中，RSV F蛋白為野生型RSV F蛋白之突變體。在一些實施例中，RSV F蛋白為亞型A之野生型RSV F蛋白之突變體。在一些實施例中，RSV F蛋白為亞型B之野生型RSV F蛋白之突變體。在一些實施例中，突變體展示胺基酸序列中相對於對應野生型RSV F蛋白之胺基酸序列引入的突變且針對呈融合前構形之野生型RSV F蛋白或針對包含野生型F蛋白之病毒具有免疫原性。相對於野生型RSV F蛋白，突變體中之胺基酸突變包括胺基酸取代、缺失或添加。
在一些實施例中，RSV F蛋白為WO2017/109629 (其以全文引用之方式併入本文中)中所描述之RSV蛋白突變體。
在一些實施例中，RSV F蛋白為野生型RSV F蛋白之突變體，其中所引入之胺基酸突變為野生型RSV F蛋白中之一對胺基酸殘基突變為一對半胱胺酸(「經工程改造之二硫鍵突變」)。所引入之半胱胺酸殘基對允許在半胱胺酸殘基之間形成二硫鍵，使蛋白質之構形或寡聚狀態(諸如融合前構形)穩定。特定的此類突變對之實例包括：55C及188C；155C及290C；103C及148C；及142C及371C，諸如S55C及L188C；S155C及S290C；A103C及I148C；及L142C及N371C。
在另其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含作為一或多個空腔填充突變之胺基酸突變。可經空腔填充之目標置換之胺基酸的實例包括小脂族(例如Gly、Ala及Val)或小極性胺基酸(例如Ser及Thr)，以及在融合前構形中內埋但在融合後構形中暴露於溶劑的胺基酸。置換胺基酸之實例包括大脂族胺基酸(Ile、Leu及Met)或大芳族胺基酸(His、Phe、Tyr及Trp)。在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含選自由以下組成之群的空腔填充突變：(1)位置55、62、155、190或290處之S經I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397處之T經I、Y、L、H或M取代；(3)位置151處之G經A或H取代；(4)位置147或298處之A經I、L、H或M取代；(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495處之V經I、Y、H取代；及(6)位置106處之R經W取代。
在一些特定實施例中，RSV F蛋白突變體包含至少一個選自由以下組成之群的空腔填充突變：T54H、S190I及V296I。
在另其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含靜電突變，其降低摺疊結構中彼此接近之蛋白質中之殘基之間的離子排斥或增加其間的離子吸引。在若干實施例中，RSV F蛋白突變體包括降低與來自RSV F三聚體之另一原聚體之Glu487及Asp489之酸性殘基的排斥性離子相互作用或增加與其之吸引性離子相互作用的靜電取代。在一些具體實施例中，RSV F蛋白突變體包含選自由以下組成之群的靜電突變：(1)位置82、92或487處之E經D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399處之K經F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489處之D經H、S、N、T或P取代；及(4)位置106或339處之R經F、Q、N或W取代。
在另其他實施例中，RSV F蛋白突變體包含選自以下之兩種或更多種不同類型之突變的組合：經工程改造之二硫鍵突變、空腔填充突變及靜電突變。在一些特定實施例中，RSV F蛋白包含相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中突變之組合係選自由以下組成之群：(1) A103C、I148C、S190I及D486S之組合；(2) T54H S55C L188C D486S之組合；(3) T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之組合；(4) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之組合；(5) S55C、L188C及D486S之組合；(6) T54H、S55C、L188C及S190I之組合；(7) S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(8) T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(9) S155C、S190I、S290C及D486S之組合；(10) T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之組合；(11) T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之組合；及(12) S155C、S190F、S290C及V207L之組合。
在一些實施例中，RSV F蛋白屬於亞型A，且包含突變S155C、S190F、S290C及V207L。在一些實施例中，RSV F蛋白屬於亞型B，且包含突變S155C、S190F、S290C及V207L。在一些實施例中，RSV F蛋白屬於亞型A，且包含突變A103C、I148C、S190I及D486S。在一些實施例中，RSV F蛋白屬於亞型B，且包含突變A103C、I148C、S190I及D486S。
鑒於RSV F序列之實質上保守，一般技術者可容易地比較不同原生RSV F序列之間的胺基酸位置，以鑑別不同RSV病毒株及亞型之間的對應RSV F胺基酸位置。舉例而言，在幾乎全部所鑑別之原生RSV F0前驅蛋白質中，弗林蛋白酶裂解位點落入相同胺基酸位置中。因此，整個病毒株及亞型中之原生RSV F蛋白序列之保守允許使用參考RSV F序列比較RSV F蛋白中特定位置處之胺基酸。出於本發明之目的(除非上下文另外指示)，參考RSV A2病毒株之全長原生F前驅物多肽之胺基酸序列給出RSV F蛋白胺基酸位置；對應於GenInfo標識符GI 138251及Swiss Prot標識符P03420 (SEQ ID NO: 1)。
在一些實施例中，RSV F蛋白呈RSV F蛋白之成熟形式，其包含兩條單獨多肽鏈，亦即F1多肽及F2多肽。在一些其他實施例中，F2多肽藉由一或兩個二硫鍵與F1多肽連接以形成F2/F1異二聚體。在另其他實施例中，RSV F突變體呈單鏈蛋白質形式，其中F2多肽藉由肽鍵或肽連接子與F1多肽連接。可使用用於接合兩條多肽鏈在一起之任何合適的肽連接子。此類連接子之實例包括G、GG、GGG、GS及SAIG連接子序列。連接子亦可為全長pep27序列或其片段。
突變體之F1多肽鏈與對應野生型RSV F蛋白之全長F1多肽可具有相同長度；然而，其亦可具有缺失，諸如缺失來自全長F1多肽之C端的1直至60個胺基酸殘基。RSV F突變體之全長F1多肽對應於原生RSV F0前驅物之胺基酸位置137-574，且包括(自N端至C端)細胞外區(殘基137-524)、跨膜域(殘基525-550)及細胞質域(殘基551-574)。應注意，原生F1多肽序列中514起之胺基酸殘基為本文提供之免疫原組合物中所包括之RSV F蛋白之F1多肽中視情況選用的序列，且因此可能不存在於突變體之F1多肽中。
在一些實施例中，RSV F突變體之F1多肽缺乏整個細胞質域。在其他實施例中，F1多肽缺乏細胞質域以及跨膜域之一部分或整個全部。在一些具體實施例中，突變體包含F1多肽，其中來自位置510、511、512、513、514、515、520、525或530至574之胺基酸殘基不存在。通常，對於與三聚域(諸如摺疊子)連接之突變體而言，胺基酸514至754可不存在。因此，在一些具體實施例中，胺基酸殘基514至574不存在於突變體之F1多肽中。在另其他具體實施例中，RSV F突變體之F1多肽包含以下或由以下組成：原生F0多肽序列，諸如替代F0前驅序列，諸如WO2017109629 (以全文引用的方式併入本文中)之SEQ ID No: 1、2、4、6及81-270中所揭示之彼等序列中之任一者的胺基酸殘基137-513。
其中引入一或多個突變之RSV F蛋白突變體之F1多肽及F2多肽可來自此項技術中已知或未來發現之任何野生型RSV F蛋白，包括但不限於RSV亞型A及亞型B病毒株(包括A2 Ontario及Buenos Aires)或任何其他亞型之F蛋白胺基酸序列。在一些實施例中，RSV F突變體包含來自RSV A病毒之F1及/或F2多肽，例如其中引入一或多個突變的來自WO2017109629之SEQ ID NO: 1、2、4、6及81-270中之任一者中所示的RSV F0前驅蛋白之F1及/或F2多肽。在一些其他實施例中，RSV F突變體包含來自RSV B病毒之F1及/或F2多肽，例如其中引入一或多個突變的來自WO2017/109629之SEQ ID NO: 2及211-263中之任一者中所示的RSV F0前驅蛋白之F1及/或F2多肽。在另其他實施例中，RSV F突變體包含來自RSV牛病毒之F1及/或F2多肽，例如其中引入一或多個突變的來自WO2017109629之SEQ ID NO: 264-270中之任一者中所示的RSV F0前驅蛋白之F1及/或F2多肽。
術語「F0多肽」(F0)係指RSV F蛋白之前驅多肽，其由信號多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列及F2多肽序列構成。在罕見例外情況下，已知RSV病毒株之F0多肽由574個胺基酸組成。
術語「F1多肽」(F1)係指成熟RSV F蛋白之多肽鏈。原生F1包括RSV F0前驅物之大致殘基137-574且由以下構成(自N端至C端)：細胞外區(大致殘基137-524)、跨膜域(大致殘基525-550)及細胞質域(「CT」) (大致殘基551-574)。如本文所用，該術語涵蓋原生F1多肽及包括原生序列之修飾(例如胺基酸取代、插入或缺失)之F1多肽兩者，該等修飾例如設計成使RSV F蛋白突變體穩定或增強RSV F蛋白突變體之免疫原性的修飾。
術語「F2多肽」(F2)係指成熟RSV F蛋白之多肽鏈。原生F2包括RSV F0前驅物之大致殘基26-109。如本文所用，該術語涵蓋原生F2多肽及包括原生序列之修飾(例如胺基酸取代、插入或缺失)之F2多肽兩者，該等修飾例如設計成使呈融合前構形之RSV F蛋白突變體穩定或增強RSV F蛋白突變體之免疫原性的修飾。在原生RSV F蛋白中，F2多肽藉由兩個二硫鍵與F1多肽連接以形成F2-F1異二聚體。術語「摺疊子」或「摺疊子域」係指能夠形成三聚體之胺基酸序列。此類摺疊子域之一個實例為來源於噬菌體T4纖維蛋白之肽序列，其具有GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 45)之序列。
在一些態樣中，RNA分子編碼以下中所揭示之RSV F蛋白突變體：WO2009/079796、WO2010/149745、WO2011/008974、WO2014/160463、WO2014/174018、WO2014/202570、WO2015/013551、WO2015/177312、WO2017/005848、WO2017/174564、WO2017/005844及WO2018/109220。此等參考文獻中所揭示之RSV F蛋白以全文引用之方式併入本文中。
針對RSV F蛋白之抗體在天然感染之後及在疫苗接種之後為普遍的，且已顯示在活體外中和病毒活性。如本文所用，術語「呼吸道融合性病毒」或「RSV」不限於任何特定病毒株或變異體。
在一些態樣中，RNA分子包含編碼RSV抗原之開放閱讀框架。在一些態樣中，RSV抗原為RSV多肽。在一些態樣中，RSV多肽為RSV醣蛋白或其片段或變異體。在一些態樣中，RNA分子編碼RSV F蛋白。
在一些態樣中，RSV多肽為全長RSV多肽。在一些態樣中，RSV多肽為截短RSV多肽。在一些態樣中，RSV多肽為RSV多肽之變異體。在一些態樣中，RSV多肽為RSV多肽之片段。
在一些態樣中，RSV多肽為全長RSV F蛋白。在一些態樣中，RSV多肽為截短RSV F蛋白。在一些態樣中，RSV多肽為RSV F蛋白之變異體。在一些態樣中，RSV多肽為RSV F蛋白之片段。
在一些態樣中，RSV F蛋白包含至少一個突變。在一些態樣中，RSV F蛋白包含至少兩個突變。在一些態樣中，RSV F蛋白包含至少三個突變。在一些態樣中，RSV F蛋白包含至少四個突變。在一些態樣中，RSV F蛋白包含4個突變。
在一些態樣中，RNA分子編碼表30之RSV F蛋白。在一些態樣中，RNA分子編碼包含SEQ ID NO: 1至6中之任一者之胺基酸序列的RSV F蛋白，或其片段或變異體。在一些態樣中，RSV F蛋白與表30之胺基酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 1至6中之任一者可具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性：70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RSV F蛋白由表30之胺基酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 1至6中之任一者組成。
在一些態樣中，RNA分子序列自表31之DNA核酸序列(DNA聚核苷酸)轉錄。在一些態樣中，RNA分子包含自SEQ ID NO: 7至10中之任一者之核酸序列轉錄的ORF或其片段或變異體。在一些態樣中，RNA分子包含自與表31之核酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 7至10中之任一者可具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性之核酸序列轉錄的ORF：70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含自由表31之核酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 7至10中之任一者組成之核酸序列轉錄的ORF。
在一些態樣中，RNA分子包含有包含表32之RNA核酸序列(RNA聚核苷酸)的ORF。在一些態樣中，RNA分子包含有包含SEQ ID NO: 11至16中之任一者之核酸序列的ORF，或其片段或變異體。在一些態樣中，RNA分子包含有包含與表32之RNA核酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 11至16中之任一者可具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性之核酸序列的ORF：70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含有包含由表32之RNA核酸序列中之任一者，例如SEQ ID NO: 11至16中之任一者組成之核酸序列的ORF。
在一些態樣中，RNA分子包含穩定化RNA。在一些態樣中，RNA分子包含至少一個尿苷經N1-甲基假尿苷置換之核酸序列。在一些態樣中，RNA分子包含所有尿苷經N1-甲基假尿苷置換之序列(表示為「Ψ」)。在一些態樣中，RNA分子包含有包含SEQ ID NO: 11至16中之任一者之核酸序列的ORF，其中所有尿苷已經N1-甲基假尿苷置換(表示為「Ψ」)。
在一些態樣中，RNA分子包含編碼與SEQ ID NO: 1至6之RSV F蛋白序列中之任一者或本文所描述之其他RSV融合前F蛋白可至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比一致的RSV F蛋白胺基酸序列的開放閱讀框架：70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含編碼由SEQ ID NO: 1至6之RSV F蛋白序列中之任一者或本文所描述之其他RSV融合前F蛋白組成之RSV F蛋白胺基酸序列的開放閱讀框架。
在一些態樣中，RNA分子包含自與SEQ ID NO: 7至10之核酸序列中之任一者或本文所描述之其他核酸可至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比一致的DNA核酸序列轉錄的開放閱讀框架：70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含自由SEQ ID NO: 7至10之核酸序列中之任一者或本文所描述之其他核酸組成之DNA核酸序列轉錄的開放閱讀框架。
在一些態樣中，RNA分子包含有包含與SEQ ID NO: 11至16之核酸序列中之任一者或本文所描述之其他核酸可至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比一致的RNA核酸序列的開放閱讀框架：70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含有包含由SEQ ID NO: 11至16 (表3)之核酸序列中之任一者或本文所描述之其他核酸組成之RNA核酸序列的開放閱讀框架。在一些態樣中，RNA分子包含有包含SEQ ID NO: 11至16 (表3)中之任一者之核酸序列的ORF，其中所有尿苷已經N1-甲基假尿苷(表示為「Ψ」)置換。
IV. RNA 分子在一些態樣中，本文所描述之RNA分子為編碼RNA分子。編碼RNA包括可轉譯成肽或多肽之功能性RNA分子。在一些態樣中，編碼RNA分子包括至少一個編碼至少一種肽或多肽之開放閱讀框架(ORF)。開放閱讀框架包含可轉譯成肽或蛋白質之密碼子序列。編碼RNA分子可包括一個(單順反子)、兩個(雙順反子)或更多個(多順反子) OFR，其可為可轉譯成相關多肽或蛋白質之密碼子序列。
編碼RNA分子可為信使RNA (mRNA)分子、病毒RNA分子或自擴增RNA分子(saRNA，亦稱為複製子)。在一些態樣中，RNA分子為mRNA。較佳地，本發明之RNA分子為mRNA。在一些態樣中，RNA分子為modRNA。在一些態樣中，RNA分子為saRNA。在一些態樣中，saRNA分子可為編碼RNA分子。
RNA分子可編碼一種相關多肽或更多種，諸如一種抗原或超過一種抗原，例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種多肽。或者或另外，一個RNA分子亦可編碼多於一種相關多肽，諸如抗原，例如編碼不同或相同抗原之雙順反子或三順反子RNA分子。
RNA分子之序列可經密碼子最佳化或去最佳化以供在所需宿主(諸如人類細胞)中表現。在一些態樣中，本文所描述之相關基因(例如抗原)由密碼子最佳化及/或鳥苷/胞苷(G/C)含量相比於野生型編碼序列增加的編碼序列編碼。在一些態樣中，與野生型編碼序列之對應序列區域相比，編碼序列之一或多個序列區域經密碼子最佳化及/或其G/C含量增加。在一些態樣中，密碼子最佳化及/或增加G/C含量不會改變所編碼胺基酸序列之序列。
熟習此項技術者應瞭解，術語「密碼子最佳化」係指改變核酸分子之編碼區中之密碼子以反映宿主生物體之典型密碼子使用而不改變由核酸分子編碼之胺基酸序列。在本發明之上下文內，在一些態樣中，編碼區經密碼子最佳化以供在待使用本文所描述之RNA聚核苷酸治療之個體中最佳表現。密碼子最佳化係基於以下發現：轉譯效率亦由細胞中tRNA分子之不同出現頻率決定。因此，RNA之序列可經修飾，使得可獲得頻繁出現之tRNA分子的密碼子代替「罕用密碼子」插入。
在一些態樣中，與編碼相關基因之野生型RNA之對應編碼序列的G/C含量相比，RNA之(例如相關基因序列之)編碼區之G/C含量增加，其中在一些態樣中，與由野生型RNA編碼之胺基酸序列相比，由該RNA編碼之胺基酸序列未經修飾。RNA序列之此修飾係基於以下事實：待轉譯的任何RNA區之序列對於該mRNA之高效轉譯而言為重要的。G (鳥苷)/C (胞苷)含量增加之序列與A (腺苷)/U (尿苷)含量增加之序列相比更穩定。相對於若干密碼子編碼同一個胺基酸之事實(所謂的遺傳密碼簡併)，可確定對於穩定性最有利之密碼子(所謂的替代密碼子使用)。視由RNA編碼之胺基酸而定，RNA序列相比於其野生型序列之修飾存在各種可能性。特定言之，含有A及/或U核苷之密碼子可藉由用其他密碼子取代此等密碼子而經修飾，該等其他密碼子編碼相同胺基酸但不含A及/或U或含有更低含量之A及/或U核苷。因此，在一些態樣中，本文所描述之RNA之編碼區的G/C含量與野生型RNA之編碼區的G/C含量相比增加至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比：10%、20%、30%、40%、50%、55%或甚至更多。
在一些態樣中，RNA分子包括約20個至約100,000個核苷酸(例如30至50個、30至100個、30至250個、30至500個、30至1,000個、30至1,500個、30至3,000個、30至5,000個、30至7,000個、30至10,000個、30至25,000個、30至50,000個、30至70,000個、100至250個、100至500個、100至1,000個、100至1,500個、100至3,000個、100至5,000個、100至7,000個、100至10,000個、100至25,000個、100至50,000個、100至70,000個、100至100,000個、500至1,000個、500至1,500個、500至2,000個、500至3,000個、500至5,000個、500至7,000個、500至10,000個、500至25,000個、500至50,000個、500至70,000個、500至100,000個、1,000至1,500個、1,000至2,000個、1,000至3,000個、1,000至5,000個、1,000至7,000個、1,000至10,000個、1,000至25,000個、1,000至50,000個、1,000至70,000個、1,000至100,000個、1,500至3,000個、1,500至5,000個、1,500至7,000個、1,500至10,000個、1,500至25,000個、1,500至50,000個、1,500至70,000個、1,500至100,000個、2,000至3,000個、2,000至5,000個、2,000至7,000個、2,000至10,000個、2,000至25,000個、2,000至50,000個、2,000至70,000個及2,000至100,000個核苷酸)。
在一些態樣中，RNA分子具有至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：約20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600、620、640、660、680、700、720、740、760、780、800、820、840、860、880、900、920、940、960、980、1000、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800、5000、5200、5400、5600、5800、6000、6200、6400、6600、6800、7000、7200、7400、7600、7800、8000、8200、8400、8600、8800、9000、9200、9400、9600、9800、10000、10000、12000、14000、16000、18000、20000、22000、24000、26000、28000、30000、32000、34000、36000、38000、40000、42000、44000、46000、48000、50000、52000、54000、56000、58000、60000、62000、64000、66000、68000、70000、72000、74000、76000、78000、80000、82000、84000、86000、88000、90000、92000、94000、96000、98000或100000個核苷酸。
在一些態樣中，RNA分子包括至少100個核苷酸。舉例而言，在一些態樣中，RNA之長度在100與15,000個核苷酸之間；在7,000與16,000個核苷酸之間；在8,000與15,000個核苷酸之間；在9,000與12,500個核苷酸之間；在11,000與15,000個核苷酸之間；在13,000與16,000個核苷酸之間；在7,000與25,000個核苷酸之間。在一些態樣中，RNA分子具有至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、5750、5800、5850、5900、5950、6000、6050、6100、6150、6200、6250、6300、6350、6400、6450、6500、6550、6600、6650、6700、6750、6800、6850、6900、6950、7000、7050、7100、7150、7200、7250、7300、7350、7400、7450、7500、7550、7600、7650、7700、7750、7800、7850、7900、7950、8000、8050、8100、8150、8200、8250、8300、8350、8400、8450、8500、8550、8600、8650、8700、8750、8800、8850、8900、8950、9000、9050、9100、9150、9200、9250、9300、9350、9400、9450、9500、9550、9600、9650、9700、9750、9800、9850、9900、9950、10000、10050、10100、10150、10200、10250、10300、10350、10400、10450、10500、10550、10600、10650、10700、10750、10800、10850、10900、10950、11000、11050、11100、11150、11200、11250、11300、11350、11400、11450、11500、11550、11600、11650、11700、11750、11800、11850、11900、11950、12000、12050、12100、12150、12200、12250、12300、12350、12400、12450、12500、12550、12600、12650、12700、12750、12800、12850、12900、12950、13000、13050、13100、13150、13200、13250、13300、13350、13400、13450、13500、13550、13600、13650、13700、13750、13800、13850、13900、13950、14000、14050、14100、14150、14200、14250、14300、14350、14400、14450、14500、14550、14600、14650、14700、14750、14800、14850、14900、14950或15000個核苷酸。
在本發明之一些態樣中，RNA為或包含信使RNA (mRNA)，其與編碼多肽之RNA轉錄物有關。在一些態樣中，本文揭示之RNA包含：5'帽，其包含本文揭示之5'帽；5'非轉譯區，其包含帽近端序列(5' UTR)、編碼有效負載(例如RSV融合前F蛋白及/或來源於流行性感冒之抗原)之序列；3'非轉譯區(3' UTR)；及/或聚腺苷酸化(Poly A)序列。
在一些態樣中，本文揭示之RNA以5'至3'取向包含以下組分：5'帽，其包含本文揭示之5'帽；5'非轉譯區，其包含帽近端序列(5' UTR)、編碼有效負載(例如RSV融合前F蛋白及/或來源於流行性感冒之抗原)之序列；3'非轉譯區(3' UTR)；及/或Poly-A序列。
1. 經修飾之核鹼基在本發明中，RNA分子可包含經修飾之核鹼基，該等經修飾之核鹼基可併入至經修飾之核苷及核苷酸中。在一些態樣中，RNA分子可包括一或多種經修飾之核苷酸。天然存在之核苷酸修飾為此項技術中已知的。
在一些態樣中，RNA分子可包括經修飾之核苷酸。可包括在RNA分子中的經修飾之核苷酸之非限制性實例包括假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基尿苷、3-甲基-尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷、4-硫基-尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿苷、5-羧基羥甲基-尿苷甲酯、5-甲氧基羰基甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫基-尿苷、5-胺甲基-2-硫基-尿苷、5-甲胺基甲基-尿苷、1-乙基-假尿苷、5-甲胺基甲基-2-硫基-尿苷、5-甲胺基甲基-2-硒基-尿苷、5-胺甲醯基甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-2-硫基-尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-假尿苷、5-甲基-2-硫基-尿苷、1-甲基-4-硫基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-1-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷、5-(異戊烯基胺甲基)尿苷、5-(異戊烯基胺甲基)-2-硫基-尿苷、a-硫基-尿苷、2'-O-甲基-尿苷、5,2'-O-二甲基-尿苷、2'-O-甲基-假尿苷、2-硫基-2'-O-甲基-尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷、5-羧甲基胺甲基-2'-O-甲基-尿苷、3,2'-O-二甲基-尿苷、5-(異戊烯基胺甲基)-2'-O-甲基-尿苷、1-硫基-尿苷、去氧胸苷、2'-F-阿糖尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷、此項技術中已知的任何其他經修飾之尿苷、或其組合。
在本發明之一些態樣中，經修飾之核苷酸包括N1-甲基假尿苷或假尿苷中之任一者。
在一些態樣中，RNA分子包含經N1-甲基假尿苷修飾之核苷酸。在一些態樣中，RNA分子包含經假尿苷修飾之核苷酸。
在一些態樣中，RNA包含經修飾之核苷來代替至少一個尿苷。在一些態樣中，RNA包含經修飾之核苷代替每一個尿苷。在一些態樣中，RNA分子包含至少一個尿苷經N1-甲基假尿苷置換之序列。在一些態樣中，RNA分子包含所有尿苷經N1-甲基假尿苷置換之序列。N1-甲基假尿苷在序列中表示為「Ψ」。如本文所用，術語「尿嘧啶」描述可出現在RNA之核酸中的一種核鹼基。如本文所用，術語「尿苷」描述可出現在RNA中的一種核苷。「假尿苷」為經修飾之核苷之一個實例，其為尿苷之異構物，其中尿嘧啶經由碳-碳鍵而非氮-碳醣苷鍵連接至戊醣環。
在一些態樣中，RNA分子包含至少一個尿苷經假尿苷置換之核酸序列。在一些態樣中，RNA分子包含至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之尿苷經假尿苷置換的核酸序列：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一些態樣中，RNA分子包含所有尿苷經假尿苷置換之核酸序列。
可存在於RNA分子中之修飾進一步包括例如m5C (5-甲基胞苷)、m5U (5-甲基尿苷)、m6A (N6-甲基腺苷)、s2U (2-硫基尿苷)、Um (2'-O-甲基尿苷)、m1A (1-甲基腺苷)；m2A (2-甲基腺苷)；Am (2-1-O-甲基腺苷)；ms2m6A (2-甲基硫基-N6-甲基腺苷)；i6A (N6-異戊烯基腺苷)；ms2i6A (2-甲基硫基-N6異戊烯基腺苷)；io6A (N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；ms2io6A (2-甲基硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；g6A (N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷)；t6A (N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms2t6A (2-甲基硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；m6t6A (N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；hn6A(N6-羥基去纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms2hn6A (2-甲基硫基-N6-羥基去纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；Ar(p) (2'-O-核糖基腺苷(磷酸))；I (肌苷)；mil (1-甲基肌苷)；m'lm (1,2'-O-二甲基肌苷)；m3C (3-甲基胞苷)；Cm (2T-O-甲基胞苷)；s2C (2-硫基胞苷)；ac4C (N4-乙醯基胞苷)；f5C (5-甲醯基胞嘧啶)；m5Cm (5,2-O-二甲基胞苷)；ac4Cm (N4乙醯基2TO甲基胞苷)；k2C (賴胞苷)；m1G (1-甲基鳥苷)；m2G (N2-甲基鳥苷)；m7G (7-甲基鳥苷)；Gm (2'-O-甲基鳥苷)；m22G (N2,N2-二甲基鳥苷)；m2Gm (N2,2'-O-二甲基鳥苷)；m22Gm (N2,N2,2'-O-三甲基鳥苷)；Gr(p) (2'-O-核糖基鳥苷(磷酸))；yW (懷丁苷)；o2yW (過氧懷丁苷)；OHyW (羥基懷丁苷)；OHyW* (修飾不足之羥基懷丁苷)；imG (懷俄苷)；mimG (甲基鳥苷)；Q (Q核苷)；oQ (環氧Q核苷)；galQ (半乳糖基-Q核苷)；manQ (甘露糖基-Q核苷)；preQo (7-氰基-7-去氮鳥苷)；preQi (7-胺基甲基-7-去氮鳥苷)；G* (古嘌苷)；D (二氫尿苷)；m5Um (5,2'-O-二甲基尿苷)；s4U (4-硫基尿苷)；m5s2U (5-甲基-2-硫基尿苷)；s2Um (2-硫基-2'-O-甲基尿苷)；acp3U (3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U (5-羥基尿苷)；mo5U (5-甲氧基尿苷)；cmo5U (尿苷5-氧乙酸)；mcmo5U (尿苷5-氧乙酸甲酯)；chm5U (5-(羧基羥基甲基)尿苷))；mchm5U (5-(羧基羥基甲基)尿苷甲酯)；mcm5U (5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um (S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫基尿苷)；nm5s2U (5-胺基甲基-2-硫基尿苷)；mnm5U (5-甲基胺基甲基尿苷)；mnm5s2U (5-甲基胺基甲基-2-硫基尿苷)；mnm5se2U (5-甲基胺基甲基-2-硒基尿苷)；ncm5U (5-胺甲醯基甲基尿苷)；ncm5Um (5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U (5-羧基甲基胺基甲基尿苷)；cnmm5Um (5-羧基甲基胺基甲基-2-L-O甲基尿苷)；cmnm5s2U (5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基尿苷)；m62A (N6,N6-二甲基腺苷)；Tm (2'-O-甲基肌苷)；m4C (N4-甲基胞苷)；m4Cm (N4,2-O-二甲基胞苷)；hm5C (5-羥基甲基胞苷)；m3U (3-甲基尿苷)；cm5U (5-羧基甲基尿苷)；m6Am (N6,T-O-二甲基腺苷)；rn62Am (N6,N6,O-2-三甲基腺苷)；m2'7G (N2,7-二甲基鳥苷)；m2'2'7G (N2,N2,7-三甲基鳥苷)；m3Um (3,2T-O-二甲基尿苷)；m5D (5-甲基二氫尿苷)；f5Cm (5-甲醯基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm (1,2'-O-二甲基鳥苷)；m'Am (1,2-O-二甲基腺苷)亞胺基甲基尿苷)；tm5s2U (S-牛磺酸甲基-2-硫基尿苷))；imG-14 (4-去甲基鳥苷)；imG2 (異鳥苷)；ac6A (N6-乙醯基腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-側氧基-腺嘌呤、其7-取代之衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-胺基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-Ce)-烯基尿嘧啶、5-(C2-Ce)-炔基尿嘧啶、5-(羥基甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-去氮-7-取代之鳥嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-去氮-8-取代之鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫基鳥嘌呤、8-側氧基鳥嘌呤、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2,4-二胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代之7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代之嘌呤、7-去氮-8-取代之嘌呤、氫(無鹼基殘基)、m5C、m5U、m6A、s2U、W或2'-O-甲基-U。
在一些態樣中，RNA分子可包括胺基磷酸酯、硫代磷酸酯及/或甲基磷酸酯鍵聯。
RNA分子之序列可視需要經修飾，例如以提高RNA之表現或複製效率，或提供額外穩定性或抗降解性。舉例而言，RNA序列可在其密碼子使用方面經修飾，例如以增加RNA之轉譯效率及半衰期。
在一些態樣中，本發明之RNA分子包含具有至少一個密碼子經修飾之序列的開放閱讀框架。密碼子經修飾之序列係指與對應野生型編碼序列相比至少一個密碼子(編碼一個胺基酸之核苷酸三聯體)不同的編碼序列。密碼子經修飾之序列可展現改良的抗降解性、改良的穩定性及/或改良的可轉譯性。
RNA分子之序列可經密碼子最佳化或去最佳化以供在所需宿主(諸如人類細胞)中表現。
在一些態樣中，RNA分子可包括賦予聚核苷酸適用特性之一或多個結構及/或化學修飾或改變，包括在一些態樣中，缺乏對引入聚核苷酸之細胞之先天性免疫反應的實質性誘導。如本文所用，「結構」特徵或修飾為兩個或更多個連接核苷酸在RNA分子中插入、缺失、複製、倒置或隨機化而不對核苷酸本身進行顯著化學修飾的特徵或修飾。因為化學鍵將必然斷裂且重新形成以實現結構修飾，因此結構修飾具有化學性質且因此為化學修飾。然而，結構修飾將產生不同核苷酸序列。舉例而言，聚核苷酸「ATCG」可經化學修飾為「AT-5meC-G」。相同聚核苷酸可自「ATCG」結構修飾為「ATCCCG」。此處，已插入二核苷酸「CC」，從而引起聚核苷酸之結構修飾。
在一些態樣中，RNA分子可包括一或多個除任何5'帽結構以外的經修飾之核苷酸。天然存在之核苷酸修飾為此項技術中已知的。
在一些態樣中，RNA分子不包括經修飾之核苷酸，例如不包括經修飾之核鹼基，且RNA分子中之所有核苷酸均為習知標準核糖核苷酸A、U、G及C，除可包括例如7-甲基鳥苷之視情況選用之5'帽以外，在下文進一步描述。在一些態樣中，RNA可包括包含7'-甲基鳥苷之5'帽，且前1個、2個或3個5'核糖核苷酸可在核糖之2'位置處甲基化。
在一些態樣中，本文所描述之RNA分子為非編碼RNA分子。非編碼RNA (ncRNA)分子包括不轉譯成肽或多肽之功能性RNA分子。非編碼RNA分子可包括高度豐富且在功能上重要的RNA分子。在一些態樣中，非編碼RNA為不轉譯成肽或多肽之功能性mRNA分子。非編碼RNA可包括如本文中所描述之經修飾之核苷酸。較佳地，RNA分子為mRNA。
本發明之RNA分子可藉由此項技術中已知之任何方法製備，包括化學合成及活體外方法，諸如RNA活體外轉錄。在一些態樣中，本發明之RNA係使用活體外轉錄製備。
在一些態樣中，本發明之RNA分子例如藉由過濾來純化，該過濾可經由例如超濾、透濾或例如切向流超濾/透濾進行。
在一些態樣中，本發明之RNA分子凍乾成溫度穩定的。
2.     5' 帽在一些態樣中，本文所描述之RNA分子包括5'帽，其通常對RNA之5'端「加帽」且使RNA分子穩定。
在一些態樣中，5'帽部分為天然5'帽。「天然5'帽」定義為包括經由5'至5'三磷酸鍵聯連接至mRNA分子之5'端之7-甲基鳥苷的帽。在一些態樣中，包括在5'帽中之鳥苷核苷可例如藉由鹼基(鳥嘌呤)上之一或多個位置處(例如7位置處)之甲基化及/或藉由核糖之一或多個位置處之甲基化而經修飾。在一些態樣中，包括在5'帽中之鳥苷核苷包含核糖處之3'O甲基化(3'OMeG)。在一些態樣中，包括在5'帽中之鳥苷核苷包含鳥嘌呤之7位置處之甲基化(m7G)。在一些態樣中，包括在5'帽中之鳥苷核苷包含鳥嘌呤之7位置處之甲基化及核糖處之3'O甲基化(m7(3'OMeG))。5'帽可在RNA合成期間併入(例如，共轉錄加帽)，或可在RNA轉錄之後酶促工程改造(例如，轉錄後加帽)。在一些態樣中，用本文所揭示之帽進行共轉錄加帽與用適當參考比較物進行共轉錄加帽相比，RNA之加帽效率增加。在一些態樣中，提高加帽效率可增加RNA之轉譯效率及/或轉譯速率，及/或增加所編碼多肽之表現。在一些態樣中，加帽在RNA分子之純化(例如，切向流過濾)之後進行。
在一些態樣中，本文所描述之RNA包含5'帽或5'帽類似物，例如帽0、帽1或帽2。在一些態樣中，所提供之RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一些態樣中，RNA之5'端以經修飾之核糖核苷酸加帽。在一些態樣中，5'帽部分為5'帽類似物。在一些態樣中，RNA可用5'帽類似物加帽。帽結構包括但不限於7mG(5')ppp(5')N,pN2p (帽0)及7mG(5')ppp(5')N1mpNp (帽1)。在一些態樣中，本文所描述之RNA包含帽0。帽0為經由5'-5'三磷酸鍵聯連接至5'核苷酸之N7-甲基鳥苷，其通常被稱作m7G帽或m7Gppp。在細胞中，帽0結構對於攜載帽之mRNA的高效轉譯為至關重要的。起始核苷酸之2'O位置上的額外甲基化產生帽1，或被稱作m7GpppNm，其中Nm表示具有2'O甲基化之任何核苷酸。在一些態樣中，本文所描述之RNA包含例如如本文所描述之帽1。在一些態樣中，本文所描述之RNA包含帽2。
在一些態樣中，帽0結構包含在鳥嘌呤之7位置處甲基化的鳥苷核苷(m7G)。在一些態樣中，帽0結構經由5'至5'三磷酸鍵聯連接至RNA，且在本文中亦被稱為m7Gppp或m7G(5')ppp(5')。5'帽可用結構m7G(5')ppp(5')N (帽0結構)或其衍生物甲基化，其中N為攜帶5'帽之核酸之末端5'核苷酸，通常為mRNA之5'端。用於加帽之例示性酶促反應可包括使用包括mRNA三磷酸酶、鳥苷醯基轉移酶及鳥嘌呤-7-甲基轉移酶之牛痘病毒加帽酶(VCE)，其催化N7-單甲基化帽0結構之構築。帽0結構在維持RNA分子之穩定性及轉譯效率方面起重要作用。
RNA分子之5'帽可進一步由2'-O-甲基轉移酶修飾，產生帽1結構(m7Gppp [m2'-Ο] N)之產生，其可進一步增加轉譯效率。在一些態樣中，帽1結構包含在鳥嘌呤之7位置處甲基化之鳥苷核苷(m7G)及RNA中經2'O甲基化之第一個核苷酸(2'OmeN 1)。在一些態樣中，帽1結構經由5'至5'三磷酸鍵聯連接至RNA，且在本文中亦被稱為m7Gppp(2'OMeN 1)或m7G(5')ppp(5')(2'OMeN 1)。在一些態樣中，N 1係選自A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A。在一些態樣中，N 1為C。在一些態樣中，N 1為G。在一些態樣中，N 1為U。在一些態樣中，m7G(5')ppp(5')(2'OmeN 1)帽1結構包含第二核苷酸N 2，其為位置2處之帽近端核苷酸且係選自A、G、C或U (m7G(5')ppp(5')(2'OmeN 1)N 2)。在一些態樣中，N 2為A。在一些態樣中，N 2為C。在一些態樣中，N 2為G。在一些態樣中，N 2為U。
在一些態樣中，帽1結構包含在鳥嘌呤之7位置處甲基化之鳥苷核苷(m7G)及一或多個額外修飾(例如核糖上之甲基化)以及RNA中經2'O甲基化之第一核苷酸。在一些態樣中，帽1結構包含在鳥嘌呤之7位置處甲基化之鳥苷核苷、核糖處之3'O甲基化(m7(3'OMeG))及RNA中經2'O甲基化之第一核苷酸(2'OMeN 1)。在一些態樣中，帽1結構經由5'至5'三磷酸鍵聯連接至RNA，且在本文中亦被稱為m7(3'OMeG)ppp(2'OMeN 1)或m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeN 1)。在一些態樣中，N 1係選自A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A。在一些態樣中，N 1為C。在一些態樣中，N 1為G。在一些態樣中，N 1為U。在一些態樣中，m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeN 1)帽1結構包含第二核苷酸N 2，其為位置2處之帽近端核苷酸且係選自A、G、C或U (m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OmeN 1)N 2)。在一些態樣中，N 2為A。在一些態樣中，N 2為C。在一些態樣中，N 2為G。在一些態樣中，N 2為U。
在一些態樣中，帽1結構中之第二核苷酸可包含一或多種修飾，例如甲基化。在一些態樣中，包含有包含2'O甲基化之第二核苷酸的帽1結構為帽2結構。
在一些態樣中，RNA分子可使用牛痘鳥苷醯基轉移酶、鳥苷三磷酸及S-腺苷基-L-甲硫胺酸在5'端處酶促加帽，得到帽0結構。倒置的7-甲基鳥苷帽經由5'-5'三磷酸橋添加。或者，使用2'O-甲基轉移酶與牛痘鳥苷醯基轉移酶得到帽1結構，其中除帽0結構以外，倒數第二個核苷酸上之2'OH基團經甲基化。S-腺苷基-L-甲硫胺酸(SAM)為用作甲基轉移試劑之輔因子。5'帽結構之非限制性實例為與此項技術中已知的合成5'帽結構(或野生型、天然或生理5'帽結構)相比，尤其帽結合多肽之結合增強、半衰期增加、對5'核酸內切酶之敏感性降低及/或5'去帽減少的彼等結構。
舉例而言，重組牛痘病毒加帽酶及重組2'-O-甲基轉移酶可在mRNA之5'末端核苷酸與鳥嘌呤帽核苷酸之間產生典型5'-5'三磷酸鍵聯，其中帽鳥嘌呤包括N7甲基化且mRNA之5'末端核苷酸包括2'-O-甲基。此類結構被稱為帽1結構。與例如此項技術中已知的其他5'帽類似物結構相比，此帽使得轉譯能力及細胞穩定性更高以及細胞促炎性細胞介素之活化減少。
在一些態樣中，5'端帽包括帽類似物，例如5'端帽可包括鳥嘌呤類似物。例示性鳥嘌呤類似物包括但不限於肌苷、N1-甲基-鳥苷、2'-氟-鳥苷、7-去氮-鳥苷、8-側氧基-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷及2-疊氮基-鳥苷。
在一些態樣中，加帽區可包括單一帽或形成帽之一系列核苷酸。在此態樣中，加帽區之長度可為1至10，例如2-9、3-8、4-7、1-5、5-10個，或至少2個或10個或更少核苷酸。在此態樣中，加帽區之長度為至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一些態樣中，不存在帽。在一些態樣中，第一及第二可操作區之長度可在3至40個核苷酸，例如5-30、10-20、15、或至少4個或30個或更少之範圍內，且除起始及/或終止密碼子以外可包含一或多個信號及/或限制序列。在一些態樣中，第一及第二可操作區之長度為至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個，且除起始及/或終止密碼子以外可包含一或多個信號及/或限制序列。
5'帽結構之其他實例包括但不限於甘油基、倒置的去氧無鹼基殘基(部分)、4',5'-亞甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸、4'-硫基核苷酸、碳環核苷酸、1,5-無水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、經修飾之鹼基核苷酸、蘇-呋喃戊醣基核苷酸、非環狀3',4'-斷核苷酸、非環狀3,4-二羥丁基核苷酸、非環狀3,5-二羥基戊基核苷酸、3'-3'-倒置的核苷酸部分、3'-3'-倒置的無鹼基部分、3'-2'-倒置的核苷酸部分、3'-2'-倒置的無鹼基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-胺基磷酸酯、己基磷酸酯、胺基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或橋聯或非橋聯甲基膦酸酯部分。
在一些態樣中，本發明之RNA分子包含至少一個5'帽結構。在一些態樣中，本發明之RNA分子不包含5'帽結構。
在一個態樣中，5'加帽結構包含經修飾之5'帽1結構(m 7G +m 3'-5'-ppp-5'-Am)。在一個態樣中，5'加帽結構包含(3'OMe) - m 2 7,3'-OGppp (m 1 2'-O)ApG (Trilink)。此分子與天然RNA帽結構一致，因為其以在N7處甲基化之鳥苷開始，且藉由5'至5'三磷酸鍵聯連接至所轉錄RNA之第一經編碼核苷酸(在此情況下為腺苷)。此鳥苷亦在核糖之3'羥基處甲基化以緩解帽分子之可能反向併入。腺苷上之核糖之2'羥基經甲基化，從而賦予帽1結構。
3. 非轉譯區 (UTR)5' UTR為位於蛋白質開放閱讀框架之5'端的調控區域，其轉錄成mRNA但不轉譯成胺基酸序列，及/或RNA聚核苷酸(諸如mRNA分子)中之對應區。非轉譯區(UTR)可存在於開放閱讀框架之5'端(上游) (5' UTR)及/或開放閱讀框架之3'端(下游) (3' UTR)。
在一些態樣中，UTR來源於在mRNA表現所靶向之特定組織(例如淋巴組織)中天然豐富的mRNA。在一些態樣中，UTR增加蛋白質合成。不受機制或理論束縛，UTR可藉由增加mRNA保持轉譯聚核糖體之時間(訊息穩定性)及/或核糖體基於訊息起始轉譯之速率(訊息轉譯效率)來增加蛋白質合成。因此，UTR序列可以組織特異性方式延長蛋白質合成。
在一些態樣中，5' UTR及3' UTR序列以計算方式衍生。在一些態樣中，5' UTR及3' UTR來源於組織中天然豐富的mRNA。該組織可為例如肝臟、幹細胞或淋巴組織。淋巴組織可包括例如淋巴球(例如B淋巴球、輔助T淋巴球、細胞毒性T淋巴球、調控T淋巴球或自然殺手細胞)、巨噬細胞、單核球、樹突狀細胞、嗜中性球、嗜酸性球及網狀紅血球中之任一者。在一些態樣中，5' UTR及3' UTR來源於α病毒(alphavirus)。在一些態樣中，5' UTR及3' UTR來自野生型α病毒。
D.  5' UTR 在一些態樣中，本文所揭示之RNA包含5' UTR。5' UTR若存在，則位於5'端，且以蛋白質編碼區之起始密碼子上游的轉錄起始位點開始。5' UTR在5'帽(若存在)下游，例如直接與5'帽相鄰。5' UTR可含有各種調控元件，例如5'帽結構、莖環結構及內部核糖體進入位點(IRES)，其可在轉譯起始之控制中起作用。
在一些態樣中，本文所揭示之5' UTR包含例如如本文所揭示之帽近端序列。在一些態樣中，帽近端序列包含與5'帽相鄰之序列。在一些態樣中，帽近端序列包含RNA聚核苷酸之位置+1、+2、+3、+4及/或+5之核苷酸。
在一些態樣中，Cap結構包含帽近端序列之一或多個聚核苷酸。在一些態樣中，Cap結構包含m7鳥苷帽及RNA聚核苷酸之核苷酸+1 (N 1)。在一些態樣中，Cap結構包含m7鳥苷帽及RNA聚核苷酸之核苷酸+2 (N 2)。在一些態樣中，Cap結構包含m7鳥苷帽及RNA聚核苷酸之核苷酸+1及+2 (N 1及N 2)。
閱讀本發明之熟習此項技術者應瞭解，在一些態樣中，帽近端序列(例如殘基+1、+2、+3、+4及/或+5中之一或多者)之一或多個殘基可藉助於包括於帽實體(例如帽1結構等)中而包括於RNA中；或者，在一些態樣中，帽近端序列中之至少一些殘基可以酶促方式添加(例如藉由聚合酶，諸如T7聚合酶)。舉例而言，在其中利用(m 2 7,3'-O)Gppp(m 2'-O)ApG帽之某些例示性態樣中，+1及+2殘基為帽之(m 2 7,3'-O) A及G殘基，且+3、+4及+5殘基藉由聚合酶(例如T7聚合酶)添加。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及/或N 2，其中N 1及N 2為任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A。在一些態樣中，N 1為C。在一些態樣中，N 1為G。在一些態樣中，N 1為U。在一些態樣中，N 2為A。在一些態樣中，N 2為C。在一些態樣中，N 2為G。在一些態樣中，N 2為U。在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2以及N 3、N 4及N 5，其中N 1至N 5對應於RNA聚核苷酸之位置+1、+2、+3、+4及/或+5。在一些態樣中，N 1、N 2、N 3、N 4或N 5為任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些態樣中，N 1N 2包含以下中之任一者：AA、AC、AG、AU、CA、CC、CG、CU、GA、GC、GG、GU、UA、UC、UG或UU。在一些態樣中，N 1N 2包含AG且N 3N 4N 5包含以下中之任一者：AAA、ACA、AGA、AUA、AAG、AGG、ACG、AUG、AAC、ACC、AGC、AUC、AAU、ACU、AGU、AUU、CAA、CCA、CGA、CUA、CAG、CGG、CCG、CUG、CAC、CCC、CGC、CUC、CAU、CCU、CGU、CUU、GAA、GCA、GGA、GUA、GAG、GGG、GCG、GUG、GAC、GCC、GGC、GUC、GAU、GCU、GGU、GUU、UAA、UCA、UGA、UUA、UAG、UGG、UCG、UUG、UAC、UCC、UGC、UUC、UAU、UCU、UGU或UUU。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2，及包含以下之序列：A 3A 4X 5(；其中X 5為A、G、C或U)，其中N 1及N 2各自獨立地選自：A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A且N 2為G。在一些態樣中，X 5係選自A、C、G或U。在一些態樣中，X 5為A。在一些態樣中，X 5為C。在一些態樣中，X 5為G。在一些態樣中，X 5為U。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2，及包含以下之序列：C 3A 4X 5(；其中X 5為A、G、C或U)，其中N 1及N 2各自獨立地選自：A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A且N 2為G。在一些態樣中，X 5係選自A、C、G或U。在一些態樣中，X 5為A。在一些態樣中，X 5為C。在一些態樣中，X 5為G。在一些態樣中，X 5為U。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2，及包含以下之序列：X 3Y 4X 5(；其中X 3或X 5各自獨立地選自A、G、C或U；且Y 4不為C)。在一些態樣中，N 1及N 2各自獨立地選自：A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A且N 2為G。在一些態樣中，X 3及X 5各自獨立地選自A、C、G或U。在一些態樣中，X 3及/或X 5為A。在一些態樣中，X 3及/或X 5為C。在一些態樣中，X 3及/或X 5為G。在一些態樣中，X 3及/或X 5為U。在一些態樣中，Y 4為C。在其他態樣中，Y 4不為C。在一些態樣中，Y 4為A。在一些態樣中，Y 4為G。在其他態樣中，Y 4不為G。在一些態樣中，Y4為U。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2，及包含以下之序列：A 3C 4A 5。在一些態樣中，N 1及N 2各自獨立地選自：A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A且N 2為G。
在一些態樣中，帽近端序列包含Cap結構之N 1及N 2，及包含以下之序列：A 3U 4G 5。在一些態樣中，N 1及N 2各自獨立地選自：A、C、G或U。在一些態樣中，N 1為A且N 2為G。
在一個態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含與SEQ ID NO: 17至19中之任一者中提供之5' UTR具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的5' UTR：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%，其中經轉錄之5'帽結構加下劃線。在一個態樣中，5' UTR包含SEQ ID NO: 17至19中之任一者之序列，其中經轉錄之5'帽結構加下劃線。
在一個態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含與SEQ ID NO: 46至48中之任一者中提供之5' UTR具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的5' UTR：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，5' UTR包含SEQ ID NO: 46至48中之任一者之序列，其中經轉錄之5'帽結構加下劃線。 SEQ ID NO: 48 (RNA) GAΨAGGCGGCGCAΨGAGAGAAGCCCAGACCAAΨΨACCΨACCCAAA
1. 3' UTRS 在一些態樣中，本文所揭示之RNA包含3' UTR。3' UTR若存在則位於蛋白質編碼序列開放閱讀框架下游，例如蛋白質編碼區之終止密碼子下游。3' UTR通常為位於mRNA之蛋白質編碼序列與poly-A尾之間的mRNA部分。因此，在一些態樣中，3' UTR在poly-A序列(若存在)上游，例如直接與poly-A序列相鄰。3' UTR可涉及調控過程，包括轉錄物裂解、穩定性及聚腺苷酸化、轉譯、及mRNA定位。
3' UTR亦可包含不在轉錄RNA之模板中編碼而是在轉錄之後在成熟期間添加的元件，例如poly-A尾。mRNA之3' UTR不轉譯成胺基酸序列。在一些態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含F元件及/或I元件之3' UTR。在一些態樣中，3' UTR或其近端序列包含限制位點。在一些態樣中，限制位點為BamHI位點。在一些態樣中，限制位點為Xhol位點。
在一些態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含與SEQ ID NO: 20至22中之任一者中提供之3' UTR具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的3' UTR：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，3' UTR包含SEQ ID NO: 20至22中之任一者之序列。SEQ ID NO: 22 (RNA)示為： CΨCGAGCΨGGΨACΨGCAΨGCACGCAAΨGCΨAGCΨGCCCCΨΨΨCCCGΨCCΨGGGΨACCCCGAGΨCΨCCCCCGACCΨCGGGΨCCCAGGΨAΨGCΨCCCACCΨCCACCΨGCCCCACΨCACCACCΨCΨGCΨAGΨΨCCAGACACCΨCCCAAGCACGCAGCAAΨGCAGCΨCAAAACGCΨΨAGCCΨAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGΨGAΨΨAACCΨΨΨAGCAAΨAAACGAAAGΨΨΨAACΨAAGCΨAΨACΨAACCCCAGGGΨΨGGΨCAAΨΨΨCGΨGCCAGCCACACCCΨGGAGCΨAGC。
在一個態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含與SEQ ID NO: 23至25中之任一者中提供之3' UTR具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的3' UTR：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，3' UTR包含SEQ ID NO: 23至25中之任一者之序列。SEQ ID NO: 25 (RNA)示為： AΨACAGCAGCAAΨΨGGCAAGCΨGCΨΨACAΨAGAACΨCGCGGCGAΨΨGGCAΨGCCGCCΨΨAAAAΨΨΨΨΨAΨΨΨΨAΨΨΨΨΨCΨΨΨΨCΨΨΨΨCCGAAΨCGGAΨΨΨΨGΨΨΨΨΨAAΨAΨΨΨC。
2. 開放閱讀框架 (ORF)5'及3' UTR可操作地連接至開放閱讀框架(ORF)，其可為能夠轉譯成相關多肽之密碼子序列。開放閱讀框架可為若干DNA或RNA核苷酸三聯體之序列，其可轉譯成肽或蛋白質。ORF可以其5'端及下一區處之起始密碼子開始，該起始密碼子例如通常編碼胺基酸甲硫胺酸之三個連續核苷酸之組合(ATG或AUG)，其長度通常為3個核苷酸之倍數。開放閱讀框架可以至少一個終止密碼子結束，該終止密碼子包括但不限於TAA、TAG、TGA或UAA、UAG或UGA，或其任何組合。在一些態樣中，開放閱讀框架可以一個、兩個、三個、四個或更多個終止密碼子結束，該等終止密碼子包括但不限於TAATAA (SEQ ID NO: 27)、TAATAG (SEQ ID NO: 28)、TAATGA (SEQ ID NO: 29)、TAGTGA (SEQ ID NO: 30)、TAGTAA (SEQ ID NO: 31)、TAGTAG (SEQ ID NO: 32)、TGATGA (SEQ ID NO: 33)、TGATAG (SEQ ID NO: 34)、TGATAA (SEQ ID NO: 35)或UAAUAA (SEQ ID NO: 36)、UAAUAG (SEQ ID NO: 37)、UAAUGA (SEQ ID NO: 38)、UAGUGA (SEQ ID NO: 39)、UAGUAA (SEQ ID NO:40)、UAGUAG (SEQ ID NO: 41)、UGAUGA (SEQ ID NO: 42)、UGAUAG (SEQ ID NO: 43)、UGAUAA (SEQ ID NO: 44)或其任何組合。開放閱讀框架可為分離的，或其可併入較長核酸序列中，例如併入載體或mRNA中。開放閱讀框架亦可被稱為「(蛋白質)編碼區」或「編碼序列」。
如本文所陳述，RNA分子可包括一個(單順反子)、兩個(雙順反子)或更多個(多順反子)開放閱讀框架。
在一些態樣中，ORF編碼非結構病毒基因。在一些態樣中，ORF進一步包括一或多個次基因體啟動子。在一些態樣中，RNA分子包括可操作地連接至ORF之次基因體啟動子。在一些態樣中，第一RNA分子不包括編碼任何相關多肽之ORF，而第二RNA分子包括編碼相關多肽之ORF。在一些態樣中，第一RNA分子不包括次基因體啟動子。
本發明提供一種RNA分子，其包含至少一個編碼呼吸道融合性病毒(RSV)多肽之開放閱讀框架。在一些態樣中，RNA分子包含至少一個編碼RSV F蛋白之開放閱讀框架。
本發明提供一種RNA分子，其包含至少一個編碼來源於流行性感冒，諸如HA及/或NA之多肽的開放閱讀框架。在一些態樣中，RNA分子包含至少一個編碼流行性感冒HA及/或NA之開放閱讀框架。
3. 相關基因本文所描述之RNA分子可包括相關基因。相關基因編碼相關多肽。相關多肽之非限制性實例包括例如生物製劑、抗體、疫苗、治療性多肽或肽、細胞穿透肽、分泌性多肽、質膜多肽、細胞質或細胞骨架多肽、細胞內膜結合多肽、核多肽、與人類疾病相關之多肽、靶向部分、由已鑑別無治療適應症但在研究及探索領域中仍具有效用之人類基因體編碼的彼等多肽，或其組合。特定相關基因之序列容易由熟習此項技術者使用公開及私有資料庫(例如GENBANK®)鑑別。
在一些態樣中，RNA分子包括相關基因之編碼區。在一些態樣中，相關基因為或包含抗原性多肽或其免疫原變異體或免疫原片段。在一些態樣中，抗原性多肽包含一個來自抗原之抗原決定基。在一些態樣中，抗原性多肽包含複數個來自抗原之不同抗原決定基。在一些態樣中，包含複數個來自抗原之不同抗原決定基的抗原性多肽為多抗原決定基的。在一些態樣中，抗原性多肽包含：來自過敏原之抗原性多肽、病毒抗原性多肽、細菌抗原性多肽、真菌抗原性多肽、寄生蟲抗原性多肽、來自傳染原之抗原性多肽、來自病原體之抗原性多肽、腫瘤抗原性多肽或自身抗原性多肽。
術語「抗原」可指能夠由免疫系統(例如由適應性免疫系統)識別且能夠例如藉由形成抗體及/或抗原特異性T細胞來引發抗原特異性免疫反應作為適應性免疫反應之一部分的物質。抗原可為或可包含肽或蛋白，其可由MHC呈遞至T細胞。抗原可為所提供核酸分子(例如本文所描述之包含至少一個編碼序列的RNA分子)之轉譯產物。另外，抗原(諸如肽或蛋白質)之包含至少一個抗原決定基之片段、變異體及衍生物理解為抗原。
在一些態樣中，編碼相關基因(例如抗原)之RNA在所治療個體之細胞中表現以提供相關基因(例如抗原)。在一些態樣中，RNA在個體之細胞中短暫表現。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現係在細胞表面處。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)在MHC之環境下表現及呈遞。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現係至細胞外空間中，例如抗原為分泌的。
在一些態樣中，RNA分子包括相關基因(例如抗原)之編碼區。在一些態樣中，RNA分子包括來源於與傳染病相關之病原體之相關基因(例如抗原)的編碼區。在一些態樣中，RNA分子包括來源於呼吸道融合性病毒(RSV)之相關基因(例如抗原)及/或來源於流行性感冒之抗原的編碼區。
在一些態樣中，本文所描述之RNA聚核苷酸或包含其之組合物或醫學製劑包含本文所揭示之核苷酸序列。在一些態樣中，RNA聚核苷酸包含與本文所揭示之核苷酸序列具有至少80%一致性之序列。在一些態樣中，RNA聚核苷酸包含編碼與本文所揭示之多肽序列具有至少80%一致性之多肽的序列。在一些態樣中，本文所描述之RNA聚核苷酸或包含其之組合物或醫學製劑由DNA模板轉錄。在一些態樣中，用於轉錄本文所描述之RNA聚核苷酸的DNA模板包含與RNA聚核苷酸互補之序列。在一些態樣中，本文所描述之相關基因由包含本文所揭示之核苷酸序列的本文所描述之RNA聚核苷酸編碼。在一些態樣中，RNA聚核苷酸編碼與本文所揭示之多肽序列具有至少80%一致性的多肽。在一些態樣中，本文所描述之多肽由RNA聚核苷酸編碼，該RNA聚核苷酸係由包含與RNA聚核苷酸互補之序列的DNA模板轉錄。
在一些態樣中，RNA分子編碼包含SEQ ID NO: 1-6中之任一者之序列的RSV F蛋白或其片段或變異體。
在一些態樣中，RNA分子編碼由包含SEQ ID NO: 7至10中之任一者之核酸序列合成的RSV F蛋白或其片段或變異體。
4.     poly-A 尾在一些態樣中，本文所揭示之RNA分子包含例如如本文所描述之聚腺苷酸(poly-A)序列。在一些態樣中，poly-A序列位於3' UTR下游，例如與3' UTR相鄰。「poly-A尾」或「poly-A序列」係指一段連續腺嘌呤殘基，其可連接至RNA分子之3'端。poly-A序列為熟習此項技術者已知的，且可接在本文所描述之RNA分子中之3' UTR後面。poly-A尾可增加RNA分子之半衰期。
本文所揭示之RNA分子可具有在轉錄之後藉由不依賴於模板之RNA聚合酶連接至RNA之游離3'端的poly-A序列，或由DNA編碼且由依賴於模板之RNA聚合酶轉錄的poly-A序列。在一些態樣中，poly-A序列在基於與編碼股互補之股中包含重複dT核苷酸(去氧胸苷酸)的DNA模板進行RNA轉錄期間，例如在活體外轉錄之RNA之製備期間連接。
編碼poly-A序列之DNA序列(編碼股)被稱為poly-A卡匣。在一些態樣中，DNA之編碼股中存在之poly-A卡匣基本上由dA核苷酸組成，但間雜有四個核苷酸(dA、dC、dG及dT)之隨機序列。此類隨機序列之長度可為至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個。此類卡匣揭示於WO 2016/005324 A1中，其以全文引用之方式併入本文中。WO 2016/005324 A1中所揭示之任何poly-A卡匣均可用於本發明中。涵蓋基本上由dA核苷酸組成，但間雜有具有均等分佈之四個核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5至50個核苷酸之長度的隨機序列的poly-A卡匣，其在DNA層面上展示在大腸桿菌中質體DNA之常數傳播，且在RNA層面上，仍與支持RNA穩定性及轉譯效率方面之有益特性相關。在一些態樣中，本文所描述之RNA聚核苷酸中所含有之poly-A序列基本上由腺苷核苷酸組成，但間雜有四種核苷酸(A、C、G、U)之隨機序列。此類隨機序列之長度可為至少、至多、恰好以下數目個核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個核苷酸：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個。
在一些態樣中，沒有除腺苷核苷酸以外的核苷酸在poly-A序列之3'端側接poly-A序列，例如poly-A序列之3'端不被除腺苷以外的核苷酸掩蓋或poly-A序列之3'端後面不跟隨除腺苷以外的核苷酸。
在一些態樣中，RNA分子可進一步包括緊接在poly-A尾序列下游的核酸內切酶識別位點序列。RNA分子可進一步包括靠近其3'端之poly-A聚合酶識別序列(例如AAUAAA)。
poly-A序列可具有任何長度。在一些態樣中，poly-A尾可包括5至300個核苷酸之長度。在一些態樣中，RNA分子包括poly-A尾，該poly-A尾包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：約25至約400個腺苷核苷酸之序列、約50至約400個腺苷核苷酸之序列、約50至約300個腺苷核苷酸之序列、約50至約250個腺苷核苷酸之序列、約60至約250個腺苷核苷酸之序列、或約40至約100個腺苷核苷酸之序列。在一些態樣中，poly-A尾包含至少、至多、恰好以下數目個腺苷核苷酸或以下中之任兩者之間的數目個腺苷核苷酸、基本上由其組成或由其組成：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500個。在此上下文中，「基本上由……組成」意指poly-A序列中之大部分核苷酸，poly-A序列中通常按數目計至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之核苷酸為腺苷核苷酸，但允許其餘核苷酸為除腺苷核苷酸以外的核苷酸，諸如尿苷、鳥苷及/或胞嘧啶。在此上下文中，「由……組成」意謂poly-A序列中之所有核苷酸(例如按數目計poly-A序列中100%之核苷酸)為腺苷核苷酸。
在一些態樣中，RNA分子包括有包括多於30個腺苷核苷酸之序列的poly-A尾。在一些態樣中，RNA分子包括有包括約40個腺苷核苷酸之poly-A尾。在一些態樣中，RNA分子包括有包括約80個腺苷核苷酸之poly-A尾。在一些態樣中，3' poly-A尾具有一段至少10個連續腺苷殘基且至多300個連續腺苷殘基。在一些特定態樣中，RNA分子包括約40個連續腺苷殘基。在一些態樣中，RNA分子包括約80個連續腺苷殘基。poly-A尾可在增強轉譯效率及調控mRNA品質控制及降解之效率中起關鍵調控作用。短序列或超聚腺苷酸化可發送RNA降解信號。一些設計包括約40個腺苷核苷酸、約腺苷核苷酸之poly-A尾。
在一些態樣中，poly-A尾可位於RNA分子或其他核酸分子內，諸如位於載體中，例如位於充當例如藉由轉錄載體來產生RNA (例如mRNA)之模板的載體中。在一些態樣中，RNA分子可不包括poly-A尾。
在一個態樣中，本文所揭示之RNA包含有包含與SEQ ID NO: 26具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的poly-A尾：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，poly-A尾包含SEQ ID NO: 26之序列。
5. 自擴增 RNA (SaRNA)在一些態樣中，RNA分子可為saRNA。「自擴增RNA (Self-amplifying RNA)」、「自擴增RNA (self-amplifying RNA)」、「自複製」及「複製子」均可互換使用，且係指本身能夠複製之RNA。自擴增RNA分子可藉由使用來源於例如α病毒之複製元件且用編碼相關多肽之核苷酸序列取代結構病毒多肽來產生。自擴增RNA分子通常為可在遞送至細胞之後直接轉譯的正股分子，且此轉譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，其接著自所遞送RNA產生反義及有義轉錄物。所遞送RNA引起多個子RNA分子之產生。此等子RNA分子以及共線次基因體轉錄物可自身經轉譯以提供經編碼之相關基因(例如病毒抗原)之原位表現，或可經轉錄以提供與經轉譯以提供抗原之原位表現的所遞送RNA同義的其他轉錄物。此順序轉錄之總體結果為所引入saRNA分子之數目擴增，且因此經編碼之相關基因(例如病毒抗原)變成細胞之主要多肽產物。
在一些態樣中，自擴增RNA包括至少一種或多種基因，包括病毒複製酶、病毒蛋白酶、病毒解螺旋酶及其他非結構病毒蛋白中之任一者，或其組合。在一些態樣中，自擴增RNA亦可包括5'端及3'端牽引複製序列，及視情況存在之編碼所需胺基酸序列(例如相關抗原)之異源序列。引導異源序列之表現的次基因體啟動子可包括在自擴增RNA中。視情況，異源序列(例如，相關抗原)可與自擴增RNA中之其他編碼區框內融合及/或可處於內部核糖體進入位點(IRES)之控制下。
在一個態樣中，本文所揭示之自擴增RNA包含有包含與SEQ ID NO: 49具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列的次基因體啟動子：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，次基因體啟動子包含SEQ ID NO: 49之序列。
SEQ ID NO: 49 (RNA)示為： CCUGAAUGGACUACGACAUAGUCUAGUCCGCCAAG
在一些態樣中，本文所描述之自擴增RNA分子編碼：(i)可由自擴增RNA分子轉錄RNA之RNA依賴性RNA聚合酶；及(ii)相關多肽，例如病毒抗原。在一些態樣中，聚合酶可為α病毒複製酶，例如包括α病毒蛋白質nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中之任一者及其任何組合。
在一個態樣中，本文所揭示之自擴增RNA包含α病毒複製酶，例如包括α病毒蛋白質nsP1、nsP2、nsP3、nsP4中之任一者及其任何組合，其分別包含與SEQ ID NO: 50-53具有至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之一致性的序列：99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%。在一個態樣中，α病毒蛋白質nsP1、nsP2、nsP3及nsP4各自分別包含SEQ ID NO: 50-53之序列。 SEQ ID NO: 50 (nsP1 RNA)；SEQ ID NO: 51 (NSP2 RNA)；SEQ ID NO: 52 (NSP3 RNA)；SEQ ID NO: 53 (NSP4 RNA)
在一些態樣中，自擴增RNA分子可具有兩個開放閱讀框架。第一(5')開放閱讀框架可編碼複製酶；第二(3')開放閱讀框架可編碼包含相關抗原之多肽。在一些態樣中，RNA可具有額外(例如下游)開放閱讀框架，例如以編碼其他抗原或編碼輔助多肽。
在一些態樣中，saRNA分子進一步包括：(1) α病毒5'複製識別序列；及(2) α病毒3'複製識別序列。在一些態樣中，自擴增RNA分子之5'序列經選擇以確保與所編碼之複製酶相容。
在一些態樣中，自擴增RNA分子可編碼單一多肽抗原，或視情況編碼兩個或更多個多肽抗原，該等多肽抗原以序列中之各者在以胺基酸序列形式表現時保持其特性的方式連接在一起(例如，串聯連接)。由自擴增RNA產生之多肽接著可以融合多肽之形式產生，或以使得產生分離多肽或肽序列之方式經工程改造。
在一些態樣中，本文所描述之自擴增RNA可編碼包括一系列抗原決定基之一或多種多肽抗原。在一些態樣中，本文所描述之自擴增RNA可編碼能夠引發輔助T細胞反應或細胞毒性T細胞反應或兩者之抗原決定基。
IV. RNA 轉錄在一些態樣中，本文所揭示之RNA係藉由活體外轉錄或化學合成產生。在本發明之上下文中，術語「轉錄」係指其中DNA序列中之遺傳密碼轉錄成RNA的過程。隨後，RNA可轉譯成肽或蛋白質。
根據本發明，「轉錄」包含「活體外轉錄」或「IVT」，其係指其中轉錄在非細胞系統中活體外發生以產生用於各種應用之合成RNA產物，包括例如產生蛋白質或多肽的過程。可應用選殖載體來產生轉錄物。此等選殖載體一般被稱為轉錄載體，且根據本發明由術語「載體」涵蓋。根據特定態樣，所使用RNA為活體外轉錄之RNA (IVT-RNA)，且可藉由適當DNA模板之活體外轉錄獲得。用於控制轉錄之啟動子可為任何RNA聚合酶之任何啟動子。RNA聚合酶之特定實例為T7、T3及SP6 RNA聚合酶。較佳地，根據本發明之活體外轉錄受T7或SP6啟動子控制。用於活體外轉錄之DNA模板可藉由選殖核酸(尤其cDNA)且將其引入用於活體外轉錄之適當載體中而獲得。cDNA可藉由RNA之反轉錄獲得。
合成IVT RNA產物可活體外轉譯或直接引入細胞中，該等產物可在該等細胞中轉譯。就RNA而言，術語「表現」或「轉譯」係指在細胞之核糖體中mRNA股引導胺基酸序列之組裝以產生肽或蛋白質的過程。此類合成RNA產物包括但不限於例如mRNA分子、saRNA分子、反義RNA分子、shRNA分子、長非編碼RNA分子、核糖核酸酶、適體、引導RNA分子(例如對於CRISPR)、核糖體RNA分子、小核RNA分子、小核仁RNA分子及其類似者。IVT反應通常利用如本文所描述及/或利用之DNA模板(例如，線性DNA模板)、核糖核苷酸(例如，未經修飾之核糖核苷酸三磷酸或經修飾之核糖核苷酸三磷酸)及適當RNA聚合酶。
在一些態樣中，mRNA係藉由活體外轉錄使用DNA模板製造，其中DNA係指含有去氧核糖核苷酸之核酸。在一些態樣中，本文所揭示之RNA為活體外轉錄之RNA (IVT-RNA)，且可藉由適當DNA模板之活體外轉錄獲得。用於控制轉錄之啟動子可為任何RNA聚合酶之任何啟動子。用於活體外轉錄之DNA模板可藉由選殖核酸(尤其cDNA)且將其引入用於活體外轉錄之適當載體中而獲得。cDNA可藉由RNA之反轉錄獲得。
在一些態樣中，IVT之起始材料可包括線性化DNA模板、核苷酸、RNA酶抑制劑、焦磷酸酶及/或T7 RNA聚合酶。在一些態樣中，IVT過程在生物反應器中進行。生物反應器可包含混合器。在一些態樣中，核苷酸可在整個IVT過程期間添加至生物反應器中。
在一些態樣中，在IVT過程後，將一或多種IVT後試劑添加至生物反應器中包含RNA之IVT混合物中。例示性IVT後試劑可包括經組態以消化線性化DNA模板之DNAse I以及經組態以消化DNAse I及T7 RNA聚合酶之蛋白酶K。在一些態樣中，在IVT之後，將IVT後試劑與生物反應器中之混合物一起培育。在一些態樣中，生物反應器可含有至少、至多、恰好以下公升數或以下中之任兩者之間的公升數之IVT混合物：60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490及500或更多公升。IVT混合物可具有至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的RNA濃度：3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、7.0、8.0、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90及100 mg/mL或更多RNA。
在一些態樣中，IVT混合物可包括殘餘亞精胺、殘餘DNA、殘餘蛋白質、肽、HEPES、EDTA、硫酸銨、陽離子(例如Mg 2+、Na +、Ca 2+)、RNA片段、殘餘核苷酸、游離磷酸酯或其任何組合。
在一些態樣中，IVT混合物之至少一部分經過濾。IVT混合物可經由超濾及/或透濾來過濾，以自IVT混合物移除至少一些雜質及/或改變至少一部分IVT混合物之緩衝溶液以產生濃縮RNA溶液作為滲餘物。
在一些態樣中，「超濾」及「透濾」均係指膜過濾製程。超濾通常使用孔徑為至少、至多、恰好以下尺寸或以下中之任兩者之間的尺寸的膜：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09及0.1 µm。在一些態樣中，超濾膜通常藉由截留分子量(MWCO)而非孔徑來進行分類。舉例而言，MWCO可為至少、至多、恰好以下或在以下中之任兩者之間：30 kDa、40 kDa、50 kDa、60 kDa、70 kDa、80 kDa、90 kDa、100 kDa、110 kDa、120 kDa、130 kDa、140 kDa、150 kDa、160 kDa、170 kDa、180 kDa、190 kDa、200 kDa、210 kDa、220 kDa、230 kDa、240 kDa、250 kDa、260 kDa、270 kDa、280 kDa、290 kDa、300 kDa、310 kDa、320 kDa、330 kDa、340 kDa、350 kDa、360 kDa、370 kDa、380 kDa、390 kDa、400 kDa、500 kDa、600 kDa、700 kDa、800 kDa、900 kDa、1000 kDa、2000 kDa、3000 kDa、4000 kDa、5000 kDa、6000 kDa、7000 kDa、8000 kDa、9000 kDa及10000kDa。熟習此項技術者應理解，視應用而定，過濾膜可具有不同的適合材料，包括例如聚合物、纖維素、陶瓷等。在一些態樣中，膜過濾可更合乎大體積純化製程需要。
在一些態樣中，用於純化RNA的IVT混合物之超濾及透濾可包括：(1)直流過濾(DFF)，亦稱為「死端」過濾，其應用垂直於膜表面之進料流且試圖使100%的流體通過膜；及/或(2)切向流過濾(TFF)，亦稱為掃流過濾，其中進料流平行於膜表面傳遞，其中一個部分通過膜(滲透物)，而剩餘物(滲餘物)保留及/或再循環回至進料槽。
在一些態樣中，IVT混合物之過濾係經由TFF進行，該TFF包含超濾步驟、第一透濾步驟及第二透濾步驟。在一些態樣中，第一透濾步驟在硫酸銨存在下進行。第一透濾步驟可經組態以自IVT混合物移除大部分雜質。在一些態樣中，第二透濾步驟在不存在硫酸銨之情況下進行。第二透濾步驟可經組態以將RNA轉移至DS緩衝液調配物中。
可選擇具有適當MWCO之過濾膜用於TFF製程中之超濾。TFF膜之MWCO決定哪些溶質可通過膜進入濾液中及哪些溶質保留在滲餘物中。TFF膜之MWCO可經選擇，使得實質上所有相關溶質(例如，所需合成RNA物種)保留在滲餘物中，而非所需組分(例如，過量的核糖核苷酸、小核酸片段(諸如經消化或水解之DNA模板)、肽片段(諸如經消化之蛋白質)及/或其他雜質)傳遞至濾液中。在一些態樣中，包含所需合成RNA物種之滲餘物可再循環至進料儲槽中以在額外循環中再過濾。在一些態樣中，TFF膜之MWCO可為至少、至多、恰好以下或在以下中之任兩者之間：30 kDa、40 kDa、50 kDa、60 kDa、70 kDa、80 kDa、90 kDa或更多。在一些態樣中，TFF膜之MWCO可為至少、至多、恰好以下或在以下中之任兩者之間：100 kDa、150 kDa、200 kDa、250 kDa、300 kDa、350 kDa、400 kDa或更多。在一些態樣中，TFF膜之MWCO可為約250-350 kDa。在一些態樣中，TFF膜(例如基於纖維素之膜)之MWCO可為約30-300 kDa；在一些態樣中，可為約50-300 kDa、約100-300 kDa、或約200-300 kDa。
透濾可不連續地或者連續地進行。舉例而言，在連續透濾中，透濾溶液可以與產生濾液相同的速率添加至樣品進料儲槽中。以此方式，樣品儲槽之體積保持恆定，但移除可自由滲透通過膜之小分子(例如，鹽、溶劑等)。使用溶劑移除作為實例，各額外透濾體積(DV)進一步降低溶劑濃度。在不連續透濾中，溶液首先經稀釋且接著濃縮回至起始體積。隨後重複此製程直至達到儲槽中剩餘之小分子(例如，鹽、溶劑等)之所需濃度。各額外透濾體積(DV)進一步降低小分子(例如溶劑)濃度。連續透濾實現待過濾分子之給定降低通常需要最小體積。另一方面，不連續透濾准許滲餘物狀態(諸如pH值、鹽含量及其類似者)之快速變化。在一些態樣中，第一透濾步驟以至少、至多、恰好以下數目或在以下中之任兩者之間的數目的透濾體積進行：2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個。在一些態樣中，第二透濾步驟以至少、至多、恰好以下數目或在以下中之任兩者之間的數目的透濾體積進行：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個。在一些態樣中，第一透濾步驟以5個透濾體積進行，且第二透濾步驟以10個透濾體積進行。
在一些態樣中，對於超濾及/或透濾，IVT混合物以至少、至多、恰好以下或在以下中之任兩者之間的速率過濾：100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、500、600、700、800、900或1000公升/平方公尺過濾器面積/小時或更大。濃縮RNA溶液可包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的單股RNA：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5 mg/mL。
在一些態樣中，亦可減少經由過濾獲得RNA產物溶液的濃縮RNA溶液之生物負荷。可使用一或多個過濾器進行過濾以用於減少生物負荷。一或多個過濾器可包括孔徑為至少、至多、恰好以下或在以下中之任兩者之間的過濾器：0.2 µm、0.45 µm、0.65 µm、0.8 µm或經組態以移除生物負荷之任何其他孔徑。
作為一個實例，減少生物負荷可包括對含有獲自超濾及/或透濾之滲餘物的滲餘物貯槽進行排液以獲得滲餘物。減少生物負荷可包括使用洗滌緩衝溶液來沖洗用於超濾及/或透濾之過濾系統，以獲得包含過濾系統中剩餘之殘餘RNA的洗滌池溶液。可過濾滲餘物以獲得經過濾之滲餘物。可使用第一0.2 µm過濾器過濾洗滌池溶液以獲得經過濾之洗滌池溶液。可使用第一0.2 µm過濾器或另一0.2 µm過濾器過濾滲餘物。
可合併經過濾之洗滌池溶液及經過濾之滲餘物以形成經合併之池溶液。可使用第二0.2 µm過濾器來過濾經合併之池溶液以獲得經過濾之合併池溶液，該經過濾之合併池溶液使用第三0.2 µm過濾器進一步過濾以產生RNA產物溶液。
V. RNA 囊封RNA產物溶液中之RNA可經囊封，且RNA溶液可進一步包含至少一種囊封劑。在一個態樣中，囊封劑包含脂質、脂質奈米粒子(LNP)、脂質複合物、聚合物粒子、聚合複合物及整體型遞送系統以及其組合。
在一個態樣中，囊封劑為脂質，且產生脂質奈米粒子(LNP)囊封之RNA。在不意欲受任何理論束縛之情況下，咸信，陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料及/或陽離子聚合物與核酸組合在一起以形成聚集物，且此聚集產生膠態穩定的粒子。脂質可為天然存在之脂質或合成脂質。然而，脂質通常為生物物質。生物脂質為此項技術中所熟知，且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、類固醇、萜類、溶血脂質、鞘醣脂、糖脂質、硫脂、具有醚及酯連接之脂肪酸之脂質及可聚合脂質，及其組合。脂質為不溶於水且可用有機溶劑萃取之物質。熟習此項技術者瞭解除本文專門描述之彼等化合物以外的作為脂質之化合物，且本發明之組合物及方法涵蓋該等化合物。脂質組分及非脂質可彼此共價或非共價連接。
在一些態樣中，LNP可設計成保護RNA分子(例如saRNA、mRNA)免於細胞外RNA酶，及/或可經工程改造用於將RNA全身性遞送至目標細胞。在一些態樣中，當將RNA分子靜脈內投與至有需要之個體時，此類LNP可尤其適用於遞送RNA分子(例如mRNA、saRNA、modRNA)。在一些態樣中，當將RNA分子肌肉內投與至有需要之個體時，此類LNP可尤其適用於遞送RNA分子(例如saRNA、mRNA)。
在一個態樣中，RNA 溶液中之RNA之濃度＜ 1 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約0.05 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約0.5 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少約1 mg/mL。在另一態樣中，RNA濃度為約0.05 mg/mL至約0.5 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少10 mg/mL。在另一態樣中，RNA之濃度為至少50 mg/mL。在一些態樣中，RNA之濃度為至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：約0.05 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、250 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或更多。
本發明提供一種RNA溶液及其脂質製劑混合物或組合物，其包含至少一種編碼例如抗原(例如RSV融合前F蛋白及/或來源於流行性感冒、例如HA及/或NA之抗原)之RNA，該至少一種RNA與一或多種脂質複合、囊封於其中及/或用其調配，且形成脂質奈米粒子(LNP)、脂質體、脂質複合物及/或奈米脂質體。在一些態樣中，組合物包含脂質奈米粒子。
脂質奈米粒子或LNP係指當陽離子脂質及視情況一或多種其他脂質例如在水性環境中及/或在RNA存在下合併時所產生之任何形態的粒子。在一些態樣中，脂質奈米粒子包括在調配物中，該調配物可用於遞送活性劑或治療劑，諸如核酸(例如mRNA、saRNA、modRNA)至相關目標部位(例如細胞、組織、器官、腫瘤及其類似物)。在一些態樣中，本發明之脂質奈米粒子包含核酸。此類脂質奈米粒子通常包含陽離子脂質及一或多種賦形劑，例如一或多種中性脂質、帶電脂質、類固醇、聚合物結合脂質或其組合。在一些態樣中，活性劑或治療劑，諸如核酸(例如mRNA、saRNA、modRNA)，可囊封在脂質奈米粒子之脂質部分或由脂質奈米粒子之一些或全部脂質部分包封的水性空間中，藉此使其避免酶促降解或由宿主生物體或細胞之機制誘發的其他不合需要之作用，例如不良免疫反應。核酸(例如mRNA、saRNA、modRNA)或其一部分亦可與脂質奈米粒子締合及複合。脂質奈米粒子可包含能夠形成連接核酸或囊封一或多種核酸之粒子的任何脂質。
在一些態樣中，所提供RNA分子(例如mRNA、saRNA、modRNA)可用LNP調配。在一些態樣中，脂質奈米粒子之平均直徑可為約1至500 nm。在一些態樣中，脂質奈米粒子之平均直徑為約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70至約90 nm、約80 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm，或至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm，且為實質上無毒的。術語「平均直徑」係指使用所謂的累積量演算法藉由動態雷射光散射(DLS)與資料分析所量測的粒子之平均流體動力學直徑，其結果提供長度維度之所謂的Z平均值及無維度的多分散性指數(PDI) (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, 第4814-4820頁, ISO 13321)。此處，粒子之「平均直徑」、「直徑」或「尺寸」與此Z平均值同義使用。
本文所描述之LNP可展現小於約0.5、小於約0.4、小於約0.3或約0.2或更小之多分散性指數。藉助於實例，LNP可展現至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的多分散性指數：0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5。在一些態樣中，多分散性指數係基於動態光散射量測結果，藉由如在「平均直徑」之定義中所提及的所謂的累積量分析來計算。在某些先決條件下，其可視為奈米粒子總體之尺寸分佈之量測值。
在某些態樣中，核酸(例如RNA分子)在存在於所提供LNP中時在水溶液中抵抗核酸酶降解。在一些態樣中，LNP為靶向肝臟之脂質奈米粒子。在一些態樣中，LNP為包含一或多種陽離子脂質(例如本文所描述者)的陽離子脂質奈米粒子。在一些態樣中，陽離子LNP可包含至少一種陽離子脂質、至少一種聚合物結合脂質及至少一種輔助脂質(例如至少一種中性脂質)。
在某些態樣中，RNA溶液及其脂質製劑混合物或組合物可具有以下量、具有至少以下量、或具有至少、至多、恰好以下量或以下中之任兩者之間的量的特定脂質、脂質類型或非脂質組分，諸如脂質樣材料及/或陽離子聚合物或佐劑、抗原、肽、多肽、糖、核酸或本文所揭示或如熟習此項技術者將已知的其他材料：約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約31%、約32%、約33%、約34%、約35%、約36%、約37%、約38%、約39%、約40%、約41%、約42%、約43%、約44%、約45%、約46%、約47%、約48%、約49%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%、約56%、約57%、約58%、約59%、約60%、約61%、約62%、約63%、約64%、約65%、約66%、約67%、約68%、約69%、約70%、約71%、約72%、約73%、約74%、約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%。
本文所描述之LNP可使用各種方法製備，該等方法可涉及自至少一種陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料及/或至少一種陽離子聚合物獲得膠體，及將膠體與核酸混合，以獲得核酸粒子。如本文所用之 術語「膠體」係指分散粒子不會沉澱出來的一種均勻混合物。混合物中之不可溶粒子為微小的，其粒徑在1與1000奈米之間。混合物可被稱為膠體或膠態懸浮液。有時，術語「膠體」僅指混合物中之粒子而非整個懸浮液。
為了製備包含至少一種陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料及/或至少一種陽離子聚合物的膠體，在本文中可應用習知用於製備脂質體囊泡且經適當調適之方法。製備脂質體囊泡之最常用方法共用以下基本階段：(i)將脂質溶解於有機溶劑中，(ii)對所得溶液進行乾燥，及(iii)由乾燥的脂質進行水合作用(使用多種水性介質)。在膜水合方法中，首先將脂質溶解於合適的有機溶劑中且乾燥，在燒瓶底部得到薄膜。使用適當水性介質對所獲得脂質膜進行水合，產生脂質體分散液。此外，可包括額外縮小尺寸的步驟。
逆相蒸發為一種製備脂質體囊泡之膜水合替代方法，該方法涉及在水相與含有脂質之有機相之間形成油包水乳液。此混合物需要經過短暫音波處理使系統均質化。在減壓下移除有機相，得到乳白色凝膠，其隨後轉變成脂質體懸浮液。
術語「乙醇注射技術」係指將包含脂質之乙醇溶液經由針頭快速注射至水溶液中的製程。此操作使脂質分散在整個溶液中且促進形成脂質結構，例如形成脂質囊泡，諸如形成脂質體。一般而言，本文所描述之RNA脂質複合物粒子可藉由將RNA添加至膠態脂質體分散液中而獲得。使用乙醇注射技術，在一些態樣中，此類膠態脂質體分散液係如下形成：在攪拌下將包含脂質(諸如陽離子脂質及額外脂質)之乙醇溶液注射至水溶液中。在一些態樣中，本文所描述之RNA脂質複合物粒子可在無擠出步驟的情況下獲得。
術語「擠出(extruding)」或「擠出(extrusion)」係指產生具有固定橫截面輪廓之粒子。特別地，其係指縮小粒子之尺寸，其中迫使粒子通過具有限定孔之過濾器。
根據本發明，亦可使用其他具有不含有機溶劑的特性之方法來製備膠體。
在一些態樣中，LNP囊封之RNA可藉由以下來產生：在可以觸發一或多種脂質組分之溶解性急劇變化(其驅動脂質傾向自組裝成LNP形式)的條件下，將本文所描述之RNA溶液(例如RNA產物溶液)與本文所描述之脂質製劑(包含例如至少一種陽離子脂質及視情況一或多種其他脂質組分於有機溶劑中)快速混合。在一些態樣中，適合的緩衝劑包含tris、組胺酸、檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽或丁二酸鹽。液體調配物之pH與囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa有關。酸化緩衝液之pH可比囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa小至少一半pH標度，且最終緩衝液之pH可比囊封劑(例如陽離子脂質)之pKa大至少一半pH標度。在一些態樣中，選擇陽離子脂質之特性，以便藉由與核酸(例如RNA)之帶相反電荷之主鏈締合而開始形成粒子。以此方式，圍繞核酸形成粒子，例如在一些態樣中，此使得囊封效率遠高於在核酸與至少一種脂質組分之間沒有相互作用的情況下所達成的囊封效率。
在某些態樣中，當核酸存在於脂質奈米粒子中時，其在水溶液中耐核酸酶降解。包含核酸之脂質奈米粒子及其製備方法揭示於例如美國專利公開案第2004/0142025號、第2007/0042031號及PCT公開案第WO 2013/016058號及第WO 2013/086373號中，該等文獻之全部揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
本文所描述之一些態樣係關於涉及多於一種，例如2、3、4、5、6或甚至更多種核酸物種(諸如RNA物種)的組合物、方法及用途。在LNP調配物中，有可能將各核酸物種分開調配為個別LNP調配物。在該情況下，各個別LNP調配物將包含一種核酸物種。個別LNP調配物可以單獨實體之形式存在，例如存在於單獨容器中。此類調配物可藉由分開提供各核酸物種(通常各自呈含核酸溶液之形式)以及允許形成LNP之適合陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料及陽離子聚合物來獲得。各別粒子將僅含有形成粒子時提供的特定核酸物種(個別顆粒調配物)。
在一些態樣中，諸如醫藥組合物之組合物包含多於一種個別LNP調配物。各別醫藥組合物被稱為混合LNP調配物。根據本發明之混合之LNP調配物可藉由個別地形成如上文所描述之個別LNP調配物，隨後進行將個別LNP調配物混合之步驟而獲得。藉由混合之步驟，可獲得包含含核酸LNP之混合群體的調配物。個別LNP群體可一起在一個容器中，其包含個別LNP調配物之混合群體。
或者，有可能的是，不同核酸物種調配在一起作為組合LNP調配物。此類調配物可藉由提供不同RNA物種之組合調配物(通常為組合溶液)以及允許形成LNP之適合陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料及陽離子聚合物來獲得。相較於混合LNP調配物，組合LNP調配物將通常包含有包含多於一種RNA物種之LNP。在組合LNP組合物中，不同RNA物種通常一起存在於單一粒子中。
1. 陽離子聚合物材料鑒於聚合物材料之高度化學可撓性，通常將聚合物材料用於基於奈米粒子之遞送。通常，使用陽離子材料使帶負電的核酸靜電凝聚成奈米粒子。此等帶正電基團通常由質子化狀態在5.5與7.5之間的pH範圍內變化的胺組成，認為該變化會引起離子不平衡，導致胞內體破裂。聚合物(諸如聚-L-離胺酸、聚醯胺基胺、魚精蛋白及聚伸乙亞胺)以及天然存在之聚合物(諸如幾丁糖)均已應用於核酸遞送且適用作適用於本文中之一些態樣中的陽離子材料。另外，一些研究者已合成特定用於核酸遞送之聚合物材料。特別地，聚(P-胺基酯)由於其易於合成及可生物降解性而廣泛用於核酸遞送中。在一些態樣中，此類合成材料可適用作本文中之陽離子材料。
如本文所用之「聚合物材料」具有其普通含義，例如包含藉由共價鍵連接之一或多個重複單元(單體)的分子結構。在一些態樣中，此類重複單元可均為一致的；或者，在一些情況下，聚合物材料內可存在超過一種 類型之重複單元。在一些情況下，聚合物材料係以生物方式衍生的，例如生物聚合物，諸如蛋白質。在一些情況下，聚合物材料中亦可存在額外部分，例如靶向部分，諸如本文所描述之彼等靶向部分。
熟習此項技術者應瞭解，當聚合物(或聚合物部分)內存在超過一種類型之重複單元時，則聚合物(或聚合物部分)稱為「共聚物」。在一些態樣中，根據本發明使用之聚合物(或聚合物部分)可為共聚物。形成共聚物之重複單元可以任何方式排列。舉例而言，在一些態樣中，重複單元可以隨機次序排列；或者或另外，在一些態樣中，重複單元可以交替次序排列，或排列為「嵌段」共聚物，其例如包含有一或多個各自包含第一重複單元(例如第一嵌段)之區域及一或多個各自包含第二重複單元(例如第二嵌段)之區域等。嵌段共聚物可具有兩種(二嵌段共聚物)、三種(三嵌段共聚物)或更多數目種不同嵌段。
在某些態樣中，根據本發明使用之聚合物材料係生物相容性的。生物相容性材料為在適中濃度下通常不導致顯著細胞死亡的材料。在某些態樣中，生物相容性材料為可生物降解的，例如能夠在生理環境內，諸如在身體內以化學及/或生物方式降解。在某些態樣中，聚合物材料可為或包含魚精蛋白或聚伸烷基亞胺，特定言之魚精蛋白。
熟習此項技術者應瞭解，術語「魚精蛋白」常用以指具有相對較低分子量、富含精胺酸且發現在各種動物(如魚)之精子細胞中尤其與DNA而非體細胞組蛋白締合的各種強鹼性蛋白質中之任一者。特別地，術語「魚精蛋白」常用以指存在於魚精子中的呈強鹼性、可溶於水、加熱不凝固且在水解時主要產生精胺酸的蛋白質。在純化形式中，其用於胰島素之長效調配物中且用以中和肝素之抗凝血作用。
在一些態樣中，如本文所用，術語「魚精蛋白」係指獲自或來源於天然或生物學來源之魚精蛋白胺基酸序列，包括其片段及/或該胺基酸序列或其片段之多聚形式，以及為人工的且專門設計用於特定目的且無法與原生或生物學來源分離之(合成)多肽。
在一些態樣中，聚伸烷基亞胺包含聚伸乙亞胺及/或聚伸丙亞胺。在一些態樣中，聚伸烷基亞胺為聚伸乙亞胺(PEI)。在一些態樣中，聚伸烷基亞胺為直鏈聚伸烷基亞胺，例如線性聚伸乙亞胺(PEI)。
考慮用於本文中之陽離子材料(例如聚合物材料，包括多陽離子聚合物)包括能夠靜電結合核酸的彼等陽離子材料。在一些態樣中，考慮用於本文中之陽離子聚合物材料包括例如藉由與核酸形成複合物或形成圍封或囊封核酸之囊泡而可與核酸締合之任何陽離子聚合物材料。
在一些態樣中，本文所描述之粒子可包含除陽離子聚合物以外之聚合物，例如非陽離子聚合物材料及/或陰離子聚合物材料。陰離子及中性聚合物材料在本文中統稱為非陽離子聚合物材料。
2. 脂質及脂質樣材料術語「脂質」及「脂質樣材料」在本文中用於指包含一或多種疏水性部分或基團以及視情況一或多種親水性部分或基團之分子。根據本發明，脂質及脂質樣材料可為陽離子、陰離子或中性的。在所選pH下，中性脂質或脂質樣材料以不帶電或中性兩性離子形式存在。
術語「脂質」係指特徵為不可溶於水中但可溶於許多有機溶劑中的一組有機化合物。通常，脂質可分為八類：脂肪酸及其衍生物(包括三酸甘油酯、二酸甘油酯、單酸甘油酯及磷脂)、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、醣脂、聚酮化合物、固醇脂質以及含固醇代謝物(諸如膽固醇)及異戊烯醇脂質。脂肪酸之實例包括但不限於脂肪酯及脂肪醯胺。甘油脂之實例包括但不限於糖基甘油(glycosylglycerol)及甘油磷脂(例如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸)。鞘脂之實例包括但不限於神經醯胺鞘磷脂(phosphosphingolipid) (例如鞘磷脂(sphingomyelin)、磷酸膽鹼)及醣神經鞘脂質(例如腦苷脂、神經節苷脂)。固醇脂質之實例包括但不限於膽固醇及其衍生物以及生育酚及其衍生物。
術語「脂質樣材料」、「脂質樣化合物」或「脂質樣分子」係指結構上及/或功能上與脂質有關但在嚴格意義上可能不視為脂質之物質。舉例而言，該術語包括在存在於水性環境中之囊泡、多層/單層脂質體或膜中時能夠形成兩親性層的化合物，且包括界面活性劑或具有親水性及疏水性部分兩者之合成化合物。一般而言，該術語係指包含具有不同結構組織之親水性及疏水性部分的分子，其可能與脂質類似或可能不類似。
在一些態樣中，RNA溶液及其脂質製劑混合物或組合物可包含陽離子脂質、中性脂質、膽固醇及/或聚合物(例如聚乙二醇)結合之脂質，其形成包圍RNA分子之脂質奈米粒子。因此，在一些態樣中，LNP可包含陽離子脂質及一或多種賦形劑，例如一或多種中性脂質、帶電脂質、類固醇或類固醇類似物(例如膽固醇)、聚合物結合之脂質(例如PEG-脂質)或其組合。在一些態樣中，LNP包涵或囊封核酸分子。
3. 陽離子脂質陽離子或陽離子可離子化脂質或脂質樣材料係指能夠帶正電且能夠靜電結合核酸之脂質或脂質樣材料。如本文所用，「陽離子脂質」或「陽離子脂質樣材料」係指具有淨正電荷之脂質或脂質樣材料。陽離子脂質或脂質樣材料藉由靜電相互作用結合帶負電之核酸。一般而言，陽離子脂質具有親脂性部分，諸如固醇、醯基鏈、二醯基或更多醯基鏈，且脂質之頭部基團通常攜帶正電荷。例示性陽離子脂質包括攜帶正電荷之一或多個胺基。陽離子脂質可囊封帶負電之RNA。
在一些態樣中，陽離子脂質為可離子化的，使得視pH而定，其可以帶正電或中性形式存在。陽離子脂質之離子化影響脂質奈米粒子在不同pH條件下之表面電荷。不希望受理論所束縛，認為此可離子化行為透過幫助胞內體逃逸以及相較於在生理pH下保持陽離子性之粒子降低毒性來增強功效。出於本發明之目的，除非與情形相矛盾，否則術語「陽離子脂質」或「陽離子脂質樣材料」包含此類「陽離子可離子化」脂質或脂質樣材料。
在一些態樣中，陽離子脂質可佔或佔粒子中存在之總脂質的約10 mol%至約100 mol%、約20 mol%至約100 mol%、約30 mol%至約100 mol%、約40 mol%至約100 mol%、或約50 mol%至約100 mol%。在一些態樣中，陽離子脂質可佔粒子中存在之總脂質的至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比：10 mol %、20 mol %、30 mol %、40 mol %、50 mol %、60 mol %、70 mol %、80 mol %、90 mol %或100 mol %，或其中可導出之任何範圍或值。
陽離子脂質之實例包括但不限於：((4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)；1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油醯氧基丙胺(DODMA)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、3-(N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、二甲基二(十八烷基)銨(DDAB)；1,2-二油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)；1,2-二醯氧基-3-二甲基銨丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基銨丙烷；氯化二(十八烷基)二甲基銨(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基銨氮(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、溴化1,2-二油醯氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基銨(DORIE)及2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-l-(順式,順式-9',12'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油醯氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞油醯基氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-KC2-DMA)、三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯(DLin-MC3 -DM A)、溴化N-(2-羥基乙基)-N,N-二甲基-2,3 -雙(十四烷氧基)-1-丙胺鎓(DMRIE)、溴化(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(順式-9-十四碳烯基氧基)-1-丙胺鎓(GAP-DMORIE)、溴化(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十二烷氧基)-1-丙胺鎓(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)-l-丙胺鎓溴化物(GAP-DMRIE)、N-(2-胺基乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)-1-丙胺鎓溴化物(bAE-DMRIE)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯基氧基)丙-1-胺鎓(DOBAQ)、2-({8-[(3b)-膽固醇-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕櫚醯基-3-二甲基銨-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[二(3-胺基-丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲醯胺(MVL5)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)、溴化2,3-雙(十二烷氧基)-N-(2-羥基乙基)-N,N-二甲基丙-1-銨(DLRIE)、溴化N-(2-胺基乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)丙-1-胺鎓(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-l-基) 8,8'-((((2(二甲基胺基)乙基)硫基)羰基)氮二基)二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-雙(十二烷氧基)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-雙(十四烷氧基)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-l-基)-9-((4-(二甲基胺基丁醯基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基胺甲醯基-乙基)-{2-[(2-十二烷基胺甲醯基-乙基)-2-{(2-十二烷基胺甲醯基-乙基)-[2-(2-十二烷基胺甲醯基-乙基胺基)-乙基]-胺基}-乙基胺基)丙醯胺(類脂質98N12-5)、1-[2-[雙(2-羥基十二烷基)胺基]乙基-[2-[4-[2-[雙(2 羥基十二烷基)胺基]乙基]哌𠯤-l-基]乙基]胺基]十二-2-醇(類脂質02-200)；或十七烷-9-基8-((2-羥基乙基) (6-側氧基-6-(十一烷基氧基)己基)胺基)辛酸酯(SM-102)。
在一些態樣中，脂質奈米粒子包含一或多種陽離子脂質。在一個態樣中，脂質奈米粒子包含4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) (ALC-0315)，其具有下式：
陽離子脂質揭示於例如U.S. 10,166,298中，其全部揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。代表性陽離子脂質包括：
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在一些態樣中，RNA-LNP包含陽離子脂質、如本文所描述之RNA分子及以下中之一或多者：中性脂質、類固醇、聚乙二醇化脂質或其組合。若將多於一種陽離子脂質併入LNP內，則此等百分比適用於經合併之陽離子脂質。在一個態樣中，陽離子脂質分別以諸如至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比之量存在於LNP中：約40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60莫耳百分比。
在本發明之一些態樣中，LNP包含上文所描述之任何脂質之組合或混合物。
4 . 聚合物結合之脂質在一些態樣中，LNP包含聚合物結合之脂質。術語「聚合物結合之脂質」係指包含脂質部分及聚合物部分兩者之分子。聚合物結合之脂質之實例為聚乙二醇化脂質。術語「聚乙二醇化脂質」係指包含脂質部分及聚乙二醇部分兩者之分子。聚乙二醇化脂質為此項技術中已知的，且包括1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-s-DMG)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺及其類似物。
在某些態樣中，LNP包含額外穩定化脂質，其為聚乙二醇-脂質(聚乙二醇化脂質)。聚合物結合之脂質(例如PEG-脂質)係指包含脂質部分及聚合物部分兩者之分子。聚合物結合之脂質之實例為PEG-脂質。PEG-脂質係指包含脂質部分及聚乙二醇部分兩者之分子。PEG-脂質包括但不限於經PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、經PEG修飾之磷脂酸、經PEG修飾之神經醯胺(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、經PEG修飾之二烷基胺、經PEG修飾之二醯基甘油、經PEG修飾之二烷基甘油。代表性聚乙二醇-脂質包括PEG-c-DOMG、PEG-c-DMA及PEG-s-DMG。在一個態樣中，聚乙二醇-脂質為N-[(甲氧基聚乙二醇)2000)胺甲醯基]-1,2-二肉豆蔻醯氧基丙-3-胺(PEG-c-DMA)。在一個態樣中，聚乙二醇-脂質為PEG-2000-DMG。在一個態樣中，聚乙二醇-脂質為PEG-c-DOMG)。在其他態樣中，LNP包含聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG) (諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG))、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二醯基甘油(PEG-S-DAG) (諸如4-O-(2',3'-二(十四碳醯氧基)丙基-1-O-((o-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer)、或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯(諸如共聚甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(u＞-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯)。PEG-脂質揭示於例如U.S. 9,737,619中，其全部揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，脂質奈米粒子包含聚合物結合之脂質。在一個態樣中，脂質奈米粒子包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺(ALC-0159)，其具有下式：
在各種態樣中，陽離子脂質與聚乙二醇化脂質之莫耳比在約100:1至約20:1之範圍內，例如約20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1，或其中可導出之任何範圍或值。
在某些態樣中，PEG-脂質以相對於奈米粒子之總脂質含量之約1至約10莫耳百分比(mol %) (例如至少、至多、恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mol %或其中任兩者之間的mol %)的量存在於LNP中。
5 . 額外脂質在某些態樣中，LNP包含一或多種額外脂質或脂質樣材料，其在粒子形成期間穩定粒子之形成。合適的穩定化或結構脂質包括非陽離子脂質，例如中性脂質及陰離子脂質。不受任何理論束縛，藉由添加其他疏水性部分，諸如膽固醇及除可離子化/陽離子脂質或脂質樣材料以外的脂質使LNP之調配最佳化可增強粒子穩定性及核酸遞送功效。
如本文所用，「陰離子脂質」係指在所選pH下帶負電的任何脂質。術語「中性脂質」係指在生理pH下以不帶電或中性兩性離子形式存在的多種脂質物種中之任一者。在一些態樣中，額外脂質包含以下中性脂質組分中之一者：(1)磷脂；(2)膽固醇或其衍生物；或(3)磷脂及膽固醇或其衍生物之混合物。
代表性中性脂質包括磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸、神經醯胺、鞘磷脂、二氫-鞘磷脂、腦磷脂及腦苷脂。例示性磷脂包括例如磷脂醯膽鹼，例如二醯基磷脂醯膽鹼，諸如二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二(十五烷醯基)磷脂醯膽鹼、二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二花生醯基磷脂醯膽鹼(DAPC)、二山崳醯基磷脂醯膽鹼(DBPC)、二(二十三烷醯基)磷脂醯膽鹼(DTPC)、二(二十四烷醯基)磷脂醯膽鹼(DLPC)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(18:0二醚PC)、l-油醯基-2-膽固醇半丁二醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)及1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)；及磷脂醯乙醇胺，例如二醯基-磷脂醯乙醇胺，諸如二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)及二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-l甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二月桂醯基-磷脂醯乙醇胺(DLPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二植烷醯基-磷脂醯乙醇胺(DpyPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯乙醇胺(SOPE)及1,2-二反油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一個態樣中，中性脂質為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3磷酸膽鹼(DSPC)，其具有下式：
在一些態樣中，LNP包含中性脂質，且中性脂質包含以下中之一或多者：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE或SM。
在各種態樣中，LNP進一步包含類固醇或類固醇類似物。「類固醇」為包含以下碳骨架之化合物： 。
在某些態樣中，類固醇或類固醇類似物為膽固醇。膽固醇衍生物之實例包括但不限於膽甾烷醇、膽甾烷酮、膽甾烯酮、糞甾醇、膽固醇基-2'-羥乙基醚、膽固醇基-4'-羥丁基醚、生育酚及其衍生物以及其混合物。在一個態樣中，膽固醇具有下式：
不受任何理論所束縛，與至少一種額外脂質之量相比，至少一種陽離子脂質之量可影響重要核酸粒子特徵，諸如核酸之電荷、粒徑、穩定性、組織選擇性及生物活性。因此，在一些態樣中，陽離子脂質與中性脂質之莫耳比在約2:1至約8:1之範圍內，或在約10:0至約1:9、約4:1至約1:2或約3:1至約1:1之範圍內。.
在一些態樣中，非陽離子脂質(例如中性脂質(例如一或多種磷脂及/或膽固醇))可佔粒子中存在之總脂質的約0 mol%至約90 mol%、在約0 mol%至約80 mol%、在約0 mol%至約70 mol%、在約0 mol%至約60 mol%、或在約0 mol%至約50 mol%。在一些態樣中，非陽離子脂質(例如中性脂質(例如一或多種磷脂及/或膽固醇))可佔粒子中存在之總脂質的至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比：0 mol %、10 mol %、20 mol %、30 mol %、40 mol %、50 mol %、60 mol %、70 mol %、80 mol %或90 mol %。
VI. RNA 分子之 表徵及分析本文所描述之RNA分子可使用各種方法分析及表徵。可在加帽之前或之後進行分析。替代地，可在基於poly-A捕捉之親和純化之前或之後進行分析。在另一態樣中，可在額外純化步驟，例如陰離子交換層析及其類似步驟之前或之後進行分析。舉例而言，可使用基於生物分析器晶片之電泳系統來測定RNA模板品質。在其他態樣中，分別使用分析型逆相HPLC來分析RNA模板純度。加帽效率可使用例如總核酸酶消化，隨後二核苷酸帽物種相對於未加帽GTP物種之MS/MS定量來分析。活體外功效可藉由例如將RNA分子轉染至人類細胞株中來分析。可使用諸如ELISA或流動式細胞量測術之方法來定量相關多肽之蛋白質表現。免疫原性可藉由例如將RNA分子轉染至指示先天性免疫刺激之細胞株(例如PBMC)中來分析。可使用例如諸如ELISA之方法來分析細胞介素誘導，從而定量細胞介素，例如干擾素-α。可例如藉由生物發光量測來分析生物分佈。
在一些態樣中，本文所揭示之RNA聚核苷酸之特徵在於，當在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑的生物體中評定時，相對於適當參考物觀測到：相關基因(例如抗原)之表現升高；相關基因(例如抗原)之表現持續時間增加(例如長期表現)；相關基因(例如抗原)之表現升高且表現持續時間增加(例如長期表現)；與RNA聚核苷酸之IFIT1的相互作用減少；RNA聚核苷酸之轉譯增加。
在一些態樣中，參考包含投與在其他方面類似但不具有m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeAi)pG2帽的RNA聚核苷酸。在一些態樣中，參考包含投與在其他方面類似但不具有本文所揭示之帽近端序列之RNA聚核苷酸的生物體。在一些態樣中，參考包含投與在其他方面類似但具有自雜交序列之RNA聚核苷酸的生物體。
在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫學製劑之後至少24小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時或至少120小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後至少24小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後至少48小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後至少72小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後至少96小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後至少120小時測定升高之表現。
在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後約24-120小時測定升高之表現。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後約24-110小時、約24-100小時、約24-90小時、約24-80小時、約24-70小時、約24-60小時、約24-50小時、約24-40小時、約24-30小時、約30-120小時、約40-120小時、約50-120小時、約60-120小時、約70-120小時、約80-120小時、約90-120小時、約100-120小時、或約110-120小時測定升高之表現。
在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少2倍至至少10倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少2倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少3倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少4倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少6倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少8倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少10倍。
在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高約2倍至約50倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高約2倍至約45倍、約2倍至約40倍、約2倍至約30倍、約2倍至約25倍、約2倍至約20倍、約2倍至約15倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約5倍、約5倍至約50倍、約10倍至約50倍、約15倍至約50倍、約20倍至約50倍、約25倍至約50倍、約30倍至約50倍、約40倍至約50倍,或約45倍至約50倍。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之表現升高至少、至多、恰好以下倍數或以下中之任兩者之間的倍數：2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍或50倍，或其中可導出之任何範圍或值。
在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後，相關基因(例如抗原)之升高之表現(例如增加之表現持續時間)持續至少、至多、恰好以下時間或以下中之任兩者之間的時間：24小時、48小時、72小時、96小時、或120小時。在一些態樣中，在投與之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少24小時。在一些態樣中，在投與之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少48小時。在一些態樣中，在投與之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少72小時。在一些態樣中，在投與之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少96小時。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少120小時。
在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後相關基因(例如抗原)之升高之表現持續約24-120小時。在一些態樣中，在投與包含RNA聚核苷酸之組合物或醫藥製劑之後升高之表現持續約24-110小時、約24-100小時、約24-90小時、約24-80小時、約24-70小時、約24-60小時、約24-50小時、約24-40小時、約24-30小時、約30-120小時、約40-120小時、約50-120小時、約60-120小時、約70-120小時、約80-120小時、約90-120小時、約100-120小時、或約110-120小時。在一些態樣中，相關基因(例如抗原)之升高之表現持續至少、至多、恰好以下時間或以下中之任兩者之間的時間：24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時、108小時、或120小時，或其中可導出之任何範圍或值。
VII. 免疫反應及分析如本文所論述，本發明係關於誘發或誘導個體中針對RSV蛋白(例如野生型或變異RSV F蛋白)及流行性感冒蛋白(例如HA及/或NA)之免疫反應。在一個態樣中，免疫反應可保護或治療患有、疑似患有感染或相關疾病、尤其與RSV及流行性感冒相關之彼等疾病或處於出現該等疾病之風險中的個體。本發明之免疫原組合物的一種用途為藉由對個體進行接種或疫苗接種來預防RSV感染及流行性感冒感染。
1. 免疫分析本發明包括實施血清學分析以評估免疫反應是否係由本發明之組合物誘導或誘發以及誘導或誘發至何種程度。存在許多類型的可實施之免疫分析。本發明涵蓋之免疫分析包括但不限於美國專利4,367,110 (雙重單株抗體夾心分析法)及美國專利4,452,901 (西方墨點法(western blot))中所描述之彼等免疫分析。其他分析法包括活體外及活體內的經標記配位體之免疫沉澱及免疫細胞化學。
免疫分析一般為結合分析。在一些態樣中，免疫分析為此項技術中已知之各種類型之酶聯免疫吸附分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)。使用組織切片進行之免疫組織化學偵測亦為尤其適用的。在一個實例中，抗體或抗原固定在所選擇表面上，諸如聚苯乙烯微量滴定盤中之孔、試紙或管柱載體上。接著，將懷疑含有所需抗原或抗體之測試組合物(諸如臨床樣品)添加至該等孔。在結合及洗滌以移除非特異性結合之免疫複合物之後，可偵測結合之抗原或抗體。偵測一般藉由添加連接至可偵測標記之對所需抗原或抗體具有特異性的另一種抗體來達成。此類型ELISA被稱為「夾心ELISA」。偵測亦可藉由添加對所需抗原具有特異性之第二抗體，隨後添加對於第二抗體具有結合親和力之第三抗體來達成，其中第三抗體連接至可偵測標記。
競爭ELISA亦為其中測試樣品與已知量之經標記抗原或抗體競爭結合的可能實施方案。未知樣品中反應性物種之量係藉由在與經塗佈之孔一起培育之前或期間將樣品與已知標記物種混合來測定。樣品中反應性物種之存在用以減少可用於結合至孔之標記物種的量，且因此減少最終信號。無論採用何種形式，ELISA均具有某些共同特徵，諸如塗佈、培育或結合、洗滌移除非特異性結合之物種，及偵測經結合之免疫複合物。
抗原或抗體亦可連接至固體載體，諸如呈培養盤、珠粒、試紙、膜或管柱基質形式，且待分析之樣品施加至固定抗原或抗體。在用抗原或抗體塗佈培養盤時，一般將該培養盤之孔與抗原或抗體之溶液一起培育隔夜或指定時間。接著洗滌該培養盤之孔以移除未完全吸附之材料。接著，該等孔之任何殘留可用表面用對測試抗血清呈抗原中性之非特異性蛋白質「塗佈」。此等蛋白質包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白及奶粉溶液。該塗佈允許阻斷固定表面上之非特異性吸附位點且因此減小由該表面上抗血清之非特異性結合引起的背景。
2 . RSV 感染之診斷本發明考慮RSV多肽、蛋白質及/或肽以多種方式之用途，包括偵測RSV之存在以診斷感染。根據本發明，偵測感染之存在的方法涉及獲得疑似感染一或多種RSV病毒株之樣品，諸如獲自個體，例如獲自個體之血液、唾液、組織、骨、肌肉、軟骨或皮膚之樣品的步驟。在分離樣品之後，可利用本發明之多肽、蛋白質及/或肽進行診斷分析以偵測RSV之存在，且用於確定樣品中之此類存在的此類分析技術為熟習此項技術者所熟知，且包括諸如放射免疫分析、西方墨點分析及ELISA分析之方法。
一般而言，根據本發明，考慮一種診斷感染之方法，其中向疑似感染RSV之樣品添加根據本發明之多肽、蛋白質或肽，且RSV係藉由與多肽、蛋白質及/或肽結合的抗體指示，或藉由與樣品中之抗體結合的多肽、蛋白質及/或肽指示。
因此，根據本發明之編碼RSV多肽、蛋白質及/或肽之RNA分子可用於治療、預防由RSV感染(例如主動免疫或被動免疫)引起之疾病或降低疾病嚴重程度或用作研究工具。
上述多肽、蛋白質及/或肽中之任一者可直接用可偵測標記進行標記以用於鑑別及定量RSV。適用於免疫分析之標記一般為熟習此項技術者已知的，且包括酶、放射性同位素、及螢光、發光及發色物質，包括有色粒子，諸如膠體金或乳膠珠粒。適合的免疫分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)。
3. 保護性免疫性在本發明之一些態樣中，編碼RSV F蛋白及/或來源於流行性感冒、例如HA及/或NA之抗原之RNA分子、RNA-LNP及其組合物為個體帶來保護性免疫性。保護性免疫性係指身體建立特異性免疫反應之能力，其保護個體免於出現涉及免疫反應所針對之因子的特定疾病或病狀。免疫原有效量能夠賦予個體保護性免疫性。
如本文所用，片語「免疫反應(immune response)」或其同等片語「免疫反應(immunological response)」係指產生針對抗原之體液反應(抗體介導)、細胞反應(由抗原特異性T細胞或其分泌產物介導)或體液及細胞反應。此類反應可為主動反應或被動反應。細胞免疫反應係藉由多肽抗原決定基與I類或II類MHC分子締合呈現以活化抗原特異性CD4 (+) T輔助細胞及/或CD8 (+)細胞毒性T細胞來引發。反應亦可涉及單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、嗜鹼細胞、樹突狀細胞、星狀細胞、小神經膠質細胞、嗜伊紅細胞或先天性免疫之其他組分的活化。如本文所用，「主動免疫性」係指回應於抗原，例如由本發明之RNA分子編碼之RSV F蛋白，及/或由本發明之RNA分子編碼的來源於流行性感冒、例如HA及/或NA之抗原之存在而產生抗體為個體帶來的任何免疫性。
如本文所用，「被動免疫性」包括但不限於投與包括免疫反應之細胞介體或蛋白質介體(例如單株及/或多株抗體)的活化免疫效應子。單株或多株抗體組合物可用於被動免疫接種以治療、預防由攜有抗體所識別之抗原之生物體感染引起之疾病或降低疾病之嚴重程度。抗體組合物可包括結合於多種抗原之抗體，該等抗原可繼而與各種生物體締合。抗體組分可為多株抗血清。在某些態樣中，一或多種抗體係自已用抗原攻擊之動物或第二個體親和純化得到。或者，可使用抗體混合物，其為針對相同、相關或不同微生物或生物體(諸如病毒，包括但不限於RSV及/或流行性感冒)中存在之抗原的單株抗體及/或多株抗體之混合物。
可藉由向患者投與獲自具有已知免疫反應性之供體或其他非患者來源的免疫球蛋白(Ig)及/或其他免疫因子而向患者或個體賦予被動免疫性。在其他態樣中，可向個體投與本發明之免疫原組合物，該個體隨後充當回應於免疫原組合物之攻擊而產生的球蛋白(「超免疫球蛋白」)之來源或供體，該免疫原組合物含有針對RSV及流行性感冒及/或其他生物體之抗體。由此治療之個體將供給血漿，接著經由習知血漿分離方法獲得超免疫球蛋白，且向另一名個體投與以賦予針對RSV感染及流行性感冒感染之抗性或治療RSV感染及流行性感冒感染。
出於本說明書及隨附申請專利範圍之目的，術語「抗原決定基」及「抗原決定子」可互換地用於指B及/或T細胞回應或識別之抗原上之位點。B細胞抗原決定基可由藉由蛋白質之三級摺疊而並置的相連胺基酸或非相連胺基酸形成。由相連胺基酸形成的抗原決定基在暴露於變性溶劑後典型地保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基在變性溶劑處理後典型地消失。抗原決定基在獨特空間構形中通常包括至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。測定抗原決定基之空間構形的方法包括例如x射線晶體學及2維核磁共振。參見例如Epitope Mapping Protocols (1996)。識別相同抗原決定基之抗體可在顯示一種抗體阻斷另一抗體與目標抗原之結合的能力的簡單免疫分析中鑑別。T細胞識別CD8細胞之約九個胺基酸之連續抗原決定基或CD4細胞之約13-15個胺基酸之連續抗原決定基。識別抗原決定基之T細胞可藉由活體外分析、藉由抗原依賴性殺死(細胞毒性T淋巴球分析，Tigges等人, 1996)或藉由細胞介素分泌來鑑別，該等活體外分析量測抗原依賴性增殖，其係藉由回應於抗原決定基之致敏T細胞引起之 3H-胸苷併入所測定(Burke等人, 1994)。
細胞介導之免疫反應的存在可藉由增殖分析(CD4 (+) T細胞)或CTL (細胞毒性T淋巴球)分析法來測定。體液及細胞反應對免疫原組合物之保護或治療作用之相對貢獻可藉由分別自經免疫接種之同基因型動物分離IgG及T細胞且量測第二個體中之保護或治療作用來區分。
如本文所用，術語「抗體」或「免疫球蛋白」可互換使用且係指充當動物或接受者之免疫反應之一部分的若干類別之結構上相關之蛋白質中之任一者，該等蛋白質包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM及相關蛋白質。在正常生理條件下，在血漿及其他體液中以及某些細胞之膜中發現抗體，且由表示為B細胞或其功能同等物之類型的淋巴球產生。
如本文所用，術語「免疫原劑」或「免疫原」或「抗原」可互換使用以描述在單獨、與佐劑結合或呈現於展示媒劑上向接受者投與時能夠誘導針對其自身之免疫反應的分子。
VIII. 組合物在一些態樣中，本文所揭示之RNA分子及/或RNA-LNP可呈醫藥組合物或藥物投與，且可呈任何適合之醫藥組合物形式投與。在一些態樣中，醫藥組合物係用於治療性或預防性治療。在一個態樣中，本發明係關於一種用於向宿主投與之組合物。在一些態樣中，宿主為人類。在其他態樣中，宿主為非人類。
在一些態樣中，本文所揭示之RNA分子及/或RNA-LNP可呈醫藥組合物投與，該醫藥組合物可調配成固體、半固體、液體、凍乾、冷凍或氣體形式之製劑。在一些態樣中，本文所揭示之RNA分子及/或RNA-LNP可呈醫藥組合物投與，該醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑且可視情況包含一或多種佐劑、穩定劑、鹽、緩衝劑、防腐劑及視情況存在之其他治療劑。在一些態樣中，本文揭示之醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。在一些態樣中，醫藥組合物不包括佐劑(其不含佐劑)。
適用於本發明之醫藥組合物的防腐劑包括但不限於苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯及硫柳汞。如本文所用，術語「賦形劑」係指本發明之醫藥組合物中可存在但不為活性成分之物質。賦形劑之實例包括但不限於載劑、黏合劑、稀釋劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、調味劑或著色劑。
術語「稀釋劑」係指稀釋及/或稀化劑。此外，術語「稀釋劑」包括流體、液體或固體懸浮液及/或混合介質中之任一或多者。適合稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。
術語「載劑」係指可為天然、合成、有機、無機之組分，活性組分組合在該組分中以便有助於、增強或實現醫藥組合物之投與。如本文所用之載劑可為一或多種適合向個體投與的相容固體或液體填充劑、稀釋劑或囊封物質。合適載劑包括但不限於無菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、林格氏乳酸鹽、無菌氯化鈉溶液、等張鹽水、聚伸烷二醇、氫化萘，以及尤其生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一些態樣中，本發明之醫藥組合物包括氯化鈉。
用於治療用途之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑為醫藥技術中所熟知的，且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro編1985)中。
可關於預期投與途徑及標準醫藥實踐來選擇醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑。
在一些態樣中，組合物包含有包含編碼免疫原多肽之開放閱讀框架的RNA分子。在一些態樣中，免疫原多肽包含RSV抗原及流行性感冒抗原。在一些態樣中，RSV抗原為RSV F蛋白且流行性感冒抗原為HA及/或NA。
在一些態樣中，組合物包含有包含編碼全長RSV F蛋白之開放閱讀框架的RNA分子。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為截短RSV F蛋白。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為RSV F蛋白之變異體。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為RSV F蛋白之片段。
在一些態樣中，組合物包含有包含編碼全長流行性感冒HA蛋白之開放閱讀框架的RNA分子。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為截短流行性感冒HA蛋白。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為流行性感冒HA蛋白之變異體。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為流行性感冒HA蛋白之片段。
在一些態樣中，組合物包含有包含編碼全長流行性感冒NA蛋白之開放閱讀框架的RNA分子。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為截短流行性感冒NA蛋白。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為流行性感冒NA蛋白之變異體。在一些態樣中，所編碼之免疫原多肽為流行性感冒NA蛋白之片段。
在一些態樣中，組合物包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP。在較佳實施例中，RSV次單元包含野生型RSV F蛋白之突變體且針對野生型RSV F蛋白或針對包含野生型F蛋白之病毒具有免疫原性，如上文所解釋。
在一個態樣中，本發明係關於一種製品，其包含小瓶，該小瓶具有(a)第一腔室，其包含有包含RNA聚核苷酸之第一組合物；(b)第二腔室，其包含有包含多肽之凍乾組合物；及(c)隔片，其將第一腔室與第二腔室分開且氣體介質不可滲透；及(d)致動構件，其藉由打破隔片有效地使第一組合物及第二組合物接觸。
在一個態樣中，本發明係關於一種製品，其包含小瓶，該小瓶具有(a)第一腔室，其實質上填充有水性懸浮液，該水性懸浮液包含(i)水性介質；(ii)治療有效量的懸浮於介質中的固體顆粒形式之藥物；(b)第二腔室；(c)隔片，其將第一腔室與第二腔室分開且氣體介質不可滲透；及(d)致動構件，其藉由打破隔片有效地使水性懸浮液及氣體介質接觸以使得氣體介質充當用於攪動調配物之有效頂部空間。在一些實施例中，小瓶在第一腔室中包含多肽抗原或其片段且在第二腔室中包含囊封RNA之LNP組合物。在一些實施例中，凍乾多肽抗原或其片段。在一些實施例中，多肽抗原或其片段為RSVpreF。在一些實施例中，多肽抗原或其片段為凍乾RSVpreF抗原。在一些實施例中，小瓶包含如美國專利7,387,623中所描述之雙室小瓶，該專利以全文引用之方式併入本文中。
如本文所描述之混合小瓶用於商業用途，例如Pharmacia Corporation之名為Act-O-Vial®的包裝系統。此類小瓶可與下部隔室中之藥物之凍乾粉末調配物及上部隔室中之水性稀釋劑一起使用。在一些實施例中，混合小瓶在上部隔室中具有水性懸浮液調配物且在下部隔室中僅具有氣體介質，通常為空氣，其中下部隔室可充當空氣或其他氣體介質之儲集器以提供在小瓶致動之後進行有效攪拌之頂部空間，但在致動之前藉助於不與上部隔室接觸而最大程度地減少或防止調配物之容易氧化降解的成分暴露於氧氣。
在一些實施例中，小瓶具有包含有包含多肽之凍乾粉末調配物的下部隔室及包含囊封mRNA之LNP之上部隔室。在一些實施例中，小瓶具有包含有包含多肽之凍乾粉末調配物的上部隔室及包含囊封mRNA之LNP之下部隔室。在一些實施例中，包含囊封mRNA之LNP的隔室(無論下部或上部)包括最小量之氣體介質或空氣。
在一些實施例中，本文所揭示之製品包含Act-O-Vial®或實質上類似之混合小瓶，該小瓶在其上部隔室中含有調配物，該調配物包含(a)水性介質；且在其下部隔室中含有包含多肽之凍乾組合物，在水性介質中分散治療有效量之該凍乾組合物。在一些實施例中，本文所揭示之製品包含Act-O-Vial®或實質上類似之混合小瓶，該小瓶在其上部隔室中含有調配物，該調配物包含(a)包含多肽之凍乾組合物；且在其下部隔室中含有水性介質，在水性介質中分散治療有效量之該凍乾組合物。在一些實施例中，凍乾組合物包含RSVpreF。在一些實施例中，水性介質包含RNA聚核苷酸。在一些實施例中，水性介質包含囊封mRNA之LNP。
熟習此項技術者將顯而易見，可對上文剛剛描述之製品進行許多修改，不使物品超出本發明之範疇。舉例而言，致動構件可包含實質上剛性構件代替用於將液壓施加至上部隔室之內含物的構件，當向下力施加至帽組件或其部分時，力直接傳輸至隔板或將上部隔室與下部隔室隔開的塞。
可取代之其他雙室裝置包括例如在個別列出之專利中描述之彼等裝置：美國專利第3,464,414號；頒與Larkin之美國專利第4,614,267號；頒與Conn等人之美國專利第4,871,354號；頒與Haber等人之美國專利第5,335,773號；頒與Kriesel及Thompson之美國專利第5,336,180號；頒與Ikeda等人之美國專利第5,350,372號；頒與Kriesel及Thompson之美國專利第5,385,546號。除Pharmacia Corporation之Act-O-Vial®系統外，用於商業用途的將凍乾粉末與稀釋劑混合的雙室系統包括Abbott Laboratories之名為Univial™及ADD-Vantage™及SmithKline Beecham之名為Piggyback™出售的系統。
本發明之物品在調配物中包含實質上填充小瓶之第一腔室的治療有效量之藥物。通常，藥物為低水溶性中之藥物，例如具有小於約10 mg/ml之溶解度，例示性地小於約1 mg/ml或甚至小於約0.1 mg/ml。
本發明之組合物可藉由包含以下之方法製備：將顆粒形式之藥物之懸浮液調配於包含一或多種潤濕劑及/或懸浮劑之水性介質中的第一步驟，其中的至少一者容易氧化降解(本文中所定義)。可使用使得組合物之成分以產生展現受控絮凝之水性懸浮液的方式結合在一起的任何適合調配方法。此類方法為此項技術中所熟知。抗氧化劑可視情況在調配步驟中之任何適合點添加。
儘管通常不必在小瓶之第二腔室中使用缺氧氛圍，但必要時，可以多種方式提供缺氧氣體介質。尤其適宜的方式為在插入隔板或塞之前，在諸如氮氣或稀有氣體(例如氬氣或氦氣)之非反應氣體層下製備小瓶。缺氧氣體介質較佳基本上由重量比不小於約10:1、更佳不小於約20:1且再更佳不小於約40:1之氮氣及氧氣組成。諸如二氧化碳、水蒸氣及稀有氣體之其他氣體可例如以其在環境空氣中存在之濃度存在於此類介質中。氣體介質可基本上由氮氣組成。
1. 包括 LNP 之 免疫原組合物在一些態樣中，醫藥組合物包含用基於脂質之遞送系統調配的本文所揭示之RNA分子(例如聚核苷酸)。因此，一些態樣中，組合物包括基於脂質之遞送系統(例如LNP) (例如基於脂質之疫苗)，其將核酸分子遞送至細胞內部，接著其可複製，抑制相關蛋白質表現及/或表現所編碼之相關多肽。遞送系統可具有增強所編碼抗原之免疫原性的佐劑作用。在一些態樣中，組合物包含至少一種編碼RSV多肽之RNA分子，該至少一種RNA分子與一或多種脂質複合、囊封於其中及/或與其一起調配，且形成脂質奈米粒子(LNP)、脂質體、脂質複合物及/或奈米脂質體。在一些態樣中，組合物包含脂質奈米粒子。因此，在某些態樣中，本發明係關於包含一或多種與核酸或多肽/肽締合之脂質的組合物(例如RSV RNA-LNP)。在一些態樣中，組合物包含至少一種編碼流行性感冒多肽之RNA分子，該至少一種RNA分子與一或多種脂質複合、囊封於其中及/或與其一起調配，且形成脂質奈米粒子(LNP)、脂質體、脂質複合物及/或奈米脂質體。在一些態樣中，組合物包含脂質奈米粒子。因此，在某些態樣中，本發明係關於包含一或多種與核酸或多肽/肽相關之脂質締合的組合物(例如流行性感冒HA及/或NA RNA-LNP)。
在一些情況下，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物可進一步包括一或多種鹽及/或一或多種醫藥學上可接受之界面活性劑、防腐劑、載劑、稀釋劑及/或賦形劑。在一些態樣中，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物進一步包括醫藥學上可接受之媒劑。在一些態樣中，緩衝劑、穩定劑及視情況存在之鹽中之各者可包括在包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物中。在其他態樣中，緩衝劑、穩定劑、鹽、界面活性劑、防腐劑及賦形劑中之任一或多者可不包括在包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物中。
在另一態樣中，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物進一步包含穩定劑。在一些態樣中，穩定劑包含蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、棉子糖、海藻糖、甘露糖醇、肌醇、氯化鈉、精胺酸、乳糖、羥乙基澱粉、聚葡萄糖、聚乙烯吡咯啶酮、甘胺酸或其組合。在一些態樣中，穩定劑為雙醣或糖。在一個態樣中，穩定劑為蔗糖。在另一態樣中，穩定劑為海藻糖。在另一態樣中，穩定劑為蔗糖與海藻糖之組合。在一些態樣中，組合物中穩定劑之總濃度為約5%至約10% w/v。例如，穩定劑之總濃度可等於至少、至多、恰好以下百分比或以下中之任兩者之間的百分比：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20% w/v或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，穩定劑濃度包括但不限於約10 mg/mL至約400 mg/mL、約100 mg/mL至約200 mg/mL、約100 mg/mL至約150mg/mL、約100 mg/mL至約140 mg/mL、約100 mg/mL至約130 mg/mL、約100 mg/mL至約120 mg/mL、約100 mg/mL至約110 mg/mL或約100 mg/mL至約105 mg/mL之濃度。在一些態樣中，穩定劑之濃度等於至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、101 mg/mL、102 mg/mL、103 mg/mL、104 mg/mL、105 mg/mL、106 mg/mL、107 mg/mL、108 mg/mL、109 mg/mL、110 mg/mL、150 mg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL或更多。
在另一態樣中，穩定劑之質量的量與RNA之質量的量呈特定比率。在一個態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過5000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過2000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過1000。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過500。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過100。在另一態樣中，穩定劑與藥物之質量的量的比率不超過50。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過10。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過1。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過0.5。在另一態樣中，穩定劑與RNA之質量的量的比率不超過0.1。在另一態樣中，穩定劑及RNA包含約200-2000:1之質量比的穩定劑:RNA。
在一些態樣中，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物進一步包含緩衝劑。緩衝劑之實例包括但不限於檸檬酸鹽緩衝溶液、乙酸鹽緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、氯化銨、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡糖酸鈣、d-葡萄糖酸、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、乳糖酸鈣、丙酸、乙醯丙酸鈣、戊酸、磷酸氫鈣、磷酸、磷酸鈣、磷酸氫氧化鈣、乙酸鉀、氯化鉀、葡糖酸鉀、鉀混合物、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀混合物、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、檸檬酸鈉、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉混合物、緩血酸胺、胺基磺酸鹽緩衝液(例如HEPES)、氫氧化鎂、氫氧化鋁、海藻酸、無熱原水、等張鹽水、林格氏溶液、乙醇及/或其組合。在一些態樣中，緩衝劑為HEPES緩衝液、Tris緩衝液或PBS緩衝液。因此，在一些實施例中，組合物進一步包括佐劑，例如含鋁化合物，諸如本文所列出之佐劑中之任一者，包括氫氧化鋁及AlPO 4。在一個態樣中，緩衝劑為Tris緩衝液。在另一態樣中，緩衝劑為HEPES緩衝液。在另一態樣中，緩衝劑為PBS緩衝液。舉例而言，緩衝液濃度可等於至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17 mM、18 mM、19 mM、或20 mM，或其中可導出之任何範圍或值。緩衝液可呈中性pH、pH 6.5至8.5、pH 7.0至pH 8.0、或pH 7.2至pH 7.6。例如，緩衝液可為至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或其中可導出之任何範圍或值。在特定態樣中，緩衝液為pH 7.4。
在一些態樣中，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物進一步包含鹽。鹽之實例包括但不限於鈉鹽及/或鉀鹽。在一個態樣中，鹽為鈉鹽。在一特定態樣中，鈉鹽為氯化鈉。在一個態樣中，鹽為鉀鹽。在一些態樣中，鉀鹽包含氯化鉀。組合物中鹽之濃度可為約70 mM至約140 mM。例如，鹽濃度可等於至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、120 mM、130 mM、140 mM、150 mM、160 mM、170 mM、180 mM、190 mM或200 mM。
在一些態樣中，鹽濃度包括但不限於約1 mg/mL至約100 mg/mL、約1 mg/mL至約50 mg/mL、約1 mg/mL至約40 mg/mL、約1 mg/mL至約30 mg/mL、約1 mg/mL至約20 mg/mL、約1 mg/mL至約10 mg/mL或約1 mg/mL至約15 mg/mL之濃度。在一些態樣中，鹽之濃度等於至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL、16 mg/mL、17 mg/mL、18 mg/mL、19 mg/mL、20 mg/mL或更多。鹽可為中性pH、pH 6.5至8.5、pH 7.0至pH 8.0或pH 7.2至pH 7.6。舉例而言，鹽可為等於至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的pH：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。
在一些態樣中，包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物進一步包含界面活性劑、防腐劑、任何其他賦形劑或其組合。如本文所用，「任何其他賦形劑」包括但不限於抗氧化劑、麩胱甘肽、EDTA、甲硫胺酸、甲磺酸去鐵胺(desferal)、抗氧化劑、金屬清除劑或自由基清除劑。在一個態樣中，界面活性劑、防腐劑、賦形劑或其組合為注射用無菌水(sWFI)、注射用抑菌水(BWFI)、鹽水、右旋糖溶液、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、Triton、二價陽離子、林格氏乳酸鹽、胺基酸、糖、多元醇、聚合物或環糊精。
賦形劑之實例(係指免疫原組合物中不為活性成分之成分)包括但不限於載劑、黏合劑、稀釋劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、緩衝劑、調味劑、崩解劑、包衣、塑化劑、壓縮劑、濕式造粒劑或著色劑。用於本文所揭示之組合物中的防腐劑包括但不限於苯紮氯銨、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯及硫柳汞。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有水性溶劑(例如水、醇/水溶液、鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏右旋糖等)、非水性溶劑(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯)、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體及營養補充劑，諸如一般技術者將已知之材料及其組合。稀釋劑或者稀釋或稀化劑包括但不限於乙醇、甘油、水、糖(諸如乳糖、蔗糖、甘露糖醇及山梨糖醇)及來源於小麥、玉米水稻及馬鈴薯之澱粉；及纖維素，諸如微晶纖維素。組合物中稀釋劑之量按總組合物之重量計可在約10%至約90%、約25%至約75%、約30%至約60%或約12%至約60%之範圍內。
包括基於脂質之遞送系統的免疫原組合物中各種組分之pH值及確切濃度係根據熟知參數來進行調整。此類介質及試劑用於醫藥學活性物質之用途在此項技術中熟知。除非任何習知介質或試劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在免疫原、預防性及/或治療性組合物中之用途。
在一個態樣中，醫藥組合物包含編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA分子，其與一或多種脂質複合、囊封於其中及/或與其一起調配以形成RSV RNA-LNP。在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物為液體。在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物為冷凍的。在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物為凍乾的。在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸分子，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為陽離子脂質、聚乙二醇化脂質(亦即PEG-脂質)及一或多種結構脂質(例如中性脂質)。
在一個態樣中，醫藥組合物包含編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA分子，其與一或多種脂質複合、囊封於其中及/或與其一起調配以形成流行性感冒RNA-LNP。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為液體。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為冷凍的。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾的。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸分子，其囊封於LNP中具有，該等LNP之脂質組成為陽離子脂質、聚乙二醇化脂質(亦即PEG-脂質)及一或多種結構脂質(例如中性脂質)。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物包含陽離子脂質。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物包含陽離子脂質。陽離子脂質可包含本文所揭示之任一或多種陽離子脂質。在特定態樣中，陽離子脂質包含((4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) (ALC-0315)。在一些態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：每毫升0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2 ng/µg/mg。在一些態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1 mg/mL。在一些態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以至少0.4、至少0.45、至少0.5、至少0.55、至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95或至少1 mg/mL之濃度包括在組合物中。在一些態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.4與0.5之間、0.5與0.6之間、0.6與0.7之間、0.7與0.8之間、0.8與0.9之間或0.9與1之間的濃度包括在組合物中。在一些態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.4與0.45 mg/mL之間、0.45與0.5 mg/mL之間、0.5與0.55 mg/mL之間、0.55與0.6 mg/mL之間、0.6與0.65 mg/mL之間、0.65與0.7 mg/mL之間、0.7與0.75 mg/mL之間、0.75與0.8 mg/mL之間、0.8與0.85 mg/mL之間、0.85與0.9 mg/mL之間、0.9與0.95 mg/mL之間或0.95與1 mg/mL之間的濃度包括在組合物中。
在特定態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.8至0.95 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.8至0.9 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.85至0.9 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，陽離子脂質(例如ALC-0315)以0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94或0.95 mg/mL之濃度包括在組合物中。凍乾組合物之濃度係在復原後測定。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物進一步包含聚乙二醇化脂質(亦即PEG-脂質)。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含聚乙二醇化脂質(亦即PEG-脂質)。聚乙二醇化脂質可包含本文所揭示之任一或多種聚乙二醇化脂質。在特定態樣中，聚乙二醇化脂質包含2-[(聚乙二醇)-2000]- N, N-二(十四烷基)乙醯胺(ALC-0159)。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：每毫升0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2 ng/µg/mg。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5 mg/mL。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.25 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.35 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.45 mg/mL或至少0.5 mg/mL之濃度包括在組合物中。在一些態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以0.01與0.05 mg/mL之間、0.05與0.1 mg/mL之間、0.1與0.15 mg/mL之間、0.15與0.2 mg/mL之間或0.2與0.25 mg/mL之間的濃度包括在組合物中。
在特定態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以0.05至0.15 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以0.10至0.15 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，聚乙二醇化脂質(例如ALC-0159)以0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15 mg/mL之濃度包括在組合物中。凍乾組合物之濃度係在復原後測定。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物進一步包含一或多種結構脂質。在一些態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含一或多種結構脂質。一或多種結構脂質可包含本文所揭示之任一或多種結構脂質。在特定態樣中，一或多種結構脂質包含中性脂質及類固醇或類固醇類似物。在特定態樣中，一或多種結構脂質包含1,2-二硬脂醯基- sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)及膽固醇。在一些態樣中，一或多種結構脂質(例如DSPC及膽固醇)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：每毫升0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2 ng/µg/mg。在一些態樣中，一或多種結構脂質(例如DSPC及膽固醇)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5 mg/mL。在一些態樣中，一或多種結構脂質(例如DSPC及膽固醇)以至少0.05、至少0.1、至少0.15、至少0.2、至少0.25、至少0.3、至少0.35、至少0.4、至少0.45、至少0.5、至少0.55、至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95或至少1 mg/mL之濃度包括在組合物中。在一些態樣中，一或多種結構脂質(例如DSPC及膽固醇)以0.05與0.1 mg/mL之間、0.1與0.15 mg/mL之間、0.15與0.2 mg/mL之間、0.2與0.25 mg/mL之間、0.25與0.3 mg/mL之間、0.3與0.35 mg/mL之間、0.35與0.4 mg/mL之間、0.4與0.45 mg/mL之間、0.45與0.5 mg/mL之間、0.5與0.55 mg/mL之間、0.55與0.6 mg/mL之間、0.6與0.65 mg/mL之間、0.65與0.7 mg/mL之間、0.7與0.75 mg/mL之間、0.75與0.8 mg/mL之間、0.8與0.85 mg/mL之間、0.85與0.9 mg/mL之間、0.9與0.95 mg/mL之間或0.95與1 mg/mL之間的濃度包括在組合物中。
在特定態樣中，一或多種結構脂質包括DSPC，且DSPC以0.1至0.25 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，一或多種結構脂質包括DSPC，且DSPC以0.15至0.25 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，一或多種結構脂質包括DSPC，且DSPC以0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25 mg/mL之濃度包括在組合物中。
在特定態樣中，一或多種結構脂質包括膽固醇，且膽固醇以0.3至0.45 mg/mL之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，一或多種結構脂質包括膽固醇，且膽固醇以0.3至0.4之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，一或多種結構脂質包括膽固醇，且膽固醇以0.35至0.45之濃度包括在組合物中。在特定態樣中，一或多種結構脂質包括膽固醇，且膽固醇以0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44或0.45 mg/mL之濃度包括在組合物中。凍乾組合物之濃度係在復原後測定。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含一或多種緩衝劑及穩定劑及視情況選用之鹽。因此，在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物包含陽離子脂質、聚乙二醇化脂質、一或多種結構脂質、一或多種緩衝劑、穩定劑及視情況選用之鹽。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含一或多種緩衝劑及穩定劑及視情況選用之鹽。因此，在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含陽離子脂質、聚乙二醇化脂質、一或多種結構脂質、一或多種緩衝劑、穩定劑及視情況選用之鹽。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物包含一或多種緩衝劑。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含一或多種緩衝劑。一或多種緩衝劑可包含本文所揭示之任一或多種緩衝劑。在特定態樣中，組合物包含Tris緩衝液，其包含至少第一緩衝液及第二緩衝液。在一些態樣中，第一緩衝液為緩血酸胺。在一些態樣中，第二緩衝液為Tris鹽酸(HCl)。在一些態樣中，Tris緩衝液之第一緩衝液及第二緩衝液(例如緩血酸胺及Tris HCl)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：每毫升0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.9、1.91、1.92、1.93、1.94、1.95、1.96、1.97、1.98、1.99或2 ng/µg/mg。凍乾組合物之濃度係在復原後測定。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為包含Tris緩衝液之液體組合物。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含Tris緩衝液。在一些態樣中，Tris緩衝液包含第一緩衝液。在一些態樣中，第一緩衝液為緩血酸胺。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在液體組合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5 mg/mL。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以至少0.1 mg/mL、至少0.05 mg/mL、至少0.1 mg/mL、至少0.15 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.25 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.35 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.45 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少0.55 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.65 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.75 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.85 mg/mL、至少0.9 mg/mL、至少0.95 mg/mL或至少1 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以0.05與0.15之間、0.15與0.25之間、0.25與0.35之間、0.35與0.45之間、0.45與0.55之間、0.55與0.65之間、0.65與0.75之間、0.75與0.85之間或0.85與0.95之間的濃度包括在液體組合物中。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以0.05與0.1 mg/mL之間、0.1與0.15 mg/mL之間、0.15與0.2 mg/mL之間、0.2與0.25 mg/mL之間、0.25與0.3 mg/mL之間、0.3與0.35 mg/mL之間、0.35與0.4 mg/mL之間、0.4與0.45 mg/mL之間、0.45與0.5 mg/mL之間、0.5與0.55 mg/mL之間、0.55與0.6 mg/mL之間、0.6與0.65 mg/mL之間、0.65與0.7 mg/mL之間、0.7與0.75 mg/mL之間、0.75與0.8 mg/mL之間、0.8與0.85 mg/mL之間、0.85與0.9 mg/mL之間、0.9與0.95 mg/mL之間或0.95與1 mg/mL之間的濃度包括在液體組合物中。
在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以0.1至0.3 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以0.15至0.25 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.3 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為包含有包含第二緩衝液之Tris緩衝液之液體組合物。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含Tris緩衝液及第二緩衝液。在一些態樣中，第二緩衝液包含Tris HCl。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在液體組合物中：0.5、0.55、1、1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.11、1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19、1.2、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.3、1.31、1.32、1.33、1.34、1.35、1.36、1.37、1.38、1.39、1.4、1.41、1.42、1.43、1.44、1.45、1.46、1.47、1.48、1.49或1.5 mg/mL。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以至少0.5 mg/mL、至少0.55 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.65 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.75 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.85 mg/mL、至少0.9 mg/mL、至少0.95 mg/mL、至少1 mg/mL、至少1.05 mg/mL、至少1.10 mg/mL、至少1.15 mg/mL、至少1.20 mg/mL、至少1.25 mg/mL、至少1.30 mg/mL、至少1.35 mg/mL、至少1.40 mg/mL、至少1.45 mg/mL、或至少1.50 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以0.5與0.6之間、0.6與0.7之間、0.7與0.8之間、0.8與0.9之間、0.9與1之間、1與1.10之間、1.10與1.20之間、1.20與1.30之間、1.30與1.40之間或1.40與1.50 mg/mL之間的濃度包括在液體組合物中。
在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以1.25至1.40 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以1.30至1.40 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30、1.31、1.32、1.33、1.34或1.35、1.36、1.37、1.38、1.39或1.40 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為包含Tris緩衝液之凍乾組合物。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含Tris緩衝液。在一些態樣中，Tris緩衝液包含第一緩衝液。在一些態樣中，第一緩衝液為緩血酸胺。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在凍乾組合物中：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5 mg/mL。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後至少0.01 mg/mL、至少0.05 mg/mL、至少0.1 mg/mL、至少0.15 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.25 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.35 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.45 mg/mL或至少0.5 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在一些態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺(Tris鹼))以復原之後0.01與0.05 mg/mL之間、0.05與0.1 mg/mL之間、0.1與0.15 mg/mL之間、0.15與0.2 mg/mL之間、0.2與0.25 mg/mL之間、0.25與0.3 mg/mL之間、0.3與0.35 mg/mL之間、0.35與0.4 mg/mL之間、0.4與0.45 mg/mL之間或0.45與0.5 mg/mL之間的濃度包括在凍乾組合物中。
在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後0.01至0.15 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後0.01至0.10 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後0.05至0.15 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第一緩衝液(例如緩血酸胺)以復原之後0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14或0.15 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為包含有包含第二緩衝液之Tris緩衝液之凍乾組合物。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含Tris緩衝液及第二緩衝液。在一些態樣中，第二緩衝液包含Tris HCl。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在凍乾組合物中：0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1 mg/mL。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後至少0.1 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.9 mg/mL或至少1 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在一些態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後0.1與0.2 mg/mL之間、0.2與0.3 mg/mL之間、0.3與0.4 mg/mL之間、0.4與0.5 mg/mL之間、0.5與0.6 mg/mL之間、0.6與0.7 mg/mL之間、0.7與0.8 mg/mL之間、0.8與0.9 mg/mL之間或0.9與1 mg/mL之間的濃度包括在凍乾組合物中。
在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後0.5至0.65 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後0.5至0.6 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後0.55至0.65 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，第二緩衝液(例如Tris HCl)以復原之後0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64或0.65 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物包含一或多種穩定劑。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物包含穩定劑。穩定劑可包含本文所揭示之任一或多種穩定劑。在一些態樣中，穩定劑亦充當低溫保護劑。在特定態樣中，穩定劑包含蔗糖。在一些態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在組合物中：每毫升1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200 ng/µg/mg。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為液體組合物。在一些態樣中，RSV次單元組合物及流行性感冒RNA-LNP組合物為液體組合物。在此類液體組合物中，穩定劑(例如蔗糖)以至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在液體組合物中：70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130 mg/mL。在一些態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以至少70 mg/mL、至少75 mg/mL、至少80 mg/mL、至少85 mg/mL、至少90 mg/mL、至少95 mg/mL、至少100 mg/mL、至少105 mg/mL、至少110 mg/mL、至少115 mg/mL、至少120 mg/mL、至少125 mg/mL、或至少130 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在一些態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以70與80 mg/mL之間、80與90 mg/mL之間、90與100 mg/mL之間、100與110 mg/mL之間、110與120 mg/mL之間、或120與130 mg/mL之間的濃度包括在液體組合物中。
在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以95至110 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以95至105 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以100至110 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110 mg/mL之濃度包括在液體組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾組合物。在一些態樣中，RSV次單元組合物及流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾組合物。在此類組合物中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後至少以下、至多以下、以下中之任兩者或恰好以下之濃度包括在凍乾組合物中：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80 mg/mL。在一些態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後至少20 mg/mL、至少25 mg/mL、至少30 mg/mL、至少35 mg/mL、至少40 mg/mL、至少45 mg/mL、至少50 mg/mL、至少55 mg/mL、至少60 mg/mL、至少65 mg/mL、至少70 mg/mL、至少75 mg/mL或至少80 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在一些態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後20至30 mg/mL之間、30至40 mg/mL之間、40至50 mg/mL之間、50至60 mg/mL之間、60至70 mg/mL之間或70至80 mg/mL之間的濃度包括在凍乾組合物中。
在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後35至50 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後35至45 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後40至50 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，穩定劑(例如蔗糖)以復原之後35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。
在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾組合物，且凍乾RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含鹽。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物為凍乾組合物，且凍乾組合物進一步包含鹽。鹽可包含本文所揭示之任一或多種鹽。在特定態樣中，鹽包含氯化鈉(NaCl)。在一些態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在凍乾組合物中：每毫升0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5或50 ng/µg/mg。在一些態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下之濃度包括在凍乾組合物中：1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5或20 mg/mL。在一些態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後至少1 mg/mL、至少2 mg/mL、至少3 mg/mL、至少4 mg/mL、至少5 mg/mL、至少6 mg/mL、至少7 mg/mL、至少8 mg/mL、至少9 mg/mL、至少10 mg/mL、至少11 mg/mL、至少12 mg/mL、至少13 mg/mL、至少14 mg/mL、至少15 mg/mL或至少20 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。
在特定態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後5與15 mg/mL之間的濃度包括在凍乾組合物中。在一些態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後5與10 mg/mL之間的濃度包括在凍乾組合物中。在特定態樣中，鹽(例如NaCl)以復原之後5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 mg/mL之濃度包括在凍乾組合物中。
在一些態樣中，凍乾組合物在合適載劑及/或稀釋劑中復原。載劑或稀釋劑可包含本文所揭示之任一或多種載劑或稀釋劑。在特定態樣中，載劑或稀釋劑包含鹽水，例如生理食鹽水。鹽水可包含用於注射之0.9%鹽水。在一些態樣中，凍乾組合物在至少以下數量、至多以下數量、以下中之任兩者之間的數量或恰好以下數量之鹽水中復原：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1 mL。在一些態樣中，凍乾組合物在至少0.1 mL、至少0.2 mL、至少0.3 mL、至少0.4 mL、至少0.5 mL、至少0.6 mL、至少0.7 mL、至少0.8 mL、至少0.9 mL或至少1 mL之鹽水中復原。
在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之鹽水中復原。在特定態樣中，凍乾組合物在0.65至0.75 mL之鹽水中復原。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7、0.71、0.72、0.73、0.74或0.75 mL之鹽水中復原。
RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物之pH值可為至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物在至少6.5、至少7.0、至少7.5、至少8.0或至少8.5之pH下。在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物在6.0與7.5之間、6.5與7.5之間、7.0與8.0、與7.5與8.5之間的pH下。在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物在7.0與8.0之間。在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物在pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下。
包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物之pH值可為至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間：pH 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5，或其中可導出之任何範圍或值。在一些態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物在至少6.5、至少7.0、至少7.5、至少8.0或至少8.5之pH下。在特定態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物在6.0與7.5之間、6.5與7.5之間、7.0與8.0之間、與7.5與8.5之間的pH下。在特定態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物在7.0與8.0之間。在特定態樣中，包含RSV次單元及流行性感冒RNA-LNP之組合物在pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇.
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為液體RSV RNA-LNP組合物，且液體RSV RNA-LNP組合物進一步包含緩衝液組合物，該緩衝液組合物包含0.15至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110 mg/mL之濃度的穩定劑。在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為液體RSV RNA-LNP組合物，且液體RSV RNA-LNP組合物進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
因此，在特定態樣中，液體RSV RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質、0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110  mg/mL之濃度的穩定劑。
因此，在特定態樣中，液體RSV RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC、0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為凍乾RSV RNA-LNP組合物，且凍乾RSV RNA-LNP組合物進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為凍乾RSV RNA-LNP組合物，且凍乾RSV RNA-LNP組合物進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的氯化鈉(NaCl)。
因此，在特定態樣中，凍乾RSV RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質、0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之載劑或稀釋劑中復原。
因此，在一些態樣中，凍乾RSV RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC、0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的NaCl。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之鹽水中復原。
凍乾RSV RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
RSV RNA-LNP組合物進一步包含囊封於LNP中的本文所描述之RSV RNA，參見章節D.投與。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為液體RSV RNA-LNP組合物，該液體RSV RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含緩衝液組合物，該緩衝液組合物包含0.15至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110 mg/mL之濃度的穩定劑。
在特定態樣中，液體RSV RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
在特定態樣中，RSV RNA-LNP組合物為凍乾RSV RNA-LNP組合物，該凍乾RSV RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之載劑或稀釋劑中復原。凍乾RSV RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
在特定態樣中，凍乾RSV RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之RSV多肽的RSV RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的NaCl。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之鹽水中復原。凍乾RSV RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物包含編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為液體流行性感冒RNA-LNP組合物，且液體流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含緩衝液組合物，該緩衝液組合物包含0.15至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110 mg/mL之濃度的穩定劑。在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為液體流行性感冒RNA-LNP組合物，且液體流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
因此，在特定態樣中，液體流行性感冒RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質、0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110  mg/mL之濃度的穩定劑。
因此，在特定態樣中，液體流行性感冒RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC、0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物，且凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物，且凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的氯化鈉(NaCl)。
因此，在特定態樣中，凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質、0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之載劑或稀釋劑中復原。
因此，在一些態樣中，凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物包含0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC、0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的NaCl。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之鹽水中復原。
凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
流行性感冒RNA-LNP組合物進一步包含囊封於LNP中的本文所描述之流行性感冒RNA，參見章節D.投與。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為液體流行性感冒RNA-LNP組合物，該液體流行性感冒RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含緩衝液組合物，該緩衝液組合物包含0.15至0.3 mg/mL之濃度的第一緩衝液、1.25至1.4 mg/mL之濃度的第二緩衝液及95至110 mg/mL之濃度的穩定劑。 在特定態樣中，液體流行性感冒RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含Tris緩衝液組合物，該Tris緩衝液組合物包含0.1至0.3 mg/mL之濃度的緩血酸胺、1.25至1.4 mg/mL之濃度的Tris HCl及95至110 mg/mL之濃度的蔗糖。
在特定態樣中，流行性感冒RNA-LNP組合物為凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物，該凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的陽離子脂質、0.05至0.15 mg/mL之濃度的聚乙二醇化脂質、0.1至0.25 mg/mL之濃度的第一結構脂質及0.3至0.45 mg/mL之濃度的第二結構脂質，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的第一緩衝液、0.5至0.65 mg/mL之濃度的第二緩衝液、35至50 mg/mL之濃度的穩定劑及5至15 mg/mL之濃度的鹽。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之載劑或稀釋劑中復原。凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
在特定態樣中，凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物包含至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的濃度的編碼如本文所揭示之流行性感冒多肽的流行性感冒RNA聚核苷酸：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL，其囊封於LNP中，該等LNP之脂質組成為0.8至0.95 mg/mL之濃度的ALC-0315、0.05至0.15 mg/mL之濃度的ALC-0159、0.1至0.25 mg/mL之濃度的DSPC及0.3至0.45 mg/mL之濃度的膽固醇，且進一步包含0.01至0.15 mg/mL之濃度的緩血酸胺、0.5至0.65 mg/mL之濃度的Tris HCl、35至50 mg/mL之濃度的蔗糖及5至15 mg/mL之濃度的NaCl。在特定態樣中，凍乾組合物在0.6至0.75 mL之鹽水中復原。凍乾流行性感冒RNA-LNP組合物中之濃度係在復原後測定。
凍乾醫藥組合物及/或本文所揭示之藉由凍乾方法製得之組合物的一些實施例包含低水分含量。可藉由此項技術中已知之方法(諸如氣相層析法)量測水分含量。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於6.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於5.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於4.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於3.5% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於3.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於2.5% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於1.0% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量小於或等於0.5% w/w。在一些實施例中，組合物之水分含量介於0.01%與6.0% w/w之間、0.01%與5.0% w/w之間、0.01%與4.0% w/w之間、0.01%與3.0% w/w之間、0.01%與2.0% w/w之間或0.01%與1.0% w/w之間。在一些實施例中，組合物之水分含量介於0.01% w/w與2.0% w/w之間。在一些實施例中，組合物之水分含量介於0.01% w/w與1.0% w/w之間。在一些實施例中，組合物之水分含量介於0.01% w/w與0.5% w/w之間。在一些實施例中，水分含量係指在儲存1或更多(例如3、6、9、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120或更多)個月之後凍乾組合物中之水分的量。
在一些實施例中，復原後脂質奈米粒子之直徑(或組合物之平均液體粒子直徑)為120 nm或更小，諸如80 nm或更小、70 nm或更小、60 nm或更小、50 nm或更小、40 nm或更小、30 nm或更小或20 nm或更小。在一些實施例中，復原後脂質奈米粒子之直徑(或組合物之平均液體粒子直徑)至多為30 nm。在一些實施例中，脂質奈米粒子之直徑為5-120 nm、5-80 nm、5-70 nm、5-60 nm、5-50 nm、5-40 nm、5-30 nm或5-20 nm。在一些實施例中，凍乾使脂質奈米粒子尺寸(或平均液體粒子直徑) (例如藉由DLS測定)增加約30 nm或更小，諸如約25 nm或更小、約20 nm或更小、約15 nm或更小、約10 nm或更小或約5 nm或更小。在一些實施例中，凍乾未可量測地增加脂質奈米粒子尺寸(平均液體粒子直徑)。
在一些實施例中，凍乾組合物中之mRNA在5℃下之降解係數為至多0.05個月-1、至多0.04個月-1、至多0.03個月-1、至多0.02個月-1、或至多0.01個月-1。在一些實施例中，降解係數為至多0.02個月-1。在一些實施例中，降解係數為至多0.01個月-1。在一些實施例中，降解係數在0.0001與0.05個月-1之間、0.0001與0.04個月-1之間、0.0001與0.03個月-1之間、0.001與0.02個月-1之間或0.001與0.01個月-1之間。在一些實施例中，降解係數在0.0001與0.02個月-1之間。在一些實施例中，降解係數在0.001與0.01個月-1之間。
在一些實施例中，在儲存至少12個月、至少18個月、至少21個月、至少24個月、至少27個月、至少30個月、至少33個月或至少36個月之後凍乾組合物中之mRNA為至少50%純。在一些實施例中，在約2℃與約8℃之間的溫度下儲存12至120個月、12至108個月、12至96個月、12至84個月、12至72個月、12至60個月、12至54個月、12至48個月、12至42個月、12至36個月、12至30個月、12至24個月或12至18個月之後凍乾組合物中之mRNA為至少50%純。
在一些實施例中，在約4℃之溫度下進行儲存。在一些實施例中，在約5℃下進行儲存。在一些實施例中，在儲存至少24個月之後凍乾組合物中之mRNA為至少50%純。在一些實施例中，在約2℃與約8℃之間的溫度下儲存24至120個月、24至108個月、24至96個月、24至84個月、24至72個月、24至60個月、24至54個月、24至48個月、24至42個月、24至36個月或24至30個月之後凍乾組合物中之mRNA為至少50%純。在一些實施例中，在約4℃之溫度下進行儲存。在一些實施例中，在約2℃與約8℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，在約4℃之溫度下進行儲存。在一些實施例中，在約5℃下進行儲存。在一些實施例中，在儲存3-12個月之後凍乾組合物之水分含量保持低於6.0% (w/w)、5.0%、4.0%、3.0%、2.0%、1.5%、1.0%或0.5%。舉例而言，在一些實施例中，在2-8℃下儲存12個月之後組合物之水分含量小於或等於6.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於5.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於4.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於3.5% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於3.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.5% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於1.5% w/w。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於1.0%。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於0.5%。在一些實施例中，在2-8℃下儲存3個月或更多個月、4個月或更多個月、5個月或更多個月、6個月或更多個月、9個月或更多個月或12個月或更多個月之後凍乾組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，在給定溫度及/或相對濕度下儲存3-12個月之後凍乾組合物之水分含量保持低於6.0% w/w。舉例而言，在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於6.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於5.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於4.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於3.5% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於3.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.5% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於1.5% w/w。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於1.0%。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3-12個月之後組合物之水分含量小於或等於0.5%。在一些實施例中，在20-30℃下儲存3個月或更多個月、4個月或更多個月、5個月或更多個月、6個月或更多個月、9個月或更多個月或12個月或更多個月之後凍乾組合物之水分含量小於或等於2.0% w/w。
在一些實施例中，在50-100%、60-100%、70-100%、75%-100%、80-100%、90-100%或95-100%相對濕度下進行儲存。
在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在儲存6個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在儲存9個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在儲存12個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在儲存24個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在儲存36個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。
在一些實施例中，在10-20℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，在20-30℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，在40-50℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，在50-60℃之間的溫度下進行儲存。在一些實施例中，儲存3-120個月、3-96個月、3-72個月、3-60個月、3-48個月、3-36個月、3-24個月、3-12個月、12-120個月、12-96個月、12-72個月、12-60個月、12-48個月、12-36個月、12-24個月、24-120個月、24-96個月、24-72個月或24-48個月。在一些實施例中，在50-100%、60-100%、70-100%、75%-100%、80-100%、90-100%或95-100%相對濕度下進行儲存。
在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在超過30℃ (例如約40℃至約50℃)儲存3、6、9、12、18、24、36、48、60或更多個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間儲存1個月之後凍乾組合物包含具有至少96%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間2個月儲存之後凍乾組合物包含具有至少93%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間儲存3個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間儲存4個月之後凍乾組合物包含具有至少85%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間儲存5個月之後凍乾組合物包含具有至少85%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在30-60℃之間儲存6個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在超過50% (例如50-100%、50-75%、50-80%、80-100%或60-75%)之相對濕度下儲存6個月之後，凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存3個月之後凍乾組合物包含具有至少93%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存6個月之後凍乾組合物包含具有至少87%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存9個月之後凍乾組合物包含具有至少85%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存12個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存24個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存36個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存48個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在70-100%之間的相對濕度下儲存60個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在2-8℃之間儲存3、6、9、12、18、24、36、48、60或更多個月之後凍乾組合物包含具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存12個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存24個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存36個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存48個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存60個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在2-8℃之間儲存72、96、108、120或更多個月之後凍乾組合物包含具有至少90%相對純度之mRNA。在一些實施例中，與凍乾剛剛結束後之mRNA純度相比，在20-30℃之間儲存3、6、9、12、18、24、36、48、60或更多個月之後凍乾組合物包含具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存12個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存24個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存36個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存48個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存60個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。在一些實施例中，在20-30℃之間儲存72、96、108、120或更多個月之後凍乾組合物包含具有至少80%相對純度之mRNA。
在一些實施例中，凍乾組合物之脂質奈米粒子包含有包含mRNA之脂質奈米粒子，囊封效率為70%。如本文所用，「囊封效率」係指包含於脂質奈米粒子內之組合物中的核酸(例如mRNA)百分比。囊封於脂質奈米粒子內之mRNA未暴露於脂質奈米粒子外部之環境，且因此避免諸如核酸酶之可使游離mRNA裂解的環境因素之作用。囊封效率可藉由此項技術中已知之多種方法中之任一者量測，諸如RiboGreen分析。RiboGreen為僅在結合於核酸時為發出螢光的螢光染料。在RiboGreen分析中，含有脂質奈米粒子中之mRNA之組合物的一種樣品經歷破壞脂質奈米粒子完整性之處理以釋放囊封之mRNA (諸如暴露於清潔劑)，而另一樣品未破壞。接著將RiboGreen添加至兩個樣品，且量測自兩個樣品發射之螢光。囊封效率(E.E.)藉由已知方程式計算。在一些實施例中，囊封效率為至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或高達100%。在一些實施例中，在剛剛凍乾之後及/或在凍乾後進行儲存之後，RNA囊封降低約10%或更少，諸如約9%或更少、約8%或更少、約7%或更少、約6%或更少、約5%或更少、約4%或更少、約3%或更少、約2%或更少或約1%或更少。
在一些實施例中，囊封之RNA之量在凍乾及/或儲存凍乾LNP期間實質上不減少。在一些實施例中，相對於在凍乾之前存在於組合物中之mRNA的活體外效力，凍乾組合物包含具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、高達100%或超過100%活體外效力之mRNA。如本文所用，mRNA之「活體外效力」係指在活體外轉譯反應期間mRNA被轉譯成由mRNA編碼之蛋白質的能力。在活體外轉譯中，編碼蛋白質之mRNA在核糖體及胺基醯基-tRNA存在下培育，此允許在不存在細胞之情況下產生所編碼之蛋白質。計算第一mRNA相對於編碼相同蛋白質之第二mRNA的活體外效力可藉由已知方法計算。
一些實施例包含例如在適合於醫藥投與之復原緩衝液中復原凍乾脂質奈米粒子組合物。在一些實施例中，凍乾脂質奈米粒子組合物在水中復原。在一些實施例中，凍乾脂質奈米粒子組合物在鹽(例如氯化鈉溶液)，諸如約0.5%、約0.9%、約1%、約1.5%、約2%、約5%、約10%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%鹽溶液中復原。
在一些實施例中，復原緩衝液在生理pH (例如pH 7-7.5，諸如7.4)下。
一些實施例包含復原之脂質奈米粒子組合物。在一些實施例中，凍乾組合物在約1℃至約75℃，諸如約4℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃或約75℃之溫度下復原(例如經由攪動、旋轉、震盪及/或重複移液管抽吸及分配)。
2 . 疫苗在一些態樣中，本文所描述之醫藥組合物為用於誘導免疫反應之免疫原組合物。舉例而言，在一些態樣中，免疫原組合物為疫苗。在一些態樣中，本文所描述之組合物包括至少一種如本文所描述之經分離核酸或多肽分子。在特定態樣中，免疫原組合物包含核酸，且免疫原組合物為核酸疫苗。在一些態樣中，免疫原組合物包含RNA (例如mRNA、saRNA)，且疫苗為RNA疫苗。在其他態樣中，免疫原組合物包含DNA，且疫苗為DNA疫苗。在其他態樣中，免疫原組合物包含多肽，且疫苗為多肽疫苗。可用核酸及/或肽或多肽組合物治療之病狀及/或疾病包括(但不限於)由感染、癌症、罕見疾病及由蛋白質或核酸之過度產生、產生不足或不當產生引起之其他疾病或病狀引起及/或影響的彼等病狀及/或疾病。
在一些態樣中，組合物實質上不含一或多種雜質或污染物，且例如包括等於至少、至多、恰好以下百分比純或以下中之任兩者之間的百分比純的核酸或多肽分子：90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%純；至少98%純或至少99%純。
本發明包括用於預防、治療或改善個體之感染、疾病或病狀的方法，其包括向個體投與有效量之包括至少一個編碼本文所描述之多肽或組合物之開放閱讀框架的RNA分子。因此，本發明涵蓋用於主動及被動免疫接種態樣之疫苗。所提出的適用作疫苗之免疫原組合物可由編碼多肽、諸如RSV糖蛋白及/或來源於流行性感冒、例如HA及/或NA之多肽的RNA分子製備。在某些態樣中，免疫原組合物經凍乾以便更容易調配至所需媒劑中。
含有核酸及/或肽或多肽作為活性成分之疫苗的製備一般在此項技術中為充分瞭解的，如美國專利4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792及4,578,770所例示，皆以全文引用之方式併入本文中。通常，此類疫苗係以呈液體溶液或懸浮液之可注射劑形式製備；亦可製備適合於在注射之前在液體中形成溶液或在液體中形成懸浮液的固體形式。製劑亦可乳化。活性免疫原成分通常與醫藥學上可接受的且與活性成分相容的賦形劑混合。適合之賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇或類似者及其組合。另外，必要時，疫苗可含有大量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或增強疫苗之有效性的佐劑。在特定態樣中，疫苗用物質組合調配，如美國專利6,793,923及6,733,754中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。
疫苗可習知地藉由例如皮下或肌肉內注射以非經腸方式投與。適合於其他投與模式之額外調配物包括栓劑及在一些情況下口服調配物。對於栓劑而言，傳統黏合劑及載劑可包括例如聚烷二醇或三酸甘油酯；此類栓劑可由含有約0.5%至約10%範圍內之活性成分的混合物形成。在一些態樣中，栓劑可由含有在約1%至約2%範圍內之活性成分的混合物形成。口服調配物包括常用賦形劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂及其類似物。此等組合物採用溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑之形式，且含有約10%至約95%之活性成分。
可將編碼多肽之核酸構築體以及多肽調配成呈中性或鹽形式之疫苗。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽(用肽之游離胺基形成)以及用無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及其類似酸)形成的彼等鹽。
通常，疫苗以與劑量調配物相容之方式且以諸如將為治療有效及具有免疫原性的量投與。待投與之數量取決於待治療之個體，包括個體免疫系統合成抗體之能力及所需防護等級。需要投與之活性成分的精確量視從業者之判斷而定。然而，適合的劑量範圍為每次疫苗接種大約數百微克活性成分。適合於初次投與及加強注射的方案亦為可變的，但通常進行初次投與，接著進行後續接種或其他投與。
施加方式可廣泛變化。可應用用於投與疫苗之習知方法中之任一種。咸信此等方法包括在生理學上可接受之固體基質內經口施加或在生理學上可接受之分散液中藉由注射或其類似方式而非經腸施加。疫苗之劑量將視投與途徑而定且將根據個體之體型及健康狀況而變化。
在某些態樣中，將需要投與一次疫苗。在一些態樣中，將需要多次投與疫苗，例如投與2、3、4、5、6或更多次。疫苗接種可間隔1、2、3、4、5、6、7、8週至5、6、7、8、9、10、11、12週，包括其間所有範圍。在一些態樣中，疫苗接種可間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月，包括其間所有範圍。可能需要以1-5年之間隔週期性加強來維持抗體之保護水平。
3 . 載劑醫藥學上可接受之載劑可包括組合物之液體或非液體基底。若組合物以液體形式提供，則載劑可為水，諸如無熱原水；等張鹽水或緩衝(水)溶液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝溶液。可使用水或含有鈉鹽、鈣鹽及/或鉀鹽之緩衝液，諸如水性緩衝液。鈉鹽、鈣鹽及/或鉀鹽可以其鹵化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)之形式存在，以其氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽等形式存在。鈉鹽之實例包括但不限於NaCl、NaI、NaBr、Na 2CO 3、NaHCO 3、Na 2SO 4、Na 2HPO 4、Na 2HPO 4·2H 2O，鉀鹽之實例包括但不限於KCl、KI、KBr、K 2CO 3、KHCO 3、K 2SO 4、KH 2PO 4，且鈣鹽之實例包括但不限於CaCl 2、CaI 2、CaBr 2、CaCO 3、CaSO 4、Ca(OH) 2。其他載劑之實例可包括糖，諸如乳糖、葡萄糖、海藻糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；右旋糖；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；牛脂；固體助滑劑，諸如硬脂酸、硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，諸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油及來自可可之油；多元醇，諸如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇及聚乙二醇；海藻酸。其他載劑之實例可包括膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素及月桂基硫酸鈉。額外適合之醫藥載劑及稀釋劑以及其使用之醫藥需求描述於Remington's Pharmaceutical Sciences中。
4 . 佐劑在一些實施例中，組合物進一步包括佐劑。適合佐劑包括所有可接受之免疫刺激化合物，諸如細胞介素、毒素或合成組合物。多種佐劑可用於增強抗體反應。佐劑包括但不限於水包油乳液、油包水乳液、礦物鹽、聚核苷酸及天然物質。可使用之特定佐劑包括弗氏佐劑(Freund's adjuvant)、油(諸如MONTANIDE® ISA51)、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、α-干擾素、PTNGg、GM-CSF、GMCSP、BCG、LT-a、鋁鹽(諸如氫氧化鋁或其他鋁化合物)、MDP化合物(諸如thur-MDP與nor-MDP)、CGP (MTP-PE)、脂質A、單磷醯基脂質A (MPL)、脂肽(例如Pam3Cys)。RIBI，含有2%角鯊烯/Tween 80乳液中自細菌提取之三種組分，MPL、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)。甚至可使用MHC抗原。在一些實施例中，組合物進一步包括以下佐劑中之任一者：細胞介素誘導劑或苯并㖠啶化合物、CpG序列及3dMPL (亦稱為3去-O-醯化單磷醯基脂質A或3-O-去醯基-4'-單磷醯基脂質A)。
達成疫苗佐劑作用之各種方法分別包括：使用諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)之試劑，其常以於磷酸鹽緩衝鹽水中之約0.05%至約0.1%溶液之形式使用；與以約0.25%溶液形式使用之合成糖聚合物(CARBOPOL®)混合；藉由在約70℃至約101℃之間的溫度下熱處理30秒至2分鐘時期而使疫苗中之蛋白質聚集。亦可採用以下步驟來產生佐劑效應：藉由用針對白蛋白的經胃蛋白酶處理之(Fab)抗體再活化來發生聚集；與細菌細胞(例如微小隱孢子蟲(C. parvum))、內毒素或革蘭氏陰性細菌之脂多醣組分混合；在生理學上可接受之油媒劑(諸如二縮甘露醇單油酸酯(Aracel A))中乳化；或使用用作阻斷替代物之全氟化碳(FLUOSOL-DA®)之20%溶液乳化。
除佐劑之外，可能需要共投與生物反應調節劑(BRM)以增強免疫反應。BRM已顯示上調T細胞免疫性或下調抑制細胞活性。此類BRM包括但不限於西咪替丁(Cimetidine) (CIM；1200 mg/d) (Smith/Kline, PA)；或低劑量環磷醯胺(CYP；300 mg/m 2) (Johnson/Mead, NJ)及細胞介素，諸如γ-干擾素、IL-2、或IL-12、或編碼免疫輔助功能中涉及之蛋白質的基因，諸如B-7。
5 . 組合療法 本發明之組合物及相關方法，尤其投與編碼RSV多肽及/或來源於流行性感冒(例如HA及/或NA)之多肽的RNA分子亦可與傳統療法之投與組合使用。此等包括但不限於抗病毒療法之投與，諸如阿昔洛韋(acyclovir)、發昔洛韋(valacyclovir)及泛昔洛韋(famciclovir)，或抗病毒劑之各種組合。亦包括投與一或多種用以治療RSV感染及/或流行性感冒感染之一或多個症狀的療法，包括但不限於類固醇(包括皮質類固醇)、抗炎劑(包括乙醯胺苯酚或布洛芬(ibuprofen))、止痛劑、緩解瘙癢之乳膏或洗劑、冷敷法或其各種組合。
在一個態樣中，經考慮，疫苗及/或療法與抗病毒治療結合使用。替代地，療法可以範圍介於數分鐘至數週之時間間隔在其他試劑治療之前或之後進行。在單獨投與其他藥劑及/或疫苗之態樣中，通常將確保在每次遞送之間有意義之時段未到期，以使得藥劑及免疫原組合物將仍能夠對個體發揮有利的組合作用。在此類態樣中，經考慮可在彼此之約12-24小時內，或在彼此之約6-12小時內投與兩種治療模式。在一些情況下，在各別投與之間流逝若干天(2、3、4、5、6或7天)至若干週(1、2、3、4、5、6、7或8週)時可能需要顯著延長投與時段。 可採用各種組合，例如抗病毒療法「A」及作為免疫療法方案之一部分給予的免疫原多肽「B」： A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
向患者/個體投與本發明之免疫原組合物將遵循用於投與此類化合物之通用方案，考慮RSV RNA疫苗組合物及/或流行性感冒RNA疫苗組合物及/或RSV次單元疫苗組合物或本文所描述之其他組合物的毒性(若存在)。預期治療週期將視需要重複進行。亦考慮，不同標準療法(諸如保濕)可與所描述之療法組合應用。
6 . 投與本文所描述之組合物之投與可經由用於起類似功用之藥劑的任一可接受投與模式進行。在一些態樣中，本文所描述之醫藥組合物可經靜脈內、動脈內、皮下、皮內或肌肉內投與。在特定態樣中，RSV RNA分子及/或流行性感冒RNA分子及/或各別RNA-LNP組合物係肌肉內投與。在某些態樣中，醫藥組合物經調配用於局部投與或全身投與。全身投與可包括經腸投與(其涉及透過胃腸道吸收)或非經腸投與。如本文所用，「非經腸投與」係指以除透過胃腸道以外之任何方式投與，諸如藉由靜脈內注射。在一個態樣中，醫藥組合物經調配用於肌肉內投與。在另一態樣中，醫藥組合物經調配用於全身投與，例如用於靜脈內投與。
醫藥組合物可調配成固體、半固體、液體、凍乾、冷凍或氣體形式之製劑，諸如錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、懸浮液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體及氣溶膠。投與此類醫藥組合物之典型途徑包括但不限於經口、局部、經皮、吸入、非經腸、舌下、經頰、經直腸、經陰道及鼻內。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、皮內、胸骨內注射或輸注技術。本文所描述之醫藥組合物經調配以便允許在向患者投與組合物後其中所含之活性成分為生物可用的。將向個體或患者投與之組合物呈一或多個劑量單元之形式，其中例如，錠劑可為單個劑量單元，且呈氣溶膠形式之化合物之容器可容納複數個劑量單元。無論如何，待投與之組合物均將含有治療及/或預防有效量的本發明範疇內之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，用於根據本文所描述之教示治療相關疾病或病狀。
在本發明之範疇內的醫藥組合物可呈固體或液體之形式，且可經冷凍或凍乾。在一個態樣中，載劑為顆粒，以使得組合物例如呈錠劑或散劑形式。載劑可為液體，使得組合物為例如口服糖漿、可注射液體或適用於例如吸入投與之氣溶膠。在一些態樣中，當意欲經口投與時，醫藥組合物呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文視為固體或液體之形式內。作為用於經口投與之固體組合物，醫藥組合物可調配為散劑、顆粒、壓縮錠劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片或其類似形式。此類固體組合物將通常含有一或多種惰性稀釋劑或可食載劑。另外，可存在或不包括以下中之一或多者：黏合劑，諸如羧基甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如海藻酸、海藻酸鈉、PRIMOJEL®、玉米澱粉及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或STEROTEX®；助流劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調味劑；及著色劑。當醫藥組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時，除以上類型之材料之外，其可含有諸如聚乙二醇或油之液體載劑。醫藥組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。舉兩個例子而言，液體可用於經口投與或用於藉由注射遞送。在一些態樣中，當意欲用於經口投與時，除本發明化合物以外，組合物亦含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及增味劑中之一或多者。在意欲藉由注射投與之組合物中，可包括或不包括界面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑中之一或多者。
液體醫藥組合物，無論其為溶液、懸浮液或其他類似形式，均可包括或不包括以下佐劑中之一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液(例如生理食鹽水)、林格氏溶液、等張氯化鈉、不揮發性油(諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單酸甘油酯或二酸甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖；充當低溫保護劑之試劑，諸如蔗糖或海藻糖。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。在一個態樣中，生理食鹽水為佐劑。在一個態樣中，可注射醫藥組合物為無菌的。意欲用於非經腸或經口投與之液體醫藥組合物應含有一定量之化合物，使得將獲得適合劑量。
醫藥組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法製備。舉例而言，可藉由將核酸或多肽與無菌蒸餾水或其他載劑組合以便形成溶液來製備意欲藉由注射投與之醫藥組合物。可添加界面活性劑以促進均勻溶液或懸浮液之形成。界面活性劑為與同本文中之教示一致的化合物非共價相互作用以便促進該化合物溶解或均勻懸浮於水性遞送系統中的化合物。
根據本發明之醫藥組合物或其醫藥學上可接受之鹽一般以「治療有效量」或「預防有效量」且於「醫藥學上可接受之製劑」中施加。術語「醫藥學上可接受」係指不與醫藥組合物之活性組分之作用相互作用的物質之非毒性。術語「治療有效量」及「預防有效量」係指單獨或與其他劑量一起達成所需反應或所需效應的量。在治療特定疾病的情況下，在一個態樣中，所需反應係指抑制該疾病之病程。此包含減緩疾病進展，且尤其中斷或逆轉疾病進展。治療疾病之所需反應亦可為延遲該疾病或該病狀之發作或預防該疾病或該病狀之發作。
本發明範疇內之組合物以治療及/或預防有效量投與，其將視多種因素而變化，該等因素包括所採用之特定治療劑及/或預防劑之活性；治療劑及/或預防劑之代謝穩定性及作用長度；患者之個別參數，包括患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投與模式、時間及/或持續時間；排泄率；藥物組合；特定病症或病狀之嚴重強度；及進行治療之個體。因此，本文所描述之組合物之投與劑量可視各種此類參數而定。在患者中之反應在初始劑量下不充分的情況中，可使用較高劑量(或藉由另一更局部的投與途徑來達成之有效較高劑量)。在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以足以遞送以下量之劑量水平投與：每天每公斤個體體重0.0001 ng/µg/mg至100 ng/µg/mg、0.001 ng/µg/mg至0.05 ng/µg/mg、0.005 ng/µg/mg至0.05 ng/µg/mg、0.001 ng/µg/mg至0.005 ng/µg/mg、0.05 ng/µg/mg至0.5 ng/µg/mg、0.01 ng/µg/mg至50 ng/µg/mg、0.1 ng/µg/mg至40 ng/µg/mg、0.5 ng/µg/mg至30 ng/µg/mg、0.01 ng/µg/mg至10 ng/µg/mg、0.1 ng/µg/mg至10 ng/µg/mg、或1 ng/µg/mg至25 ng/µg/mg，每天投與一或多次、每週投與一或多次、每月投與一或多次等，以獲得所需治療性、診斷性、預防性或成像作用(參見例如國際公開案第WO2013/078199號中所描述之單位劑量範圍，該公開案以全文引用之方式併入本文中)。在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的劑量水平投與：每天每公斤個體體重0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ng/µg/mg，每天投與一或多次、每週投與一或多次、每月投與一或多次等，以獲得所需治療性、診斷性、預防性或成像作用。
在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量或以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量的劑量水平投與：每天0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ng/µg/mg，每天投與一或多次、每週投與一或多次、每月投與一或多次等，以獲得所需治療性、診斷性、預防性或成像作用。
在特定態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量或以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量的劑量水平投與：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 mg/mL囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
在例示性態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的劑量水平投與：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg/mL囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。在例示性態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的劑量水平投與：0.01、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75或0.90 mg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
在特定態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量或以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量的劑量水平投與：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 µg/mL囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
在例示性態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的劑量水平投與：1、15、30、45、60、75或90 µg/mL囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。在例示性態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的劑量水平投與：1、15、30、45、60、75或90 µg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
所需劑量可一天多次(例如一天1、2、3、4、5或更多次)、每隔一天、每三天、每週、每兩週、每三週、每四週、每2個月、每三個月、每6個月等遞送。在某些態樣中，所需劑量可使用單次劑量投與進行遞送。在某些態樣中，所需劑量可使用多次投與(例如兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次投與)來遞送。當採用多次投與時，可使用分次給藥方案。組合物之初次投與與組合物之後續投與之間的投與時間可為(但不限於) 1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、1天、36小時、2天、3天、4天、5天、6天、1週、10天、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、18個月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超過99年。
在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以單次劑量投與。在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可投與兩次(例如第0天及第7天、第0天及第14天、第0天及第21天、第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第90日、第0天及第120天、第0天及第150天、第0天及第180天、第0天及1個月後、第0天及2個月後、第0天及3個月後、第0天及6個月後、第0天及9個月後、第0天及12個月後、第0天及18個月後、第0天及2年後、第0天及5年後、或第0天及10年後)，各以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量或以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量的劑量水平投與：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ng/µg/mg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。本發明涵蓋較高及較低投與劑量及頻率。舉例而言，可投與組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)三次或四次。可能需要以1-5年之間隔週期性加強來維持抗體之保護水平。
在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的單次劑量投與至個體：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ng/µg/mg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的單次劑量投與：1 µg、15 µg、30 µg、45 µg、60 µg、75 µg或90 µg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的兩個劑量投與：0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.0006、0.0007、0.0008、0.0009、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100 ng/µg/mg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。在一些態樣中，組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的兩個劑量投與：1 µg、15 µg、30 µg、45 µg、60 µg、75 µg或90 µg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
在特定態樣中，組合物(例如，RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可投與兩次(例如，第0天及第28天、第0天及第60天、第0天及第180天、第0天及2個月後、第0天及6個月後)，其中各以至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量或以足以遞送至少、至多、恰好以下或以下中之任兩者之間的總劑量的劑量水平投與：1 µg、15 µg、30 µg、45 µg、60 µg、75 µg或90 µg囊封於LNP中之RSV RNA及/或囊封於LNP中之流行性感冒RNA。
IX. 使用方法本文提供用於預防及/或治療人類及其他哺乳動物中之RSV的組合物(例如包含RSV RNA分子及/或RSV RNA-LNP及/或流行性感冒RNA及/或流行性感冒RNA-LNP之醫藥組合物)、方法、套組及試劑。
RSV RNA組合物及/或流行性感冒RNA組合物(例如RSV RNA-LNP組合物及/或流行性感冒RNA-LNP組合物)可用作預防劑。其可用於藥物中以預防及/或治療傳染病。在例示性態樣中，RSV RNA組合物及/或流行性感冒RNA組合物用於預防急性下呼吸道感染(ALRI)。本發明之RSV疫苗可用於預防RSV及/或流行性感冒(感染相關疾病，包括肺炎及支氣管炎)，且尤其可用於預防及/或治療免疫功能不全且年老之患者以預防RSV感染及/或流行性感冒感染或降低其嚴重程度及/或持續時間。
在一些態樣中，向個體(例如哺乳動物個體，諸如人類個體)投與本發明之RSV RNA組合物(例如RSV RNA-LNP組合物)及/或流行性感冒RNA組合物(例如流行性感冒RNA-LNP組合物)，且RNA聚核苷酸在活體內轉譯以產生抗原性多肽。
在一些態樣中，本發明之RSV RNA組合物及/或流行性感冒RNA組合物可用於對免疫效應細胞致敏，例如離體活化周邊血液單核細胞(PBMC)，接著將其輸注(再輸注)至個體中。
在一些態樣中，在投與本文所描述之RSV RNA分子及/或流行性感冒RNA分子(例如調配為RNA LNP)之後，將RNA之至少一部分遞送至目標細胞。在一些態樣中，RNA之至少一部分遞送至目標細胞之胞溶質。在一些態樣中，RNA由目標細胞轉譯以產生其編碼之多肽或蛋白質。在一些態樣中，目標細胞為脾臟細胞。在一些態樣中，目標細胞為脾臟中之抗原呈遞細胞，諸如專職抗原呈遞細胞。在一些態樣中，目標細胞為樹突狀細胞或巨噬細胞。RNA分子(諸如本文所描述之RNA-LNP)可用於將RNA遞送至此類目標細胞。因此，本發明亦關於一種用於將RNA遞送至個體中之目標細胞的方法，其包含向該個體投與本文所描述之RNA粒子。
在一些態樣中，RNA被遞送至目標細胞之胞溶質。在一些態樣中，RNA由目標細胞轉譯以產生RNA編碼之多肽或蛋白質。「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之核苷酸之特異性序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股均可被稱為編碼該蛋白質或該基因或cDNA之其他產物。
在一些態樣中，本文所描述之核酸組合物，例如包含RSV RNA-LNP之組合物的特徵為(例如當向個體投與時)持續表現所編碼之多肽。在一些態樣中，本文所描述之核酸組合物，例如包含流行性感冒RNA-LNP之組合物的特徵為(例如當向個體投與時)持續表現所編碼之多肽。舉例而言，在一些態樣中，此類組合物之特徵在於，當向人類投與時，其在來自此類人類之生物樣品(例如血清)中達成可偵測之多肽表現，且在一些態樣中，此類表現持續至少36小時或更長，包括例如至少48小時、至少60小時、至少72小時、至少96小時、至少120小時、至少148小時或更長之時段。
在一些態樣中，本發明係關於一種誘導個體之免疫反應的方法。該方法包括向個體投與有效量之如本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種對個體進行疫苗接種之方法。該方法包括向有需要之個體投與有效量的本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療或預防傳染病之方法。該方法包括向個體投與有效量的如本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療或預防RSV感染及/或由RSV引起之疾病及或流行性感冒感染及/或由流行性感冒引起之疾病或降低其嚴重程度的方法。該方法包括向個體投與有效量之如本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由例如誘導個體中針對傳染病之免疫反應來治療或預防個體之傳染病或降低其嚴重程度的方法。在一些態樣中，該方法包括投與包括有效量的本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物的初打組合物，及投與包括有效量的RNA分子、RNA-LNP及/或組合物之加強組合物。在一些態樣中，組合物引發免疫反應，包括抗體反應。在一些態樣中，組合物引發免疫反應，包括T細胞反應。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由例如誘導個體中針對RSV及/或流行性感冒之各別免疫反應來治療或預防個體之RSV感染及/或由RSV引起之疾病及/或流行性感冒感染及/或由流行性感冒引起之疾病或降低其嚴重程度的方法。在一些態樣中，該方法包括投與包括有效量的本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物的初打組合物，及投與包括有效量的如本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物的加強組合物。在一些態樣中，組合物引發免疫反應，包括抗體反應。在一些態樣中，組合物引發免疫反應，包括T細胞反應。
本文所揭示之方法可涉及向個體投與包含具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種RSV RNA分子之RSV RNA-LNP組合物，從而在個體中誘導對RSV抗原性多肽具有特異性之免疫反應，其中相對於疫苗接種預防有效劑量(例如在臨床上可接受程度下預防感染病毒之治療有效劑量)之針對RSV之傳統疫苗的個體中之抗抗原性多肽抗體力價，個體中之抗抗原性多肽抗體力價在疫苗接種之後增加。「抗抗原性多肽抗體」為特異性結合於抗原性多肽之血清抗體。在一些態樣中，相對於投與預防有效劑量之針對RSV之傳統組合物的個體中之抗抗原性多肽抗體力價，個體中之抗抗原性多肽抗體力價在投與RSV RNA-LNP組合物之後增加至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 log。
本文所揭示之方法可涉及向個體投與包含具有編碼至少一種RSV抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種RSV RNA分子之RSV RNA-LNP組合物，從而在個體中誘導對RSV抗原性多肽具有特異性之免疫反應，其中在相對於RNA組合物至少以下倍數、至多以下倍數、以下中之任兩者之間的倍數或恰好以下倍數的劑量水平下，個體中之免疫反應等效於投與針對RSV之傳統組合物之個體中的免疫反應：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100倍。
本文所揭示之方法可涉及向個體投與包含具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種流行性感冒RNA分子之流行性感冒RNA-LNP組合物，從而在個體中誘導對流行性感冒抗原性多肽具有特異性之免疫反應，其中相對於疫苗接種預防有效劑量(例如在臨床上可接受水平下預防感染病毒之治療有效劑量)之針對流行性感冒之傳統疫苗的個體中之抗抗原性多肽抗體力價，個體中之抗抗原性多肽抗體力價在疫苗接種之後增加。「抗抗原性多肽抗體」為特異性結合於抗原性多肽之血清抗體。在一些態樣中，相對於投與預防有效劑量之針對流行性感冒之傳統組合物的個體中之抗抗原性多肽抗體力價，個體中之抗抗原性多肽抗體力價在投與流行性感冒RNA-LNP組合物之後增加至少以下、至多以下、以下中之任兩者之間或恰好以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 log。
本文所揭示之方法可涉及向個體投與包含具有編碼至少一種流行性感冒抗原性多肽之開放閱讀框架的至少一種流行性感冒RNA分子之流行性感冒RNA-LNP組合物，從而在個體中誘導對流行性感冒抗原性多肽具有特異性之免疫反應，其中在相對於RNA組合物至少以下倍數、至多以下倍數、以下中之任兩者之間的倍數或恰好以下倍數的劑量水平下，個體中之免疫反應等效於投與針對流行性感冒之傳統組合物之個體中的免疫反應：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98或100倍。
在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物用作疫苗。在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物可在預防、治療或改善急性下呼吸道感染(ALRI)或與呼吸道病痛相關之病症，包括肺炎及支氣管炎之各種治療或預防方法中使用。
在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物可在預防、治療或改善急性下呼吸道感染(ALRI)，包括肺炎及支氣管炎之各種治療或預防方法中使用。
可向健康個體或在感染早期在潛伏期期間或在症狀發作之後的活動性感染期間預防性地投與RSV RNA組合物及/或流行性感冒RNA組合物。在一些態樣中，個體具有免疫能力。在一些態樣中，個體免疫功能不全。
在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物以單次劑量投與。在一些態樣中，可給予第二、第三或第四劑量。在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物以多次劑量投與。
在一些態樣中，RNA分子、RNA-LNP及/或組合物經肌肉內(IM)或皮內(ID)投與。
本發明進一步提供包含RNA分子、RNA-LNP及/或組合物之套組。
在一些態樣中，向小於約1歲、或約1歲至約10歲、或約10歲至約20歲、或約20歲至約50歲、或約60歲至約70歲或更大之個體投與本文所描述之RNA分子、RNA-LNP及/或組合物。
在一些態樣中，個體為至少、至多、恰好以下歲數或以下中之任兩者之間的歲數：小於1歲、大於1歲、大於5歲、大於10歲、大於20歲、大於30歲、大於40歲、大於50歲、大於60歲、大於70歲或更大。在一些態樣中，個體大於50歲。
在一些態樣中，個體為至少、至多、恰好以下歲數或以下中之任兩者之間的歲數：約1歲或更大、約5歲或更大、約10歲或更大、約20歲或更大、約30歲或更大、約40歲或更大、約50歲或更大、約60歲或更大、約70歲或更大、或更大歲數。在一些態樣中，個體可為約50歲或更大。
在一些態樣中，個體為至少、至多、恰好以下歲數或以下中之任兩者之間的歲數：約1歲或更大、5歲或更大、10歲或更大、20歲或更大、30歲或更大、40歲或更大、50歲或更大、60歲或更大、70歲或更大、或更大歲數。在一些態樣中，個體可為50歲或更大。
其他實施例： 在一些實施例中，本發明表明，與編碼A型流行性感冒病毒之RNA相比，增加編碼B型流行性感冒病毒之抗原的RNA之相對量改良免疫反應(例如，針對B型流行性感冒病毒包含較高中和力價之免疫反應(例如，與包含等量之編碼A型流行性感冒抗原之RNA及編碼B型流行性感冒抗原之RNA的組合物相比中和力價較高(例如，藉由本文所描述之假病毒中和分析測定)))。本發明亦提供針對兩種類型流行性感冒病毒類型可產生強力免疫反應之例示性劑量之RNA (例如在臨床相關水平下之中和力價及/或血清轉化率(例如(i)與先前顯示預防流行性感冒症狀之彼等者相當或優於其之中和力價，及/或(ii)與由相關比較例(例如市售經批准之流行性感冒疫苗或流行性感冒RNA疫苗)誘導之中和力價及/或血清轉化率相當或優於其之中和力價及/或血清轉化率))。在一些實施例中，相較於編碼A型流行性感冒抗原之RNA包含更大量之編碼B型流行性感冒抗原之RNA的組合物針對B型流行性感冒病毒及A型流行性感冒病毒中之各者產生的免疫反應與由非RNA流行性感冒疫苗(例如經批准之疫苗)及/或包含等量之編碼A型流行性感冒抗原之RNA及編碼B型流行性感冒抗原之RNA的RNA疫苗誘導之免疫反應相當或更優。
在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.1-0.2 mg/ml。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.1 mg/ml。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.12 mg/ml。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.14 mg/ml。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.16 mg/ml。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中RNA之濃度為約0.18 mg/ml。在一些實施例中，藉由投與約200 μL RNA製劑投與約30 μg RNA。在一些實施例中，醫藥學上RNA製劑中之RNA在投與之前稀釋(例如稀釋至約0.05 mg/ml之濃度)。在一些實施例中，投與體積在約200 µl與約300 µl之間。在一些實施例中，醫藥RNA製劑中之RNA調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。
在一些實施例中，醫藥RNA製劑包含約0.1 mg/ml之濃度的RNA，且調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。在一些實施例中，醫藥RNA製劑包含約0.12 mg/ml之濃度的RNA，且調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。在一些實施例中，醫藥RNA製劑包含約0.14 mg/ml之濃度的RNA，且調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。在一些實施例中，醫藥RNA製劑包含約0.16 mg/ml之濃度的RNA，且調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。在一些實施例中，醫藥RNA製劑包含約0.18 mg/ml之濃度的RNA，且調配於約10 mM Tris緩衝液及約10%蔗糖中。此類調配物可視需要在投與之前稀釋以投與不同劑量之RNA，同時保持總注射體積相對恆定。舉例而言，可藉由以約1:1稀釋此類醫藥RNA製劑及投與約200 µl稀釋的醫藥RNA製劑來投與約10 µg之RNA劑量。
在一些實施例中，疫苗調配於小瓶(例如玻璃小瓶)中。在一些實施例中，玻璃小瓶用溴丁基彈性塞子及具有翻蓋式塑膠蓋之鋁密封件密封。
在一些實施例中，組合物包含編碼流行性感冒病毒之抗原(例如HA蛋白)之RNA，相關衛生當局建議將該RNA包括於季節性適應性疫苗中(例如基於細胞之病毒、重組病毒或活減毒病毒)。在一些實施例中，組合物包含複數種編碼各流行性感冒病毒之抗原(例如HA蛋白)之RNA，相關衛生當局建議將其包括於季節性適應性疫苗中(例如基於細胞之病毒、重組病毒或活減毒病毒)。
在一些實施例中，流行性感冒病毒為A型流行性感冒、B型流行性感冒或C型流行性感冒病毒。在一些實施例中，A型流行性感冒病毒為H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7或H10N8病毒。在一些實施例中，A型流行性感冒病毒為H1N1、H3N2、H5N1或H5N8病毒。在一些實施例中，A型流行性感冒病毒為H1N1病毒(例如A/Wisconsin/588/2019或A/Sydney/5/2021)。在一些實施例中，A型流行性感冒病毒為H3N2病毒。在一些實施例中，H3N2病毒為A/Cambodia/e0826360/2020或A/Darwin/6/2021。在一些實施例中，B型流行性感冒病毒屬於B/Yamagata或B/Victoria譜系。在一些實施例中，B/Victoria譜系流行性感冒病毒為B/Washington/02/2019。在一些實施例中，B/Victoria譜系病毒為B/Austria/1359417/2021。在一些實施例中，B/Yamagata譜系流行性感冒病毒為B/Phuket/3073/2013。
在一些實施例中，本文所描述之組合物包含多價流行性感冒疫苗。在一些實施例中，多價流行性感冒疫苗包含2至50個不同RNA分子(例如2至40、2至30或2至20個RNA分子)，在一些實施例中，其中各者可編碼與流行性感冒相關之不同抗原性多肽(或特定抗原性多肽之不同型式)，例如如Arevalo, Claudia P.等人「A multivalent nucleoside-modified mRNA vaccine against all known influenza virus subtypes」. Science 378.6622 (2022): 899-904中所描述。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含三價流行性感冒疫苗。在一些實施例中，三價流行性感冒疫苗包含編碼與相關管轄區域中預測普遍存在的兩種A型病毒及一種B型病毒相關之抗原性多肽的RNA。在一些實施例中，三價組合物包括用於注射之modRNA懸浮液，例如0.09 mg/mL，流行性感冒HA A:A:B病毒株之比率分別為1:1:4。在一些實施例中，三價組合物包含0.015 mg/ml編碼來自A型流行性感冒病毒株之HA的modRNA、0.015 mg/ml編碼來自A型流行性感冒病毒株之HA的modRNA及0.060 mg/ml B型流行性感冒病毒株。組合物可進一步包含陽離子脂質、聚乙二醇化脂質、磷脂及固醇、蔗糖、緩血酸胺及Tris-HCl。三價modRNA HA (B/Austria, A/Wisconsin, A/Darwin) 0.6 μg組合物在小鼠中引發免疫反應，其中該組合物包括0.2 μg之3種HA中之各者。劑量體積及免疫接種途徑為50 μl/IM，在第0天及第28天投與。在第21天及第42天抽血。
在一些實施例中，三價組合物包含用於注射之流行性感冒modRNA-LNP懸浮液，例如0.09 mg/ml，A:A:B之比率為1:1:4。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含四價流行性感冒疫苗。在一些實施例中，四價流行性感冒疫苗包含編碼與相關管轄區域中預測普遍存在的兩種A型病毒及兩種B型病毒相關之抗原性多肽的RNA。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含八價流行性感冒疫苗。在一些實施例中，八價流行性感冒疫苗包含編碼兩種與相關管轄區域中預測普遍存在的兩種A型病毒及兩種B型病毒中之各者相關之抗原性多肽(例如與各病毒相關的HA蛋白及NA蛋白，或其免疫原片段)的RNA。在一些實施例中，本文揭示之組合物包含四價流行性感冒疫苗，其包含：包含編碼與H1N1病毒(例如A/Wisconsin/588/2019)相關之HA蛋白的核苷酸序列的RNA；包含編碼與H3N2病毒(例如A/Cambodia/e0826360/2020)相關之HA蛋白的核苷酸序列的RNA；包含編碼與B/Victoria譜系流行性感冒病毒(例如B/Washington/02/2019)相關之HA蛋白及與B/Yamagata譜系流行性感冒病毒(例如B/Phuket/3073/2013)相關之HA蛋白的核苷酸序列的RNA。
在一些實施例中，組合物包含四價流行性感冒疫苗，該四價流行性感冒疫苗包含編碼與相關管轄區域中預測普遍存在的兩種A型病毒及兩種B型病毒相關之抗原性多肽的RNA。在一些實施例中，四價流行性感冒疫苗包含：編碼與H1N1流行性感冒病毒相關之抗原性多肽的RNA、編碼與H3N2流行性感冒病毒相關之抗原性多肽的RNA、編碼與Victoria譜系流行性感冒病毒相關之抗原性多肽的RNA、及編碼與Yamagata譜系流行性感冒病毒相關之抗原性多肽的RNA。在一些實施例中，四價流行性感冒疫苗包含與相關管轄區域中預測普遍存在的流行性感冒類型相關的RNA (例如與相關管轄區域中預測普遍存在的H1N1、H3N2、B/Victoria及B/Yamagata流行性感冒病毒相關之HA多肽)。
在一些實施例中，本文揭示之組合物中之各RNA編碼與相關管轄區域中預測普遍存在的傳染原相關之抗原性多肽。此類組合物可降低所需疫苗接種之次數。
在一些實施例中，含有核酸之粒子包含兩種或更多種RNA分子，其各自包含編碼與不同流行性感冒病毒相關之抗原(例如HA蛋白)之核苷酸序列。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含三種或更多種RNA分子，其各自包含編碼與不同流行性感冒病毒相關之抗原(例如HA蛋白)之核苷酸序列。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含四種或更多種RNA分子，其各自包含編碼與不同流行性感冒病毒相關之抗原(例如HA蛋白)之核苷酸序列。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含：包含編碼與H1N1流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的RNA分子；包含編碼與H3N2流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的RNA分子；包含編碼與B/Victoria譜系流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的RNA分子；及包含編碼與B/Yamagata流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的RNA分子。在一些實施例中，包含編碼與流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的組合物中之各RNA調配於相同的含有核酸之粒子中。在一些實施例中，包含編碼與流行性感冒病毒相關之抗原性多肽之核苷酸序列的組合物中之各RNA調配於單獨的含有核酸之粒子中。
在一些實施例中，包含兩種或更多種RNA分子之含有核酸之粒子(例如在一些實施例中，如本文所描述之LNP)包含相同量(亦即以1:1比率)之各RNA分子。
在一些實施例中，包含兩種或更多種RNA分子之含有核酸之粒子(例如在一些實施例中，如本文所描述之LNP)包含不同量之各RNA分子。舉例而言，在一些實施例中，含有核酸之粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之存在量為第二RNA分子之0.01至100倍(例如其中第一RNA分子之量比第二RNA分子高0.01至50、0.01至4、0.01至30、0.01至25、0.01至20、0.01至15、0.01至10、0.01至9、0.01至8、0.01至7、0.01至6、0.01至5、0.01至4、0.01至3、0.01至2、0.01至1.5、1至50、1至4、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、或1至1.5倍)。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之濃度為第二RNA分子之1至10倍。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之濃度為第二RNA分子之1至5倍。在一些實施例中，含有核酸之粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之濃度為第二RNA分子之1至3倍。在一些實施例中，含核酸粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之濃度為第二RNA分子之2倍。在一些實施例中，含核酸粒子包含第一RNA分子及第二RNA分子，其中第一RNA分子之濃度為第二RNA分子之3倍。
在一些實施例中，包含三種RNA分子之含有核酸之粒子(例如在一些實施例中，如本文所描述之LNP)包含相同量(亦即，以1:1:1比率)之各RNA分子。
在一些實施例中，包含三種RNA分子之含有核酸之粒子(例如在一些實施例中，如本文所描述之LNP)包含不同量之各RNA分子。舉例而言，在一些實施例中，第一RNA分子:第二RNA分子:第三RNA分子之比率為1:0.01-100:0.01-100 (例如1:0.01-50:0.01-50；1:0.01-40:0.01-40；1:0.01-30:0.01-25；1:0.01-25:0.01-25；1:0.01-20:0.01-20；1:0.01-15:0.01-15；1:0.01-10:0.01-9；1:0.01-9:0.01-9；1:0.01-8:0.01-8；1:0.01-7:0.01-7；1:0.01-6:0.01-6；1:0.01-5:0.01-5；1:0.01-4:0.01-4；1:0.01-3:0.01-3；1:0.01-2:0.01-2；或1:0.01-1.5:0.01-1.5)。在一些實施例中，第一RNA分子:第二RNA分子:第三RNA分子之比率為1:1:3。在一些實施例中，第一RNA分子:第二RNA分子:第三RNA分子之比率為1:3:3。
如本文所用，術語「劑量(dose)」一般係指「給藥量(dose amount)」，其係指每次投與(亦即每次給藥)投與之RNA的量。
在一些實施例中，本發明之免疫原組合物或疫苗之投與可藉由單次投與進行或藉由多次投與增強。
在一些實施例中，本文所描述之方案包括至少一次劑量。在一些實施例中，方案包括第一劑量及至少一次後續劑量。在一些實施例中，第一劑量之量與至少一次後續劑量相同。在一些實施例中，第一劑量之量與所有後續劑量相同。在一些實施例中，第一劑量之量與至少一次後續劑量不同。在一些實施例中，第一劑量之量與所有後續劑量不同。在一些實施例中，方案包含兩次劑量。在一些實施例中，所提供方案由兩次劑量組成。在一些實施例中，方案包含三次劑量。
在一個實施例中，本發明設想投與單一劑量。在一個實施例中，本發明設想投與初打劑量，隨後一或多次加強劑量。加強劑量或第一加強劑量可在投與初打劑量後7至28天或14至24天投與。在一些實施例中，第一加強劑量可在投與初打劑量後1週至3個月(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週)投與。在一些實施例中，後續加強劑量可在前一加強劑量後至少1週或更長時間投與，包括例如至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週或更長時間。在一些實施例中，後續加強劑量可間隔約5-9週或6-8週投與。在一些實施例中，至少一個後續加強劑量(例如第一加強劑量後)可在前一劑量後至少3個月或更長時間投與，包括例如至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月或更長時間。
在一些實施例中，劑量包含0.1 µg至300 µg、0.5 µg至200 µg或1 µg至100 µg之總RNA量，諸如約1 µg、約2 µg、約3 µg、約10 µg、約15 µg、約20 µg、約25 µg、約30 µg、約35 µg、約40 µg、約45 µg、約50 µg、約55 µg、約60 µg、約65 µg、約70 µg、約75 µg、約80 µg、約85 µg、約90 µg、約95 µg或約100 µg。在一些實施例中，劑量包含至多約100 µg之總RNA (例如modRNA)量。在一些實施例中，劑量包含0.1 µg至100 µg之一或多種第一RNA及0.1 µg至100 µg之一或多種第二RNA，其中該一或多種第一RNA各自包含編碼與第一傳染原(例如冠狀病毒)相關之抗原性多肽的核苷酸序列，且該一或多種第二RNA各自包含編碼與第二傳染原(例如流感)相關之抗原性多肽的核苷酸序列。在一些實施例中，劑量包含3至60 µg之一或多種第一RNA及3至90 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含3至60 µg之一或多種第一RNA及3至90 µg之一或多種第二RNA，其中該劑量包含至多100 µg之總RNA。在一些實施例中，劑量包含3至30 µg之一或多種第一RNA及3至60 µg之一或多種第二RNA，其中該劑量包含至多100 µg之總RNA。在一些實施例中，劑量包含3 µg之一或多種第一RNA及3 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含3 µg之一或多種第一RNA及6 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含10 µg之一或多種第一RNA及10 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含10 µg之一或多種第一RNA及20 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含30 µg之一或多種第一RNA及30 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含30 µg之一或多種第一RNA及60 µg之一或多種第二RNA。在一些實施例中，劑量包含60 µg之一或多種第一RNA及30 µg之一或多種第二RNA。
在一些實施例中，給與個體(例如作為主要方案或加強方案之一部分)之後續劑量可具有與先前給與個體相同的RNA量。在一些實施例中，相較於先前給與個體之量，給與個體(例如作為主要方案或加強方案之一部分)之後續劑量之RNA量可不同。舉例而言，在一些實施例中，例如基於各種因素之考慮，包括例如由先前劑量誘導之免疫原性及/或反應原性、疾病流行率等，後續劑量可高於或低於先前劑量。在一些實施例中，後續劑量可高出先前劑量至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更高。在一些實施例中，後續劑量可高出先前劑量至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍或更高。在一些實施例中，後續劑量可高出先前劑量至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更高。在一些實施例中，後續劑量可比先前劑量低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或更低。在一些實施例中，每劑量(例如在給定劑量中)可投與0.1 µg至300 µg、0.5 µg至200 µg或1 µg至100 µg之量的本文所描述之RNA，諸如約1 µg、約2 µg、約3 µg、約10 µg、約15 µg、約20 µg、約25 µg、約30 µg、約35 µg、約40 µg、約45 µg、約50 µg、約55 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg或約100 µg。
在一些實施例中，每劑量(例如在給定劑量中)可投與以下量之本文所描述之RNA：60 µg或更低、55 µg或更低、50 µg或更低、45 µg或更低、40 µg或更低、35 µg或更低、30 µg或更低、25 µg或更低、20 µg或更低、15 µg或更低、10 µg或更低、5 µg或更低、3 µg或更低、2.5 µg或更低、或1 µg或更低。
在一些實施例中，每劑量(例如在給定劑量中)可投與以下量之本文所描述之RNA：至少0.25 µg、至少0.5 µg、至少1 µg、至少2 µg、至少3 µg、至少4 µg、至少5 µg、至少10 µg、至少15 µg、至少20 µg、至少25 µg、至少30 µg、至少40 µg、至少50 µg或至少60 µg。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少3 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少10 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少15 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少20 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少25 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少30 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少50 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，在至少一次給定劑量中可投與至少60 μg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，前述量之組合可在包含兩次或更多次劑量之方案中投與(例如先前劑量及後續劑量可如本文所描述具有不同量)。在一些實施例中，前述量之組合可在主要方案及加強方案中投與(例如主要方案及加強方案中可給與不同劑量)。
在一些實施例中，每劑量可投與以下量之本文所描述之RNA：0.25 µg至60 µg、0.5 µg至55 µg、1 µg至50 µg、5 µg至40 µg或10 µg至30 µg。在一些實施例中，可在至少一次給定劑量中投與3 µg至30 µg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，可在至少一次給定劑量中投與3 µg至20 µg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，可在至少一次給定劑量中投與3 µg至15 µg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，可在至少一次給定劑量中投與3 µg至10 µg之量的本文所描述之RNA。在一些實施例中，可在至少一次給定劑量中投與10 µg至30 µg之量的本文所描述之RNA。
在一些實施例中，向個體投與之方案可包含複數次劑量(例如至少兩次劑量、至少三次劑量或更多次)。在一些實施例中，向個體投與之方案可包含第一劑量及第二劑量，其間隔至少2週、間隔至少3週、間隔至少4週或更長時間給與。在一些實施例中，此類劑量可間隔至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月或更長時間。在一些實施例中，劑量可間隔多天投與，諸如間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60天或更多天。在一些實施例中，劑量可間隔約1至約3週、或間隔約1至約4週、或間隔約1至約5週、或間隔約1至約6週、或間隔約1至超過6週投與。在一些實施例中，劑量可相隔約7至約60天，諸如約14至約48天等之時段。在一些實施例中，劑量之間的最小天數可為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更長時間。在一些實施例中，劑量之間的最大天數可為約60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或更短時間。在一些實施例中，劑量可間隔約21至約28天。在一些實施例中，劑量可間隔約19至約42天。在一些實施例中，劑量可間隔約7至約28天。在一些實施例中，劑量可為約14至約24天。在一些實施例中，劑量可為約21至約42天。
在一些實施例中，疫苗接種方案包含第一劑量及第二劑量。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少21天投與。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少28天投與。
在一些實施例中，疫苗接種方案包含第一劑量及第二劑量，其中第一劑量中投與之RNA量與第二劑量中投與之RNA量相同。在一些實施例中，疫苗接種方案包含第一劑量及第二劑量，其中第一劑量中投與之RNA量與第二劑量中投與之RNA量不同。
在一些實施例中，疫苗接種方案包含第一劑量及第二劑量，其中第一劑量中投與之RNA量小於第二劑量中投與之RNA量。在一些實施例中，第一劑量中投與之RNA量為第二劑量之10%-90%。在一些實施例中，第一劑量中投與之RNA量為第二劑量之10%-50%。在一些實施例中，第一劑量中投與之RNA量為第二劑量之10%-20%。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少2週投與，包括間隔至少3週、間隔至少4週、間隔至少5週、間隔至少6週或更長時間。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少3週投與。
在一些實施例中，第一劑量包含小於約30 μg RNA，且第二劑量包含至少約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約1至小於約30 μg RNA (例如約0.1、約1、約3、約5、約10、約15、約20、約25或少於約30 μg RNA)，且第二劑量包含約30至約100 μg RNA (例如約30、約40、約50或約60 μg RNA)。在一些實施例中，第一劑量包含約1至約20 μg RNA、約1至約10 μg RNA、或約1至約5 μg RNA，且第二劑量包含約30至約60 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約1至約10 μg RNA (例如約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10 μg RNA)，且第二劑量包含約30至約60 μg RNA (例如約30、約35、約40、約45、約50、約55或約60 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約1 μg RNA，且第二劑量包含約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA，且第二劑量包含約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約5 μg RNA，且第二劑量包含約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA，且第二劑量包含約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約15 μg RNA，且第二劑量包含約30 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約1 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約5 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約6 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約15 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約20 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約25 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA，且第二劑量包含約60 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含小於約10 μg RNA，且第二劑量包含至少約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至小於約10 μg RNA (例如約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8或小於約10 μg RNA)，且第二劑量包含約10至約30 μg RNA (例如約10、約15、約20、約25或約30 μg RNA)。在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至約10 μg RNA、約1至約5 μg RNA、或約0.1至約3 μg RNA，且第二劑量包含約10至約30 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至約5 μg RNA (例如約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5 μg RNA)，且第二劑量包含約10至約20 μg RNA (例如約10、約12、約14、約16、約18、約20 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約0.1 μg RNA，且第二劑量包含約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約0.3 μg RNA，且第二劑量包含約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約1 μg RNA，且第二劑量包含約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA，且第二劑量包含約10 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含小於約3 μg RNA且第二劑量包含至少約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至小於約3 μg RNA (例如約0.1、約0.2、約0.3、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.5、約2.0或約2.5 μg RNA)且第二劑量包含約3至約10 μg RNA (例如約3、約4、約5、約6或約7、約8、約9或約10 μg RNA)。在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至約3 μg RNA、約0.1至約1 μg RNA或約0.1至約0.5 μg RNA且第二劑量包含約3至約10 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約0.1至約1.0 μg RNA (例如約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或約1.0 μg RNA)且第二劑量包含約1至約3 μg RNA (例如約1.0、約1.5、約2.0、約2.5或約3.0 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約0.1 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約0.3 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約0.5 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約1 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。
在一些實施例中，疫苗接種方案包含第一劑量及第二劑量，其中第一劑量中投與之RNA量大於第二劑量中投與之RNA量。在一些實施例中，第二劑量中投與之RNA量為第一劑量之10%-90%。在一些實施例中，第二劑量中投與之RNA量為第一劑量之10%-50%。在一些實施例中，第二劑量中投與之RNA量為第一劑量之10%-20%。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少2週投與，包括間隔至少3週、間隔至少4週、間隔至少5週、間隔至少6週或更長時間。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量間隔至少3週投與。
在一些實施例中，第一劑量包含至少約30 μg RNA，且第二劑量包含少於約30 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30至約100 μg RNA (例如約30、約40、約50或約60 μg RNA)，且第二劑量包含約1至約30 μg RNA (例如約0.1、約1、約3、約5、約10、約15、約20、約25或約30 μg RNA)。在一些實施例中，第二劑量包含約1至約20 μg RNA、約1至約10 μg RNA、或約1至5 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30至約60 μg RNA，且第二劑量包含約1至約20 μg RNA、約1至約10 μg RNA、或約0.1至約3 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約30至約60 μg RNA (例如約30、約35、約40、約45、約50、約55或約60 μg RNA)，且第二劑量包含約1至約10之RNA (例如約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA且第二劑量包含約1 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA且第二劑量包含約5 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA且第二劑量包含約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約30 μg RNA且第二劑量包含約15 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約1 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約5 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約6 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約15 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約20 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約25 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約60 μg RNA且第二劑量包含約30 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含至少約10 μg RNA且第二劑量包含小於約10 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10至約30 μg RNA (例如約10、約15、約20、約25或約30 μg RNA)且第二劑量包含約0.1至小於約10 μg RNA (例如約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8或小於約10 μg RNA)。在一些實施例中，第一劑量包含約10至約30 μg RNA或約0.1至約3 μg RNA且第二劑量包含約1至約10 μg RNA或約1至約5 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約10至約20 μg RNA (例如約10、約12、約14、約16、約18、約20 μg RNA)且第二劑量包含約0.1至約5 μg RNA (例如約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4或約5 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA且第二劑量包含約0.1 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA且第二劑量包含約0.3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA且第二劑量包含約1 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約10 μg RNA且第二劑量包含約3 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含至少約3 μg RNA且第二劑量包含小於約3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3至約10 μg RNA (例如約3、約4、約5、約6或約7、約8、約9或約10 μg RNA)且第二劑量包含0.1至小於約3 μg RNA (例如約0.1、約0.2、約0.3、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.5 約2.0或約2.5 μg RNA)。在一些實施例中，第一劑量包含約3至約10 μg RNA且第二劑量包含約0.1至約3 μg RNA、約0.1至約1 μg RNA或約0.1至約0.5 μg RNA。
在一些實施例中，第一劑量包含約1至約3 μg RNA (例如約1、約1.5、約2.0、約2.5或約3.0 μg RNA)且第二劑量包含約0.1至0.3 μg RNA (例如約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9或約1.0 μg RNA)。
在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA且第二劑量包含約0.1 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA且第二劑量包含約0.3 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA且第二劑量包含約0.6 μg RNA。在一些實施例中，第一劑量包含約3 μg RNA且第二劑量包含約1 μg RNA。
在一些實施例中，疫苗接種方案包含至少兩次劑量，包括例如至少三次劑量、至少四次劑量或更多次。在一些實施例中，疫苗接種方案包含三次劑量。在一些實施例中，第一劑量與第二劑量之間的時間間隔可與第二劑量與第三劑量之間的時間間隔相同。在一些實施例中，第一劑量與第二劑量之間的時間間隔可長於第二劑量與第三劑量之間的時間間隔，例如長數天或數週(包括例如至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週或更長時間)。在一些實施例中，第一劑量與第二劑量之間的時間間隔可短於第二劑量與第三劑量之間的時間間隔，例如短數天或數週(包括例如至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1週、至少2週、至少3週、至少4週、至少5週、至少6週或更長時間)。在一些實施例中，第一劑量與第二劑量之間的時間間隔可短於第二劑量與第三劑量之間的時間間隔，例如短至少1個月(包括例如至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月或更長時間)。
在一些實施例中，主要方案之最後一次劑量及加強方案之第一劑量間隔至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月或更長時間給與。在一些實施例中，主要方案可包含兩次劑量。在一些實施例中，主要方案可包含三次劑量。
在一些實施例中，第一劑量及第二劑量(及/或其他後續劑量)可藉由肌肉內注射投與。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量(及/或其他後續劑量)可投與至三角肌中。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量(及/或其他後續劑量)可投與至同一臂中。
在一些實施例中，本文所描述之mRNA組合物以間隔21天之一系列兩次劑量(例如各0.3 mL)投與(例如藉由肌肉內注射)。在一些實施例中，本文所描述之mRNA組合物以間隔21天之一系列兩次劑量(例如各0.2 mL)投與(例如藉由肌肉內注射)。在一些實施例中，本文所描述之mRNA組合物以一系列三次劑量(例如0.3 mL或更低，包括例如0.2 mL)投與(例如藉由肌肉內注射)，其中各劑量間隔至少3週給與。在一些實施例中，第一劑量及第二劑量可間隔3週投與，而第二劑量及第三劑量可以比第一劑量與第二劑量之間更長的時間間隔，例如間隔至少4週或更長時間(包括至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週或更長)投與。在一些實施例中，各劑量為約60 μg。在一些實施例中，各劑量為約50 μg。在一些實施例中，各劑量為約30 μg。在一些實施例中，各劑量為約25 μg。在一些實施例中，各劑量為約20 μg。在一些實施例中，各劑量為約15 μg。在一些實施例中，各劑量為約10 μg。在一些實施例中，各劑量為約3 μg。
在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約60 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約50 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約30 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約25 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約20 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約15 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約10 μg。在一些實施例中，疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約3 μg。
在一個實施例中，每劑量投與約60 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約50 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約30 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約25 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約20 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約15 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約10 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約5 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，每劑量投與約3 µg之量的本文所描述之RNA。在一個實施例中，投與此類劑量中之至少兩者。舉例而言，第二劑量可在投與第一劑量後約21天投與。
在一些實施例中，本文所描述之RNA疫苗(例如以兩次劑量投與，其中第二劑量可在投與第一劑量後約21天投與，且例如每劑量以約30 µg之量投與)之功效在投與第二劑量後7天開始(例如若在投與第一劑量後21天投與第二劑量，則在投與第一劑量後28天開始)為至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%。在一些實施例中，在年齡為至少50、至少55、至少60、至少65、至少70歲或更大之群體中觀測到此類功效。在一些實施例中，在年齡為至少65歲(諸如65至80、65至75、或65至70歲)之群體中，本文所描述之RNA疫苗(例如以兩次劑量投與，其中第二劑量可在投與第一劑量後約21天投與，且例如每劑量以約30 µg之量投與)之功效在投與第二劑量後7天開始(例如若第二劑量在投與第一劑量後21天投與，則在投與第一劑量後28天開始)為至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%或至少95%。此類功效可在長達1個月、2個月、3個月、6個月或甚至更長之時段內觀測到。
在一個實施例中，疫苗功效定義為具有感染跡象之個體數之減少百分比(疫苗接種個體相對於未經疫苗接種個體)。
在一個實施例中，向兒科群體投與本文所描述之方法及藥劑。在各種實施例中，兒科群體包含18歲以下個體或由其組成，例如5歲至小於18歲、12歲至小於18歲、16歲至小於18歲、12歲至小於16歲、5歲至小於12歲、或6個月至小於12歲之個體。在各種實施例中，兒科群體包含5歲以下個體或由其組成，例如2歲至小於5歲、12歲至小於24個月齡、7個月至小於12個月齡、或小於6個月齡之個體。在一些此類實施例中，向小於2歲，例如6個月至小於2歲之個體投與本文所描述之mRNA組合物。在一些此類實施例中，向小於6個月，例如1個月至小於4個月齡之個體投與本文所描述之mRNA組合物。在一些實施例中，兒科群體之給藥方案(例如劑量及/或給藥時程)可隨不同年齡群組而變化。舉例而言，在一些實施例中，可根據包含至少三次劑量之主要方案向6個月至4歲之個體投與，其中初始兩次劑量間隔至少3週(包括例如至少4週、至少5週、至少6週或更長時間)投與，隨後在第二劑量後至少8週(包括例如至少9週、至少10週、至少11週、至少12週或更長時間)投與第三劑量。在一些此類實施例中，投與之至少一次劑量為3 μg本文所描述之RNA。在一些實施例中，可根據包含至少兩次劑量之主要方案向5歲及更大之個體投與，其中兩次劑量間隔至少3週(包括例如至少3週、至少4週、至少5週、至少6週或更長時間)投與。在一些此類實施例中，投與之至少一次劑量為10 μg本文所描述之RNA。在一些實施例中，可根據包含至少三次劑量之主要方案向免疫功能不全(例如在一些實施例中，已經歷實體器官移植之個體，或經診斷患有被視為具有免疫功能不全同等情況之病狀之個體)之5歲及更大個體投與，其中初始兩次劑量間隔至少3週(包括例如至少3週、至少4週、至少5週、至少6週或更長時間)投與，隨後在第二劑量後至少4週(包括例如至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週或更長時間)投與第三劑量。
在一些實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約30 μg。在一些實施例中，向12歲或更大(包括例如18歲或更大)個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量高於30 μg，包括例如35 μg、40 μg、45 μg、50 μg、55 μg、60 μg、65 μg、70 μg或更高。在一些此類實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約60 μg。在一些此類實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約50 μg。在一個實施例中，兒科群體包含12歲至小於18歲個體(包括16歲至小於18歲個體及/或12歲至小於16歲個體)或由其組成。在此實施例中，治療可包含間隔21天之2次疫苗接種，其中在一個實施例中，疫苗以每劑量30 µg RNA之量投與，例如藉由肌肉內投與。在一些實施例中，相較於較年幼兒童或嬰兒(例如2歲至小於5歲、6個月至小於2歲、或小於6個月)，向較大兒科患者及成年人(例如向12歲或更大患者)投與更高劑量。在一些實施例中，相較於例如6個月至小於2歲、或小於6個月之幼童及/或嬰兒，向2歲至小於5歲兒童投與較高劑量。
在一個實施例中，兒科群體包含5歲至小於18歲個體(包括12歲至小於18歲個體及/或5歲至小於12歲個體)或由其組成。在此實施例中，治療可包含間隔21天之2次疫苗接種，其中在各種實施例中，疫苗以每劑量10 µg、20 µg或30 µg RNA之量投與，例如藉由肌肉內投與。在一些此類實施例中，向5歲至11歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約10 μg。
在一個實施例中，兒科群體包含小於5歲個體或由其組成，包括2至小於5歲個體、12個月至小於24個月齡個體、7個月至小於12個月齡個體、6個月至小於12個月齡個體、及/或小於6個月齡個體。在此實施例中，治療可包含例如間隔21至42天，例如間隔21天之2次疫苗接種，其中在各種實施例中，疫苗以每劑量3 µg、10 µg、20 µg或30 µg RNA之量投與，例如藉由肌肉內投與。在一些此類實施例中，向2歲至小於5歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約3 μg。在一些此類實施例中，向約6個月至小於約5歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且各劑量為約3 μg。
在一些實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約60 μg。在一些實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約30 μg。在一些實施例中，向12歲或更大個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約15 μg。在一些實施例中，向5歲至小於12歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約10 μg。在一些實施例中，向2歲至小於5歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約3 μg。在一些實施例中，向6個月至小於2歲個體投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約3 μg或更低，包括例如2 μg、1 μg或更低。在一些實施例中，向小於6個月之嬰兒投與本文所描述之mRNA組合物，且疫苗接種方案(例如主要疫苗接種方案及/或加強疫苗接種方案)中給與之至少一次劑量為約3 μg或更低，包括例如2 μg、1 μg、0.5 μg或更低。
在一些實施例中，向有需要之個體投與之劑量可包含投與本文所描述之單一mRNA組合物。
在一些實施例中，向有需要之個體投與之劑量可包含投與至少兩種或更多種(包括例如至少三種或更多種)不同藥品/調配物。舉例而言，在一些實施例中，至少兩種或更多種不同藥品/調配物可包含至少兩種不同的本文所描述之mRNA組合物(例如在一些實施例中，各自包含不同RNA構築體)。
在一些實施例中，向個體投與兩種或更多種RNA (例如作為主要方案或加強方案之一部分)，其中該兩種或更多種RNA係在同一天或同一次問診投與。在一些實施例中，兩種或更多種RNA係以單獨組合物投與，例如藉由將各RNA投與至個體之單獨一部分(例如藉由肌肉內投與至個體之不同臂，或投與至個體之同一臂之不同部位)。在一些實施例中，在投與之前將兩種或更多種RNA混合(例如臨在投與之前例如藉由投與醫師混合)。在一些實施例中，兩種或更多種RNA調配在一起(例如藉由(a)將單獨的LNP群體混合，各群體包含不同RNA；或(b)藉由在LNP調配之前混合兩種或更多種RNA，以使得各LNP包含兩種或更多種RNA)。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，兩種RNA各自呈相同量(亦即，以1:1比率)。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，兩種RNA各自呈不同量。舉例而言，在一些實施例中，向個體投與或組合物包含量為一或多種第二RNA之量的0.01至100倍之一或多種第一RNA (例如其中一或多種第一RNA之量為一或多種第二RNA之量的0.01至50、0.01至4、0.01至30、0.01至25、0.01至20、0.01至15、0.01至10、0.01至9、0.01至8、0.01至7、0.01至6、0.01至5、0.01至4、0.01至3、0.01至2、0.01至1.5、1至50、1至4、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、或1至1.5倍)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，其中一或多種第一RNA之濃度為一或多種第二RNA之濃度的1至10倍。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，其中一或多種第一RNA之量為一或多種第二RNA之量的1至5倍。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，其中一或多種第一RNA之濃度為一或多種第二RNA之濃度的1至3倍。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，其中一或多種第一RNA之量為一或多種第二RNA之量的2倍。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種第一RNA及一或多種第二RNA，其中一或多種第一RNA之濃度為一或多種第二RNA之濃度的3倍。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含兩種第一RNA，各自編碼來源於流行性感冒病毒株或變異體之抗原，其中各RNA之量不相同。舉例而言，在一些實施例中，兩種第一RNA之比率為1:0.01-100 (例如1:0.01-50；1:0.01-40；1:0.01-30；1:0.01-25；1:0.01-20；1:0.01-15；1:0.01-10；1:0.01-9；1:0.01-8；1:0.01-7；1:0.01-6；1:0.01-5；1:0.01-4；1:0.01-3；1:0.01-2；1:0.01-1.5、1:0.1-10、1:0.1-5、1:0.1-3、1:2-10、1:2-5、或1:2-3)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含兩種第一RNA，比率為1:3。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含兩種第一RNA，比率為1:2。
舉例而言，在一些實施例中，三種第一RNA之比率為1:0.01-100:0.01-100 (例如1:0.01-50:0.01-50；1:0.01-40:0.01-40；1:0.01-30:0.01-30；1:0.01-25:0.01-25；1:0.01-20:0.01-20；1:0.01-15:0.01-15；1:0.01-10:0.01-10；1:0.01-9:0.01-9；1:0.01-8:0.01-8；1:0.01-7:0.01-7；1:0.01-6:0.01-6；1:0.01-5:0.01-5；1:0.01-4:0.01-4；1:0.01-3:0.01-3；1:0.01-2:0.01-2；1:0.01-1.5:0.01-1.5；1:0.1-10:0.1-10、1:0.1-5:0.1-5、1:0.1-3:0.1-3、1:2-10:2-10、1:2-5:2-5、或1:2-3:2-3)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種第一RNA，比率為1:1:3。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種第一RNA，比率為1:3:3。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含兩種或更多種第二RNA，其中之一或多者編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白，且其中之一或多者編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白。在一些實施例中，存在一或多種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA及一或多種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA，且係以相同量(亦即以1:1之比率)投與。在一些實施例中，以不同量(例如以在1:10與10:1之間的比率，或以1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1或5:1之比率(編碼A抗原之總RNA:編碼B抗原之總RNA)投與一或多種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA及一或多種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含兩種第二RNA，各自編碼不同流行性感冒病毒類型之HA蛋白(例如編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA及編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA)。在一些實施例中，第二RNA以相同量(亦即以1:1比率)投與或存在。在一些實施例中，第二RNA以不同量(例如以1:10與10:1之間的比率，或以1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、3:1、4:1或5:1之比率(A:B))投與或存在。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種第二RNA，各自編碼不同流行性感冒病毒亞型之HA蛋白(例如A/Wisconsin (H1N1)病毒、A/Darwin (H3N2)病毒及B/Austria (Victoria)病毒之HA蛋白)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含呈相同量(亦即以1:1:1比率)之三種第二RNA中之各者。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含不同量之三種第二RNA中之一或多者(例如以1:1:2與1:1:10之間的比率(例如以1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5之比率)，或以2:2:1與2:2:10之間的比率(例如以2:2:1、3:3:1、4:4:1或5:5:1之比率)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種第二RNA，其中之兩者編碼不同A型流行性感冒病毒之HA蛋白，且其中之一者編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白。在一些此類實施例中，編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA以相較於編碼A型病毒之HA蛋白的第二RNA更高的量存在或投與(例如在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白之第二RNA相對於編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之比率為1:1:1-10、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5 (A:A:B))。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種第二RNA，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白且一種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白，其中三種第二RNA之比率為1:1:4 (A:A:B)。在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA各自以相較於編碼B型病毒之HA蛋白的第二RNA更高的量存在或各自以更高的量投與(例如在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA相對於編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之比率為1-10:1-10:1、2:2:1、3:3:1、4:4:1或5:5:1 (A:A:B))。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含四種第二RNA，各自編碼不同流行性感冒病毒亞型之HA蛋白。在一些此類實施例中，四種第二RNA包含兩種編碼不同A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA及兩種編碼不同B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA (例如H1N1病毒之HA蛋白、H3N2病毒之HA蛋白、B/Victoria譜系病毒之HA蛋白、及B/Yamagata譜系病毒之HA蛋白)。在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA中之各者以及兩種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA中之各者以相同量(亦即四種第二RNA之比率為1:1:1:1)存在。在一些實施例中，兩種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA各自以相較於編碼A型病毒之HA蛋白的任一第二RNA更高的量投與或各自以更高的量存在(例如在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA相對於兩種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之比率為1:1:2-10:2-10、1:1:2-5:2-5、1:1:2:2、1:1:3:3、1:1:4:4、1:1:5:5、1:1:6:6、1:1:7:7、1:1:8:8、1:1:9:9、1:1:10:10 (A:A:B:B))。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含四種第二RNA，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白及兩種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白，其中四種第二RNA之比率為1:1:5:5 (A:A:B:B)。在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA各自以相較於編碼B型病毒之HA蛋白的任一第二RNA更高的量投與或各自以更高的量存在(例如在一些實施例中，兩種編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA相對於兩種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之比率為2-10:2-10:1:1、2-5:2-5:1:1、2:2:1:1、3:3:1:1、4:4:1:1、5:5:1:1、6:6:1:1、7:7:1:1、8:8:1:1、9:9:1:1、10:10:1:1 (A:A:B:B))。
在一些實施例中，組合物包含或向個體投與四種第二RNA，其包含三種編碼不同A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA及一種編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA (例如A/Wisconsin (H1N1)、A/Darwin (H3N2)、A/Cambodia (H3N2)及B/Austria (Victoria))。在一些此類實施例中，四種第二RNA中之各者以相同量(亦即以1:1:1:1比率)投與或存在。在一些實施例中，編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之量高於編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的任一第二RNA (例如在一些實施例中，第二RNA之比率為1:1:1:1-10、1:1:1:1-5、1:1:1:2、1:1:1:3、1:1:1:4或1:1:1:5 (A:A:A:B))。在一些實施例中，所投與或組合物中之第二RNA之比率為1:1:1:5 (A:A:A:B)。在一些實施例中，編碼A型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA中之各者之量高於編碼B型流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA之量(例如在一些實施例中，第二RNA之比率為1-10:1-10:1-10:1、1-5:1-5:1-5:1、2:2:2:1、3:3:3:1、4:4:4:1或5:5:5:1 (A:A:A:B))。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種編碼流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA(例如兩種第二RNA、三種第二RNA或四種第二RNA，各自編碼不同流行性感冒病毒之HA蛋白)，其總量為0.1至100 µg (例如1至90 µg、3至90 µg、1至60 µg、3至60 µg、5至60 µg、10至60 µg、30至60 µg、3至30 µg)。在一些實施例中，向個體投與或組合物包含一或多種編碼流行性感冒病毒之HA蛋白的第二RNA，其總量為3 µg、5 µg、6 µg、10 µg、15 µg、20 µg、25 µg、30 µg、45 µg、60 µg、75 µg或90 µg。
在一些實施例中，向個體投與或組合物包含三種或四種第二RNA，各自編碼不同流行性感冒病毒株之HA抗原，呈下表C中列舉之量中之一者(各「流行性感冒組分」對應於編碼HA抗原之第二RNA (例如如本文所描述之第二RNA)。 表 C ： 編碼 HA 抗原之第二 RNA 之例示性量
組合# 流行性感冒組分1 流行性感冒組分2 流行性感冒組分3 流行性感冒組分4 總計
1 7.5 µg (A型) 7.5 µg (A型) 7.5 µg (B型) 7.5 µg (B型) 30 µg
2 15 µg (A型) 15 µg (A型) 15 µg (B型) 15 µg (B型) 60 µg
3 11.25 µg (A型) 11.25 µg (A型) 11.25 µg (B型) 11.25 µg (B型) 45 µg
4 5 µg (A型) 5 µg (A型) 25 µg (B型) 25 µg (B型) 60 µg
5 2.5 µg (A型) 2.5 µg (A型) 12.5 µg (B型) 12.5 µg (B型) 30 µg
6 7.5 µg (A型) 7.5 µg (A型) 30 µg (B型) - 45 µg
7 7.5 µg (A型) 7.5 µg (A型) 7.5 µg (A型) 7.5 µg (B型) 30 µg
在一些實施例中，本文所描述之組合物之特徵在於其產生之流行性感冒中和抗體力價在參考疫苗針對其編碼抗原之各流行性感冒病毒產生之流行性感冒中和抗體力價的至少兩倍內(例如其中參考疫苗為單獨投與的四價流行性感冒RNA疫苗、或經批准之(非RNA)流行性感冒疫苗)。
在一些實施例中，流行性感冒疫苗為α流行性感冒病毒疫苗、β流行性感冒病毒疫苗、γ流行性感冒病毒疫苗或δ流行性感冒病毒疫苗。在一些實施例中，疫苗為A型流行性感冒病毒疫苗、B型流行性感冒病毒疫苗、C型流行性感冒病毒疫苗或D型流行性感冒病毒疫苗。在一些實施例中，A型流行性感冒病毒疫苗包含選自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17及H18之血球凝集素，或其免疫原片段或變異體，或編碼其中之任一者的核酸(例如RNA)。在一些實施例中，A型流行性感冒疫苗包含或編碼選自N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10及N11之神經胺糖酸苷酶(NA)，或其免疫原片段或變異體，或編碼其中之任一者的核酸(例如RNA)。在一些實施例中，流行性感冒疫苗包含至少一種流行性感冒病毒血球凝集素(HA)、神經胺糖酸苷酶(NA)、核蛋白(NP)、基質蛋白1 (M1)、基質蛋白2 (M2)、非結構蛋白1 (NS1)、非結構蛋白2 (NS2)、核輸出蛋白(NEP)、聚合酶酸性蛋白質(PA)、聚合酶鹼性蛋白質PB1、PB1-F2、及/或聚合酶鹼性蛋白質2 (PB2)、或其免疫原片段或變異體、或編碼其中之任一者的核酸(例如RNA)。
實例下文為用於實施本發明之特定態樣的實例。包括以下實例以說明本發明之態樣。實例僅出於說明性目的提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表本發明人發現的在本發明之實踐中發揮良好作用的技術。然而，熟習此項技術者應理解，根據本發明，在不背離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定態樣作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。已儘力確保關於所用數字(例如量、溫度等)之準確性，但當然應該允許一些實驗誤差及偏差。
實例 1 ： 流行性感冒 modRNA 藥品組合物藥品組合物為靶向Wisconsin 2021/2022血球凝集素之流行性感冒modRNA原料藥。 表 1 流感疫苗藥品之備用 (RTU) 呈現之例示性調配物組成
組分 功能 濃度，mg/mL
PF-07829855原料藥(mRNA) 活性劑 0.1
ALC-0315 功能性脂質 1.43
ALC-0159 功能性脂質 0.18
DSPC 結構脂質 0.31
膽固醇 結構脂質 0.62
蔗糖 低溫保護劑/張力劑 1.3
Tris/緩血酸胺 緩衝劑，pH 7.4 0.18
Tris HCl 1.34
注射用水 溶劑/媒劑 q.s.
除非另有說明，否則如本文所用，編碼HA之流感modRNA分子(在本文中亦稱為流感mRNA原料藥)包括表2中所列出之以下元件： 表 2 元件表
元素 描述 位置
帽 經修飾之5'-帽1結構(m 7G +m 3'-5'-ppp-5'-Am) 1-2 ( GA)
5'-UTR 來源於人類α-血球蛋白RNA的具有最佳化科紮克序列(Kozak sequence)之5'-非轉譯區 SEQ ID NO: 54 3-54
3'-UTR 3'非轉譯區包含兩個來源於胺基末端分裂增強因子(AES) mRNA及粒線體編碼之12S核糖體RNA之序列元件以賦予RNA穩定性及較高總蛋白質表現。SEQ ID NO: 55 3880-4174
poly(A) 由以下組成之110個核苷酸的poly(A)-尾：一段30個腺苷殘基，接著為10個核苷酸的連接子序列及其他70個腺苷殘基。SEQ ID NO: 56 4175-4284
序列 Ψ = 1-甲基-3'-假尿苷醯基
在一些實施例中，包含一種經脂質奈米粒子囊封之編碼HA之mRNA分子的免疫原組合物為單價的且具有選自1 µg mRNA、2 µg RNA、5 µg RNA及20 µg RNA中之任一者的劑量。
在一些實施例中，免疫原組合物包含經一種經脂質奈米粒子囊封之編碼HA之mRNA分子、經脂質奈米粒子囊封之編碼HA之第二mRNA分子、經脂質奈米粒子囊封之編碼NA之第三mRNA分子及經脂質奈米粒子囊封之編碼NA之第四mRNA分子，其中總劑量為至多20 µg RNA。
在一些實施例中，個體年齡為30 -50歲。
實例 2 ： 四價藥品之描述四價藥品為脂質奈米粒子(LNP)於水性低溫保護劑緩衝液中的無防腐劑無菌分散液，用於肌肉內投與。藥品以0.1 mg/mL RNA於10 mM Tris緩衝液、300 mM蔗糖，pH 7.4中調配。 藥品供應在用氯丁基橡膠塞及具有翻蓋式塑膠蓋之鋁密封件密封之2 mL玻璃小瓶中(最大標稱體積為0.3 mL)。 表 3
四價藥品之組成
成分名稱 等級/ 品質標準 功能 單位配方 (mg/mL) 填充量 ( 總毫克數/ 小瓶) 標稱量或淨數量 ( 淨 毫克數/ 小瓶)
PF-07829855原料藥(Wisconsin) 內部規格 活性成分 0.025 0.013 0.008
PF-07836258原料藥(Cambodia) 內部規格 活性成分 0.025 0.013 0.008
PF-07836259原料藥(Phuket) 內部規格 活性成分 0.025 0.013 0.008
PF-07836261原料藥(Washington) 內部規格 活性成分 0.025 0.013 0.008
ALC-0315 a 內部規格 功能性脂質 1.43 0.72 0.43
ALC-0159 b 內部規格 功能性脂質 0.18 0.09 0.05
DSPC c 內部規格 結構脂質 0.31 0.16 0.09
膽固醇 Ph. Eur.、NF 結構脂質 0.62 0.31 0.2
蔗糖 Ph. Eur.、NF 低溫保護劑 102.69 51.35 30.81
緩血酸胺(Tris鹼) Ph. Eur.、USP 緩衝劑組分 0.20 0.10 0.06
Tris (羥基甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl) 內部規格 緩衝劑組分 1.32 0.66 0.40
注射用水 Ph. Eur.、USP、JP 溶劑 q.s. d至1.00 mL q.s. d至0.50 mL q.s. d至0.30 mL
a.     ALC-0315 = ((4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) b.     ALC-0159 = 2-[(聚乙二醇)-2000]- N,N-二(十四烷基)乙醯胺 c.     DSPC = 1,2-二硬脂醯基- sn-甘油基-3-磷酸膽鹼 d.     q.s.為足量(quantum satis)之縮寫，意謂足夠多的。
FIH原料藥之推薦儲存溫度為-20±5℃。 FIH藥品之推薦長期儲存溫度為-60℃至-90℃。 在使用點藥品可儲存在2℃-8℃下。
實例 3 ： RSV F 蛋白組合物除非另外說明，否則如在本發明實例中所用之組合RSV次單元及流行性感冒mRNA-LNP組合物的RSV次單元組分描述如下：RSVpreF、RSV二價穩定融合前F次單元疫苗(項目碼PF-06928316)，旨在經由主動免疫接種預防老年人中或透過向妊娠期婦女投與預防嬰兒之RSV相關之下呼吸道疾病。
RSVpreF含有兩個經工程改造之融合前F抗原，847 A (來自RSV子組A [病毒株Ontario]之經修飾F)及847 B (來自子組B之經修飾F[病毒株Buenos Aires])，各自在結構上經工程改造以實現融合前構形之穩定性。疫苗包含經無菌水復原之共同凍乾抗原。RSVpreF之所選商業劑量為0.5 mL中120 μg (60 µg 847A及60 µg 847B)，其以單一IM劑量形式投與，用於老年人及母體免疫接種。
研究性RSV疫苗包含等量的兩種重組RSV F抗原，來自子組A之847A及來自子組B之847B，各自在結構上經工程改造以增強融合前構形之穩定性。RSVpreF藥品呈現為無菌凍乾粉末，在復原之後為240 μg/mL之目標強度，且填充於2 mL 1型玻璃瓶中。凍乾疫苗之各小瓶用0.65 mL無菌水稀釋劑復原。散裝藥品調配物含有20 mM Tris (緩血酸胺)、50 mM氯化鈉、0.2 mg/mL聚山梨醇酯80、30 mg/mL蔗糖及60 mg/mL甘露糖醇。
實例 4 ： 包含呈融合前構形之 RSV F 蛋白三聚體之水性組合物的最佳化以減少凍乾持續時間 ， 同時限制融合前內含物之損失及聚集體之增加為了最佳化待用於組合物中之穩定劑/增積劑之選擇及比率，選擇表4中所示之10種不同基質且凍乾。應用開發之凍乾循環產生含有蔗糖/甘露糖醇或蔗糖/甘胺酸之凍乾組合物。在凍乾之前及之後藉由AM14 ELISA及AM22 Fab滴定監測所有測試調配物之聚集(HMMS%)及融合前內含物。 表 4
RSV F蛋白組合物
調配物# 常見組分 蔗糖 %(w/v) 甘露糖醇 %(w/v) 甘胺酸 %(w/v) NaCl (mM)
1 240 µg/mL RSV A及240 µg/mL RSV B、20 mM Tris pH 7.4、0.02% PS80 3 6 0 50
2 3 6 0 0
3 2 5.5 0 50
4 2 5.5 0 0
5 1.5 0 3 25
6 1.5 0 3 0
7 1 0 2.5 25
8 1 0 2.5 0
9 2 4 0 50
10 (Gen 1基質，對照) 9 0 0 50
組合物#1至#9均可在約24小時內凍乾。對於含有蔗糖及甘露糖醇之組合物，含有3%蔗糖/6%甘露糖醇之有或無NaCl的兩種組合物(表4中之#1及#2)證明在所有測試組合物當中在凍乾之後最好的總體穩定性。組合物#4 (2%蔗糖/5.5%甘露糖醇)及組合物#9 (2%蔗糖/4%甘露糖醇，有NaCl)顯示在凍乾之後融合前內含物最大下降及聚集最大增加，表明非理想的蔗糖/甘露糖醇含量及/或比率。另外，資料表明，組合物中NaCl之存在可潛在地降低凍乾後大部分組合物中之聚集速率。
對於含有蔗糖及甘胺酸之組合物，含有1%蔗糖/2.5%甘胺酸之有或無NaCl的組合物(表4中之#7及#8)顯示穩定性略佳於含有1.5%蔗糖/3%甘胺酸之有或無NaCl的組合物(表4中之#5及#6)
鑒於以上內容，包含呈融合前構形之RSV F蛋白三聚體之組合物中包括蔗糖及甘露糖醇或蔗糖及甘胺酸尤其有利於獲得可凍乾之組合物，且其中融合前內含物之損失及聚集之增加受到限制。特定言之，蔗糖與甘露糖醇或蔗糖與甘胺酸之比率在1:1與1:4之間，較佳1:2至1:4，更佳1:2的組合物提供可在24小時內凍乾且其中融合前內含物之損失及聚集增加為可接受的組合物。
實例 5 ： 開發用於呈融合前構形之 RSV F 蛋白三聚體之凍乾製程凍乾開放之目標係藉由最佳化凍乾循環各階段之條件來開發目標凍乾循環，該等條件包括冷凍、退火及乾燥以產生具有可接受之產物品質之視覺上精緻餅狀物。進行初始開發以獲得目標凍乾循環之後，藉由挑戰目標循環參數且評估對產物品質之影響來評估凍乾循環之穩固性。在凍乾製程開發期間評估之關鍵品質屬性包括殘餘水分含量、HMMS及融合前內含物。另外，甘露糖醇-蔗糖調配物之凍乾可導致存在甘露糖醇之多個多晶型形式，因此亦監測甘露糖醇半水合物(MHH)之存在，因為此相可隨時間推移對產物穩定性有負面影響。
凍乾製程中之主要步驟包括冷凍、退火、經由昇華進行乾燥及經由殘餘水分之脫附進行乾燥。必須在整個步驟中之各者中考慮若干參數，包括儲存溫度、斜坡及保持時間、乾燥期間之腔室壓力及整個循環中之產物溫度。冷凍保持溫度影響冷凍基質之結構特徵。包括退火步驟可藉由促進結晶及冰晶尺寸之均一性及使甘露糖醇結晶最大化來減小通常在冷凍期間誘導的小瓶之間的不均一性，由此可最終最小化餅狀物外觀差異且減少乾燥時間。在第一乾燥斜坡期間所用之循環時間、儲存溫度及腔室壓力直接影響冷凍基質之溫度、昇華速率及乾燥餅狀物之結構及外觀。在第二乾燥斜坡期間所利用之總循環時間及儲存溫度主要影響乾燥餅狀物中之殘餘水分含量。對各步驟之適當參數值的選擇共同地使得凍乾循環能夠在小瓶中產生乾燥餅狀物，其具有精緻餅狀物之理想外觀，且殘餘水分含量低，從而支持藥品之穩定。
在藥品調配物之熱分析之後，基於使用半結晶調配物之歷史製程開發體驗選擇用於實驗室規模凍乾循環之初始參數(參見下表5)。 表 5- 目標凍乾循環
區段 溫度 (℃) 斜坡速率(℃/min) 斜坡時間 (min) 保持時間 (min) 腔室壓力 ( 毫托 / 微巴 )
冷凍 -50 1.0 70 60 NA
退火 -10 0.5 80 210 NA
再冷凍 -50 0.5 80 60 NA
真空起始 -50 NA NA NA 200毫托(267微巴)
第一乾燥步驟 0 0.5 100 0 200毫托(267微巴)
第二乾燥步驟 50 0.2 250 515 200毫托(267微巴)
加塞 NA NA NA NA 600,000毫托(800微巴)
縮寫：NA=不適用。
接著創造侵襲性循環條件以證實關鍵製程參數且界定待挑戰之上邊界及下邊界以評估製程穩固性。RSV F蛋白組合物(參見表6)使用表7中描述之五個侵襲性循環凍乾以證實關鍵製程參數且界定在製程穩固性研究中待挑戰之上邊界及下邊界。藉由挑戰目標凍乾循環之參數值，循環評估冷凍斜坡速率、退火斜坡速率及溫度以及乾燥斜坡速率及溫度的凍乾參數。累積侵襲性循環將緩慢冷凍及退火斜坡速率與高冷凍溫度、退火溫度以及乾燥溫度組合。個別循環如表7中所列出執行且改變冷凍斜坡速率、退火溫度、退火斜坡速率或乾燥溫度及斜坡速率，同時保持所有其他參數與目標循環值一致。 表 6. 凍乾前及凍乾後之 RSV A 及 B 組合物
成分 待凍乾之RSV F 蛋白組合物 (mg/mL 或g/L) 用無菌水稀釋劑復原後之組合物(mg/mL)
RSV A 0.32 0.24
RSV B 0.32 0.24
緩血酸胺 b 0.30 d 0.23 e
Tris-HCl c 2.76 d  2.07 e
蔗糖 30 22.5 
甘露糖醇 60 45.0 
聚山梨醇酯80 0.20  0.15 
NaCl 2.92 f  2.19 g
注射用水 q.s至1 mL或L q.s至1 mL
b亦稱為胺丁三醇及Tris鹼 c亦稱為Tris (羥基甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、緩血酸胺HCl及胺丁三醇HCl d緩血酸胺+Tris-鹽酸鹽組合物相當於20 mM Tris e緩血酸胺+Tris-鹽酸鹽組合物相當於15 mM Tris f相當於50 mM NaCl g相當於37.5 mM NaCl 表 7- 關鍵製程參數評估循環
循環描述 冷凍溫度 (℃) 冷凍斜坡 速率 (℃/min) 退火溫度 (℃) 退火斜坡速率 (℃/min) 乾燥斜坡速率 (℃/min) 第2 次乾燥溫度 (℃)
目標 -50 1 -10 0.5 0.5 (第1次乾燥)； 0.2 (第2次乾燥) 50
累積侵襲性 -45 0.25 -5 0.2 0.1 (第1次乾燥)； 0.1 (第2次乾燥) 55
冷凍斜坡侵襲性 -50 0.25 -10 0.5 0.5 (第1次乾燥)； 0.2 (第2次乾燥) 50
退火溫度侵襲性 -50 1 -5 0.5 0.5 (第1次乾燥)； 0.2 (第2次乾燥) 50
退火斜坡侵襲性 -50 1 -10 0.2 0.5 (第1次乾燥)； 0.2 (第2次乾燥) 50
乾燥溫度+斜坡侵襲性 -50 1 -10 0.5 0.5 (第1次乾燥)； 0.1 (第2次乾燥) 55
所有實驗均用來自FTS System Inc.之LyoStar3 Lyophilizer ®進行。與使用目標循環產生之凍乾組合物相比，侵襲性循環評估冷凍斜坡速率、退火斜坡速率及溫度以及乾燥斜坡速率及溫度對水分含量、融合前內含物、HMMS及MHH存在的影響。
累積侵襲性循環對關鍵品質屬性之影響指示輕微影響，而HMMS在SE-HPLC之典型方法可變性內，觀測到融合前內含物相對於凍乾前組合物及使用目標循環獲得之凍乾組合物有所下降。
實例 6 ： 四價流行性感冒及 RSV 二價組合組合物表8中列出I期劑量及投與說明書(DAI)驗證研究中使用之四價流行性感冒mRNA疫苗及RSV二價疫苗材料。 表 8
用途 材料/ 組分 描述
活性DP (四價流行性感冒) 亦參見表3 10 mM Tris緩衝液、300 mM蔗糖中之0.12 mg/ml流感mRNA， pH 7.4
活性DP (RSV二價) 120 µg RSV二價抗原、1.15 mg Tris、11.3 mg蔗糖、22.5 mg甘露糖醇、1.1 mg NaCl、0.08 mg聚山梨醇酯80 (PS80)，pH 7.4
稀釋劑(RSV二價) 無菌水作為稀釋劑
小瓶配接器 13 mm APE藥瓶配接器 13 mm APE藥瓶配接器
注射器 1 mL聚碳酸酯注射器 拋棄式無菌聚碳酸酯；1 mL
注射器 3 mL聚丙烯注射器 拋棄式無菌聚丙烯；3 mL
注射器 10 mL聚丙烯注射器 拋棄式無菌聚丙烯；10 mL
不鏽鋼針(用於抽取樣品) 21G×1''不鏽鋼針 21G 1''
不鏽鋼針 (用於封蓋) 25G×1.5''不鏽鋼針 25G 1.5''
流體分配連接器 流體分配連接器 流體分配連接器
樣品收集 無RNA酶之1.2 mL離心管 用於樣品儲存之小瓶
實例 7 ： 流行性感冒 mRNA 與 RSV 次單元疫苗之組合的相容性 此研究經設計以證明： a)流行性感冒mRNA與RSV次單元疫苗之組合(「流行性感冒mRNA與RSV組合疫苗」)的給藥懸浮液與劑量製劑所需之投藥組分相容。 b)流行性感冒mRNA與RSV次單元疫苗之組合的給藥懸浮液在足以進行DAI中所說明之操作的時段內係穩定的。
流行性感冒mRNA與RSV組合疫苗之計劃I期呈現包括： ● 四價流行性感冒modmRNA疫苗： o 四價流行性感冒mod mRNA藥品，注射用懸浮液(60微克/小瓶) o 除本文所描述之60微克/小瓶以外，DAI研究亦研究四價流行性感冒mod mRNA藥品，注射用懸浮液(90微克/小瓶)。 ● RSV二價疫苗套組： o RSV二價藥品，注射溶液用散劑(120微克/小瓶) o 無菌水作為稀釋劑預填充之注射器(SW PFS) o 13 mm小瓶配接器
此研究評估所製備之四價流行性感冒及RSV二價組合疫苗在保持與小瓶、給藥注射器及不鏽鋼針接觸時之穩定性。所評估濃度係基於最低及最高最終臨床劑量180 mcg(1:2比率之流行性感冒:RSV)及210 mcg( /流行性感冒:RSV)之括號。表9提供關於劑量組態之資訊。為評估該括號，設計此研究之劑量混合組態以製備180 mcg及210 mcg劑量作為主體製劑，如表10中所概述。 表 9. 用於 IM 注射之 PF-07941314 組合疫苗之劑型組態的劑量計算
活性DP 180 mcg 劑量( 組1 - 1:2 比率) 210 mcg 劑量( 組2 - 1:1.33 比率)
最終劑量(mcg) 給藥體積(mL) 最終劑量(mcg) 給藥體積(mL)
四價流行性感冒(0.12 mg/mL) 60 0.5 90 0.75
RSV二價(0.24 mg/mL) 120 0.5 120 0.5
總計 180 1.0 210 1.25
表 10. 每個樣品之主體製劑計算
活性DP 度量值 主體製劑組1 (1:2) 180 mcg 劑量 主體製劑組2 (1:1.33) 210 mcg 劑量
四價流行性感冒(0.12 mg/mL) 體積 3 mL 3.6 mL
小瓶數目 6個小瓶 8個小瓶
RSV二價(0.24 mg/mL) 體積(mL) 3 mL 2.4 mL
小瓶數目 6個小瓶 5個小瓶
組合疫苗 體積(mL) 6 mL 6 mL
直接自-80℃冷凍機轉移四價流行性感冒小瓶且在室溫下在環境光下解凍。在完全解凍後，藉由倒置將小瓶內含物混合10次。RSV二價疫苗製備係使用無菌水稀釋劑及小瓶配接器根據所提出之使用說明書進行。
使用注射器與注射器混合製備之樣品支持注射器接觸樣品。使用小瓶內稀釋製備之樣品將支持玻璃瓶接觸樣品。聚碳酸酯(PC)注射器、聚丙烯(PP)注射器及玻璃瓶中之所製備溶液將保持在30℃下長達4小時，此支持市售RSV疫苗溫度保持指導。在培育之後，觀測製劑之顆粒且透過25號1.5''針噴出。即時提交樣品等分試樣以藉由下表11中所列出之分析立即分析。
「180 mcg劑量」最終藥品之組合物為120 mcg RSV及60 mcg流感modRNA DP。組合前DP之基質為：用WFI復原後之RSV DP組合物包括：15 mM Tris、2.25%蔗糖、4.5%甘露糖醇、37.5 mM NaCl、0.015% PS-80 (pH 7.4)中240 mcg/ml RSV (120 mcg RSV-A +120 mcg RSV-B)，且不包括佐劑。四價modRNA流感DP組合物包括：10 mM Tris及300 mM蔗糖(pH 7.4)中之120 mg/ml流感modRNA。因此，RSV對照混合後組合物包括：12.5 mM Tris、6.26%蔗糖、2.25%甘露糖醇、18.75 mM NaCl、0.0075% PS-80 (pH 7.4)中之120 mcg/ml (60 mcg RSV-A + 60 mcg RSV-B)。流感對照混合後組合物包括：12.5 mM Tris、6.26%蔗糖、2.25%甘露糖醇、18.75 mM NaCl、0.0075% PS-80 (pH 7.4)中之60 mcg/ml流感modRNA。
「210 mcg劑量」最終藥品劑量之組合物為120 mcg RSV及90 mcg流感modRNA DP。組合前藥品(DP)之基質為：用WFI復原後之RSV次單元DP組合物包括：15 mM Tris、2.25%蔗糖、4.5%甘露糖醇、37.5 mM NaCl、0.015% PS-80 (pH 7.4)中240 mcg/ml RSV (120 mcg RSV-A +120 mcg RSV-B)，且不包括佐劑。四價modRNA流感DP組合物包括10 mM Tris及300 mM蔗糖(pH 7.4)中之120 mg/ml流感modRNA。因此，RSV對照混合後組合物包括：12 mM Tris、7.06%蔗糖、1.8%甘露糖醇、15 mM NaCl、0.006% PS-80 (pH 7.4)中之96 mcg/ml (48 mcg RSV-A + 48 mcg RSV-B)。流感對照混合後組合物包括：12 mM Tris、7.06%蔗糖、1.8%甘露糖醇、15 mM NaCl、0.006% PS-80 (pH 7.4)中之72mcg/ml流感modRNA。
例示性小瓶中稀釋描述如下：將RSV DP之RSV DP對照小瓶使用必要小瓶配接器用含有WFI之預填充注射器復原。使用小瓶配接器將3 mL聚丙烯注射器填充1.0 mL流感DP基質。將含有流感modRNA DP基質之注射器分配至RSV DP小瓶中。將其倒置以混合。重複此舉，且將各小瓶加蓋。使用小瓶配接器刺穿RSV復原後基質(0.7 mL填充物)之流感DP對照小瓶。3 mL聚丙烯注射器填充有1.05 mL流感四價modRNA LNP DP。使用小瓶配接器，將含有流感DP之注射器分配至含有RSV復原後基質之小瓶中。將其倒置以混合。重複此舉，且將各小瓶加蓋。在4、2及0小時時間點進行小瓶中稀釋。4小時及2小時樣品在30℃下分級。 表 11. 分析方法
分析關鍵 分析 研究標準 方法編號與版本 所需體積(mL)
A 外觀 白色至灰白色懸浮液 研究方法 與pH分享
外觀(粒子) 基本上不含可見粒子
pH 7.4 ± 0.5 M00125 1
RNA含量(RG) T0 ± 20% 研究方法 0.1
RNA完整性(CGE，藉由片段分析儀) ≥ 50%完整RNA 研究方法 0.2
RNA囊封(RG) ≥ 80% 研究方法 與RNA含量分享
LNP尺寸(DLS) 40 - 120 nm 研究方法 0.1
LNP PDI (DLS) ≤ 0.3 研究方法 與DLS分享
活體外表現 報導結果 研究方法 0.5
蛋白質濃度 T0 ± 20% 研究方法 1
HMMS (SEC) ≤25% 研究方法 1
LMMS (SEC) ≤5%
三聚體(SEC) ≥70%
相對融合前含量(融合前F ELISA) a 50-150% 研究方法 0.5
偶然性 1.6
總體積 6
a.     融合前F ELISA自相同樣品一式兩份測試。批簽發之蛋白質濃度結果將用於稀釋計算。 縮寫：RG=RiboGreen；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
6.1. mRNA LNP之劑型穩定性資料 自此研究產生之資料顯示，180 µg及210 µg劑型之T4小時樣品與其各別T0樣品之間的外觀、可見顆粒、pH、RNA完整性、活體外表現(IVE)及LNP尺寸及PDI的結果可比。所有資料均滿足研究標準。
180 μg及210 μg樣品之所有穩定性結果分別展示於表12及表13中。
6.2. RSV蛋白之劑型穩定性資料 自此研究產生之資料顯示，180 µg及210 µg劑型之T4小時樣品與其各別T0樣品之間的外觀、可見顆粒、pH、蛋白質濃度及相對融合前含量的結果可比。所有資料均滿足研究標準。180 μg及210 μg樣品之所有穩定性結果分別展示於表12及表13中。 表 12. PF-07941314 流行性感冒 mod mRNA 與 RSV 組合疫苗 (180 µg 劑量 [1:2] 製劑 ) 之測試結果
測試 研究標準 T0 30℃
T2H PP T4H PP T2H PC T4H PC T2H 小瓶 T4H 小瓶
外觀 白色至灰白色懸浮液 WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS
外觀 ( 可見粒子 ) 基本上不含可見粒子 EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP
pH 7.4 ± 0.5 7.3 7.3 7.2 7.2 7.3 7.3 7.3
RNA 含量 (RiboGreen) T0 ± 20% 62 59 61 59 54 58 53
RNA 完整性 (CGE ，藉由片段分析儀 ) ≥ 50%完整RNA 77 79 77 78 77 79 78
RNA 囊封 (RiboGreen) ≥ 80% 93 90 86 88 83 86 83
LNP 尺寸 (DLS) 40 - 120 nm 68 69 69 68 69 68 70
LNP PDI (DLS) ≤ 0.3 0.15 0.15 0.16 0.15 0.16 0.15 0.18
活體外表現 報導結果 A/Wisc：93% [22奈克/孔]，A/Darwin：95% [7奈克/孔]， B/Austria：91% [22奈克/孔]，B/Phuket：85% [67奈克/孔] A/Wisc：92% [22奈克/孔]， A/Darwin：95% [7奈克/孔]， B/Austria：90% [22奈克/孔]， B/Phuket：86% [67奈克/孔] A/Wisc：92% [22奈克/孔]， A/Darwin：95% [7奈克/孔]， B/Austria：89% [22奈克/孔]， B/Phuket：86% [67奈克/孔] A/Wisc：91% [22奈克/孔]， A/Darwin：94% [7奈克/孔]， B/Austria：89% [22奈克/孔]， B/Phuket：85% [67奈克/孔] A/Wisc：91% [22奈克/孔]， A/Darwin：94% [7奈克/孔]， B/Austria：85% [22奈克/孔]， B/Phuket：83% [67奈克/孔] A/Wisc：92% [22奈克/孔]， A/Darwin：96% [7奈克/孔]， B/Austria：85% [22奈克/孔]， B/Phuket：87% [67奈克/孔] A/Wisc：98% [22奈克/孔]， A/Darwin：97% [7奈克/孔]， B/Austria：86% [22奈克/孔]， B/Phuket：95% [67奈克/孔]
蛋白質濃度 T0 ± 20% (mcg/mL) 115 113 113 103 107 102 104
HMMS (SEC) ≤25% 2.4 5.3 4.5 6.1 5.9 4.0 5.7
LMMS (SEC) ≤5% 1.6 2.1 1.9 1.7 2.0 1.9 1.9
三聚體 (SEC) ≥70% 96.0 92.6 93.5 92.2 92.1 94.1 92.4
相對融合前含量 ( 融合前 F ELISA) a 50-150% 81 94 80 88 89 83 105
縮寫：PP=聚丙烯；PC=聚碳酸酯；WOWS=白色至灰白色懸浮液；EFVP=基本上不含可見粒子；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層
表 13. PF-07941314 流行性感冒 mod mRNA 與 RSV 組合疫苗 (210 µg 劑量 [1:1.33] 製劑 ) 之測試結果
測試 預期結果 T0 30℃
T2H PP T4H PP T2H PC T4H PC T2H 小瓶 T4H 小瓶
外觀 白色至灰白色懸浮液 WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS
外觀 ( 可見粒子 ) 基本上不含可見粒子(EFVP) EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP
pH 7.4 ± 0.5 7.2 7.2 7.3 7.2 7.2 7.2 7.2
RNA 含量 (RiboGreen) T0 ± 20% 75 71 70 81 71 73 76
RNA 完整性 (CGE ，藉由片段分析儀 ) ≥ 50%完整RNA 81 83 80 81 81 81 81
RNA 囊封 (RiboGreen) ≥ 80% 90 89 89 85 87 89 88
LNP 尺寸 (DLS) 40 - 120 nm 67 68 67 68 68 69 69
LNP PDI (DLS) ≤ 0.3 0.16 0.16 0.14 0.15 0.16 0.17 0.18
活體外表現 報導結果 A/Wisc：89% [22奈克/孔]， A/Darwin:86% [7奈克/孔]， B/Austria：88% [22奈克/孔]， B/Phuket：80% [67奈克/孔] A/Wisc：87% [22奈克/孔]， A/Darwin：86% [7奈克/孔]， B/Austria：87% [22奈克/孔]， B/Phuket：79% [67奈克/孔] A/Wisc：87%  [22奈克/孔]， A/Darwin：83%[7奈克/孔]， B/Austria：88% [22奈克/孔]， B/Phuket：77% [67奈克/孔] A/Wisc：90%[22奈克/孔]， A/Darwin：87%[7奈克/孔]， B/Austria：87% [22奈克/孔]， B/Phuket：74% [67奈克/孔] A/Wisc：87%[22奈克/孔]， A/Darwin：83%[7奈克/孔]， B/Austria：83% [22奈克/孔]， B/Phuket：71% [67奈克/孔] A/Wisc：88% [22奈克/孔]， A/Darwin：85%[7奈克/孔]， B/Austria：82% [22奈克/孔]， B/Phuket：74% [67奈克/孔] A/Wisc：90% [22奈克/孔]， A/Darwin：85%[7奈克/孔]， B/Austria：80% [22奈克/孔]， B/Phuket：71% [67奈克/孔]
蛋白質濃度 T0 ± 20% (mcg/mL) 85 85 84 78 81 85 84
HMMS (SEC) ≤25% 1.7 4.6 6.1 11.7 7.7 4.2 3.1
LMMS (SEC) ≤5% 1.9 2.1 1.7 1.8 1.7 1.6 1.9
三聚體 (SEC) ≥70% 96.4 93.3 92.2 86.5 90.6 94.2 95.0
相對融合前含量 ( 融合前 F ELISA) a 50-150% 90 96 95 90 100 107 96
縮寫：PP=聚丙烯；PC=聚碳酸酯；WOWS=白色至灰白色懸浮液；EFVP=基本上不含可見粒子；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
7. 結論 在30℃之溫度下進行DAI驗證研究長達4小時。自此研究產生之資料顯示，在三種類型之容器/封閉系統中之組合給藥調配物呈現中所研究RSV二價蛋白次單元抗原及四價流行性感冒mod RNA抗原長達4小時的使用穩定性結果可比。此研究之結果支持所提出之關於即時使用所製備之四價流行性感冒及RSV二價組合疫苗進行臨床研究的使用指導之投藥組分中給藥溶液之物理化學穩定性。
實例 8 ： 流感 mRNA + RSV 次單元相容性臨床DAI實驗設計測試2個臂：(i)1 mL劑量中120 μg劑量(總RSV蛋白) + 60 μg劑量(總RNA)；及(ii) 1.25毫升劑量中120 μg劑量(總RSV蛋白) + 90 μg劑量(總RNA)。在以下情況下在最初30℃、2小時及4小時評估劑量：(a)小瓶中；(b)聚丙烯注射器；及(c)聚碳酸酯注射器。結論：符合支持混合物長達4小時之相容性及穩定性之所有預先指定標準。參見圖2及圖3。
另外，在活體外表現(IVE)分析中未觀測到RNA表現之顯著變化。參見表14及表15，其中報導之所有值為以下各者之陽性細胞%：A/Wisc：[22奈克/孔]，A/Darwin：[7奈克/孔]，Bv/Austria：[22奈克/孔]， By/Phuket：[67奈克/孔]。
目標：報導結果。 表 14
120 μg RSV+60 μg 流感劑量 T0 T2H T4H
PP A/Wisc：93% A/Darwin：95% Bv/Austria：91% By/Phuket：85% A/Wisc：92% A/Darwin：95% Bv/Austria：90% By/Phuket：86% A/Wisc：92% A/Darwin：95% Bv/Austria：89% By/Phuket：86%
PC A/Wisc：91% A/Darwin：94% Bv/Austria：89% By/Phuket：85% A/Wisc：91% A/Darwin：94% Bv/Austria：85% By/Phuket：83%
小瓶 A/Wisc：92% A/Darwin：96% Bv/Austria：85% By/Phuket：87% A/Wisc：98% A/Darwin：97% Bv/Austria：86% By/Phuket：95%
表 15
120 μg RSV+ 90 μg 流感劑量 T0 T2H T4H
PP A/Wisc：89% A/Darwin：86% Bv/Austria：88% By/Phuket：80% A/Wisc：87% A/Darwin：86% Bv/Austria：87% By/Phuket：79% A/Wisc：87% A/Darwin：83% Bv/Austria：88% By/Phuket：77%
PC A/Wisc：90% A/Darwin：87% Bv/Austria：87% By/Phuket：74% A/Wisc：87% A/Darwin：83% Bv/Austria：83% By/Phuket：71%
小瓶 A/Wisc：88% A/Darwin：85% Bv/Austria：82% By/Phuket：74% A/Wisc：90% A/Darwin：85% Bv/Austria：80% By/Phuket：71%
此外，藉由DLS，LNP尺寸及多分散性指數無顯著變化。參見表16及表17，其中尺寸目標：40-120 nm及PDI：≤0.3。 表 16
120 μg RSV+60 μg 流感劑量 T0 ( 尺寸/PDI) T2H ( 尺寸/PDI) T4H ( 尺寸/PDI)
PP 68nm / 0.15 69nm / 0.15 69nm / 0.16
PC 68nm / 0.15 69nm / 0.16
小瓶 68nm / 0.15 70nm / 0.18
表 17
120 μg RSV+ 90 μg 流感劑量 T0 ( 尺寸/ PDI) T2H ( 尺寸/ PDI) T4H ( 尺寸/ PDI)
PP 67nm / 0.16 68nm / 0.16 67nm / 0.14
PC 68nm / 0.15 68nm / 0.16
小瓶 69nm / 0.17 69nm / 0.18
此外，RSV濃度無顯著改變，其中目標為T0±20% (μg/mL)。參見表18。 表 18
120 μg RSV+ 60 μg 流感劑量 T0 T2H T4H
PP 115 113 113
PC 115 103 107
小瓶 115 102 104
120 μg RSV+ 90 μg 流感劑量 T0 T2H T4H
PP 85 85 84
PC 85 78 81
小瓶 85 85 84
實例 9 ： 使用 293F 懸浮細胞之活體外表現 (IVE) 分析DAI研究T0 T2h T4h；測試小瓶中包含經WFI復原且接著與囊封四價modFlu之LNP混合之RSV蛋白的組合組合物。
測試之樣品展示在所有樣品中：200 - 0.1 ng/mL 表19.
所有樣品：200 - 0.1 ng/mL 表 19
樣品名稱 第1 天(120 μg RSV+60 μg 流感，G1) 第2 天(120 μg RSV+90 μg 流感，G2)
PP注射器_30C T0_G1 T0_G2
PP注射器_30C T2H_G1_PP T2H_G2_PP
PP注射器_30C T4H_G1_PP T4H_G2_PP
PC注射器_30C T2H_G1_PC T2H_G2_PC
PC注射器_30C T4H_G1_PC T4H_G2_PC
小瓶_30C T2H_G1_小瓶 T2H_G2_小瓶
小瓶_30C T4H_G1_小瓶 T4H_G2_小瓶
在小瓶中RSV蛋白經WFI復原且接著與modRNA LNP基質混合 T0_G1_RSV T0_G2_RSV
T0_G1_流感 T0_G2_流感
T2H_G1_RSV T2H_G2_RSV
在小瓶中modRNA LNP與RSV基質混合 T2H_G1_流感 T2H_G2_流感
T4H_G1_RSV T4H_G2_RSV
T4H_G1_流感 T4H_G2_流感
HA A/Wisconsin 及 A/Darwin病毒株之IVE滴定曲線展示類似效能。參見圖5及圖6。
結果亦展示於表20中。 表 20
第1天(120 μgRSV+60 μg流感，G1)
樣品批號 相關分析物 針對HA A/Wisconsin染色 針對HA A/Darwin染色
%蛋白質表現 (22奈克/孔) EC50 (奈克/孔)限制 %蛋白質表現 (7奈克/孔) EC50 (奈克/孔)限制
T0_G1 RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 93 3 95 1
T2H_G1_PP RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 92 3 95 1
T4H_G1_PP RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 92 3 95 1
T2H_G1_PC RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 91 3 94 1
T4H_G1_PC RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 91 4 94 1
T2H_G1_小瓶 RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 92 3 96 1
T4H_G1_小瓶 RSV + modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 98 3 97 1
T0_G1_RSV RSV 3 超過曲線最高劑量 5 超過曲線最高劑量
T0_G1_流感 modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 97 3 96 1
T2H_G1_RSV RSV 3 超過曲線最高劑量 5 超過曲線最高劑量
T2H_G1_流感 modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 97 3 96 1
T4H_G1_RSV RSV 3 超過曲線最高劑量 5 超過曲線最高劑量
T4H_G1_流感 modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 87 5 85 1
00716387-0012-M05 (陽性對照) modRNA HA Wisconsin/Darwin/ Austria/Phuket 88 4 87 1
在T0-T4穩定性窗口內所有調配物均呈現穩定。如所預期，在IVE分析中不表現僅RSV材料。
HA A/Wisconsin及A/Darwin病毒株之IVE滴定曲線展示類似效能；在測試之流感-RSV調配物之間未觀測到顯著差異。
在T0-T4穩定性窗口內所有流感-RSV調配物均呈現穩定。
實例 10. RSV RNA 構築體之產生本文中產生之RNA構築體編碼RSV F蛋白野生型(WT)及RSV F蛋白變異體/突變體(亦即RSV融合前F蛋白)。表21展示WT F蛋白(WT F)及變異RSV F蛋白(RSV A 847 F及RSV B 847 F)。 表 21. RSV F 蛋白及描述
RSV 蛋白 RSV 蛋白描述
SEQ ID NO: 1 原生RSV A2之全長F0 (GenBank GI: 138251；Swiss Prot P03420)  (574 aa)
SEQ ID NO: 2 原生RSV B之全長F0 (18537病毒株；GenBank GI: 138250；Swiss Prot P13843) (574 aa)
RSV A WT FSEQ ID NO: 3 全長WT RSV亞型A，F蛋白(574 aa)
RSV A 847 FSEQ ID NO: 4 具有取代A103C、I148C、S190I及D486S之RSV亞型A 847突變F蛋白(574 aa)
RSV B WT FSEQ ID NO: 5 全長WT RSV亞型B，F蛋白(574 aa)
RSV B 847 FSEQ ID NO: 6 具有取代A103C、I148C、S190I及D486S之RSV亞型B 847突變F蛋白(574 aa)
製備編碼RSV F蛋白之DNA序列且將其用於活體外轉錄反應以產生RNA。RNA之活體外轉錄為此項技術中已知且在本文中描述。將DNA模板選殖至具有用於改良RNA穩定性及轉譯效率之主鏈序列元件(T7啟動子、5'及3' UTR、poly-A尾)之質體載體中。DNA經純化，以分光光度法定量，且在三核苷酸帽1類似物((m 2 7,3 ' -O)Gppp(m 2'-O)ApG) (TriLink)存在下藉由T7 RNA聚合酶活體外轉錄，且其中N1-甲基假尿苷(T)置換尿苷(經修飾之RNA (modRNA))。
RSV RNA由密碼子最佳化(CO) DNA產生以實現穩定性及優良蛋白質表現。表22展示本發明之RNA構築體及對應序列，包含5' UTR、編碼呼吸道融合性病毒(RSV)多肽之開放閱讀框架、3' UTR及poly-A尾。 表 22. RSV F modRNA 構築體
RNA 構築體 5' -UTR SEQ ID NO RSV [ORF] SEQ ID NO 3' -UTR SEQ ID NO Poly-A 尾* SEQ ID NO RSV F 蛋白/DNA SEQ ID NO
RSV F 847A modRNA 18 11 21 26 4/8
RSV F 847B modRNA 18 12 21 26 6/9
*poly-A尾長度可含有+1/-1 A。
實例 11.RSV 847A 及 847B F 表現此實例用以捕獲針對本文所描述之呼吸道融合性病毒(RSV) modRNA脂質奈米粒子(LNP)藥品產生之活體外表現(IVE)結果。LNP中囊封之構築體分別編碼來自A-病毒株及B-病毒株病毒之全長RSV三聚融合醣蛋白(F-蛋白)。 表 23 抗體清單
項目 來源 分析中濃度
人類mAb抗RSV mAb1 自製 500 ng/mL
小鼠mAb抗RSV L4-6 自製 500 ng/mL
山羊抗小鼠IgG AF647 Invitrogen 500 ng/mL
山羊抗人類κ-PE Southern Biotech 500 ng/mL
表 24 . 測試物品之清單
項目 測試物品
1 含有RSV F modRNA_847A_之LNP
2 含有RSV F modRNA_847B_之LNP
以下方案之描述係針對全染色(表面+細胞內蛋白質)，對於僅表面染色方案而言，改變固定及洗滌緩衝液以移除滲透劑，所有其他步驟及試劑均相同。簡言之，以2.5×105個細胞/孔之密度對96孔培養盤接種HEK293F細胞，且將其置於震盪培育箱(350 RPM，37℃，潮濕，5% CO2)中，同時準備樣品滴定。將LNP藥品稀釋於DPBS中至80 ng/μL之濃度，且以4之稀釋因子連續稀釋8點。接著，自培育箱移出96孔培養盤，且將50 μL各步驟之所稀釋LNP添加至96孔培養盤之重複孔中，以產生在8,000奈克/孔-1.95奈克/孔之範圍內的滴定曲線。將96孔培養盤放回震盪培育箱中隔夜。在培育之後，將250 μL細胞轉移至96孔U形底聚苯乙烯培養盤中，且使用擺動斗式離心機集結(500 rcf，5分鐘，在室溫下)。移除上清液，且將細胞再懸浮於100 μL Aqua405活/死染色溶液中。在室溫避光培育培養盤30分鐘。在培育之後，細胞用洗滌緩衝液洗滌且使用離心(500 rcf，5分鐘，在室溫下)集結。移除上清液，且將細胞再懸浮於100 μL固定/滲透緩衝液中，且在2-8℃下避光培育培養盤30分鐘。一旦培育完成，則使用擺動斗式離心機(500 rcf，5分鐘，在室溫下)使細胞集結。移除上清液，且細胞用250 μL洗滌緩衝液再懸浮，重複此總共2次洗滌。在最終洗滌步驟之後，使細胞集結，移除上清液，且再懸浮於50 μL初級抗體溶液中。將培養盤密封且在2-8℃下避光培育45分鐘。一旦完成，則使用擺動斗式離心機(500 rcf，5分鐘，在室溫下)使細胞集結。移除上清液，且細胞用250 μL洗滌緩衝液再懸浮，重複此總共2次洗滌。在最終洗滌步驟之後，使細胞集結，移除上清液，且再懸浮於50 μL二級抗體溶液中。將培養盤密封且在2-8℃下避光培育45分鐘。一旦完成，則使用擺動斗式離心機(500 rcf，5分鐘，在室溫下)使細胞集結。移除上清液，且細胞用250 μL洗滌緩衝液再懸浮，重複此總共2次洗滌。在最終洗滌步驟之後，使細胞集結，移除上清液，且再懸浮於200 μL洗滌緩衝液中，並且藉由流動式細胞量測術獲取資料。
藉由轉染HEK293F細胞，用劑量滴定曲線，以及進行抗體染色評定modRNA LNP藥品之活體外表現(IVE)，該等抗體為對三聚RSV F-蛋白具有特異性的RSVmab及對總RSV F-蛋白具有特異性的L4-6。已顯示此等抗體識別A-病毒株及B-病毒株RSV F-蛋白，且用於利用滲透或非滲透條件之分析中以評定RSV F-蛋白之總細胞含量與細胞表面含量。所量測之陽性細胞% (2,000奈克/孔輸入)及藥品批次之劑量反應曲線的EC50展示於表25中。 表 25 . 藥品 IVE 結果
項目 測試物品 RSVF- 蛋白質細胞定位 抗體 EC50 ( 奈克/ 孔) 陽性細胞% (2000 奈克/ 孔)
1 含有modRNA_847A_之LNP 細胞表面/TGN RSV mab1 131 89
L4-6 33 99
2 含有modRNA_847B_之LNP 細胞表面/TGN RSV mab1 187 89
L4-6 95 94
實例 13. 調配於 LNP 中之 RSV F modRNA 的製備LNP調配物含有2種功能性脂質ALC-0315及ALC-0159，以及2種結構脂質DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼)及膽固醇。4種脂質之物理化學特性及結構展示於下表26中。
根據美國專利9737619 (PCT公開案第WO2015/199952號)及美國專利10166298 (WO 2017/075531)及WO2020/146805 (其各自以全文引用之方式併入本文中)中所描述之通用程序來製備及測試脂質奈米粒子。簡言之，陽離子脂質、DSPC、膽固醇及PEG-脂質以約47.5:10:40.7:1.8之莫耳比溶解於乙醇中。 表 26. LNP 調配物中之 脂質
脂質(CAS 號) 分子量[Da] 分子式 物理狀態與儲存條件 化學名稱與結構
陽離子脂質 ALC-0315 (不適用) 766 C 48H 95NO 5液體(油) -20℃ (4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)
PEG-脂質 ALC-0159 (1849616-42-7) 約2400-2600 C 30H 60NO(C 2H 4O) nOCH 3n=45-50 固體 -20℃ 2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二(十四烷基)乙醯胺
DSPC (816-94-4) 790 C 30H 88NO 8P 固體 -20℃ 1,2-二硬脂醯基- sn-甘油基-3-磷酸膽鹼
膽固醇(57-88-5) 387 C 27H 46O 固體 -20℃
CAS=化學文摘社(Chemical Abstract Service)；DSPC=1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼
實例 14. 免疫反應 ( 活體內實驗 )在第0天及第21天，以不同劑量，對雌性BALB/c小鼠免疫接種WO2017/109629中所描述的呈二價蛋白質次單元型式(RSV 847A + 847B)之RSV融合前F (874)或本文所描述的呈單價(RSV 847A)或二價(RSV 847A + 847B)形式之modRNA-LNP調配物。藉由量測RSV中和抗體反應及RSV F特異性T細胞反應來評估免疫原性。在第21天及第35天(劑量2後(PD2) 2週)收集血清用於RSV中和分析，且在第35天(PD2 2週)收集脾臟用於T細胞分析(ELISpot及細胞內細胞介素染色ICS分析)。
中和分析RSV微量中和分析為使用A549細胞(人類肺泡基底上皮細胞)進行之3天分析，其用於量測血清中中和RSV活性從而預防宿主細胞單層感染之功能性抗體。在第0天，以2.5×10 4個細胞/孔將A549細胞(人類肺泡基底上皮細胞；ATCC，目錄號CCL-185)接種於96孔組織培養物處理的培養盤中，且培育至少20小時，以形成匯合單層。在第1天，將稀釋的病毒(RSV A，M37；RSV B，B18537；500 FFU/孔)添加至所製備的熱滅活測試血清之3倍連續稀釋液中，重複兩次，且培育1小時，以使抗體與病毒結合。接著，將中和反應轉移至所製備的A549細胞單層上且培育2小時。在隔夜培育(至少16小時)之前，將額外培養基補充至培養盤上。在第2天，培養盤用甲醇固定且用小鼠抗RSV F (Pfizer，L4-6)初級抗體染色，隨後用Alexa 488螢光標記之二級抗體染色以偵測病毒灶。50%中和力價計算為與僅含有病毒之孔相比50%病毒被中和之最後血清稀釋度倒數。力價報導為各樣品之兩個重複力價之幾何平均力價(GMT)。分析力價範圍為20至43,740。將力價＞43,740之任何樣品預稀釋且重複以擴大力價上限。低於偵測下限(LLOD)之任何樣品均以LLOD 20報導。
T 細胞 反應量測藉由在RSV F (A+B)肽池存在下離體刺激脾細胞以活化抗原特異性T細胞中各種細胞介素(諸如IFN-γ)之產生來評定疫苗誘導之針對RSV F的T細胞反應。可藉由ELISpot (表示為每一百萬細胞之斑點形成細胞SFC)來量測分泌在細胞外部的細胞介素，或可阻斷細胞內部之細胞介素分泌，藉由ICS量測(表示為表現細胞介素之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之百分比)。
在ELISpot之情況下，活化T細胞所分泌的細胞介素IFN-γ被塗覆至微量盤上孔底之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上的抗IFN-γ抗體捕獲。所捕獲IFN-γ藉由另一非競爭性生物素標記之抗IFN-γ二級抗體顯色為斑點，隨後使用鏈黴抗生物素蛋白-鹼性磷酸酶(ALP)結合物及受質溶液硝基藍四唑鎓及5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸(BCIP/NBT-plus)進行酶促顏色反應，其產生深紫色沉澱或斑點。使用Mabtech小鼠IFN-γ ELISpot PLUS套組(ALP)來量測T細胞IFN-γ反應，且其表示為斑點形成細胞(SFC)/百萬細胞。
ICS染色可偵測在抗原肽刺激之後在CD4+及CD8+ T細胞中產生的多種細胞介素，包括IFN-γ。在具有培養基-DMSO (未刺激)或表示RSV F A+B之特定肽池(15aa，11aa重疊，2 µg/mL/肽)之cRPMI中，在37℃下，在抗CD107a APC抗體及蛋白質轉運抑制劑GolgiPlug及GolgiStop存在下，離體培養脾細胞之單細胞懸浮液(2×10 6個細胞/孔) 5小時。在刺激之後，將脾細胞與針對表面蛋白質CD19、CD3、CD4、CD8、CD44之螢光結合抗體一起培育(25 ± 5分鐘，在18-25℃下)，隨後固定及滲透且針對細胞內蛋白IFN-γ、TNF-α、IL-2及CD40L/CD154進行染色(25 ± 5分鐘，在18-25℃下)。在染色之後，洗滌細胞且再懸浮於FC緩衝液中。在LSR Fortessa上收集細胞且藉由FlowJo (10.7.1)分析資料。結果為減去背景(培養基-DMSO)的，且展示為表現細胞介素之CD4+ T細胞及CD8+ T細胞之百分比。
第35天(PD2 2週)之中和分析結果揭露，對小鼠免疫接種呈單價RSV 847A或二價形式RSV 847A及847B之RSV 847的modRNA-LNP調配物誘導針對RSV A及RSV B兩者之強力中和抗體反應，該中和抗體反應與二價蛋白質次單元型式相比更高(圖1A及圖1B、表27)。此外，由modRNA-LNP之二價調配物RSV847A+847B誘導之RSV B中和反應比單價調配物RSV847A的反應更高(圖1B、表27)，證實人類中之最佳免疫反應需要RSV 847 modRNA疫苗之二價型式。
吾人接下來評估在小鼠中由此等RSV 847之modRNA-LNP調配物誘導之T細胞反應。IFN-γ ELISpot結果顯示，RSV 847 modRNA疫苗誘導強力T細胞反應，趨勢與RSV中和反應類似(圖1C、表27)。此外，ICS分析結果揭露，RSV 847 modRNA疫苗以劑量依賴性方式誘導高頻率之F特異性的表現IFN-γ之CD4+ T細胞以及CD8+ T細胞(圖1D及圖1E、表27)。值得注意的是，由二價調配物(RSV 847A + 847B)誘導之RSV A+B F特異性T細胞反應比單價調配物(RSV 847A)高，進一步證實RSV 847之二價型式誘導更高量值的T細胞反應，與中和反應類似。
總而言之，小鼠研究結果證明與蛋白質次單元疫苗相比，RSV融合前F構築體之modRNA-LNP調配物的免疫原性更高。 表 27. 小鼠中由蛋白質次單元及 RSV 融合前 F 之 modRNA-LNP 調配物 (847) 誘導之免疫反應
分析結果( 單位) 組 鹽水 0.5 µg 下RSV 847 A+B 次單元 1.0 µg 下RSV 847 A modRNA 0.5 µg 下RSV 847 A modRNA 0.2 µg 下RSV 847 A modRNA 1.0 µg 下RSV 847 A+B modRNA 0.2 µg 下RSV 847 A+B modRNA
RSV A 50% 中和抗體 幾何平均值 40 415 32776 34743 5781 36349 7351
STDEV 8 2554 22871 30468 4498 27605 7629
RSV B 50% 中和抗體 幾何平均值 29 429 27158 17077 3461 81593 16495
STDEV 8 4045 22737 19634 5246 85120 18874
IFN-γ ELISpot (SFC/10 6 細胞) 中位數 0 NA 1386 1500 450 2608 1194
STDEV 2 NA 368 468 67 469 464
IFN-γ+ CD4+ T 細胞(%) 中位數 0.00 NA 0.23 0.14 0.08 0.47 0.16
STDEV 0.00 NA 0.05 0.06 0.03 0.09 0.08
IFN-γ+ CD8+ T 細胞(%) 中位數 0.00 NA 1.66 1.20 0.31 2.08 0.68
STDEV 0.00 NA 0.49 0.43 0.06 0.52 0.35
NA：未分析
實例 15. RSV F saRNAsaRNA合成經由活體外轉錄(IVT)進行且藉由超濾/透濾(UFDF-1)純化。接著，saRNA被酶促加帽且藉由層析及最終UFDF-2純化，隨後最終過濾且分配。 表 28. 按次序包含 5' 帽 - 5' UTR-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4- 次基因體啟動子 -RSV [ORF]- 3' UTR-polyA 尾之 RSV F 847A saRNA 構築體 ( 編碼具有 SEQ ID NO: 4 之 RSV F 蛋白 )
RNA 構築體 起點 [SEQ ID:15] 終點 [SEQ ID: 15] SEQ ID
5' -CAP 1 1 -
5' -UTR 2 45 52
NSP1 46 1650 55
NSP2 1651 4032 56
NSP3 4033 5703 57
NSP4 5704 7527 58
次基因體啟動子 7528 7562 54
RSV [ORF] 7563 9290 11
3'-UTR 9291 9407 24
Poly-A 尾 9408 9487 26
表 29 . 按次序包含 5' 帽 - 5' UTR-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4- 次基因體啟動子 -RSV [ORF]- 3' UTR-polyA 尾之 RSV F 847B saRNA 構築體 ( 編碼具有 SEQ ID NO: 6 之 RSV F 蛋白 )
RNA 構築體 起點 [SEQ ID:16] 終點 [SEQ ID: 16] SEQ ID
5' -CAP 1 1 -
5' -UTR 2 45 52
NSP1 46 1650 55
NSP2 1651 4032 56
NSP3 4033 5703 57
NSP4 5704 7527 58
次基因體啟動子 7528 7562 54
RSV [ORF] 7563 9290 12
3'-UTR 9291 9407 24
Poly-A 尾 9408 9487 26
實例 16. RSV 抗原本發明之RSV抗原/多肽、RSV DNA及RSV RNA之序列提供於表30-32中。序列可包含任何終止密碼子，包括但不限於表中所提供之終止密碼子。 表 30 . RSV 多肽
ID SEQ ID NO:
原生RSV A2 之全長F0 (GenBank GI: 138251 ；Swiss Prot P03420)胺基酸 1
原生RSV B 之全長F0 (18537 病毒株；GenBank GI: 138250 ；Swiss Prot P13843)胺基酸 2
RSV A WT F胺基酸 3
RSV A 847 F胺基酸 4
RSV B WT F胺基酸 5
RSV B 847 F胺基酸 6
表 31. RSV DNA
ID SEQ ID NO:
RSV A WT FDNA TGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 3) 7
RSV A 847 FDNA TGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 4) 8
RSV B WT FDNA TGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 5) 9
RSV B 847 FDNA TGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 6) 10
表 32. RSV RNA
ID SEQ ID NO:
RSV 847A FRNA  UGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 4) 11
RSV 847B FRNA   UGA終止密碼子(胺基酸SEQ ID NO: 6) 12
847A_modRNA 13
847B_modRNA 14
saRNA 847A 15
saRNA 847B 16
實例 17 ： 調配於 LNP 中之編碼四種 HA 蛋白的四價流行性感冒核苷經修飾之 RNA 與包含來自 RSV 亞型 A 及 B 之融合前 F 蛋白的 RSV 二價次單元疫苗候選物之組合的臨床前試驗進行臨床前研究以測試小鼠模型中含有流行性感冒病毒及呼吸道融合性病毒(RSV)抗原之組合疫苗候選物之免疫原性。在此研究中使用之流行性感冒疫苗材料為推薦用於2022-23北半球(NH)季節的調配於脂質奈米粒子(LNP)中之編碼四種血球凝集素(HA)蛋白的四價流行性感冒核苷經修飾之RNA (modRNA)疫苗候選物，或特許NH 2022-23輔助流行性感冒疫苗比較物(Fluad)。在此研究中使用之RSV二價次單元疫苗候選物包括來自RSV亞型A及B之融合前F蛋白。相隔4週用兩個劑量以下各者對小鼠(10隻動物/組)進行免疫接種：獨立的流行性感冒或RSV疫苗材料，或候選呼吸道疫苗之組合(在注射之前混合或在各腿中分開投與)，以評估免疫原性之潛在干擾。使用2.5µg RSV疫苗製劑及1.2 µg流行性感冒modRNA疫苗製劑，其等同於各疫苗候選物在60+群體中預期人類劑量之1/50。使用2.4 µg Fluad對照(人類劑量之1/25)。使用在初打後第21天及在第42天(加打後第14天)收集之血清評估針對RSV亞型A及B及針對四種流行性感冒病毒株中之各者的中和力價。動物研究組展示如下： 表 33
組# 疫苗製劑 劑量水平 劑量體積/ 途徑
1 鹽水 - 50 µl / IM
2 四價流行性感冒modRNA 1.2 µg 50 µl / IM
3 二價RSV次單元 2.5 µg 50 µl / IM
4 二價RSV次單元與四價流行性感冒modRNA (床邊混合物) 2.5 µg (RSV) + 1.2 µg (流感) 50 µl / IM
5 二價RSV次單元及四價流行性感冒modRNA (在各腿中分開投與) 2.5 µg (RSV) 1.2 µg (流感) 腿#1中50 µl/ IM RSV 腿#2中50µl/IM流感
6 二價RSV次單元及Fluad (NH 22-23) (在各腿中分開投與) 2.5 µg (RSV) 2.4 µg (Fluad) 腿#1中50 µl/ IM RSV 腿#2中50 µl/IM Fluad
7 Fluad (NH 22-23) 2.4 µg 20 µl / IM
與單獨RSV疫苗相比，在小鼠中在劑量1後3週(圖7)或在劑量2後2週(圖9)，流行性感冒modRNA/RSV次單元組合疫苗候選物引起類似或較高水平的針對RSV亞型A及B之病毒中和抗體。當RSV次單元疫苗與特許輔助流行性感冒疫苗比較物Fluad組合時，與單獨RSV疫苗相比，引發較低水平的針對RSV A及B亞型兩者之中和抗體。
圖7描繪相隔4週用2個劑量以下疫苗製劑對Balb/c小鼠進行IM免疫接種的資料：2.5 µg二價RSV次單元疫苗；2.5 µg RSV次單元疫苗與1.2 µg四價modRNA流感疫苗組合(在注射之前混合或在各腿中分開給與)，或2.5 µg RSV次單元疫苗與2.4 µg特許輔助四價流行性感冒疫苗比較物Fluad組合(在各腿中分開給與)。使用在劑量1後3週第21天(圖7)或在劑量2後2週第42天(圖9)收集之血清評估針對RSV亞型A及B之病毒中和反應。
在劑量1後3週(圖8)及劑量2後2週(圖10),流行性感冒modRNA/RSV次單元組合疫苗候選物具有與單獨四價modRNA流行性感冒疫苗可比的免疫原性。無論流行性感冒及RSV疫苗在同一腿中共投與或注射至小鼠分開的腿中，對流行性感冒病毒株中之各者之中和力價均可比。總體而言，此等資料指示小鼠中流行性感冒modRNA及RSV次單元組合疫苗之免疫原性無干擾。
圖8描繪相隔4週用2個劑量以下疫苗製劑對Balb/c小鼠進行IM免疫接種的資料：1.2 µg四價modRNA流感疫苗、1.2 µg四價modRNA流感疫苗與2.5 µg RSV次單元疫苗組合(在注射之前混合或在各腿中分開給與)，或單獨或與2.5 µg RSV次單元疫苗組合(在各腿中分開共投與)給與的2.4 µg特許輔助四價流行性感冒疫苗比較物Fluad。使用第21天(劑量1後3週)收集之血清量測針對四種流行性感冒疫苗病毒株之病毒中和反應。
圖10描繪相隔4週用2個劑量以下疫苗製劑對Balb/c小鼠進行IM免疫接種的資料：1.2 µg四價modRNA流感疫苗、1.2 µg四價modRNA流感疫苗與2.5 µg RSV次單元疫苗組合(在注射之前混合或在各腿中分開給與)，或單獨或與2.5 µg RSV次單元疫苗組合(在各腿中分開共投與)給與的2.4 µg特許輔助四價流行性感冒疫苗比較物Fluad。使用第42天(劑量2後2週)收集之血清量測針對四種流行性感冒疫苗病毒株之病毒中和反應。
實例 18 ： 評估呼吸道組合疫苗候選物在 60 歲及更大年齡之成年人中之安全性、耐受性及免疫原性的研究流行性感冒、RSV及SARS-COV-2病毒為共循環感染。最近發現RSV疫苗RSVpreF對老年人中之RSV相關LRTI有效。同時投與針對此等呼吸道病毒感染之疫苗潛在地減少對多次保健或藥房問診之需求且可改善疫苗吸收。利用RSVpreF及qIRV之組合疫苗潛在地涉及在保健提供者問診之1次注射。除安全性及耐受性以外，組合疫苗接種之研究亦可用於研究潛在免疫干擾。
本發明研究將研究投與組合之RSVpreF與qIRV以評估安全性、耐受性及免疫干擾可能性。此評估最初將在≥60歲之健康參與者中作為1b期子研究進行，標記為子研究A。預期該子研究提供有用資料以告知RSVpreF與基於mRNA之疫苗組合的未來疫苗研究，且可添加其他子研究。
如實例3中所描述，「RSVpreF」組合物包括120 μg RSVpreF，無任何佐劑。RSVpreF呈凍乾白色餅狀物供應，封裝在具有橡膠塞、鋁外封口及易拉蓋之2 mL透明玻璃小瓶中。其用注射用無菌水稀釋劑之PFS復原。
「qIRV」組合物係指1劑編碼2種流行性感冒A病毒株及2種流行性感冒B病毒株之qIRV，60 µg (每一病毒株15 µg)，適合於向18至64歲之參與者投與及≥65歲之參與者，如實例2中所描述。qIRV呈白色至灰白色懸浮液供應在2 mL 1型透明玻璃小瓶中，用13 mm血清塞及13 mm鋁易拉密封件密封。填充體積為0.68 mL。
此研究經設計以評估當作為組合疫苗投與時及當單獨投與時針對RSV及流行性感冒之RSVpreF及經修飾RNA疫苗(qIRV)的安全性、耐受性及免疫原性。此3次問診研究最初將作為1b期、多中心、平行組、隨機、安慰劑對照、觀測者不知情之子研究進行。
≥60歲之健康成年人將1:1隨機化至組1：組合(RSVpreF + qIRV) (問診A101)，接著安慰劑(問診A102)，或組2：依序投與qIRV (問診A101)，接著RSVpreF (問診A102)，相隔1個月投與。在各研究點內隨機化將由3個年齡組(60-64、65-79及≥80歲)分層。
在遵從關鍵方案標準之參與者(可評估參與者)中，將在用組合RSVpreF+qIRV進行疫苗接種之後1個月各RSV子組(A或B)之中和力價(NT)的幾何平均值比(GMR)與使用單獨RSVpreF (依序投與組，問診A103)下相比，以描述與由單獨RSVpreF引發之免疫反應相比由組合RSVpreF+qIRV引發的免疫反應(亦即RSV A及RSV B NT)。
在遵從關鍵方案標準之參與者(可評估參與者)中，將在用組合RSVpreF+qIRV進行疫苗接種之後1個月的病毒株特異性HAI力價之GMR與單獨qIRV (依序投與組，問診A102)相比，以描述與由單獨qIRV引發之免疫反應相比由組合RSVpreF+qIRV引發之免疫反應(亦即針對WHO推薦重組或基於細胞之流行性感冒疫苗之當前季節性病毒株(2×A、2×B)的病毒株特異性HAI力價)。進一步評估可包括確定：(a)在各適用時間點各RSV子組(A或B)之NT之GMT；(b)在疫苗接種之前至疫苗接種之後的各適用時間點，各RSV子組(A或B)之NT之GMFR；(c)在各適用時間點病毒株特異性HAI之GMT；(d)在疫苗接種之前至疫苗接種之後的各適用時間點，病毒株特異性HAI之GMFR；(e)在各適用時間點病毒株特異性HAI力價≥1:40之參與者的百分比；(f)在疫苗接種之後的各適用時間點實現病毒株特異性HAI血清轉化之參與者的百分比(血清轉化定義為，在疫苗接種之前HAI力價＜1:10且在相關時間點≥1:40，或在疫苗接種之前HAI力價≥1:10且在相關時間點上升4倍)；(g)在各適用時間點具有HAI 複合反應之參與者的百分比(複合反應定義為，對疫苗中包括之所有4種流行性感冒病毒株的HAI力價≥1:40)；及(h)在各適用時間點具有HAI複合血清轉化之參與者的百分比(複合血清轉化定義為，疫苗中包括之所有4種流行性感冒病毒株之血清轉化)。
出於此方案之目的，研究干預係指以下產品： 組合RSVpreF + qIRV RSVpreF + qIRV，其為以下疫苗候選物之組合：
120 µg含有2種來自病毒子組A及B之等量穩定RSV融合前F抗原之RSVpreF 60 µg qIRV，亦即編碼針對流行性感冒季節推薦之4種病毒株之HA (2種A病毒株及2種B病毒株，以每一病毒株15 µg之劑量) RSVpreF 120 µg含有2種來自病毒子組A及B之等量穩定RSV融合前F抗原之RSVpreF qIRV 60 µg qIRV，亦即編碼針對流行性感冒季節推薦之4種病毒株之HA (2種A病毒株及2種B病毒株，以每一病毒株15 µg之劑量)
安慰劑為注射用0.9%生理食鹽水。所有研究干預均作為IM注射投與至三角肌，較佳非優勢臂。
子研究A (SSA)研究當組合時(RSVpreF+qIRV)及當單獨投與時RSVpreF及qIRV之安全性、耐受性及免疫原性。≥60歲之健康成年人接受組合疫苗，隨後1個月後接受安慰劑注射，或依序投與qIRV疫苗，隨後1個月後接受RSVpreF疫苗。組合疫苗為床邊混合物，RSVpreF凍乾餅狀物經水復原，隨後與qIRV混合，得到1.0 mL之最終注射體積。在依序投與組中，RSVpreF凍乾餅狀物經注射用水復原，得到0.5 mL之最終注射體積。
子研究B (SSB)研究RSVpreF+qIRV之2種調配物，該等調配物之體積及重量莫耳滲透濃度不同，因為可注射產品展現功效、安全性及/或穩定性有時需要開發高滲透壓調配物，但此可能影響耐受性。第一組合為與SSA中相同之調配物。第二組合為床邊混合物，RSVpreF凍乾餅狀物直接經qIRV復原，得到0.5 mL之最終注射體積。0.5 mL直接復原組合將產生高滲性(855 mOsm/kg)溶液。評估此等組合之安全性、耐受性及免疫原性，目的為選擇一種調配物用於進一步研究。為了更好地評估年齡/性別之影響與研究干預新調配物之耐受性之間的關係，研究群體包括50歲及以上老年人。
3.1. 研究設計概述 ： 子研究 A.子研究A為針對RSV及流行性感冒之RSVpreF及核苷經修飾之RNA疫苗(qIRV)在作為組合疫苗(RSVpreF+qIRV)投與時及在單獨投與時的1b期、單點、平行組、隨機、安慰劑對照、觀測者不知情之子研究。大致250名(n=125名/組)≥60歲之健康成年人1:1隨機化至：•組1：組合(RSVpreF + qIRV) (問診A101)，接著安慰劑(問診A102)，或•組2：依序投與qIRV (問診A101)，接著相隔1個月投與RSVpreF (問診A102)。在研究點內隨機化由3個年齡組(60-64、65-79及≥80歲)分層。存在3次預定研究問診，各相隔1個月(圖1)。用在疫苗接種之前在第1次問診(A101)及第2次問診(A102)及在第3次問診(A103)時收集之血液樣品評估免疫原性。在2個月時收集組合RSVpreF+qIRV組之血液樣品以評估RSV與流行性感冒。在各疫苗接種之後7天內發生的局部反應及全身事件記錄於電子日記裝置或智慧型手機app中。自簽署知情同意書起至研究完成收集AE及SAE 表 34. 子研究 A 設計方案 ， C5401001
健康成年人 ≥60歲 每組125，隨機化1:1 問診A101 (第1天) 疫苗接種1 問診A102 (第1個月) 疫苗接種1後28-35天為 疫苗接種2 問診A103 (第2個月) 疫苗接種2後28-35天 隨訪
組1：組合 RSVpreF + qIRV/安慰劑 組合(RSVpreF + qIRV) 安慰劑 抽血
組2： qIRV/RSVpreF qIRV RSVpreF 抽血
研究設計之討論 . 子研究 A. 子研究A經設計以評估當作為組合疫苗投與時及當單獨投與時針對RSV及流行性感冒之RSVpreF及經修飾RNA疫苗(qIRV)的安全性、耐受性及免疫原性。所選RSVpreF之劑量及調配物(120 μg，無任何佐劑)反映經批准之劑量。基於來自1期及3期研究之安全性及免疫原性資料選擇編碼2種A病毒株及2種B病毒株(每一病毒株15 µg)之qIRV 60 µg之劑量。≥60歲之健康成年人1:1隨機化至：•組1：組合(RSVpreF + qIRV) 1.0 mL (問診A101)，接著安慰劑(問診A102)，或•組2：依序投與qIRV (問診A101)，接著相隔1個月投與RSVpreF (問診A102)。在各研究點內隨機化由3個年齡組(60-64、65-79及≥80歲)分層。為確保季節性流行性感冒疫苗接種之當前建議之年齡組(參與者至少65歲)的廣泛代表，將對60至64歲不超過40名參與者進行疫苗接種。
子研究A中招收≥60歲之健康參與者，其患有先前存在之穩定疾病，穩定疾病定義為在招收之前6週期間不需要顯著改變療法或因疾病惡化而住院的疾病。
投與之研究干預. 下文呈現之子研究A及子研究B之所有研究干預均作為以單次注射在三角肌中給與之IM注射投與。子研究A疫苗組分(組合RSVpreF+qIRV及安慰劑) RSVpreF+qIRV為以下疫苗候選物之組合：•120 µg含有2種來自病毒子組A及B之等量穩定RSV融合前F抗原之RSVpreF；•60 µg qIRV，編碼針對流行性感冒季節推薦之4種病毒株之HA (2種A病毒株及2種B病毒株，以每一病毒株15 µg之劑量)。安慰劑為注射用0.9%生理食鹽水。
免疫原性分析 - 子研究 A及子研究B 子研究A ● 提供在疫苗接種之後1個月(組合RSVpreF+qIRV組中之問診A102至依序投與組中之問診A103)流行性感冒病毒株特異性HAI力價之GMR，及在疫苗接種之後1個月(組合RSVpreF+qIRV組中之問診A102至依序投與組中之問診A103) RSV NT之GMR，以及相關雙邊95% CI。
子研究 A 初級免疫原性.  在子研究A中，與依序投與組中之單獨RSVpreF或qIRV相比，在疫苗接種之後1個月，組合RSVpreF+qIRV組中展示對目標抗原之穩固免疫反應(RSV亞型及流行性感冒病毒株)(表35)。在RSVpreF投與之後1個月，RSV 50%中和GMT之比率≥0.79且雙邊95% CI之下限＞0.5。在qIRV之後1個月，對於qIRV中包括之4種流行性感冒病毒株，HAI GMT之比率≥0.74且雙邊95% CI之下限＞0.5。因此，與依序投與組中之單獨RSVpreF或qIRV相比，對於組合RSVpreF+qIRV，基於(GMR之雙邊描述性95% CI之下限＞0.5)所有6種抗原(RSV及HAI)均符合2倍界值。針對可評估RSV及qIRV免疫原性群體，藉由年齡組評估GMT及GMFR。然而，兩個年齡群(60-64及≥80歲)包括有限數目之參與者。總體而言，在年齡組之間中和力價方面不存在有意義的差異(表36)。針對A病毒株及B/維多利亞實現「血清保護」之參與者百分比達到＞60% (表35)。針對疫苗組中之A病毒株及依序組中之B病毒株實現血清保護之參與者百分比達到＞30% (表35)。
子研究 A 評估對研究干預之反應在子研究A中，組合組及依序投與組中展示對目標抗原(RSV亞型及流行性感冒病毒株)之穩固免疫反應。此等反應為可比的且特徵為： 對 RSV 之 免疫反應● RSV A與RSV B抗原均符合2倍非劣性界值(下限95% CI ＞0.5)。 ● RSV GMT展示組合RSVpreF+qIRV及單獨RSVpeF (依序投與)組中對RSV A及RSV B之穩固反應。 ● 在RSVpreF+qIRV (組合)之後及在單獨RSVpreF (依序投與)組之後，RSV A及RSV B NT GMFR ＞10。對於兩個疫苗組，在疫苗接種之後1個月組合RSV A/B NT之GMFR ≥11。 對 qIRV 之 免疫反應● 對於組合及單獨qIRV組，病毒株特異性HAI力價之GMFR展示高反應。基於2倍非劣性界值，滿足非劣性(LBCI ＞0.5)。 ● 在疫苗接種之後1個月，組合(範圍：24%至97%)及單獨qIRV (範圍：34%至93%)組之HAI血清轉化率類似。在組合(範圍：17%至116%)與單獨qIRV (13%至109%)組之間HAI血清保護類似。 表 35 在疫苗接種之後 1 個月 HAI 及 RSV 中和力價 GMT/GMR- 可評估 HAI 免疫原性群體及可評估 RSV 免疫原性群體
疫苗組 ( 隨機化 )
組合 (RSVpreF+qIRV)/ 安慰劑 單獨qIRV 或RSVpreF 比較
分析：病毒株或子組 N a GMT b (95% CI b) N a GMT b (95% CI b) GMR c (95% CI c)
HAI：H1N1 A/Wisconsin d 119 194 (164.3, 227.9) 112 238 (196.5, 288.7) 0.81 (0.632, 1.044)
HAI：H3N2 A/Darwin d 119 161 (136.9, 189.9) 112 219 (178.1, 269.0) 0.74 (0.567, 0.957)
HAI：B/Austria d 119 53 (44.6, 62.1) 112 56 (47.7, 66.3) 0.94 (0.741, 1.181)
HAI：B/Phuket d 119 22 (18.5, 26.4) 112 24 (20.2, 29.1) 0.91 (0.707, 1.174)
NT：RSV A e 119 16553 (14120.9, 19403.1) 112 19740 (16555.5, 23536.4) 0.84 (0.662, 1.062)
NT：RSV B e 119 11795 (9961.1, 13966.7) 112 14959 (12408.8, 18032.4) 0.79 (0.614, 1.013)
縮寫：GMR=幾何平均值比；GMT=幾何平均力價；HAI=血球凝集抑制分析；LLOQ=定量下限；NT=中和力價。 註釋：HAI力價之LLOQ值為10，RSV A NT為242，且RSV B NT為99。低於LLOQ之分析結果設定成0.5×LLOQ。 a.     N=所說明分析在各別可評估免疫原性群體中具有有效及確定分析結果之參與者數目。 b.     藉由對力價之平均對數及對應CI求冪來計算GMT及雙邊CI (基於史都登氏t分佈(Student t distribution))。 c.     藉由對力價對數之平均差異(組合減去依序投與)及對應CI (基於史都登氏t分佈)求冪來計算GMR及雙邊CI。 d.     基於可評估之HAI免疫原性群體。 e.     基於可評估之RSV免疫原性群體。
表 36
藉由年齡組 ， 在疫苗接種之後 1 個月 HAI 及 RSV 中和力價 GMT/GMR- 可評估 HAI 免疫原性群體及可評估 RSV 免疫原性群體
疫苗組(隨機化)
組合 (RSVpreF+qIRV)/安慰劑 單獨qIRV或RSVpreF 比較
年齡組 分析：病毒株或子組 N a GMT b (95% CI b) N a GMT b (95% CI b) GMR c (95% CI c)
60-64 歲 HAI：H1N1 A/Wisconsin d 21 177 (115.3、270.7) 20 237 (161.3、347.8) 0.75 (0.428、1.300)
HAI：H3N2 A/Darwin d 21 140 (86.3、227.7) 20 184 (116.7、289.4) 0.76 (0.401、1.451)
HAI：B/Austria d 21 80 (53.0、120.7) 20 55 (35.6、83.8) 1.46 (0.825、2.600)
HAI：B/Phuket d 21 24 (14.6、38.0) 20 21 (13.2、32.6) 1.14 (0.603、2.154)
NT：RSV A e 21 17168 (11500.3、25629.5) 22 23282 (15431.2、35127.2) 0.74 (0.423、1.287)
NT：RSV B e 21 11738 (6944.1、19842.0) 22 17856 (12671.5、25161.9) 0.66 (0.357、1.211)
65-79 歲 HAI：H1N1 A/Wisconsin d 89 198 (164.2、239.9) 86 241 (191.7、303.7) 0.82 (0.612、1.106)
HAI：H3N2 A/Darwin d 89 158 (131.7、189.4) 86 227 (178.2、290.4) 0.69 (0.513、0.939)
HAI：B/Austria d 89 49 (40.2、58.7) 86 57 (47.3、68.7) 0.85 (0.655、1.109)
HAI：B/Phuket d 89 22 (18.3、27.3) 86 25 (20.2、30.6) 0.90 (0.673、1.196)
NT：RSV A e 89 16217 (13442.1、19563.6) 84 18994 (15458.4、23337.6) 0.85 (0.647、1.126)
NT：RSV B e 89 11872 (9855.5、14300.7) 84 14028 (11183.3、17596.0) 0.85 (0.632、1.132)
≥80 歲 HAI：H1N1 A/Wisconsin d 9 187 (93.3、373.4) 6 202 (61.5、661.2) 0.93 (0.267、3.215)
HAI：H3N2 A/Darwin d 9 274 (153.2、491.1) 6 226 (75.1、681.9) 1.21 (0.388、3.784)
HAI：B/Austria d 9 43 (22.0、85.0) 6 50 (15.4、165.3) 0.86 (0.248、2.961)
HAI：B/Phuket d 9 17 (6.9、42.8) 6 28 (9.4、85.2) 0.61 (0.169、2.170)
NT：RSV A e 9 18619 (10208.9、33957.5) 6 18482 (6908.0、49446.7) 1.01 (0.356、2.851)
NT：RSV B e 9 11187 (5471.6、22874.1) 6 19211 (6036.9、61133.6) 0.58 (0.171、1.985)
子研究 A 探索性免疫原性 RSV ： A 及 B 子組中和在可評估RSV免疫原性群體中，對於組合RSVpreF+qIRV及單獨RSVpreF (依序投與組)，自RSVpreF疫苗接種之前至之後1個月，RSV A及B 50% NT GMT實質上增加。對於RSV A及RSV B之50% NT，兩組自疫苗接種之前至疫苗接種之後1個月之GMFR類似(範圍：10.9至15.9)。在2個月時間點(僅針對組合組(RSVpreF+qIRV))，免疫反應保持升高。在mITT免疫原性群體中結果類似。
qIRV 中包括之 4 種流行性感冒病毒株的 HAI 力價 .對於可評估qIRV免疫原性群體，在疫苗接種之後1個月，H3N2及H1N1病毒株之HAI GMR最低，但＞0.73，LBCI＞0.56。對於組合RSVpreF+qIRV及單獨qIRV (依序投與)組，對H1N1及H3N2之HAI力價展示反應更高，且觀測到對B/Phuket反應最低，其次是B/Austria。單獨qIRV依序組中HAI GMFR較高，但B/Austria及B/Phuket GMFR類似地為最低。
年齡子組分析 -RSV NT 及 HAI 力價 .藉由年齡對可評估RSV及HAI免疫原性群體之子組分析展示跨越所有3個年齡組(60-64、65-79及≥80歲)，組合組中之免疫反應具有非劣性。
血清保護及血清轉化之差異 .組合RSVpreF+qIRV及單獨qIRV (依序投與組)之HAI力價血清保護(定義為HAI力價≥1:40)類似。針對H1N1 (97.5%)，組合RSVpreF+qIRV實現血清保護之參與者比例為最高，其次為H3N2 (96.6%)、B/Austria (80.7%)，且B/Phuket (44.5%)最低。在組合組中，跨越病毒株，≥44.5%參與者在疫苗接種之後1個月實現與血清保護相關之力價。在依序投與組中，跨越病毒株，≥46.4%參與者在疫苗接種之後1個月實現與血清保護相關之力價。對於接受組合(RSVpreF+qIRV)及qIRV之參與者，針對所有病毒株，各組之間的差異≤6.1%。
在疫苗接種之後1個月觀測到HAI力價血清轉化(定義為，若在疫苗接種之前HAI力價≥1:10，或若HAI ＜1:10，HAI ≥1:40，則自疫苗接種之前上升≥4倍)。在組合RSVpreF+qIRV組中，跨越病毒株，≥20.2%參與者在疫苗接種之後1個月實現與血清轉化相關之力價。在單獨qIRV (依序投與)組中，跨越病毒株，在疫苗接種之後1個月≥30.4%參與者實現與血清轉化相關之力價，其中觀測到B/Austria (-12.0%)、B/Phuket (-10.2%)及H1N1 (-9.7%)之差異最大。
在子研究A中，發現與單獨qIRV及單獨RSVpreF之依序投與相比，RSVpreF+qIRV之組合安全且耐受良好。藉由RSV A及B NT及病毒株特異性流行性感冒HAI力價所量測，組合疫苗引發穩固免疫反應，類似於由依序單獨投與之個別疫苗組分引發的免疫反應。
實例 19 ： 在 RSV 次單元免疫原組合物復原之後 modRNA 流感與 RSV 次單元免疫原組合物之組合證實在高達 30 ℃ 下穩定性持續至少 4 小時在RSV次單元免疫原組合物復原之後modRNA流感與RSV次單元免疫原組合物之組合證實在高達30℃下穩定性持續至少4小時。在較佳實施例中，在RSV次單元免疫原組合物復原之後觀測到的高分子量物種之百分比小於或等於25%，且更佳小於10%。
此研究經設計以直接檢查經qIRV mRNA復原之RSV疫苗之復原後行為及使用中之穩定性。此組合將產生高滲性(+800 mOsm/Kg)溶液且自安全性及耐受性角度進行評估。
下表中列出復原(共調配)研究中待使用之四價流行性感冒mRNA疫苗及RSV二價疫苗材料。 表 37
用途 材料/ 組分 描述
活性DP (四價流行性感冒) PF-07871992 10 mM Tris緩衝液、300 mM蔗糖(pH 7.4)中0.12 mg/ml流感mRNA
活性DP (RSV二價) PF-06928316 120 µg RSV二價抗原、1.15 mg Tris、11.3 mg蔗糖、22.5 mg甘露糖醇、1.1 mg NaCl、0.08 mg聚山梨醇酯80 (PS80)(pH 7.4)
Luer-lok注射器 1 mL聚碳酸酯注射器 拋棄式無菌聚碳酸酯；1 mL
不鏽鋼針(用於抽取樣品) 21G×1''不鏽鋼針 21G 1'' Becton Dickenson (BD) PRECISIONGLIDE®
不鏽鋼針 (用於加蓋) 25G×1.5''不鏽鋼針 25G 1.5'' MONOJECT®
PF-07941314流行性感冒mRNA與RSV組合疫苗之計劃I期呈現包括： ● 四價流行性感冒mRNA疫苗： o 四價流行性感冒mRNA藥品，注射用懸浮液(60微克/小瓶) ● RSV二價疫苗： o RSV二價藥品，注射溶液用散劑(120微克/小瓶)
此研究評估所製備之四價流行性感冒及RSV二價組合疫苗在經復原且保持與小瓶接觸時之行為及穩定性。評估濃度係基於180 mcg之1期臨床劑量。下表38提供關於製備組態之資訊。為評估此製劑，設計此研究之劑量混合組態以製備177.4 mcg劑量作為主體製劑，如表39中所概述。 表 38 用於 IM 注射之 PF-07941314 組合疫苗之劑型組態的劑量計算
活性DP 最終劑量(mcg) 最終濃度 體積(mL)/ 製劑 小瓶/ 製劑
四價流行性感冒(0.12 mg/mL) 57.4 a 114.7 µg/mL 0.65 2
RSV二價(0.24 mg/mL) 120 b 240 µg/mL - 1
總計 177.4 354.7 µg/mL 0.68 1
a.     基於如下假設：復原之後0.68 mL劑量體積(用WFI執行時0.68 mL) b.     如意欲用於單獨RSV Vx，考慮用0.65 mL (類似於用0.65 mL(0.69 mL填充物)WFI復原)復原 註釋：流感之可提取體積為0.5 mL，因此需要2個小瓶/製劑；使用彙集之DP，需要33個小瓶
表 39 每一樣品之主體製劑計算
活性DP 度量值 主體製劑177.4 mcg 劑量
四價流行性感冒(0.12 mg/mL) 體積 0.65 mL
小瓶數目 33個小瓶(ARD，+1) = 34個小瓶
RSV二價(0.24 mg/mL) 體積(mL) 0.5 mL
小瓶數目 25個小瓶(ARD，+1) = 26個小瓶
組合疫苗 體積(mL) 0.68 mL 24個小瓶
直接自 -80 ℃ 冷凍機轉移四價流行性感冒小瓶且在室溫下在環境光下解凍。在完全解凍後，藉由倒置將小瓶內含物混合 10 次。隨後 RSV 二價疫苗用 qIRV 材料復原。進行觀測且在復原時記錄。將製備之溶液保持在 30℃ 下長達 4 小時 ， 其支持市售 RSV 疫苗溫度保持指導。在培育之後，觀測製劑之顆粒且分析品質屬性。即時提交等分試樣以藉由多個分析立即分析 (IVE 及 ELISA 除外，其進行快速冷凍且儲存於 -80℃ 下直至測試 ) 。 表 40
PF-07941314 流行性感冒mod mRNA 與RSV 組合疫苗(180 µg 劑量) 之測試結果
測試 研究標準 T0 30℃
T2H注射器 T4H注射器 T2H小瓶 T4H小瓶
HMMS (SEC) ≤25% 2.4 6.1 5.9 4.0 5.7
縮寫：HMMS=高分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
表 41
PF-07941314 流行性感冒mod mRNA 與RSV 組合疫苗(180 µg 劑量) 之測試結果
測試 研究標準 T0 30℃
T2H注射器 T4H注射器 T2H小瓶 T4H小瓶
外觀 白色至灰白色懸浮液 WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS
外觀 ( 可見粒子) 基本上不含可見粒子 EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP
pH 7.4 ± 0.5 7.3 7.2 7.3 7.3 7.3
RNA 含量(RiboGreen) T0 ± 20% 62 59 54 58 53
RNA 完整性(CGE ，藉由片段分析儀) ≥ 50%完整RNA 77 78 77 79 78
RNA 囊封(RiboGreen) ≥ 80% 93 88 83 86 83
LNP 尺寸(DLS) 40 - 120 nm 68 68 69 68 70
LNP PDI (DLS) ≤ 0.3 0.15 0.15 0.16 0.15 0.18
活體外表現 報導結果 A/Wisc：93% [22奈克/孔]， A/Darwin：95% [7奈克/孔]， B/Austria：91% [22奈克/孔]， B/Phuket：85% [67奈克/孔] A/Wisc：91% [22奈克/孔]， A/Darwin：94% [7奈克/孔]， B/Austria：89% [22奈克/孔]， B/Phuket：85% [67奈克/孔] A/Wisc：91% [22奈克/孔]， A/Darwin：94% [7奈克/孔]， B/Austria：85% [22奈克/孔]， B/Phuket：83% [67奈克/孔] A/Wisc：92% [22奈克/孔]， A/Darwin：96% [7奈克/孔]， B/Austria：85% [22奈克/孔]， B/Phuket：87% [67奈克/孔] A/Wisc：98% [22奈克/孔]， A/Darwin：97% [7奈克/孔]， B/Austria：86% [22奈克/孔]， B/Phuket：95% [67奈克/孔]
蛋白質濃度 T0 ± 20% (mcg/mL) 115 103 107 102 104
HMMS (SEC) ≤25% 2.4 6.1 5.9 4.0 5.7
LMMS (SEC) ≤5% 1.6 1.7 2.0 1.9 1.9
三聚體(SEC) ≥70% 96.0 92.2 92.1 94.1 92.4
相對融合前含量( 融合前F ELISA) a 50-150% 81 88 89 83 105
縮寫：WOWS=白色至灰白色懸浮液；EFVP=基本上不含可見粒子；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
實例 20 ： 確定在 TRIS- 蔗糖緩衝液中共調配次單元藥品及 LNP 囊封之 mRNA 及冷凍乾燥之可行性的研究 此研究之目標之一係確定在 Tris- 蔗糖緩衝液中共調配 RSV 次單元 ( 實例 3 中描述 ) 及 modFlu (Phuket 病毒株 ； 調配物例示性描述於實例 1 中 ) 及冷凍乾燥之可行性。目標包括評估凍乾前基質中之鹽 (NaCl) 對 RSV 及 mRNA-LNP 穩定性之影響；在冷凍乾燥之後；在復原之後 (sWFI 、 0.45% NaCl 及 0.9% NaCl 中 ) ；及穩定性 (2-8℃ 、 25℃ 及 35℃) 。 表 42
調配物 NaCl (mM) modRNA (mg/mL) 蔗糖 (%) RSV (mg/mL) PS80 (%) Tris (mM) Osmo (mOsm/kg)
凍乾前調配物
1 0 0.260 10.3 0.52 0.02 21.67 323
2 50.00 0.260 10.3 0.52 0.02 21.67 416
復原後調配物
用 WFI復原 用 0.45% NaCl復原 用 0.9% NaCl復原
1 0.00 0.12 5 0.24 0.01 10 149 292 435
2 23.08 0.12 5 0.24 0.01 10 192 335 478
表 43
填充體積(mL) 0.3
復原體積(mL) ( 總體積) 0.63 (0.65)
注射體積(mL) 0.5
關於包含modRNA流感及RSV次單元組合物之組合的組合物所測試之例示性冷凍乾燥循環參數展示如下： 表 44
製程步驟 目標循環參數 時間，小時 累計時間，小時
在-10℃下冷凍，包括退火，持續270分鐘 在130分鐘內斜坡至-45℃ 2.17 2.17
保持在-45℃ 60分鐘 1.00 3.17
在70分鐘內斜坡至-10℃ 1.17 4.33
保持在-10℃ 180分鐘 3.00 7.33
在70分鐘內斜坡至-45℃ 1.17 8.50
保持在-45℃ 60分鐘 1.00 9.50
冷卻冷凝器及抽真空 Tcond＜-50℃； 0.00 9.50
Pch=40 mT
初次乾燥 10分鐘內斜坡至-36℃ 0.17 9.67
保持在-36℃ 2700分鐘 45.00 54.67
二次乾燥 355分鐘內斜坡至35℃ 5.92 60.58
保持在35℃ 360分鐘 6.00 66.58
所製備及測試之調配物包括： a) 調配物1：凍乾前：21 mM Tris、10.3%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80 (pH 7.4)中0.26 mg/mL mRNA/0.52 mg/mL RSV F蛋白Vx b) 調配物1 凍乾後：10 mM Tris、5%蔗糖、0.01%聚山梨醇酯80 (pH 7.4)中0.12 mg/mL mRNA/0.24 mg/mL RSV F蛋白Vx c) 調配物2凍乾前：21 mM Tris、10.3%蔗糖、50 mM NaCl、0.02%聚山梨醇酯80 (pH 7.4)中0.26 mg/mL mRNA/0.52 mg/mL RSV F蛋白Vx d) 調配物2 凍乾後：10 mM Tris、5%蔗糖、23 mM NaCl、0.01%聚山梨醇酯80 (pH 7.4)中0.12 mg/mL mRNA/0.24 mg/mL RSV F蛋白Vx
關於上列四種調配物a)-d)及製備及測試之額外調配物之資料展示如下： 表 45
凍乾前
調配物 NaCl (mM) modRNA (mg/mL) 蔗糖 (%) RSV (mg/mL) PS 80 (%) Tris (mM) Osmo (mOsm/kg)
1 0 0.022 10.3 0.52 0.02 21.67 322
2 0 0.022 20.5 0.52 0.02 21.67 621
3 50.00 0.022 20.5 0.52 0.02 21.67 714
4 0 0.260 10.3 0.52 0.02 21.67 621
5 50.00 0.260 20.5 0.52 0.02 21.67 415
6 0 0.607 10.3 0.52 0.02 21.67 322
7 0 0.607 20.5 0.52 0.02 21.67 621
8 50.00 0.607 20.5 0.52 0.02 21.67 714
表 46
復原後
調配物 NaCl (mM) modRNA (mg/mL) 蔗糖(%) RSV (mg/mL) PS 80 (%) Tris (mM) Osmo (mOsm/kg)
1 0.00 0.01 5 0.24 0.01 10 150
2 0.00 0.01 9 0.24 0.01 10 288
3 23.08 0.01 9 0.24 0.01 10 331
4 0.00 0.12 5 0.24 0.01 10 193
5 23.08 0.12 9 0.24 0.01 10 193
6 0.00 0.28 5 0.24 0.01 10 150
7 0.00 0.28 9 0.24 0.01 10 288
8 23.08 0.28 9 0.24 0.01 10 331
以下為包含modRNA流感及RSV次單元免疫原組合物之組合之組合物的穩定性資料總結： A)來自無NaCl之測試調配物的結果，其中0.9%鹽水用作復原溶液 表 47
品質屬性(mRNA-LNP) BDP T0 T1W/35℃ T2W/35℃ T1M
5℃ 25℃ 35℃
外觀 白色至灰白色懸浮液、EFVP
pH 7.4 7.3 7.3 7.3
DLS 尺寸 63 75 75 75
PDI 0.09 0.13 0.11 0.16
Ribogreen 濃度(mg/mL) 0.26 0.12 0.13 0.13
囊封(%) 97 77 77 78
FA 83 62 74 68
IVE (%) 98 95 97 97
品質屬性(RSV)
濃度 540.4 247 230.3 227.7
相對融合前含量 111 89 90 81 88 85 80
以下為包含modRNA流感及RSV次單元免疫原組合物之組合之組合物的穩定性資料總結： B)來自具有NaCl之測試調配物的結果，其中0.9%鹽水用作復原溶液 表 48
品質屬性(mRNA-LNP) BDP T0 T1W/35℃ T2W/35℃ T1M
5℃ 25℃ 35℃
外觀 白色至灰白色懸浮液、EFVP
pH 7.3 7.3 7.3 7.2
DLS 尺寸 63 74 78 77
PDI 0.12 0.11 0.12 0.11
Ribogreen 濃度(mg/mL) 0.26 0.12 0.13 0.13
囊封(%) 97 72 70 71
FA 84 57 74 72
IVE (%) 97 97 97 98
品質屬性(RSV)
濃度 550.8 248.7 244.3 229.5
相對融合前含量 118 93 92 87 91 91 86
實例 21 ： RSV 次單元與流行性感冒 mRNA 組合藥品之描述及組成藉由在投與時將二價RSVpreF (847A及847B) (PF-06928316)及modRNA四價流行性感冒疫苗(Wisconsin、Phuket、Austria及Darwin) (PF-07871992)混合來製備用於肌肉內注射之RSVpreF次單元與流行性感冒mRNA組合疫苗(PF-07941314)，用於共投與。本實例描述共投與，其與例如描述共調配組合物之實例20不同。
藉由將兩個藥品RSVpreF及流行性感冒modRNA四價組合物(Wisconsin、Phuket、Austria及Darwin)混合來製備RSVpreF與流行性感冒mRNA組合組合物。RSVpreF組合物為一種無防腐劑之無菌凍乾粉末，其包含等量之兩種穩定原料藥蛋白質抗原847A及847B。在用於肌肉內注射之前，凍乾藥品用含有無菌水稀釋劑之預填充注射器復原。流行性感冒modRNA四價組合物為脂質奈米粒子(LNP)於水性低溫保護劑緩衝液中的無防腐劑無菌分散液，用於肌肉內注射。經無菌水復原之RSVpreF疫苗調配物為15 mM Tris緩衝液、37.5 mM NaCl、2.25%蔗糖、4.5%甘露糖醇及0.015% PS80中0.24 mg/ml藥品，pH 7.4。流行性感冒modRNA四價疫苗在10 mM Tris緩衝液、300 mM蔗糖(pH 7.4)中調配成0.12 mg/ml RNA。
各別疫苗、RSVpreF及流行性感冒mRNA之目標組成分別提供於表49及表50中。RSV稀釋劑之目標組成提供於表49中。 表 49
成分 量/ 劑量 (mg)
847A DS 活性成分 0.06
847B DS 活性成分 0.06
緩血酸胺鹼 緩衝劑 0.11
Tris-鹽酸鹽 緩衝劑 1.04
蔗糖 低溫保護劑 11.25
甘露糖醇 增積劑 22.50
聚山梨醇酯80 界面活性劑 0.08
氯化鈉 張力劑 1.1
注射用水 溶劑 q.s至0.5 mL
表 50 .           0.12 mg/mL 四價藥品 (PF-07871992) 組合物
成分名稱 等級/ 品質標準 功能 單位配方 (mg/mL) 標稱量或淨數量( 淨 毫克數/ 小瓶)
PF-07829855原料藥(Wisconsin) 內部規格 活性成分 0.03 0.015
PF-07871853原料藥(Darwin) 內部規格 活性成分 0.03 0.015
PF-07872963原料藥(Austria) 內部規格 活性成分 0.03 0.015
PF-07836259原料藥(Phuket) 內部規格 活性成分 0.03 0.015
ALC-0315 a 內部規格 功能性脂質 1.72 0.86
ALC-0159 b 內部規格 功能性脂質 0.21 0.11
DSPC c 內部規格 結構脂質 0.37 0.19
膽固醇 Ph. Eur.、NF 結構脂質 0.74 0.37
蔗糖 Ph. Eur.、NF 低溫保護劑 102.69 51.35
緩血酸胺(Tris鹼) Ph. Eur.、USP 緩衝劑組分 0.20 0.10
Tris (羥基甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris HCl) 內部規格 緩衝劑組分 1.32 0.66
注射用水 Ph. Eur.、USP、JP 溶劑 q.s. d至1.00 mL q.s. d至0.50 mL
a.     ALC-0315 = ((4-羥基丁基)氮二基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯) b.     ALC-0159 = 2-[(聚乙二醇)-2000]- N,N-二(十四烷基)乙醯胺 c.     DSPC = 1,2-二硬脂醯基- sn-甘油基-3-磷酸膽鹼 d.     q.s.為足量之縮寫，意謂足夠多的。
進行劑量驗證研究，以證明RSVpreF及流行性感冒modRNA四價組合物在混合用於投與時係相容的，且所有藥品及給藥溶液在足以進行劑量製備及投與操作的時段內均與投藥組分相容。如表52中詳述之劑量驗證研究設計係基於一種括號法，其經設計以支持180 µg (1:2比率之流行性感冒mRNA:RSVpreF)及210 µg ( 之流行性感冒mRNA:RSVpreF)之最低及最高最終臨床劑量。評估組合組合物在聚碳酸酯(PC)注射器、聚丙烯(PP)注射器及玻璃小瓶中保持在30℃下長達4小時之穩定性。藉由混合適當體積之個別疫苗且以單次注射組合疫苗投與來製備劑量。 表 51 用於 IM 注射之 PF-07941314 組合疫苗之劑型組態的劑量計算
180 µg 劑量( 組1) (1:2 流行性感冒:RSV ) 210 µg 劑量( 組2) (1:1.33 流行性感冒:RSV )
最終劑量(µg) 劑量體積(mL) 最終劑量(µg) 劑量體積(mL)
流行性感冒modRNA疫苗(0.12 mg/mL) 60 0.5 90 0.75
RSVpreF (0.24 mg/mL) 120 0.5 120 0.5
總計 180 1 210 1.25
根據預定實驗計劃測試樣品且藉由分析進行分析。將給藥溶液樣品與研究標準及其各別T0樣品進行比較。 表 52 PF-07941314 流行性感冒 mod mRNA 與 RSV 組合疫苗組 1 [180 µg 劑量 (1:2) 製劑 ] 之給藥驗證結果
測試 研究標準 T0 30℃
T2H PP T4H PP T2H PC T4H PC T2H 小瓶 T4H 小瓶
外觀 白色至灰白色懸浮液 WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS
外觀 ( 可見粒子 ) 基本上不含可見粒子 EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP
pH 7.4 ± 0.5 7.3 7.3 7.2 7.2 7.3 7.3 7.3
RNA 含量 ( 螢光 ) T0 ± 20% 62 59 61 59 54 58 53
RNA 完整性 (CGE ，藉由片段分析儀 ) ≥50%完整RNA 77 79 77 78 77 79 78
RNA 囊封 ( 螢光 ) ≥80% 93 90 86 88 83 86 83
LNP 尺寸 (DLS) 40 - 120 nm 68 69 69 68 69 68 70
LNP PDI (DLS) ≤0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
活體外表現 報導結果 A/Wisc：93%，A/Darwin：95%， B/Austria：91%，B/Phuket：85% A/Wisc：92%， A/Darwin：95%， B/Austria：90%， B/Phuket：86% A/Wisc：92%， A/Darwin：95%， B/Austria：89%， B/Phuket：86% A/Wisc：91%， A/Darwin：94%， B/Austria：89%， B/Phuket：85% A/Wisc：91%， A/Darwin：94%， B/Austria：85%， B/Phuket：83% A/Wisc：92%， A/Darwin：96%， B/Austria：85%， B/Phuket：87% A/Wisc：98%， A/Darwin：97%， B/Austria：86%， B/Phuket：95%
RSV 蛋白濃度 T0 ± 20% (mcg/mL) 115 aa 113 103 107 102 104
RSV HMMS (SEC) ≤25% 2.4 5.3 4.5 6.1 5.9 4.0 5.7
RSV LMMS (SEC) ≤5% 1.6 2.1 1.9 1.7 2.0 1.9 1.9
RSV 三聚體 (SEC) ≥70% 96.0 92.6 93.5 92.2 92.1 94.1 92.4
RSV 相對融合前含量 ( 融合前 F ELISA) 50-150% 81 94 80 88 89 83 105
縮寫：PP=聚丙烯；PC=聚碳酸酯；WOWS=白色至灰白色懸浮液；EFVP=基本上不含可見粒子；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
表 53 PF-07941314 流行性感冒 mod mRNA 與 RSV 組合疫苗組 2 [210 µg 劑量 (1: 1.33) 製劑 ] 之給藥驗證結果
測試 預期結果 T0 30℃
T2H PP T4H PP T2H PC T4H PC T2H 小瓶 T4H 小瓶
外觀 白色至灰白色懸浮液 WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS WOWS
外觀 ( 可見粒子 ) 基本上不含可見粒子(EFVP) EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP EFVP
pH 7.4 ± 0.5 7.2 7.2 7.3 7.2 7.2 7.2 7.2
RNA 含量 ( 螢光 ) T0 ± 20% 75 71 70 81 71 73 76
RNA 完整性 (CGE ，藉由片段分析儀 ) ≥ 50%完整RNA 81 83 80 81 81 81 81
RNA 囊封 ( 螢光 ) ≥ 80% 90 89 89 85 87 89 88
LNP 尺寸 (DLS) 40 - 120 nm 67 68 67 68 68 69 69
LNP PDI (DLS) ≤ 0.3 0.16 0.16 0.14 0.15 0.16 0.17 0.18
活體外表現 報導結果 A/Wisc：89%， A/Darwin：86%， B/Austria：88%， B/Phuket：80% A/Wisc：87%， A/Darwin：86%， B/Austria：87%， B/Phuket：79% A/Wisc：87%， A/Darwin：83%， B/Austria：88%， B/Phuket：77% A/Wisc：90%， A/Darwin：87%， B/Austria：87%， B/Phuket：74% A/Wisc：87%， A/Darwin：83%， B/Austria：83%， B/Phuket：71% A/Wisc：88%， A/Darwin：85%， B/Austria：82%， B/Phuket：74% A/Wisc：90%， A/Darwin：85%， B/Austria：80%， B/Phuket：71%
蛋白質濃度 T0 ± 20% (mcg/mL) 85 85 84 78 81 85 84
HMMS (SEC) ≤25% 1.7 4.6 6.1 11.7 7.7 4.2 3.1
LMMS (SEC) ≤5% 1.9 2.1 1.7 1.8 1.7 1.6 1.9
三聚體 (SEC) ≥70% 96.4 93.3 92.2 86.5 90.6 94.2 95.0
相對融合前含量 ( 融合前 F ELISA) 50-150% 90 96 95 90 100 107 96
縮寫：PP=聚丙烯；PC=聚碳酸酯；WOWS=白色至灰白色懸浮液；EFVP=基本上不含可見粒子；LNP=脂質奈米粒子；CGE=毛細管凝膠電泳；DLS=動態光散射；HMMS=高分子量物種；LMMS=低分子量物種；SEC=尺寸排阻層析
實例 22 ： 評估呼吸道組合疫苗候選物在老年人中之安全性、耐受性及免疫原性的研究 (C5401001)子研究B將研究不同體積及重量莫耳滲透濃度之RSVpreF + qIRV之2種調配物。將評估此等調配物之安全性、耐受性及免疫原性。
組合疫苗之調配物開發包括考慮所投與體積及張力兩者，以確定最終產物是否以安全及可耐受之方式實現所需作用。在一些情況下，超過600 mOsm/kg之理論臨限值的考慮因素係保證組合調配物內含有足夠抗原及賦形劑所必需的。
此為≥50歲之健康參與者中的1b期研究。子研究B將研究不同體積及重量莫耳滲透濃度之RSVpreF + qIRV之2種調配物。第一組合為床邊混合物，RSVpreF凍乾餅狀物經WFI復原且與qIRV混合，得到1.0 mL之最終注射體積(406 mOsm/kg之理論容積莫耳滲透濃度)。
第二組合為床邊混合物，RSVpreF凍乾餅狀物直接經qIRV復原，得到0.5 mL之最終注射體積。0.5 mL直接復原組合將產生高滲性(855 mOsm/kg)溶液，可能會影響注射部位之反應原性。
將評估此等組合之安全性、耐受性及免疫原性，目的為選擇一種調配物用於進一步研究。
子研究B將作為針對RSV及流行性感冒之RSVpreF及核苷經修飾之RNA疫苗(qIRV)在作為組合疫苗於1.0 mL調配物中投與時及在0.5 mL調配物中投與時的1b期、平行組、隨機、觀測者不知情之子研究進行。
≥50歲之健康成年人將1:1隨機化至組1：組合(RSVpreF + qIRV) 1.0 mL調配物；或組2：組合(RSVpreF + qIRV) 0.5 mL調配物。在研究點內隨機化將藉由6個年齡/性別組(女性50-64、女性65-79及女性≥80歲；男性50-64、男性65-79及男性≥80歲)分層。大致100名參與者將隨機化在50至64歲組，且100名≥65歲之參與者將隨機化。
子研究 B 之研究干預 表 54
組1 疫苗細節
組合1.0 mL (RSVpreF + qIRV) 疫苗組分 RSVpreF qIRV (modRNA)
2種來自病毒子組A及B之等量穩定RSV融合前F抗原 編碼針對流行性感冒季節推薦之4種病毒株之HA (2種A病毒株及2種B病毒株)
劑量調配物 RSV疫苗120微克/小瓶注射溶液用散劑 四價流行性感冒注射用懸浮液， 0.12 mg/mL (qIRV)
復原產物 無菌水作為注射用稀釋劑(0.65毫升/注射器) N/A
單位劑量強度 120 µg 60 µg
投與途徑 在兩種疫苗組合之後，將單一1 mL IM注射液給與至非優勢臂之三角肌(較佳)。
包裝及標記 RSVpreF呈凍乾白色餅狀物供應，封裝在具有橡膠塞、鋁外封口及易拉蓋之2 mL透明玻璃小瓶中。對於1.0 mL調配物，白色餅狀物經注射用無菌水稀釋劑之PFS (供應)復原且接著與qIRV懸浮液組合。 qIRV呈白色至灰白色懸浮液供應在2 mL 1型透明玻璃小瓶中，用13 mm血清塞及13 mm鋁易拉密封件密封。填充體積為0.68 mL。
組2 疫苗細節
組合0.5 mL (RSVpreF + qIRV) 疫苗組分 RSVpreF qIRV
2種來自病毒子組A及B之等量穩定RSV融合前F抗原 編碼針對流行性感冒季節推薦之4種病毒株之HA (2種A病毒株及2種B病毒株)
劑量調配物 RSV疫苗120微克/小瓶注射溶液用散劑 四價流行性感冒注射用懸浮液， 0.12 mg/mL (qIRV)
復原產物 qIRV懸浮液 N/A
單位劑量強度 120 µg 60 µg
投與途徑 在qIRV懸浮液與RSVpreF餅狀物組合之後，將單一0.5 mL IM注射液給與至非優勢臂之三角肌(較佳)。
包裝及標記 RSVpreF呈凍乾白色餅狀物供應，封裝在具有橡膠塞、鋁外封口及易拉蓋之2 mL透明玻璃小瓶中。對於0.5 mL調配物，白色餅狀物將用qIRV懸浮液直接復原。 qIRV呈白色至灰白色懸浮液供應在2 mL 1型透明玻璃小瓶中，用13 mm血清塞及13 mm鋁易拉密封件密封。填充體積為0.68 mL。
條項藉由以下枚舉條項描述本發明之若干示例性實施例： 1. 一種組合物，其包含：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，該第一RNA聚核苷酸包含編碼第一抗原之開放閱讀框架，該抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中該第一RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中；及(ii)呈融合前構形之第一RSV F蛋白三聚體。 2. 根據條項1之組合物，其進一步包含(iii)第二RNA聚核苷酸，該第二RNA聚核苷酸包含編碼第二抗原之開放閱讀框架，該第二抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段。 3. 根據條項1至2中任一項之組合物，其中該等抗原包含血球凝集素(HA)、或其免疫原片段或變異體。 4. 根據條項1至3中任一項之組合物，其中該等抗原各自包含來自流行性感冒病毒之不同亞型的HA或其免疫原片段。 5. 條項1至4中任一項之組合物，其進一步包含第三RNA聚核苷酸，該第三RNA聚核苷酸包含編碼包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段之抗原的開放閱讀框架。 6. 根據條項5之組合物，其中該第三抗原來自與該第一抗原及該第二抗原之流行性感冒病毒株不同的流行性感冒病毒。 7. 條項6之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸、該第二RNA聚核苷酸及該第三RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。 8. 條項7之組合物，其進一步包含第四RNA聚核苷酸，該第四RNA聚核苷酸包含編碼第四抗原之開放閱讀框架，該抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段。 9. 根據條項8之組合物，其中該第四抗原來自流行性感冒病毒，但來自與該第一抗原、該第二抗原及該第三抗原不同的流行性感冒病毒株。 10.   條項8之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸、該第二RNA聚核苷酸、該第三RNA聚核苷酸及該第四RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子中。 11.   條項1至10中任一項之組合物，其中該等RNA聚核苷酸以約相等比率存在。 12.   條項1至11中任一項之組合物，其中該等RNA聚核苷酸中之任一者包含經修飾之核苷酸。 13.   條項12之組合物，其中該經修飾之核苷酸係選自由以下組成之群：假尿苷、1-甲基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷及2'-O-甲基尿苷。 14.   條項1至13中任一項之組合物，其中各RNA聚核苷酸包含5'端帽、5' UTR、3' UTR及3'聚腺苷酸化尾。 15.   條項14之組合物，其中該5'端帽包含： 。 16.   條項14之組合物，其中該5' UTR包含SEQ ID NO: 1。 17.   條項14之組合物，其中該3' UTR包含SEQ ID NO: 2。 18.   條項14之組合物，其中該3'聚腺苷酸化尾包含SEQ ID NO: 3。 19.   條項1至18中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸具有大於約85%之完整性。 20.   條項1至19中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸具有大於85%之純度。 21.   條項1至20中任一項之組合物，其中該脂質奈米粒子包含20-60 mol%可離子化陽離子脂質、5-25 mol%中性脂質、25-55 mol%膽固醇及0.5-5 mol%經聚合物修飾之脂質。 22.   條項1至21中任一項之組合物，其中該陽離子脂質包含 。 23.   條項1至22中任一項之組合物，其中該經PEG修飾之脂質包含： 。 24.   條項1至23中任一項之組合物，其中該第一抗原為來自A型流行性感冒亞型H1之HA或其免疫原片段或變異體且該第二抗原為來自與該第一抗原不同之H1病毒株之HA或其免疫原片段或變異體。 25.   條項1至24中任一項之組合物，其中該第一抗原及該第二抗原為來自A型流行性感冒亞型H3之HA或其免疫原片段或變異體且其中兩種抗原來源於H3流行性感冒病毒之不同病毒株。 26.   條項1至25中任一項之組合物，其中該第一抗原及該第二抗原為來自A型流行性感冒亞型H1之HA或其免疫原片段或變異體且該第三抗原及該第四抗原來自A型流行性感冒亞型H3或其免疫原片段或變異體，且其中該第一抗原及該第二抗原來源於H1病毒之不同病毒株且該第三抗原及該第四抗原來自H3流行性感冒病毒之不同病毒株。 27.   條項1至26中任一項之組合物，其中至少該第一RNA聚核苷酸及該第二RNA聚核苷酸調配於單一脂質奈米粒子中。 28.   條項1至27中任一項之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸、該第二RNA聚核苷酸及該第三RNA聚核苷酸調配於單一脂質奈米粒子中。 29.   條項1至28中任一項之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸、該第二RNA聚核苷酸、該第三RNA聚核苷酸及該第四RNA聚核苷酸調配於單一LNP中。 30.   條項1至26中任一項之組合物，其中該等RNA聚核苷酸中之各者調配於單一LNP中，其中各單一LNP囊封編碼一種抗原之RNA聚核苷酸。 31.   條項30之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；且該第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中。 32.   條項30之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；該第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中；且該第三RNA聚核苷酸調配於第三LNP中。 33.   條項30之組合物，其中該第一RNA聚核苷酸調配於第一LNP中；該第二RNA聚核苷酸調配於第二LNP中；該第三RNA聚核苷酸調配於第三LNP中；且該第四RNA聚核苷酸調配於第四LNP中。 34.   條項1至33中任一項之組合物，其用於引發個體中針對流行性感冒之免疫反應。 35.   根據條項1至34中任一項之組合物，其中該第一RSV F蛋白為亞型A之F蛋白。 36.   根據條項1至35中任一項之組合物，其中該第一RSV F蛋白包含相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中該突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 103C、148C、190I及486S，較佳A103C、I148C、S190I及D486S之組合；(2) 54H、55C、188C及486S，較佳T54H、S55C、L188C及D486S之組合；(3) 54H、103C、148C、190I、296I及486S，較佳T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之組合；(4) 54H、55C、142C、188C、296I及371C，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之組合；(5) 55C、188C及486S，較佳S55C、L188C及D486S之組合；(6) 54H、55C、188C及190I，較佳T54H、S55C、L188C及S190I之組合；(7) 55C、188C、190I及486S，較佳S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(8) 54H、55C、188C、190I及486S，較佳T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(9) 155C、190I、290C及486S，較佳S155C、S190I、S290C及D486S之組合；(10) 54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之組合；(11) 54H、155C、190I、290C及296I，較佳T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之組合；及(12) 155C、190F、290C及207L，較佳S155C、S190F、S290C及V207L之組合。 37.   根據條項36之組合物，其中該第一RSV F蛋白包含相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中該突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 215P及486N，較佳S215P及D486N之組合；(2) 66E、215P及486N，較佳K66E、S215P及D486N之組合；(3) 66E、76V、215P及486N，較佳K66E、I76V、S215P及D486N之組合；及(4) 66E、67I、76V、215P及486N，較佳K66E、N67I、I76V、S215P及D486N之組合。 38.   根據條項1至37中任一項之組合物，其中該第一RSV F蛋白包含三聚域。 39.   根據條項1至37中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含呈融合前構形之第二RSV F蛋白三聚體。 40.   根據條項39之組合物，其中該第二RSV F蛋白為亞型B之F蛋白。 41.   根據條項39或40之組合物，其中該第二RSV F蛋白包含相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中該突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 103C、148C、190I及486S，較佳A103C、I148C、S190I及D486S之組合；(2) 54H、55C、188C、486S，較佳T54H、S55C、L188C及D486S之組合；(3) 54H、103C、148C、190I、296I及486S，較佳T54H、A103C、I148C、S190I、V296I及D486S之組合；(4) 54H、55C、142C、188C、296I及371C，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I及N371C之組合；(5) 55C、188C及486S，較佳S55C、L188C及D486S之組合；(6) 54H、55C、188C及190I，較佳T54H、S55C、L188C及S190I之組合；(7) 55C、188C、190I及486S，較佳S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(8) 54H、55C、188C、190I及486S，較佳T54H、S55C、L188C、S190I及D486S之組合；(9) 155C、190I、290C及486S，較佳S155C、S190I、S290C及D486S之組合；(10) 54H、55C、142C、188C、296I、371C、486S、487Q及489S，較佳T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q及D489S之組合；(11) 54H、155C、190I、290C及296I，較佳T54H、S155C、S190I、S290C及V296I之組合；及(12) 155C、190F、290C及207L，較佳S155C、S190F、S290C及V207L之組合。 42.   根據條項39至41中任一項之組合物，其中該第二RSV F蛋白包含相對於對應野生型RSV F蛋白之突變之組合，其中該突變之組合係選自由以下組成之群：(1) 215P及486N，較佳S215P及D486N之組合；(2) 66E、215P及486N，較佳K66E、S215P及D486N之組合；(3) 66E、76V、215P及486N，較佳K66E、I76V、S215P及D486N之組合；及(4) 66E、67I、76V、215P及486N，較佳K66E、N67I、I76V、S215P及D486N之組合。 43.   根據條項39至42中任一項之組合物，其中該第二RSV F蛋白包含三聚域。 44.   根據條項1至43中任一項之組合物，其中該第一RSV F蛋白三聚體為亞型A；其中該組合物進一步包含呈融合前構形之第二RSV F蛋白三聚體，該第二RSV F蛋白三聚體為亞型B。 45.   根據條項1至44中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含濃度在約20 mM與約250 mM之間的氯化鈉；(iii)濃度在約5 mg/mL與約100 mg/mL之間的蔗糖、甘露糖醇及甘胺酸中之至少一者；及(iv)緩衝液；其中該組合物之pH在約7與約8之間。 46.   根據條項1至45中任一項之組合物，其中該LNP呈液態且該第一RSV F蛋白三聚體經凍乾。 47.   根據條項46之組合物，其中該組合物之重量莫耳滲透濃度為最多500 mOsm/kg。 48.   根據條項1至47中任一項之組合物，其中藉由片段分析儀量測，各RNA具有至少50%完整性。 49.   根據條項1至48中任一項之組合物，其中各LNP具有至少80%囊封效率，持續至少4小時。 50.   根據條項1至49中任一項之組合物，其進一步包含濃度在約20 mM與約250 mM之間的氯化鈉；(iii)濃度在約5 mg/mL與約100 mg/mL之間的蔗糖、甘露糖醇及甘胺酸中之至少一者；及(iv)緩衝液；其中該組合物之pH在約7與約8之間。 51.   根據條項1至50中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸經純化且實質上不含污染物，包含短流產性RNA物種、長流產性RNA物種、雙股RNA (dsRNA)、殘留質體DNA、殘留活體外轉錄酶、殘留溶劑及/或殘留鹽。 52.   根據條項1至51中任一項之組合物，其中該RSV多肽經純化且實質上不含污染物。 53.   根據條項1至52中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。 54.   根據條項53之組合物，其中該佐劑與該第一RSV蛋白三聚體及/或該第二RSV蛋白三聚體結合。 55.   根據條項1至52中任一項之組合物，其中該組合物不包含佐劑。 56.   根據條項1至55中任一項之組合物，其中該佐劑。 57.   一種組合物，其包含：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其包含編碼第一抗原之開放閱讀框架，該抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段，其中該第一RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中；(ii)第二RNA聚核苷酸，其包含編碼第二抗原之開放閱讀框架，該第二抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段；(iii)第三RNA聚核苷酸，其包含編碼包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段之抗原之開放閱讀框架；(iv)第四RNA聚核苷酸，其包括編碼第四抗原之開放閱讀框架，該抗原包含至少一種流行性感冒病毒抗原性多肽或其免疫原片段；及(v)包含編碼至少一種呼吸道融合性病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原片段之至少一個開放閱讀框架的RNA聚核苷酸。 58.   根據條項57之組合物，其中該RSV抗原性多肽與選自SEQ ID NO: 1至6之胺基酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性。 59.   根據條項57至58中任一項之組合物，其中該包含編碼至少一種呼吸道融合性病毒(RSV)抗原性多肽或其免疫原片段之至少一個開放閱讀框架的RNA聚核苷酸包含SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16中之任一者中所示之序列。 60.   根據條項57至59中任一項之組合物，其中該RSV抗原性多肽來源於RSV亞型A及/或RSV亞型B。 61.   根據條項57至60中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸中之各者包含5'帽、5' UTR、3' UTR及poly-A尾。 62.   根據條項57至61中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸中之任一者包含至少一種選自由以下組成之群的經修飾之核苷酸：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。 63.   根據條項57至62中任一項之組合物，其中該RNA聚核苷酸中之各者囊封於脂質奈米粒子(LNP)中。 64.   根據條項57至63中任一項之組合物，其中該LNP包含陽離子脂質、聚合物脂質、中性脂質及類固醇或類固醇類似物。 65.   一種在個體中引發針對流行性感冒之免疫反應之方法，該方法包含投與有效量之根據條項1至64中任一項之組合物。 66.   一種在個體中引發針對流行性感冒及RSV之免疫反應之方法，其包含投與有效量之根據條項1至64中任一項之組合物。 67.   一種預防、治療或改善個體之與流行性感冒及/或RSV相關之感染、疾病或病狀的方法，其包含向個體投與有效量之根據條項1至64中任一項之組合物。 68.   根據條項65至67中任一項之方法，其中該個體小於約1歲、約1歲或更大、約5歲或更大、約10歲或更大、約20歲或更大、約30歲或更大、約40歲或更大、約50歲或更大、約60歲或更大、約70歲或更大、或更大歲數。 69.   根據條項65至67中任一項之方法，其中根據條項1至64中任一項之組合物藉由皮內或肌肉內注射投與。 70.   一種製品，其包含小瓶，該小瓶具有(a)第一腔室，其包含有包含RNA聚核苷酸之第一組合物；(b)第二腔室，其包含有包含多肽之凍乾組合物；及(c)隔片，其將該第一腔室與該第二腔室分開且氣體介質不可滲透；及(d)致動構件，其藉由打破該隔片有效地使該第一組合物及該第二組合物接觸。 71.   一種在個體中引發針對與流行性感冒相關之疾病之免疫反應的方法，其包含向該個體投與有效量之根據條項1至64中任一項之組合物，其中該個體係選自至少18歲之人類群體，其中該疫苗以約0.05 ml與約0.2 ml之間的劑量體積提供且其中該疫苗在該至少18歲之人類群體中誘導保護性免疫反應。 72.   根據條項71之方法，其中該組合物經皮內投與至該個體。 73.   根據條項71至72中任一項之方法，其中該保護性免疫反應滿足至少一個選自以下之組的準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%；(2)在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%；或(3)對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。根據條項71至72中任一項之方法，其中該保護性免疫反應滿足至少一個選自以下之組的準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%；(2)在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%；或(3)對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。 74.   根據條項71至73中任一項之方法，其中該保護性免疫反應滿足至少兩個選自以下之組的準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%；(2)在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%；或(3)對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。 75.   根據條項71至74中任一項之方法，其中該保護性免疫反應包含藉由血球凝集抑制分析(HAI)量測，幾何平均力價比≥0.74。 76.   根據條項71至75中任一項之方法，其中該方法進一步包含引發針對RSV之免疫反應。 77.   根據條項76之方法，其中該針對RSV之免疫反應包含引發50%中和幾何平均力價比≥0.79。 78.   一種在個體中引發針對與RSV相關之疾病之免疫反應的方法，其包含向該個體投與有效量之根據條項1至64中任一項之組合物，其中該個體係選自至少18歲之人類群體，其中該疫苗以約0.05 ml與約0.2 ml之間的劑量體積提供且其中該疫苗在該至少18歲之人類群體中誘導保護性免疫反應。 79.   根據條項78之方法，其中該組合物經皮內投與至該個體。 80.   根據條項78至79中任一項之方法，其中該免疫反應包含誘導對該呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體，且其中在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中，對呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅高於對呈融合後構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅。 81.   根據條項78至80中任一項之方法，其中該免疫反應包含誘導對該呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體，且其中對呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅高於在投與之前對RSV F蛋白具有特異性之抗體的幾何平均力價(GMT)增幅。
本文所揭示及主張之所有方法可在不依據本發明進行不當實驗之情況下進行及執行。雖然本發明之組合物及方法已根據某些態樣加以描述，但熟習此項技術者將顯而易見的係，變化形式可適用於本文所描述之方法以及方法之步驟或方法之步驟順序，而不脫離本發明之概念、精神及範疇。更確切而言，顯而易知化學上及生理學上均相關之某些藥劑可取代本文所描述之藥劑，同時達成相同或類似結果。本領域中熟習此項技術者顯而易知的所有此類類似取代及修改視為在由隨附申請專利範圍所界定的本揭示案之精神、範疇及概念內。
在本申請案中敍述的所有引用之參考文獻(包括如在整個本申請案中引用之文獻參考、頒予之專利、公開專利申請案及GENBANK®寄存編號)之內容在其提供補充本文所闡述之彼等者之例示性程序或其他細節的程度上特定且明確地以引用之方式併入本文中。當以引用之方式併入本文中的文獻中之術語之定義與本文所使用之定義衝突時，以本文所使用之定義為準。
圖 1A 至圖 1E展示小鼠中RSV 847之modRNA-LNP調配物的免疫原性。在第0及21天，以指示劑量，對雌性BALB/c小鼠(10隻/組)肌肉內免疫接種呈二價蛋白質次單元(RSV 847A+B)形式的RSV 847構築體或呈單價(RSV 847A)或二價(RSV 847A+B)形式之modRNA-LNP調配物。在第35天(劑量2後(PD2) 2週)，收集血清用於RSV中和分析，且收集脾用於T細胞分析(ELISpot及細胞內細胞介素染色，ICS分析)。 圖 1A及 圖 1B展示RSV A及B之中和分析結果，其表示為50%中和力價(各符號表示來自個別動物之力價。條杠表示幾何平均力價(GMT))。 圖 1C展示ELISpot分析結果，其量測分泌IFN-γ之RSV A+B F特異性細胞之數目，且表示為斑點形成細胞(SFC)/一百萬細胞。 圖 1D及 圖 1E展示ICS分析結果，其量測CD4+及CD8+ T細胞內之表現IFN-γ之RSV A+B F特異性細胞，表示為IFN-γ+細胞之百分比。條杠及誤差條杠描繪中位數與四分位數範圍。NA：未分析。 圖 2-描繪藉由片段分析儀(FA)測得的RSV次單元至流感mRNA組合之流感mRNA組分的完整性；目標：≥50%完整RNA。 圖 3-說明對於RSV次單元-流感mRNA組合之流感mRNA組分，囊封效率之百分比維持。目標：RNA濃度：T0±20%；EE%：≥80%。 圖 4-說明藉由ELISA，RSV相對融合前F含量維持。目標：50-150%。 圖 5-流行性感冒HA A/Wisconsin病毒株活體外表現資料，其來自包含RSV-次單元及囊封流感四價HA modRNA之LNP的組合組合物；IVE分析使用293F懸浮細胞；DAI研究T0 T2hT4h。 圖 6-流行性感冒HA A/Darwin病毒株活體外表現資料，其來自包含RSV-次單元及囊封流感四價HA modRNA之LNP的組合組合物；IVE分析使用293F懸浮細胞；DAI研究T0 T2hT4h。 圖 7-在劑量1後3週(第21天)針對RSV亞型A及B之病毒中和力價。 圖 8-在劑量1後3週(第21天)針對四種流行性感冒病毒株之病毒中和力價。 圖 9-在劑量2後2週(第42天)針對RSV亞型A及B之病毒中和力價。 圖 10-在劑量2後2週(第42天)針對四種流行性感冒病毒株之中和力價。 圖 11A- 圖 11B-在劑量1後(PD1)之後，小鼠中之劑量1後3週資料：與小鼠中之獨立疫苗相比，modRNA流感/RSV次單元組合疫苗候選物之流感免疫原性無干擾或干擾最少，且RSV免疫原性傾向於增強；(圖11A)二價RSV疫苗反應；(圖11B)四價流感疫苗反應。 圖 12A- 圖 12B-在劑量2後(PD2)之後，小鼠中之劑量2後2週資料：與小鼠中之獨立疫苗相比，modRNA流感/RSV次單元組合疫苗候選物之流感免疫原性無干擾，且RSV免疫原性類似或更高；(圖12A)二價RSV疫苗反應；(圖12B)四價流感疫苗反應。
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Claims (20)

  1. 一種以組合物在製造用於在人類中引發針對與流行性感冒相關之疾病之免疫反應的藥劑中之用途，其中該組合物包含：(i)第一核糖核酸(RNA)聚核苷酸，其包含編碼至少一種流行性感冒病毒血球凝集素(HA)多肽或其免疫原片段之開放閱讀框架，其中該第一RNA聚核苷酸調配於脂質奈米粒子(LNP)中；及(ii)呈融合前構形之第一RSV F蛋白三聚體。
  2. 如請求項1之用途，其中該藥劑進一步包含引發針對呼吸道融合性病毒(RSV)之免疫反應。
  3. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該人類為18歲或更大。
  4. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該RNA聚核苷酸包含至少一種選自由以下組成之群的經修飾之核苷酸：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-假尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-硫-二氫尿苷、2-硫-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫-1-甲基-假尿苷、4-硫-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲氧基尿苷或2'-O-甲基尿苷。
  5. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該LNP呈液態且該第一RSV F蛋白三聚體經凍乾。
  6. 如請求項1至2中任一項之用途，其中藉由片段分析儀量測，各RNA具有至少50%完整性。
  7. 如請求項1至2中任一項之用途，其中各LNP具有至少80%囊封效率，持續至少4小時。
  8. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應至少滿足以下準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%。
  9. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應至少滿足以下準則：在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%。
  10. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應至少滿足以下準則：對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。
  11. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應滿足至少一個選自以下之組的準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%；(2)在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%；或(3)對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。
  12. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應滿足至少兩個選自以下之組的準則：(1)在年齡為18-60歲之成年人中保護率＞70%或在年齡高於60歲之老年人中保護率＞60%；(2)在年齡為18-60歲之成年人中血清轉化率＞40%或在年齡高於60歲之老年人中血清轉化率＞30%；或(3)對於各流行性感冒病毒株，在年齡為18-60歲之成年人中轉化因子＞2.5 HI力價或在年齡高於60歲之老年人中轉化因子＞2.0 HI力價。
  13. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該免疫反應包含藉由血球凝集抑制分析(HAI)量測，幾何平均力價比≥0.74。
  14. 如請求項2之用途，其中該藥劑進一步包含引發針對RSV之免疫反應。
  15. 如請求項2之用途，其中該針對RSV之免疫反應包含引發50%中和幾何平均力價比≥0.79。
  16. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該疫苗以介於約0.05 ml與約0.2 ml之間的劑量體積提供。
  17. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該組合物經肌肉內投與至個體。
  18. 如請求項2之用途，其中該免疫反應包含誘導對該呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體，且其中在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中，對呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅高於對呈融合後構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅。
  19. 如請求項2之用途，其中該免疫反應包含誘導對該呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體，且其中對呈融合前構形之RSV F蛋白具有特異性的抗體之幾何平均力價(GMT)增幅高於在投與之前對RSV F蛋白具有特異性之抗體的幾何平均力價(GMT)增幅。
  20. 如請求項2之用途，其中該針對RSV之免疫反應包含引發50%中和幾何平均力價比≥0.79。
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