TW202417506A - 標靶egfr之雙抗原決定四價抗體 - Google Patents
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Abstract
一種對EGFR之至少兩個抗原決定基具有結合親和力的雙抗原決定四價抗體。該抗體包含抗體骨架及連接至該抗體骨架之scFv域。EGFR之該兩個抗原決定基可包括EGFR野生型(EGFRwt)抗原決定基及EGFRvIII抗原決定基。該抗體對該EGFRvIII抗原決定基之結合親和力強於對該EGFRwt之結合親和力。
Description
相關申請案之交叉參考
本申請案根據專利法主張2022年8月31日提審之美國臨時申請案序列號63/402,945的申請日權益,該申請案之全部揭示內容藉由引用併入本文。
本揭示案一般係關於抗體癌症治療劑的技術領域,且更具體地係關於雙抗原決定四價抗體。
多形性神經膠母細胞瘤是一種侵襲性形式的癌症,其佔腦部惡性腫瘤的大部分且預後較差,診斷後平均存活期為14-15個月。
1很大一部分的神經膠母細胞瘤病例(34-63%)涉及EGFR基因之擴增。
2除了野生型EGFR蛋白的過表現之外,EGFR之突變型版本亦出現於63-75%之病例中,該等突變型版本中最常見的是EGFRvIII且其出現於25-64%之病例中。
2在結構上,EGFRvIII突變導致蛋白質之細胞外域的267個殘基缺失,這從功能上講,由於受體內吞作用效率較低,可能會誘導組成型傳訊。
2此等變化引起攜帶EGFRvIII之腫瘤表現出增殖增加、血管生成增加及細胞凋亡減少。
2除了與多形性神經膠母細胞瘤相關性之外,野生型EGFR及突變型EGFRvIII亦可能在其他類型的實體腫瘤中過表現,該等實體腫瘤包括卵巢癌、乳癌及肺癌。
2
FDA已經批准了若干種標靶EGFR之抗體(包括西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)及耐昔妥珠單抗(Necitumumab))用於治療上皮性腫瘤。尼妥珠單抗(Nimotuzumab)亦被若干個國家批准用於治療實體腫瘤。與西妥昔單抗或帕尼單抗相比,尼妥珠單抗對EGFR的親和力較低,這可能有助於解釋其降低之皮膚毒性。
3與此同時,專門靶向突變型EGFRvIII的基於抗體之療法已在臨床試驗中得到評價,該等療法包括單株抗體迪妥昔珠單抗(Depatuxizumab) (第一期)及抗體藥物偶聯物迪妥昔珠單抗莫福汀(Depatuxizumab mafodotin) (第三期)。詳言之,針對EGFRvIII靶向性ADC的第3期試驗在新診斷神經膠母細胞瘤的患者中未達到總存活期之主要終點後被停止。
4標靶EGFRvIII及CD3的T細胞接合劑亦已進行臨床前評估,進一步強調了EGFRvIII作為治療標靶的前景。
5,6雖然EGFRvIII靶向療法不會很快上市,但仍沒有這樣的單一治療劑,其同時靶向表現包括過度表現(wt)及突變EGFR (vIII)二者的致癌EGFR的腫瘤細胞。
西妥昔單抗及ABT806衍生抗體的一個潛在缺點為,此等抗體之可變區是在小鼠中發現的,且保留了非人類序列。已證明,與人源化抗體或人類抗體相比,嵌合抗體可能具有增強的免疫原性能力。
7在另一個方面,人源化不僅可以降低免疫原性,而且可以藉由使可變區及恆定區更加相容來增加抗體的穩定性。
8
西妥昔單抗與其抗原EGFR的高親和力可能導致中靶、腫瘤外結合。因此,經常觀察到毒性諸如嚴重皮膚刺激。與此同時,以較低親和力結合EGFR之尼妥珠單抗在此等不期望副作用方面似乎較少。
9因此,降低抗體(如西妥昔單抗)之親和力可能是有利的,以便保留其抗原特異性,同時減少與低表現健康組織的結合,從而增加治療指數。在雙特異性抗體之背景下,減弱親和力可能有助於平衡兩個結合域之相對強度,且有效最佳化抗體之整體特異性。
以下概述僅是說明性的,且不旨在以任何形式進行限制。除上文描述的說明性態樣、實施例及特徵之外,其他態樣、實施例及特徵藉由參考圖式及以下詳細描述將變得顯而易見。
本揭示案提供了標靶EGFR之至少兩個抗原決定基的雙抗原決定四價抗體以及製備及使用該抗體的方法。
在一個態樣中,本申請案提供了對EGFR之至少兩個抗原決定基具有結合親和力的雙抗原決定四價抗體。抗體可包括抗體骨架,其包含具有抗體輕鏈可變(VL)域之抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(VH)域之抗體重鏈,其中抗體VL域及抗體VH域形成Fab區。抗體可進一步包括具有scFv輕鏈可變(VL)域及scFv重鏈可變(VH)域之scFv域,其中該scFv域藉由域間連接子連接至抗體輕鏈或抗體重鏈之至少一端。
在一個實施例中,各scFv域具有N末端-VH-連接子-VL-C末端或N末端-VL-連接子-VH-C末端之結構次序。在一個實施例中,連接子包含具有約20個胺基酸之撓性GS連接子。在一個實施例中,連接子包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)m,且其中m是至少3之整數。在一個實施例中,m是4。
在一個實施例中,域間連接子包含約10個至約30個胺基酸。在一個實施例中,域間連接子包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)m,且其中m是至少2之整數。在一個實施例中,m是2至6之整數。
在一個實施例中,EGFR之兩個抗原決定基包含EGFR野生型(EGFR wild-type ,EGFRwt)抗原決定基及EGFRvIII抗原決定基,且雙抗原決定四價抗體對EGFRvIII的結合親和力強於對EGFRwt的結合親和力。在一個實施例中,抗體對EGFRwt抗原決定基具有第一KD之結合親和力,且對EGFRvIII抗原決定基具有第二KD之結合親和力,其中第一KD高於第二KD。
在一個實施例中,第一KD不小於1E-11 M,且第二KD不大於1E-06 M。在一個實施例中,第一KD在1E-10 M與1E-06 M之間,且第二KD在1E-11 M與1E-07 M之間。在一個實施例中,第一KD是第二KD的多於1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍或70倍。在一個實施例中,第一KD是第二KD的1.1至1000倍。
在一個實施例中,抗體具有針對僅攜帶EGFRwt之細胞的第一ADCC EC50及針對攜帶EGFRwt及EGFRvIII之細胞的第二ADCC EC50,其中第一ADCC EC50大於第二ADCC EC50。在一個實施例中,第一ADCC EC50是第二ADCC EC50的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍。
在一個實施例中,EGFRwt抗原決定基包含對西妥昔單抗具有結合親和力之抗原決定基。在一個實施例中,EGFRvIII抗原決定基包含對ABT-806具有結合親和力之抗原決定基。
在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體之scFv域對EGFRwt抗原決定基具有結合親和力,且Fab域對EGFRvIII抗原決定基具有結合親和力。在一個實施例中,scFv域對EGFRvIII抗原決定基具有結合親和力,且Fab域對EGFRwt抗原決定基具有結合親和力。
在一個實施例中,scFv域連接至雙抗原決定四價抗體輕鏈的C末端。在一個實施例中,scFv域連接至抗體輕鏈的N末端。在一個實施例中,scFv域連接至抗體重鏈的C末端。在一個實施例中,scFv域連接至抗體重鏈的N末端。
在一個實施例中,抗體骨架可衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、或人源化去成熟西妥昔單抗(亦即,西妥昔單抗衍生之骨架)、或尼妥珠單抗,且scFv域可包含衍生自ABT-806或人源化ABT-806的結合域。
或者,抗體骨架可衍生自ABT-806或人源化ABT-806,且scFv域可包含衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、或人源化去成熟西妥昔單抗、或尼妥珠單抗的結合域。
在一個實施例中,人源化ABT-806是ABT-806 V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9。
西妥昔單抗骨架雙抗原決定四價抗體
在一個實施例中,本申請案提供了雙抗原決定四價,其中抗體骨架衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、或人源化去成熟西妥昔單抗(亦即,西妥昔單抗衍生之骨架)。在一個實施例中,scFv域包含衍生自ABT-806或人源化ABT-806之可變區的結合域。
在一個實施例中,抗體骨架包含選自VH-Y101、VH-Y102、VH-D103、VH-Y104、VL-N92或其組合的西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)。在一個實施例中,西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K或其組合。
在一個實施例中,抗體重鏈包含與SEQ ID NO.1、13、79、97、101、103、105、107、123、127、129、131或133具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.3、81、83、99、109、125或135具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體骨架包含人源化西妥昔單抗。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.237具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO.239具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體骨架包含去成熟西妥昔單抗。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO.243或269具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體骨架包含人源化去成熟西妥昔單抗。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.245、249、255或257具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO.241具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,人源化ABT-806是ABT-806 V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8或V9。
在一個實施例中,scFv域包含ABT-806或人源化ABT-806之可變區。
在一個實施例中,scFv VH域包含與SEQ ID NO.209、225、229或233具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv VL域包含與SEQ ID NO.211、227、231或235具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體VH域包含SEQ ID NO.201、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267之3個互補決定區(complementary determining region,CDR)。在一個實施例中,抗體VL域包含SEQ ID NO.203、239、241、243或269之3個CDR。在一個實施例中,scFv VH域包含SEQ ID NO.209之3個CDR。在一個實施例中,scFv VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。
在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體包含與SEQ ID NO.1、3、13、79、81、83、97、99、101、103、105、107、109、123、125、127、129、131、133或135具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
ABT-806骨架雙抗原決定四價抗體
在一個實施例中,本申請案提供了一種雙抗原決定四價抗體,其中抗體骨架衍生自ABT0806或人源化ABT-806,且其中scFv域包含衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、人源化去成熟西妥昔單抗之可變區的結合域。在一個實施例中,scFv域包含衍生自尼妥珠單抗的結合域。
在一個實施例中,抗體重鏈包含與SEQ ID NO.9、17、19、21、23、25、27、29、31、75、93、113、115、117、119、121、137、139、141、143、145、147或179具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.11、33、35、37、39、41、43、77、91、95或111具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體骨架包含ABT-806,且其中抗體VH域包含與SEQ ID NO.209具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,VL域包含與SEQ ID NO.211具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體骨架包含人源化ABT-806。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.225、229或233具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO.227、231或235具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,scFv VH域包含與SEQ ID NO.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,scFv VL域包含與SEQ ID NO.203、207、239、241、243或269具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,scFv域包含衍生自去成熟西妥昔單抗或人源化去成熟西妥昔單抗之可變區的結合域。在一個實施例中,去成熟西妥昔單抗或人源化去成熟西妥昔單抗包含選自Y101、Y102、D103、Y104、N92及其組合的西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)。在一個實施例中,西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含VH-Y101、VH-Y102、VH-D103、VH-Y104、VL-N92或其組合。在一個實施例中,西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K或其組合。
在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體VH域包含SEQ ID NO.209之3個互補決定區(CDR)。在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。在一個實施例中,scFv VH域包含SEQ ID NO.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267之3個CDR。在一個實施例中,scFv VL域包含SEQ ID NO.203、207、239、241、243或269之3個CDR。
在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體包含與SEQ ID NO.9、11、17、19、21、23、25、27、29、31、33、37、41、43、75、77、91、93、95、111、113、115、117、119、121、137、139、141、143、145、147或179具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
尼妥珠單抗骨架抗體
在一個實施例中,本申請案提供了雙抗原決定四價抗體,其中抗體骨架包含尼妥珠單抗,且其中scFv域包含衍生自ABT-806或人源化ABT-806之可變區的結合域。在一個實施例中,scFv域包含ABT-806之可變區。
在一個實施例中,抗體重鏈包含與SEQ ID NO.5、15、45、47、49、51、53、55或85具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.7、57、59、61、63、65、67、69、71或73具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.205具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO.207具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,scFv VH域包含與SEQ ID NO.209具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv VL域包含與SEQ ID NO.211具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體VH域包含SEQ ID NO.205之3個互補決定區(CDR)。在一個實施例中,抗體VL域包含SEQ ID NO.207之3個CDR。在一個實施例中,scFv VH域包含SEQ ID NO.209之3個CDR。在一個實施例中,scFv VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。
在一個實施例中,雙抗原決定四價抗體包含與SEQ ID NO.5、7、15、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73或85具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
去成熟西妥昔單抗單株抗體
在一個態樣中,本申請案提供了一種去成熟西妥昔單抗單株抗體,其包含具有輕鏈可變(VL)域之輕鏈及具有重鏈可變(VH)域之重鏈,其中該VL域及該VH域形成Fab區,且其中該單株抗體包含選自VH-Y101、VH-Y102、VH-D103、VH-Y104、VL-N92及其組合的西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)。
在一個實施例中,西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K或其組合。
在一個實施例中,去成熟西妥昔單抗單株抗體是非人源化的。
在一個實施例中,抗體VH域包含3個互補決定區(CDR),該等CDR具有與SEQ ID NO.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含3個CDR,該等CDR具有與SEQ ID NO.243或269具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,重鏈包含與SEQ ID NO.1、155、157、159、161、163、165、167或169具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,輕鏈包含與SEQ ID NO.3、151或153具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,VL域包含與SEQ ID NO.243或269具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,去成熟西妥昔單抗單株抗體是人源化的。
在一個實施例中,抗體VH域包含3個互補決定區(CDR),該等CDR具有與SEQ ID NO.245、249、255或257具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含3個互補決定區(CDR),該等CDR具有與SEQ ID NO.241具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,重鏈包含與SEQ ID NO.123、127、129、131或133具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VH域包含與SEQ ID NO.245、249、255或257具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,輕鏈包含與SEQ ID NO.99或109具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含與SEQ ID NO. 241具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,本申請案提供了一種多特異性抗體,其包含抗體骨架以及與該抗體骨架連接的至少一個scFv域,其中該抗體骨架包含如本文所揭示的去成熟西妥昔單抗單株抗體。
在一個實施例中,本申請案提供了一種多特異性抗體,其包含抗體骨架以及與該抗體骨架連接的至少一個scFv域,其中該scFv域包含如本文所揭示的去成熟西妥昔單抗單株抗體之可變區。
人源化抗EGFRvIII單株抗體
在一個態樣中,本申請案提供了一種人源化抗EGFRvIII單株抗體,其包含具有輕鏈可變(VL)域之輕鏈及具有重鏈可變(VH)域之重鏈,其中該VL域及該VH域形成Fab區。在一個實施例中,單株抗體是ABT0806或人源化ABT-806。
在一個實施例中,重鏈包含與SEQ ID NO.171、149或177具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,輕鏈包含與SEQ ID NO.111、173或175具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,VH域包含與SEQ ID NO.225、229或233具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,VL域包含與SEQ ID NO.227、231或235具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中,本申請案提供了一種多特異性抗體,其包含抗體骨架以及與該抗體骨架連接的至少一個scFv域,其中該抗體骨架包含如本文所揭示的人源化抗EGFRvIII單株抗體。
在一個實施例中,本申請案提供了一種多特異性抗體,其包含抗體骨架以及與該抗體骨架連接的至少一個scFv域,其中該scFv域包含如本文所揭示的人源化抗EGFRvIII之可變區。
四價抗體
在一個態樣中,本申請案提供了一種對EGFR具有結合親和力的四價抗體,其包含具有抗體輕鏈可變(VL)域之抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(VH)域之抗體重鏈以及具有scFv輕鏈可變(VL)域及scFv重鏈可變(VH)域之scFv域,其中該抗體VL域及該抗體VH域形成Fab區,其中該scFv域連接至該抗體輕鏈或抗體重鏈之至少一端。
在一個實施例中,抗體VH域包含具有SEQ ID NO.201之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含具有SEQ ID NO.203之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體重鏈包含具有SEQ ID NO.89之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體輕鏈包含具有SEQ ID NO.3之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv域包含輕鏈可變(VL)域,其包含具有SEQ ID NO.203之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv域包含重鏈可變(VH)域,其包含具有SEQ ID NO.201之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體重鏈包含與SEQ ID NO.89具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體輕鏈包含SEQ ID NO.3。在一個實施例中,抗體VH包含SEQ ID NO.201。在一個實施例中,抗體VL包含SEQ ID NO.203。在一個實施例中,抗體scFv VH包含SEQ ID NO.201。在一個實施例中,抗體scFv VL包含SEQ ID NO.203。
在一個實施例中,抗體VH包含SEQ ID NO.201之3個互補決定區(CDR)。在一個實施例中,抗體VL包含SEQ ID NO.203之3個CDR。在一個實施例中,抗體scFv VH包含SEQ ID NO.201之3個CDR。在一個實施例中,抗體scFv VL包含SEQ ID NO.203之3個CDR。
在一個實施例中,四價抗體由SI-95X42表示,如以下實例所示。
在另一個實施例中,本申請案提供了一種對EGFRvIII具有結合親和力的四價抗體,其包含具有抗體輕鏈可變(VL)域之抗體輕鏈、具有抗體重鏈可變(VH)域之抗體重鏈以及具有scFv輕鏈可變(VL)域及scFv重鏈可變(VH)域之scFv域,其中該抗體VL域及該抗體VH域形成Fab區,其中該scFv域連接至該抗體輕鏈或該抗體重鏈之至少一端。
在一個實施例中,抗體VH域包含具有SEQ ID NO.209之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體VL域包含具有SEQ ID NO.211之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體重鏈包含具有SEQ ID NO.87之胺基酸序列。在一個實施例中,抗體輕鏈包含具有SEQ ID NO.11之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv域包含輕鏈可變(VL)域,其包含具有SEQ ID NO.211之胺基酸序列。在一個實施例中,scFv域包含重鏈可變(VH)域,其包含具有SEQ ID NO.209之胺基酸序列。
在一個實施例中,抗體重鏈包含SEQ ID NO.87。在一個實施例中,抗體輕鏈包含SEQ ID NO.11。在一個實施例中,抗體VH域包含SEQ ID. NO. 209。在一個實施例中,抗體VL域包含SEQ ID NO.211。在一個實施例中,抗體scFv VH域包含SEQ ID NO.209。在一個實施例中,抗體scFv VL域包含SEQ ID NO.211。
在一個實施例中,抗體VH域包含SEQ ID NO.209之3個互補決定區(CDR)。在一個實施例中,抗體VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。在一個實施例中,抗體scFv VH域包含SEQ ID NO.209之3個CDR。在一個實施例中,抗體scFv VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。
在一個實施例中,種內抗體(intraspecific antibody)由SI-95X41表示,如以下實例所示。
在另一個態樣中,本申請案提供了分離的核酸序列,其編碼如本文所揭示的雙抗原決定四價抗體、單株抗體、四特異性抗體或多特異性抗體。
在進一步的態樣中,本申請案提供了包含如本文所揭示的核酸序列的表現載體,其中該載體可在細胞中表現。
在進一步的態樣中,本申請案提供了包含本文所揭示的核酸的宿主細胞。在一個實施例中,宿主細胞包含如本文所揭示的表現載體。在一個實施例中,宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
在進一步的態樣中,本申請案提供了產生如本文所揭示的抗體的方法。在一個實施例中,方法包括培養本文揭示的宿主細胞,使得產生所揭示的抗體。在一個實施例中,抗體是雙抗原決定四價抗體。在一個實施例中,抗體是單株抗體。在一個實施例中,抗體是四特異性抗體。在一個實施例中,抗體是多特異性抗體。
在進一步的態樣中,本申請案提供了免疫偶聯物,其包含如本文所揭示的雙抗原決定四價抗體及細胞毒性劑。在一個實施例中,細胞毒性劑包含化療劑、生長抑制劑、毒素或放射性同位素。
在進一步的態樣中,本申請案提供了一種醫藥組合物,其包含如本文所揭示的抗體及醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中,醫藥組合物進一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治療劑、化療劑或其組合。在一個實施例中,抗體是雙抗原決定四價抗體。在一個實施例中,抗體是單株抗體。在一個實施例中,抗體是四特異性抗體。在一個實施例中,抗體是多特異性抗體。
在進一步的態樣中,本申請案提供了醫藥組合物,其包含如本文所揭示的免疫偶聯物及醫藥學上可接受之載劑。
在進一步的態樣中,本申請案提供了治療患有癌症之受試者的方法,其包含向受試者投與有效量的如本文所揭示的雙抗原決定四價抗體。在一個實施例中,癌症包含表現EGFR、EGFRvIII或兩者之細胞。在一個實施例中,癌症包含乳癌、結腸直腸癌、胰腺癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、食道癌、鼻咽癌、腎癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。
在一個實施例中,治療方法進一步包括共同投與有效量的治療劑。在一個實施例中,治療劑包含抗體、化療劑、酶或其組合。在一個實施例中,治療劑包含卡培他濱(capecitabine)、順鉑、曲妥珠單抗(trastuzumab)、氟維司群(fulvestrant)、他莫昔芬(tamoxifen)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)、阿那曲唑(anastrozole)、胺魯米特(aminoglutethimide)、睾內酯(testolactone)、伏羅唑(vorozole)、福美坦(formestane)、法屈唑(fadrozole)、來曲唑、厄洛替尼(erlotinib)、拉法替尼(lafatinib)、達沙替尼(dasatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、帕唑帕尼(pazopinib)、拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼洛替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)、nab-紫杉醇、其衍生物或組合。
在一個實施例中,受試者是人類。
在進一步的態樣中,本申請案提供了一種溶液,其包含有效濃度的如本文所揭示的雙抗原決定四價抗體,其中該溶液是受試者之血漿。
由於野生型及突變型EGFR (亦即,分別為過度表現之EGFRwt蛋白及EGFRvIII突變蛋白)在若干種類型實體腫瘤中之表現的高普遍性,因此開發同時標靶EGFR之兩個版本的有效治療策略是一個尚未解決的挑戰。該策略將涉及針對EGFRvIII的可允許優先靶向最惡性細胞的第一特異性及針對野生型受體的可允許廣泛腫瘤靶向的第二特異性。這種雙特異性抗體將代表一類新的雙抗原決定四價抗體,其特徵在於對同一EGFR靶分子之兩個抗原決定基的雙重結合特異性。
為了構築能夠結合野生型及突變型EGFR蛋白二者並優先結合EGFRvIII的雙特異性四價抗體,將scFv域附接至抗體重鏈及輕鏈的各個末端。如第1圖所示,將EGFRvIII靶向性scFv連接至標靶EGFR之抗體之N末端或C末端(經由重鏈或輕鏈)(第1A、1B、1C及1D圖)。或者,將EGFRwt靶向性scFv連接至標靶EGFRvIII之抗體之N末端或C末端(經由重鏈或輕鏈)。若干種參數,包括域間連接子長度及scFv VH/VL域之定向,都針對穩定性及結合親和力進行了最佳化(表1)。
本申請案係關於製備及使用雙特異性四價抗體、具體地雙抗原決定四價抗體的方法。
術語「抗原決定基」定義了與抗體結合的抗原區域。術語「抗體」以最廣泛意義使用且具體涵蓋單一單株抗體(包括促效劑及拮抗劑抗體)、具有多抗原決定特異性之抗體組合物、以及抗體片段(例如,Fab、F(ab′)
2及Fv),只要它們表現出期望的生物學活性即可。在一些實施例中,抗體可為單株、多株、嵌合、單鏈、雙特異性或雙效、人類及人源化抗體及其活性片段。與已知抗原結合的分子之活性片段之實例包括Fab、F(ab′)
2、scFv及Fv片段,包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產物以及上文提及的抗體及片段中任一者之抗原決定基結合片段。在一些實施例中,抗體可包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分,亦即含有免疫特異性地結合抗原之結合位點的分子。該免疫球蛋白可屬於免疫球蛋白分子之任何類型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)、或類別(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。在一個實施例中,抗體可為完整抗體及衍生自該完整抗體之任何抗原結合片段。典型的抗體是指通常由兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈組成的異源四聚物蛋白。每條重鏈由重鏈可變域(縮寫為VH)及重鏈恆定域組成。每條輕鏈由輕鏈可變域(縮寫為VL)及輕鏈恆定域組成。VH及VL區可進一步細分為以下域:高度可變的互補決定區(CDR)及被稱為框架區(FR)的更保守區域。各可變域(VH或VL)通常由三個CDR及四個FR組成,其從胺基末端至羧基末端按以下次序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在輕鏈及重鏈之可變區內存在與抗原相互作用的結合區。
如本文所用的術語「單株抗體」是指從實質上均質抗體之群體獲得的抗體,亦即除可以少量存在的可能天然存在的突變之外,構成該群體的個別抗體是相同的。單株抗體是高度特異性的,針對一個共同的抗原位點。此外,與通常包括針對不同決定簇(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑不同,各單株抗體針對抗原上的單一決定簇。除其特異性之外,單株抗體是有利的還在於它們藉由雜交瘤培養合成,不被其他免疫球蛋白污染。
修飾語「單株」表明,抗體之特性是獲自抗體之實質上均質群體,而並不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。在抗體針對多於一個共同抗原位點之背景下,術語「單株抗體」是指在早期開發階段的一組單株單特異性抗體。例如,欲根據本揭示案使用的單株抗體可藉由最初由Kohler & Milstein,
Nature,256:495 (1975)描述的雜交瘤方法製備,或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製備。在後者情況下,術語「單株多特異性抗體」之修飾語「單株」通常被可理解地省略。
單株抗體可包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白),其中重鏈及/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中之對應序列相同或同源,而該(等)鏈之剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體以及此類抗體之片段中的對應序列相同或同源,只要它們表現出期望的生物學活性即可(美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851-6855 [1984])。
單株抗體可使用多種方法產生,該等方法包括小鼠雜交瘤或噬菌體展示(參見Siegel. Transfus. Clin. Biol. 9:15-22 (2002)的綜述),或者由直接來自原代B細胞之抗體的分子選殖產生(參見Tiller. New Biotechnol. 28:453-7 (2011))。使用重組DNA技術分離抗體可變基因,且重組地表現所得抗體且進一步針對期望特徵諸如抑制野生型或突變型EGFR結合之能力對所得抗體進行篩選。該抗體發現之一般方法與Seeber等人 PLOS One. 9:e86184 (2014)中描述的方法類似。一旦發現單株抗體基因,就可將它們人源化、工程化、組合或以其他方式修飾以生成各種類型的多特異性抗體。西妥昔單抗(抗EGFR)及ABT-806 (抗EGFRvIII)均為使用小鼠雜交瘤發現的。
9,10
在本申請案中,術語「抗原或抗原決定基結合部分或片段」是指能夠結合抗原(諸如EGFR)的抗體片段。此等片段可能具有完整抗體之抗原結合功能及額外功能。結合片段之實例包括但不限於:單鏈Fv片段(scFv),其由藉由合成連接子連接至單一多肽鏈中的抗體之單臂之VL及VH域組成;或Fab片段,其是由VL域、恆定輕鏈(CL)域、VH域及恆定重鏈1 (CH1)域組成的單價片段。抗體片段可為甚至更小的子片段,且可由小至單個CDR域(具體地來自VL及/或VH域的CDR3區域)的域組成(例如參見Beiboer等人, J. Mol.Biol.296:833-49 (2000))。使用熟悉此項技術者已知的習知方法產生抗體片段。可使用與完整抗體相同的技術針對實用性來篩選抗體片段。
「抗原或抗原決定基結合片段」可藉由若干種本領域已知的技術衍生自本揭示案之抗體。例如,純化的單株抗體可用酶(諸如胃蛋白酶)切割,且進行HPLC凝膠過濾。然後可收集含有Fab片段之適當部分且藉由膜過濾等進行濃縮。對於用於分離抗體活性片段的一般技術之進一步描述,參見例如Khaw, B. A.等人 J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982);Rousseaux等人Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個被稱為「Fab」片段的相同抗原結合片段,其各自具有單一抗原結合位點;以及剩餘的「Fc」片段,其名稱反映其能夠易於結晶。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯抗原的F(ab')
2片段。
Fab片段可含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1域之羧基末端添加少量殘基(包括一個或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸)而不同於Fab片段。Fab’-SH是其中恆定域之(多個)半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’在本文中之名稱。F(ab')
2抗體片段最初以之間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab'片段對之形式產生。抗體片段之其他化學偶合亦是已知的。
「Fv」是含有完全抗原識別及結合位點的最小抗體片段。該區由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密、非共價締合形成的二聚物組成。在此組態中,各可變域之三個CDR相互作用以界定VH-VL二聚物表面上的抗原結合位點。總之,六個HVR對抗體賦予抗原結合特異性。然而,甚至單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性的CDR的Fv之一半)就具有識別及結合抗原的能力,儘管與整個結合位點相比,親和力較低。
來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而指定為兩種明顯不同類型(稱為卡帕及拉姆達(λ))中之一者。
取決於其重鏈之恆定域之胺基酸序列,免疫球蛋白可被指定為不同類別。存在五個主要類別的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且此等免疫球蛋白中之若干者可進一步分成子類(同種型),例如,IgG-1、IgG-2、IgG-3、及IgG-4;IgA-1及IgA-2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別被稱為α、δ (delta)、ε (epsilon)、γ、及μ。不同類別的免疫球蛋白之亞基結構及三維組態是眾所周知的。
「人源化抗體」是指一類工程化抗體,其CDR衍生自非人類供體免疫球蛋白,分子之剩餘免疫球蛋白衍生部分衍生自一種(或多種)人類免疫球蛋白。另外,可改變框架支撐殘基以保持結合親和力。獲得「人源化抗體」之方法是熟悉此項技術者眾所周知的。(參見例如Queen等人, Proc.Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)、Hodgson等人, Bio/Technology, 9:421 (1991))。
如本文所用,術語「多肽、「肽」及「蛋白質」可互換且定義為意指由經肽鍵連接之胺基酸組成的生物分子。
除非上下文不合適,否則如本文所用的術語「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」定義為意指「一或多個」且包括複數個。
「分離」意指生物分子不含至少一些與其天然地一起存在的組分。當「分離」用於描述本文揭示的各種多肽時,意指已從表現其的細胞或細胞培養物鑑定且分開及/或回收的多肽。通常,經分離多肽將藉由至少一個純化步驟製備。「經分離抗體」是指實質上不含具有不同抗原結合特異性之其他抗體的抗體。
「重組」意指使用重組核酸技術在外源宿主細胞中生成抗體。
術語「抗原」是指可在生物體,尤其動物、更尤其哺乳動物(包括人類)中誘導免疫反應的實體或其片段。該術語包括免疫原及其負責抗原性或抗原決定簇的區域。
另外,如本文所用,術語「免疫原性」是指引發或增強針對免疫原性劑之抗體、T-細胞或其他反應性免疫細胞的產生且有助於人類或動物中之免疫反應的物質。當個體產生針對所投與的本揭示案之免疫原性組合物的足量抗體、T-細胞及其他反應性免疫細胞來減輕或緩解欲治療病症時,即為發生了免疫反應。在製備人源化抗體的情況下,術語「免疫原性」是指治療劑(諸如非人源化抗體)觸發針對治療劑之不期望免疫反應的能力。
「特異性結合」或「特異性地結合」或對特定抗原或抗原抗原決定基「具有特異性」意指明顯不同於非特異性相互作用的結合。特異性結合可例如藉由測定分子之結合相比於對照分子之結合來量測,該對照分子一般為不具有結合活性的結構類似分子。舉例而言,特異性結合可藉由與類似於標靶之對照分子的競爭來測定。
對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可表現為例如抗體對抗原或抗原決定基具有至少約10
-4M、至少約10
-5M、至少約10
-6M、至少約10
-7M、至少約10
-8M、至少約10
-9M、或者至少約10
-10M、至少約10
-11M、至少約10
-12M、或更大的KD,其中KD是指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。通常,特異性地結合抗原的抗體對於對照分子之KD是對於該抗原或抗原決定基的20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更高倍數。
此外,與特定抗原或抗原決定基之特異性結合可表現為例如抗體對抗原或抗原決定基之KA或Ka是對照的至少20、50、100、500、1000、5,000、10,000或更多倍,其中KA或Ka是指特定抗體-抗原相互作用之締合速率。
藉由序列一致性來決定兩個序列之間的「同源性」。若欲比較之兩個序列彼此長度不同,則序列一致性優選是指與較長序列之核苷酸殘基一致的較短序列之核苷酸殘基的百分比。序列一致性可使用電腦程式以習知方式決定。給定序列與本揭示案上述序列之間的比較中出現之偏差可能由例如添加、缺失、取代、插入或重組引起。
術語「去成熟」是指將成熟抗體(諸如本申請案中之西妥昔單抗)工程化以在其結合域中具有突變(諸如點突變)的過程。所得抗體稱為「去成熟」抗體,其表現出改變的但期望的結合活性,該結合活性的特徵與「成熟」抗體之結合活性不同。
術語「ADCC」是指抗體依賴性細胞毒性,其為一種適應性免疫反應,其中攜帶Fc受體之效應細胞識別且殺死在表面上表現腫瘤相關或病原體衍生抗原的抗體包被之靶細胞。ADCC廣泛用於表徵及比較單株抗體之候選治療劑。經典ADCC由自然殺傷(NK)細胞介導。
藉由參考本文所包括的具體實施例及實例之以下詳細描述,可更容易地瞭解本揭示案。儘管已參考本揭示案之某些實施例的具體細節來描述本揭示案,但不意欲將此類細節視為對本揭示案之範疇之限制。
實例
實例1. 工程化標靶EGFR之雙抗原決定四價抗體
使用標準分子生物學技術將編碼抗體重鏈及輕鏈(前面是Kozak及分泌訊號肽)之基因選殖於pTT5載體中。藉由在ExpiCHO系統(Thermo Fisher)中瞬時轉染重鏈及輕鏈的表現質體來表現抗體及雙特異性抗體。簡而言之,將10 μg各表現質體用OptiPRO SFM培養基定容至1 ml。將1 ml含有80ul Expifectamine CHO試劑之OptiPRO SFM培養基添加至DNA中且在室溫下孵育2.5分鐘。然後將所得混合物以6x10
6細胞/ml添加至125 ml錐形瓶中的25 ml ExpiCHO細胞中,且在37℃、5% CO
2、150rpm下孵育。在轉染後24小時,用8.75 ml ExpiCHO補料及150 μl CHO增強劑餵養細胞,且將溫度調至32℃、5% CO
2、150rpm。在轉染後48小時再次用8.75ml ExpiCHO補料餵養細胞。轉染後9天收穫培養物上清液,以4500rpm旋轉1小時以沉澱細胞,然後使其通過0.2mm過濾器。在具有蛋白A感測器之Octet384系統上使用生物層干涉量測法對表現滴度進行定量,且使用純化的雙特異性抗體蛋白製備標準曲線。
在AKTA Avant系統上使用經磷酸鹽緩衝鹽水中平衡之5-ml MabSelect PrismA蛋白A管柱(GE Healthcare)自收穫之上清液中純化蛋白質。然後將上清液以5 ml/min之流速流經管柱且用25 ml PBS (125 mM磷酸鈉,137 mM氯化鈉,pH 6.8)洗滌。然後藉由使15 ml 50 mM乙酸鈉,pH 3.5流經管柱來溶析感興趣蛋白質。藉由添加0.5 ml 1M Tris-Cl,pH8.0來立即中和經溶析之蛋白質。
第一步蛋白A純化後,立即使用由Waters Acquity UPLC H-Class控制之ACQUITY UPLC® Protein BEH SEC 200Å, 4.6mm x 150mm, 1.7 µm管柱藉由分析型SEC來分析蛋白質。將10 µg蛋白質注射於PBS流動相中,且以0.3 ml/min之流速流動10分鐘。在AKTA Pure系統上使用Superdex Increase 10/300 GL管柱於25 mM乙酸鈉,125 mM NaCl,pH 5.5之流動相中藉由製備型SEC進一步純化蛋白質,且最終經緩衝液更換為25 mM乙酸鈉,125 mM NaCl,10%蔗糖,pH 5.5。如藉由分析型SEC評估,最終樣品含有>95%的感興趣蛋白質,且將其用於後續檢定。
在Octet384儀器上執行生物層干涉量測(Octet)結合檢定(親和力),以量化雙特異性抗體與EGFR及EGFRvIII之結合動力學。藉由以5 μg/ml加載180秒,將抗體捕獲至抗人類Fc (AHC)感測器尖端。在60秒基線步驟後,在檢定緩衝液(含有0.1% BSA、0.05% Tween20的PBS)中執行His標籤化EGFR或EGFRvIII (內部表現及純化)之系列稀釋液(0-100 nM;1:2稀釋因數)的180秒締合階段,然後在檢定緩衝液中進行300秒解離階段。使用10 mM甘胺酸,pH 1.5實現再生。結合曲線整體擬合為1:1模型以提取解離常數K
D以及動力學締合及解離速率。
在Octet384儀器上執行生物層干涉量測(Octet)結合檢定(親合力),以量化雙特異性抗體與固定化EGFR及EGFRvIII的二價結合動力學。藉由以1 μg/ml加載120秒,將生物素化EGFR或EGFRvIII捕獲至鏈黴親和素(SA)感測器尖端。在60秒基線步驟後,在檢定緩衝液中執行抗體之系列稀釋液(0-25 nM;1:2稀釋因數)的180秒締合階段,然後在檢定緩衝液中進行300秒解離階段。使用10 mM甘胺酸,pH 1.5實現再生。結合曲線整體擬合為1:1模型以提取解離常數K
D以及動力學締合及解離速率。
生物層干涉量測法(Octet)用於抗原決定基分格研究。將生物素化EGFR-WT (Acro EGR-H82E3)或EGFRvIII (Acro EGR-H82E0)以1 ug/ml在檢定緩衝液(含有0.1% BSA、0.05% Tween20的PBS)中固定於鏈黴親和素感測器上,持續180秒。在30秒基線後,與100 nM第一抗體締合,持續300秒。最後,與100 nM第二抗體締合,持續300秒。Octet Analysis 12.0軟件用於生成抗原決定基分格矩陣。
實例2:表現滴度
蛋白質穩定性是由折疊狀態與未折疊狀態之間的自由能差異定義之關鍵參數。對於蛋白質治療劑,穩定性可能會影響免疫原性、藥代動力學、甚至功效。聚集的減少可幫助開發更容易製造且對患者更安全的治療劑。此外,表現效率及蛋白質產率直接決定蛋白質治療劑之成本。若可高效表現蛋白質以達到更高滴度且提高純化蛋白質之產率,則可顯著降低製造成本。
在ExpiCHO細胞中瞬時表現後,使用生物層干涉量測法對滴度進行量化(表2)。含有簡單結構之單株抗體(EGFR或EGFRvIII)的生產效率最高,而雙特異性(EGFR x EGFRvIII、SI-95X1-31、SI-95X35-39)抗體的生產效率各不相同,這主要視結合域之組成而定。含有尼妥珠單抗scFv之雙特異性抗體(SI-95X4-16)的滴度顯著較低,表明此scFv格式之尼妥珠單抗VH及VL不穩定。在另一個方面,在抗體及ABT-806 scFv 之Fab位置中具有尼妥珠單抗的結構(SI-95X2、SI-95X17-31)趨於顯示出較高平均滴度。
實例3:藉由分析型尺寸排阻層析法測定之穩定性
第一步蛋白A純化後,立即藉由Waters UPLC系統上的分析型尺寸排阻層析法評估雙特異性EGFR x EGFRvIII抗體之穩定性及聚集性(表2)。含有尼妥珠單抗scFv之抗體(SI-95X4-16)一般而言由於低表現而顯示出低訊號,且除了與感興趣蛋白質(POI)相對應的主峰外,趨於具有高豐度之高分子量(HMW)或低分子量(LMW)污染物。這表明當摻入到雙特異性抗體中時,尼妥珠單抗scFv並不穩定。其他雙特異性抗體平均顯示出更多的感興趣蛋白質,以及更少的HMW及LMW種類。C末端scFv與重鏈融合之蛋白質(SI-95X1-3)顯示出最高的%POI,這表明穩定性良好。scFv定向似乎對SEC圖譜亦有影響,含ABT-806 scFv之抗體在處於HL定向時顯示出複雜的分裂圖譜(SI-95X17-19、SI-95X23-25、SI-95X29-31),但當ABT-806 scFv處於LH定向時則沒有對應的結構(SI-95X20-22、SI-95X26-28)。此結果表明這種scFv之LH定向可能更穩定及/或構型上均質。域間連接子長度對聚集之影響可忽略不計。
實例4:Octet測定的與EGFR WT (EGFRwt)之結合
使用生物層干涉量測法評估雙特異性抗體對野生型EGFR之親和力(表3)。西妥昔單抗及尼妥珠單抗顯示出與野生型EGFR之強結合,分別如0.75及0.32 nm之反應值所示,而ABT-806 (EGFRvIII特異性抗體)顯示出0.07 nm之低得多的反應。大多數EGFR x EGFRvIII雙特異性抗體顯示出與野生型EGFR之強結合,但含有尼妥珠單抗scFv及ABT-806 Fab (SI-95X4-16)之彼等除外,其顯示出低結合。此結果表明當以scFv格式存在時,尼妥珠單抗之功能降低。在另一個方面,當尼妥珠單抗位於Fab位置(SI-95X2、SI-95X17-31)時,或者當西妥昔單抗位於Fab (SI-95X1、SI-95X37-39)或scFv (SI-95X3、SI-95X35-36)位置時,觀察到與野生型EGFR之良好結合。親和力資料顯示,具有西妥昔單抗域之抗體比具有尼妥珠單抗域之抗體具有更強親和力(更低KD)。
實例5:Octet測定的與EGFRvIII之結合
使用生物層干涉量測法評估雙特異性抗體對EGFRvIII之親和力(表4)。如預期的那樣,所有靶向野生型EGFR及/或EGFRvIII之單株及雙特異性抗體均顯示出與EGFRvIII之可偵測結合,這與EGFRvIII蛋白中存在兩個結合抗原決定基一致。與尼妥珠單抗相比,西妥昔單抗具有更強的結合反應及親和力,而ABT-806之結合處於中等水準。對於含有尼妥珠單抗scFv及ABT-806 Fab之雙特異性抗體(SI-95X4-16),觀察到的結合與ABT-806單株抗體之結合類似,這表明尼妥珠單抗scFv沒有提供額外功能。相比而言,含有尼妥珠單抗Fab及ABT-806 scFv之雙特異性抗體(SI-95X2、SI-95X17-31)具有較低KD值及較慢解離速率,在一些情況下與組分mAb相比顯示出增強的親和力。對於含有西妥昔單抗及ABT-806域之雙特異性抗體(SI-95X1、SI-95X3、SI-95X35-39),觀察到相同的親和力增強。此結果表明尼妥珠單抗/西妥昔單抗及ABT-806域可同時結合同一EGFRvIII分子之兩個抗原決定基,從而產生增強表觀親和力的多價親合效應。
實例6:抗原決定基分格(EGFRwt抗原決定基)
使用生物層干涉量測法對一組具有野生型EGFR之單株抗體進行抗原決定基分格(表5)。抗體包括EGFR特異性西妥昔單抗(Cetu)、帕尼單抗(Pani)、尼妥珠單抗(Nimo)及耐昔妥珠單抗(Neci),以及EGFRvIII特異性ABT-806。較大反應值表明,即使在第一抗體已飽和之後,第二抗體亦能夠與EGFR締合(表明存在不同抗原決定基)。相反,較小數字表明第二抗體藉由競爭性抑制被第一抗體阻斷(表明存在相同抗原決定基)。
如預期的那樣,ABT-806作為第二抗體始終顯示出低反應,因為ABT-806不會明顯結合野生型EGFR。所有EGFR靶向性抗體在ABT-806締合後都顯示出作為第二抗體的高反應,因為ABT-806無法結合且阻斷第二抗體。
相比而言,四種EGFR靶向性抗體中的每一者都在一定程度上相互阻斷,這表明抗原決定基相同或重疊。值得注意的是,若使用尼妥珠單抗作為第一抗體,四種EGFR靶向性抗體具有可偵測但降低的結合。這可能是因為尼妥珠單抗之締合動力學較慢,且無法在第一個300秒步驟中使EGFR完全飽和。總之,資料證實了ABT-806不與野生型EGFR顯著結合,且表明所有四種EGFR靶向性抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、耐昔妥珠單抗)共享一個保守抗原決定基。後一結論得到了其他研究的支持,該等研究表明帕尼單抗、西妥昔單抗及尼妥珠單抗在EGFR域III內具有重疊的抗原決定基。使用Chimera 1.13中之MatchMaker功能,對EGFR與西妥昔單抗(1YY9)、帕尼單抗(5SX4)及耐昔妥珠單抗(6B3S) Fab的複合物之晶體結構進行結構比對,以比較此等EGFR靶向性抗體之抗原決定基(第2圖)。此比對表明,所有三種抗體均結合EGFR之域III內的重疊抗原決定基,這與Octet的抗原決定基分格資料一致。
11-12實例7:抗原決定基分格(EGFRvIII抗原決定基)
使用生物層干涉量測法對同一組具有EGFRvIII之單株抗體進行抗原決定基分格(表6)。較大反應值表明,即使在第一抗體已飽和之後,第二抗體亦能夠與EGFR締合(表明存在不同抗原決定基)。相反,較小數字表明第二抗體藉由競爭性抑制被第一抗體阻斷(表明存在相同抗原決定基)。
如野生型EGFR分格實驗所觀察到的,所有四種EGFR靶向性抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗及耐昔妥珠單抗)均顯示出相互競爭性結合,如第一抗體飽和後第二種抗體之結合減少所證明。這表明此四種抗體在EGFRvIII上共享一個可能不對EGFRvIII具有特異性的重疊抗原決定基,亦即EGFRwt抗原決定基。當尼妥珠單抗用作第一(阻斷)抗體時,觀察到第二抗體之反應略高,這可藉由尼妥珠單抗在第一個300秒阻斷步驟期間由於其較慢締合速率而未使EGFRvIII蛋白飽和來解釋。
相比而言,ABT-806明顯與四種EGFR靶向性抗體分格成不同的抗原決定基,亦即EGFRvIII特異性抗原決定基。當使用ABT-806作為第一抗體時,其他抗體中之每一者均在第二步中顯示出顯著締合反應。類似地,當ABT-806用作第二抗體時,觀察到大量額外反應。ABT-806及其他抗體之間缺乏競爭性結合表明,ABT-806標靶EGFRvIII上的獨特抗原決定基,且ABT-806及其他EGFR結合性抗體可能同時與EGFRvIII蛋白上的不同抗原決定基相互作用。ABT-806與EGFR靶向性抗體結合EGFRvIII之不同表位與以下一致:ABT-806結合EGFR蛋白的僅限於突變型EGFRvIII且不存在於野生型EGFR上之構型。
實例8:人源化ABT-806之生成及表徵
為了增加ABT-806可變區之人源化且降低免疫原性之可能性,將小鼠VH及VK域轉換為更人源化的框架。所有版本都使用基於ABT-806可變域之序列的Discovery Studio抗體建模功能生成之scFv模型。所有人源化版本均使用Discovery Studio 2022套件來設計。VH1、VH2、VK1及VK2使用「預測人源化突變(Predict Humanizing Mutations)方案」進行設計,一致性閾值設置為50,頻繁殘基取代容差設置為20,種系取代容差(germline substitution tolerance)設置為0,且排除Kabat CDR殘基、IMGT CDR殘基、Vernier區殘基及人類種系殘基的取代。此方案完全基於ABT-806之胺基酸序列作為查詢序列。VH1及VK1是基於種系取代生成的,而VH2及VK2版本則使用頻繁殘基取代。VH3及VK3使用ABT806之輸入Fv模型來設計,「計算突變能量(calculate mutation energy)」設置為真(true) (CHARMm力場),以便生成「最佳單突變(best single mutations)」序列。查詢結構是由Discovery Studio之Antibody Modeling Cascade生成的ABT-806模型。輸入序列是ABT-806 VH及VL。CDR環定義設置為Honegger,且各環的最大模板設置為3,最佳化級別設置為高。
將各人源化鏈組合以生成9個版本:V1 (VH1、VK1)、V2 (VH1、VK2)、V3 (VH1、VK3)、V4 (VH2、VK1)、V5 (VH2、VK2)、V6 (VH2、VK3)、V7 (VH3、VK1)、V8 (VH3、VK2)、V9 (VH3、VK3) (表7)。重鏈及輕鏈基因如實例1中所述進行選殖及表現,然後評估抗體的穩定性及功能性質。
在ExpiCHO細胞中瞬時表現後,使用生物層干涉量測法對滴度進行量化(表7)。(部分地)基於整體表現來選擇最佳人源化版本。
藉由如實例1中所述之蛋白A及SEC層析法純化抗體。在蛋白A純化後,除了與感興趣蛋白質(POI)相對應的主峰外,許多抗體趨於具有高豐度之高分子量(HMW)或低分子量(LMW)污染物。這表明此等抗體不太穩定,偏好於形成其他種類(HC二聚物)且/或更容易聚集。基於上述指標,V3及V9似乎是最穩定的人源化(表7)。用於後續研究的樣品藉由製備型SEC純化至>95%純度。
在Octet384儀器上進行生物層干涉量測(Octet)結合檢定以量化人源化抗體與EGFR及EGFRvIII之結合動力學,如實例1所述。表8顯示出所有標靶EGFRvIII之單株抗體均表現出與EGFRvIII之可偵測結合。儘管所有抗體都顯示出類似的結合動力學,但人源化V3及V9抗體似乎具有與ABT-806相媲美的更高反應,且優於競爭對手迪妥昔珠單抗,即AbbVie的人源化ABT-806(內部純化)。
為了驗證抗體在細胞上的結合,將經純化之一級抗體添加至經EGFR或EGFRvIII或uPAR轉染之CHO細胞中。使用針對一級抗體的螢光二級抗體來量測細胞表面處的抗原結合。所有測試抗體都保留了與模擬癌症表面之細胞的結合性質(表9)。此外,所有抗體與EGFRvIII表現性CHO細胞之結合顯著優於與EGFR表現性CHO細胞之結合。這表明此等抗體偏好於結合ABT-806抗原決定基,而非西妥昔單抗抗原決定基。
在完整質量分析之前使用製備型SEC (pSEC),以便將完全mAb分子(pSEC部分1)與重鏈二聚物分子(pSEC部分2)部分地分離。為了進行質量分析及pSEC部分之確認,用50 mM tris pH 7.5將樣品稀釋至0.5 mg/mL。將1.0 µg製備樣品注射於在線分析型SEC管柱上以在變性條件下進行LC-MS完整質量分析。使用Unifi (Waters Corp)內的MaxEnt 1演算法處理資料。如第3A圖所示,迪妥昔珠單抗之pSEC部分1幾乎僅含有完整的完全mAb分子,而後來溶析之pSEC部分2含有完全mAb及重鏈二聚物之混合物。第3B圖顯示出經純化之hABT-806 V3及V9抗體均含有大部分完整的完全mAb。因此,ABT806之人源化生成了一種更穩定且經表現時問題污染物更少的抗體。
將前導重鏈及輕鏈之可變域與LENS資料庫進行比較以獲得序列相似性。結果表明VH3、VK3及VH1之可變區序列是獨特的(表10)。
實例9. 去成熟西妥昔單抗之生成及表徵
使用基於電腦之方法來鑑定西妥昔單抗的使其與EGFR之結合去成熟的突變。使用Discovery Studio (Biovia)中之分析蛋白界面方法(Analyze Protein Interface Method)計算與西妥昔單抗結合之EGFR (1YY9)的高分辨率晶體結構中西妥昔單抗與EGFR之間的接觸面積。九個接觸表面積大於20 Å
2的西妥昔單抗殘基被鑑定為與EGFR之結合密切相關。感興趣殘基如下(按順序編號):輕鏈W94、N91及N92;重鏈W52、N56、Y101、Y102、D103、Y104。各感興趣殘基均單獨突變為20種天然存在的胺基酸之一。藉由電腦總共產生了180個(9個殘基 * 20個胺基酸)獨立突變。使用Discovery Studio計算突變能量(穩定性)(Calculate Mutation Energy (Stability))函數計算突變對西妥昔單抗穩定性之影響,而使用計算突變能量(結合)(Calculate Mutation Energy (Binding))函數計算突變對EGFR結合之影響,將EGFR設置為配體分子。簡而言之,穩定性函數計算野生型西妥昔單抗與突變型西妥昔單抗之間的能量差(ΔΔG穩定性),而結合函數計算西妥昔單抗與EGFR之間的結合能(ΔΔG WT),然後計算西妥昔單抗突變體與EGFR之間的結合能(ΔΔG突變體),能量之間的差異報告為由於突變引起的結合能量變化(ΔΔ結合 = ΔΔG突變體 – ΔΔG WT)。使用CHARMm在pH無關模式下計算能量。對於所有突變,將ΔΔG Stability與對應的ΔΔG Binding作圖,以鑑定具有一系列可能的結合去成熟的突變,該等突變亦不會強烈破壞西妥昔單抗之穩定性。選擇十個突變進行進一步分析:輕鏈N92K、N92F;重鏈Y101A、Y101W、Y102V、Y102A、D103W、D103Y、D103F及Y104L(表11)。
如下製備去成熟西妥昔單抗變異體。使用標準分子生物學技術將Kozak及分泌訊號肽序列之前的經密碼子最佳化之編碼區選殖於pTT5載體中。藉由在ExpiCHO系統(ThermoFischer Scientific)中瞬時轉染輕鏈及重鏈來表現抗體,如實例1所述,但在6孔板中將培養體積縮小至2 ml。使用Captureem蛋白A 24孔板(TaKaRa)自收穫之上清液中純化蛋白質。將上清液加載至經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS,125 mM磷酸鈉,137 mM氯化鈉,pH 6.8)平衡之板上。用10 mL PBS洗滌板,然後用0.5 mL 50 mM乙酸鈉,pH 3.5溶析經結合之蛋白質。藉由添加0.1 mL 1M Tris-Cl,pH 8.0來立即中和經溶析之蛋白質。蛋白A純化後,立即藉由分析型SEC分析蛋白質,如實例1所述。如實例1中所述進行生物層干涉量測(Octet)結合檢定。
為了評估去成熟西妥昔單抗變異體之穩定性,使用了生物層干涉量測法及分析型尺寸排阻層析法。在ExpiCHO細胞中瞬時表現後,使用生物層干涉量測法對滴度進行量化(表12)。最佳去成熟版本的選擇部分程度上取決於整體表現。第一步蛋白A純化後,立即藉由Waters UPLC系統上之分析型尺寸排阻層析法評估抗體之穩定性及聚集性。除了與感興趣蛋白質(POI)相對應的主峰外,許多抗體趨於具有高分子量(HMW) (表12)。HMW種類之較高豐度表明此等抗體不太穩定且更容易聚集。
使用生物層干涉量測法分別評估去成熟西妥昔單抗對EGFR及EGFRvIII之親和力及親合力。表13展示了與西妥昔單抗野生型相比,大多數去成熟西妥昔單抗變異體對EGFR具有降低的結合親和力及/或降低的結合反應,這表明所選擇之突變改變了西妥昔單抗結合EGFR之能力。然而,該等抗體保留了對固定EGFR之良好親合力。
表14展示了大多數去成熟西妥昔單抗變異體亦對EGFRvIII具有降低的結合親和力及/或降低的結合反應。儘管有所減少,但所有選擇的去成熟西妥昔單抗變異體仍保留其以類似結合動力學結合EGFRvIII之能力。此資料對西妥昔單抗結合EGFRvIII及EGFR上之相同抗原決定基提供支持。儘管該等變異體對EGFR及EGFRvIII之親和力較弱,但由於二價結合,它們保留了對EGFR及EGFRvIII之良好親合力。由於親合力視表面抗原之水準而定,因此此結果表明,西妥昔單抗之去成熟版本對於攜帶大量EGFR及/或EGFRvIII之腫瘤可能更具選擇性。
為了驗證去成熟西妥昔單抗變異體保留與細胞結合之能力,將經純化之一級抗體添加至經EGFR、EGFRvIII或uPAR轉染之CHO細胞中。使用針對一級抗體的螢光二級抗體來量測細胞表面處的抗原結合。表15展示了所有測試抗體(HC: D103W除外)保留了其與模擬癌症表面之細胞的結合性質。結果表明此等抗體保留了製備抗體治療劑所期望的結合行為。
實例10. 標靶EGFR之雙抗原決定四價抗體之生成及表徵
繼西妥昔單抗獲批後,尼妥珠單抗已在多個國家被批准用於治療實體腫瘤。其改進中的至少一項是降低了皮膚毒性,這似乎與其對EGFR之較低親和力相關,亦即KD值為9.1 nM與3.77 nM (表3)。
9在此背景下,動力學上最具可比性的西妥昔單抗變異體是Y104L (KD 9.2 nM),而所有其他變異體表現出比尼妥珠單抗甚至更弱的EGFR親和力,包括Y101A (KD 67 nM)、Y102A (97 nM)及N92F (34 nM)。將此等去成熟變異體摻入雙抗原決定四價抗體中,以篩選在EGFRwt的存在下有效標靶EGFRvIII表現性腫瘤之潛在候選治療劑。
標靶EGFR及EGFRvIII之雙抗原決定四價抗體,亦稱為抗EGFR X EGFRvIII抗體,藉由將scFv融合至抗體重鏈或輕鏈之N末端或C末端來構築。第1圖描繪了四種示例性結構,其中EGFR結合域可衍生自人源化及/或去成熟西妥昔單抗變異體(hDC-EGFR)且經格式化為Fab或scFv,而ABT-806或人源化ABT-806可相互格式化為scFv或Fab。
表16列出了四組抗hDC-EGFR x hABT-806抗體之組態格式,亦即SI-95X45-49、SI-95X52-56、SI-95X58-62及SI-95X64-68。它們的EGFR結合域衍生自人源化去成熟西妥昔單抗變異體(hDC-EGFR),亦即SI-95m4-10。SI-95X45-49在抗體重鏈上具有抗ABT-806 scFv之C端融合物,在Fab位置中具有抗hDC-EGFR,SI-95X52-56在抗體重鏈上含有抗hDC-EGFR scFv之N末端融合物,在Fab位置中具有ABT-806 V9,SI-95X58-62在抗體輕鏈上含有ABT-806 V9之C末端融合物,在Fab位置中具有抗hDC-EGFR,且SI-95X64-68在抗體重鏈上含有抗hDC-EGFR scFv之C末端融合物,在Fab位置中具有ABT-806。用於生成抗EGFR x EGFRvIII抗體之材料及方法與實例1中描述之彼等相同或類似。
在ExpiCHO細胞中瞬時表現後,使用生物層干涉量測法對滴度進行量化(表17)。如預期的那樣,此等雙特異性抗體(SI-95X40-68)的生產效率各不相同,這主要視各結合域之組成及組態而定。例如,抗hDC-EGFR scFv融合至抗體重鏈之C末端的分子(SI-95X63-68)在表現上似乎低於hDC-EGFR scFv融合至重鏈之N末端之彼等(SI-95X51-56)。此外,具有抗hDC-EGFR Y101A域的分子(SI-95X47、53、58、65)趨於具有高滴度,而具有抗hDC-EGFR Y104L域的分子(SI-95X46、56、61、68)趨於具有低滴度。
第一步蛋白A純化後,立即藉由Waters UPLC系統上之分析型尺寸排阻層析法評估抗EGFR x EGFRvIII雙特異性抗體之穩定性及聚集性(表17)。第一步純化後,分子之組態似乎對感興趣蛋白質之百分比發揮最大作用。大量高分子量聚集體表明SI-95X57-62分子不穩定。此趨勢表明,抗體輕鏈上之ABT-806 V9 scFv融合物產生了一種通常不穩定的分子。相反,在初步純化後,SI-95X51-56表現出非常高的感興趣蛋白質百分比,這表明抗hDC-EGFR scFv與抗體重鏈之N末端融合通常產生穩定的分子。
使用生物層干涉量測法評估雙特異性抗體對EGFR之親和力(表18)。含有抗hDC-EGFR D103Y (SI-95X45、55、60、67)域的分子表現出與EGFR沒有結合或結合很少。這表明此域對EGFR之親和力非常低或被消除。與「成熟」組態之對照分子相比,所有其他含有抗hDC-EGFR域的分子都表現出對EGFR之親和力降低。親和力之降低視分子之組態及抗hDC-EGFR域類型而變化。
使用生物層干涉量測法評估雙特異性抗體對EGFRvIII之親和力(表19)。含有抗hDC-EGFR D103Y (SI-95X45、55、60、67)域的分子表現出與EGFRvIII的結合,但不與EGFR結合(表18、表19)。總而言之,這表明ABT-806域(或域衍生物)是有功能的,而抗hDC-EGFR D103Y是無功能或能夠輕微發揮功能,視分子之組態而定。與成熟組態之對照分子相比,所有分子都能夠結合EGFRvIII (儘管親和力稍低)。與表14中之單特異性mAb相比,所有雙特異性抗體的結合都大大增強。因此,此等分子即使具有抗hDC-EGFR域亦可緊密結合EGFR及EGFRvIII。事實上,與野生型西妥昔單抗及ABT806 mAb相比,一些雙特異性抗體對EGFRvIII之親和力有所增強,複製了實例5中觀察到的多價親合效應,且表明了成熟西妥昔單抗及ABT806域同時結合EGFRvIII之同一分子的機制。此外,一些抗體與EGFRvIII之結合(表19)比與EGFRwt之結合(表18)更緊密,這表明優先結合EGFRvIII,同時仍保留與EGFRwt之良好結合。
實例11:雙抗原決定四價抗體對EGFRvIII表現性細胞發揮ADCC活性
為了分析雙抗原決定四價抗體在靶向表現EGFRwt及EGFRvIII之腫瘤細胞時的任何效力變化,藉由使用NK細胞(1個供體)與表現EGFRwt之U87-MG-GFP細胞、表現EGFRwt及EGFRvIII二者之U87-MG-EGFRvIII-NR (亦即,mKATE2+)細胞或兩種細胞之混合培養物進行共培養來執行ADCC檢定。接種混合的細胞培養物且以50:50綠色/紅色訊號開始。來自U87-MG-GFP細胞之綠色訊號與EGFRwt表現性活細胞相關,而來自U87-MG-EGFRvIII-NR細胞之紅色訊號與共表現EGFRwt及EGFRvIII的細胞相關。橢球體形成後,NK細胞以5:1之效應物與標靶比率進行鋪板,且抗體以8點log
10劑量反應曲線進行鋪板。60小時後,量測細胞螢光以量化活細胞,且正規化成0小時處之時間點。使用此ADCC檢定來篩選用於候選治療劑的單抗原決定二價抗體(亦即,mAb)及雙抗原決定四價抗體(表16)。
SI-95m4及SI-95m5抗體皆為分別標靶EGFRvIII及EGFRwt的單抗原決定二價抗體。如第4A圖所示,SI-95m4在ADCC檢定中未能殺死U87-MG-EGFRwt-GFP細胞,這證實此人源化抗EGFRvIII抗體保留了ABT-806抗體之獨有結合特異性。然而,當與U87-MG-EGFRvIII-NR細胞混合時,SI-95m4對U87-MG-EGFRwt-GFP細胞(亦即,EGFRwt靶細胞,第4A圖)發揮ADCC活性。這一令人驚訝的結果可解釋為活化的NK細胞對EGFRwt表現性細胞之旁觀者效應。相比而言,SI-95m5能夠殺死U87-MG-EGFRwt及U87-MG-EGFRvIII細胞二者,無論是單獨的還是混合的,這與此抗體結合EGFRwt及EGFRvIII二者的能力一致(第4B圖)。
為了分析去成熟之影響,使用EGFRwt表現性U87-MG-GFP細胞及EGFRwt/EGFRvIII表現性U87U87-MG-NR細胞分別對一組具有成熟EGFRwt (西妥昔單抗)或去成熟EGFRwt結合域的單抗原決定二價抗體進行ADCC檢定。如第5圖所示,由SI-95m6、SI-95m7、SI-95m8、SI-95m9及SI-95m10組成的單抗原決定二價抗體組(表16)與親代抗hDC-EGFR抗體SI-95m5相比表現出對EGFRwt表現性細胞之ADCC活性的一系列降低(第5A圖)。與親代mAb SI-95m5相比,變異體之EC50值增加了多達12倍(對於SI-95m6),這表明效力較弱。如預期的那樣,用於該檢定的抗EGFRvIII對照抗體SI-95m4未顯示出活性。當使用EGFRwt/EGFRvIII表現性細胞時,SI-95m6、SI-95m9及SI-95m10以與陽性對照抗體SI-95m4類似之水準發揮其ADCC活性(第5B圖)。在這組抗體中,SI-95m7表現出右移曲線,EC50增加3倍,表明ADCC活性之特徵性降低。與此同時,SI-95m8不再顯示出任何針對EGFR之活性(第5A及5B圖),這可能是由於其EGFR結合域中的特定D103Y突變。即使資料有限,在比較含有不同去成熟突變之mAb組時,EGFRwt表現與EGFRvIII表現之間似乎沒有相關的ADCC降低。此結果可藉由兩個細胞群上EGFRwt/EGFRvIII的不同密度或幾何形狀來解釋,從而允許不同的結合親合力及ADCC之啟動。
為了篩選雙特異性候選物,基於單抗原決定二價抗體組構築了雙抗原決定四價抗體組(表16、第4及5圖),且分別使用EGFRwt表現性細胞及EGFRwt/EGFRvIII表現性細胞進行相同的ADCC檢定。
雙抗原決定四價抗體組包括SI-95X52、SI-95X53、SI-95X54、SI-95X55及SI-95X56,每種抗體含有抗EGFRvIII Fab結合域,亦即hABT-806 (V9)抗體骨架,及抗EGFRwt scFv結合域。該組共享衍生自其親代mAb SI-94m4之共同抗體骨架。它們的EGFRwt結合域衍生自抗hDC-EGFR scFv變異體,且對應於以SI-95m5作為親代抗體之一的去成熟抗EGFRwt mAb組,亦即SI-95m10 (對應於SI-95X52)、SI-95m6 (SI-95X53)、SI-95m7 (SI-95X54)、SI-95m8 (SI-95X55)及SI-95m9 (SI-95X56) (表16,第5B圖)。在這方面,SI-95X44充當成熟的雙抗原決定四價抗體對照(表16)。此等雙抗原決定四價抗體對EGFRwt表現性細胞表現出一系列ADCC活性(第6A圖)且對EGFRvIII表現性腫瘤細胞表現出看似重疊的曲線(第6B圖)。值得注意的是,SI-95X55對EGFRwt表現性細胞之活性顯著降低。計算了此等重疊曲線之EC50值且在第6B圖中列出,揭示了EC50值低於其親代抗體SI-95m4的19.3 nM之EC50。較低的EC50值表明ADCC活性提高。觀察結果可能意味著由於EGFRwt/EGFRvIII表現性細胞上之兩個EGFR抗原決定基同時結合而導致的ADCC活性增強之協同效應。值得注意的是,雙抗原決定抗體在抗EGFR及抗EGFRvIII結合域之幾何形狀及距離方面的不同組態可能允許細胞上的這種同時結合機制之不同能力,這可能會影響針對EGFRwt表現性腫瘤細胞以及EGFRwt/EGFRvIII表現性腫瘤細胞的ADCC程度。連同mAb格式中之發現一起,雙抗原決定四價抗體之協同效應可能受到由人源化、去成熟及/或組態導致的結構變化的影響。此外,與第6B圖中列出的SI-95m4 (19.39 nM)或SI-95X44 (14.72 nM)之EC50相比,SI-95X55對EGFRwt/EGFRvIII表現性細胞表現出改善的效力,如其EC50 (12.37 nM)所示。此觀察結果表明,即使對EGFRwt之殘餘親和力/親合力(表15),亦有助於提高其ADCC效力。它還證明藉由降低針對攜帶EGFRwt之細胞的效力同時增加針對攜帶EGFRwt/EGFRvIII之細胞的效力來改善治療指數。
實例12:標靶EGFRwt及EGFRvIII表現性腫瘤二者之雙抗原決定四價抗體。
來自實例11之結果表明去成熟單抗原決定抗體的ADCC活性可能無法預測具有相同去成熟突變之雙抗原決定抗體的ADCC活性。舉例而言,SI-95m8、SI-95X55、及SI-95X67 (組態與SI-95X55相反,參見表16)具有相同的D103Y突變。針對EGFRwt表現性細胞之ADCC效力的喪失使得SI-95X55成為標靶EGFRvIII腫瘤的唯一候選物。在此背景下,可高效標靶EGFRwt及EGFRvIII表現性腫瘤二者之雙抗原決定四價抗體之篩選聚焦於彼等具有去成熟突變Y101A及Y102A的抗體組。
Y101A突變是去成熟抗體SI-95m6及SI-95X53/SI-95X65之共同特徵,其中SI-95X65之抗體骨架並非人源化的(表16)。如第7圖所示,與SI-95X53相比,與SI-95X53一樣在重鏈之另一端含有抗EGFR scFv的SI-95X65表現出重疊但不完全的殺傷曲線(第7A圖),而SI-95m6針對EGFRwt細胞之EC50 (199.9 nM)是親代抗體(亦即,與EGFRwt成熟結合) SI-95m5之EC50 (EC50 = 16.06 nM)的近10倍(參見第7B圖中的表)。這意味著當將去成熟突變Y101A置於雙抗原決定四價抗體中時,EC50 (7.659 nM)與親代SI-95m5抗體以及含有親代mAb骨架結構之雙特異性物(SI-95X44 )之EC50 (EC50 = 14.38 nM)類似。在這方面,具有N92F突變的SI-95X52 (表16)顯示出類似的效力及完全殺傷(第6B圖)。
Y102A突變是去成熟抗體SI-95m7、SI-95X54及SI-95X66之共同特徵,其中SI-95X66之抗體骨架並非人源化的且與SI-95X54相比在重鏈之另一端上含有抗EGFR scFv域(表16)。與SI-95m5及SI-95X44之重疊曲線相比,SI-95m7及SI-95X66二者均表現出右移曲線及不完全殺傷,而SI-95X54對EGFRwt表現性細胞的完整殺傷曲線的反應範圍在10 nM至100 nM之間(參見第7B圖中之表)。測得SI-95X54的右移是SI-95m5及SI-95X44二者之EC50值的大約5倍。SI-95X54是一種雙抗原決定四價抗體,其scFv域衍生自具有Y102A之抗hDC-EFGR變異體。因此,SI-95X54揭示了其偏向EGFRvIII之細胞殺傷,同時還以至少5倍之EC50值殺死EGFRwt腫瘤。
為了進一步比較ADCC活性之變化,使用單獨及混合的EGFRwt及EGFRvIII細胞組來評估雙特異性候選物。作為對照,SI-95X44顯示出重疊的曲線以及與預期類似的ED50值(第8A圖)。雙特異性候選物諸如SI-95X54表現出特徵性右移曲線,完全殺死混合細胞(第8B圖)。此結果表明,作為示例性雙抗原決定四價抗體,SI-95X54能夠高效殺傷混合的EGFRwt及EGFRvIII細胞群,該細胞群可模擬人類患者之神經膠母細胞瘤之異質性,且SI-95X54殺傷EGFRwt細胞的敏感性降低可能意味著對患者健康組織之毒性降低。
EGFRwt及EGFRvIII在腦腫瘤之發生中發揮複雜且交互的作用。在大多數神經膠母細胞瘤病例中,EGFR過表現在腫瘤細胞中廣泛存在,而當使用泛EGFR抗體進行染色時,EGFRvIII通常僅在少數腫瘤細胞中顯示斑片狀腫瘤陽性。這種腫瘤異質性仍然是開發有效且有意義的腦腫瘤治療方法之一個尚未解決的挑戰。因此,同時標靶EGFRwt及EGFRvIII細胞且具有偏向EGFRvIII之結合的治療性抗體可能是期望的解決方案。在此背景下,本申請案提供了治療策略之概念驗證,已藉由該治療策略生成了雙抗原決定四價抗體以有效根除表現EGFRwt及/或EGFRvIII之混合腫瘤細胞群,且對正常組織之毒性較低。
表
表1. 雙特異性四價抗體之組態
表2. 在第一步蛋白A純化後,藉由表現滴度及分析型尺寸排阻層析法評估標靶EGFR-WT x EGFRvIII的雙特異性四價抗體之穩定性。
表3. 雙特異性四價抗體與EGFRwt之結合動力學
表4. 雙特異性四價抗體與EGFRvIII之結合動力學
表5. EGFRwt及EGFRvIII靶向性抗體之EGFRwt抗原決定基分格。
表6. EGFRwt及EGFRvIII靶向性抗體之EGFRvIII抗原決定基分格
表7. 蛋白A純化後,人源化ABT-806變異體的表徵,諸如表現滴度及純度,如藉由使用分析型尺寸排阻層析法評估。
表8. 人源化ABT-806抗體與EGFRvIII之結合親和力。
表9. 細胞上結合檢定驗證了抗體保留與細胞上抗原的結合。報告的所有值均為每種抗體1.1 ug/mL下之MFI。
表10.前導人源化ABT-806序列與LENS資料庫中之所有序列的相似性。
表11. 去成熟西妥昔單抗突變之能量計算
表12. 蛋白A純化後,去成熟西妥昔單抗變異體之表徵,諸如表現滴度及純度,如藉由使用分析型尺寸排阻層析法評估。
表13. 去成熟西妥昔單抗對EGFR之結合親和力及親合力
表14. 去成熟西妥昔單抗對EGFRvIII之結合親和力及親合力
表15. 細胞上結合測定驗證了抗體保留與細胞上抗原的結合。報告的所有值均為每種抗體10 ug/mL下之MFI。
表16. 抗EGFR x EGFRvIII雙特異性抗體及組分mAb之組態,包含人源化去成熟EGFR結合域及人源化EGFRvIII結合域。
表17. 蛋白A純化後,包含人源化去成熟EGFR結合域及人源化EGFRvIII結合域之抗EGFR x EGFRvIII雙特異性抗體之表徵,諸如表現滴度及純度,如藉由使用分析型尺寸排阻層析法評估。
表18. 包含人源化去成熟EGFR結合域及人源化EGFRvIII結合域之抗EGFR x EGFRvIII雙抗原決定四價抗體與EGFR-WT之結合動力學
表19. 包含人源化去成熟EGFR結合域及人源化EGFRvIII結合域之抗EGFR x EGFRvIII雙抗原決定抗體與EGFRvIII之結合動力學
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序列表
>Seq ID 1: 西妥昔單抗重鏈胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>Seq ID 2: 西妥昔單抗重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 3: 西妥昔單抗輕鏈胺基酸序列
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>Seq ID 4: 西妥昔單抗輕鏈核苷酸序列
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>Seq ID 5: 尼妥珠單抗重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 6: 尼妥珠單抗重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 7: 尼妥珠單抗輕鏈胺基酸序列
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>Seq ID 8: 尼妥珠單抗輕鏈核苷酸序列
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>Seq ID 9: ABT-806重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 10: ABT-806重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 11: ABT-806輕鏈胺基酸序列
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIYHGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>Seq ID 12: ABT-806輕鏈核苷酸序列
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>Seq ID 13: SI-95X1重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 118: SI-95X54重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 168: SI-95m19重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 169: SI-95m20重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 170: SI-95m20重鏈核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATGATCTCGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>Seq ID 171: ABT-806 V1重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 172: ABT-806 V1重鏈核苷酸序列
CAAGTGCAGTTGCAGGAGAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAGCCTTCTCAGTCACTGAGCCTCACGTGCACCGTAAGCGGTTATAGTATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCGCCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATTTCCTACAGTGGAAACACTCGATATAATCCTAGTCTTAAAAGTCGGGTAACCATCTCTAGGGATACCAGCAAGAATCAGTTCTCATTGCAACTCAATTCAGTGACCGCAGAAGACACCGCAGTCTACTATTGCGTCACAGCCGGACGCGGTTTCCCGTACTGGGGCCAAGGAACACTAGTCACCGTGTCTTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>Seq ID 173: ABT-806 V1輕鏈胺基酸序列
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>Seq ID 174: ABT-806 V1輕鏈核苷酸序列
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>Seq ID 175: ABT-806 V2輕鏈胺基酸序列
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>Seq ID 176: ABT-806 V2輕鏈核苷酸序列
GACATAGTGATGACACAGTCTCCAAGTTCTTTGAGCGTATCCCCAGGCGACCGCGTAACAATTACCTGTCACAGCTCCCAGGATATTAATAGTAATATTGGCTGGCTTCAACAGAAGCCAGGGAAGGCACCAAAAGGACTGATCTACCACGGAACTAATCTGGACGATGGGGTTCCTTCACGGTTCTCCGGGTCCGGCTCTGGTGCCGACTACACTCTGACAATTAGCTCCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCAGTGTACTATTGCGTGCAGTACGCACAATTTCCCTGGACATTTGGTCAAGGCACCAAAGTCGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>Seq ID 177: ABT-806 V4重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 178: ABT-806 V4重鏈核苷酸序列
CAAGTCCAGCTGCAGGAAAGTGGCCCTGGACTCGTTAAGCCTAGTCAGAGCTTGTCATTGACTTGCACAGTCAGTGGTTATTCCATCACAAGTGACTTTGCCTGGAATTGGATTCGGCAGGCTCCCGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCGGGTATATTTCCTACAGCGGAAATACTCGATATAACCCATCCCTTAAAAGTCGCTTCACCATATCTCGTGACACCAGCAAAAATCAATTTTATCTTCAACTCAATTCAGTGACAGCCGAGGATACAGCTGTTTACTATTGTGTGACAGCTGGCAGAGGATTTCCCTATTGGGGACAGGGAACCCTTGTAACGGTCTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
>Seq ID 179: SI-95X51重鏈胺基酸序列
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>Seq ID 180: SI-95X51重鏈核苷酸序列
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>Seq ID 201: 西妥昔單抗VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 202: 西妥昔單抗VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 203: 西妥昔單抗VL胺基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC
RASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIK
YASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC
QQNNNWPTTFGAGTKLELK
>Seq ID 204: 西妥昔單抗VL核苷酸序列
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATTCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAATAATAACTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
>Seq ID 205: 尼妥珠單抗VH胺基酸序列
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFT
NYYIYWVRQAPGQGLEWIG
GINPTSGGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTR
QGLWFDSDGRGFDFWGQGTTVTVSS
>Seq ID 206: 尼妥珠單抗VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTACATCTACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGGCATCAACCCCACCAGCGGCGGCAGCAACTTCAACGAGAAGTTCAAGACCCGGGTGACCATCACCGCCGACGAGAGCAGCACCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCTTCTACTTCTGCACCCGGCAGGGCCTGTGGTTCGACAGCGACGGCCGGGGCTTCGACTTCTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
>Seq ID 207: 尼妥珠單抗VL胺基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIY
KVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC
FQYSHVPWTFGQGTKLQIT
>Seq ID 208: 尼妥珠單抗VL核苷酸序列
GATATTCAAATGACTCAATCTCCTTCTTCTCTTTCTGCTTCTGTTGGTGATCGTGTTACTATTACTTGTCGTTCTTCTCAAAATATTGTTCATTCTAATGGTAATACTTATCTTGATTGGTATCAACAAACTCCTGGTAAAGCTCCTAAACTTCTTATTTATAAAGTTTCTAATCGTTTTTCTGGTGTTCCTTCTCGTTTTTCTGGTTCTGGTTCTGGTACTGATTTTACTTTTACTATTTCTTCTCTTCAACCTGAAGATATTGCTACTTATTATTGTTTTCAATATTCTCATGTTCCTTGGACTTTTGGTCAAGGTACTAAACTTCAAATTACT
>Seq ID 209: ABT-806 VH胺基酸序列
DVQLQESGPSLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT
SDFAWNWIRQFPGNKLEWMG
YISYSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTIEDTATYYCVT
AGRGFPYWGQGTLVTVSA
>Seq ID 210: ABT-806 VH核苷酸序列
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTAGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGCTGGAGTGGATGGGCTACATAAGTTATAGTGGTAACACTAGGTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGCGACACATCCAAGAACCAATTCTTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAACGGCGGGACGCGGGTTTCCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
>Seq ID 211: ABT-806 VL胺基酸序列
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITC
HSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIY
HGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYC
VQYAQFPWTFGGGTKLEIK
>Seq ID 212: ABT-806 VL核苷酸序列
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATTCAAGTCAGGACATTAACAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAGACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGACGATGAAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGCTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>Seq ID 213: (G4S)2連接子胺基酸序列
GGGGSGGGGS
>Seq ID 214: (G4S)2連接子核苷酸序列
GGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCC
>Seq ID 215: (G4S)4連接子胺基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGS
>Seq ID 216: (G4S)4連接子核苷酸序列
GGTGGAGGAGGCAGTGGTGGTGGAGGAAGCGGAGGTGGTGGCAGC
>Seq ID 217: (G4S)5連接子胺基酸序列
GGGGSGSGSGGGGGSGGGGSGGGGS
>Seq ID 218: (G4S)5連接子核苷酸序列
GGTGGCGGTGGCTCCGGATCCGGTTCTGGAGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGCTCTGGAGGAGGCGGTTCG
>Seq ID 219: (G4S)6連接子胺基酸序列
GGGGSGGGGSGSGSGGGGGSGGGGSGGGGS
>Seq ID 220: (G4S)6連接子核苷酸序列
GGAGGCGGTGGTAGCGGTGGCGGTGGCTCCGGATCCGGTTCTGGAGGAGGCGGTGGAAGCGGAGGCGGTGGCTCTGGAGGAGGCGGTTCG
>Seq ID 221: 人類IgG1胺基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>Seq ID 222: 人類IgG1核苷酸序列
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>Seq ID 223: 人類CK胺基酸序列
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>Seq ID 224: 人類CK核苷酸序列
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>Seq ID 225: ABT-806 V1 VH胺基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVSGYSITSDFAWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTRYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLQLNSVTAEDTAVYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 226: ABT-806 V1 VH核苷酸序列
CAAGTGCAGTTGCAGGAGAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAGCCTTCTCAGTCACTGAGCCTCACGTGCACCGTAAGCGGTTATAGTATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGCCGCCCGGGAAGGGACTGGAGTGGATCGGATACATTTCCTACAGTGGAAACACTCGATATAATCCTAGTCTTAAAAGTCGGGTAACCATCTCTAGGGATACCAGCAAGAATCAGTTCTCATTGCAACTCAATTCAGTGACCGCAGAAGACACCGCAGTCTACTATTGCGTCACAGCCGGACGCGGTTTCCCGTACTGGGGCCAAGGAACACTAGTCACCGTGTCTTCC
>Seq ID 227: ABT-806 V1 VL胺基酸序列
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGQGTKVEIK
>Seq ID 228: ABT-806 V1 VL核苷酸序列
GACATTCAGATGACACAGAGCCCAAGTAGCGTTTCTGCCAGCGTGGGGGACCGAGTCACCATTACTTGTCACAGTTCACAAGATATTAACTCTAACATCGGCTGGCTGCAGCAAAAACCAGGTAAAGCACCAAAAGGGCTCATTTATCATGGGACCAACCTGGATGACGGAGTCCCGAGTCGATTCAGCGGGAGTGGAAGCGGAGCTGATTATACCCTGACGATCTCAAGCTTGCAGCCAGAGGATTTCGCCACATACTATTGTGTCCAGTATGCCCAGTTCCCCTGGACATTTGGCCAGGGTACGAAGGTGGAGATTAAG
>Seq ID 229: ABT-806 V2 VH胺基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVSGYSITSDFAWNWIRQAPGKGLEWVGYISYSGNTRYNPSLKSRFTISRDTSKNQFYLQLNSVTAEDTAVYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 230: ABT-806 V2 VH核苷酸序列
CAAGTCCAGCTGCAGGAAAGTGGCCCTGGACTCGTTAAGCCTAGTCAGAGCTTGTCATTGACTTGCACAGTCAGTGGTTATTCCATCACAAGTGACTTTGCCTGGAATTGGATTCGGCAGGCTCCCGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCGGGTATATTTCCTACAGCGGAAATACTCGATATAACCCATCCCTTAAAAGTCGCTTCACCATATCTCGTGACACCAGCAAAAATCAATTTTATCTTCAACTCAATTCAGTGACAGCCGAGGATACAGCTGTTTACTATTGTGTGACAGCTGGCAGAGGATTTCCCTATTGGGGACAGGGAACCCTTGTAACGGTCTCCAGC
>Seq ID 231: ABT-806 V2 VL胺基酸序列
DIVMTQSPSSLSVSPGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKAPKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLEPEDFAVYYCVQYAQFPWTFGQGTKVEIK
>Seq ID 232: ABT-806 V2 VL核苷酸序列
GACATAGTGATGACACAGTCTCCAAGTTCTTTGAGCGTATCCCCAGGCGACCGCGTAACAATTACCTGTCACAGCTCCCAGGATATTAATAGTAATATTGGCTGGCTTCAACAGAAGCCAGGGAAGGCACCAAAAGGACTGATCTACCACGGAACTAATCTGGACGATGGGGTTCCTTCACGGTTCTCCGGGTCCGGCTCTGGTGCCGACTACACTCTGACAATTAGCTCCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCAGTGTACTATTGCGTGCAGTACGCACAATTTCCCTGGACATTTGGTCAAGGCACCAAAGTCGAAATTAAA
>Seq ID 233: ABT-806 V3 VH胺基酸序列
QVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDFAWNWIRQFPGRKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRFTISRDTSKNQFYLKLRSVTIADTAVYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 234: ABT-806 V3 VH核苷酸序列
CAAGTGCAGCTCCAGGAGTCAGGCCCTAGCCTCGTGAAGCCCTCCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTATCTGGTTATAGTATTACAAGTGACTTCGCCTGGAACTGGATTAGGCAGTTTCCAGGTCGCAAGCTGGAGTGGATGGGGTATATCTCCTACTCCGGTAACACTCGATACAACCCTTCCCTCAAAAGCAGATTTACCATTTCCAGAGACACATCTAAGAACCAATTTTATCTGAAGTTGAGATCTGTTACCATCGCTGATACTGCTGTGTACTATTGCGTTACCGCCGGACGCGGCTTCCCCTATTGGGGGCAGGGAACCCTGGTGACTGTATCATCC
>Seq ID 235: ABT-806 V3 VL胺基酸序列
DIVMTQSPSSVSLSLGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKPGKAFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQAEDFATYYCVQYAQFPWTFGPGTKLEIK
>Seq ID 236: ABT-806 V3 VL核苷酸序列
GACATCGTGATGACCCAATCTCCAAGCTCAGTGAGTCTGTCACTAGGCGACCGTGTCACCATTACATGTCATAGTTCCCAGGATATCAACAGTAATATTGGGTGGCTTCAGCAAAAGCCTGGTAAAGCCTTTAAAGGACTGATTTATCACGGGACCAACTTGGACGATGGAGTTCCCTCCCGGTTTTCTGGCTCCGGGTCCGGTGCAGACTATACTTTGACAATTAGCTCTCTCCAGGCAGAGGACTTCGCTACATATTACTGCGTCCAGTATGCCCAGTTCCCTTGGACCTTTGGACCCGGCACTAAACTGGAAATTAAA
>Seq ID 237: SI-95m5 (人源化西妥昔單抗) VH胺基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLTNYGVHWIRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 238: SI-95m5 (人源化西妥昔單抗) VH核苷酸序列
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT
>Seq ID 239: SI-95m5 (人源化西妥昔單抗) VL胺基酸序列
EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSCRASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIKYASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYCQQNNNWPTTFGPGTKLTVL
>Seq ID 240: SI-95m5 (人源化西妥昔單抗) VL核苷酸序列
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTG
>Seq ID 241: 西妥昔單抗N92F VL胺基酸序列
EIVLTQSPSTLSVSPGERATFSC
RASQSIGTNIHWYQQKPGKPPRLLIK
YASESISGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQSEDFAVYYC
QQNFNWPTTFGPGTKLTVL
>Seq ID 242: 西妥昔單抗N92F VL核苷酸序列
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTTCCACACTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCTTCAGCTGTAGAGCCTCTCAGTCCATCGGCACCAACATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGCCTCCTCGGCTGCTGATTAAGTACGCCTCCGAGTCCATCAGCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGAGTTTACCCTGACCATCTCCTCCGTGCAGTCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACTTCAACTGGCCCACCACCTTTGGACCCGGCACCAAGCTGACCGTGCTG
>Seq ID 243: 西妥昔單抗N92K VL胺基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC
RASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIK
YASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC
QQNKNWPTTFGAGTKLELK
>Seq ID 244: 西妥昔單抗N92K VL核苷酸序列
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATTCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAATAAGAACTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
>Seq ID 245: 人源化西妥昔單抗Y101A VH胺基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLT
NYGVHWIRQAPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCAR
ALTAYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 246: 人源化西妥昔單抗Y101A VH核苷酸序列
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCGCCTACGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT
>Seq ID 247: 西妥昔單抗Y101W VH胺基酸序列
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NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTWYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 248: 西妥昔單抗Y101W VH核苷酸序列
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>Seq ID 249: 人源化西妥昔單抗Y102A VH胺基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLT
NYGVHWIRQAPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCAR
ALTYADYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 250: 人源化西妥昔單抗Y102A VH核苷酸序列
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACGCCGACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT
>Seq ID 251: 西妥昔單抗D103F VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYYFYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 252: 西妥昔單抗D103F VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATTTCTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 253: 西妥昔單抗D103W VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYYWYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 254: 西妥昔單抗D103W VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATTGGTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 255: 人源化西妥昔單抗D103Y VH胺基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLT
NYGVHWIRQAPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCAR
ALTYYYYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 256: 人源化西妥昔單抗D103Y VH核苷酸序列
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACTACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT
>Seq ID 257: 人源化西妥昔單抗Y104L VH胺基酸序列
QVQLQQSGPGLVKPSETLSITCTVSGFSLT
NYGVHWIRQAPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRFTITKDNSKNQVYFKLRSVRADDTAIYYCAR
ALTYYDLEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 258: 人源化西妥昔單抗Y104L VH核苷酸序列
CAAGTTCAGTTGCAGCAGTCTGGCCCTGGCCTGGTCAAGCCTTCTGAGACACTGTCCATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCTCCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGATCAGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCTTTCACCAGCCGGTTCACCATCACCAAGGACAACTCCAAGAACCAGGTGTACTTCAAGCTGCGGAGCGTGCGGGCTGATGACACCGCCATCTACTACTGTGCTCGGGCCCTGACCTACTACGACCTCGAGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCT
>Seq ID 259: 西妥昔單抗Y101A VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTAYDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 260: 西妥昔單抗Y101A VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCGCCTATGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 261: 西妥昔單抗Y102A VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYADYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 262: 西妥昔單抗Y102A VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACGCCGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 263: 西妥昔單抗Y102V VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYVDYEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 264: 西妥昔單抗Y102V VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACGTGGATTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 265: 西妥昔單抗D103Y VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
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>Seq ID 266: 西妥昔單抗D103Y VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATTACTACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 267: 西妥昔單抗Y104L VH胺基酸序列
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLT
NYGVHWVRQSPGKGLEWLG
VIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCAR
ALTYYDLEFAYWGQGTLVTVSS
>Seq ID 268: 西妥昔單抗Y104L VH核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAACACAGACTATAATACACCTTTCACATCCAGACTGAGCATCAACAAGGACAATTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAATCTAATGACACAGCCATATATTACTGTGCCAGAGCCCTCACCTACTATGATCTCGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTAGC
>Seq ID 269: 西妥昔單抗N92F VL胺基酸序列
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSC
RASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIK
YASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYC
QQNFNWPTTFGAGTKLELK
>Seq ID 270: 西妥昔單抗N92F VL核苷酸序列
GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGTCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAGAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTGGCACAAACATACACTGGTATCAGCAAAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGATTCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAAATTTCAACTGGCCAACCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
蛋白質 | 滴度(ug/ml) | %POI | %HMW | %LMW | 注意 |
西妥昔單抗 | 154 | ||||
尼妥珠單抗 | 39 | ||||
ABT-806 | 58 | ||||
SI-95X1 | 175 | 83.82 | 16.18 | 0.00 | |
SI-95X2 | 64 | 89.36 | 10.42 | 0.22 | |
SI-95X3 | 127 | 92.08 | 7.92 | 0.00 | |
SI-95X4 | 22 | 38.30 | 60.15 | 1.55 | 低品質資料 |
SI-95X5 | 15 | 55.96 | 42.99 | 1.04 | 低品質資料 |
SI-95X6 | 16 | 61.47 | 37.01 | 1.52 | 低品質資料 |
SI-95X7 | 13 | 72.67 | 21.67 | 5.66 | 低品質資料 |
SI-95X8 | 35 | 73.88 | 14.56 | 11.53 | 低品質資料 |
SI-95X9 | 50 | 24.72 | 72.71 | 2.56 | 低品質資料 |
SI-95X10 | 49 | 22.15 | 76.13 | 1.72 | 低品質資料 |
SI-95X11 | 6 | 70.24 | 28.67 | 1.09 | 低品質資料 |
SI-95X12 | 6 | 20.98 | 64.00 | 15.05 | 低品質資料 |
SI-95X13 | 5 | 71.42 | 1.78 | 26.80 | 低品質資料 |
SI-95X14 | 13 | 4.43 | 86.86 | 8.87 | 低品質資料 |
SI-95X15 | 10 | 3.85 | 85.11 | 11.04 | 低品質資料 |
SI-95X16 | 10 | 7.75 | 82.53 | 9.72 | 低品質資料 |
SI-95X17 | 37 | 63.42 | 36.58 | 0.00 | 分裂峰 |
SI-95X18 | 34 | 56.42 | 42.94 | 0.64 | 分裂峰 |
SI-95X19 | 42 | 57.92 | 41.44 | 0.63 | 分裂峰 |
SI-95X20 | 78 | 73.91 | 25.77 | 0.32 | |
SI-95X21 | 85 | 71.64 | 21.20 | 7.16 | |
SI-95X22 | 68 | 77.81 | 18.37 | 3.81 | |
SI-95X23 | 22 | 54.31 | 15.21 | 30.48 | 分裂峰 |
SI-95X24 | 21 | 58.03 | 39.50 | 2.47 | 分裂峰 |
SI-95X25 | 21 | 54.92 | 43.81 | 1.27 | 分裂峰 |
SI-95X26 | 36 | 63.31 | 35.16 | 1.53 | |
SI-95X27 | 34 | 66.02 | 29.88 | 4.09 | |
SI-95X28 | 34 | 69.26 | 27.28 | 3.46 | |
SI-95X29 | 27 | 61.32 | 35.13 | 3.55 | 寬主峰 |
SI-95X30 | 23 | 52.39 | 43.24 | 4.37 | 寬主峰 |
SI-95X31 | 24 | 54.06 | 42.63 | 3.31 | 寬主峰 |
SI-95X35 | 119 | 68.30 | 31.70 | 0.00 | |
SI-95X36 | 52 | 72.00 | 28.00 | 0.00 | |
SI-95X37 | 72 | 75.30 | 25.00 | 0.00 | |
SI-95X38 | 24 | 67.20 | 32.80 | 0.00 | |
SI-95X39 | 50 | 60.20 | 39.80 | 0.00 |
蛋白質 | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) |
西妥昔單抗 | 0.75 | 3.77E-09 | 3.41E+05 | 1.29E-03 |
尼妥珠單抗 | 0.32 | 9.09E-09 | 1.48E+05 | 1.34E-03 |
ABT-806 | 0.07 | ND | ND | ND |
SI-95X1 | 0.62 | 2.36E-09 | 3.89E+05 | 9.18E-04 |
SI-95X2 | 0.26 | 5.53E-09 | 1.14E+05 | 6.30E-04 |
SI-95X3 | 0.41 | 6.80E-10 | 4.20E+05 | 2.85E-04 |
SI-95X4 | 0.04 | ND | ND | ND |
SI-95X5 | 0.04 | ND | ND | ND |
SI-95X6 | 0.03 | ND | ND | ND |
SI-95X7 | 0.02 | ND | ND | ND |
SI-95X8 | 0.02 | ND | ND | ND |
SI-95X9 | 0.01 | ND | ND | ND |
SI-95X10 | 0.00 | ND | ND | ND |
SI-95X11 | 0.02 | ND | ND | ND |
SI-95X12 | 0.02 | ND | ND | ND |
SI-95X13 | 0.01 | ND | ND | ND |
SI-95X14 | 0.00 | ND | ND | ND |
SI-95X15 | 0.00 | ND | ND | ND |
SI-95X16 | 0.00 | ND | ND | ND |
SI-95X17 | 0.26 | 6.02E-09 | 7.78E+04 | 4.69E-04 |
SI-95X18 | 0.24 | 4.17E-09 | 6.35E+04 | 2.65E-04 |
SI-95X19 | 0.23 | 5.01E-09 | 8.78E+04 | 4.40E-04 |
SI-95X20 | 0.24 | 4.73E-09 | 6.94E+04 | 3.29E-04 |
SI-95X21 | 0.24 | 5.56E-09 | 7.62E+04 | 4.23E-04 |
SI-95X22 | 0.21 | 6.10E-09 | 4.67E+04 | 2.85E-04 |
SI-95X23 | 0.16 | 6.17E-09 | 8.16E+04 | 5.04E-04 |
SI-95X24 | 0.17 | 7.94E-09 | 5.52E+04 | 4.38E-04 |
SI-95X25 | 0.13 | 1.34E-08 | 5.56E+04 | 7.44E-04 |
SI-95X26 | 0.17 | 9.35E-09 | 7.13E+04 | 6.67E-04 |
SI-95X27 | 0.16 | 1.07E-08 | 4.55E+04 | 4.88E-04 |
SI-95X28 | 0.15 | 7.56E-09 | 5.52E+04 | 4.17E-04 |
SI-95X29 | 0.22 | 1.01E-08 | 8.89E+04 | 9.01E-04 |
SI-95X30 | 0.20 | 8.84E-09 | 9.72E+04 | 8.60E-04 |
SI-95X31 | 0.19 | 1.05E-08 | 8.77E+04 | 9.23E-04 |
SI-95X35 | 0.72 | 6.86E-10 | 3.82E+05 | 2.62E-04 |
SI-95X36 | 0.72 | 1.44E-09 | 5.08E+05 | 7.30E-04 |
SI-95X37 | 0.76 | 1.55E-09 | 4.61E+05 | 7.12E-04 |
SI-95X38 | 0.75 | 1.62E-09 | 4.68E+05 | 7.57E-04 |
SI-95X39 | 0.35 | 5.05E-09 | 1.58E+05 | 7.97E-04 |
蛋白質 | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) |
西妥昔單抗 | 0.58 | 1.98E-09 | 8.09E+05 | 1.60E-03 |
尼妥珠單抗 | 0.31 | 6.68E-09 | 2.02E+05 | 1.35E-03 |
ABT-806 | 0.39 | 4.79E-09 | 3.29E+05 | 1.58E-03 |
SI-95X1 | 0.55 | 4.45E-10 | 1.13E+06 | 5.03E-04 |
SI-95X2 | 0.44 | 1.15E-09 | 3.07E+05 | 3.53E-04 |
SI-95X3 | 0.45 | 3.75E-10 | 8.32E+05 | 3.12E-04 |
SI-95X4 | 0.27 | 5.52E-09 | 3.61E+05 | 2.00E-03 |
SI-95X5 | 0.30 | 7.94E-09 | 2.70E+05 | 2.15E-03 |
SI-95X6 | 0.31 | 6.35E-09 | 3.34E+05 | 2.12E-03 |
SI-95X7 | 0.31 | 8.41E-09 | 2.87E+05 | 2.41E-03 |
SI-95X8 | 0.28 | 6.97E-09 | 2.91E+05 | 2.03E-03 |
SI-95X9 | 0.20 | 6.16E-09 | 3.00E+05 | 1.85E-03 |
SI-95X10 | 0.14 | 7.00E-09 | 3.27E+05 | 2.29E-03 |
SI-95X11 | 0.08 | 4.87E-09 | 3.56E+05 | 1.73E-03 |
SI-95X12 | 0.15 | 7.80E-09 | 2.98E+05 | 2.32E-03 |
SI-95X13 | 0.22 | 8.77E-09 | 2.73E+05 | 2.40E-03 |
SI-95X14 | 0.08 | 4.28E-10 | 1.00E+05 | 4.28E-05 |
SI-95X15 | 0.07 | 1.75E-10 | 1.00E+05 | 1.75E-05 |
SI-95X16 | 0.08 | 1.94E-08 | 1.50E+05 | 2.91E-03 |
SI-95X17 | 0.50 | 6.42E-10 | 2.87E+05 | 1.84E-04 |
SI-95X18 | 0.49 | 5.93E-10 | 2.96E+05 | 1.75E-04 |
SI-95X19 | 0.47 | 6.76E-10 | 3.04E+05 | 2.06E-04 |
SI-95X20 | 0.56 | 8.39E-10 | 3.46E+05 | 2.90E-04 |
SI-95X21 | 0.53 | 6.54E-10 | 3.22E+05 | 2.11E-04 |
SI-95X22 | 0.52 | 8.34E-10 | 3.45E+05 | 2.88E-04 |
SI-95X23 | 0.38 | 1.45E-09 | 3.52E+05 | 5.09E-04 |
SI-95X24 | 0.42 | 1.45E-09 | 3.49E+05 | 5.05E-04 |
SI-95X25 | 0.32 | 1.21E-09 | 3.50E+05 | 4.23E-04 |
SI-95X26 | 0.40 | 2.81E-10 | 3.92E+05 | 1.10E-04 |
SI-95X27 | 0.41 | 5.07E-10 | 3.74E+05 | 1.90E-04 |
SI-95X28 | 0.41 | 5.79E-10 | 3.70E+05 | 2.14E-04 |
SI-95X29 | 0.44 | 1.12E-09 | 2.82E+05 | 3.16E-04 |
SI-95X30 | 0.40 | 1.24E-09 | 2.90E+05 | 3.60E-04 |
SI-95X31 | 0.40 | 1.08E-09 | 2.84E+05 | 3.07E-04 |
SI-95X35 | 0.54 | 6.28E-10 | 4.43E+05 | 2.78E-04 |
SI-95X36 | 0.53 | 4.01E-10 | 5.70E+05 | 2.29E-04 |
SI-95X37 | 0.59 | 7.30E-10 | 5.34E+05 | 3.90E-04 |
SI-95X38 | 0.54 | 6.71E-10 | 5.13E+05 | 3.44E-04 |
SI-95X39 | 0.37 | 1.43E-09 | 2.22E+05 | 3.17E-04 |
第二抗體 | ||||||
Cetu | Pani | Nimo | Neci | ABT-806 | ||
第一抗體 | Cetu | 0.0198 | 0.0124 | 0.0112 | -0.0007 | -0.0048 |
Pani | 0.0156 | 0.0071 | 0.0083 | 0.0031 | -0.0033 | |
Nimo | 0.1815 | 0.1641 | 0.1045 | 0.1402 | -0.0072 | |
Neci | 0.0283 | 0.0110 | 0.0153 | 0.0040 | 0.0034 | |
ABT-806 | 0.5338 | 0.5094 | 0.2723 | 0.4637 | -0.0034 |
第二抗體 | ||||||
Cetu | Pani | Nimo | Neci | ABT-806 | ||
第一抗體 | Cetu | -0.0009 | 0.0104 | 0.0277 | 0.0000 | 0.6938 |
Pani | 0.0108 | 0.0085 | 0.0097 | 0.0058 | 0.7129 | |
Nimo | 0.1755 | 0.1529 | 0.1015 | 0.1304 | 0.6880 | |
Neci | 0.0114 | 0.0093 | 0.0303 | 0.0071 | 0.7138 | |
ABT-806 | 0.9734 | 0.8917 | 0.7272 | 0.8168 | 0.0315 |
人源化版本 | 重鏈 | 輕鏈 | 滴度(ug/mL) | %POI | %HMW | %LMW |
版本1 (V1) | VH1 | VK1 | 23.0 | 54.97 | 24.25 | 20.78 |
版本2 (V2) | VH1 | VK2 | 36.3 | 50.06 | 31.33 | 18.61 |
版本3 (V3) | VH1 | VK3 | 60.0 | 87.49 | 9.8 | 2.71 |
版本4 (V4) | VH2 | VK1 | 50.7 | 58.66 | 28.04 | 13.3 |
版本5 (V5) | VH2 | VK2 | 25.1 | 43.05 | 40.87 | 16.08 |
版本6 (V6) | VH2 | VK3 | 57.8 | 52.69 | 34.97 | 12.34 |
版本7 (V7) | VH3 | VK1 | 31.1 | 56.06 | 23.06 | 20.88 |
版本8 (V8) | VH3 | VK2 | 32.6 | 63.77 | 16.94 | 19.29 |
版本9 (V9) | VH3 | VK3 | 77.5 | 91.90 | 3.38 | 4.01 |
人源化版本 | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) |
V1 | 0.2074 | 2.95E-08 | 1.26E+05 | 3.70E-03 |
V2 | 0.2315 | 2.66E-08 | 1.34E+05 | 3.56E-03 |
V3 | 0.3547 | 1.54E-08 | 1.53E+05 | 2.36E-03 |
V4 | 0.2738 | 2.32E-08 | 1.27E+05 | 2.95E-03 |
V5 | 0.2305 | 3.07E-08 | 1.21E+05 | 3.71E-03 |
V6 | 0.3067 | 1.84E-08 | 1.16E+05 | 2.13E-03 |
V7 | 0.1691 | 3.78E-08 | 1.09E+05 | 4.13E-03 |
V8 | 0.198 | 3.19E-08 | 1.09E+05 | 3.46E-03 |
V9 | 0.3433 | 1.61E-08 | 1.60E+05 | 2.58E-03 |
ABT-806 | 0.3045 | 1.57E-08 | 1.45E+05 | 2.28E-03 |
迪妥昔珠單抗 | 0.259 | 1.09E-08 | 1.57E+05 | 1.72E-03 |
人源化版本 | EGFR | EGFRvIII | uPAR |
V1 | 634 | 10695 | 166 |
V2 | 661 | 11707 | 199 |
V3 | 1261 | 14652 | 204 |
V4 | 620 | 12031 | 195 |
V5 | 528 | 10224 | 190 |
V6 | 664 | 11803 | 185 |
V7 | 749 | 11179 | 196 |
V8 | 876 | 13080 | 196 |
V9 | 2713 | 16041 | 114 |
ABT-806 | 914 | 13986 | 184 |
西妥昔單抗 | 8896 | 9229 | 177 |
人源化ABT-806 | %相似性 | 序列 |
VH3 | 89.7 | QVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSDFAWNWIRQ FPGRKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRFTISRDTSKNQFY LKLRSVTIADTAVYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS |
VK3 | 92.5 | DIVMTQSPSSVSLSLGDRVTITCHSSQDINSNIGWLQQKP GKAFKGLIYHGTNLDDGVPSRFSGSGSGADYTLTISSLQA EDFATYYCVQYAQFPWTFGPGTKLEIK |
VH1 | 92.2 | QVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVSGYSITSDFAWNWIRQ PPGKGLEWIGYISYSGNTRYNPSLKSRVTISRDTSKNQFS LQLNSVTAEDTAVYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSS |
突變 | ΔΔG穩定性(kcal/mol) | ΔΔG結合(kcal/mol) |
西妥昔單抗(HC: D103F) | -0.50 | 1.17 |
西妥昔單抗(HC: D103Y) | -1.41 | 3.16 |
西妥昔單抗(HC: D103W) | 0.91 | 4.17 |
西妥昔單抗(HC: Y101A) | 2.85 | 1.90 |
西妥昔單抗(HC: Y101W) | 0.71 | 2.06 |
西妥昔單抗(HC: Y102A) | 454 | 3.96 |
西妥昔單抗(HC: Y104L) | 1.13 | 1.58 |
西妥昔單抗(LC: N92F) | -2.21 | -1.43 |
西妥昔單抗(LC: N92K) | -1.06 | 0.05 |
去成熟西妥昔單抗變異體 | 滴度(ug/mL) | %POI | %HMW | %LMW |
西妥昔單抗_WT | 39.0 | 95.19 | 4.81 | 0 |
西妥昔單抗(HC: D103F) | 35.6 | 82.37 | 11.68 | 5.95 |
西妥昔單抗(HC: D103Y) | 26.5 | 88.77 | 4.79 | 6.44 |
西妥昔單抗(HC: D103W) | 22.5 | 69.95 | 30.05 | 0 |
西妥昔單抗(HC: Y101A) | 26.0 | 80.74 | 19.26 | 0 |
西妥昔單抗(HC: Y101W) | 38.9 | 78.23 | 21.77 | 0 |
西妥昔單抗(HC: Y102A) | 31.0 | 90.93 | 9.07 | 0 |
西妥昔單抗(HC: Y104L) | 34.1 | 95.31 | 4.69 | 0 |
西妥昔單抗(LC: N92F) | 35.5 | 86.06 | 13.94 | 0 |
西妥昔單抗(LC: N92K) | 33.8 | 85.15 | 14.85 | 0 |
蛋白質名稱 | 與EGFR之結合親和力 | 與EGFR之結合親合力 | ||||||
反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) | |
西妥昔單抗_WT | 0.6754 | 5.53E-09 | 4.42E+05 | 2.44E-03 | 0.3947 | 4.80E-11 | 1.89E+06 | 9.08E-05 |
_HC: D103F | 0.0196 | N/A | N/A | N/A | 0.0018 | N/A | N/A | N/A |
_HC: D103Y | 0.0130 | N/A | N/A | N/A | -2.50E-03 | N/A | N/A | N/A |
_HC: D103W | 0.0140 | N/A | N/A | N/A | -2.03E-03 | N/A | N/A | N/A |
_HC: Y101A | 0.3343 | 6.71E-08 | 5.79E+05 | 3.89E-02 | 0.2809 | 2.01E-10 | 2.02E+06 | 4.05E-04 |
_HC: Y101W | 0.5531 | 3.48E-09 | 4.71E+05 | 1.64E-03 | 0.2833 | <1.0E-12 | 1.77E+06 | 3.36E-07 |
_HC: Y102A | 0.2016 | 9.65E-08 | 5.74E+05 | 5.54E-02 | 0.1641 | 5.25E-10 | 2.05E+06 | 1.08E-03 |
_HC: Y104L | 0.4609 | 9.20E-09 | 5.38E+05 | 4.95E-03 | 0.1486 | 3.35E-11 | 2.40E+06 | 8.05E-05 |
_LC: N92F | 0.4764 | 3.41E-08 | 5.30E+05 | 1.81E-02 | 0.4202 | 3.58E-11 | 2.12E+06 | 7.56E-05 |
_LC: N92K | 0.6189 | 3.91E-09 | 3.83E+05 | 1.50E-03 | 0.378 | <1.0E-12 | 1.51E+06 | 5.78E-07 |
蛋白質名稱 | 與EGFRvIII之結合親和力 | 與EGFRvIII之結合親合力 | ||||||
反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) | |
西妥昔單抗_WT | 0.3236 | 1.97E-09 | 7.13E+05 | 1.40E-03 | 0.7112 | 1.03E-11 | 1.13E+06 | 1.15E-05 |
_HC: D103F | -7.88E-03 | N/A | N/A | N/A | 0.0087 | N/A | N/A | N/A |
_HC: D103Y | -2.25E-03 | N/A | N/A | N/A | 0.0034 | N/A | N/A | N/A |
_HC: D103W | -5.59E-03 | N/A | N/A | N/A | 0.0096 | N/A | N/A | N/A |
_HC: Y101A | 0.2186 | 3.22E-08 | 9.06E+05 | 2.91E-02 | 0.3358 | 2.44E-10 | 1.98E+06 | 4.83E-04 |
_HC: Y101W | 0.244 | 1.28E-09 | 7.24E+05 | 9.27E-04 | 0.3164 | <1.0E-12 | 1.55E+06 | 4.90E-07 |
_HC: Y102A | 0.164 | 3.28E-08 | 7.94E+05 | 2.60E-02 | 0.1879 | 4.21E-10 | 2.00E+06 | 8.44E-04 |
_HC: Y104L | 0.1875 | 2.52E-09 | 9.77E+05 | 2.46E-03 | 0.1765 | <1.0E-12 | 2.02E+06 | 4.27E-07 |
_LC: N92F | 0.2444 | 2.13E-08 | 8.99E+05 | 1.92E-02 | 0.5917 | 9.25E-11 | 1.77E+06 | 1.64E-04 |
_LC: N92K | 0.3062 | 8.13E-10 | 6.44E+05 | 5.23E-04 | 0.4518 | <1.0E-12 | 1.38E+06 | 6.15E-07 |
蛋白質名稱 | EGFR | EGFRvIII | uPAR |
西妥昔單抗_WT | 10844 | 8405 | 43.9 |
西妥昔單抗(HC: D103F) | 4655 | 4240 | 93.5 |
西妥昔單抗(HC: D103Y) | 4958 | 3920 | 114 |
西妥昔單抗(HC: D103W) | 137 | 118 | 96.9 |
西妥昔單抗(HC: Y101A) | 9535 | 8660 | 150 |
西妥昔單抗(HC: Y101W) | 9158 | 8347 | 113 |
西妥昔單抗(HC: Y102A) | 7934 | 7881 | 107 |
西妥昔單抗(HC: Y104L) | 10121 | 11074 | 108 |
西妥昔單抗(LC: N92F) | 8526 | 8211 | 114 |
西妥昔單抗(LC: N92K) | 8057 | 7605 | 112 |
抗uPAR對照mAb | 134 | 98.8 | 26152 |
蛋白質 | 滴度(ug/ml) | %POI | %HMW | %LMW |
SI-95X40 | 16 | 88.00 | 12.00 | 0.00 |
SI-95X41 | 30 | 72.90 | 27.10 | 0.00 |
SI-95X42 | 9 | 87.10 | 12.90 | 0.00 |
SI-95X43 | 32 | 69.77 | 25.81 | 4.43 |
SI-95X44 | 195 | 92.70 | 7.30 | 0.00 |
SI-95X45 | 27 | 71.73 | 28.27 | 0.00 |
SI-95X46 | 16 | 83.34 | 16.66 | 0.00 |
SI-95X47 | 115 | 85.12 | 14.88 | 0.00 |
SI-95X48 | 25 | 88.33 | 11.67 | 0.00 |
SI-95X49 | 66 | 88.98 | 11.02 | 0.00 |
SI-95X50 | 205 | 84.74 | 15.26 | 0.00 |
SI-95X51 | 42 | 84.20 | 15.80 | 0.00 |
SI-95X52 | 83 | 89.10 | 10.90 | 0.00 |
SI-95X53 | 154 | 77.00 | 23.00 | 0.00 |
SI-95X54 | 172 | 88.40 | 11.60 | 0.00 |
SI-95X55 | 89 | 89.00 | 11.00 | 0.00 |
SI-95X56 | 8 | 95.00 | 5.00 | 0.00 |
SI-95X57 | 137 | 65.18 | 34.82 | 0.00 |
SI-95X58 | 87 | 47.74 | 52.26 | 0.00 |
SI-95X59 | 98 | 47.75 | 52.25 | 0.00 |
SI-95X60 | 115 | 55.41 | 44.59 | 0.00 |
SI-95X61 | 91 | 54.69 | 45.31 | 0.00 |
SI-95X62 | 110 | 74.10 | 25.90 | 0.00 |
SI-95X63 | 20 | 86.57 | 13.43 | 0.00 |
SI-95X64 | 46 | 67.52 | 32.48 | 0.00 |
SI-95X65 | 36 | 69.39 | 30.61 | 0.00 |
SI-95X66 | 35 | 69.73 | 30.27 | 0.00 |
SI-95X67 | 48 | 70.32 | 29.68 | 0.00 |
SI-95X68 | 48 | 84.45 | 15.55 | 0.00 |
蛋白質 | 反應(nm) | KD (M) | Kon (M -1s -1) | koff (s -1) |
西妥昔單抗 | 0.75 | 3.77E-09 | 3.41E+05 | 1.29E-03 |
尼妥珠單抗 | 0.32 | 9.09E-09 | 1.48E+05 | 1.34E-03 |
ABT-806 | 0.07 | ND | ND | ND |
SI-95X40 | 0.70 | 9.54E-10 | 3.16E+05 | 3.02E-04 |
SI-95X41 | 0.09 | NA | NA | NA |
SI-95X42 | 1.1 | 3.43E-09 | 3.52E+05 | 1.21E-03 |
SI-95X43 | 0.74 | 1.18E-09 | 3.16E+05 | 3.72E-04 |
SI-95X44 | 0.47 | 1.81E-09 | 5.61E+05 | 1.26E+03 |
SI-95X45 | 0.18 | 4.61E-09 | 4.11E+05 | 1.89E-03 |
SI-95X46 | 0.59 | 7.30E-09 | 4.58E+05 | 3.34E-03 |
SI-95X47 | 0.48 | 2.06E-08 | 4.29E+05 | 8.85E-03 |
SI-95X48 | 0.44 | 2.55E-08 | 3.24E+05 | 8.25E-03 |
SI-95X49 | 0.52 | 1.76E-08 | 3.78E+05 | 6.64E-03 |
SI-95X50 | 0.59 | 1.38E-09 | 4.50E+05 | 6.23E-04 |
SI-95X51 | 0.705 | 1.81E-09 | 3.94E+05 | 7.14E-04 |
SI-95X52 | 0.5267 | 1.93E-08 | 2.75E+05 | 5.29E-03 |
SI-95X53 | 0.3655 | 1.82E-08 | 2.45E+05 | 4.45E-03 |
SI-95X54 | 0.3548 | 2.57E-08 | 3.11E+05 | 7.99E-03 |
SI-95X55 | 0.056 | NA | NA | NA |
SI-95X56 | 0.4402 | 6.88E-09 | 5.38E+05 | 3.70E-03 |
SI-95X57 | 0.65 | 7.68E-10 | 4.00E+05 | 3.07E-04 |
SI-95X58 | 0.48 | 1.60E-08 | 3.98E+05 | 6.36E-03 |
SI-95X59 | 0.39 | 2.36E-08 | 3.30E+05 | 7.78E-03 |
SI-95X60 | 0.14 | 4.98E-09 | 3.21E+05 | 1.60E-03 |
SI-95X61 | 0.57 | 4.89E-09 | 4.13E+05 | 2.02E-03 |
SI-95X62 | 0.55 | 8.16E-09 | 3.83E+05 | 3.13E-03 |
SI-95X63 | 0.50 | 4.97E-10 | 4.67E+05 | 2.32E-04 |
SI-95X64 | 0.43 | 2.31E-09 | 4.85E+05 | 1.12E-03 |
SI-95X65 | 0.44 | 3.07E-09 | 5.14E+05 | 1.58E-03 |
SI-95X66 | 0.36 | 4.65E-09 | 4.46E+05 | 2.08E-03 |
SI-95X67 | 0.11 | 7.06E-09 | 3.23E+05 | 2.28E-03 |
SI-95X68 | 0.47 | 1.87E-09 | 4.59E+05 | 8.60E-04 |
蛋白質 | 反應(nm) | KD (M) | kon (M -1s -1) | koff (s -1) |
西妥昔單抗 | 0.58 | 1.98E-09 | 8.09E+05 | 1.60E-03 |
尼妥珠單抗 | 0.31 | 6.68E-09 | 2.02E+05 | 1.35E-03 |
ABT-806 | 0.39 | 4.79E-09 | 3.29E+05 | 1.58E-03 |
SI-95X40 | 0.44 | 1.16E-09 | 2.97E+05 | 3.43E-04 |
SI-95X41 | 0.48 | 1.59E-08 | 1.15E+05 | 1.84E-03 |
SI-95X42 | 0.73 | 3.60E-09 | 3.52E+05 | 2.03E-03 |
SI-95X43 | 0.61 | 8.38E-10 | 3.73E+05 | 3.13E-04 |
SI-95X44 | 0.29 | 4.66E-10 | 6.88E+05 | 1.28E+03 |
SI-95X45 | 0.36 | 1.11E-09 | 3.84E+05 | 4.27E-04 |
SI-95X46 | 0.39 | 3.58E-10 | 8.27E+05 | 2.96E-04 |
SI-95X47 | 0.34 | 2.72E-10 | 7.56E+05 | 2.05E-04 |
SI-95X48 | 0.42 | 4.04E-10 | 6.03E+05 | 2.43E-04 |
SI-95X49 | 0.36 | 2.91E-10 | 6.61E+05 | 1.92E-04 |
SI-95X50 | 0.38 | 2.07E-10 | 7.78E+05 | 1.61E-04 |
SI-95X51 | 0.40 | 1.16E-09 | 4.89E+05 | 5.66E-04 |
SI-95X52 | 0.37 | 1.47E-09 | 4.21E+05 | 6.20E-04 |
SI-95X53 | 0.31 | 1.28E-09 | 4.11E+05 | 5.27E-04 |
SI-95X54 | 0.32 | 1.37E-09 | 4.68E+05 | 6.40E-04 |
SI-95X55 | 0.24 | 7.67E-09 | 2.20E+05 | 1.69E-03 |
SI-95X56 | 0.26 | 1.93E-09 | 7.19E+05 | 1.38E-03 |
SI-95X57 | 0.40 | 5.49E-10 | 8.74E+05 | 4.80E-04 |
SI-95X58 | 0.36 | 8.07E-10 | 8.37E+05 | 6.75E-04 |
SI-95X59 | 0.43 | 1.03E-09 | 6.23E+05 | 6.42E-04 |
SI-95X60 | 0.37 | 1.95E-09 | 4.16E+05 | 8.14E-04 |
SI-95X61 | 0.40 | 5.73E-10 | 8.78E+05 | 5.03E-04 |
SI-95X62 | 0.39 | 1.02E-09 | 7.48E+05 | 7.60E-04 |
SI-95X63 | 0.34 | 4.93E-10 | 4.57E+05 | 2.25E-04 |
SI-95X64 | 0.31 | 6.38E-10 | 4.66E+05 | 2.97E-04 |
SI-95X65 | 0.31 | 8.04E-10 | 4.55E+05 | 3.65E-04 |
SI-95X66 | 0.29 | 5.76E-10 | 4.33E+05 | 2.49E-04 |
SI-95X67 | 0.27 | 1.24E-09 | 3.11E+05 | 3.85E-04 |
SI95X68 | 0.32 | 8.65E-10 | 4.47E+05 | 3.87E-04 |
蛋白質 | HC胺基酸 Seq ID | HC核苷酸 Seq ID | LC胺基酸 Seq ID | LC核苷酸 Seq ID |
西妥昔單抗 | 1 | 2 | 3 | 4 |
尼妥珠單抗 | 5 | 6 | 7 | 8 |
ABT-806 | 9 | 10 | 11 | 12 |
SI-95X1 | 13 | 14 | 3 | 4 |
SI-95X2 | 15 | 16 | 7 | 8 |
SI-95X3 | 17 | 18 | 11 | 12 |
SI-95X4 | 19 | 20 | 11 | 12 |
SI-95X5 | 21 | 22 | 11 | 12 |
SI-95X6 | 23 | 24 | 11 | 12 |
SI-95X7 | 25 | 26 | 11 | 12 |
SI-95X8 | 27 | 28 | 11 | 12 |
SI-95X9 | 29 | 30 | 11 | 12 |
SI-95X10 | 31 | 32 | 11 | 12 |
SI-95X11 | 9 | 10 | 33 | 34 |
SI-95X12 | 9 | 10 | 35 | 36 |
SI-95X13 | 9 | 10 | 37 | 38 |
SI-95X14 | 9 | 10 | 39 | 40 |
SI-95X15 | 9 | 10 | 41 | 42 |
SI-95X16 | 9 | 10 | 43 | 44 |
SI-95X17 | 45 | 46 | 7 | 8 |
SI-95X18 | 47 | 48 | 7 | 8 |
SI-95X19 | 49 | 50 | 7 | 8 |
SI-95X20 | 51 | 52 | 7 | 8 |
SI-95X21 | 53 | 54 | 7 | 8 |
SI-95X22 | 55 | 56 | 7 | 8 |
SI-95X23 | 5 | 6 | 57 | 58 |
SI-95X24 | 5 | 6 | 59 | 60 |
SI-95X25 | 5 | 6 | 61 | 62 |
SI-95X26 | 5 | 6 | 63 | 64 |
SI-95X27 | 5 | 6 | 65 | 66 |
SI-95X28 | 5 | 6 | 67 | 68 |
SI-95X29 | 5 | 6 | 69 | 70 |
SI-95X30 | 5 | 6 | 71 | 72 |
SI-95X31 | 5 | 6 | 73 | 74 |
SI-95X35 | 75 | 76 | 11 | 12 |
SI-95X36 | 9 | 10 | 77 | 78 |
SI-95X37 | 79 | 80 | 3 | 4 |
SI-95X38 | 1 | 2 | 81 | 82 |
SI-95X39 | 1 | 2 | 83 | 84 |
SI-95X40 | 85 | 86 | 7 | 8 |
SI-95X41 | 87 | 88 | 11 | 12 |
SI-95X42 | 89 | 90 | 3 | 4 |
SI-95X43 | 9 | 10 | 91 | 92 |
SI-95X44 | 93 | 94 | 95 | 96 |
SI-95X45 | 97 | 98 | 99 | 100 |
SI-95X46 | 101 | 102 | 99 | 100 |
SI-95X47 | 103 | 104 | 99 | 100 |
SI-95X48 | 105 | 106 | 99 | 100 |
SI-95X49 | 107 | 108 | 109 | 110 |
SI-95X50 | 107 | 108 | 99 | 100 |
SI-95X51 | 179 | 180 | 111 | 112 |
SI-95X52 | 113 | 114 | 111 | 112 |
SI-95X53 | 115 | 116 | 111 | 112 |
SI-95X54 | 117 | 118 | 111 | 112 |
SI-95X55 | 119 | 120 | 111 | 112 |
SI-95X56 | 121 | 122 | 111 | 112 |
SI-95X57 | 123 | 124 | 125 | 126 |
SI-95X58 | 127 | 128 | 125 | 126 |
SI-95X59 | 129 | 130 | 125 | 126 |
SI-95X60 | 131 | 132 | 125 | 126 |
SI-95X61 | 133 | 134 | 125 | 126 |
SI-95X62 | 123 | 124 | 135 | 136 |
SI-95X63 | 137 | 138 | 11 | 12 |
SI-95X64 | 139 | 140 | 11 | 12 |
SI-95X65 | 141 | 142 | 11 | 12 |
SI-95X66 | 143 | 144 | 11 | 12 |
SI-95X67 | 145 | 146 | 11 | 12 |
SI-95X68 | 147 | 148 | 11 | 12 |
SI-95m4 | 149 | 150 | 111 | 112 |
SI-95m5 | 123 | 124 | 99 | 100 |
SI-95m6 | 127 | 128 | 99 | 100 |
SI-95m7 | 129 | 130 | 99 | 100 |
SI-95m8 | 131 | 132 | 99 | 100 |
SI-95m9 | 133 | 134 | 99 | 100 |
SI-95m10 | 123 | 124 | 109 | 110 |
SI-95m11 | 1 | 2 | 151 | 152 |
SI-95m12 | 1 | 2 | 153 | 154 |
SI-95m13 | 155 | 156 | 3 | 4 |
SI-95m14 | 157 | 158 | 3 | 4 |
SI-95m15 | 159 | 160 | 3 | 4 |
SI-95m16 | 161 | 162 | 3 | 4 |
SI-95m17 | 163 | 164 | 3 | 4 |
SI-95m18 | 165 | 166 | 3 | 4 |
SI-95m19 | 167 | 168 | 3 | 4 |
SI-95m20 | 169 | 170 | 3 | 4 |
ABT-806 V1 | 171 | 172 | 173 | 174 |
ABT-806 V2 | 171 | 172 | 175 | 176 |
ABT-806 V3 | 171 | 172 | 111 | 112 |
ABT-806 V4 | 177 | 178 | 173 | 174 |
ABT-806 V5 | 177 | 178 | 175 | 176 |
ABT-806 V6 | 177 | 178 | 111 | 112 |
ABT-806 V7 | 149 | 150 | 173 | 174 |
ABT-806 V8 | 149 | 150 | 175 | 176 |
ABT-806 V9 | 149 | 150 | 111 | 112 |
域 | 胺基酸Seq ID | 核苷酸Seq ID |
西妥昔單抗VH | 201 | 202 |
西妥昔單抗VL | 203 | 204 |
尼妥珠單抗VH | 205 | 206 |
尼妥珠單抗VL | 207 | 208 |
ABT-806 VH | 209 | 210 |
ABT-806 VL | 211 | 212 |
(G4S)2連接子 | 213 | 214 |
(G4S)4連接子 | 215 | 216 |
(G4S)5連接子 | 217 | 218 |
(G4S)6連接子 | 219 | 220 |
人類IgG1 | 221 | 222 |
人類CK | 223 | 224 |
ABT-806 V1 VH | 225 | 226 |
ABT-806 V1 VL | 227 | 228 |
ABT-806 V2 VH | 229 | 230 |
ABT-806 V2 VL | 231 | 232 |
ABT-806 V3 VH | 233 | 234 |
ABT-806 V3 VL | 235 | 236 |
SI-95m5 (hCetux) VH | 237 | 238 |
SI-95m5 (hCetux) VL | 239 | 240 |
h西妥昔單抗N92F VL | 241 | 242 |
西妥昔單抗N92K VL | 243 | 244 |
h西妥昔單抗Y101A VH | 245 | 246 |
西妥昔單抗Y101W VH | 247 | 248 |
h西妥昔單抗Y102A VH | 249 | 250 |
西妥昔單抗D103F VH | 251 | 252 |
西妥昔單抗D103W VH | 253 | 254 |
h西妥昔單抗D103Y VH | 255 | 256 |
h西妥昔單抗Y104L VH | 257 | 258 |
西妥昔單抗Y101A VH | 259 | 260 |
西妥昔單抗Y102A VH | 261 | 262 |
西妥昔單抗Y102V VH | 263 | 264 |
西妥昔單抗D103Y VH | 265 | 266 |
西妥昔單抗Y104L VH | 267 | 268 |
西妥昔單抗N92F VL | 269 | 270 |
無
結合附圖,根據以下描述及所附申請專利範圍,本揭示案之前述及其他特徵將變得更徹底清楚。應理解,此等圖式僅描繪了根據本揭示案的若干個實施例,且因此不應被視為對本揭示案範疇之限制,本揭示案可藉由使用附圖來更明確且更詳細地描述,其中:
第1圖描繪了能夠標靶EGFR之兩個抗原決定基的雙抗原決定四價抗體之組態,其包含兩個抗EGFR Fab域及兩個抗EGFRvIII scFv域(A)或兩個抗EGFRvIII Fab域及兩個抗EGFR scFv域(B),其中scFv域可連接至抗體之重鏈或輕鏈之N末端或C末端,且結合域可衍生自西妥昔單抗(其可為人源化的及/或去成熟的)或尼妥珠單抗與ABT-806 (其可為人源化的)之組合;
第2圖描繪了西妥昔單抗(PDB 1YY9)、帕尼單抗(PDB 5SX4)及耐昔妥珠單抗(PDB 6B3S)與EGFR或EGFR之域III的複合物的結構比對,表明所有三種抗體均結合EGFR之域III內的重疊抗原決定基(EGFRwt);
第3圖展示了ABT806之野生型及人源化版本的質量分析結果,ABT806之野生型含有對應於完整mAb及重鏈二聚物污染物的兩個純化部分(3A);且ABT806之兩個人源化版本顯示出含有完整的感興趣mAb但缺乏重鏈二聚物污染物的單一純部分(3B);
第4圖展示了在NK效應細胞的存在下(E:T = 5:1),量測SI-95m4 (4A)及SI-95m5 (4B)對EGFRwt表現性U87MG-EGFRwt (GFP)細胞及EGFRwt/EGFRvIII表現性U87MG-EGFRvIII (NR)細胞之效力的ADCC檢定結果,其中靶細胞(T)是分離的或混合的。
第5圖展示了在NK效應細胞的存在下(E:T = 5:1),量測抗EGFRwt單株抗體(mAb)組(包括去成熟變異體SI-95m6、SI-95m7、SI-95m8、SI-95m9、SI-95m10以及抗EGFRvIII及抗EGFRwt抗體的對照)對EGFRwt表現性U87MG-EGFRwt(GFP)細胞(5A)或EGFRwt/EGFRvIII表現性U87MG-EGFRvIII (NR)細胞(5B)之效力的ADCC檢定結果,且列出了抗體之EC50值;
第6圖展示了在NK效應細胞的存在下(E:T = 5:1),量測標靶EGFRwt及EGFRvIII之雙抗原決定四價抗體(亦即,雙特異性物)組(包括SI-95X44及其去成熟衍生物,包括但不限於SI-95X52、SI-95X53、SI-95X54、SI-95X55及SI-95X56)對EGFRwt表現性U87MG-EGFRwt(GFP)細胞(6A)及EGFRwt/EGFRvIII表現性U87MG-EGFRvIII (NR)細胞(6B)之效力的ADCC檢定結果,且列出了抗體之EC50值;
第7圖描繪了在NK效應細胞的存在下(E:T = 5:1),去成熟西妥昔單抗突變VH-Y101A (7A)或VH-Y102A (7B)對標靶EGFRwt及EGFRvIII雙抗原決定四價抗體(又稱為雙特異性物) SI-95X44的影響,以及分別地與SI-95X65及SI-95X66相比,在SI-95X53及SI-95X54中具有人源化抗EGFRvIII抗體ABT-806骨架的影響,如藉由其對EGFRwt表現性U87MG-EGFRwt (GFP)細胞之效力所量測,這顯示出SI-95X53及SI-95X54都對EGFRwt表現性細胞具有更完全的殺傷作用及更好的EC50值(如所列);且
第8圖描繪了藉由將去成熟突變Y102A引入標靶EGFRwt及EGFRvIII二者之雙抗原決定四價抗體或簡稱(雙特異性物)之成熟西妥昔單抗結合域中而獲得的治療指數之潛在增加,此是藉由量測其對U87MG-EGFRwt表現性細胞及U87MG-EGFRwt/EGFRvIII表現性細胞(分離的或混合的群體)之ADCC活性,且顯示出具有成熟西妥昔單抗結合之SI-95X44介導重疊的殺傷曲線,ED50值類似,而具有Y102A突變之SI-95X54在模擬患者之神經膠母細胞瘤與正常組織的混合群體與分離群體中對EGFRwt表現性細胞之殺傷不同。
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Claims (36)
- 一種對EGFR之至少兩個抗原決定基具有結合親和力的雙抗原決定四價抗體,其包含, 一抗體骨架,其包含 具有一抗體輕鏈可變(VL)域之一抗體輕鏈, 具有一抗體重鏈可變(VH)域之一抗體重鏈, 其中該抗體VL域及該抗體VH域形成一Fab區,及 具有scFv輕鏈可變(VL)域及scFv重鏈可變(VH)域之一scFv域,其中該scFv域藉由域間連接子連接至該抗體輕鏈或該抗體重鏈之至少一端。
- 如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中EGFR之該兩個抗原決定基包含EGFR野生型(EGFRwt)抗原決定基及EGFRvIII抗原決定基,且其中該抗體對EGFRvIII抗原決定基之結合親和力強於對EGFRwt抗原決定基之結合親和力。
- 如請求項2所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體對該EGFRwt抗原決定基的結合親和力具有第一KD,且對EGFRvIII抗原決定基的結合親和力具有第二KD,其中該第一KD高於該第二KD,且其中該第一KD不小於1E-11 M,且該第二KD不大於1E-06 M。
- 如請求項2所述之雙抗原決定四價抗體,其中該EGFRwt抗原決定基包含對西妥昔單抗具有結合親和力之抗原決定基,或者其中該EGFRvIII抗原決定基包含對ABT-806具有結合親和力之抗原決定基。
- 如請求項2所述之雙抗原決定四價抗體, 其中該scFv域對該EGFRwt抗原決定基具有結合親和力且該Fab域對該EGFRvIII抗原決定基具有結合親和力,或者 其中該scFv域對該EGFRvIII抗原決定基具有結合親和力,且該Fab域對該EGFRwt抗原決定基具有結合親和力。
- 如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv域連接至該抗體輕鏈之C末端、該抗體輕鏈之N末端、該抗體重鏈之C末端、或該抗體重鏈之N末端。
- 如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、或人源化去成熟西妥昔單抗,且其中該scFv域包含衍生自ABT-806或人源化ABT-806之可變區的結合域。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含西妥昔單抗去成熟突變,該西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K或其組合。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體重鏈包含與SEQ ID NO.1、13、79、97、101、103、105、107、123、127、129、131或133具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.3、81、83、99、109、125或135具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含人源化西妥昔單抗,其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.237具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.239具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含去成熟西妥昔單抗,且其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.247、251、253、259、261、263、265或267具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.243或269具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含人源化去成熟西妥昔單抗,且其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.245、249、255或257具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.241具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv域包含ABT-806或人源化ABT-806之可變區。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv VH域包含與SEQ ID NO.209、225、229或233具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該scFv VL域包含與SEQ ID NO.211、227、231或235具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項7所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體VH域包含SEQ ID NO.201、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267之3個互補決定區(CDR); 其中該抗體VL域包含SEQ ID NO.203、239、241、243或269之3個CDR; 其中該scFv VH域包含SEQ ID NO.209之3個CDR;且 其中該scFv VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR。
- 如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含ABT0806或人源化ABT-806,且其中該scFv域包含衍生自西妥昔單抗、人源化西妥昔單抗、去成熟西妥昔單抗、人源化去成熟西妥昔單抗、或尼妥珠單抗之可變區的結合域。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體重鏈包含與SEQ ID NO.9、17、19、21、23、25、27、29、31、75、93、113、115、117、119、121、137、139、141、143、145、147或179具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.11、33、35、37、39、41、43、77、91、95或111具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含ABT-806,且其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.211具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含人源化ABT-806,且其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.225、229或233具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體骨架包含人源化ABT-806,且其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.227、231或235具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv VH域包含與SEQ ID NO.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該scFv VL域包含與SEQ ID NO.203、207、239、241、243或269具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv域包含衍生自該去成熟西妥昔單抗或該人源化去成熟西妥昔單抗之可變區的結合域,其中該去成熟西妥昔單抗或該人源化去成熟西妥昔單抗包含西妥昔單抗去成熟突變,該西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)包含:VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K或其組合。
- 如請求項16所述之雙抗原決定四價抗體, 其中該抗體VH域包含SEQ ID NO.209之3個互補決定區(CDR); 其中該抗體VL域包含SEQ ID NO.211之3個CDR; 其中該scFv VH域包含SEQ ID NO.201、205、237、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265或267之3個CDR;且 其中該scFv VL域包含SEQ ID NO.203、207、239、241、243或269之3個CDR。
- 如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體骨架包含尼妥珠單抗,且其中該scFv域包含衍生自ABT-806或人源化ABT-806之可變區的結合域。
- 如請求項23所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體重鏈包含與SEQ ID NO.5、15、45、47、49、51、53、55或85具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體輕鏈包含與SEQ ID NO.7、57、59、61、63、65、67、69、71或73具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項23所述之雙抗原決定四價抗體,其中該抗體VH域包含與SEQ ID NO.205具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該抗體VL域包含與SEQ ID NO.207具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項23所述之雙抗原決定四價抗體,其中該scFv VH域包含與SEQ ID NO.209具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該scFv VL域包含與SEQ ID NO.211具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 一種去成熟西妥昔單抗單株抗體,其包含具有一輕鏈可變(VL)域之一輕鏈及具有一重鏈可變(VH)域之一重鏈,其中該VL域及該VH域形成Fab區,且其中該單株抗體包含選自VH-Y101A、VH-Y101W、VH-Y102A、VH-D103F、VH-D103W、VH-D103Y、VH-Y104L、VL-N92F、VL-N92K及其組合的西妥昔單抗去成熟突變(按順序編號)。
- 一種人源化抗EGFRvIII單株抗體,其包含具有一輕鏈可變(VL)域之一輕鏈及具有一重鏈可變(VH)域之一重鏈,其中該VL域及該VH域形成Fab區,且其中該重鏈包含與SEQ ID NO.171、149或177具有至少99%序列一致性之胺基酸序列,或者其中該輕鏈包含與SEQ ID NO.111、173或175具有至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 一種分離的核酸序列,其編碼如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體。
- 一種產生雙抗原決定四價抗體之方法,其包含以下步驟:培養一宿主細胞使得產生該雙抗原決定抗體,其中該宿主細胞包含如請求項1所述之核酸。
- 一種免疫偶聯物,其包含如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體及細胞毒性劑,其中該細胞毒性劑包含一化療劑、一生長抑制劑、一毒素或一放射性同位素。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體及一醫藥學上可接受之載劑。
- 如請求項32所述之醫藥組合物,其進一步包含放射性同位素、放射性核素、一毒素、一治療劑、一化療劑或其組合。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項31所述之免疫偶聯物及一醫藥學上可接受之載劑。
- 一種治療患有一癌症之一受試者的方法,其包含以下步驟:向該受試者投與有效量的如請求項1所述之雙抗原決定四價抗體,其中該癌症包含表現EGFR、EGFRvIII或兩者之細胞。
- 如請求項35所述之方法,其進一步包含以下步驟:共同投與一有效量之一治療劑,其中該治療劑包含一抗體、一化療劑、一酶或其組合。
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