TWI874613B - 微型導引和導航控制(miniGNC)類抗體蛋白及其製造和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一種具有N末端及C末端之多特異性類抗體蛋白，該多特異性類抗體蛋白包括第一單體，該第一單體自該N末端至該C末端包括第一結合單體、CH1域、第一鉸鏈、第一CH2域及第一CH3域，其中該第一單體可包含視情況存在之連接於該N末端之第一結合域(D1)、連接於該C末端之第四結合域(D4)或兩者；第二單體，該第二單體自該N末端至該C末端包含第二結合單體、CL域、第二鉸鏈、第二CH2域及第二CH3域，其中該第二單體可包含視情況存在之連接於該N末端之第二結合域(D2)、連接於該C末端之第五結合域(D5)或兩者，其中該第一結合單體與第二結合單體經組態以形成二聚物，其中該第一單體及該第二單體經由CH1域及CL域之間的至少一個二硫鍵及該第一鉸鏈與該第二鉸鏈之間的至少一個二硫鍵共價配對，且其中該多特異性類抗體蛋白至少具有雙特異性。
Description
本申請案根據專利法主張2020年3月17日申請之美國臨時申請案第62/991,042號之申請日的權益，其全部揭露內容以引用之方式併入本文中。
本申請案大體上係關於用於癌症免疫療法之多特異性抗體的技術領域，且更特定言之關於製備及使用對免疫細胞及腫瘤細胞兩者之表面分子具有多重結合活性的微型導引和導航控制(MINIATURE GUIDANCE AND NAVIGATION CONTROL；miniGNC)抗體。
治療性抗體已成為治療數種疾病，包括但不限於癌症、感染及自體免疫之主要方法。儘管單株單特異性抗體提供治療疾病之直接機制，例如經由抑制或活化特定訊號傳導途徑，但多特異性抗體允許探索更複雜之治療機制。藉由靶向多種不同抗原或單一抗原內之多個抗原決定基，可引發生物反應諸如細胞共定位及活化，從而使得可例如將T細胞及其他免疫細胞再定向至表現特定抗原之腫瘤細胞之位點。以此方式，雙特異性及多特異性抗體已成為免疫腫瘤學領域之重要平台。
由於多特異性抗體平台之優點，已開發多種此類框架。一種此類平台稱為導引和導航控制(Guidance and Navigation Control；GNC)。GNC蛋白包括將多個功能獨立之結合部分連接成單一實體，從而能夠將效應細胞與標靶細胞連接在一起之蛋白質(參見申請者之申請案WO/2019/005641、WO2019191120及PCT/US20/59230，將該等案之全文併入本文中)。一般而言，此等平台限於至少兩種特異性，從而阻止了需要結合超過兩種抗原之複雜治療機制的探索。對於具有兩種以上特異性之抗體平台，結合域之數量增加通常需要形成大分子，其通常具有不適宜之物理及生物特性。分子量之增加可降低可開發性，因為愈大且愈複雜之分子更可能在聚集及溶解度方面存在問題。此外，與較小尺寸之蛋白質相比，大分子滲透至實體腫瘤中之能力可受阻。因此，需要不顯著大於單株IgG抗體之具有超過兩種特異性之多特異性抗體平台。
以下發明內容僅為說明性的，且不欲以任何方式限制本發明。除上述說明性態樣、實施例及特徵外，其他態樣、實施例及特徵將藉由參考圖式及以下詳細描述變得顯而易見。
本申請案提供具有結合特異性之蛋白質，諸如多特異性蛋白質，如抗體，包括多特異性抗體，及此等結合蛋白質之片段，包括但不限於scFv域、Fab區、Fc域、VH、VL、輕鏈、重鏈、可變區及互補決定區(complementary determining region；CDR)。本申請案進一步提供製備及使用本文揭露之類抗體蛋白之方法。
在一個態樣中，本申請案提供多特異性類抗體蛋白。在一個實施例中，具有N末端及C末端之多特異性類抗體蛋白包括第一單體，該第一單體自N末端至C末端包括第一結合單體、CH1域、第一鉸鏈、第一CH2域及第一CH3域，其中第一單體可包含視情況存在之連接於N末端之第一結合域(D1)、連接於C末端之第四結合域(D4)或兩者；第二單體，該第二單體自N末端至C末端包含第二結合單體、CL域、第二鉸鏈、第二CH2域及第二CH3域，其中第二單體可包含視情況存在之連接於N末端之第二結合域(D2)、連接於C末端之第五結合域(D5)或兩者，其中第一結合單體與第二結合單體經組態以形成二聚物，其中第一單體及第二單體經由CH1域及CL域之間的至少一個二硫鍵及第一鉸鏈與第二鉸鏈之間的至少一個二硫鍵共價配對，且其中該多特異性類抗體蛋白至少具有雙特異性。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可具有三特異性、四特異性或五特異性。在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可為單株抗體。在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可為經純化單株抗體。在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可為人源化抗體。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可在第一CH3域與第二CH3域之間進一步包含二硫鍵。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可在第一鉸鏈與第二鉸鏈之間進一步包含第二二硫鍵。
在一個實施例中，在各種域之間使用連接連接子。在一個實施例中，連接連接子可包含(Gx
Sy
)n
連接子，其中n、x，及y各自獨立地為1至10之整數。在一個實施例中，D1、D2、D4或D5經由連接子連接於N或C末端。在一個實施例中，連接子可包含(Gx
Sy
)n
連接子。n、x及y可各自獨立地為1至10之整數。在一個實施例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。在一個實施例中，x為1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。在一個實施例中，y為1、2、3、4、5、6、7、8、9及10。
在一個實施例中，第一CH3域經組態以形成臼結構，其中第二CH3域經組態以形成杵結構，且其中第一CH2及CH3域與第二CH2及CH3域經組態以異二聚形成互補Fc域。
在一個實施例中，第一CH3域可在T366S、L368A或Y407V處包含至少一種「臼」突變，且第二CH3域可在T366W處包含「杵」突變。
在一個實施例中，Fc域可在H435R/Y436F處包含突變。
在一個實施例中，Fc域經工程改造以消除選自ADCC、ADCP或CDC之效應細胞功能。
在一個實施例中，Fc域在L234A、L235A、G237A或K322A (EU編號)處包含至少一種突變。在一個實施例中，Fc區在L234A/L235A/G237A/K322A處包含突變。在一個實施例中，Fc區在L234A/L235A/K322A (Eu編號)處包含突變。在一個實施例中，Fc域包含無效突變。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含突變S228P (EU編號)。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含突變S228P/F234A/L234A (EU編號)。
在一個實施例中，重鏈恆定序列可衍生自IgG1或IgG4。
在一個實施例中，Fc域可包括與SEQ ID NO.313或314具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，第一結合單體可包含VH域，第二結合單體可包含VL域，且VH、CH1、VL、CL域形成Fab區作為第三結合域(D3)。在一個實施例中，Fab區可在VH-44C與VL 100C之間包括二硫鍵。
在一個實施例中，第一結合單體及第二結合單體形成NKG2D受體作為第三結合域(D3)。
在一個實施例中，D1、D2、D4及D5獨立地為scFv域、VHH域、受體或配位體。
在一個實施例中，scFv域可具有VH域連接於VL域。在一個實施例中，scFv域可具有VH-VL取向。在一個實施例中，scFv域具有VL-VH取向。
在一個實施例中，scFv域可在VL與VH之間包含二硫鍵。在一個實施例中，二硫鍵在scFv域之VL100與VH44之間。在一個實施例中，scFv域可在VH中包含突變R19S。
在一個實施例中，VHH域可在VH或VHH中包含突變R19S。
在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之至少一者、兩者或三者可為scFv。在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之全部均可為scFv。
在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之至少一者、兩者或三者可為VHH域。在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之全部均可為VHH域。
在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之至少一者、兩者或三者可為受體。在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之全部均可為受體。
在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之至少一者、兩者或三者可為配位體。在一個實施例中，D1、D2、D4及D5中之全部均可為配位體。
在一個實施例中，D1、D2、D3、D4及D5可各自獨立地對以下具有結合特異性：T細胞活化受體、免疫細胞結合受體、免疫檢查點分子、免疫檢查點分子、共刺激因子、白血球之受體、腫瘤抗原、腫瘤相關抗原(tumor associated antigen；TAA)、組織細胞之受體、癌細胞之受體或其組合。
在一個實施例中，T細胞活化受體之結合域與腫瘤相關抗原(tumor associated antigen；TAA)之結合域相鄰。
在一個實施例中，T細胞活化受體可包含CD3。
在一個實施例中，免疫檢查點受體可包含PD-L1、PD-1、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、BTLA、VISTA、PD-L2、CD160、LOX-1、siglec-15、CD47、HVEM、SIRPα、CSF1R、CD73、Siglec-15、CD47或其組合。
在一個實施例中，共刺激受體可包含4-1BB、CD28、OX40、GITR、CD40L、CD40、ICOS、LIGHT、CD27、CD30或其組合。
在一個實施例中，腫瘤相關抗原可包含EGFR、HER2、HER3、EGRFVIII、CD19、BCMA、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、ROR1、CEA、LMP1、LMP2A、間皮素、PSMA、EpCAM、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D配位體、CD39、CLDN18.2、DLL3、HLA-G、FcRH5、GPRC5D、LIV-1、MUC1、CD138、CD70、uPAR、CD38或其組合。
在一個實施例中，D1、D2、D3、D4及D5可各自獨立地對選自以下之抗原具有結合特異性：EGFR、HER2、HER3、EGFRvIII、ROR1、CD3、CD28、CEA、LMP1、LMP2A、間皮素、PSMA、EpCAM、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D、NKG2D配位體、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、PD-L1、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40、CD40L、VISTA、ICOS、BTLA、LIGHT、HVEM、CSF1R、CD73、CD39、CLDN18.2、DLL3、HLA-G、FcRH5、GPRC5D、LIV-1、MUC1、CD138、CD70、CD16、uPAR、Siglec-15、CD47、CD38、NKp46、PD-L2、CD160、LOX-1、SIRPα及CD27，且Fc域可包含人類IgG Fc域。
在一個實施例中，D1可對CD3、CD20、CEA、HER2、EGFR或NKG2D配位體具有結合特異性。在一個實施例中，D2可對HER3、EGFR、CD3或CD19具有結合特異性。在一個實施例中，D3可對HER3、EGFR、CD3或NKG2D配位體具有結合特異性。在一個實施例中，D4可對4-1BB或EGFR具有結合特異性。在一個實施例中，D5可對PD-L1或HER3具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對CD3具有結合特異性，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對EGFR具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D2可對CD3具有結合特異性，D3可對HER3具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對CD3或EGFR具有結合特異性，D2可對CD19具有結合特異性，D3可對CD3或EGFR具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1及D4各自可對EGFR具有結合特異性，D2及D5各自可對HER3具有結合特異性，且D3可對CD3具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對CD20具有結合特異性，D2可對CD19具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對NKG2D配位體具有結合特異性，D2可對CD19具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性，且D5可對PD-L1具有結合特異性。
在一個實施例中，D1可對CD3具有結合特異性，且D3可包含NKG2D受體。在一個實施例中，蛋白可進一步包含對CD19具有結合特異性之D2。在一個實施例中，蛋白質可進一步包含對PD-L1具有結合特異性之D5。在一個實施例中，蛋白可進一步包含對4-1BB具有結合特異性之D4。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白具有雙特異性。在一個實施例中，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性。在一個實施例中，D1可對HER2具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性。在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性。在一個實施例中，D3可對CD3具有結合特異性，D5可對HER3具有結合特異性。在一個實施例中，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對EGFR具有結合特異性。
在一個實施例中，雙特異性類抗體蛋白可包括與SEQ ID NO.1及3；5及7；9及11；13及15；53及55；57及59；113及115；117及119；121及123；125及127；157及159；297及299；或199及201具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白具有雙特異性。在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性。在一個實施例中，D1可對CEA具有結合特異性，D2可對EGFR具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性。在一個實施例中，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對EGFR具有結合特異性，D5可對HER3具有結合特異性。在一個實施例中，抗體為對EGFR、HER3及CD3具有結合特異性之三特異性抗體。在一個實施例中，三特異性類抗體蛋白可包括與SEQ ID NO.41及43；45及47；49及51；101及103；105及107；109及111；195及197；137及139；或161及163具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白具有四特異性。在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性，D4可對4-1BB具有結合特異性。在一個實施例中，D1可對EGFR具有結合特異性，D2可對HER3具有結合特異性，D3可對CD3具有結合特異性，D5可對PD-L1具有結合特異性。抗體為對EGFR、HER3、CD3及4-1BB具有結合特異性之四特異性抗體。抗體為對EGFR、HER3、CD3及PD-L1具有結合特異性之四特異性抗體。在一個實施例中，四特異性類抗體蛋白可包括與SEQ ID NO.33及35；37及39；141及143；145及147；或165及167具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，抗體具有五特異性。在一個實施例中，類抗體蛋白可對EGFR、HER3、CD3、4-1BB及PD-L1具有結合特異性。在一個實施例中，雙特異性類抗體蛋白可包括與SEQ ID NO.17及19；21及23；25及27；29及31；69及71；73及75；77及79；81及83；85及87；89及91；93及95；97及99；129及131；133及135；149及151；169及171；173及175；或177及179具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致性之胺基酸序列。
在第二態樣中，本申請案提供互補決定區(complimentary determining region；CDR)之新穎序列。在一個實施例中，本申請案提供本文所揭露之蛋白質、類抗體蛋白或包含CDR之抗體。
在一個實施例中，CDR可對CEA具有親和力。在一個實施例中，CDR可對CEA具有平衡解離常數(KD)，其中KD不超過0.1 nM、2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM或50 nM。在一個實施例中，CDR可包括與SEQ ID NO.301、302、303、304、305或306具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，本申請案提供對CEA具有親和力之蛋白質。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR H1，該CDR H1具有與SEQ ID NO.301具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR H2，該CDR H2具有與SEQ ID NO.302具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR H3，該CDR H3具有與SEQ ID NO.303具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR L1，該CDR H1具有與SEQ ID NO.314具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR L2，該CDR H2具有與SEQ ID NO.305具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可具有CDR L3，該CDR H3具有與SEQ ID NO.306具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可包括與選自SEQ ID NO.279、280、281或282之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，蛋白質可包括與選自SEQ ID NO.279、280、281或282之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，本申請案提供具有可變區之多特異性類抗體蛋白，其中該可變區可包含選自SEQ ID NO.301、302、303、304、305或306之胺基酸序列。
在一個實施例中，CDR可對CD3具有親和力。在一個實施例中，CDR可對CD3具有平衡解離常數(KD)，其中KD不超過10 nM、20 nM、30 nM或50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM或500 nM。在一個實施例中，CDR可包括與SEQ ID NO.307、308、309、310、311或312具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR H1，該CDR H1具有與SEQ ID NO.307具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR H2，該CDR H2具有與SEQ ID NO.308具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR H3，該CDR H3具有與SEQ ID NO.309具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR L1，該CDR H1具有與SEQ ID NO.310具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR L2，該CDR H2具有與SEQ ID NO.311具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，對CD3具有親和力之蛋白質包括CDR L3，該CDR H3具有與SEQ ID NO.312具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，蛋白質可包含與選自SEQ ID NO.227-230、231-234、235-238、239-242及291-294之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可包含與選自SEQ ID NO.227-230、231-234、235-238、239-242及291-294之胺基酸序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實施例中，多特異性類抗體蛋白可具有可變區，其中該可變區可包含選自SEQ ID 307、308、309、310、311或312之胺基酸序列。
在另一態樣中，本申請案提供經分離核酸序列，該等核酸序列編碼本文所揭露之多特異性類抗體蛋白、片段、域、區。
在另一態樣中，本申請案提供包括本文所揭露之經分離核酸序列的表現載體。
在另一態樣中，本申請案提供包括本文所揭露之經分離核酸序列的宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞包括本文所揭露之表現載體。在一個實施例中，宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
在另一態樣，本申請案提供用於產生本文所揭露之多特異性抗體的方法。在一個實施例中，方法包括如下步驟：培養宿主細胞，以使編碼多特異性類抗體蛋白之DNA序列表現，及純化該多特異性抗體。在一個實施例中，方法包括如下步驟：在產生該等多特異性類抗體蛋白之條件下培養宿主細胞，及回收該類抗體蛋白。
在另一態樣中，本申請案提供免疫結合物。在一個實施例中，免疫結合物可包括與細胞毒性劑、成像劑或兩者連接之多特異性類抗體蛋白。
在另一態樣中，本申請案提供醫藥組成物。在一個實施例中，醫藥組成物可包括多特異性類抗體蛋白及醫藥學上可接受之載劑。在一個實施例中，醫藥組成物可進一步包括放射性同位素、放射性核素、毒素、治療劑、化學治療劑或其組合。在一個實施例中，醫藥組成物可包括如其中所揭露之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本申請案提供用於治療或預防個體之癌症、自體免疫疾病或感染性疾病之方法。在一個實施例中，方法可包括如下步驟：向個體投與包括經純化多特異性類抗體蛋白、免疫結合物之醫藥組成物或本文所揭露之醫藥組成物。在一個實施例中，方法還可包括共同投與有效量之治療劑。在一個實施例中，治療劑可包含抗體、化療劑、酶或其組合。
在一個實施例中，個體為人類。在一個實施例中，個體為哺乳動物。在一個實施例中，個體為黑猩猩。在一個實施例中，個體為寵物動物。
在另一態樣中，本申請案提供如下溶液，該溶液包括有效濃度之本文所揭露之多特異性類抗體蛋白、免疫結合物或醫藥組成物。在一個實施例中，溶液為個體之血漿。
在以下詳細描述中，參考隨附圖式，該等隨附圖式形成本文之一部分。在圖式中，除非上下文另外規定，否則類似符號典型地鑒別類似組件。詳細描述、圖式及申請專利範圍中描述之說明性實施例並不意欲限制。可使用其他實施例，且可在不背離本文所呈現之技術主題之精神或範圍的情況下進行其他改變。將容易地理解，如本文通常描述且在圖式中說明之本揭露態樣可以多種不同構型排列、替代、組合、分離及設計，其全部均明確涵蓋於本文中。
本揭露尤其提供經分離抗體，製備此類抗體之方法，由此類抗體或抗原結合片段構成之雙特異性或多特異性分子、抗體-藥物結合物及/或免疫結合物，含有該等抗體、雙特異性或多特異性分子、抗體-藥物結合物及/或免疫結合物之醫藥組成物，用於製備該等分子及組成物之方法，以及用於使用本文揭露之分子及組成物治療癌症之方法。
本申請案揭露微型構型之多特異性導引和導航控制(Guidance and Navigation Control；GNC)抗體(miniGNC)。如第 1 圖
中所示，miniGNC平台分子為兩條多肽鏈之經組裝異二聚物，其特徵在於形成具有一個、兩個、三個或四個額外結合域(D1至D5)之Fab-鉸鏈-Fc區核心結構。可組態兩種多肽，對於鏈A (或鏈1)：N-D1-D3(VH)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-D4-C；且對於鏈B(或鏈2)：N-D2-D3(VL)-CL-鉸鏈-CH2-CH3-D5-C。兩條鏈之Fc域經工程改造以含有互補突變，亦稱為「杵臼結構」，以增強異二聚物之形成。miniGNC平台分子可具有可變組分。舉例而言，Fab區之VH和VL可由具有或不具有結合特異性之非Fab二聚物置換。額外結合域可為抗體片段，諸如scFv或VHH，或非抗體結構，諸如配位體或受體。miniGNC平台抗體可為二價、三價、四價或五價，其具有最多五種不同特異性，且保留大致為正常二價IgG抗體之尺寸(tri-miniGNC Ab為150 kD)或略大(tetra-miniGNC Ab為175 kD，且penta-miniGNC Ab為200 kD)。
本申請案係關於製備及使用miniGNC抗體，尤其五特異性miniGNC抗體(penta-specific miniGNC antibody；penta-miniGNC Ab)之方法。一般而言，GNC蛋白，諸如GNC抗體之特徵在於包含用於接合免疫細胞，諸如活化T細胞，同時靶向腫瘤細胞之兩個部分。類似於GNC抗體，miniGNC抗體保留用於接合免疫細胞之多個抗原結合域，諸如用於T細胞活化之抗CD3、用於共刺激之抗4-1BB及用於抑制免疫檢查點之抗PD-L1。為改良抗體療法用於治療癌症之療效，miniGNC抗體經設計以在結構上穩定且緊湊，同時保留GNC抗體中兩個部分之特徵性特點。此改良允許對相同或不同腫瘤細胞上之第二腫瘤相關抗原具有額外結合特異性。與GNC抗體相比，miniGNC抗體含有Fc域，該Fc域允許FcRn介導之再循環及半衰期延長，以及基於蛋白A之迅速純化。需要時，可併入Fc受體介導之免疫。含FC之miniGNC抗體極其緊湊，從而可更好地開發且增加腫瘤滲透。GNC抗體通常大於IgG抗體，因為抗原結合域(antigen binding domain；AgBD)數量增加，此提供用於結合於T細胞及腫瘤細胞兩者之空間靈活性。另一方面，與人類IgG之150 KD相比，miniGNC抗體保留與人類IgG抗體大致相同之尺寸，對於雙特異性，經計算為約110-130 kD；對於三特異性，為120-160；對於四特異性，為 130-190 kD；對於五特異性，為 140-220 kD。將一個或兩個scFv併入各鏈上可減少鏈配對混雜，且改良在腫瘤微環境中導航之穩定性。由於此等特徵性特點，GNC及miniGNC抗體可為用於治療相同癌症之有效抗體療法之替代方案，因為用於靶向包括但不限於以下之腫瘤相關抗原的部分保持不變：EGFR、HER2、HER3、EGRFVIII、CD19、BCMA、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、ROR1、CEA、LMP1、LMP2A、間皮素、PSMA、EpCAM、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D配位體、CD39、CLDN18.2、DLL3、HLA-G、FcRH5、GPRC5D、LIV-1、MUC1、CD138、CD70、uPAR、CD38。
術語「抗體」以最廣泛意義使用，且特別涵蓋單一單株抗體(包括促效劑及拮抗劑抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組成物以及抗體片段(例如，Fab、F(ab')2
及Fv)，只要其展現所要生物活性即可。在一些實施例中，抗體可為單株、多株、嵌合、單鏈、雙特異性或雙效人類及人源化抗體以及其活性片段。結合已知抗原之分子的活性片段之實例包括Fab、F(ab')2
、scFv及Fv片段，包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產品及上述任何抗體及片段之抗原決定基結合片段。在一些實施例中，抗體可包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有免疫特異性結合抗原之結合位點的分子。免疫球蛋白可為免疫球蛋白分子之任何類型(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)或類別(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。在一個實施例中，抗體可為完整抗體及衍生自完整抗體之任何抗原結合片段。典型抗體指異四聚物蛋白，其典型地包含兩條重(heavy；H)鏈及兩條輕(light；L)鏈。各重鏈包含重鏈可變域(heavy chain variable domain；縮寫為VH)及重鏈恆定域。各輕鏈包含輕鏈可變域(light chain variable domain；縮寫為VL)及輕鏈恆定域。VH及VL區可進一步細分為具有高變互補決定區(complementarity determining region；CDR)及稱為框架區(framework region；FR)之更保守區域的域。各可變域(VH或VL)典型地包含自胺基末端至羧基末端以如下次序排列之三個CDR及四個FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在輕鏈及重鏈之可變區內存在與抗原相互作用之結合區。
如本文所用之術語「單株抗體」指獲自大體上均勻抗體之群體的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然發生突變以外為一致的。單株抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。此外，與典型地包括針對不同決定基(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定基。除特異性以外，單株抗體之有利之處還在於其由融合瘤培養物合成，故未由其他免疫球蛋白污染。修飾詞「單株」指示抗體之特徵為獲自大體上均勻抗體群體，且不應視為要求藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本揭露使用之單株抗體可藉由Kohler及Milstein,Nature,
256:495 (1975)首次描述之融合瘤方法製備，或可藉由重組DNA方法製備(參見例如，美國專利第4,816,567號)。
單株抗體可包括如下「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或者屬於特定抗體類別或亞類之抗體中之相應序列一致或同源，而其餘鏈與衍生自另一物種或者屬於另一抗體類別或亞類之抗體中之相應序列一致或同源，或者屬於另一種抗體類或亞類，以及此類抗體之片段，只要其展現所要生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6851-6855 [1984])。
單株抗體可使用包括小鼠融合瘤或噬菌體呈現之各種方法產生(關於評述，參見Siegel. Transfus. Clin. Biol. 9:15-22 (2002))或由直接來自原發性B細胞之抗體的分子選殖產生(參見Tiller. New Biotechnol. 28:453-7 (2011))。在本揭露中，藉由使兔、小鼠或美洲駝免疫之方法與隨後如融合瘤或呈現之策略組合產生抗體。已知兔產生具有高親和力、多樣性及特異性之抗體(Weber等人, Exp. Mol. Med. 49:e305)。除免疫兔繼而B細胞培養以外，用於抗體產生及發現之其他常見策略包括免疫其他動物(例如小鼠、美洲駝)，繼而產生融合瘤及/或呈現於噬菌體、酵母或哺乳動物細胞上；或者使用合成可變基因文庫進行呈現。此抗體發現之通用方法類似於Seeber等人, PLOS One. 9:e86184 (2014)中所述之方法。
術語「抗原或抗原決定基結合部分或片段」指抗體中能夠結合抗原之片段。此等片段可具有完整抗體之抗原結合功能及其他功能。結合片段之實例包括但不限於：單鏈Fv片段(single-chain Fv fragment；scFv)，其由用合成連接子連接於單一多肽鏈中之抗體單臂之VL及VH域組成；Fab片段，其為由VL、恆定輕鏈(constant light；CL)、VH及恆定重鏈1 (constant heavy 1；CH1)域組成之單價片段。抗體片段可為甚至更小之亞片段，且可由小至單一CDR域，尤其來自VL及/或VH域之CDR3區的域組成(例如參見，Beiboer等人, J. Mol. Biol. 296:833-49 (2000)).抗體片段使用熟習此項技術者已知之習知方法產生。可使用用於完整抗體之相同技術篩選抗體片段之效用。
「抗原或抗原決定基結合片段」可藉由多種此項技術中已知技術衍生自本揭露之抗體。舉例而言，經純化單株抗體可用酶諸如胃蛋白酶裂解，且進行HPLC凝膠過濾。隨後可收集含Fab片段之適當級分，且藉由膜過濾及其類似方法濃縮。為進一步描述用於分離抗體之活性片段的通用技術，參見例如Khaw, B. A.等人, J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)；Rousseaux等人, Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個一致抗原結合片段，稱為「Fab」片段，該等片段各自具有單一抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映其易於結晶之能力。胃蛋白酶處理產生F(ab')2
片段，其具有兩個抗原組合位點，且仍能夠交聯抗原。
Fab片段可含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(first constant domain；CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1域之羧基末端添加一些殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH在本文中指如下Fab'，其中恆定域之半胱胺酸殘基帶有游離氫硫基。F(ab')2
抗體片段最初以Fab'片段對之形式產生，該等片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。亦已知抗體片段之其他化學偶聯形式。
「Fv」為含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此區域由一個重鏈及一個輕鏈可變域緊密非共價結合之二聚物組成。在此構型中，各可變域之三個CDR相互作用以在VH-VL二聚物之表面上界定抗原結合位點。六個CDR一起賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或Fv之一半，其僅包含三個特異於抗原之CDR)亦具有識別且結合抗原之能力，但親和力低於完整結合位點。
來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列分為兩種明顯不同類型（稱為κ及λ）中之一者。
視重鏈恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可分為不同類別。存在五大免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中數種可進一步分為亞類(同型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3及IgG-4；IgA-1及IgA-2。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同免疫球蛋白類別之亞單位結構及三維構型為吾人所熟知。
「人源化抗體」指如下經工程改造抗體之類型，其CDR衍生自非人類供體免疫球蛋白，該分子之剩餘免疫球蛋白衍生部分衍生自一種(或多種)人類免疫球蛋白。此外，可改變框架支持殘基以保留結合親和力。獲得「人源化抗體」之方法為熟習此項技術者所熟知。(參見例如，Queen等人, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgson等人, Bio/Technology, 9:421 (1991))。
如本文所用，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換，且定義為指包含由肽鍵連接之胺基酸的生物分子。
除非上下文不合適，否則如本文所用之術語「一」及「該」定義為指「一或多」，且包括複數。
「分離」指生物分子不含至少一些其天然存在所具有之組分。「分離」當用於描述本文揭露之各種多肽時，指多肽已鑒別且分離及/或自其所表現之細胞或細胞培養物回收。通常，經分離多肽藉由至少一種純化步驟製備。「經分離抗體」指大體上不含具有不同抗原結合特異性之其他抗體的抗體。
「重組」指使用重組核酸技術在外源宿主細胞中產生抗體。
術語「抗原」指可在生物體，尤其動物，更尤其包括人類之哺乳動物中誘導免疫反應之實體或其片段。該術語包括負責抗原性或抗原決定基之免疫原及其區域。
此外，如本文所用，術語「免疫原性」指物質引發或增強針對免疫原劑之抗體、T細胞或其他反應性免疫細胞之產生，且有助於人類或動物之免疫反應。當個體針對所投與之本揭露免疫原性組成物產生足以緩和或減輕待治療病症之抗體、T細胞及其他反應性免疫細胞時，發生免疫反應。
「特異性結合」特定抗原或抗原決定基或與特定抗原或抗原決定基「特異性結合」或「特異於」特定抗原或抗原決定基指與非特異性相互作用可量測得不同的結合。特異性結合可例如藉由相較於對照分子之結合確定分子之結合來量測，該對照分子通常為不具有結合活性之類似結構分子。例如，可藉由與類似於標靶之對照分子競爭來確定特異性結合。
術語「親和力」指兩種多肽之間的吸引力之量度，諸如抗體/抗原、受體/配位體等。兩種多肽之間的內在吸引力可表示為特定相互作用之結合親和力平衡解離常數(KD)。KD結合親和力常數可例如藉由生物層干涉術來量測，其中KD為kdis (解離速率常數)與kon (締合速率常數)之比率，如KD = kdis/kon。
對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可例如由如下抗體展現，該抗體對抗原或抗原決定基之KD為至少約10-4 M、至少約10-5 M、至少約10-6 M、至少約10-7 M、至少約10-8 M、至少約10-9 M，替代地至少約10-10 M、至少約10-11 M、至少約10-12 M或更大，其中KD指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。典型地，特異性結合抗原之抗體對抗原或抗原決定基之KD為對照分子之20、50、100、500、1000、5,000、10,000倍或更高。
此外，對特定抗原或抗原決定基之特異性結合可例如由如下抗體展現，該抗體對抗原或抗原決定基之KA或Ka為對照對抗原決定基之至少20、50、100、500、1,000、5,000、10,000倍或更高，其中KA或Ka指特定抗體-抗原相互作用之締合速率。
兩個序列之間的「同源性」由序列一致性決定。若欲彼此進行比較之兩個序列的長度不同，則序列一致性較佳與較短序列中與較長序列之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基的百分比有關。通常可藉由使用計算機程序來確定序列一致性。可例如藉由添加、刪除、取代、插入或重組引起在給定序列與本揭露上述序列之間的比較中出現之偏差。
本揭露可藉由參考以下對於本文中包括之特定實施例及實例之詳細描述而更容易地理解。儘管本揭露已參考其某些實施例之特定細節描述，但不旨在將此類細節視為對本揭露範圍之限制。
實例實例 1 ：
五特異性miniGNC抗體之構型
miniGNC抗體之設計依賴於鏈A及鏈B之間的異二聚物之兩條多肽鏈的共表現及組裝(第 1 圖
)。鏈A可為天然重鏈(heavy chain；HC)，而鏈B為輕鏈與HC之Fc域之間的重組融合肽。在此抗體結構之核心，存在Fab區(VH-CH1/VL-CL)，後接人類IgG1之鉸鏈及Fc區(CH2-CH3/CH 2)。可將「杵臼」突變或其他互補突變組引入CH3域中以使同二聚物去穩定且促進異二聚物形成(Ridgway JB, Presta LG, Carter P., Protein Eng 1996;9:617-21)。鏈A之CH3域中之「臼」突變由T366S、L368A及Y470V組成，而鏈B之CH3域中之「杵」突變為T366W。鏈B上由T366W突變產生之「杵」優先與鏈A上三個突變產生之「臼」相互作用。此優先配對可進一步穩定異二聚物，同時Fab域組分之非共價配對（亦即，鏈A上之VH-CH1與鏈B上之VL-Ck之間）產生功能性Fab區。換言之，功能性D3結合域，諸如功能性Fab區或非Fab受體二聚物僅可在鏈A-鏈B異二聚物中產生。儘管與GNC抗體相比，miniGNC抗體亦含有來自天然IgG之抗體片段 (Fab、Fc)及其他基於可變序列之結構，諸如scFv及VHH，但其經工程改造以在形成異二聚物後優先組態Fab區-鉸鏈-Fc區結構。miniGNC抗體之特徵性特點為此經工程改造結構之緊湊性。
可將一或多個結構多樣化之抗原結合域添加至miniGNC分子之兩個N末端及兩個C末端作為D1、D2、D4或D5，從而產生高達五種結合特異性。此等添加之結合域中之每一者可為基於可變序列之結構，諸如scFv及VHH，或基於非可變序列之結構，諸如配位體及受體。如第 1 圖
中所示，D1及D2指分別連接於鏈A及鏈B之N末端的結合域，而D4及D5指分別連接於鏈A及鏈B之C末端的結合域。因此，五特異性miniGNC (penta-specific miniGNC；penta-miniGNC)抗體之兩種多肽可組態為
鏈A：N-D1-D3(VH)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-D4-C；及
鏈B：N-D2-D3(VL)-CL-鉸鏈-CH2-CH3-D5-C；
其中如第 1 圖
中所示，VL可為Vλ或Vκ且CL可為Cλ或Cκ。
視結合域之數量及其結合特異性而定，可藉由減少一或多個結合域且變為tetra-、tri-及bi-miniGNC來簡化第 1 圖
中penta-miniGNC抗體之結構構型。舉例而言，表 1
描繪抗CD3 miniGNC抗體家族之產生及表徵以用於最佳化其靶向EGFR及HER3之功效。在此情況下，各結合域具有一種結合特異性。當其五個結合域中之兩者靶向抗原之相同抗原決定基，亦即具有相同結合特異性時，penta-miniGNC抗體成為四特異性penta-miniGNC抗體。實例 2 ：
miniGNC抗體之經工程改造核心結構
為展現miniGNC之構型可轉譯成穩定且具功能性之異二聚蛋白，設計一種簡化不對稱格式以評價構型及突變對miniGNC分子之異二聚物形成的影響。簡言之，使單一scFv (D1)融合於鏈A之N末端，而鏈B不具有任何添加之結合域。以此方式，可藉由SDS-PAGE及SEC區分鏈A與鏈B之間的每種二聚物質之比例，因為鏈A同二聚物(未觀察到)、鏈B同二聚物及鏈A與鏈B異二聚物之預測尺寸分別為100 kDa、150 kDa及125 kDa (第 2 圖
)。
為設計自混合物選擇性純化異二聚miniGNC分子之策略，將鏈B之CH3域中的兩個胺基酸殘基(H435和Y436)進行取代。詳言之，組胺酸(H435)對於鏈B在治療性抗體純化期間結合蛋白A樹脂至關重要(Tustian等人, 2016)，且取代此胺基酸或ProA敲除突變(ProA knockout mutation；ProAKO)終止蛋白A結合。此策略可允許經由自蛋白A管柱選擇性溶離來分離異二聚物。蛋白A管柱經由異二聚物之母重鏈結合位點保留該異二聚物，而鏈B同二聚物因為鏈B缺乏蛋白A結合而流過。鏈B上ProAKO之設計使得因用獲自IgG3亞類中同源區域之殘基進行蛋白A結合位點之胺基酸取代而改變免疫原性的任何可能問題減至最小。儘管大多數miniGNC分子主要併入IgG1亞型之結構及序列，但IgG3與其他IgG亞類之結構總體上類似，其在結合蛋白A、蛋白G及FcRn (新生兒Fc受體)方面具有一些特異性結構擾動。如先前所顯示，此差異基於Fc序列差異，其中IgG3中R435 (在其他亞型中為H435)之存在消除其與蛋白A之Fc相互作用。因此，在代表性miniGNC分子中，miniGNC鏈B上對蛋白A結合關鍵之胺基酸(H435及F436)突變為IgG3對應序列(R435及Y436)。
在添加有scFv與鏈B之N末端融合之多特異性miniGNC抗體的類別中，若scFv來自VH3家族，則仍可具有與蛋白A結合之相互作用。已知VH3編碼之抗體與葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白A (Staphylococcal Protein A；SPA)相互作用，且已鑑別FR1、CDR2及FR3中之殘基參與SPA結合(Roben等人, 1995)中，且結構資料指示用來自非結合免疫球蛋白之相應區域置換單一所涉及區域消除由VH3編碼之抗體與蛋白A之結合。FR1中胺基酸R19之取代經鑑別在結合蛋白A中至關重要，且用來自VH4家族中等效區域之胺基酸序列(S19)進行。
用分析型尺寸排阻層析純化且分析具有四種不同形式之鏈B突變(SEQ ID 3、7、11及15)的四組miniGNC分子(SEQ ID 1-16)，該等突變包括ProAKO:H435R/Y436F (Fc)及R19S (VH)之不同組合。僅含有具有兩組突變之鏈B之蛋白質允許完全移除鏈B污染物(第 2A 圖
)。將鏈B上之此VH3蛋白A敲除突變(R19S)以及Fc蛋白A敲除突變(H435R、F436Y)併入大多數多特異性抗體格式中，且用於產生bi-、tri-、tetra-及penta-miniGNC分子。
為展現用替代抗體同型產生功能性miniGNC蛋白之可行性，產生含有IgG4恆定區之例示性miniGNC。SI-75XM9 (SEQ ID 297-300)類似於SI-75X5 (SEQ ID 1-4)雙特異性miniGNC，不同之處在於用IgG4 CH1、鉸鏈及Fc置換IgG1 CH1、鉸鏈及Fc。值得注意地，兩種蛋白質均具有相同結合域(D2中之抗HER3域及D3中之抗CD3*域)，且含有相同核心結構及突變(杵臼Fc突變；抗HER3 scFv中之R19S；及Fc中之H435R/Y436F突變)。如表 8
中所示，SI-75XM9具有與SI-77X5相當之力價，且在蛋白A純化後，如分析型SEC評定，目的蛋白質百分比顯著增加19% (85.6% POI相比於72.2% POI)。高分子量物質之減少可與IgG4之較短鉸鏈長度(12個胺基酸而非15個)有關，從而可減少高階寡聚物之締合傾向。因此，用替代抗體同型產生miniGNC蛋白不僅可能，而且可產生更有利之特性，諸如聚集減少。實例 3 ：
多特異性miniGNC抗體之構型
為產生且表徵第一組多特異性miniGNC抗體，選擇三個部分1結合域，亦即αCD3、αPD-L1及α4-1BB，以及分別針對EGFR及HER3之兩個部分2結合域以進行比較。如表 1
中所示，將該組細分為penta-miniGNC、tri-miniGNC及bi-miniGNC組。在各亞組中存在至少一種miniGNC抗體，其在D3處具有CD3結合。penta-miniGNC組包括SI-75P6 (SEQ ID 17、19，其在D3位置處具有αEGFR)、SI-75P4 (SEQ ID 21、23，在D4處具有41BBL，即4-1BB受體之配位體)、SI-75P3 (SEQ ID 25、27)及SI-75P9 (SEQ ID 29、31，其在D3位置處具有HER3)。tetra-miniGNC組具有兩種抗體，SI-75E1 (SEQ ID 33、35)及SI-75E2 (SEQ ID 37、39)，以比較α4-1BB或αPD-L1域存在及不存在下之影響。tri-miniGNC組具有三種抗體，SI-75X3 (SEQ ID 41、43)、SI-75X16 (SEQ ID 45、47)及SI-75X18 (SEQ ID 49、51)以用於比較異二聚物之N或C末端上的兩個部分2結合域。bi-miniGNC組具有三種抗體，SI-75X1 (SEQ ID 53、55)、SI-75X2 (SEQ ID 57、59)及SI-75X5 (SEQ ID 1、3)，該等抗體中之每一者均具有一個部分1結合域及一個部分2結合域。
將編碼第一組miniGNC抗體之各成員的DNA選殖至載體pTT5中，使用ExpiCHO表現系統9天使該DNA以可接受之力價表現。用5 ml MabSelect蛋白A管柱，繼而使用高負載16/600 200 pg製備型SEC管柱在Akta Avant或Purifier系統上進行尺寸排阻來純化miniGNC抗體。使用關聯多角度光散射(multi angle light scattering；MALS，Wyatt Systems)之waters HPLC分析SEC聚集體，以藉由dn/dc計算法鑑別正確分子量。實例 4 ：
結合親和力之Octet分析
為評定miniGNC抗體之功能，藉由使用生物層干涉術(Octet 384 system)確定各域之結合親和力。使用Octet分析確保所選miniGNC抗體保留對所有其同源抗原之結合特異性及親和力。將各miniGNC抗體以10 um/mL裝載於AHC感測器上持續180秒，繼而60秒基線步驟、180秒與100 nM市售人類抗原之締合步驟及360秒解離步驟。所有步驟之樣品均在Octet緩衝液(含0.1% Tween 20及1% BSA之PBS)中。使用1:1結合模型進行配合，以提取親和力KD值。如表1中所示，各結合域之結合親和力如藉由其KD所量測，在可接受範圍內變化。對於部分1結合，aCD3域之KD可在17.4與36.2 nM之間變化，對於αPD-L1，在1與2.72 nM之間變化，且對於α4-1BB，在7.51與37.3 nM之間變化；且對於部分2結合，αEGFR之KD在5.56與11.1之間變化，且對於aHER3，在112.8與185 nM之間變化。實例 5 ：
多特異性miniGNC抗體之比較效力
對第一組多特異性miniGNC抗體進行T細胞依賴性細胞細胞毒性(TDCC)檢定，以量測殺滅癌細胞之效力。因所有分子中均具有αCD3結合域，故此組miniGNC抗體經配備以接合T細胞，再定向T細胞介導之細胞溶解，且最終殺滅標靶細胞。
使用基於發光之T細胞依賴性細胞毒性(TDCC)檢定，藉由經由螢光素酶之組成型表現定量細胞活力來量測抗體誘導之細胞毒性的程度。將螢光素化BXPC3人類胰腺癌細胞株(ATCC, Manassas, VA)在37℃，5% CO2下，在具有10%熱滅活胎牛血清(Invitrogen, Waltham, MA)之RPMI (ATCC, Manassas, VA)培養基中培養。用Vi-CELL自動化細胞計數器(Beckman Coulter, Pasadena, CA)監測細胞活力。藉由流式細胞術量測標靶細胞表面表現。將人類胰腺癌細胞BXPC3細胞與人類pan T細胞以5:1之效應與標靶(E:T)比率共培養，且以5倍稀釋系列(0-30 nM)添加抗體。使用Multidrop散裝液體分配器(BIOTEK, Winooski, VT)，將500個細胞/孔之標靶細胞(20 μl/孔)及25,00個細胞/孔之T細胞(20 μl/孔)依序塗佈於384孔白色平底聚苯乙烯TC處理微板(Corning, Corning, NY)上。添加抗體稀釋物(10 μl/孔)，且在37℃，5% CO2
下培育板72小時，隨後進行基於發光之細胞活力定量。將20 ul Bright-Glo (Promega)添加至孔中，且使用CLARIOstar板讀取器確定對應於腫瘤細胞活力之發光。
將資料擬合S形函數以計算且在表1中列出EC50值以進行比較。第3圖展示選自penta-miniGNC (SI-75P6)、tetra-miniGNC (SI-75E2)、tri-miniGNC (SI-75X3)、bi-miniGNC (SI-75X2)及mono-miniGNC (SI-75O2)分子之miniGNC抗體的劑量依賴性細胞活力曲線。儘管所有多特異性miniGNC抗體均能夠完全殺滅BXPC3細胞，但pent-及tetra-miniGNC抗體兩者均穩定地呈現在pM EC50範圍內之高效力。在此方面，SI-75X1尤其有效。該等資料展現部分1結合域，尤其作為免疫檢查點抑制劑之αPD-L1域在靶向BXPC3癌細胞時的重要作用。實例 6 ：
miniGNC抗體中CD3結合域之構型
藉由定義，miniGNC抗體能夠分別藉由其部分1及2結合域之結合與至少一個免疫效應細胞及一個標靶癌細胞相互作用。使用miniGNC抗體構型之一般方案(第1圖)，將兩個部分2結合域分配至D1及D2與將其分配至D1及D4或D2及D5可產生不同功效，因為標靶在細胞表面上之相對位置不同，在頂部及底部或兩側。在此情形下，組態第二組penta-miniGNC抗體且列於表2中。此組minGNC抗體均對CD3、CD19、EGFR、4-1BB及PD-L1具有相同結合特異性，且在D2、D4及D5處具有相同結合域。SI-68P13(SEQ ID 69、71)具有αCD3 D3域，SI-68P13與第一組之SI-75P3相當，但D2中具有差異，亦即αCD19相比於αHER3，且與第二組之SI-68P17(SEQ ID 73、75)相當，在SI-68P17中，將αCD3域換至D1。其餘第二組miniGNC抗體在D1(αCD3)及D3(αEGFR)處具有相同結合特異性。
抗CD3抗體在基於T細胞活化之免疫療法中起重要作用。人源化抗體對於開發治療性抗體為適宜的。將CD3域併入位置D1及D3中以產生SI-68P17(SEQ ID 73、75)及SI-68P13(SEQ ID 69、71)來測試位置影響。將人源化框架1(CD3**)、2(CD3***)、3(CD****)及4(CD*****)中之抗CD3序列選殖至表現盒中以產生SI-68P15(SEQ ID NO.77、79)、SI-68P18(SEQ ID 81、83)、SI-68P19(SEQ ID 85、87)及SI-68P 16(SEQ ID 89、91)(表2)。將各表現盒轉染至25mL ExpiCHO中，且表現8天，繼而進行蛋白A親和力層析以收穫且純化各penta-miniGNC抗體。產生具有良好力價之抗體(表2)。使用Octet驗證含有不同CD3域之penta-miniGNC抗體可分別結合人類CD3 (表 2
)。經由AHC感測器裝載10 μg/ml各penta-miniGNC抗體，且結合連續稀釋物(最高200 nm，1:2.5稀釋物)或單一100-nM濃度之His標記之人類CD3。所得1:1結合模型之全域擬合展現penta-GNC抗體以低奈米莫耳濃度範圍內之親和力結合CD3 (表2)。
為評價CD3介導之T細胞定向細胞毒性對癌細胞之影響，使用BXPC3腫瘤細胞株作為標靶。將抗體之連續稀釋物(0至30 nM；稀釋因數為1至5)添加至含有螢光素化標靶細胞及經活化T細胞(在臨添加藥物之前塗佈；效應細胞:標靶細胞= 5:1)之白色384孔板中，總體積為50 ul。再經72小時後，將20 ul Bright-Glo (Promega)添加至孔中，且使用CLARIOstar板讀取器確定對應於螢光素化腫瘤細胞活力之發光。將資料擬合S形函數以計算EC50值，如第4圖所示，該等EC50值在0.1至5.5 pM之範圍內且在表2中列出。該等資料展現，抗CD3定位、構型及結合親和力方面存在一定程度之靈活性。實例 7.
具有VHH作為結合域之多特異性miniGNC抗體
對於多特異性抗體平台，諸如含有多個scFv域之GNC及miniGNC抗體，潛在問題與由於同一分子中之多個VH及VL域所致的鏈錯配有關。不同VH及VL域具有不同彼此相互作用傾向。若不同特異性之結合域具有優異相互作用能量，則可在蛋白質組裝時形成錯對。因此，結合域將均不結合其靶向抗原。
VHH指具有單一Ig域之「抗體」，亦即「僅重鏈」，其亦稱為單域抗體(single-domain antibody；sdAb)或奈米抗體。第一單域抗體工程改造自駱駝中發現之重鏈抗體，亦稱為VH
H片段(VHH)。由於數種有利特性，VHH域愈來愈多地併入基於抗體之治療劑中。與更多傳統使用之scFv域相比，VHH域可具有增加之穩定性及溶解度。儘管傳統抗體可變區之VH/VL界面為疏水性的，但此等表面之瞬時暴露可引起顯著聚集或沉澱。另一方面，VHH域具有天然更親水性表面，因此可具有優異溶解度及穩定特性。VHH域優於Fab或scFv域之明顯益處為其小體積。其中Fab域為約50 kDa，且scFv域為約25 kDa，VHH域極其緊湊為12-15 kDa。penta-miniGNC抗體含有五個結合域(第 1 圖
)。併入VHH域替代scFv域可顯著降低分子尺寸，且增加腫瘤滲透。
產生第三組多特異性miniGNC抗體，且經組態以具有針對EGFR及HER3之VHH結合域(Gottlin等人, 2009；Eliseev等人, 2018) (表 3
)。構建併入五、三及雙特異性單域可變區(VHH)之miniGNC分子，且經純化以具有合理力價。使用Octet驗證多特異性miniGNC之各域的結合活性：SI-75P5 (SEQ ID 93、95)、SI-75P8 (SEQ ID 97、99)、SI-75X4 (SEQ ID 101、103)、SI-75X17 (SEQ ID 105、107)、SI-75X19 (SEQ ID 109、111)、SI-75X9 (SEQ ID 113-115)、SI-75X11 (SEQ ID 117、119)、SI-75X15 (SEQ ID 121、123)及SI-75X13(SEQ ID 125、127)。使用AHC感測器以10ug/ml之濃度捕獲GNC抗體180秒。在60秒基線步驟後，將單一濃度之抗原用於180秒締合步驟。測試之抗原包括200nM人類EGFR(內部純化)、100nM人類CD3(Acro CDD-H52W1)、20nM人類PD-L1(Acro PD1-H5229)、400nM人類4-1BB(內部純化)、200nM人類HER3(Acro ER3-H5223)。締合後，使用420秒解離步驟。在ForteBio資料分析軟體版本11中使用一比一結合模型計算列表之KD值。資料展現，在併入VHH之miniGNC平台中所有域均保留高親和力。
為評價VHH介導之T細胞定向細胞毒性對癌細胞之影響，使用BXPC3腫瘤細胞株作為標靶。將抗體之連續稀釋物(0至30nM；稀釋因數為1至5)添加至含有螢光素化標靶細胞及經活化T細胞(在臨添加藥物之前塗佈；效應細胞：標靶細胞=5：1)之白色384孔板中，總體積為50ul。再經72小時後，將20ul Bright-Glo(Promega)添加至孔中，且使用CLARIOstar板讀取器確定對應於螢光素化腫瘤細胞活力之發光。將EC50值列於表3中。
視情況在fab區之VH-VL界面中引入二硫連接(第5圖)。此工程改造之目的為藉由在核心-fab界面處形成共價二硫鍵(Weatherill等人，2012)來改良異二聚物配對且穩定整體結構。視情況引入半胱胺酸對以在鏈B之VL
A100及鏈A fab區之相應VH
A44處形成二硫鍵。
產生一對具有一致結合特異性之penta-miniGNC抗體(SI-38P11及SI-76PM1) (SEQ ID NO.129 及 131 ； 133 及 135)
，以用於分析Fab中經連接可變區之效果。根據第 1 圖
中之命名系統，兩種抗體之鏈A在D1處包含αCD20 scFv，在D3處包含αCD3 VH (VH Fab-CH1-Fc)，且在D4處包含α4-1BB，而鏈B在D2處包含αCD19，在D3處包含αCD3VL
(Vκ Fab CL-Fc)且在D5處包含αPD-L1 scFv (表 4
) 。構建D3中具有額外二硫基之SI-76PM1 (VH/VL Fab-CH1/CL-Fc)，且構建VH/VL fab中無任何額外二硫基配對之SI-38P11。
在ExpiCHO系統中表現位置D3處具有及不具有二硫連接之penta-miniGNC抗體構築體。產生力價顯著高於SI-38P11之具有經連接D3之構築體(SI-76PM1)。用5 ml MabSelect蛋白A管柱，繼而使用高負載16/600 200 pg製備型SEC管柱在Akta Avant或Akta Pure Purifier系統上進行尺寸排阻來純化兩種蛋白質。使用關聯多角度光散射(multi angle light scattering；MALS，Wyatt Systems)之waters HPLC分析SEC聚集體，以藉由dn/dc計算法鑑別正確分子量。對於如表 4
所示進行之所有分析，二硫鍵鍵結，亦即「具有D3連接之Fab」的penta-miniGNC抗體呈現高5%之目的蛋白質產生。兩種分子均展現相當之抗原結合動力學( 表 4)
。實例 9.
具有經連接scFv結合域之多特異性miniGNC抗體
工程改造多特異性miniGNC分子之核心結構以獲取數個特徵來穩定異二聚物，該等特徵包括共價連接之鉸鏈以及藉由Fc區中CH3域進行之非共價及優先「杵臼結構」相互作用。儘管穩定性及緊湊性為適宜的，但仍然不清楚D1及D2或D3及D4之近距離是否可能影響其穩定性及獨立功能。為維持各所添加結合域之穩定性及獨立性，一種選擇為在各scFv域中VL
100及VH
44處引入二硫鍵，亦即以連接各scFv域。VL
與VH
之間的二硫鍵可用於所有scFv域以穩定整個結構。替代地，可將二硫鍵引入任何位置處至少一個所選scFv域中。
將D1及D2靶向EGFR及HER3之四種miniGNC抗體分組以用於量測TDCC對胰腺癌細胞(HPAF-II)之比較效力，該等抗體包括tri-miniGNC (SI-68X2，SEQ ID NO.137、139)、tetra-miniGNC (SI-68E1，SEQ ID NO.141、143，及SI-68E2，SEQ ID NO.145、147)及penta-miniGNC (SI-68P1，SEQ ID NO.149、151)分子。就多特異性而言，部分1對4-1BB及PD-L1之結合特異性為可變的，而在該組中CD3恆定地作為D3。編碼此四種抗體中之每一者的表現構築體經修飾以使得所有scFv域均具有二硫鍵。使構築體在ExpiCHO系統中個別地表現，且各抗體經純化具有合理力價。使用Octet驗證對各別抗原之結合動力學。使用AHC感測器以10 ug/ml之濃度捕獲miniGNC抗體180秒。在60秒基線步驟後，將單一濃度之抗原用於180秒締合步驟。測試之抗原包括200 nM人類EGFR (內部純化)、100 nM人類CD3 (Acro CDD-H52W1)、20 nM人類PD-L1 (Acro PD1-H5229)、400 nM人類4-1BB (內部純化)、200 nM人類HER3 (Acro ER3-H5223)。締合後，使用420秒解離步驟。在ForteBio資料分析軟體版本11中使用一比一結合模型計算列表之KD
值。將如表 5
所示，所有scFv域經連接之各miniGNC分子的經分析KD值，與如表 6
所示，各別抗原之單株抗體對照的KD進行比較。結合動力學資料展示各經連接scFv域與其各別mAb或Fc-scFv對照SI-1C3 (SEQ ID 181、183)、SI-1C7 (SEQ ID 185)、SI-9C21 (SEQ ID 187、189)、SI-35SF11 (SEQ ID 191)、SI-3SF11 (SEQ ID 193)、SI-20C14 (SEQ ID 287及289)相比結合親和力相當(表 6
)，表明連接一或多個scFv域似乎對結合親和力幾乎無影響。
為評價經連接scFv域對miniGNC抗體效力之影響，使用T細胞定向細胞毒性(T cell directed cytotoxicity；TDCC)檢定，且標靶細胞為HPAF-II，一種人類胰腺癌細胞株(ATCC，Manassas, VA)。藉由流式細胞術驗證標靶細胞之表面表現。將抗體之連續稀釋物(0至30 nM；稀釋因數為1至5)添加至含有標靶細胞及經活化T細胞(在臨添加藥物之前塗佈；效應細胞:標靶細胞= 5:1)之白色384孔板中，總體積為50 ul。再經72小時後，將20ul Bright-Glo(Promega)添加至孔中，且使用CLA RIOstar板讀取器確定對應於螢光素化腫瘤細胞活力之發光。將資料擬合S形函數以計算EC50值。如第6圖及表5所示，存活曲線顯示，所有四種miniGNC抗體之效力均在pM劑量範圍內，且具有penta-miniGNC抗體發揮之TDCC效力高於tetra-miniGNC及tri-miniGNC抗體之趨勢。此觀察結果再次展示使用經連接scFv域幾乎無影響。
增加量之結合特異性使GNC抗體不僅可結合T細胞，亦結合T細胞之亞組、自然殺手細胞及其他類型之免疫細胞，統稱為部分1結合域/特異性(參見申請者之申請案WO/2019/005641及WO2019191120，該等案之全文併入本文中)。一些部分1結合特異性可置換對靶向細胞之細胞反應或識別。舉例而言，NKG2D為用於偵測及消除經轉型及感染細胞之主要識別受體，因為其配位體在細胞應激期間由於病毒感染或基因組應激而誘導，諸如在癌症中。在人類中，NKG2D由NK細胞及CD8+ T細胞表現。將NKG2D作為結合域/特異性添加至此類miniGNC抗體可改良單一多功能性治療劑形式之抗體的細胞毒性及功效。
在NK細胞中，NKG2D用作活化受體，其本身可觸發細胞毒性，而在CD8+ T細胞上，NKG2D之功能為發送共刺激訊號來活化該等細胞。NKG2D形成共二聚物，其胞外域用於配位體結合。此功能使NKG2D可作為miniGNC格式中基於非可變序列之結合域，且可添加其他結合域以產生一類多特異性NKG2D-miniGNC蛋白。在一種miniGNC格式中，個別NKG2D單體併入鏈A及鏈B上之D3位置中，從而在Fc二聚後形成二聚合NKG2D受體。因此，NKG2D可用作多特異性miniGNC分子之受體以結合其配位體。在其他miniGNC格式中，藉由在個別NKG2D單體之間添加(GxSy)n間隔子/連接子來設計NKG2D串聯重複序列，該等單體同二聚且形成功能性二聚合受體。此NKG2D串聯二聚合結構可位於D1、D2、D4或D5中。
如表 7
中所列，此類別包括mono-NKG2D-miniGNC (SI-49R26，SEQ ID NO.153、155)、bi-miniGNC (SI-49R27，SEQ ID NO.157、159)、tri-miniGNC (SI-49R25，SEQ ID NO.161、163)、tetra-miniGNC (SI-49P_X，SEQ ID NO.165、167)及penta-mini-GNC分子(SI49P8、SI-49P9，SEQ ID. NO. 169、171、177及179)。藉由交換SI-49P8之D1 (αCD3)與D3之位置產生對照penta-miniGNC, SI-49PM1 (SEQ ID NO.173、175)，且對NKG2D或CD3之Octet結合親和力不受此交換之影響。儘管在此類NKG2D-miniGNC分子中，其他部分1結合域之結合親和力保持穩定，但NKG2D之結合親和力在2倍內。因此，penta-miniGNC分子具有NKG2D受體結合NKG2D配位體之結合功能。
為評定且比較NKG2D-miniGNC分子之TDCC的效力，使用tri-、tetra-及penta-miniGNC分子、SI-49R25、SI-49P_X及SI-49P8及SI-49PM1靶向MDA-MB-231乳癌細胞株。在之前24小時，將miniGNC蛋白之連續稀釋物(0至30 nM；稀釋因數為1至5)添加至含有螢光素化MDA-MB-231細胞之白色384孔板中，且在37℃下生長。在臨添加miniGNC分子前塗佈經活化T細胞(效應細胞:標靶細胞= 15:1)，總體積為50 ul。再培育72小時後，將20 ul Bright-Glo (Promega)添加至孔中，且使用CLARIOstar板讀取器確定對應於螢光素化腫瘤細胞活力之發光。將資料擬合S形函數以計算EC50值(圖 7
)。基於劑量-活力曲線，存在兩組即tetra-及penta-miniGNC分子比tri-miniGNC分子SI-49R25有效。如表7所列，該差異可由於添加αPD-L1。然而，SI-49R25之EC50值(59.3 nM)應視為相對有效。對於乳癌細胞株MDA-MB-231，作為pan-B細胞標記物之CD19為非參與性腫瘤抗原。在此方面，可將SI-49R25視為對CD3劑NKG2D配位體具有兩個結合特異性。因此，資料指示，向不同miniGNC抗體格式併入NKG2D受體摻有助於TDCC之效力。在更廣泛意義上，miniGNC抗體分子可提供多個結合特異性以調節、合作及將最佳化免疫反應定向至標靶細胞，諸如癌症。表格 表 1.
在靶向表現EGFR及/或HER3之胰腺癌細胞(BXPC3)時，多特異性minGNC分子之構型、產生、結合親和力及效力。
表 2.
在靶向表現EGFR之胰腺癌細胞(BXPC3)時，CD3結合域之位置及結合親和力對penta-minGNC分子之效力的影響。
表 3.
在靶向BXPC3腫瘤細胞時，VHH單一結合域對多特異性minGNC分子之效力的影響。
表 4.
D3位置處「經連接」CD3結合域對多特異性miniGNC分子之產生的影響。
表 5.
在靶向腫瘤細胞時，所有位置處具有「經連接」scFv之多特異性miniGNC分子的比較效力。
表 6.
各別抗原之mAb或scFv格式之各域(D1-D5)的未連接形式的表徵。
表 7.
NKG2D受體二聚物併入miniGNC格式中之多特異性minGNC分子的表徵，以及三、四及五特異性分子在殺滅MDA-MB-231腫瘤細胞中之效力
表 8
. Fc域中具有不同IgG亞型之雙特異性miniGNC分子的表徵。
表 9
.關於結合域之結合特異性、域結構、來源及序列鑑別號(sequence identification number；SEQ ID)的註解。
序列表
＞序列ID 1：SI-75X5鏈A胺基酸序列
＞序列ID 2：SI-75X5鏈A核苷酸序列
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＞序列ID 228：αCD3* VH核苷酸序列
＞序列ID 229：αCD3* VL胺基酸序列
＞序列ID 230：αCD3* VL核苷酸序列
＞序列ID 231：αCD3** VH胺基酸序列
＞序列ID 232：αCD3** VH核苷酸序列
＞序列ID 233：αCD3** VL胺基酸序列
＞序列ID 234：αCD3** VL核苷酸序列
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＞序列ID 314：人類IgG4胺基酸序列
| 蛋白質ID | D1 /KD (nM) | D2 /KD (nM) | D3 /KD (nM) | D4 /KD (nM) | D5 /KD (nM) | 力價(µg/ml) | EC50 (pM) |
| Penta-miniGNC | |||||||
| SI-75P6 | αCD3 | αHER3 | αEGFR | α4-1BB | αPDL-1 | 96.5 | 0.011 |
| 36.2 | 138 | 5.56 | 37.3 | 1.45 | |||
| SI-75P4 | αEGFR | αHER3 | αCD3 | α4-1BBL | αPDL-1 | 48.4 | 0.102 |
| 10.4 | 150 | 22.7 | 115 | 2.72 | |||
| SI-75P3 | αEGFR | αHER3 | αCD3 | α4-1BB | αPDL-1 | 39.4 | 1.300 |
| 8.91 | 158 | 17.4 | 7.51 | 1 | |||
| SI-75P9 | αEGFR | αCD3 | αHER3 | α4-1BB | αPDL-1 | 30 | 0.160 |
| 11.1 | 20.1 | 140 | 21.2 | 2.7 | |||
| Tetra-miniGNC | |||||||
| SI-75E1 | αEGFR | αHER3 | αCD3 | α 4-1BB | -- | 30.2 | 5.800 |
| 8.9 | 185 | 20.3 | 17.8 | -- | |||
| SI-75E2 | αEGFR | αHER3 | αCD3 | -- | αPDL-1 | 172.3 | 0.085 |
| 8.24 | 114 | 22.1 | -- | 1.36 | |||
| Tri-miniGNC | |||||||
| SI-75X3 | αEGFR | αHER3 | αCD3 | 193.5 | 5417 | ||
| 8.47 | 146 | 18.2 | -- | -- | |||
| SI-75X16 | αEGFR | αHER3 | αCD3* | 183.5 | 95540 | ||
| 6.8 | 112.8 | 33.4 | -- | -- | |||
| SI-75X18 | αCD3* | αEGFR | αHER3 | 38.2 | 6090 | ||
| 47.3 | 2.72 | 93.75 | |||||
| Bi-miniGNC | |||||||
| SI-75X1 | αEGFR | αCD3 | 246.1 | 0.71 | |||
| 8.11 | 24 | -- | -- | ||||
| SI-75X2 | αHER3 | αCD3 | 237.7 | 433.8 | |||
| 162 | 27.8 | -- | -- | ||||
| SI-75X5 | αHER3 | αCD3* | 192.9 | 9,095 | |||
| 139.2 | 44.4 | -- | -- |
| 蛋白質ID | D1/KD (nM) | D2/KD (nM) | D3/KD (nM) | D4/KD (nM) | D5/KD (nM) | 力價(µg/ml) | EC50(pM) |
| SI-68P13 | αEGFR | αCD19 | αCD3 | α4-1BB | αPD-L1 | 35.1 | 0.09 |
| 5.64 | 4.33 | 25.9 | 14.8 | 1.04 | |||
| SI-68P17 | αCD3 | αCD19 | αEGFR | α4-1BB | αPD-L1 | 40 | 0.6 |
| 15.82 | 5.05 | 5.38 | 26.8 | 2.72 | |||
| SI-68P15 | αCD3** | αCD19 | αEGFR | α4-1BB | αPD-L1 | 58.1 | 0.16 |
| 22.4 | 2.85 | 2.42 | 17.1 | 0.4 | |||
| SI-68P18 | αCD3*** | αCD19 | αEGFR | α4-1BB | αPD-L1 | 26 | 0.19 |
| 14.46 | 1.35 | 8.18 | 7.51 | 1.00 | |||
| SI-68P19 | αCD3**** | αCD19 | αEGFR | α4-1BB | αPD-L1 | 28 | 0.12 |
| 16.74 | 3.44 | 4.43 | 21.2 | 0.7 | |||
| SI-68P16 | αCD3***** | αCD19 | αEGFR | α4-1BB | αPD-L1 | 72 | 5.5 |
| 60.6 | 2.55 | 2.41 | 23.3 | 0.5 |
| 蛋白質ID | D1 /KD (nM) | D2 /KD (nM) | D3 /KD (nM) | D4 /KD (nM) | D5 /KD (nM) | 力價 (µg/ml) | EC50 (pM) |
| SI-68P1 SI-75P5 | αEGFR VHH | αHER3 VHH | αCD3 | α4-1BB | αPD-L1 | 200.5 | 0443 |
| 23.5 | 4.68 | 26.1 | 23.3 | 3.25 | |||
| SI-75P8 | αEGFR VHH | αHER3 VHH | αCD3* | αEGFR | αHER3 | 295 | 96746800 |
| 6.22 | 0.786 | 44.1 | 6.22 | 0.786 | |||
| SI-75X4 | αEGFR VHH | αHER3 VHH | αCD3 | -- | -- | 65.8 | 5766 |
| 51.5 | 7.68 | 26.3 | -- | -- | |||
| SI-68P1 SI-75X17 | αEGFR VHH | αHER3 VHH | αCD3* | -- | -- | 330 | No killing |
| 14.8 | 4.58 | 68 | -- | -- | |||
| SI-75X19 | -- | -- | αCD3* | αEGFR VHH | αHER3 VHH | 223.4 | 1873 |
| 64.4 | 20.6 | 10.52 | |||||
| SI-75X9 | -- | αHER3 VHH | αCD3* | -- | -- | 234 | 2584 |
| -- | 3.86 | 84.2 | -- | -- | |||
| SI-75X11 | αEGFR VHH | -- | αCD3* | -- | -- | 214 | 564 |
| 21.6 | -- | 65.7 | -- | -- | |||
| SI-75X15 | -- | -- | αCD3* | -- | αHER3 VHH | 161.3 | 27400 |
| -- | 38.08 | -- | 13.7 | ||||
| SI-75X13 | -- | -- | αCD3* | αEGFR VHH | -- | 165.6 | 4858 |
| -- | 56 | 34-- | -- |
| 蛋白質ID | D1 /KD (nM) | D2 /KD (nM) | D3 (經連接)/KD (nM) | D4 /KD (nM) | D5 /KD (nM) | 力價 (µg/ml) | %POI |
| αCD20 | αCD19 | αCD3 | α4-1BB | αPD-L1 | |||
| SI-38P11 | 7.33 | 1.89 | 5.23 (未連接) | 14.8 | 1.1 | 80 | 69 |
| SI-76PM1 | 6.09 | 3.30 | 3.22 (經連接) | 22.43 | 1.47 | 129 | 75 |
| 蛋白質ID | D1 (經連接)/KD (nM) | D2 (經連接)/KD (nM) | D3 /KD (nM) | D4 (經連接)/KD (nM) | D5 (經連接)/KD (nM) | 力價(µg/ml) | EC50 (pM) |
| αEGFR* | αHER3 | αCD3 | α4-1BB | αPD-L1 | HPAF-II | ||
| SI-68X2 | ＜0.001 | 114.4 | 24.3 | -- | -- | 88.9 | 6.6 |
| SI-68E1 | ＜0.001 | 138.8 | 26.2 | 12.7 | -- | 114.8 | 3.6 |
| SI-68E2 | ＜0.001 | 120 | 28.4 | -- | 0.4 | 67 | 1.3 |
| SI-68P1 | ＜0.001 | 93.4 | 24.3 | 9.8 | 0.6 | 87.1 | 1.02 |
| αCEA | αEGFR* | αCD3 | MCF-7 | ||||
| SI-68X1 | ＜0.001 | ＜0.001 | 14.3 | -- | -- | 69 | 4.2 |
| αHER2 | -- | αCD3 | |||||
| SI-68X3 | NA | NA | 57 | NA |
| 蛋白質ID | 未連接對照 | 域結構 | 力價(µg/ml) | KD (nM) |
| SI-1C3 | D1 = αEGFR* | mAb | 44.9 | ＜0.001 |
| SI-1C7 | D2= αHER3 | Fc-scFv | 290.7 | 136.5 |
| SI-9C21 | D3 = αCD3 | mAb | 252.1 | 26.3 |
| SI-35FS11 | D4 = α4-1BB | Fc-ScFv | 7.67 | 14.9 |
| SI-3FS11 | D5 = αPD-L1 | Fc-ScFv | 18 | 0.94 |
| SI-20C14 | D1= αCEA | mAb | NA | ＜0.001 |
| 蛋白質ID | D1 /KD (nM) | D2 /KD (nM) | D3 /KD (nM) | D4 /KD (nM) | D5 /KD (nM) | 力價(µg/ml) | EC50 (pM) |
| SI-49R26 | -- | -- | NKG2D | -- | -- | 28 | n.a. |
| -- | -- | 17.7- | -- | -- | |||
| SI-49R27 | αCD3 | -- | NKG2D | -- | -- | 38.6 | n.a. |
| 32.2 | -- | 16 | -- | -- | |||
| SI-49R25 | αCD3 | αCD19 | NKG2D | -- | -- | 50 | 59330 |
| 34.50 | 7.62 | 12.80 | -- | -- | |||
| SI-49P_X | αCD3 | αCD19 | NKG2D | -- | αPD-L1 | 8.8 | 119.5 |
| 30.45 | 1.31 | 10.4 | -- | 0.2 | |||
| SI-49P8 | αCD3 | αCD19 | NKG2D | α4-1BB | αPD-L1 | 62.3 | 570.3 |
| 36.3 | 2.98 | 24.3 | 7.71 | 1.08 | |||
| SI-49PM1 | NKG2D | αCD19 | αCD3 | α4-1BB | αPD-L1 | 30.3 | 946.5 |
| 24.49 | 5.5 | 30.2 | 2.74 | 2.23 | |||
| SI-49P9 | αCD3 | αCD19 | NKG2D | 41BBL | αPD-L1 | 28.9 | n.a. |
| 29.80 | 6.4 | 27.2 | 112 | 2.01 |
| 蛋白質 | IgG亞型 | D1 | D2 | D3 | D4 | D5 | 力價(µg/ml) | %POI |
| SI-75X5 | IgG1 | - | αHER3 | αCD3* | - | - | 192.9 | 72.2 |
| SI-75XM9 | IgG4 | - | αHER3 | αCD3* | - | - | 150.5 | 85.6 |
| 標靶 | 結合域 | miniGNC中之結構 | 來源 | 序列標識編號 | |
| CD20 | Ritu | scFv | 利妥昔單抗(Rituximab) | 259-262 | |
| EGFR | EGFR | scFv及Fab | αEGFR H7 | 203-206 | |
| EGFR | EGFR* | scFv | 帕尼單抗 | 207-210 | |
| HER3 | MM-111 | scFv及Fab | MM-111 | 255-258 | |
| CD3 | αCD3 | scFv及Fab | 284A10 | 219-222 | |
| CD3 | αCD3* | scFv及Fab | 283E3BSM | 227-230 | |
| CD3 | αCD3** | scFv | 284A10 FR 1 | 231-234 | |
| CD3 | αCD3*** | scFv | 284A10 FR 2 | 235-238 | |
| CD3 | αCD3**** | scFv | 284A10 FR 3 | 239-242 | |
| CD3 | αCD3***** | scFv | 283E3FRS | 291-294 | |
| PD-L1 | αPD-L1 | scFv | PL221G5 | 243-246 | |
| 4-1BB | α4-1BB | scFv | 466F6 | 247-250 | |
| NKG2D配位體 | NKG2D | 受體 | 253-254 | ||
| 4-1BB | 41BBL | 配位體 | 251-252 | ||
| EGFR | αEGFR VHH | VHH | VHH-122 | 263-264 | |
| HER3 | αHER3 VHH | VHH | VHH BCD090-M2 | ||
| 265-266 | |||||
| CD19 | huBU12 | scFv | SI-huBU12-H4, | 215-218 | |
| CEA | αCEA-H1 | scFv | CEA-656E11 | 279-282 | |
| HER2 | Tras | scFv | 曲妥珠單抗 | 284-285 | |
| 人類IgG1重鏈 | 313 | ||||
| 人類IgG4輕鏈 | 314 |
| 樣品 ID | 鏈 | 序列標識編號 | Fc ProA KO (H435R/Y436F) | VH3 ProA KO (R19S) | |
| 蛋白質 | DNA | ||||
| SI-75X5 | A | 1 | 2 | + | + |
| B | 3 | 4 | |||
| SI-75X6 | A | 5 | 6 | + | - |
| B | 7 | 8 | |||
| SI-75X7 | A | 9 | 10 | - | + |
| B | 11 | 12 | |||
| SI-75X8 | A | 13 | 14 | - | - |
| B | 15 | 16 | |||
| SI-75P6 | A | 17 | 18 | + | + |
| B | 19 | 20 | |||
| SI-75P4 | A | 21 | 22 | + | + |
| B | 23 | 24 | |||
| SI-75P3 | A | 25 | 26 | + | + |
| B | 27 | 28 | |||
| SI-75P9 | A | 29 | 30 | + | + |
| B | 31 | 32 | |||
| SI-75E1 | A | 33 | 34 | + | + |
| B | 35 | 36 | |||
| SI-75E2 | A | 37 | 38 | + | + |
| B | 39 | 40 | |||
| SI-75X3 | A | 41 | 42 | + | + |
| B | 43 | 44 | |||
| SI-75X16 | A | 45 | 46 | + | + |
| B | 47 | 48 | |||
| SI-75X18 | A | 49 | 50 | + | + |
| B | 51 | 52 | |||
| SI-75X1 | A | 53 | 54 | + | NA |
| B | 55 | 56 | |||
| SI-75X2 | A | 57 | 58 | + | + |
| B | 59 | 60 | |||
| SI-75O2 | A | 61 | 62 | + | NA |
| B | 63 | 64 | |||
| SI-75O7 | A | 65 | 66 | + | NA |
| B | 67 | 68 | |||
| SI-68P13 | A | 69 | 70 | + | + |
| B | 71 | 72 | |||
| SI-68P17 | A | 73 | 74 | + | + |
| B | 75 | 76 | |||
| SI-68P15 | A | 77 | 78 | + | + |
| B | 79 | 80 | |||
| SI-68P18 | A | 81 | 82 | + | + |
| B | 83 | 84 | |||
| SI-68P19 | A | 85 | 86 | + | + |
| B | 87 | 88 | |||
| SI-68P16 | A | 89 | 90 | + | + |
| B | 91 | 92 | |||
| SI-75P5 | A | 93 | 94 | + | + |
| B | 95 | 96 | |||
| SI-75P8 | A | 97 | 98 | + | + |
| B | 99 | 100 | |||
| SI-75X4 | A | 101 | 102 | + | NA |
| B | 103 | 104 | |||
| SI-75X17 | A | 105 | 106 | + | NA |
| B | 107 | 108 | |||
| SI-75X19 | A | 109 | 110 | + | NA |
| B | 111 | 112 | |||
| SI-75X9 | A | 113 | 114 | + | NA |
| B | 115 | 116 | |||
| SI-75X11 | A | 117 | 118 | + | NA |
| B | 119 | 120 | |||
| SI-75X15 | A | 121 | 122 | + | NA |
| B | 123 | 124 | |||
| SI-75X13 | A | 125 | 126 | + | NA |
| B | 127 | 128 | |||
| SI-38P11 | A | 129 | 130 | + | + |
| B | 131 | 132 | |||
| SI-76PM1 | A | 133 | 134 | + | + |
| B | 135 | 136 | |||
| SI-68X1 | A | 195 | 196 | - | - |
| B | 197 | 198 | |||
| SI-68X3 | A | 199 | 200 | - | - |
| B | 201 | 202 | |||
| SI-68X2 | A | 137 | 138 | - | - |
| B | 139 | 140 | |||
| SI-68E1 | A | 141 | 142 | - | - |
| B | 143 | 144 | |||
| SI-68E2 | A | 145 | 146 | - | - |
| B | 147 | 148 | |||
| SI-68P1 | A | 149 | 150 | - | - |
| B | 151 | 152 | |||
| SI-49R26 | A | 153 | 154 | + | NA |
| B | 155 | 156 | |||
| SI-49R27 | A | 157 | 158 | + | NA |
| B | 159 | 160 | |||
| SI-49R25 | A | 161 | 162 | - | - |
| B | 163 | 164 | |||
| SI-49P_X | A | 165 | 166 | - | - |
| B | 167 | 168 | |||
| SI-49P8 | A | 169 | 170 | - | - |
| B | 171 | 172 | |||
| SI-49PM1 | A | 173 | 174 | + | + |
| B | 175 | 176 | |||
| SI-49P9 | A | 177 | 178 | - | - |
| B | 179 | 180 | |||
| SI-75XM9 | A | 297 | 298 | + | + |
| B | 299 | 300 |
| 蛋白質ID | 格式 | 序列標識編號 | |
| 蛋白質 | 蛋白質 | ||
| SI-1C3 HC | αEGFR mAb | 181 | 182 |
| SI-1C3 LC | αEGFR mAb | 183 | 184 |
| SI-1C7 | αHER3 Fc-scFv | 185 | 186 |
| SI-9C21 HC | αCD3 mAb | 187 | 188 |
| SI-9C21 LC | αCD3 mAb | 189 | 190 |
| SI-35FS11 | α4-1BB Fc-scFv | 191 | 192 |
| SI-3FS11 | αPD-L1 Fc-SCFv | 193 | 194 |
| SI-20C14 HC | αCEA mAb 656E11 | 287 | 288 |
| SI-20C14 LC | αCEA mAb 656E11 | 289 | 290 |
| 域 | 可變 鏈 | SEQ ID | |
| 蛋白質 | DNA | ||
| αEGFR | VH | 203 | 204 |
| VL | 205 | 206 | |
| αEGFR * | VH | 207 | 208 |
| VL | 209 | 210 | |
| 經連接αEGFR * | VH | 211 | 212 |
| VL | 213 | 214 | |
| αCD19 | VH | 215 | 216 |
| VL | 217 | 218 | |
| αCD3 | VH | 219 | 220 |
| VL | 221 | 222 | |
| 經連接αCD3 | VH | 223 | 224 |
| VL | 225 | 226 | |
| αCD3 * | VH | 227 | 228 |
| VL | 229 | 230 | |
| αCD3 ** | VH | 231 | 232 |
| VL | 233 | 234 | |
| αCD3 *** | VH | 235 | 236 |
| VL | 237 | 238 | |
| αCD3 **** | VH | 239 | 240 |
| VL | 241 | 242 | |
| αPDL1 | VH | 243 | 244 |
| VL | 245 | 246 | |
| α41BB | VH | 247 | 248 |
| VL | 249 | 250 | |
| 41BBL | NA | 251 | 252 |
| NKG2D二聚物 | NA | 253 | 254 |
| αHER3 | VH | 255 | 256 |
| VL | 257 | 258 | |
| αCD20 | VH | 259 | 260 |
| VL | 261 | 262 | |
| EGFR VHH | VHH | 263 | 264 |
| HER3 VHH | VHH | 265 | 266 |
| 經連接αPDL1 | VH | 267 | 268 |
| VL | 269 | 270 | |
| 經連接α41BB | VH | 271 | 272 |
| VL | 273 | 274 | |
| 經連接αHER3 | VH | 275 | 276 |
| VL | 277 | 278 | |
| αCEA | VH | 279 | 280 |
| VL | 281 | 282 | |
| 經連接αHER2 | VH | 283 | 284 |
| VL | 285 | 286 | |
| αCD3 ***** | VH | 291 | 292 |
| VL | 293 | 294 | |
| NKG2D單體 | NA | 295 | 296 |
| 抗體 | Kabat CDR | AA SEQ ID |
| αCEA 656E11 | CDR-H1 | 301 |
| CDR-H2 | 302 | |
| CDR-H3 | 303 | |
| CDR-L1 | 304 | |
| CDR-L2 | 305 | |
| CDR-L3 | 306 | |
| αCD3 283E3 (BSM/FRS) | CDR-H1 | 307 |
| CDR-H2 | 308 | |
| CDR-H3 | 309 | |
| CDR-L1 | 310 | |
| CDR-L2 | 311 | |
| CDR-L3 | 312 |
無
本揭露之前述及其他特徵將因以下描述及隨附申請專利範圍結合隨附圖式變得更加明顯。應理解，此等圖式僅描繪根據本揭露排列之數個實施例，因此，不應視為限制本揭露之範圍，本揭露將經由使用附圖，以額外特異性及細節來描述，其中：第 1 圖
描繪具有五個結合域(D1-D5)之miniGNC分子之異二聚構型，其中兩個單體由鏈A (N-D1-D3/VH-CH1-CH2-CH3-D4-C)及鏈B (N-D2-D3/VL-CL-CH2-CH3-D5-C)編碼；第 2 圖
展示在VH或Fc上具有敲除突變(KO)之經工程改造miniGNC鏈A及鏈B之二聚：(2A
)藉由蛋白A純化將混合物分級分離成同二聚物(a)、所要異二聚物(b)及鏈B單體(c)；(2B
)藉由非還原及還原條件下之SDS-PAGE分析預期尺寸之經蛋白A分級分離之同二聚物(a)、異二聚物(b)、鏈B單體(c)，以及鏈A單體(d)；第 3 圖
展示藉由使用penta-miniGNC (SI-75P6)、tetra-miniGNC (SI-75E2)、tri-miniGNC (SI-75X3)、bi-miniGNC (SI-75X2)及mono-miniGNC (SI-75O2)分子獲得之多特異性miniGNC分子介導之TDCC對BXPC3腫瘤細胞的比較效力；第 4 圖
展示miniGNC分子介導之TDCC對BXPC3腫瘤細胞株的比較效力，其中EC50值在0.1至5.5 pM範圍內；第 5 圖
展示量測以下之比較效力的TDCC檢定的存活曲線：(A
)多特異性miniGNC分子對於在TDCC檢定中殺滅胰腺癌細胞(HPAFII)之比較效力，該等多特異性miniGNC分子具有經連接域，包括penta-miniGNC (SI-68P1)、tetra-miniGNC (SI-68E2及SI-68E1)及tri-miniGNC (SI-68x2)，(B
) SI-68X1對MCF-7乳癌細胞之比較效力；且第 6 圖
展示多特異性miniGNC分子在TDCC檢定中在殺滅乳癌細胞(MDA-MB-231)中之功能，該等多特異性miniGNC分子具有二聚合NKG2D受體，包括三特異性分子(SI-49R25)、四特異性分子(SI-49P_X)、五特異性分子(SI-49PM1及SI-49P8)。
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無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (13)
- 一種具有一N末端及一C末端之五特異性類抗體蛋白，該五特異性類抗體蛋白包含：一第一單體，該第一單體自該N末端至該C末端包含一第一結合單體、一CH1域、一第一鉸鏈、一第一CH2域及一第一CH3域，其中該第一單體包含連接於該N末端之一第一結合域(D1)及連接於該C末端之一第四結合域(D4)，一第二單體，該第二單體自該N末端至該C末端包含一第二結合單體、一CL域、一第二鉸鏈、一第二CH2域及一第二CH3域，其中該第二單體包含連接於該N末端之一第二結合域(D2)及連接於該C末端之一第五結合域(D5)，其中該第一結合單體與該第二結合單體經組態以形成一二聚物，其中該第一單體及該第二單體經由該CH1域與該CL域間之至少一個二硫鍵及該第一鉸鏈與該第二鉸鏈間之至少一個二硫鍵共價配對，且該第一結合單體包含一VH域，該第二結合單體包含一VL域，且其中該VH域、該CH1域、該VL域、該CL域形成一Fab區作為一第三結合域(D3)；或該第一結合單體及該第二結合單體形成一NKG2D受體作為一第三結合域(D3)，其中：該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：17的 胺基酸序列及SEQ ID NO：19的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：21的胺基酸序列及SEQ ID NO：23的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：25的胺基酸序列及SEQ ID NO：27的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列及SEQ ID NO：31的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對CD3之結合特異性，D3具有對HER3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：69的 胺基酸序列及SEQ ID NO：71的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：73的胺基酸序列及SEQ ID NO：75的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：77的胺基酸序列及SEQ ID NO：79的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：81的胺基酸序列及SEQ ID NO：83的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：85的 胺基酸序列及SEQ ID NO：87的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：89的胺基酸序列及SEQ ID NO：91的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對EGFR之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：93的胺基酸序列及SEQ ID NO：95的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：97的胺基酸序列及SEQ ID NO：99的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對EGFR之結合特異性，D5具有對HER3之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：129的 胺基酸序列及SEQ ID NO：131的胺基酸序列，其中D1具有對CD20之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：133的胺基酸序列及SEQ ID NO：135的胺基酸序列，其中D1具有對CD20之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：149的胺基酸序列及SEQ ID NO：151的胺基酸序列，其中D1具有對EGFR之結合特異性，D2具有對HER3之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：169的胺基酸序列及SEQ ID NO：171的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3為一NKG2D受體，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：173的 胺基酸序列及SEQ ID NO：175的胺基酸序列，其中D1為一NKG2D受體，D2具有對CD19之結合特異性，D3具有對CD3之結合特異性，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性，或該五特異性類抗體蛋白具有SEQ ID NO：177的胺基酸序列及SEQ ID NO：179的胺基酸序列，其中D1具有對CD3之結合特異性，D2具有對CD19之結合特異性，D3為一NKG2D受體，D4具有對4-1BB之結合特異性，D5具有對PD-LI之結合特異性。
- 如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白，其中該第一CH3域經組態以形成一臼結構，其中該第二CH3域經組態以形成一杵結構，且其中該第一CH2及該CH3域與該第二CH2及該CH3域經組態以異二聚形成一互補Ec域。
- 如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白，其中該D1、該D2、該D4及該D5獨立地為一scFv域、一VHH域、一受體或一配位體。
- 一種經分離核酸，編碼如請求項1所述之一五特異性類抗體蛋白。
- 一種表現載體，包含如請求項4所述之經分離核酸。
- 一種宿主細胞，包含如請求項4所述之經分 離核酸。
- 一種免疫結合物，該免疫結合物包含如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白及一細胞毒性劑。
- 一種醫藥組成物，包含如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白及醫藥學上可接受之一載劑。
- 一種醫藥組成物，包含如請求項7所述之免疫結合物及醫藥學上可接受之一載劑。
- 一種醫藥組成物，用於治療或預防個體之一癌症、一自體免疫疾病或一感染性疾病，該醫藥組成物包含經純化之如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白。
- 一種包含經純化之如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白的一醫藥組成物的用途，其係用於製備用於治療或預防個體之一癌症、一自體免疫疾病或一感染性疾病的藥物。
- 一種用於製備如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白的方法，該方法包含：培養宿主細胞，以使得編碼如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白的一DNA序列表現，及純化該五特異性類抗體蛋白。
- 一種溶液，包含有效濃度之如請求項1所述之五特異性類抗體蛋白，其中該溶液為血漿。
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