TW202430226A

TW202430226A - 抗cd40抗體藥物偶聯物、其製備方法及其醫藥用途

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Publication number: TW202430226A
Application number: TW112151408A
Authority: TW
Inventors: 粟璐; 任文明; 祝令建; 唐滿平; 林�源; 黃建; 廖成; 張連山
Original assignee: 大陸商上海盛迪醫藥有限公司; 大陸商上海森輝醫藥有限公司; 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
Priority date: 2022-12-28
Filing date: 2023-12-28
Publication date: 2024-08-01
Also published as: WO2024140917A1

Abstract

本揭露涉及抗CD40抗體藥物偶聯物、其製備方法及其醫藥用途。具體地，本揭露涉及包含抗CD40抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物偶聯物、包含該抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物，以及其用於治療自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和/或移植排斥反應的方法和相關製藥用途。

Description

抗CD40抗體藥物偶聯物、其製備方法及其醫藥用途

本揭露要求如下專利申請的優先權：於2022年11月28日提交，申請號為CN202211699375.2的中國專利申請，前述專利申請的全部內容藉由引用結合至本揭露中。

本揭露涉及生物醫藥領域，具體而言，本揭露涉及一種抗CD40抗體-藥物偶聯物，包含該抗CD40抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物，以及用於治療自身免疫疾病(包括移植物抗宿主病、移植排異)的方法和相關製藥用途。

CD40屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，是一種定位在細胞膜表面的I型跨膜糖蛋白，分子量約為48kDa，在免疫系統中發揮重要作用。CD40表達在多種免疫細胞中，如B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞，也在血小板上表達，並且在某些條件下可以在嗜酸性粒細胞和實質細胞上表達。CD40的天然配體為CD154或CD40L，是一種II型跨膜蛋白，可在多種細胞類型上誘導表達，包括活化的CD4+ T細胞、NK細胞、血小板和B細胞(Pucino V等人，2020)。

CD40L結合CD40後，可招募TRAF並藉由NF-kB、JNK和MAPK通路介導下游信號傳導，發揮多種細胞類型依賴性活化結果，包括免疫細胞激活與增殖、炎症因子和趨化因子分泌等(Vonderheide RH等人，2007)。例如，藉由該途徑的信號傳導對於適應性免疫系統的若干重要效應子功能是必需的，包括原發性T細胞依賴性抗體應答(TDAR)、B細胞增殖、生髮中心(GC)形成、免疫球蛋白(Ig)同種型轉換、體細胞突變、以及記憶B細胞和漿細胞的分化(Foy TM等人，1993；Foy TM等人，1994)。除了對B細胞產生影響外，CD40途徑活化為DC成熟和功能以及單核細胞和巨噬細胞存活和細胞因子分泌提供了重要信號(Caux,C等人，1994)。

CD40信號通路的功能調節障礙可導致自身免疫疾病(Karnell JL等人，2018)。CD40-CD40L信號通路被發現參與炎症組織中實質細胞的功能：來自腎、唾液腺和皮膚等部位，可分泌趨化因子的活化上皮細胞能夠響應CD40。此外，CD40或CD40L在動脈粥樣硬化患者及臨床前動脈粥樣硬化模型的病變部位中的表達水平均升高。CD40可刺激誘導基質降解酶的表達，促進與動脈粥樣硬化致病相關的細胞類型如內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞等中的組織因子表達(Michel NA等人，2017)。CD40通路上調IL-1、IL-6及IL-8等炎症因子、以及細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)及血管細胞黏附分子(VCAM)等的黏附分子的生成。CD40/CD40L相互作用還被用來預防移植排異，在恆河猴的腎臟同種異體移植研究中使用嵌合抗CD40拮抗劑ch5D12表明，CD40的拮抗作用足以改善病情並延長平均存活時間超過100天。當將ch5D12 與抗CD86抗體組合並僅在同種異體移植研究開始時給予，隨後用環孢素進行延長治療時，實現大於4年的平均存活時間，這表明這種組合可潛在地誘導免疫耐受性(Haanstra等人，2005)。

大量臨床前研究提供了CD40/CD40L相互作用在促進T細胞依賴性免疫應答中的關鍵作用的證據。因此，CD40信號傳導的阻斷被認為是在抑制致病性自身免疫應答的合適且需要的治療策略。目前，尚未批准任何抗CD40抗體用於此類疾病的治療。

抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，是指單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的藥物相連。臨床前和臨床開發中的大多數ADC都用於腫瘤適應症，其中細胞毒性有效載荷靶向表達抗原的癌細胞。但是，藉由ADC介導的生物活性小分子的傳遞來調節病原性細胞活性對於非腫瘤學適應症也是有吸引力的，從而導致了該技術的廣泛應用。

目前，本領域仍然亟需可用於干預CD40-CD40L的相互作用並阻斷CD40信號傳導的治療劑。

本揭露提供了一種抗體-藥物偶聯物，包含該抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物，其用於治療或干預自身免疫疾病(包括移植物抗宿主病、移植排異)的方法和相關製藥用途。

抗CD40抗體、其抗原結合片段

一方面，本揭露提供抗CD40抗體及其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

a-1)該VH包含如SEQ ID NO：13-14中任一所示VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：9-12中任一所示VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

a-2)該VH包含如SEQ ID NO：1所示VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：2所示VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，例如，根據Kabat編號系統定義。

一些具體實施方案中，本揭露提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含：

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4和5所示的序列；和/或，輕鏈LCDR1，其包含如SEQ ID NO：6所示的序列；輕鏈LCDR2，其包含如SEQ ID NO：7所示的序列；輕鏈LCDR3，其包含如QGGYWTSTSNFGX₁X₂(SEQ ID NO：19)所示的序列，其中，X₁選自N、S、T或Q，X₂選自V或G。

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4和5所示的序列；輕鏈LCDR1，其包含如SEQ ID NO：6所示的序列；輕鏈LCDR2，其包含如SEQ ID NO：7所示的序列；輕鏈LCDR3，其包含如SEQ ID NO：8、15-18中任一所示的序列。

一些具體實施方案中，本揭露提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其包含前述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中的任一個，或其任意組合。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段為重組抗體。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段為兔源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或其抗原結合片段。

一些實施方案中，當前述抗CD40抗體或其抗原結合片段為人源化抗體時，重鏈框架區源自IGHV2-26*01、IGHV4-30-4*02、IGHV4-4*08、和IGHJ1*01；和/或，輕鏈框架區源自IGkV1-13*02、IGkV1-9*01、IGkV1-6*01、和IGKJ4*01。例如，重鏈框架區的FR1-FR3源自IGHV2-26*01、IGHV4-30-4*02、和IGHV4-4*08，重鏈框架區的FR4源自IGHJ1*01；輕鏈框架區的FR1-FR3源自IGkV1-13*02、IGkV1-9*01、和IGkV1-6*01，輕鏈框架區的FR4源自IGKJ4*01。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中，

A-1)VH包含如SEQ ID NO：13所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：9-12任一所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；

A-2)VH包含如SEQ ID NO：14所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：9-12任一所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；

A-3)VH包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段為IgG抗體或其抗原結合片段，例如為IgG1、IgG2、IgG2、IgG4抗體或其抗原結合片段，例如為具有297A突變的IgG1抗體或其抗原結合片段，例如為具有234A、235A、252Y、254T和256E中之一或其任意組合的IgG1抗體或其抗原結合片段。該突變根據EU編號規則編號。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體的抗原結合片段為Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)₂、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、二鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，例如為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體的抗原結合片段的重鏈全長的胺基酸序列如SEQ ID NO：20或22所示或與之具有至少80%同一性；輕鏈全長的胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示或與之具有至少80%同一性；或

如前所述的“至少80%同一性”例如包含至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化；輕鏈可變區有0至10個(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化。在一些具體實施方案中，該胺基酸變化為保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。

一些實施方案中，提供抗CD40抗體或抗原結合片段，其與前述抗CD40抗體或抗原結合片段結合或競爭結合相同的表位。

一些實施方案中，提供抗CD40抗體或抗原結合片段，其阻斷前述抗CD40抗體或其抗原結合片段與CD40(例如人CD40)的結合。

一些實施方案中，提供抗CD40抗體或抗原結合片段，其與CD40(例如人CD40)的結合被前述抗CD40抗體或其抗原結合片段阻斷。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或抗原結合片段具有以下至少一項：

(i)以10nM或更低的K_D結合人CD40；

(ii)無明顯的激動活性。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或抗原結合片段使CD40配體與CD40的結合降低至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或抗原結合片段以10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更低的K_D結合人CD40。

一些實施方案中，提供CD40結合分子，包含前述任意的抗CD40抗體或其抗原結合片段。

一些實施方案中，本揭露提供經分離的多核苷酸，其編碼本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段。該分離的多核苷酸可以為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是分離的多核苷酸。

一些實施方案中，本揭露還提供DNA分子，其編碼前述本揭露任意的抗CD40抗體或其抗原結合片段。

本揭露的多核苷酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供VEGF結合分子或其綴合物體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的多核苷酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領域中具有通常知識者的常識。對本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。

本揭露的多核苷酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。

一些實施方案中，本揭露提供表達本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段或含有本揭露的多核苷酸或載體的宿主細胞。一些實施方案中，該宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬(Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。

真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及曲菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。

哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。

然而，本揭露也可使用兩棲類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。

在一個實施方案中，本揭露中使用的宿主細胞不能發育成完成的植株或動物個體。

抗體-藥物偶聯物

本揭露提供一種抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其包含抗CD40抗體或其抗原結合片段，該抗CD40抗體或其抗原結合片段是本揭露任意的抗CD40抗體或其抗原結合片段。

在抗體-藥物偶聯物的一些實施方案中，抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

a-2)該VH包含如SEQ ID NO：1所示VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：2所示VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

在一些實施方案中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。

在抗體-藥物偶聯物的一些實施方案中，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4和5所示的序列；和輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：6、7和19所示的序列。

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4、5所示的序列；輕鏈LCDR1，其包含如SEQ ID NO：6所示的序列；輕鏈LCDR2，其包含如SEQ ID NO：7所示的序列；和輕鏈LCDR3，其包含如SEQ ID NO：8、15-18任一所示的序列。

在抗體-藥物偶聯物的一些實施方案中，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中，

A-2)VH包含如SEQ ID NO：14所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：9-12任一所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；或

在抗體-藥物偶聯物的一些實施方案中，該抗CD40抗體的抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中，

重鏈包含如SEQ ID NO：20或22所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列；輕鏈包含如SEQ ID NO：21所示或與之具有至少80%同一性的胺基酸序列。

在抗體-藥物偶聯物的一些實施方案中，其為式(I)所示結構的抗體-藥物偶聯物：

Ab-(L-D)_k (I)；

其中，Ab為前述任一種的抗CD40抗體或其抗原結合片段；

D為具有免疫抑制活性的效應分子。

L為將Ab共價連接於D的連接子，k為1-20的整數或小數(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或前述任意兩數值之間任意小數或整數)。在一些實施方案中，k為4±0.4、4±0.5、4±0.6、4±0.8。例如，k為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0等。

在一些實施方案中，D選自糖皮質激素受體激動劑、鈣調磷酸酶抑制劑、或雷帕黴素靶蛋白(mTOR)激酶抑制劑。在另一些實施方案中，D還可以是其他具有免疫抑制活性的化合物、多肽、蛋白、核酸等物質。

在一些實施方案中，D為糖皮質激素受體激動劑，例如是選自WO2022166779A1揭露的任意結構的糖皮質激素受體激動劑。

在一些實施方案中，D為糖皮質激素，例如地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、布地奈德、莫米松、丙酸倍氯米松、氟替卡松、曲安奈德和環索奈德。在一些實施方案中，D為布地奈德。

在一些實施方案中，D為鈣調磷酸酶抑制劑(Calcineurin inhibitors,CAI)，例如是他克莫司(tacrolimus)、伏環孢素(Voclosporin)、環孢素A(CsA)。

在一些實施方案中，D為雷帕黴素靶蛋白(mTOR)激酶抑制劑，例如為雷帕黴素(rapamycin)、依維莫司和替西羅莫司。

抗體-藥物(糖皮質激素受體激動劑)偶聯物

WO2022166779A1揭露了一種糖皮質激素受體激動劑的抗體-藥物偶聯物，本本揭露全文引入其內容，包括抗體-藥物偶聯物的結構、製備方法。

本揭露提供一種式(I)所示結構的抗體-藥物偶聯物：

Ab-(L-D)_k (I)；

其中，Ab為本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段；

D為糖皮質激素；

L為將Ab共價連接於D的連接子，k為1-20的整數或小數(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間任意小數或整數)。

在一些實施方案中，D如下式所示：

或

其中，

R_1a各自獨立地選自氫、烷基和烷氧基，該烷基和烷氧基視需要被選自烷基、烷氧基、鹵素、氘、胺基、氰基、硝基、羥基和羥烷基中的一個或多個取代基所取代；

環A選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

環B選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

X₁選自-(CR_5aR_5b)m-、視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、硝基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、烷氧基、烷硫基、烯基和炔基；

環C、環D各自獨立地選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基、雜芳基、稠環芳基或稠雜芳基，且環C、環D中至少有一個選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的稠環芳基或稠雜芳基；

X₂選自-(CR_6aR_6b)n-、視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)(O)-、-NR_6c-、-CH₂S-、-CH₂O-、-NHCR_6dR_6e-、-CR_6f=CR_6g-、-C≡C-或者X不存在；

R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、硝基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、烷氧基、烷硫基、烯基和炔基，或者R_6a、R_6b與其相鄰的碳原子一起形成3員至10員環烷基；

R_6c、R_6d、R_6e、R_6f、R_6g各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基或C₁-C₆烷氧基；

R₁各自獨立地選自氫、烷基或烷氧基，其中該烷基和烷氧基各自獨立地視需要被選自烷基、烷氧基、鹵素、氘、胺基、氰基、硝基、羥基和羥烷基中的一個或多個取代基所取代；

R₂各自獨立地選自-CH₂OH、-CH₂SH、-CH₂Cl、-SCH₂Cl、-SCH₂F、-SCH₂CF₃、-OH、-OCH₂CN、-OCH₂Cl、-OCH₂F、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-SCH₂CN、

R_2a各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R_2b各自獨立地選自C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R_2c各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、-CH₂OH或C₁-C₆烷氧基；

R_2d和R_2e各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R₃各自獨立地選自氫或鹵素；

R₄各自獨立地選自氫、鹵素或羥基；

m、n各自獨立地選自1至6的整數；

取代基團Q₁各自獨立地選自C₁-C₆烷基、鹵素、氘、羥基、巰基、-NR_iR_j、側氧、硫基、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、硝基、氰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、3至10員環烷基、3至10員雜環基、6至10員芳基、5至10員雜芳基、8至12員稠環芳基和5至12員稠雜芳基；

R_i、R_j各自獨立地選自氫原子、羥基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基；R_k獨立地選自氫原子、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基、C₁-C₆烷氧基、羥基、-NR_iR_j，其中該烷基、烷氧基、鹵烷基視需要被選自C₁-C₆烷基、鹵素、羥基、巰基、-NR_iR_j、側氧、硫基、羧基、硝基、氰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、3至10員環烷基、3至10員雜環基、6至10員芳基和5至10員雜芳基中的一個或多個取代基所取代；

條件是當R_5a為氫或烷基時，R_5b不為氫或烷基。

在某些實施方案中，R_1a各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基和C₁-C₆烷氧基，該烷基和烷氧基各自獨立地視需要被選自C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、鹵素、氘、胺基、氰基和羥基中的一個或多個取代基所取代。

在某些實施方案中，R_1a各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基。

在某些實施方案中，環A選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，環A選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的

或

。

在某些實施方案中，環B選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，環B選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的

或

。

在某些實施方案中，X₁選自-(CR_5aR_5b)m-、視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、硝基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基。

在某些實施方案中，R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團： C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基。

在某些實施方案中，R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)(O)R_k、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基。

在某些實施方案中，R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k或C₁-C₆烷氧基。

在某些實施方案中，環C、環D各自獨立地選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基、5至10員雜芳基、8至12員稠環芳基或5至12員稠雜芳基，該雜芳基或稠雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，環C、環D各自獨立地選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：

在某些實施方案中，環C選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的：

、

、

、

或

。

在某些實施方案中，環D選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，環D選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的

或

。

在某些實施方案中，X₂選自-(CR_6aR_6b)n-、-O-、-S-、-NR_6c-、-CH₂S-、-CH₂O-、-NHCR_6dR_6e-，或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子。

在某些實施方案中，R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，或者R_6a、R_6b與其相鄰的碳原子一起形成3員至10員環烷基。

在某些實施方案中，R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)(O)R_k、C₁-C₆烷氧基、 C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，或者R_6a、R_6b與其相鄰的碳原子一起形成3員至10員環烷基。

在某些實施方案中，R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k或C₁-C₆烷氧基。

在某些實施方案中，R₁各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基，較佳氫。

在某些實施方案中，R₄各自獨立地選自氫。

在某些實施方案中，取代基團Q₁各自獨立地選自鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基、胺基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或鹵C₁-C₆烷氧基。

在某些實施方案中，R_k獨立地選自氫原子、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基、C₁-C₆烷氧基、羥基、-NR_iR_j。

在某些實施方案中，-D如下式所示：

或

其中，

R_1a各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

環A選自

或

，該環A視需要被一個或多個取代基Q₁所取代；

環B選自

或

，該環B視需要被一個或多個取代基Q₁所取代；

X₁選自-(CR_5aR_5b)m-或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基，該雜芳基包含至少一個氮原子；

R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k或C₁-C₆烷氧基；

環C選自

、

、

、

或

，該環C視需要被一個或多個取代基Q₁所取代；

環D選自

或

，該環D視需要被一個或多個取代基Q₁所取代；

X₂選自-(CR_6aR_6b)n-、-O-、-S-、-NR_6c-、-CH₂S-、-CH₂O-、-NHCR_6dR_6e-，或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的6至10員芳基或5至10員雜芳基；

R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k或C₁-C₆烷氧基；

R_6c、R_6d、R_6e各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基或C₁-C₆烷氧基；

R_2a各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R_2b各自獨立地選自C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R_2d和R_2e各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R₃各自獨立地選自氫或鹵素；

m、n各自獨立地選自1至6的整數；

取代基團Q₁各自獨立地選自鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基、胺基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或鹵C₁-C₆烷氧基；

R_i、R_j各自獨立地選自氫原子、羥基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基；R_k獨立地選自氫原子、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基、C₁-C₆烷氧基、羥基、-NR_iR_j；

條件是當R_5a為氫或烷基時，R_5b不為氫或烷基。

在某些實施方案中，R_1a為氫。

在某些實施方案中，X₁選自-(CR_5aR_5b)m-或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的：

、

或

。

在某些實施方案中，R_5a、R_5b均為氟。

在某些實施方案中，R_5a為側氧或硫基，較佳側氧。

在某些實施方案中，X₂選自-(CR_6aR_6b)n-或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的：

、

或

。

在某些實施方案中，R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基、C₁-C₆烷基、-NR_iR_j、-C(O)OR_k或C₁-C₆烷氧基。

在某些實施方案中，R₂各自獨立地選自-CH₂OH、-CH₂SH、-OH或

。

在某些實施方案中，R₃為氫。

在某些實施方案中，R₃為氟。

在某些實施方案中，k為1-10之間的任意數值，較佳2-5之間的任意數值。k可以為整數，也可以為小數。

在一些具體的實施方案中，D為如下結構所示：

在某些實施方案中，連接子在細胞外是穩定的，使得ADC在存在於細胞外環境中時保持完整，但在細胞中內化時能夠裂解。在某些實施方案中，當ADC進入表達對ADC的抗體部分具有特異性的抗原的細胞時，糖皮質激素受體激動劑藥物部分從抗體部分裂解，且裂解釋放糖皮質激素受體激動劑的未修飾形式。

在某些實施方案中，連接子中的可裂解部分為可裂解肽部分。在某些實施方案中，相對於包含其他可裂解部分的ADC，包含可裂解肽部分的ADC顯示較低的聚集水平，改善的抗體與藥物比率。在某些實施方案中，相對於不可裂解的連接子，添加可裂解部分增加細胞毒性和/或效力。在某些實施方案中，可裂解肽部分能夠由酶裂解，且連接子為酶能夠裂解的連接子。在某些實施方案中，酶為組織蛋白酶，且連接子為組織蛋白酶能夠裂解的連接子。在某些實施方案中，與其它分裂機制相比，酶能夠裂解的連接子(例如組織蛋白酶能夠裂解的連接子)顯示上述改善特性中的一種或多種。

在某些實施方案中，連接子包含胺基酸單元L₂，該胺基酸單元較佳包含由2至7個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、高賴胺酸、n-甲基-纈胺酸、

(q為1-6的整數)的胺基酸構成的肽殘基，示例性胺基酸單元包括但不限於纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(Ala-Phe)；苯丙胺酸-賴胺酸(Phe-Lys)、苯丙胺酸-高賴胺酸(Phe-Homolys)、n-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-谷胺酸(Gly-Glu)、谷胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)和甘胺酸-賴胺酸(Gly- Lys)、甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(Glv-Val-Cit)和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Gly)、

。

在某些實施方案中，連接子包含拉伸單元，其一端藉由碳原子與抗體共價連接而另一端與胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或非肽化學部分相連的化學結構片段。示例性拉伸單元包括但不限於

在某些實施方案中，該拉伸單元選自

、

、

，其中p各自獨立地選自1、2、3、4、5或6。

在某些實施方式中，連接子選自

在某些實施方式中，連接子選自

在一些具體的實施方案中，連接子為：

。

在某些實施方式中，該抗體-藥物偶聯物選自：

其中，Ab、D、k如前所述，p各自獨立地選自1、2、3、4、5或6。

在某些實施方式中，該抗體-藥物偶聯物選自

k選自1-10的整數或小數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或前述任意兩數值之間任意小數或整數)。在一些實施方案中，k為4±0.4、4±0.5、4±0.6、4±0.8。例如，k為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0等。

在一些具體的實施方案中，抗體-藥物偶聯物如下所示：

其中，k為1-10的整數或小數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或前述任意兩數值之間任意小數或整數)。在一些實施方案中，k為4±0.4、4±0.5、 4±0.6、4±0.8。例如，k為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0等。

在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物選自WO2022166779A1揭露的任意的抗體-藥物偶聯物結構。

在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物具有提高的抗移植排斥活性。本揭露中抗體-藥物偶聯物的抗移植排斥活性顯著優於抗CD40抗體、抗CD40抗體與糖皮質激素聯用，並且優於地塞米松。在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物具有提高的安全性。例如，降低的毒副作用。在一些實施方案中，降低的毒副作用包括但不限於對體重影響的降低，降低的對內源皮質酮釋放的影響，降低的對骨生成指標P1NP的影響。

抗體-藥物(糖皮質激素)偶聯物

WO2023143351A1揭露了一種糖皮質激素的藥物偶聯物，本本揭露全文引入其內容，包括抗體-藥物偶聯物的結構、製備方法。

本揭露提供一種式(I)所示結構的抗體-藥物偶聯物：

Ab-(L-D)_k (I)；

其中，Ab為本揭露的抗CD40抗體或其抗原結合片段；

D為糖皮質激素；

L為將Ab共價連接於D的連接子，k選自1-20的整數或小數(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間任意數值)。

在一些實施方案中，D如下式所示：

在某些實施方案中，連接子在細胞外是穩定的，使得ADC在存在於細胞外環境中時保持完整，但在細胞中內化時能夠裂解。在一些實施方案中，當ADC進入表達對ADC的抗體部分具有特異性的抗原的細胞時，糖皮質激素藥物部分從抗體部分裂解，且裂解釋放糖皮質激素的未修飾形式。

在某些實施方案中，連接子中的可裂解部分為可裂解肽部分。在一些實施方案中，相對於包含其他可裂解部分的ADC，包含可裂解肽部分的ADC顯示較低的聚集水平，改善的抗體與藥物比率。在某些實施方案中，相對於不可裂解的連接子，添加可裂解部分增加細胞毒性和/或效力。在一些實施方案中，可裂解肽部分能夠由酶裂解，且連接子為酶能夠裂解的連接子。在一些實施方案中，酶為組織蛋白酶，且連接子為組織蛋白酶能夠裂解的連接子。在某些實施方案中，與其它分裂機制相比，酶能夠裂解的連接子(例如組織蛋白酶能夠裂解的連接子)顯示上述改善特性中的一種或多種。

在一些實施方案中，連接子包含拉伸單元，其一端藉由碳原子與抗體共價連接而另一端與胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或非肽化學部分相連的化學結構片段。示例性拉伸單元包括但不限於

在一些實施方案中，連接子包含胺基酸單元，該胺基酸單元較佳包含由2至7個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、高賴胺酸、n-甲基-纈胺酸、

(q為1-6的整數)的胺基酸構成的肽殘基，示例性胺基酸單元包括但不限於纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(Ala-Phe)；苯丙胺酸-賴胺酸(Phe-Lys)、苯丙胺酸-高賴胺酸(Phe-Homolys)、n-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-谷胺酸(Gly-Glu)、谷胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)和甘胺酸-賴胺酸(Gly-Lys)、甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(Glv-Val-Cit)和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Gly)、

。

在一些實施方案中，連接子可以包含至少一種聚乙二醇(PEG)部分。PEG部分可以例如包含-(PEG)_p1-，

，其中p1為整數1至20，例如

，(PEG)₂；

，(PEG)₄；

，(PEG)₅。

在一些實施方案中，該連接子包含連接於D的間隔單元。在一些實施方案中，該間隔單元包含對胺基苯甲氧基羰基(PAB)，

在一些實施方案中，該間隔單元包含對胺基苯甲醯基，

在一些實施方案中，該間隔單元包含：

-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-，其中n1選自0-6之間整數；L^a表示-C(=O)-NH-、-NR⁷-(CH₂)_n2-、-O-或單鍵，R⁷選自氫、C_1-6烷基、-(CH₂)_n3-COOH、-(CH₂)_n4-OH，n3選自1-4之間整數，n4選自1-6之間整數；L^b表示-CR⁸(R⁹)-、-O-、-NR¹⁰-或單鍵，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、-(CH₂)_n5-NH₂、-(CH₂)_n6-COOH、-(CH₂)_n7-OH，R¹⁰選自氫或C_1-6烷基，n5選自0-6之間整數，n6選自1-4之間整數，n7選自1-4之間整數，且n5為0時，R⁸與R⁹不相同，或者R⁸和R⁹與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；L^c表示-CH₂-或-C(=O)-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^c表示-NHCH₂-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基，例如氫、甲基、乙基或環丙基。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-C(=O)-，R⁸和R⁹與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-C(=O)-，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、-(CH₂)_n5-NH₂、-(CH₂)_n6-COOH、-(CH₂)_n7-OH，R¹⁰選自氫或C_1-6烷基，n5選自0-6之間整數，n6選自1-4之間整數，n7選自1-4之間整數，且n5為0時，R⁸與R⁹不相同。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-CH₂-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-CH₂-，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基，較佳氫、甲基、乙基或環丙基。

在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物中-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-為：-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、-NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃-C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、-NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、

在一些實施方案中，-NH-(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-為-NHCH₂-或-NHCH₂CH₂CH₂-。

在一些實施方案中，連接子中的間隔子單元包含(PEG)₄。在一些實施方案中，儘管連接子長度較短，但相對於包含較長間隔子單元(例如(PEG)₈)的ADC，包含較短間隔子單元(例如(PEG)₄)的ADC顯示較低的聚集水平和/或較高的藥物負載。

另一方面，本揭露抗體偶聯物(ADC)中L-D是由下式表示的化學部分：

-Str-Pep-Sp-D

Str是與Ab共價連接的伸展基單元，

Sp為間隔單元，

Pep選自胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或以下非肽化學部分：

，

或

，其中，W是-NH-亞(伸)雜環烷基-或雜環烷基；Y是亞(伸)雜芳基、亞(伸)芳基、-C(O)C_1-6亞(伸)烷基、C_2-6亞(伸)烯基、C_1-6亞(伸)烷基或-C_1-6亞(伸)烷基-NH-；每個R¹⁶獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(NH)NH₂或-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(O)NH₂；R¹⁷和R¹⁸各自獨立選自氫、C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基，或R¹⁷和R¹⁸一起可形成C_3-6環烷基；R¹⁹和R²⁰各自獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基、(C_1-6烷基)OCH₂-，或R¹⁹和R²⁰一起可形成C_3-6環烷基環。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物(ADC)中Str選自下式表示的化學部分：

或

，其中R²¹選自-W1-C(O)-、-C(O)-W1-C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-，其中p1為1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，W1選自C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、氰基、胺基、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和C_3-6環烷基所取代；

L¹選自-NR²²(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-、-NR²²(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、-S(CH₂)_p1C(O)-、-(CH₂)_p1C(O)-或單鍵，較佳單鍵；p1為1至20的整數，R²²選自氫原子、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基或氘代C_1-6烷基。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物Str中R²¹選自C_1-6亞(伸)烷基C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₃C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₄C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₄CH₂C(O)-和-(CH₂-CH₂O)₄CH₂CH₂C(O)-。

在一些實施方案中，該Pep選自纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺(Ala-Ala-Asn)、甘胺酸-甘胺酸-賴胺酸(Gly-Gly-lys)、纈胺酸-賴胺酸(Val-lys)、纈胺酸-丙胺酸(Val-Ala)、纈胺酸-苯丙胺酸(Val-Phe)或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Phe-Gly)。

在一些實施方案中，該Sp選自-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、-NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃-C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、-NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、

、

、

、

、

和

。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物中連接子L包含：順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺、順丁烯二醯亞胺-(PEG)_2-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺或Mal-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-二硫化物。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物中連接子L包含：-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₆-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₈-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅-Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH- (PEG)₆-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH-(PEG)₈-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺或Mal-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-二硫化物。

在另一些實施方案中，本揭露抗體-藥物偶聯物(ADC)，其由下式表示：

，其中k選自1至10，可以為整數，也可以為小數，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2；

在另一些實施方式中，本揭露抗體-藥物偶聯物(ADC)，選自：

其中k為1-10的整數或小數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或前述任意兩數值之間任意小數或整數)。在一些實施方案中，k為4±0.4、4±0.5、4±0.6、4±0.8。例如，k為3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0等。

在另一些實施方式中，本揭露抗體-藥物偶聯物(ADC)，其為如下所示：

本揭露還提供了一種式II-A所示化合物或其可藥用鹽，

其中p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2。

本揭露還提供了一種式II-B所示化合物或其可藥用鹽，

其中X為鹵素，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2。

本揭露所述的結構中，

表示單鍵或雙鍵。

在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物包含WO2023143351A1揭露的任意的連接子和/或藥物部分。

組成物

本揭露提供組成物，包含前述抗CD40抗體-藥物偶聯物。例如，提供醫藥組成物，其含有治療或緩解有效量的如上所述的抗CD40抗體-藥物偶聯物和至少一種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。

在一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的抗CD40抗體-藥物偶聯物，或醫藥組成物單位劑量中含抗CD40抗體-藥物偶聯物的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方案中為1-1000mg。

在一些具體實施方案中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的抗體-藥物偶聯物，或醫藥組成物單位劑量中含抗體-藥物偶聯物的量為0.1-2000mg，在一些具體實施方案中為1-1000mg。

在一些實施方案中，提供前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物與一種或多種另外的免疫抑制劑的組合或組成物。該組成物例如是醫藥組成物。可選地，該醫藥組成物可進一步包含可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

一些實施方案中，提供製品，包含前述抗CD40抗體或其抗原結合片段，或抗體-藥物偶聯物。可選地，製品包含容器和標簽。容器例如瓶、注射器和試管。容器容納有效於治療病症的組成物。容器上或與容器相連的標簽表明該組成物用於治療所選病症。組成物中含有前述抗CD40抗體或其抗原結合片段，或抗體-藥物偶聯物。

治療方法和製藥用途

本揭露提供前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物，或醫藥組成物用於治療、干預、預防、診斷疾病或病症的方法。

具體地，在一些實施方案中，本揭露提供了根據本揭露所述的抗CD40抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物在製備用於治療或緩解自身免疫疾病、移植物抗宿主病、或緩解移植排異反應的藥物中的用途。

一些實施方案中，提供改善或治療自身免疫性疾病的方法和相關製藥用途，包括相向受試者施用改善或治療有效量的前述抗CD40抗體-藥物偶聯物或其醫藥組成物。

一些實施方案中，提供治療CD40相關障礙疾病的方法和相關製藥用途；一些實施方案中，提供抑制CD40相關障礙細胞生長或分化的方法和相關製藥用途；一些實施方案中，提供抑制表達人CD40抗原的細胞的生長和/或分化的方法和相關製藥用途；一些實施方案中，提供抑制受試者中B細胞的抗體產生的方法和相關製藥用途；一些實施方案中，提供治療患有免疫障礙疾病的方法和相關製藥用途。上述方法中，均包括向受試者或細胞施用治療或抑制有效量的前述抗CD40抗體-藥物偶聯物或其醫藥組成物。

一些實施方案中，提供誘導外周B細胞耗竭的方法和相關製藥用途，包括向受試者施用誘導有效量的前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物或其醫藥組成物。

一些實施方案中，提供治療、緩解疾病或病症的方法和相關製藥用途，包括向有需要的受試者施用有效量的前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物，該疾病或病症可以是CD40相關或CD40不相關的。在一些實施方案中，該疾病或病症為免疫性疾病。在一些實施方案中，該疾病或病症為移植排斥反應反應。

一些實施方案中，提供治療B淋巴細胞、Th1淋巴細胞或Th2淋巴細胞相關疾病的方法和相關製藥用途，包括向有需要的受試者施用有效量的前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物。

一些實施方案中，提供治療或緩解移植物抗宿主病或移植排異反應的方法，包括向有需要的受試者施用前述抗CD40抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物。

一些實施方案中，提供抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物用於製備治療或緩解移植物抗宿主病或移植排異反應的藥物的用途。

一些實施方案中，上述移植為實體器官和/或組織移植。

一些實施方案中，上述移植是指移植選自由同種細胞、異種細胞、同種組織、異種組織、同種器官及異種器官組成組中的一種。

一些實施方案中，前述抗CD40抗體或其抗原結合片段、抗體-藥物偶聯物或醫藥組成物抑制或逆轉基於移植受體的組織移植物的排異反應，或者延長或保留移植到移植受體的組織的功能，或者恢復移植受體中的受損移植組織的功能。

在一些實施方案中，本揭露提供的抗體-藥物偶聯物可用於治療或緩解自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和/或移植排斥反應。

因而，本揭露提供了本文的抗體-藥物偶聯物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或緩解自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和/或移植排斥反應。

另一方面，本揭露提供了一種預防或治療移植排斥反應、移植物抗宿主病和/或自身免疫性疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用預防或治療有效量的本文的抗體-藥物偶聯物。

術語定義

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的具有通常知識者通常理解的含義。

除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。

“CD40”和“CD40抗原”是指在正常和贅生性B細胞表面上表達的約48kD糖蛋白，其充當參與細胞增殖和分化的信號的受體(Ledbetter等人，1987,J.Immunol.138：788-785)。已從由伯基特氏淋巴瘤細胞系Raji製備的文庫中分離出編碼CD40的cDNA分子(Stamenkovic等人，1989,EMBO J.8：1403)。序列信息可參見本揭露表2。內源性表達CD40的細胞是特徵在於CD40的表面表達的任何細胞，包括但不限於正常和贅生性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞和骨髓來源的漿細胞。

術語“連接子”、“連接單元”、“接頭單元”、“接頭”或“連接片段”是指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。

接頭可以包含一種或多種接頭構件。例示性的接頭構件包括6-馬來醯亞胺基己醯基(MC)、馬來醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit或vc)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對胺基苄氧羰基(PAB)，及那些源自與接頭試劑的偶聯的：N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(SMCC，在本文中也稱作MCC)和N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)。接頭可以包括拉伸單員、間隔單員、胺基酸單員和延伸單員。可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。

術語“拉伸單元”指一端藉由碳原子與抗體共價連接而另一端與胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或非肽化學部分相連的化學結構片段。

術語“間隔單元”是一種雙功能化合結構片段，可用於偶聯胺基酸單元和效應分子最終形成抗體-藥物偶聯物，這種偶聯方式可以將效應分子選擇性的連接到胺基酸單元上。

術語“胺基酸”是指分子結構中含有胺基和羧基，並且胺基和羧基都直接連接在-CH-結構上的有機化合物。通式是H2NCHRCOOH，R為H、取代或未取代烷基等。根據胺基連結在羧酸中碳原子的位置，可分為α、β、γ、δ、ε......-胺基酸。在生物界中，構成天然蛋白質的胺基酸具有其特定的結構特點，即其胺基直接連接在α-碳原子上，即α-胺基酸，包括甘胺酸(Glycine)、丙胺酸(Alanine)、纈胺酸(Valine)、亮胺酸(Leucine)、異亮胺酸(Isoleucine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、色胺酸(Tryptophan)、酪胺酸(Tyrosine)、天冬胺酸(Aspartic acid)、組胺酸(Histidine)、天冬醯胺(Asparagine)、谷胺酸(Glutamic acid)、賴胺酸(Lysine)、穀胺醯胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methionine)、精胺酸(Arginine)、絲胺酸(Serine)、蘇胺酸(Threonine)、半胱胺酸(Cysteine)、脯胺酸(Proline)等。非天然胺基酸如瓜胺酸。如所屬技術領域中具有通常知識者所公知的，非天然胺基酸並不構成天然蛋白質，因此也不參與本揭露中抗體的合成。本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“抗體-藥物偶聯物”，指抗體藉由穩定的連接單元與具有生物活性的藥物相連。在本揭露中“抗體-藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，指把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接單元與具有免疫抑制活性的效應分子相連。其中抗體或抗體片段可藉由其中的特定基團(例如鏈間二硫鍵)與包含接頭的效應分子相結合。

在一些實施方案中，該效應分子具有抗自身免疫疾病活性的分子。在一些實施方案中，該效應分子是抗移植排斥活性。

在一些實施方案中，該效應分子選自糖皮質激素受體激動劑、糖皮質激素、鈣調磷酸酶抑制劑、或雷帕黴素靶蛋白(mTOR)激酶抑制劑。在另外一些實施方案中，該效應分子還可以是具有免疫抑制活性的多肽、核酸、蛋白、化合物等。

術語“載藥量”是指抗體-藥物偶聯物群體中，每個抗體-藥物偶聯物分子載有的藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值。載藥量的範圍可以是每個抗體(Ab)連接1-20個，較佳1-10個效應分子(D)。在本揭露的實施方式中，載藥量表示為k，示例性的可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間數值的均值。較佳1-10，更佳1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗、單抗分子大小變異體測定法(CE-SDS)和HPLC特徵鑑定偶聯反應後每個ADC分子的藥物平均數量。

本揭露單抗分子大小變異體測定法(CE-SDS)可採用十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)紫外檢測方法，在還原和非還原條件下，依據分子量大小，按毛電泳法(2015年版《中國藥典》0542)，定量測定重組單株抗體產品的純度。

本揭露的一個實施方式中，藥物部分藉由連接單元偶聯在抗體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。

可以用以下非限制性方法控制抗體-藥物偶聯物的載量，包括：

(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，

(2)控制反應時間和溫度，

(3)選擇不同的反應試劑。

術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本揭露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體，較佳人源化抗體和全人源抗體。

術語“鼠源抗體”在本揭露中為根據本領域知識和技能用鼠製備抗體。製備時用特定抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。

術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

F(ab')₂是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

Fab'是藉由切割上述F(ab')₂的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本揭露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括 “Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(參見Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。

術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸(參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996))。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如：大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中揭露的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明該抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。

本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

胺基酸序列“同一性”指在比對胺基酸序列及必要時引入間隙，以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基同一的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的，比對可以藉由屬於本領域技術的範圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“抗CD40抗體”或“與CD40結合的抗體”是指能夠例如以足夠的親和力結合CD40的抗體，使得該抗體可用作靶向CD40的治療劑。抗CD40抗體與不相關的非CD40蛋白的結合程度可以小於例如藉由放射免疫測定(RIA)所測量的抗體與CD40的結合的約10%。在某些實施方式中，與CD40結合的抗體具有

1μM、

100nM、

10nM、

1nM或

0.1nM的解離常數(Kd)。

術語“肽”是指介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子藉由肽鍵相互連接而成，是蛋白質的結構與功能片段，如激素、酶類等本質上都是肽。

術語“糖”是指由C、H、O三種元素組成的生物大分子，可分為單糖、二糖和多糖等。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、二級丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、三級丁基、二級丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“亞(伸)烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有2個從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子，更佳含有1至6個碳原子的亞(伸)烷基。亞(伸)烷基的非限制性實例包括但不限於亞甲基(-CH₂-)、1,1-亞乙基(-CH(CH₃)-)、1,2-伸乙基(-CH₂CH₂)-、1,1-亞丙基(-CH(CH₂CH₃)-)、1,2-伸丙基(-CH₂CH(CH₃)-)、1,3-伸丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、1,4-伸丁基(-CH₂CH₂CH₂CH₂-)等。亞(伸)烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代。

術語“亞(伸)鏈烯基”指包含具有2至8個碳原子，較佳地具有2至6個碳原子，更佳地具有2至4個碳原子並在任何位置具有至少一個雙鍵的線性鏈烯基，包括例如亞(伸)乙烯基、亞(伸)烯丙基(allylene)、亞(伸)丙烯基、亞(伸)丁烯基、亞(伸)異戊二烯基(prenylene)、亞(伸)丁二烯基(butadienylene)、亞(伸)戊烯基、亞(伸)戊二烯基、亞(伸)己烯基、亞(伸)己二烯基等。

術語“亞(伸)鏈炔基”包括具有2至8個碳原子，較佳地具有2至6個碳原子，更佳地具有2至4個碳原子且在任何位置具有至少一個三鍵的線性亞(伸)鏈炔基，包括例如亞乙炔基、亞(伸)丙炔基、亞(伸)丁炔基、亞(伸)戊炔基、亞(伸)己炔基等。

術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。“碳環”指的是環烷基中的環系。

術語“螺環烷基”指5至20員的單環之間共用一個碳原子(稱螺原子)的多環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺環烷基分為單螺環烷基、雙螺環烷基或多螺環烷基，較佳為單螺環烷基和雙螺環烷基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺環烷基。“螺碳環”指的是螺環烷基中的環系。螺環烷基的非限制性實例包括：

術語“稠環烷基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對碳原子的全碳多環基團，其中一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠環烷基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環烷基。“稠碳環”指的是稠環烷基中的環系。稠環烷基的非限制性實例包括：

術語“橋環烷基”指5至20員，任意兩個環共用兩個不直接連接的碳原子的全碳多環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋環烷基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋環烷基的非限制性實例包括：

該環烷基環可以稠合於芳基、雜芳基或雜環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳包含3至6個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌嗪基等，較佳哌啶基、吡咯烷基。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。“雜環”指的是雜環基中的環系。

術語“螺雜環基”指5至20員的單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。“螺雜環”指的是螺雜環基中的環系。螺雜環基的非限制性實例包括：

術語“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。“稠雜環”指的是稠雜環基中的環系。稠雜環基的非限制性實例包括：

術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更有選為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實例包括：

該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：

和

等。

雜環基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，例如苯基和萘基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環。“芳環”指的是芳基中的環系。芳基非限制性實例包括：

芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基，較佳苯基。

術語“稠環芳基”可以是含有8-14個環原子由兩個或兩個以上環狀結構彼此共用兩個相鄰的原子連接起來形成的不飽和的具有芳香性的稠環結構，環原子較佳8-12個。例如包括全部不飽和稠環芳基，例如萘、菲等，還包括部分飽和稠環芳基，例如苯并3-8員飽和單環環烷基、苯并3-8員部分飽和單環環烷基。“稠芳環”指的是稠環芳基中的環系。稠環芳基具體實例如2,3-二氫-1H-茚基、IH-茚基、1,2,3,4-四氫萘基、1,4-二氫萘基等。

術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至12員，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，較佳為咪唑基、吡唑基、嘧啶基或噻唑基；更佳為吡唑基或噻唑基。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環。“雜芳環”指的是雜芳基中的環系。雜芳基非限制性實例包括：

雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“稠雜芳基”可以是含有5-14個環原子(其中至少含有一個雜原子)由兩個或兩個以上環狀結構彼此共用兩個相鄰的原子連接起來形成的不飽和的具有芳香性的稠環結構，同時包括碳原子、氮原子和硫原子可以被側氧，較佳"5-12員稠雜芳基"、"7-12員稠雜芳基"、"9-12員稠雜芳基"等，例如苯并呋喃基、苯并異呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、喹啉基、2-喹啉酮、4-喹啉酮、1-異喹啉酮、異喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并噠嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、酚嗪基、喋啶基、嘌呤基、萘啶基、吩嗪、吩噻嗪等。“稠雜芳環”指的是稠雜芳基中的環系。

稠雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“烷硫基”指-S-(烷基)和-S-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷硫基的非限制性實例包括：甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、環丙硫基、環丁硫基、環戊硫基、環己硫基。烷硫基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基中的一個或多個取代基所取代。

術語“羥烷基”指被羥基取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“鹵烷基”指被鹵素取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“氘代烷基”指被氘原子取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“羥基”指-OH基團。

術語“側氧”指=O基團。例如，碳原子與氧原子藉由雙鍵連接，其中形成酮或醛基。

術語“硫基”指=S基團。例如，碳原子與硫原子藉由雙鍵連接，形成硫基羰基-C(S)-。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“氰基”指-CN。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“羧基”指-C(O)OH。

術語“醛基”指-CHO。

術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或-C(O)O(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。

術語“醯鹵”指含有-C(O)-鹵素的基團的化合物。

術語“磺醯基”指-S(O)(O)-。

術語“亞磺醯基”指-S(O)-。

“胺基保護基”是本領域已知的適當的用於胺基保護的基團，參見文獻(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5^Th.Ed.T.W.Greene & P.G.M.Wuts)中的胺基保護基團，較佳地，該胺基保護基可以是(C_1-10烷基或芳香基)醯基，例如：甲醯基，乙醯基，苯甲醯基等；可以是(C_1-6烷基或C_6-10芳基)磺醯基；也可以是(C_1-6烷氧基或C_6-10芳基氧基)羰基，例如：Boc或Cbz；還可以是取代或非取代的烷基，例如：三苯甲基(Tr)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、對甲氧基苄基(PMB)或苄基(Bn)。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環烷基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環烷基團被烷基取代的情形和雜環烷基團不被烷基取代的情形。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥物載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。

圖1為CD40拮抗型抗體9E6-L4H2在報告基因系統中的活性結果，圖1使用人IgG1同種型作為陰性對照，CFZ533作為陽性對照。

圖2A和圖2B為CD40拮抗型抗體在B細胞激活實驗體系中的抑制活性結果，圖2A是9E6-L4H2和2F12-L4H2的CD19+CD69+的細胞百分比抑制結果，圖2B是9E6-L4H2和2F12-L4H2的CD19+CD69+的細胞MFI抑制結果，圖2A和圖2B均使用人IgG1同種型作為陰性對照，CFZ533作為陽性對照。

圖3A至圖3D為CD40拮抗型抗體在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性結果，圖3A是9E6-L4H2和2F12-L4H2的CD11C+CD80+的細胞MFI抑制結果，圖3B是9E6-L4H2和2F12-L4H2的CD11C+CD86+細胞MFI抑制結果，圖3C是9E6-L4H2和2F12-L4H2的抑制IL-12/23 p40的結果，圖3D是9E6-L4H2和2F12-L4H2抑制TNFα的結果，圖3A-3D均使用人IgG1同種型作為陰性對照，CFZ533作為陽性對照。

圖4為CD40拮抗型抗體9E6-L4H2、2F12-L4H2在B細胞激活實驗體系中的內源激動活性結果，使用人IgG1同種型、CFZ533、激動性抗CD40抗體9E5-SELFNS作為對照。

圖5A和圖5B為CD40拮抗型抗體在小鼠T細胞依賴的體液免疫反應模型中的活性結果，圖5A為流程圖，圖5B為第7、14、21、28天的檢測結果圖。

圖6A和圖6B為CD40拮抗型抗體在小鼠皮膚移植排異模型中的活性結果，圖6A為流程圖，圖6B為皮膚移植物生存率(%)和皮膚移植物評分的結果。

圖7為CD40拮抗型抗體聯用他克莫司(FK506)在小鼠皮膚移植排異模型中的活性結果，圖7的A為9E6-L4H2(10mpk)及其與他克莫司(FK506)聯用的皮膚移植物生存率(%)的結果，圖7的B為2F12-L4H2(10mpk)及其與他克莫司(FK506)聯用的皮膚移植物生存率(%)的結果，圖7的C為9E6-L4H2(10mpk)及其與他克莫司(FK506)聯用的皮膚移植物評分的結果，圖7的D為2F12-L4H2(10mpk)及其與他克莫司(FK506)聯用的皮膚移植物評分的結果。

圖8為CD40拮抗型抗體9E6-L4H2、2F12-L4H2在人CD40轉基因小鼠中的PK檢測結果，使用CFZ533作為對照。

圖9A和圖9B為Fc突變的CD40拮抗型抗體在B細胞激活實驗體系中的抑制活性結果，圖9A是9E6-L4H2和9E6-L4H2-AAYTE的CD19+CD69+的細胞MFI抑制結果，圖9B是2F12-L4H2和2F12-L4H2-AAYTE的CD19+CD69+的細胞MFI抑制結果。

圖10A至圖10D為Fc突變的CD40拮抗劑在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性結果，圖10A是9E6-L4H2和9E6-L4H2-AAYTE抑制IL-12/23 p40的結果，圖10B是9E6-L4H2和9E6-L4H2-AAYTE抑制TNFα的結果，圖10C是2F12-L4H2和2F12-L4H2-AAYTE抑制IL-12/23 p40的結果，圖10D是2F12-L4H2和2F12-L4H2-AAYTE抑制TNFα的結果。

圖11A和圖11B為抗CD40-ADC在CD40介導的GRE報告基因系統中的活性，圖11A和圖11B分別是ADC-1和ADC-2的相關結果。偶連激素的IgG1同種型hIgG-化合物1作為陰性對照，ref-ADC作為陽性對照。

圖12A和圖12B為抗CD40-ADC在B細胞激活實驗體系中的抑制活性的結果，圖12A和圖12B是9E6-L4H2、ADC-1和ADC-2在供體1(圖12A)和供體2(圖12B)來源的PBMC中的CD19+CD69+細胞百分比抑制結果，圖12A和圖12B均使用人IgG1同種型hIgG1作為陰性對照。

圖13A至圖13E為抗CD40-ADC在小鼠皮膚移植排斥模型中的活性結果，圖13A為流程圖，圖13B為不同劑量ADC-1的皮膚移植物生存率(%)結果，圖13C為不同劑量ADC-1的皮膚移植物評分結果，圖13D為ADC-1的皮膚移植物生存率(%)結果，圖13E為ADC-1的皮膚移植物評分結果。

圖14A和圖14B為抗CD40-ADC在小鼠皮膚移植排斥模型中的活性結果，圖14A為ADC-1和ADC-2的皮膚移植物生存率(%)結果，圖14B為ADC-1和ADC-2的皮膚移植物評分結果。

以下結合實施例用於進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制本揭露的範圍。

本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。、

實施例1. CD40免疫抗原、篩選抗原的序列及製備

帶his標簽的人CD40(h-CD40-his)重組蛋白(貨號CD0-H5228)、帶小鼠Fc標簽的人CD40(h-CD40-mFc)重組蛋白(貨號CD0-H525a)、帶his標簽和生物素標簽的人CD40(hCD40-his-avi)重組蛋白(貨號CD0-H82E8)和帶his標簽的食蟹猴CD40(cyno-CD40-his)重組蛋白(貨號CD0-C52H6)均為購買自Acrobiosystems公司的純化商業蛋白試劑，其各自的序列來源見表1。該蛋白試劑可用於下述各實施例實驗中。

表1. 重組蛋白胺基酸序列來源

實施例2. 抗CD40兔單株抗體的篩選和人-兔嵌合抗體的製備

抗人CD40單株抗體藉由免疫2隻新西蘭白兔產生。免疫抗原為帶His標簽的人CD40重組蛋白(h-CD40-his，用磷酸鹽緩衝液配製成1μg/μl)。用弗氏佐劑乳化：首次用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。每次免疫採用多點皮下注射400μg抗原。免疫注射時間為第0、7、20、41天。於第27和48天採血進行血檢，用ELISA和FACS方法檢測兔子血清中的抗體滴度。選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平穩的兔子：第63天加強免疫，靜脈注射400μg/隻的磷酸鹽緩衝液配製的抗原溶液；第67天收集該兔子的脾臟，加入帶有生物素標簽的CD40抗原，用流式細胞儀分選被標記的單株B細胞至96孔板中。培養14天後，收集上清液，藉由ELISA和FACS的方法篩選上清液可以結合人CD40、食蟹猴CD40以及Raji細胞(表達人CD40的腫瘤細胞系)的株，一共28株B細胞單株。對這些單株細胞提取RNA，反轉錄，進行PCR擴增後送測序公司測序，最終得到28株兔源抗體的序列，經親和力、活性鑑定實驗(方法參見實施例2-3)，篩選獲得多株單抗(9E6、3F6、8E1、2F1、2F12)，其中，9E6抗體的重鏈和輕鏈可變區序列如表2所示，CDR序列如表3所示。

表2. 抗CD40兔單株抗體可變區序列

表3. 抗CD40兔單株抗體的CDR區(Kabat編號規則)

將獲得的可變區序列分別接上人的抗體IgG1恆定區(帶有N297A突變，Eu編號系統)序列和人kappa鏈恆定區序列，得到人-兔嵌合抗體序列，利用分子選殖技術，把嵌合抗體的序列插入到表達載體中，利用HEK293細胞表達系統，即可獲得人-兔嵌合抗體。

實施例3. 人-兔嵌合抗CD40抗體Raji細胞結合實驗

Raji細胞是過表達人CD40的腫瘤細胞系。將數量為2E5的Raji細胞接種到96孔板上。加入100μL待測抗體，最高終濃度為100nM，5倍稀釋，一共8個濃度，4℃孵育1小時。用洗液洗一遍，按1：500的稀釋度加入偶聯了AF647的抗人IgG抗體(Jackson Immunoresearch Laborotories，貨號205-609- 088)，4℃孵育30分鐘。用洗液洗一遍，流式細胞儀讀取螢光強度。計算抗CD40抗體對CD40的結合EC₅₀值。使用抗CD40拮抗型抗體CFZ533(即，Iscalimab，Nova)作為陽性對照，重鏈和輕鏈可變區序列分別來源於US8277810B的序列5和序列2。

表4結果顯示，3F6、9E6均具有強於CFZ533的結合EC₅₀，而以8E1(序列未出示)為例的其他抗體的EC₅₀則弱於CFZ533。

表4. 人-兔嵌合抗CD40抗體對Raji細胞的FACS結合EC₅₀(nM)

實施例4 人-兔嵌合抗CD40抗體報告基因細胞活性實驗

HEK-Blue CD40L細胞購自Invivogen(Cat#hkb-cd40)，該細胞穩定轉染了人CD40基因和NF-kB介導的SEAP基因組，可以藉由SEAP受質QUANTI-Blue檢測上清中分泌的SEAP來表徵CD40信號通路的活化水平。本實驗藉由檢測CD40L對細胞HEK-Blue CD40L的活化，根據IC₅₀大小評價抗CD40抗體的體外拮抗劑活性。細胞HEK-Blue CD40L培養在含10% FBS，100μg/mL Zeocin和30μg/mL Blasticidin的DMEM培養基中，一週傳代2~3次，傳代比例1：5或1：10。傳代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入100μL的細胞懸液，密度為5×10^5細胞/mL，培養基為含10% FBS，100μg/mL Zeocin和30μg/mL Blasticidin的DMEM，96孔板外圍只加入100μl無菌水。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO₂)。細胞貼壁後，每孔加入100μl梯度稀釋的待測抗體，37℃孵育30分鐘。加入25ng/mL CD40L(R&D，貨號2706-CL)和2μg/mL anti-His抗體(R&D，貨號MAB050)，將培養板在培養箱孵育20-24小時(37℃，5% CO2)。每孔取20μl細胞上清到一個新的96孔平底板中，加入180μl QUANTI-Blue受質溶液，將培養板在培養箱內避光孵育1-3小時。用酶標儀(Thermo MμltiSkanFc)測定在630nm處的吸光度，計算IC₅₀值評價抗CD40抗體的體外細胞活性。參見表5，結果顯示9E6具有與CFZ533相比略強的報告基因細胞抑制活性IC₅₀，而以2F1(序列未出示)為例的其他抗體的IC₅₀則弱於CFZ533。

表5. 抗CD40抗體報告基因細胞活性IC₅₀(nM)

實施例5. 抗CD40抗體的人源化

將兔源抗體2F12、9E6的重、輕鏈可變區序列與抗體GermLine數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。最終抗體進行人源化的人種系模板信息參見表6。

表6. 抗體人源化過程的人種系模板信息

將兔源抗體的CDR區移植到選擇的人種系模板上，替換人種系可變區，再與相應的人源IgG恆定區(較佳重鏈為帶有N297A突變的IgG1，輕鏈為κ)重組。然後以兔源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對潛在的翻譯後修飾風險點進行突變，得到最終的人源化分子。實例性出示9E6對應的人源化輕、重鏈可變區序列(參見表7)，其中L代表輕鏈，H代表重鏈，L和H後的數字代表包含不同回復突變的不同版本的人源化序列。

表7. 人源化的9E6的重、輕鏈可變區序列

(下劃線為Kabat編碼規則的CDR。)

9E6在人源化的過程中，獲得了如下的LCDR3：

>9E6-L1的LCDR3

QGGYWTSTSNFGNV(SEQ ID NO：15)

>9E6-L2的LCDR3

QGGYWTSTSNFGSG(SEQ ID NO：16)

>9E6-L3的LCDR3

QGGYWTSTSNFGTG(SEQ ID NO：17)

>9E6-L4的LCDR3

QGGYWTSTSNFGQG(SEQ ID NO：18)

>9E6-L的LCDR3通式

QGGYWTSTSNFGX₉X₁₀(SEQ ID NO：19)，其中，X₉選自N、S、T或Q，X₁₀選自V或G。

在每個兔抗的人源化各版本輕、重鏈之間進行兩兩組合、表達和純化。命名規則為重鏈和輕鏈可變區編號的組合，例如“9E6-L1H1”即是VH選擇SEQ ID NO：13，VL選擇SEQ ID NO：9的抗體。輕、重鏈恆定區分別採用人IgG1恆定區(帶有N297A突變，Eu編號系統)序列和人kappa鏈恆定區序列。

示例性的人源化分子2F12-L4H2(使用2F12-L4輕鏈和2F12-H2重鏈)，9E6-L4H2(使用9E6-L4輕鏈和9E6-H2重鏈)序列如下，其輕、重鏈恆定區分別採用人IgG1恆定區(帶有N297A突變，Eu編號系統)序列和人kappa鏈恆定區序列。

>9E6-L4H2 HC：

SEQ ID NO：20

>9E6-L4H2 LC：

SEQ ID NO：21

>2F12-L4H2 HC：

SEQ ID NO：25

>2F12-L4H2 LC：

SEQ ID NO：26

對上述抗體的重鏈恆定區進行改造，抗體採用人IgG1恆定區，帶有L234A，L235A，M252Y，S254T和T256E(Eu編號系統)5個點突變，輕鏈恆定區以及輕、重鏈可變區保持不變。新產生的抗體為2F12-L4H2-AAYTE和9E6-L4H2-AAYTE，其完整重鏈序列如下所示：

>9E6-L4H2-AAYTE HC：

SEQ ID NO：22

>2F12-L4H2-AAYTE HC：

SEQ ID NO：27

以上下劃線區為重鏈或輕鏈恆定區。

實例性的IgG Fc如下所示：

>IgG1-Fc(N297A)

SEQ ID NO：23

>IgG1-Fc(AAYTE)

SEQ ID NO：24

實施例6. 人源化抗CD40抗體Raji細胞結合實驗

Raji細胞表面高表達人CD40，可用於檢測CD40拮抗型抗體與細胞表面人CD40的結合特性。

將Raji以1.5E5/孔鋪板，加入不同濃度的CD40拮抗型抗體，4度孵育1小時。FACS緩衝液(PBS+2% FBS)洗滌兩遍後，加入二抗(Alexa Flour488偶連的抗人IgG(H+L)抗體)，4度孵育0.5小時。FACS緩衝液洗滌兩遍後，流式細胞儀(BD FACS Celesta)檢測細胞表面的螢光強度。

結果如表8所示，其中2F12-L4H2、9E6-L4H2和CFZ533與Raji表面的人CD40有相似的結合能力。

表8. 人源化抗CD40抗體對Raji細胞的FACS結合EC₅₀結果

實施例7. 抗CD40抗體與人CD40和食蟹猴CD40的親和力測定

將待測抗體親和捕獲在抗人Fc的芯片上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的帶有His標簽的人或食蟹猴CD40抗原，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP+ 10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀釋至1×(pH 7.4)。實驗得到的數據以(1：1)Binding模型進行擬合，得出親和力數值，見表9。

9E6-L4H2、2F12-L4H2相比CFZ533與人CD40有相似的結合常數，9E6-L4H2與食蟹猴CD40的結合親和力較強，2F12-L4H2與食蟹猴CD40的結合親和力略弱。

表9. CD40拮抗型抗體與不同種系CD40的SPR親合力

實施例8. 抗CD40抗體報告基因細胞活性實驗

HEK-Blue CD40L細胞購自Invivogen(Cat# hkb-cd40)，該細胞穩定轉染了人CD40基因和NF-kB介導的SEAP基因組，可以藉由SEAP受質QUANTI-Blue檢測上清中分泌的SEAP含量來表徵CD40信號通路的活化水平。本實驗藉由檢測CD40拮抗型抗體對CD40L誘導的HEK-Blue CD40L細胞活化的抑制作用，根據IC₅₀大小評價CD40拮抗型抗體的體外細胞活性。

HEK-Blue CD40L細胞培養在含10% FBS，100μg/ml Normocin，100μg/ml Zeocin和30pg/ml Blasticidin的DMEM培養基中，一週傳代2~3次。將HEK-Blue CD40L細胞以5E4/孔鋪入96孔細胞培養板(培養基為DMEM，10% FBS，100μg/ml Normocin)，培養過夜。細胞貼壁後，每孔加入100μL梯度稀釋的待測抗體，37℃孵育1小時。加入CD40L-his(R&D,2706-CL-025)和抗His抗體(R&D,MAB050-500)，過夜培養。將細胞離心，轉移20μL細胞上清到一個新的96孔白板中，加入180μL QUANTI-Blue受質溶液，避光孵育15分鐘，用Envision酶標儀測定在620nm處的吸光度，計算IC₅₀值評價CD40拮抗型抗體的體外細胞活性。

結果如表10和圖1所示，9E6-L4H2和CFZ533對報告基因系統具有相似的抑制活性，2F12-L4H2的抑制活性比CFZ533更優。

表10. 抗CD40抗體對CD40報告基因細胞活性抑制IC₅₀

實施例9. 抗CD40抗體在B細胞激活實驗體系中的抑制活性

CD40高表達於B細胞，CD40L結合CD40後可誘導B細胞活化，上調一系列激活標誌物的表達。CD40拮抗型抗體藉由阻斷CD40L與CD40的結合，解除B細胞的免疫激活過程。

將人PBMC以2E5/孔，每孔50μL鋪入96孔細胞培養板(培養基為RPMI-1640，10% FBS,1%青黴素-鏈黴素)。每孔加入50μL梯度稀釋的待測抗體，37℃，5%CO₂條件共孵育0.5小時。每孔加入CD40L-his和抗His抗體，刺激過夜。第二天離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍，加入100μL 1：1000稀釋的Fixable viability dye EF780(Invitrogen,65086514)室溫染色15 分鐘。細胞洗滌兩遍後加入100μL 1：200稀釋的人Fc封閉劑(Fc blocker，BD,564220)室溫封閉10分鐘。離心細胞後加入1：200稀釋的流式抗體(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD19(Biolegend,302230)，APC anti-human CD69(Biolegend,310910))，4℃孵育0.5小時。離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍後，用200μL PBS重新懸浮細胞，流式細胞儀(BD FACS Celesta)檢測細胞表面的螢光強度。

結果如表11和圖2A至圖2B所示，9E6-L4H2相比CFZ533具有相似的B細胞激活抑制活性。2F12-L4H2的B細胞抑制活性強於CFZ533。

表11. 人源化抗CD40抗體在B細胞激活實驗體系中的抑制活性

加入抗體後，CD19+CD69+信號低於本底值，可能是因為一定程度抑制了B細胞的本底激活(除抑制CD40L誘導的信號外)。

實施例10. 抗CD40抗體在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性

CD40在樹突狀細胞(Dendritic Cell,DC)上高表達，CD40L結合CD40後可誘導DC活化，上調DC細胞表面多個激活標誌物的表達，並促進DC分泌多種炎症因子，進一步擴大免疫反應。CD40拮抗型抗體藉由阻斷CD40L與CD40的結合，解除DC細胞的免疫激活過程。

使用EsaySepTM人CD14分選試劑盒(Stemcell,19359)從新鮮原代人外周血PBMC中分選並富集單核細胞，用RPMI-1640培養基(10% FBS,1%青黴素-鏈黴素)，50ng/ml IL-4(PeproTech,200-04)和50ng/ml GM-CSF(PeproTech,300-03)分化6天。第7天時將分化完成的DC細胞以1E5/孔鋪入96孔細胞培養板。每孔加入梯度稀釋的待測抗體，37℃，5% CO₂條件共孵育0.5小時。每孔再加入終濃度為CD40L-his和抗His抗體。培養48小時後流式檢測DC細胞的激活水平：離心去除上清，細胞用FACS緩衝液(PBS+2% FBS)洗滌兩遍，加入100μL 1：1000稀釋的Fixable viability dye EF780(Invitrogen,65086514)室溫染色15分鐘。細胞洗滌兩遍後加入100μL 1：200稀釋的人Fc封閉(BD,564220)室溫封閉10分鐘。離心細胞後加入1：200稀釋的流式抗體(Alexa Fluor® 700anti-human CD11c(Biolegend,337220)，Brilliant Violet 421^TM anti-human CD80(Biolegend,305221)，APC anti-human CD86(Biolegend,305412))，4℃孵育0.5小時。離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍後，用200μL PBS重新懸浮細胞，流式細胞儀(BD FACS Celesta)檢測細胞表面的螢光強度。

此外，分別於培養24小時(TNFα，Cisbio,62HTNFAPEG)和48小時(IL-12/23 p40，Novus,VAL121)後檢測上清中細胞因子的分泌水平。

實驗結果如表12和圖3A至圖3D所示，9E6-L4H2和2F12-L4H2具有與對照抗體CFZ533相似的DC細胞抑制活性。

表12. 人源化抗CD40抗體在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性

實施例11. 人源化抗CD40抗體在B細胞激活實驗體系中的激動活性

CD40屬於TNF超家族受體，在結合配體CD40L或被抗體交聯後可介導下游信號通路的特異和非特異性激活，因此在不加入CD40L條件下可檢測CD40拮抗型抗體對B細胞的本底激動劑活性。

將人PBMC以2E5/孔，每孔100μL鋪入96孔細胞培養板(培養基為RPMI-1640，10% FBS,1%青黴素-鏈黴素)。每孔加入100μL梯度稀釋的待測抗體，37℃，5% CO₂培養過夜。第二天離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍，加入100μL 1：1000稀釋的Fixable viability dye EF780室溫染色15分鐘。細胞洗滌兩遍後加入100μL 1：200稀釋的人Fc封閉室溫封閉10分鐘。離心細胞後加入1：200稀釋的流式抗體(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD19(Biolegend,302230)，APC anti-human CD69(Biolegend,310910))，4℃孵育0.5小時。離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩次後，用200μL PBS重新懸浮細胞，流式細胞儀(BD FACS Celesta)檢測細胞表面的螢光強度。

結果如圖4所示，CD40激動性抗體9E5-SELFNS(WO2020108611A1)劑量依賴地激活B細胞，而9E6-L4H2和2F12-L4H2在2.5nM下仍然沒有表現出明顯的B細胞激動活性。

實施例12. 小鼠T細胞依賴的體液免疫反應(TDAR)模型

雌性人CD40轉基因小鼠，6-7週齡，購自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司。飼養環境：SPF；生產許可證：SCXK(蘇)-2016-0004；人CD40轉基因小鼠合格證編號：320726200100167773。動物到達後適應性飼養7天，隨機分組。實驗第0天，各組小鼠取1隻採血，之後腹腔注射給藥。第1天時小鼠腹腔注射50μg KLH(KLH：弗氏完全佐劑CFA=1：1乳化免疫複合物)/隻免疫。實驗第15天時，腹腔注射50μg KLH(KLH：弗氏不完全佐劑IFA=1：1乳化免疫複合物)/隻進行二次免疫。各組藥物每週腹腔注射2次，分別於第7、14、21和28天經眼眶靜脈叢採血~150μL。全血室溫放置1-4小時，7000rpm速度4℃離心10分鐘分離血清-80℃保存備用。具體實驗流程如圖5A所示。

具體給藥方案如表13所示，每週分離小鼠血清並用ELISA檢測抗KLH的特異性IgG水平。

表13. 小鼠TDAR模型實驗給藥方案

結果如圖5B和表14所示，1mg/kg CD40拮抗型抗體顯著抑制兩次免疫後抗KLH特異IgG的產生。低劑量0.3mg/kg 9E6-L4H2和2F12-L4H2相比同劑量CFZ533對兩次免疫後抗KLH的IgG的產生有更優的抑制作用。

表14. 抗CD40抗體對免疫後IgG產生的抑制作用(0.3mpk)

實施例13. 小鼠皮膚移植排異模型

雄性Balb/c小鼠，6週齡，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部。飼養環境：SPF；合格證編號：20180006023393。

雌性人CD40轉基因小鼠，6-7週齡，購自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司。飼養環境：SPF；合格證編號：320726200100179778。

動物到達後適應性飼養7天，隨機分組。實驗第-2天，小鼠腹腔注射他克莫司FK506或CD40拮抗型抗體。實驗第0天，4%水合氯醛麻醉供體Balb/c小鼠和C57BL6/J小鼠，取下供體小鼠尾巴，分離整圈長度1cm尾部皮膚。受體小鼠背部去毛，沿皮膚層切口，在保留背部脂肪和結締組織的情況下去掉等面積的皮膚，將供體皮膚放置於受體小鼠切口處，使用膠水縫合邊緣皮膚，放入籠中恢復。具體實驗流程如圖6A所示。

藉由表15的給藥方案給藥小鼠，小鼠恢復7天後，每天觀察小鼠皮膚生存情況，根據排異評分記錄排異分數。評分體系如下，3：皮膚沒有出現紅色，光滑；2：部分皮膚發紅，失去光澤，乾燥；1：皮膚大部分變紅，沒有條紋，縮水；0：移植排異導致80%的皮膚壞死。

表15. 小鼠皮膚移植排異模型給藥方案

結果如圖6B和表16-表18所示，CD40拮抗型抗體相比模型組均能顯著改善小鼠皮膚移植物評分，並延長皮膚移植物的存活時間。在對皮膚移植物評分的過程中，由於之前看不出來是否有排異，是從第8天開始進行評分。9E6-L4H2和2F12-L4H2相比對照抗體CFZ533表現出更優的抗移植排異活性。

表16. 抗CD40抗體的第15天皮膚移植物生存率(%)

表17. 抗CD40抗體的皮膚移植物評分(3mpk)

表18. 抗CD40抗體的皮膚移植物評分(10mpk)

此外，如圖7和表19-表21所示，9E6-L4H2和2F12-L4H2聯用他克莫司後對抗小鼠皮膚移植排異有進一步的增效。

表19. 抗CD40抗體和他莫克司聯用的第15天皮膚移植物生存率

表20. 抗CD40抗體和他莫克司聯用的皮膚移植物評分

表21. 抗CD40抗體和他莫克司聯用的皮膚移植物評分

實施例14. 人源化抗CD40抗體在人CD40轉基因小鼠中的PK檢測

雌性人CD40轉基因小鼠，6-7週齡，購自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司。飼養環境：SPF；生產許可證：SCXK(蘇)-2016-0004；人CD40轉基因小鼠合格證編號：320726200100154632。動物到達後適應性飼養7天，隨機分組。實驗第0天，各組小鼠10mg/kg腹腔注射抗CD40抗體，於給藥後15分鐘、4小時、8小時、第1、2、4、7、10和14天，分別採血100-150μL，使用10μL EDTA-K2(0.1M)抗凝，冰上保存。用ELISA檢測不同時間點小鼠血漿中的抗體濃度。具體檢測方法如下：將山羊抗人IgG Fc抗體(Rockland,Cat#609-101-017)用PBS稀釋至2.5μg/ml，50μL/每孔加入96孔板中，4度孵育過夜。洗液洗三遍後，每孔加入50μL封閉液，37℃孵育1小時。加入小鼠血漿和待檢測抗體的標準曲線，37℃孵育2小時。洗液洗三遍，按50μL/每孔加入抗hlgG Fab-HRP(Sigma,Cat# A0293，1：10000)，室溫孵育1小時。洗液洗三遍。每孔加入100μL TMB，避光反應5分鐘。每孔加入100μL的0.16M硫酸。Envision酶標儀讀取450nm OD值，計算CD40拮抗型抗體的濃度。

結果如表22和圖8所示，9E6-L4H2,2F12-L4H2和對照分子CFZ533在人CD40轉基因小鼠中有相似的PK特徵。

表22. CD40拮抗型抗體在hCD40轉基因小鼠中的PK數據

實施例15. 人源化抗CD40抗體與人FcRn的親合力測定

將待測抗體親和捕獲在抗人Fab的芯片上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人FcRn抗原(購自AcroBiosystem)，利用Biacore儀器實時檢測反應達到穩態時的信號。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP+ 10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀釋至1×(pH 7.4)。實驗得到的數據以穩態結合(Steady State Binding)模型進行擬合，得出親和力數值，見表23。相比母本抗體，攜帶AAYTE突變的抗CD40抗體與人FcRn有更高的結合親和力。

表23. 人源化抗CD40抗體與人FcRn的親合力測定

實施例16. Fc攜帶AAYTE突變的抗CD40抗體在B細胞激活實驗體系中的抑制活性

參照實施例10中的方法，檢測Fc上攜帶AAYTE突變的抗CD40抗體2F12-L4H2-AAYTE、9E6-L4H2-AAYTE在B細胞激活實驗體系中的抑制活性。結果如圖9A至圖9B所示，Fc突變的抗CD40抗體與母本抗CD40抗體具有相似的B細胞抑制活性。

實施例17. Fc攜帶AAYTE突變的抗CD40抗體在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性

參照實施例11中的方法，檢測Fc上攜帶AAYTE突變的抗CD40抗體2F12-L4H2-AAYTE、9E6-L4H2-AAYTE在DC細胞激活實驗體系中的抑制活性。結果如圖10A至圖10D所示，Fc突變抗CD40抗體與母本抗CD40抗體具有相似的DC細胞抑制活性。

實施例18. 抗體藥物偶聯物ADC-1(9E6-L4H2-化合物1)的製備

1. 781F02的合成

在1000mL單口瓶中加入原料781F01c(48g，176.4mmol，1.0eq)，聯硼酸頻哪醇酯(71.7g，282.2mmol，1.6eq)，醋酸鉀(34.6g，352.8mmol，2.0eq)，PdCl2(dppf)(6.4g，8.82mmol，0.05eq)，再加二噁烷(500mL)，氮氣保護下升溫至95℃攪拌2小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，反應液冷卻，再加入原料781F01f(80.8g，352.8mmol，2.0eq)，碳酸鉀(48.8g，352.8mmol，2.0eq)，PdCl2(dppf)(6.4g，8.82mmol，0.05eq)，再加水(100mL)攪拌，氮氣保護下加熱到80度攪拌過夜，取樣原料反應完全。反應液冷卻後加乙酸乙酯和水攪拌，分液，無水硫酸鈉乾燥，旋乾，粗品過管柱，得到白色固體約54g，純度95%，收率90%。Ms(ESI)：m/z 342.1[M+1]⁺。

2. 781F03的合成

在500mL三口瓶中加入原料781F02(7.0g，20.5mmol，1.0eq)，高錳酸鉀(9.7g，61.6mmol，3.0eq)，四三級丁基溴化銨(20.0g，61.6mmol，3.0eq)，再加二氯乙烷(140mL)，氮氣保護下室溫攪拌48小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，反應液冰水冷卻，加入10%亞硫酸氫鈉和醋酸攪拌，固體全溶，分液，有機層加無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋乾，粗品過管柱，得到白色固體約6.2g，純度95%，收率85%。Ms(ESI)：m/z 378.1[M+23]⁺。

3. 781F04的合成

在500mL三口瓶中加入原料781F03(20.0g，56.0mmol，1.0eq)，丙二硫醇(12.1g，112.0mmol，2.0eq)，三氟化硼乙醚(23.8g，168.0mmol，3.0eq)，再加氯仿(100mL)，氮氣保護下加熱回流攪拌4小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，反應液冰水冷卻，加入水攪拌，固體全溶，分液，有機層加無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋乾，粗品加石油醚攪拌，抽濾得到類白色固體約22g，直接投入下一步。Ms(ESI)：m/z 346.0[M+1]⁺。

4. 781F05的合成

在100mL三口瓶中加入原料粗品781F04(22.0g，以56.0mmol計，1.0eq)，二碳酸二三級丁酯(24.4g，112.0mmol，2.0eq)，再加乙醇(60mL)，氮氣保護下加熱50度攪拌4小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，反應液旋乾，過管柱，得到白色固體約18.5g，純度95%，收率71%。Ms(ESI)：m/z 468.1[M+23]⁺。

5. 781F06的合成

在100mL三口瓶中加入原料粗品781F05(4.7g，13.6mmol，1.0eq)，DAST(6.6g，40.9mmol，3.0eq)，再加二氯甲烷(50mL)，氮氣保護下加熱50度攪拌4小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，冰水冷卻下加水淬滅，分液，有機層無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋乾，過管柱，得到白色固體約3.9g，純度95%，收率76%。Ms(ESI)：m/z 400.1[M+23]⁺。

6. 781F07的合成

在100mL三口瓶中加入原料粗品781F06(2.0g，5.3mmol，1.0eq)，再加四氫呋喃(25mL)溶解，氮氣保護下，冷卻到0度左右，緩慢滴加1.0M的氫化鋁鋰四氫呋喃溶液(8.0mL，8.0mmol，1.5eq)，保持0度左右攪拌1小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，冰水冷卻下加水(0.8mL)淬滅，再加3.0M氫氧化鉀水溶液(0.8mL)，再加水(1.6mL)攪拌15min，抽濾，濾液加無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋乾，得到粗品約2.2g，直接投入下一步。Ms(ESI)：m/z 372.1[M+23]⁺。

7. 781F08的合成

在100mL三口瓶中加入原料粗品781F07(粗品2.2g，5.3mmol，1.0eq)，再加乙酸乙酯(25mL)溶解，氮氣保護下，冷卻到5度左右，加入Dess-Martin氧化劑(6.7g，15.9mmol，3.0eq)，保持10度左右攪拌1小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，抽濾，濾液旋乾，粗品過管柱純化，得到白色固體約1.5g，純度95%，收率82%。Ms(ESI)：m/z 370.1[M+23]⁺。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δ 10.06(s,1H),7.94(d,2H),7.70(d,2H),7.53(s,1H),7.47(d,2H),7.35(t,1H),7.15(d,1H),6.55(m,1H)。

8. 781F00A的合成

在100mL三口瓶中加入16-α-羥基潑尼松龍(1.2g，3.0mmol，1.0eq)，781F08(1.1g，3.17mmol，1.05eq)，再加無水硫酸鎂(1.8g，15.0mmol，5.0eq)，再加乙腈(25mL)攪拌，氮氣保護下，冷卻到0度以下，加入三氟甲磺酸(2.3g，15.0mmol，5.0eq)，保持0度左右攪拌1小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，停止反應，抽濾，濾液直接製備，得到白色固體約1.5g，純度95%，收率70%。Ms(ESI)：m/z 606.3[M+1]⁺。

¹H-NMR(400MHz,MeOD)δ 7.53(m,4H),7.44(m,2H),7.28(m,3H),6.23(dd,1H),5.99(t,1H),5.52(s,1H),5.08(d,1H),4.63(d,1H),4.37(m,2H),2.65(td,1H),2.36(d,1H),2.25(m,1H),2.13(m,1H),1.95(dd,1H),1.80(m,4H),1.49(s,3H),1.11(dt,1H),1.10(m,4H)。

9. 781F10的合成

在25mL三口瓶中加入原料781F00A(0.329g，0.544mmol，1.05eq)，加原料78101-11(0.25g，0.52mmol，1.0eq)，三乙胺(0.25g，1.56mmol，3.0eq)，DMF(2mL)，加完後在冰浴下降溫5-10min，使內溫達到-5℃，然後緩慢加入T3P(50% DMF)(0.9mL,1.82mmol,3.5eq)，加完後在自然升溫條件下攪拌16小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，目標產物為主峰，有目標產物脫水的副產物生成，兩者的比例為2.5/1，停止反應，反應液直接經pre-HPLC純化，得白色固體產品781F10(223mg，收率40%，純度96%。Ms(ESI)：m/z 1092.4[M+Na]⁺。

10. 781F11的合成

在50mL三口瓶中加入原料781F10(0.22g，0.206mmol，1.0eq)，加原料四氮唑(0.20g，2.87mmol，14.0eq)，N,N-二乙基亞磷醯胺二三級丁酯(0.616g，2.47mmol，12.0eq)，DMF(2.6mL)，加完後在室溫下反應2小時，取樣LCMS檢測，原料反應完全，生成了中間體，中間體為兩個峰，冰浴下降溫5-10min，使內溫達到0℃，然後緩慢加入H₂O₂(30%)(0.13g,0.57mmol,5.5eq)，加完後在室溫下攪拌1小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，目標產物為主峰，停止反應，反應液直接經pre-HPLC純化，得白色固體產品781F11(184.1mg，收率70.8%，純度98%。Ms(ESI)：m/z 1284.6[M+Na]⁺。

11. 781F12的合成

在25mL單口瓶中加入原料781F11(0.285g，0.233mmol，1.0eq)，加原料piperidine(0.17g，1.96mmol，8.5eq)，乙腈(5mL)，加完後在室溫條件下攪拌0.5小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，目標產物為主峰。後處理為減壓旋乾溶劑，加入5mL石油醚打漿，在室溫下攪拌2小時，然後過濾，濾餅再用2mL石油醚洗滌兩次，得白色固體產品781F12(209mg，收率91%，純度90%。Ms(ESI)：m/z 1004.4[M+H]⁺。

12. 781F13的合成

在25mL單口瓶中加入原料2-溴乙酸(0.074g，0.523mmol，2.6eq)，加原料EEDQ(0.13g，0.523mmol，2.6eq)，DMF(1mL)，加完後在室溫下攪拌1小時，反應液由無色變為黃綠色，這時，加入781F12(0.21g，0.201mmol，1.0eq)的DMF(0.5mL)溶液，加完後在室溫下攪拌1.6小時。取樣LCMS檢測，原料反應完全，目標產物為主峰。停止反應，先用二氯甲烷(40mL)稀釋，再用1M HBr(10mL x 2)洗滌，然後飽和碳酸氫鈉(20mL x 2)洗滌，最後用飽和食鹽水洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，油泵減壓旋乾，得褐色固體粗品781F13(230mg，粗，純度80%。Ms(ESI)：m/z 1182.4[M+Na]⁺。

13. 化合物1的合成

在25mL單口瓶中加入原料781F13(0.240g，0.201mmol，1.0eq)，DCM(2mL)，加完後在冰浴下降溫5min，使內溫達到0℃，然後緩慢加入三氟乙酸 (1mL)，加完後在室溫下攪拌40分鐘。取樣LCMS檢測，原料反應完全，目標產物為主峰，反應液在冰浴下減壓旋乾後經pre-HPLC純化，凍乾得白色固體產品化合物1(78mg，收率39.2%，純度99%。Ms(ESI)：m/z 1014.2[M+Na]⁺。

14. ADC-1(9E6-L4H2-化合物1)的合成

於37℃，向抗體9E6-L4H2的緩衝液A緩衝水溶液(pH=6.3的0.05M緩衝水溶液；40.0mg/ml，4.0mL，0.27mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP.HCl)的水溶液(2.5mM，540.5uL，1.35mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。加入1.0M Tris緩衝液pH=8.30(560uL)。

將化合物1(2.68mg，2.70mmol)溶解於200ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：緩衝液A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-1(9E6-L4H2-化合物1)的緩衝液A緩衝液(1.97mg/mL，19.7mL，收率97%)，於4℃冷凍儲存。理論DAR值為4，實測DAR值為4。

實施例19：抗體藥物偶聯物ADC-2(9E6-L4H2-化合物2)的製備

1. (((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸三級丁基酯(化合物1b)的製備

將原料1a(5.14g，20.0mmol，1.0eq)和L-苯丙胺酸三級丁酯鹽酸鹽(7.08g，20.0mmol，1.0eq)置入250mL三口燒瓶中，加入無水DMF(60mL)溶清。冰浴冷卻，再加入HATU(9.12g,24.0mmol,1.2eq)和DIEA(7.74g，60.0mmol，3.0eq)，保持冰浴反應2小時。向反應液中加入水，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得白色固體產品1b(11.5g，收率100%)，粗品可直接投入下一步。

MS(ESI)：m/z 580.3[M+Na]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.21-8.16(m,1H),8.12-8.05(m,1H),7.91-7.87(m,2H),7.72-7.68(m,2H),7.64-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,2H),7.36-7.25(m,4H),7.23-7.18(m,3H),4.41-4.18(m,4H),3.76-3.72(m,2H),3.68-3.61(m,2H),2.98-2.89(m,2H),2.69(s,2H),1.30(s,9H).

2. 甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸三級丁酯(化合物1c)的製備

將原料1b(5.57g，10.0mmol，1.0eq)置入250mL三口燒瓶中，加入無水DCM(60mL)溶清，冰浴冷卻。緩慢加入哌啶(8.5g，100.0mmol，10.0eq)，加畢之後維持室溫攪拌反應約2小時。直接將反應液濃縮至乾，粗品經管柱層析純化得產品1c為淺黃色漿狀物(2.70g，收率81%)。MS(ESI)：m/z 358.3[M+H]⁺。

3. (1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸三級丁酯(化合物1d)的製備

100mL三口燒瓶中加入原料1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-油酸(1.0g，2.05mmol，1.0eq；來源於通萊生化，批號：P110114)和1c(0.69g，2.05mmol，1.0eq)，加入無水DMF(25mL)溶清，冰浴冷卻。加入HATU(1.01g,2.67mmol,1.3eq)和DIEA(529mg，4.10mmol，2.0eq)，維持冰浴反應1小時。向反應液中加入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，乾燥且減壓濃縮得1d為淺黃色油狀物(1.60g，收率97%)。

MS(ESI)：m/z 805.3[M+H]⁺。

4. (1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸(化合物1e)的製備

100mL單口瓶中加入原料1d(1.60g，1.99mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(16mL)溶解。室溫下加入三氟乙酸(8mL)，維持攪拌反應2小時。將反應液直接濃縮至乾得黃色將狀物，加入乙酸乙酯溶解，飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得1e為黃色油狀物(1.23g，收率83%)；

MS(ESI)：m/z 749.3[M+H]⁺。

5. (9H-芴-9-基)甲基(2-(((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯(化合物1f)的製備

100mL三口瓶中加入原料布地奈德(1.29g，3.0mmol，1.0eq)和(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)乙酸甲酯(1.16g，3.15mmol，1.05eq；參考文獻“Tetrahedron,2018,74(15),1951-1956”製備得到)及對甲苯磺酸吡啶鹽(75mg，0.30mmol，0.1eq)。室溫下加入無水四氫呋喃(20mL)，回流加熱反應4小時。直接將反應液濃縮至乾，粗品管柱層析純化得產品1f為白色固體(0.54g，收率24%)。

MS(ESI)：m/z 739.4[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.76-8.69(m,1H),7.91-7.84(m,2H),7.73-7.67(m,2H),7.63-7.57(m,1H),7.43-7.58(m,2H),7.35-7.23(m,3H),6.13(d,J=7.5Hz,1H),5.91(s,2H),5.15-4.97(m,1H),4.73-4.45(m,5H),4.30-4.09(m,5H), 3.65-3.59(m,2H),2.29-2.21(m,1H),2.11-1.87(m,2H),1.74-1.21(m,11H),1.09-0.77(m,8H).

6. 2-胺基-N-((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-側氧乙氧基)甲基)乙醯胺(化合物1g)的製備

25mL單口瓶中置入原料1f(540mg，0.73mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(10mL)溶解。冰浴冷卻，加入DBU(167mg，1.10mmol，1.5eq)，維持攪拌反應30分鐘。加入水分液，水相用二氯甲烷萃取兩次，飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮得1g淺黃色半固體(450mg粗品含芴烯，收率100%)，粗品可以直接用於下一步反應。

MS(ESI)：m/z 517.4[M+H]⁺。

7. (9H-芴-9-基)甲基((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,21,24,27,30-五側氧-5,8,11,14,17-五胺雜三十烷-32-基)胺基甲酸酯(化合物1h)的製備

100mL三口燒瓶中置入原料1g(0.45g粗品，折算為0.73mmol，1.0eq)和1e(0.55g，0.73mmol，1.0eq)，加入無水DMF(9mL)溶清。冰浴冷卻，再依次加入HATU(361mg,0.95mmol,1.3eq)和DIEA(189mg，1.46mmol，2.0eq)，維持攪拌反應1小時。向反應液中加入水，二氯甲烷萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌一次，乾燥且減壓濃縮得黃色油固狀粗品。將固體粗品在混合溶劑石油醚和乙酸乙酯中打漿純化，得產品1h為淺黃色固體(710mg，收率78%)。

MS(ESI)：m/z 1269.7[M+Na]⁺。

8. 1-胺基-N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-側氧-5,8,11,14-聚四乙二醇-16-基-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物1i)的製備

25mL單口瓶中置入原料1h(350mg，0.28mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(10mL)溶清。冰浴冷卻，加入DBU(64mg，0.42mmol，1.5eq)，維持攪拌反應1小時。直接將反應液濃縮至乾，得油狀物粗品，再經管柱層析純化得產品1i為淺黃色泡沫狀固體(289mg，收率89%)。

MS(ESI)：m/z 1025.6[M+H]⁺。

9. N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-側氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物2)的製備

25ml Schlenk-Tube中置入溴乙酸固體(35.2mg，0.25mmol，2.0eq)和EEDQ(63mg，0.25mmol，2.0eq)，加入無水DMF(5mL)溶清。維持室溫攪拌反應1小時。原料1i(130mg，0.127mmol，1.0eq)溶解在DMF(2mL)中，將此溶液逐滴加入到上述製備的活性酯溶液中，加畢，再維持室溫反應2小時。

向反應體系中加入水，乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌，乾燥且減壓濃縮得油狀物粗品，再經管柱層析純化得化合物2為淺黃色固體(39mg，收率27%)。

MS(ESI)：m/z 1145.5/1147.6[M+1]⁺。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.62-8.57(m,1H),8.34-8.28(m,2H),8.19-8.11(m,2H),8.03-7.99(m,1H),7.30-7.17(m,6H),6.15(d,J=9.6Hz,1H),5.92(s,2H),5.18-5.03(m,1H),4.72-4.47(m,5H),4.29-4.15(m,2H),3.78-3.42(m,27H),3.27-3.21(m,2H),3.06-2.84(m,2H),2.41-2.28(m,3H),2.06-1.73(m,2H),1.60-1.24(m,10H),1.01-0.82(m,8H).

10. ADC-2(9E6-L4H2-化合物2)的製備

於37℃，向抗體9E6-L4H2的緩衝液A緩衝水溶液(pH=6.3的0.05M緩衝水溶液；15.0mg/ml，1.5mL，0.10mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP.HCl)的水溶液(2.5mM，170.3uL，0.42mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。加入1.0M Tris緩衝液pH=8.30(210uL)。

將化合物2(1.16mg，1.0mmol)溶解於75ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：緩衝液A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-2(9E6-L4H2-化合物2)的緩衝液A緩衝液(5.14mg/mL，2.48mL)，收率85%，於4℃冷凍儲存。理論DAR值為4.0，實測DAR值為3.8。

實施例20. 抗CD40-ADC與人CD40和食蟹猴CD40的親和力測定

將待測抗體和抗CD40-ADC親和捕獲在抗人Fc的芯片上，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的帶有His標簽的人或食蟹猴CD40抗原，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP+ 10×緩衝溶液(Cat.# BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀釋至1×(pH 7.4)。實驗得到的數據以(1：1)Binding模型進行擬合，得出親和力數值，見表24。

表24. 抗CD40-ADC與不同種系CD40的SPR親合力

實施例21. 抗CD40-ADC在CD40介導的GRE報告基因系統中的活性

在Hela細胞中用慢病毒建立穩定轉染MMTV-Luc的報告基因細胞系，MMTV可響應糖皮質激素受體的激活，後續將該細胞系稱為GRE報告基因細胞系。將穩轉Hela-MMTV-Luc細胞系鋪板於96孔板中(30000個細胞/孔)，每孔用lipo3000轉染空載質粒或人CD40質粒(hCD40，50ng/孔)。過夜後與不同濃度的抗CD40-ADC孵育，22h後用Bright-Glo(promega)檢測試劑檢測報告基因系統中螢光酶的表達。

結果如表25和圖11A(實驗1)、11B(實驗2)所示，ADC-1和ADC-2特異地激活表達CD40的GRE報告基因細胞系，在不表達CD40的GRE報告基因細胞系中無活性。對照分子ref-ADC(對照分子為CN111465399A，表6B中實例13-水解所示的ADC分子；抗體對應為Ab102，其包含如序列3所示的重鏈和序列4所示的輕鏈；CN111465399A藉由引用全文併入本揭露)在CD40-GRE細胞系中活性更高，但在不表達CD40的GRE報告基因細胞系表現出非特異的激活活性。

表25. 抗CD40-ADC在CD40介導的GRE報告基因系統中的活性

實施例22. 抗CD40-ADC在B細胞激活實驗體系中的抑制活性

將人PBMC以2E5/孔，每孔50μL鋪入96孔細胞培養板(培養基為RPMI-1640，10% FBS,1%青黴素-鏈黴素)。每孔加入50μL梯度稀釋的待測抗體或ADC，37℃，5%CO₂條件共孵育0.5小時。每孔加入50μL預孵育的CD40L-his和抗His抗體，刺激過夜。第二天離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍，加入100μL 1：1000稀釋的Fixable viability dye EF780(Invitrogen,65086514)室溫染色15分鐘。細胞洗滌兩遍後加入100μL 1：200稀釋的人Fc blocker(BD,564220)室溫封閉10分鐘。離心細胞後加入100μL流式抗體(PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD19(Biolegend,302230,1：100稀釋)，APC anti-human CD69(Biolegend,310910,1：200稀釋))，4℃孵育0.5小時。離心去除上清，細胞用FACS緩衝液洗滌兩遍後，用200μL FACS緩衝液重新懸浮細胞，流式細胞儀(BD FACS Celesta)檢測細胞表面的螢光強度。

結果如表26和圖12A、圖12B所示，ADC-1和ADC-2與單抗9E6-L4H2具有相似的B細胞抑制活性。

表26. 抗CD40-ADC在B細胞激活實驗體系中的抑制活性

加入抗體或ADC後，CD19+CD69+信號低於本底值，可能是因為一定程度抑制了B細胞的本底激活(除抑制CD40L誘導的信號外)。

實施例23. 小鼠皮膚移植排斥模型

雄性Balb/c小鼠，6週齡，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部。飼養環境：SPF；生產許可證：SCXK(滬)2018-0006；Balb/c小鼠合格證編號：20180006023393。

雌性人CD40轉基因小鼠，6-7週齡，購自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司。飼養環境：SPF；生產許可證：SCXK(蘇)-2016-0004；人CD40轉基因小鼠合格證編號：320726200100179778。

動物到達後適應性飼養7天，隨機分組。實驗第-2天，小鼠腹腔注射CD40拮抗型抗體、抗CD40-ADC或糖皮質激素。實驗第0天，4%水合氯醛麻醉供體Balb/c小鼠和C57BL6/J小鼠，取下供體小鼠尾巴，分離整圈長度1cm尾部皮膚。受體小鼠背部去毛，沿皮膚層切口，在保留背部脂肪和結締組織的情況下去掉等面積的皮膚，將供體皮膚放置於受體小鼠切口處，使用膠水縫合邊緣皮膚，放入籠中恢復。具體實驗流程如圖13A所示。

藉由表27的給藥方案給藥小鼠，小鼠恢復7天後，每天觀察小鼠皮膚生存情況，根據排斥評分記錄排斥分數。評分體系如下，3：皮膚沒有出現紅色，光滑；2：部分皮膚發紅，失去光澤，乾燥；1：皮膚大部分變紅，沒有條紋，縮水；0：移植排斥導致80%的皮膚壞死。

表27. 小鼠皮膚移植排斥模型給藥方案1

結果如表28-29、圖13B和圖13C所示，9E6-L4H2和ADC-1均顯著改善小鼠皮膚移植物評分，並延長皮膚移植物的存活時間。相比CD40拮抗劑單抗9E6-L4H2，ADC-1的抗移植排斥活性更優。

表28. 抗CD40-ADC的皮膚移植物生存率(%)

表29. 抗CD40-ADC的皮膚移植物評分

此外，如圖13D和圖13E所示，ADC-1具有略優於高劑量地塞米松的抗移植排斥活性，和優於CD40拮抗劑單抗的抗移植排斥活性。

表30. 抗CD40-ADC和高劑量地塞米松的皮膚移植物生存率(%)

表31. 抗CD40-ADC和高劑量地塞米松的皮膚移植物評分

此外，藉由表32的給藥方案給藥小鼠，小鼠恢復7天後，用上述同樣的方法每天觀察小鼠皮膚生存情況，根據排斥評分記錄排斥分數。

表32. 小鼠皮膚移植排斥模型給藥方案2

結果如圖14A和圖14B所示，ADC-1和ADC-2具有相似的抗移植排斥活性，均顯著優於CD40拮抗劑單抗9E6-L4H2、單抗聯用糖皮質激素，並且略優於高劑量地塞米松。

表33. 抗CD40-ADC的皮膚移植物生存率(%)

表34. 抗CD40-ADC的皮膚移植物評分

實施例24. 抗CD40-ADC的副作用評價

在實施例23所述的體內藥效實驗最後一天，向小鼠腹腔注射1mpk ACTH，30分鐘後收集小鼠外周血和血漿用於血常規和激素副作用相關指標檢測。其中內源皮質酮用LC-MS定量，P1NP用抗鼠P1NP ELISA試劑盒(Novusbio，NBP2-76466)檢測。

結果如表35所示，高劑量地塞米松表現出明顯的毒副作用：降低體重、降低免疫細胞數目、抑制內源HPA軸。ADC-1劑量依賴地降低小鼠外周血免疫細胞數目(可能由於抗CD40-ADC將激素富集在CD40陽性細胞中)，但對內源皮質酮釋放和骨生成指標P1NP無影響，安全性優於同劑量對照分子ref-ADC。

表35. 抗CD40-ADC的副作用

此外，如表36所示，10mg/kg ADC-1和ADC-2的安全性良好，相比高劑量地塞米松均無激素相關副作用。

表36. 抗CD40-ADC的副作用

雖然以上描述了本揭露的具體實施方案，但是所屬技術領域中具有通常知識者應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本揭露的原理和實質的前提下，可以對這些實施方案做出多種變更或修改。

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Claims

一種抗體-藥物偶聯物，其包含抗CD40抗體或其抗原結合片段，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

a-1)該VH包含如SEQ ID NO：13-14中任一所示VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：9-12中任一所示VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

a-2)該VH包含如SEQ ID NO：1所示VH中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含如SEQ ID NO：2所示VL中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

其中，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4和5所示的序列；和輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：6、7和19所示的序列；

較佳地，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含：

重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3，其分別包含如SEQ ID NO：3、4和5所示的序列；輕鏈LCDR1，其包含如SEQ ID NO：6所示的序列；輕鏈LCDR2，其包含如SEQ ID NO：7所示的序列；和輕鏈LCDR3，其包含如SEQ ID NO：8和15-18中任一所示的序列。
如請求項1或2所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體選自重組抗體、兔源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項3所述的抗體-藥物偶聯物，其中，

該人源化抗體或其抗原結合片段的重鏈框架區源自IGHV2-26*01、IGHV4-30-4*02、IGHV4-4*08、和IGHJ1*01；和/或，輕鏈框架區源自IGkV1-13*02、IGkV1-9*01、IGkV1-6*01、和IGKJ4*01；

較佳地，重鏈框架區的FR1-FR3源自IGHV2-26*01、IGHV4-30-4*02、和IGHV4-4*08，重鏈框架區的FR4源自IGHJ1*01；輕鏈框架區的FR1-FR3源自IGkV1-13*02、IGkV1-9*01、和IGkV1-6*01，輕鏈框架區的FR4源自IGKJ4*01。
如請求項1至4中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體或其抗原結合片段包含VH和VL，其中，

A-1)該VH包含如SEQ ID NO：13所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該VL包含如SEQ ID NO：9-12中任一所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；

A-2)該VH包含如SEQ ID NO：14所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該VL包含如SEQ ID NO：9-12中任一所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；或

A-3)該VH包含如SEQ ID NO：1所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列，該VL包含如SEQ ID NO：2所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項1至5中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體或其抗原結合片段進一步含有IgG抗體的Fc區；較佳地，該IgG抗體為IgG1、IgG2或IgG4抗體；更佳地，該Fc區為IgG1的Fc區，其含有選自297A、234A、235A、252Y、254T、和256E中任一個或多個突變，該突變根據EU編號規則編號。
如請求項1至6中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體的抗原結合片段為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
如請求項1至7中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該抗CD40抗體包含重鏈和輕鏈，其中，

該重鏈包含如SEQ ID NO：20或22所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列；該輕鏈包含如SEQ ID NO：21所示或與之具有至少90%同一性的胺基酸序列。
如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其為式(I)所示結構的抗體-藥物偶聯物：

Ab-(L-D)_k (I)；

其中，Ab為如請求項1至8中任一項所定義的抗CD40抗體或其抗原結合片段；

D為具有免疫抑制活性的效應分子，較佳為糖皮質激素受體激動劑、鈣調磷酸酶抑制劑、或雷帕黴素靶蛋白(mTOR)激酶抑制劑；

L為將Ab共價連接於D的連接子，k為1-20的整數或小數。
如請求項9所述的抗體-藥物偶聯物，其中，D如下式所示：

或

其中，

R_1a各自獨立地選自氫、烷基和烷氧基，該烷基和烷氧基視需要被選自烷基、烷氧基、鹵素、氘、胺基、氰基、硝基、羥基和羥烷基中的一個或多個取代基所取代，較佳R_1a各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

環A選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

環B選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

X₁選自-(CR_5aR_5b)m-、視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基；

R_5a、R_5b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、硝基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、烷氧基、烷硫基、烯基和炔基；

環C、環D各自獨立地選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基、雜芳基、稠環芳基或稠雜芳基，且環C、環D中至少有一個選自視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的稠環芳基或稠雜芳基；

X₂選自-(CR_6aR_6b)n-、視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的芳基或雜芳基、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)(O)-、-NR_6c-、-CH₂S-、-CH₂O-、-NHCR_6dR_6e-、-CR_6f=CR_6g-、-C≡C-或者X不存在；

R_6a、R_6b各自獨立地選自氫、鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、硝基、氰基或視需要被一個或多個取代基Q₁所取代的下述基團：烷基、-NR_iR_j、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、烷氧基、烷硫基、烯基和炔基，或者R_6a、R_6b與其相鄰的碳原子一起形成3員至10員環烷基；

R_6c、R_6d、R_6e、R_6f、R_6g各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基或C₁-C₆烷氧基；

R₁各自獨立地選自氫、烷基或烷氧基，其中該烷基和烷氧基各自獨立地視需要被選自烷基、烷氧基、鹵素、氘、胺基、氰基、硝基、羥基和羥烷基中的一個或多個取代基所取代，較佳R₁各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基，更佳氫；

R₂各自獨立地選自-CH₂OH、-CH₂SH、-CH₂Cl、-SCH₂Cl、-SCH₂F、-SCH₂CF₃、-OH、-OCH₂CN、-OCH₂Cl、-OCH₂F、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-SCH₂CN、

R_2a各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R_2b各自獨立地選自C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R_2c各自獨立地選自氫、C₁-C₆烷基、-CH₂OH或C₁-C₆烷氧基；

R_2d和R_2e各自獨立地選自氫或C₁-C₆烷基；

R₃各自獨立地選自氫或鹵素；

R₄各自獨立地選自氫、鹵素或羥基，較佳R₄各自獨立地選自氫；

m、n各自獨立地選自1至6的整數；

取代基團Q₁各自獨立地選自C₁-C₆烷基、鹵素、氘、羥基、巰基、-NR_iR_j、側氧、硫基、-C(O)R_k、-C(O)OR_k、-S(O)R_k、-S(O)OR_k、-S(O)(O)R_k、-S(O)(O)OR_k、-C(S)R_k、硝基、氰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、3至10員環烷基、3至10員雜環基、6至10員芳基、5至10員雜芳基、8至12員稠環芳基和5至12員稠雜芳基，較佳Q₁各自獨立地選自鹵素、羥基、巰基、氘、側氧、硫基、氰基、胺基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基或鹵C₁-C₆烷氧基；

R_i、R_j各自獨立地選自氫原子、羥基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基；

R_k各自獨立地選自氫原子、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基、C₁-C₆烷氧基、羥基、-NR_iR_j，其中該烷基、烷氧基、鹵烷基視需要被選自C₁-C₆烷基、鹵素、羥基、巰基、-NR_iR_j、側氧、硫基、羧基、硝基、氰基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷硫基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、3至10員環烷基、3至10員雜環基、6至10員芳基和5至10員雜芳基中的一個或多個取代基所取代，較佳R_k各自獨立地選自氫原子、C₁-C₆烷基、C₁-C₆鹵烷基、C₁-C₆烷氧基、羥基、-NR_iR_j；

條件是當R_5a為氫或烷基時，R_5b不為氫或烷基；

較佳地，D為如下結構所示：
如請求項10所述的抗體-藥物偶聯物，其中連接子包含胺基酸單員，該胺基酸單員較佳包含由2至7個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、高賴胺酸、n-甲基-纈胺酸、
的胺基酸構成的肽殘基，q為1-6的整數，更佳纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(Ala-Phe)；苯丙胺酸-賴胺酸(Phe-Lys)、苯丙胺酸-高賴胺酸(Phe-Homolys)、n-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-谷胺酸(Gly-Glu)、谷胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)和甘胺酸-賴胺酸(Gly-Lys)、甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(Glv-Val-Cit)和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Gly)、
，最佳甘胺酸-谷胺酸(Gly-Glu)；

較佳地，該抗體-藥物偶聯物，其中連接子包含拉伸單元，較佳該拉伸單元選自

、
或
，其中p各自獨立地選自1、2、3、4、5或6；

較佳地，該連接子為
。
如請求項10或11所述的抗體-藥物偶聯物，其為如下結構所示：

其中，p為1-6的整數，k為1-10的整數或小數；

較佳地，該抗體-藥物偶聯物如下結構所示：

其中，k為1-10的整數或小數，較佳為4±0.4。
如請求項9所述的抗體-藥物偶聯物，其中，該D為糖皮質激素，較佳包含如下所示結構：
如請求項13所述的抗體-藥物偶聯物，其中L-D是由下式表示的化學部分：-Str-Pep-Sp-D，

其中，Str是與Ab共價連接的伸展基單元；

Sp為間隔單元，較佳為-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、-NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃-C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、-NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、
、
、

、
、
或
；

Pep選自胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或以下非肽化學部分：

，
或
，其中，W是-NH-亞(伸)雜環烷基-或雜環烷基；Y是亞(伸)雜芳基、亞(伸)芳基、-C(O)C_1-6亞(伸)烷基、C_2-6亞(伸)烯基、C_1-6亞(伸)烷基或-C_1-6亞(伸)烷基-NH-；每個R¹⁶獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(NH)NH₂或-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(O)NH₂；R¹⁷和R¹⁸各自獨立選自氫、C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基，或R¹⁷和R¹⁸一起可形成C_3-6環烷基；R¹⁹和R²⁰各自獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基、(C_1-6烷基)OCH₂-，或R¹⁹和R²⁰一起可形成C_3-6環烷基環。
如請求項14所述的抗體-藥物偶聯物，其中Str選自下式表示的化學部分：

或
，其中R²¹選自-W1-C(O)-、-C(O)-W1-C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-，其中W1選自C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、氰基、胺基、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和C_3-6環烷基的基團所取代；

L¹選自-NR²²(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-、-NR²²(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、-S(CH₂)_p1C(O)-、-(CH₂)_p1C(O)-或單鍵，較佳單鍵；p1為1至20的整數，R²²選自氫原子、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基或氘代C_1-6烷基；

較佳地，其中R²¹選自C_1-6亞(伸)烷基C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₃C(O)-和-(CH₂-CH₂O)₄C(O)-。
如請求項14或15所述的抗體-藥物偶聯物，其中Pep選自纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺、甘胺酸-甘胺酸-賴胺酸、纈胺酸-賴胺酸(Val-lys)、纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-苯丙胺酸或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸。
如請求項13至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗體-藥物偶聯物中連接子L包含：-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₆-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₈-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅-Val-Cit、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(CH₂)₅- Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH-(PEG)₆-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH-(PEG)₈-Ala-Ala-Asn、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺、-CH₂C(O)NH-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、-CH₂C(O)NH-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺或Mal-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-二硫化物。
如請求項13至17中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其為如下結構所示：

其中k為1至10的整數或小數，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2；

較佳地，該抗體-藥物偶聯物如下結構所示：

其中，k為1-10的整數或小數，較佳為4±0.4。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至18中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，以及，一種或多種可藥用的賦形劑。
一種製備如請求項1至18中任一項所述的抗體-藥物偶聯物的方法，其包括如下步驟：

將該抗CD40抗體或其抗原結合片段與藥物偶聯反應，得到該抗體-藥物偶聯物；可選地，該方法還包括：純化該抗體-藥物偶聯物。
一種如請求項1至18中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或如請求項19所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，其中該藥物用於治療或緩解自身免疫性疾病、移植物抗宿主病和/或移植排斥反應。
一種預防或治療移植排斥反應、移植物抗宿主病和/或自身免疫性疾病的方法，其包括向有需要的受試者施用預防或治療有效量的如請求項1至18中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或如請求項19所述的醫藥組成物；較佳地，該受試者是進行器官或組織移植後的受試者。