TW202332687A - 免疫刺激性mrna組成物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於免疫療法領域。更特定言之，本發明係關於一或多種核酸分子之組成物，該一或多種核酸分子編碼諸如IL-21之功能性免疫刺激性蛋白質且編碼共刺激性分子，其視情況與細胞介素及/或趨化介素組合以增強針對體內存在之腫瘤細胞的宿主免疫反應。本發明亦係關於含有核酸之組成物或醫藥調配物，其係用於治療罹患腫瘤及/或癌症疾病之患者。

Description

免疫刺激性MRNA組成物及其用途

本發明係關於免疫療法領域。更特定言之，本發明係關於一或多種核酸分子之組成物，該一或多種核酸分子編碼諸如IL-21之功能性免疫刺激性蛋白質及共刺激性分子，其視情況與細胞介素及/或趨化介素組合以增強針對體內存在之腫瘤細胞的宿主免疫反應。本發明亦係關於含有核酸之組成物或醫藥調配物，其係用於治療罹患腫瘤及/或癌症疾病之患者。

旨在活化針對腫瘤細胞之免疫反應的免疫療法使癌症治療發生巨大變化且向先前不可治療之患者提供臨床益處。免疫療法之長期益處需要識別癌症相關抗原之記憶T細胞的誘導、擴增及維持。檢查點抑制劑（CPI），即阻斷諸如CTLA-4及PD-1/PD-L1之T細胞抑制性受體的抗體之全身性遞送藉由再活化/擴增先前存在之T細胞而產生持久的臨床反應，但許多腫瘤已演化出免疫抑制策略，使其對CPI具有抗性，因此需要開發引起T細胞免疫性增強之互補策略。

最佳T細胞反應之誘導需要由共刺激配體及細胞介素或趨化介素所介導之額外T細胞活化信號組合來將抗原呈現給T細胞受體（TCR）。包括病毒載體、質體DNA及信使mRNA之基於核酸之方法已用於在腫瘤微環境中局部編碼此等免疫刺激性蛋白質，引起針對腫瘤床中存在之抗原的全身性免疫反應之誘導及擴增。此等編碼免疫刺激性蛋白質之核酸亦可用於在疫苗接種之情形下促進針對共同遞送抗原的T細胞反應之產生。

儘管個別免疫刺激性蛋白質可引發某一程度之抗腫瘤功效，但需要同時靶向多種免疫刺激性路徑以增強治療益處。然而，將哪些因子組合以產生最佳功效仍然為巨大的挑戰，此為本發明之主題。

本案發明人證實，（局部）遞送包含至少編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21之核酸的組成物誘導引起腫瘤縮小或腫瘤生長延遲之全身性免疫反應。

此外，包含編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21之核酸的該組成物與共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素中之一或多者之組合進一步增強所觀測到之功效。

本發明尤其係關於一種組成物，其包含一或多種編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且編碼共刺激性分子之經分離之非病毒核酸分子。在一特定具體實例中，該組成物可進一步包含一或多種編碼細胞介素及/或趨化介素之核酸分子。

本發明提供以下概念驗證：此類組成物可尤其藉由在遞送後縮小腫瘤的體積來誘導/增強抗腫瘤的功效，從而形成用於抗腫瘤免疫療法之有前景的新方法。

因此，本發明提供用於改良組成物之免疫刺激性特徵的解決方案，該等組成物包含至少一種編碼修飾腫瘤微環境之蛋白質的核酸（尤其mRNA或DNA分子）之引入，該核酸之特徵在於所編碼之功能性免疫刺激性蛋白至少為IL-21，視情況與共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素中之一或多者組合。

在一特定具體實例中，組成物包含編碼IL-21同功異構物，尤其選自包含以下之清單之IL-21同功異構物的核酸分子：IL-21同功異構物1及IL-21同功異構物2，更特定言之IL-21同功異構物1。

在一特定具體實例中，組成物進一步包含標靶特異性抗原及/或檢查點抑制劑中之一或多者。

在一些具體實例中，組成物包含選自包含以下之清單的共刺激性分子：4-1BBL、OX40L、ICOS配體及CD40L。

在一特定具體實例中，組成物包含選自包含以下之清單的細胞介素：IL-7、IL-12、IL-18、IFNλ、IL-15sushi、IL-23、I型IFN、II型IFN、III型IFN。

在另一具體實例中，組成物包含選自包含以下之清單的趨化介素：CCL19、CCL20、CCL21、CXCL9、CXCL10、CCL4、CCL5及XCL1。

在一特定具體實例中，組成物包含標靶特異性抗原，諸如腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原或新抗原。

該標靶特異性抗原可衍生自以下任一者：自靶細胞分離之總mRNA、一或多種特異性標靶mRNA分子、靶細胞之蛋白質溶胞產物（lysates）、來自靶細胞之特異性蛋白、或合成之標靶特異性肽或蛋白質及編碼標靶特異性抗原或其衍生肽之合成mRNA或DNA。

在一特定具體實例中，本發明之組成物包含檢查點抑制劑，諸如尤其選自包含以下之清單的檢查點抑制劑多肽：PD-1、PD-L1、CTLA4、TIGIT、TIM3、LAG-3及VISTA之抑制性分子；較佳PD-1、PD-L1或CTLA4之抑制性分子。

本發明之方法中所使用之免疫刺激性因子的較佳組合為IL-21及4-1BBL。在其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-7免疫刺激性分子之組合。在另外其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IFNλ免疫刺激性分子之組合；或IL-21、4-1BBL及IL-18之組合。在其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-15之組合。在其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-15sushi之組合。

在一特定具體實例中，mRNA或DNA分子為個別核酸分子。在另一具體實例中，mRNA或DNA分子為一種單個核酸分子之部分，其中單個核酸分子能夠同時表現兩種或更多種免疫刺激性蛋白質，例如兩種或更多種編碼免疫刺激性蛋白質之mRNA或DNA分子可藉由內部核糖體進入位點（IRES）或自裂解（self-cleaving）之2a肽編碼序列在單個mRNA或DNA分子中連接。

在某些具體實例中，組成物中之核酸分子係選自包含以下之群：RNA、DNA、較佳為RNA、更佳為mRNA。

在一特定具體實例中，組成物之核酸分子包含以下中之一或多者：5'端帽（5'CAP）、聚（A）尾及/或經修飾之核苷；其中該經修飾之核苷可為N1-甲基假尿苷。

在一特定具體實例中，組成物之核酸分子係呈裸核酸分子或囊封於奈米粒子，諸如脂質奈米粒子或聚合物奈米粒子，尤其係脂質奈米粒子中之核酸形式。

本發明進一步提供一種脂質奈米粒子，其包含如本發明中所描述之組成物。

在另一具體實例中，組成物或脂質奈米粒子包含可離子化脂質、膽固醇、磷脂及聚乙二醇化脂質。

在一較佳具體實例中，組成物或脂質奈米粒子包含約且在35莫耳%與65莫耳%之間的可離子化脂質；約且在5莫耳%與25莫耳%之間的磷脂；約且在0.5莫耳%與3.0莫耳%之間的PEG脂質；其餘之量為固醇；尤其係50莫耳%之可離子化脂質、10莫耳%之磷脂、1.5莫耳%之PEG脂質及38.5莫耳%之固醇。

本發明進一步提供一種醫藥調配物，其包含本發明之組成物或脂質奈米粒子及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。本發明之醫藥調配物尤其適用作疫苗。

在另一態樣中，本發明提供如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於非經腸投予；更特定言之，用於靜脈內、腫瘤內、皮內、腹膜內、肌肉內或淋巴結內投予，較佳為腫瘤內投予。

在一特定具體實例中，提供本發明之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於人類醫學或獸醫學中。

在一較佳具體實例中，提供如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於與包括放射線療法及化學療法之標準照護癌症療法組合使用。

在一更佳具體實例中，提供本發明之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於預防及/或治療細胞增殖病症。

在又另一具體實例中，提供如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於引發針對個體中之腫瘤及/或癌症之免疫反應。

現將進一步描述本發明。在以下段落中，更詳細地定義本發明之不同態樣。除非有相反地明確指示，否則如此定義之各態樣可與任何其他態樣或多個態樣組合。特定言之，任何指示為較佳或有利之特徵可與任何其他一或多個指示為較佳或有利之特徵組合。

除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一（a）」、「一（an）」及「該（the）」包括複數個參考物。作為實例，「化合物」意謂一種化合物或超過一種化合物。

在提及諸如參數、量、時間長度及其類似者之可量測值時，如本文中所使用之術語「約」或「大約」意謂涵蓋+/-10%或更小、較佳+/-5%或更小、更佳+/-1%或更小且再更佳+/-0.1%或更小之所指定值之變化及自所指定值之變化，就此而言，此類變化適合於在本發明中實現。應理解，修飾語「約」或「大約」所指之值自身亦為特定地且較佳為揭示的。

在搜尋誘導全身性抗腫瘤免疫反應之新方法時，本案發明人研究包含囊封LNP中之編碼免疫調節分子之核酸的組成物之局部投予是否誘導有效抗腫瘤反應。本案發明人出乎意料地發現，包含編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21之核酸的組成物在直接腫瘤內注射後引起強且持久之抗腫瘤反應。

進一步確定將IL-21mRNA與編碼4-1BBL及IL-7之mRNA分子組合進一步增強功效。

雖然本發明適合於藉由在腫瘤內投予之後直接調節腫瘤微環境來活化及擴展抗腫瘤免疫，但其亦可適合於在疫苗接種情形（例如肌肉內、淋巴結內或靜脈內免疫接種）下增強針對共同遞送抗原之T細胞反應。

在本說明書通篇使用之術語「標靶（target）」不限於可在本文中描述之特定實例。可靶向腫瘤或癌細胞。在本說明書通篇使用之術語「標靶特異性抗原」不限於可在本文中描述之特定實例。所屬技術領域中具有通常知識者將清楚，本發明涉及藉由提供修飾腫瘤微環境之因子來增強抗腫瘤反應。

在不希望限制本發明之保護範圍的情況下，可能標記之一些實例列於下文。

本說明書通篇所使用之術語「抗原呈現細胞」包括所有抗原呈現細胞。特定非限制性實例為樹突狀細胞、樹突狀細胞株、b細胞或B細胞株。樹突狀細胞或B細胞可自患者或健康個體之血液分離或產生。患者或個體可為先前進行疫苗接種之個體或未進行疫苗接種之個體。

本說明書通篇所使用之術語「癌症」及/或「腫瘤」並不意欲限於可能已例示之癌症或腫瘤類型。因此，該術語涵蓋所有增生性病症，諸如贅瘤（neoplasma）、發育不良（dysplasia）、惡化前或癌前病變、異常細胞生長、良性腫瘤、惡性腫瘤、癌症或癌症轉移，其中癌症係選自以下之群：白血病、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、乳癌、神經膠質瘤、大腸癌、膀胱癌、肉瘤、胰臟癌、大腸直腸癌、頭頸癌、肝癌、骨癌、骨髓癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、甲狀腺癌、血液學（hematological）癌症及淋巴瘤。癌症之特異性抗原可例如為MelanA/MART1、癌症-生殖系抗原、gplOO、酪胺酸酶、CEA、PSA、Her-2/neu、存活素、端粒酶。

因此，本發明提供一種組成物，其包含編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且視情況地編碼共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素中之一或多者的核酸分子。特定言之，本發明提供一種組成物，其包含一或多種編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且編碼共刺激性分子之經分離之非病毒核酸分子。該組成物可進一步視情況包含一或多種編碼細胞介素及/或趨化介素之核酸分子。

在本發明之上下文中，術語「免疫刺激性蛋白質」應理解為任何能夠藉由誘導組分中之任一者之活化或增加活性來刺激免疫系統的蛋白質。如本文中所使用，該等免疫刺激性蛋白質由於例如進行疫苗投予而提供免疫反應中之抗原特異性。

在本發明之上下文中，術語「介白素21」應理解為對免疫系統細胞（包括自然殺手（NK）細胞及可破壞病毒感染或癌細胞之細胞毒性T細胞）具有有效調節作用之細胞介素。IL-21經由持續及增加之CD8+細胞反應來實現持久之腫瘤免疫而具有抗腫瘤功效。

在一特定具體實例中，組成物包含編碼IL-21同功異構物，尤其選自包含以下之清單之IL-21同功異構物的核酸分子：IL-21同功異構物1及IL-21同功異構物2，更特定言之IL-21同功異構物1。

在本發明之上下文中，術語「共刺激性分子」應理解為細胞表面分子之異質基團，其作用為放大或抵消T細胞受體（TCR）在與抗原/主要組織相容性複合物（MHC）相互作用後向T細胞提供之初始活化信號，藉此影響T細胞分化及去向。如本文中所使用，該等共刺激性分子可為免疫球蛋白（Ig）超家族、腫瘤壞死因子（TNF）-TNF受體（TNFR）超家族以及T細胞Ig及黏蛋白（TIM）域家族中之分子中之一者。

在一些具體實例中，共刺激性分子係選自包含以下之清單：4-1BBL、OX40L、ICOS配體及CD40L。

在本發明之上下文中，術語「細胞介素」應理解為在細胞信號傳導中至關重要之蛋白質。如本文中所使用，細胞介素為免疫調節性細胞信號傳導蛋白且涵蓋干擾素、介白素、淋巴介質及腫瘤壞死因子，但不涵蓋激素或生長因子。細胞介素經由細胞表面受體起作用且在免疫系統中尤其重要；細胞介素調節體液與基於細胞之免疫反應之間的平衡，且其調控特定細胞群體之成熟、生長及反應。特定言之，如本發明中所定義之細胞介素可尤其選自包含以下之清單：IL-7、IL-12、IL-18、IFNλ、IL-15sushi、IL-23、I型IFN、II型IFN、III型IFN。

在一特定具體實例中，細胞介素係選自包含以下之清單：IL-7、IL-12、IL-18、IFNλ及IL-15sushi。

在一特定具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物及細胞介素IL-7同功異構物，尤其選自包含以下之清單之IL-7同功異構物的核酸分子：IL-7同功異構物1及IL-7同功異構物2，更特定言之IL-7同功異構物1。

在另一特定具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物1及IL-7同功異構物1之核酸分子。

在又另一特定具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物1及IL-15sushi之核酸分子。

在本發明之上下文中，術語「趨化介素」應理解為誘導白血球定向移動之細胞以及其他細胞類型（包括內皮細胞及上皮細胞）所分泌的信號傳導蛋白。趨化介素與連接G蛋白之跨膜受體相互作用。如本文中所使用，該趨化介素可選自包含以下之群：CXC、CC、CX3C及C模體。

在一些具體實例中，該趨化介素可選自包含以下之清單：CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL1-V21C/V59C、XCL2 CX3CL1。

將編碼額外趨化介素之核酸遞送至腫瘤環境中可為有益的，諸如使用吸引樹突狀細胞之趨化介素（例如CCL4、CCL5、CCL19、CCL20、CCL21、XCL1）或使用T細胞/NK吸引性趨化介素（例如CCL3、CCL5、CXCL9-10_CCL19、XCL1）。

在一較佳具體實例中，趨化介素係選自包含以下之清單：CCL19、CCL20、CCL21、CXCL9、CXCL10、CCL4、CCL5及XCL1。

在一特定具體實例中，組成物進一步包含標靶特異性抗原及/或檢查點抑制劑中之一或多者。

在一特定具體實例中，組成物包含標靶特異性抗原，其為腫瘤抗原。

該標靶特異性抗原可以以下任一者之形式提供：自靶細胞分離之總mRNA、一或多種標靶特異性mRNA分子、靶細胞之蛋白溶解產物、來自靶細胞之特異性蛋白、或合成之標靶特異性肽或蛋白質及編碼標靶特異性抗原或其衍生肽之合成mRNA或DNA。

在本發明之上下文中，術語「檢查點抑制劑」應理解為一種類型之藥物或分子，其阻斷腫瘤細胞所採用之免疫檢查點以減少免疫活化及抗原識別。因此，此等檢查點抑制劑亦可為改良癌症療法之強大工具。

在一特定具體實例中，組成物包含一或多種核酸分子，其編碼任何能夠藉由減少（例如）該檢查點抑制劑之表現（亦即，轉錄及/或轉譯）或其天然配體或檢查點抑制劑活性而直接或間接地影響該檢查點抑制劑之調節的化合物。不限於此，此類抑制劑包括阻斷該檢查點抑制劑相關信號傳導分子或路徑之蛋白質、肽、小分子、抗體等。

在一特定具體實例中，檢查點抑制劑係選自包含以下之清單：PD-1、PD-L1、CTLA4、TIGIT、TIM3、LAG-3及VISTA之抑制性分子；較佳為PD-1、PD-L1或CTLA4之抑制性分子。

舉例而言，該組成物可包含針對PD-1之抗PD1抗體，諸如納武單抗（nivolumab）（BMS-936558/MDX1106）、皮立珠單抗（pidilizumab）（CT-011）或帕博利珠單抗（pembrolizumab）（MK-3475）。或者，諸如阿特珠單抗（atezolizumab）或德瓦魯單抗（durvalumab）之PD-L1抑制劑亦可適合地在本發明之上下文中使用。

例示性人類抗CTLA4抗體詳細描述於例如WO 00/37504中。此類抗體包括（但不限於）3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、替卡單抗（ticilimumab）、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1及12.9.1.1，以及曲美木單抗（tremelimumab）及伊匹木單抗（ipilimumab）。

上文所描述之抗檢查點抑制劑抗體（諸如抗PD-1抗體及/或抗PD-L1/PD-L2抗體）為所屬技術領域中所熟知的。其他阻斷抗體可容易由所屬技術領域中具有通常知識者鑑別及製備。

在一極特定具體實例中，本發明提供一種組成物，其包含一或多種編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且視情況編碼以下中之一或多者的經分離之非病毒核酸分子： -共刺激性分子，其係選自包含以下之清單：4-1BBL、OX40L、ICOS配體及CD40L； -細胞介素，其係選自包含以下之清單：IL-7、IL-12、IL-18、IFNλ、IL-15sushi、IL-23、I型IFN、II型IFN、III型IFN； -趨化介素，其係選自包含以下之清單：CCL19、CCL20、CCL21、CXCL9、CXCL10、CCL4、CCL5及XCL1； -PD-1、PD-L1、CTLA4、TIGIT、TIM3、LAG-3及/或VISTA之抑制性分子；較佳為PD-1、PD-L1或CTLA4之抑制性分子。

在另一極特定具體實例中，本發明提供一種組成物，其包含一或多種編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且視情況編碼以下中之一或多者的經分離之非病毒核酸分子：IL-7、4-1BBL、IFNλ、IL-18、IL-15sushi及/或CCL5。

本發明之方法中所使用之免疫刺激性因子的較佳組合為IL-21及4-1BBL。在其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-7免疫刺激性分子之組合。在又其他較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-15sushi免疫刺激性分子之組合。

在一特定具體實例中，組成物包含編碼IL-21同功異構物1及4-1BBL之核酸分子。

在另一特定具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物2、4-1BBL及IL-7同功異構物1之核酸分子。

在又另一特定具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物2、4-1BBL及IL-15sushi之核酸分子。

在又另一具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物2、4-1BBL及IFNλ之核酸分子。

在又另一具體實例中，本發明之組成物包含編碼IL-21同功異構物2、4-1BBL及IL-18之核酸分子。

本發明中所定義之免疫刺激性蛋白質之人類胺基酸序列的SEQ ID編號列於 表 1中。

應理解，本文中所描述之胺基酸序列不為限制性的且可涵蓋序列變化（亦即與所描述之序列具有序列一致性百分比）。

因此，在一特定具體實例中，本文中所描述之人類胺基酸序列與 表 1中所列舉之SEQ ID至少及/或約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

本發明亦可提供一種組成物，其包含編碼免疫刺激性蛋白質、共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素之核酸，其中人類胺基酸序列被置換為例如呈現於 表 2中之相應小鼠胺基酸序列，諸如本文中所揭示之實例部分中所使用之胺基酸序列。

因此，在一特定具體實例中，本文中所描述之小鼠胺基酸序列與 表 2中所列舉之SEQ ID至少及/或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

出於比較兩個或更多個核苷酸或胺基酸（AA）序列之目的，第一核苷酸/AA序列及第二核苷酸/AA序列之間的「序列一致性」百分比可藉由將[第一核苷酸/AA序列中與第二核苷酸/AA序列中相應位置處之核苷酸/AA一致之核苷酸/AA數目]除以[第一核苷酸/AA序列中之核苷酸/AA之總數目]並乘以[100%]來計算，其中與第一核苷酸/AA序列相比，各第二核苷酸/AA序列中之核苷酸/AA的缺失、插入、取代或添加被視為單個核苷酸/AA（位置）之差異。或者，兩個或更多個核苷酸/AA序列之間的序列一致性程度可使用已知的用於序列比對之電腦演算法（諸如NCBI Blast v2.0）使用標準設定來計算。特定方法使用設定為預設參數之WU-BLAST-2之BLAST模組，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。

此外，在測定兩個胺基酸序列之間的序列一致性程度時，所屬技術領域中具有通常知識者可考慮所謂之「保守性」胺基酸取代，其一般可描述為胺基酸殘基經具有類似化學結構之另一胺基酸殘基置換且對多肽之功能、活性或其他生物特性幾乎無影響或基本上無影響之胺基酸取代。此類保守性取代較佳為其中以下組（a）至（e）內之一個胺基酸經相同組內之另一胺基酸殘基取代的取代：（a）小型脂肪族、非極性或略微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；（b）極性、帶負電殘基及其（不帶電）醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；（c）極性、帶正電殘基：His、Arg及Lys；（d）大型脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及（e）芳香族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤其較佳之保守性取代如下：Ala取代為Gly或Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或Pro；His取代為Asn或Gln；Ile取代為Leu或Val；Leu取代為Ile或Val；Lys取代為Arg、Gln或Glu；Met取代為Leu、Tyr或Ile；Phe取代為Met、Leu或Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp；及/或Phe取代為Val、Ile或Leu。因此，在一個具體實例中，具有如上文中所給出之指定序列一致性百分比之序列為與參考序列相比具有一個、兩個、三個或更多個保守性胺基酸取代之序列。

另一方面，由本發明之核酸所編碼之變異體抗原/多肽可含有賦予多種所需特性中之任一者的胺基酸變化，例如增強其免疫原性、增強其表現及/或改良其在個體中之穩定性或PK/PD特性。變異體抗原/多肽可使用常規突變誘發技術製備且按需要來分析以確定其是否具有所需特性。

如所屬技術領域中具有通常知識者所認識，蛋白質片段（或編碼其之核酸）、功能性蛋白質域及同源蛋白質亦視為在所關注之腫瘤抗原之範疇內。舉例而言，本文提供參考蛋白質之任何蛋白質片段（意謂多肽序列比參考抗原序列短至少一個胺基酸殘基但在其他方面相同），其限制條件為片段為免疫原性且賦予腫瘤相關抗原保護性免疫反應。除與參考蛋白質一致但截短之變異體以外，在一些具體實例中，如本文中所提供或參考之序列中之任一者中所示，抗原可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個突變。抗原/抗原多肽之長度可在約4、6或8個胺基酸至全長蛋白質之範圍內。

本發明亦提供編碼如 表 3中所闡述之免疫刺激性蛋白質、共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素之小鼠特異性核酸分子。

因此，在一特定具體實例中，本文中所描述之小鼠核酸序列與 表 3中所列舉之SEQ ID至少及/或約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。

在本發明之上下文內，重要的是理解，組成物包含至少一種編碼免疫刺激性蛋白質IL-21之核酸分子。另外，組成物可包含至少一或多種編碼另一免疫刺激性蛋白質（諸如共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素）之核酸序列。因此，組成物可包含一或多種僅編碼IL-21之核酸序列，或其在編碼額外免疫刺激性蛋白質之情況下可包含兩個或更多個核酸分子。或者，IL-21及至少一種其他免疫刺激性蛋白質可由一種單個核酸分子編碼。

當組成物包含編碼兩種或更多種如本文所定義之蛋白質的核酸時，此等蛋白質可由單個核酸分子或由兩個或更多個核酸分子編碼。

因此，在一特定具體實例中，兩個或更多個編碼免疫刺激性蛋白質之核酸分子（尤其mRNA或DNA分子）為個別核酸分子。在另一具體實例中，該mRNA或DNA分子為一種單個核酸分子之部分，其中單個核酸分子能夠同時表現兩種或更多種免疫刺激性蛋白質。此單個mRNA或DNA分子較佳能夠獨立地表現兩種或更多種蛋白質。在一較佳具體實例中，兩種或更多種編碼免疫刺激性蛋白質之mRNA或DNA分子係藉由內部核糖體進入位點（IRES）在單個mRNA或DNA分子中連接，使得兩種或更多種mRNA序列中之各者分別轉譯成胺基酸序列。或者，在不同免疫刺激性因子之編碼序列之間併入自裂解2a肽編碼序列。以此方式，兩種或更多種因子可由一種單個mRNA或DNA分子編碼。

因此，本發明進一步提供一種用於編碼兩種或更多種免疫刺激性因子之mRNA分子，其中兩種或更多種免疫刺激性因子經由在兩種或更多種編碼序列之間使用IRES而自單個mRNA分子分別轉譯。或者，本發明提供一種用於編碼兩種或更多種由自裂解2a肽編碼序列分開之免疫刺激性因子的mRNA分子，其使得兩種蛋白質序列在轉譯後裂解（cleavage）。

在某些具體實例中，組成物中之核酸分子係選自包含以下之群：RNA、DNA、較佳為RNA、更佳為mRNA。

在本發明之上下文中，「核酸」為去氧核糖核酸（DNA）或較佳為核糖核酸（RNA），更佳為mRNA，但亦可包含cDNA、以重組方式產生及化學合成之分子。根據本發明，核酸可呈單股或雙股且線性或共價閉合以形成環之分子形式。核酸可用於引入細胞中，亦即轉染細胞，例如該核酸為可藉由從試管內轉錄DNA模板來製備之RNA形式。此外，RNA可在施用前藉由穩定序列、加帽及/或聚腺苷酸化進行修飾。

在本發明之上下文中，術語「RNA」係指包含核糖核苷酸殘基且較佳是完全由核糖核苷酸殘基所構成或實質上是由核糖核苷酸殘基所構成之分子。「核糖核苷酸」係指在β-D-呋喃核糖基之2'-位置具有羥基之核苷酸。該術語包括雙股RNA、單股RNA、經分離之RNA（諸如經部分純化之RNA）、基本上純的RNA、合成RNA、以重組方式產生之RNA，以及藉由添加、缺失、取代及/或改變一或多個核苷酸而與天然存在之RNA不同的經修飾之RNA。此類改變可包括添加非核苷酸材料，諸如添加至RNA之末端或內部，例如在RNA之一或多個核苷酸處。RNA分子中之核苷酸亦可包含非標準型核苷酸，諸如非天然存在之核苷酸或化學合成之核苷酸或去氧核苷酸。此等經改變之RNA可稱為類似物。核酸可包含於載體中。如本文中所使用之術語「載體（vector）」包括所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何載體，包括質體載體、黏質體載體、噬菌體載體（諸如λ噬菌體）、病毒載體（諸如腺病毒或桿狀病毒載體）或人造染色體載體（諸如細菌人造染色體（BAC）、人工酵母或天然存在之RNA的類似物）。

根據本發明，術語「RNA」包括且較佳係指「mRNA」，其意謂「信使RNA」且係指可使用DNA作為模板產生且編碼肽或蛋白質之「轉錄本」。mRNA典型地包含5'端非轉譯區（5'-UTR）、蛋白質或肽編碼區及3'端非轉譯區（3'-UTR）。mRNA在細胞中及試管內具有有限之半衰期。較佳地，mRNA係藉由使用DNA模板進行試管內轉錄產生。在本發明之一個具體實例中，RNA係藉由試管內轉錄或化學合成獲得。試管內轉錄方法為所屬技術領域中具有通常知識者已知的。舉例而言，存在多種可商購之試管內轉錄套組。

在一特定具體實例中，組成物之核酸分子包含以下中之一或多者：5'端帽、聚（A）尾及/或經修飾之核苷；其中該經修飾之核苷為N1-甲基假尿苷。

在本發明之上下文中，術語「五'帽（five-prime cap；5CAP）」應理解為在mRNA加帽過程期間合成的一些初級轉錄本（諸如前驅體信使RNA）之5'末端上的經特別改變之核苷酸。在一特定具體實例中，經試管內轉錄之mRNA分子可具有5'端帽-1、5'端帽-2、5'端m6Am結構或其衍生物。真核5'端帽由7-甲基鳥苷（m7G）經三磷酸橋連接至第一個核苷酸所組成，形成被稱為ARCA端帽類似物（5'端帽-0類似物）之結構。在本發明之上下文中，術語「5'端帽-1」（CleanCap）意謂在第一個端帽近端核苷酸之核糖的第二個碳原子處具有一額外甲基（2'單甲基化）之端帽-0結構，諸如下文所表示：

在本發明之上下文中，術語「5'端帽-2」意謂在第二個端帽近端核苷酸之核糖的第二個碳原子處具有一額外甲基（2'二甲基化）之端帽-1結構。在本發明之上下文中，術語「5' m6Am」結構意謂端帽-1結構，其中第一個核苷酸為在第六氮原子處具有甲基之腺苷，形成N6-甲基腺苷（m6Am）。如本文中所使用，加帽可涉及mRNA製造期間之加帽策略。在一特定具體實例中，加帽可指『共轉錄加帽』，其中在轉錄期間併入端帽類似物。舉例而言，CleanCap®技術為產生天然端帽1結構之專用共轉錄5'端加帽解決方案。在另一具體實例中，加帽可指『轉錄後加帽』，其中端帽類似物在mRNA合成之後使用基於酶之方法併入。

術語「核苷」意謂無磷酸根基團（phosphate group）之核苷酸。在另一具體實例中，本發明之mRNA分子中之一或多者可進一步包含至少一個經修飾之核苷。在另一特定具體實例中，本發明之兩個、三個、四個……或全部所使用之mRNA分子具有至少一個經修飾之核苷。

在本發明之另一特定具體實例中，該等mRNA分子進一步包含至少一個經修飾之核苷，諸如選自包含以下之清單：假尿苷、5-甲氧基-尿苷、5-甲基-胞苷、2-硫基-尿苷及N6-甲基腺苷。

在本發明之一特定具體實例中，該至少一個經修飾之核苷可為假尿苷，諸如選自包含以下之清單：4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、1-羧甲基-假尿苷、1-乙基-假尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。在一極特定具體實例中，該至少一個經修飾之核苷為N1-甲基-假尿苷。

適用於本發明之上下文內的替代性核苷修飾包括：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺基甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。在一些具體實例中，mRNA包含至少一個選自由以下組成之群的核苷：5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林（zebularine）、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。在一些具體實例中，mRNA包含至少一個選自由以下組成之群的核苷：2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-（順羥基異戊烯基）腺苷、2-甲硫基-N6-（順羥基異戊烯基）腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤。在一些具體實例中，mRNA包含至少一個選自由以下組成之群的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷（wyosine）、懷俄丁苷（wybutosine）、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、l-甲基-6-硫基-鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷。

本發明中所使用之mRNA分子可含有一或多個經修飾之核苷酸，在特定具體實例中，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之特定類型的核苷酸可由經修飾之核苷酸置換。亦不排除在相同之mRNA分子內包括不同之核苷酸修飾。在本發明之一極特定具體實例中，該等mRNA分子中約100%之尿苷經N1-甲基-假尿苷置換。

如本文中所使用，術語「聚（A）尾」應理解為包含多個腺苷單磷酸之部分且為所屬技術領域中熟知的。聚（A）尾通常在稱為聚腺苷酸化之步驟期間產生，該步驟為通常發生於成熟信使RNA產生期間的轉譯後修飾之一；此類聚（A）尾有助於該等mRNA之穩定性及半衰期，且可具有可變長度。特定言之，聚（A）尾可等於或長於10個腺苷核苷酸，包括等於或長於20個腺苷核苷酸，包括等於或長於100個腺苷核苷酸，且例如約介於90與120個腺苷核苷酸之間，諸如約90或約120個腺苷核苷酸。

本文中所使用或提及之核酸分子可為裸露之mRNA或DNA，或受保護之mRNA或DNA。對DNA或mRNA之保護增加其穩定性，但仍保留將mRNA或DNA用於疫苗接種目的之能力。對mRNA及DNA兩者之保護的非限制性實例可為：脂質體囊封、魚精蛋白保護、（陽離子）脂質脂質複合物化（Lipoplexation）、脂質組成物、陽離子組成物或聚陽離子組成物、甘露糖基脂質複合物化、氣泡脂質體化（Liposomation）、聚乙烯亞胺（PEI）保護、負載脂質體之微泡保護、脂質奈米粒子等。

本發明亦提供如本文中所定義之組成物；其中該等mRNA分子中之一或多者涵蓋於奈米粒子中。

如本文中所使用，術語「奈米粒子」係指任何具有使得粒子適合於全身性、尤其腫瘤內、肌肉內或靜脈內投予（特定言之核酸）之直徑的粒子，典型地具有小於1000奈米（nm）、較佳小於500 nm、甚至更佳小於200 nm、諸如在50與200 nm之間、較佳在80與160 nm之間的直徑。

在本發明之一特定具體實例中，奈米粒子係選自包含以下之清單：脂質奈米粒子及聚合物奈米粒子。

本發明進一步提供一種脂質奈米粒子，其包含如本發明中所描述之組成物。

在本發明之上下文中，以術語「脂質奈米粒子」或LNP之方式提及包含一或多種脂質(例如不同脂質之組合)之奈米尺寸粒子。LNP中所使用之可能脂質可為例如（但不限於）至少一種磷脂、至少一種經聚合物修飾之脂質（諸如PEG脂質或聚肌胺酸脂質）、至少一種陽離子或可離子化脂質、至少一種固醇。

在本發明之上下文中，在化合物或脂質之上下文中，術語「可離子化」（或替代地陽離子的）意謂在該化合物或脂質中存在任何不帶電基團，該基團能夠藉由產生離子（通常為H+離子）而解離且因此其自身變得帶正電荷。或者，該化合物或脂質中之任何不帶電基團可產生電子且因此變得帶負電荷。可離子化脂質之pH敏感度有益於活體內mRNA遞送，因為中性脂質與血球細胞陰離子膜的相互作用較小，因此提高了脂質奈米粒子之生物相容性。如本文中所使用，可適當地使用任何類型之可離子化脂質。舉例而言，適合之可離子化脂質為可離子化胺基脂質，其包含2個相同或不同之經由S-S鍵連接之尾部。

在本發明之上下文中，術語「PEG脂質」或替代地「PEG化脂質」意謂任何用聚乙二醇（PEG）基團修飾之適合之脂質。在本發明之上下文中，術語「磷脂」意謂由兩個疏水性脂肪酸「尾部」及一個由磷酸酯基組成之親水性「頭部」組成的脂質分子。兩種組分最常由甘油分子接合在一起，因此，本發明之磷脂較佳為甘油-磷脂。

在本發明之上下文中，術語「固醇」亦稱為類固醇，其為在植物、動物及真菌中天然存在或可藉由一些細菌產生之類固醇子群。在本發明之上下文中，可使用任何適合之固醇，諸如膽固醇。

在本發明之一特定具體實例中，以下中之一或多者適用： -該LNP包含約且在10莫耳%與70莫耳%之間的該可離子化脂質； -該LNP包含約且在1莫耳%與40莫耳%之間的該磷脂； -該LNP包含約且在0.5莫耳%與10莫耳%之間的該PEG脂質； 其餘之量為該固醇。

在本發明之一較佳具體實例中，以下中之一或多者適用： -該LNP包含約且在35莫耳%與65莫耳%之間的該可離子化脂質； -該LNP包含約且在5莫耳%與25莫耳%之間的該磷脂； - 該LNP包含約且在0.5莫耳%與3.0莫耳%之間的該PEG脂質； 其餘之量為該固醇。

在另一較佳具體實例中，本發明之LNP包含50莫耳%之可離子化脂質、10莫耳%之磷脂、1.5莫耳%之PEG脂質及38.5莫耳%之固醇。

在一些具體實例中，脂質之混合物形成脂質奈米粒子。在一些具體實例中，本發明之組成物調配於脂質奈米粒子中。在一些具體實例中，脂質奈米粒子首先形成為空脂質奈米粒子且在即將（例如，在數分鐘至一小時內之）投藥（尤其疫苗投予）之前與組成物組合。

為了避免任何誤解，本發明之LNP可包含組成物，或其可包含複數種組成物，諸如一或多種包含編碼免疫調節蛋白之核酸的組成物；及/或一或多種包含編碼共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素之核酸的組成物的組合。

在一極特定具體實例中，本發明之LNP可包含一種組成物，其包含編碼免疫調節分子之核酸及一或多種編碼衍生自腫瘤或癌細胞之肽的核酸分子。舉例而言，本發明之LNP可包含一種組成物，其包含編碼衍生自腫瘤之肽的核酸；以及一或多種編碼免疫刺激性蛋白質IL-21之核酸，該等核酸視情況與一或多種編碼共刺激性分子、細胞介素及/或趨化介素之其他核酸分子組合。

此外，應理解，本發明之LNP可包含根據本發明之該組成物、該等核酸分子或該醫藥調配物。

在一些具體實例中，兩種或更多種編碼免疫刺激性蛋白質及/或腫瘤抗原之不同核酸分子（例如，mRNA）可調配於相同脂質奈米粒子中。在其他具體實例中，兩種或更多種編碼免疫刺激性蛋白質或腫瘤抗原之不同核酸分子可調配於個別脂質奈米粒子中（各核酸調配於單個脂質奈米粒子中）。接著，可將脂質奈米粒子合併且以單個組成物（例如，包含多種編碼多種免疫刺激性蛋白質或腫瘤抗原之核酸）形式投予或可分別投予。

本文中所定義之組成物、核酸分子或醫藥調配物可調配於囊封構築體以防止其降解及促進細胞吸收之脂質奈米粒子（LNP）中。

本發明進一步提供一種醫藥調配物，其包含組成物或脂質奈米粒子及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

特定言之，如本文中所定義，術語「醫藥調配物」尤其用於包含本發明之組成物以及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之該LNP的上下文中。另一方面，術語「醫藥調配物」亦可指本發明之組成物與至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合（亦即不囊封於LNP內）。此組合可例如調配於LNP中且尤其意欲用於延長核酸穩定性及/或改良遞送。

如本文中所使用，「調配物」係指任何兩種或更多種產物或化合物（例如藥劑、調節劑、調控劑等）之混合物。其可為溶液、懸浮液、液體或水性調配物或其任何組合。

在本發明之上下文中，以術語「醫藥調配物」之方式提及具有醫藥學特性之調配物。換言之，提及提供藥理學及/或生理學功效之調配物。醫藥調配物可包含一或多種醫藥學上可接受之藥劑，諸如賦形劑、載劑、稀釋劑。

在一些具體實例中，醫藥學上可接受之藥劑包括（但不限於）生物相容媒劑、佐劑、添加劑及稀釋劑以便獲得可用作劑型之組成物。

如本文中所使用且除非另外規定，否則術語「賦形劑」應理解為任何包括出於長期穩定之目的而與活性化合物一起調配之物質，該目的諸如在預期儲存期限內預防變性或聚集、使含有少量有效活性化合物之液體或固體調配物膨化（因此通常稱為「膨化劑」、「填充劑」或「稀釋劑」）、或增強最終劑型中之活性化合物，諸如促進吸收、降低黏度或增強溶解度。

本發明之特定調配物可例如包含：

緩衝液	磷酸鹽（磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉）	Tris（三羥甲基胺基甲烷）
其他賦形劑	氯化鉀、氯化鈉 蔗糖 注射用水	乙酸鈉 蔗糖 注射用水

醫藥調配物尤其適用作疫苗。

在本發明之上下文中，如本文中所使用之術語「疫苗」意謂任何意欲提供針對疾病之適應性免疫（抗體及/或T細胞反應）的製劑。為此，如本文中所意謂之術語「疫苗」包含至少一種組成物或至少一種脂質奈米粒子或至少一種醫藥調配物，其中發生適應性免疫反應。在本發明之上下文內，術語疫苗可與術語醫藥調配物互換地使用。

在一些具體實例中，該疫苗可包含裸露之核酸，其懸浮於適合之注射緩衝液，諸如林格氏乳酸鹽緩衝液（Ringer Lactate buffer）中。

本發明之疫苗可防治性（諸如在症狀顯現之前）或治療性（例如，積極地治療或減輕正在進行之疾病之症狀，諸如腫瘤生長）使用。疫苗之投予稱為疫苗接種。

在另一態樣中，本發明提供一種組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於非經腸投予；更特定言之，用於所屬技術領域中已知的疫苗投予途徑，諸如靜脈內、腫瘤內、皮內、腹膜內、肌肉內或淋巴結內投予，較佳為腫瘤內投予。

本發明之疫苗尤其意欲用於腫瘤內投予，亦即直接將液體物質輸注至腫瘤中。投予至腫瘤中之流體快速吸收至循環中，亦即全身性地吸收。

本發明亦提供一種經靜脈內投予之疫苗，亦即直接將液體物質輸注至靜脈中。靜脈內途徑係將流體及藥劑遞送至全身之最快方式，但引起廣泛之全身性暴露。

在本發明之上下文內，疫苗可防治性（=預防性）或治療性地作為活性疫苗接種方案之部分向疾病發作早期、在症狀發作之後或在偵測表現或一或多種腫瘤抗原之後的個體投予。

在一些具體實例中，疫苗可以單一藥物療法形式或以組合療法形式投予。如實例部分中所描述，術語「單一藥物療法」應理解為包含編碼一種單個免疫刺激性蛋白質（例如IL-21）之核酸的疫苗投予。相反，術語「組合療法」意謂作為包含編碼兩種或更多種免疫刺激性蛋白質（例如IL-21以及IL-7）之核酸的疫苗投予。

或者，組合療法亦可在本發明之組成物之上下文中使用，該組成物編碼IL-21或不與其他免疫刺激性分子或其他h標準照護腫瘤治療（諸如化學療法或放射線療法）組合。

在另一具體實例中，包含編碼一或多種免疫調節蛋白之核酸的本發明之治療劑亦可與引起「組合治療」功效之抗原特異性腫瘤疫苗組合投予。

在一些具體實例中，疫苗（呈單一藥物療法或組合療法形式）可以單次劑量、兩次劑量、三次劑量、四次劑量、較佳三次劑量之形式進行投予，或重複進行，只要個體有需要即可。

在一些具體實例中，單一藥物療法或組合療法中之投藥時間可為（但不限於）1週、2週、3週、4週、2個月、3個月、6個月、1年，且可每年重複，只要個體有需要即可。

在另一具體實例中，在組合治療（亦即與另一抗腫瘤疫苗之單一藥物/組合療法）中之注射之間的投藥時間可為（但不限於）1分鐘至30分鐘、30分鐘至1小時、3小時、6小時、12小時、1天、1週、2週、3週、4週、2個月、3個月、6個月、1年。

對於該等投藥中之各者，劑量亦可不同，諸如在治療開始時的劑量較高，而在治療即將結束時的劑量較低。

在一特定具體實例中，本發明亦提供一種組成物、脂質奈米粒子、醫藥調配物或疫苗，其係用於人類醫學或獸醫學中。

亦預期如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子、醫藥調配物或疫苗在人類醫學或獸醫學中之用途。最後，本發明提供一種用於防治及/或治療人類醫學及獸醫學病症之方法，其係藉由向有需要之個體投予如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子、醫藥調配物或疫苗來實現。

在一更佳具體實例中，提供一種如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於預防及/或治療細胞增殖病症。

在本申請案之上下文中，術語「治療（treatment）」、「治療（treating）」、「治療（treat）」及其類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理學功效。該功效就完全或部分地預防疾病或其症狀而言可具防治性，及/或就部分或完全地穩定或治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良作用而言可具治療性。「治療（treatment）」涵蓋任何對哺乳動物（尤其人類）之疾病的治療，且包括：（a）預防疾病或症狀在可能易患該疾病或症狀但尚未診斷出患有該疾病或症狀之個體中發生；（b）抑制疾病症狀，亦即遏制其發展；或（c）緩解疾病症狀，亦即使疾病或症狀消退。

在又另一具體實例中，提供一種如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於引發針對個體中之腫瘤及/或癌症之免疫反應。

本說明書通篇所使用之術語「免疫反應」並不意欲限於可在本文中例示之免疫反應類型。因此，該術語涵蓋疫苗接種將對個體有益之所有腫瘤抗原或癌症抗原。

本發明之疫苗可用於誘導免疫反應，尤其針對疾病相關抗原或表現疾病相關抗原之細胞的免疫反應，諸如針對腫瘤相關抗原之免疫反應。該免疫反應較佳為T細胞反應。在一個具體實例中，疾病相關抗原為腫瘤抗原。由本文中所描述之本發明之核酸編碼的抗原較佳為疾病相關抗原或引發針對疾病相關抗原或表現疾病相關抗原之細胞的免疫反應。

在一較佳具體實例中，本發明提供一種用於直接活體內施用之組成物。

經由直接活體內遞送，為DC提供強烈的活化刺激，引起T細胞吸引性及刺激性環境之誘導。此外，當抗原mRNA與本發明之組成物一起共同遞送時，此引起針對各種腫瘤抗原之抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞以及CTL之募集。特定言之，該組成物之活體內遞送在mRNA之吸收及轉譯之後引發DC之成熟，因此仍允許此等DC之強烈抗原表現。與直接活體內單獨遞送抗原mRNA相比，同時遞送該組成物及抗原mRNA顯著增強抗原特異性T細胞之誘導。此等觀測結果指示共同遞送mRNA組成物以用於誘導針對癌症之強抗原特異性免疫反應之值。

在一較佳具體實例中，提供一種如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於與包括放射線療法及化學療法之標準癌症療法組合使用。

本發明進一步提供用本發明之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物或用本發明之疫苗治療有需要之患者的方法。

本發明進一步提供一種如本文中所定義之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物，其係用於治療癌症。在癌症之活性免疫療法之情況下，用本發明之組成物、脂質奈米粒子或醫藥調配物進行之治療可在免疫調節之任何非特異性治療之前、與其組合或在其之後以便改良本發明本身之活性或利用不同治療模式之間的任何協同作用（例如藉由用細胞介素（例如介白素-2或干擾素α-2b）或TLR-配體經由患者免疫系統之非特異性刺激來改良對本發明之免疫反應；或例如藉由將本發明與共刺激信號調節藥物（諸如伊匹木單抗或曲美木單抗）組合）；或任何其他形式之免疫療法。本發明亦提供複合治療方案，其中本發明本身及限定數目之其他免疫調節治療係用以產生更有效之治療計劃（例如本發明與模式1（例如細胞介素）之連續使用，隨後本發明用於疫苗免疫細胞之活體內或活體外擴增之用途，隨後此等細胞之過繼性細胞轉移，隨後本發明與額外模式（例如共刺激受體信號調節劑）之組合治療或本發明與額外免疫調節治療之同時及/或連續使用之任何可能組合）。

在一較佳具體實例中，本發明取決於IL-21與標靶特異性抗原之同時表現，藉此引起DC在腫瘤環境中之免疫刺激性作用增加。在另一較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-7之特定組合來改良DC之免疫刺激性作用。在另一較佳具體實例中，使用IL-21、4-1BBL及IL-15sushi之特定組合來改良DC之免疫刺激性作用。在所有此等具體實例中，可同時引入以下標記中之任一者：細胞介素及/或趨化介素。 表 1 ：經編碼之免疫刺激性蛋白質之人類胺基酸序列。

SEQ ID	肽或片段	NCBI 編號	胺基酸序列
1	huIL-21同功異構物1	NP_068575.1	MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
2	huIL-21同功異構物2	NP_001193935	MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKVSTLSFI
3	huIL-7同功異構物1	NP_000871.1	MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
4	huIL-7同功異構物2	NP_001186815.1	MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
5	hu4-1BB-L (tnfsf9)	NP_003802.1	MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
6	huIL-18 WT	NP_001553.1	MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED
7	huCCL5	NP_002976	MKVSAAALAVILIATALCAPASASPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS
8	huCCL19	NP_006265.1	MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
9	huCXCL9	NP_002407.1	MKKSGVLFLLGIILLVLIGVQGTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT
10	huXCL1	NP_002986.1	MRLLILALLGICSLTAYIVEGVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG
11	huXCL1-V21C/V59C	不可獲得	MRLLILALLGICSLTAYIVEGVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPCSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDCVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG
12	huIL-29（干擾素λ 1）	NP_742152.1	MAAAWTVVLVTLVLGLAVAGPVPTSKPTTTGKGCHIGRFKSLSPQELASFKKARDALEESLKLKNWSCSSPVFPGNWDLRLLQVRERPVALEAELALTLKVLEAAAGPALEDVLDQPLHTLHHILSQLQACIQPQPTAGPRPRGRLHHWLHRLQEAPKKESAGCLEASVTFNLFRLLTRDLKYVADGNLCLRTSTHPEST
13	huIL-28A（干擾素λ 2）	NP_742150.1	MKLDMTGDCTPVLVLMAAVLTVTGAVPVARLHGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCRCHSRLFPRTWDLRQLQVRERPMALEAELALTLKVLEATADTDPALVDVLDQPLHTLHHILSQFRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLYRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV
14	huIL-28B（干擾素λ 3）	NP_742151.2	MTGDCMPVLVLMAAVLTVTGAVPVARLRGALPDARGCHIAQFKSLSPQELQAFKRAKDALEESLLLKDCKCRSRLFPRTWDLRQLQVRERPVALEAELALTLKVLEATADTDPALGDVLDQPLHTLHHILSQLRACIQPQPTAGPRTRGRLHHWLHRLQEAPKKESPGCLEASVTFNLFRLLTRDLNCVASGDLCV

表 2 ：經編碼之免疫刺激性蛋白質之小鼠胺基酸序列。

SEQ ID	肽或片段	NCBI 編號	胺基酸序列
15	muIL-21同功異構物1	NP_001277970.1	MERTLVCLVVIFLGTVAHKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKVCTLNAFLSLPCCVRVPPVPSDS
16	muIL-21同功異構物2	NP_068554.1	MERTLVCLVVIFLGTVAHKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS
17	muIL-7	NP_032397.1	MFHVSFRYIFGIPPLILVLLPVTSSECHIKDKEGKAYESVLMISIDELDKMTGTDSNCPNNEPNFFRKHVCDDTKEAAFLNRAARKLKQFLKMNISEEFNVHLLTVSQGTQTLVNCTSKEEKNVKEQKKNDACFLKRLLREIKTCWNKILKGSI
18	mu4-1BB-L (tnfsf9)	NP_033430.1	MDQHTLDVEDTADARHPAGTSCPSDAALLRDTGLLADAALLSDTVRPTNAALPTDAAYPAVNVRDREAAWPPALNFCSRHPKLYGLVALVLLLLIAACVPIFTRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWE
19	muIgGk信號肽-mu IL-15Ra sushi  (aa34-103)-GS連接子-IL-15 (aa49-162)	不可獲得	METDTLLLWVLLLWVPGSTGDTTCPPPVSIEHADIRVKNYSVNSRERYVCNSGFKRKAGTSTLIECVINKNTNVAHWTTPSLKCIRDPSLAGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGNWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS
20	muIL-18 WT	NP_032386.1	MAAMSEDSCVNFKEMMFIDNTLYFIPEENGDLESDNFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYMYKDSEVRGLAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS
21	高斯（gausia）信號肽-muIL-18 WT	不可獲得	MGVKVLFALICIAVAEANFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYMYKDSEVRGLAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS
22	muIL-18突變CS2（誘餌受體）	不可獲得/來自文獻	MAAMSEDSCVNFKEMMFIDNTLYFIPEENGDLESDHFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYAYGDSRARGKAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS
23	高斯信號肽-muIL-18突變CS2（誘餌受體）	不可獲得	MGVKVLFALICIAVAEAHFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYAYGDSRARGKAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS
24	muCCL5	NP_038681.2	MKISAAALTIILTAAALCTPAPASPYGSDTTPCCFAYLSLALPRAHVKEYFYTSSKCSNLAVVFVTRRNRQVCANPEKKWVQEYINYLEMS
25	muCCL19	NP_036018.1	MAPRVTPLLAFSLLVLWTFPAPTLGGANDAEDCCLSVTQRPIPGNIVKAFRYLLNEDGCRVPAVVFTTLRGYQLCAPPDQPWVDRIIRRLKKSSAKNKGNSTRRSPVS
26	muCXCL9	NP_032625.2	MKSAVLFLLGIIFLEQCGVRGTLVIRNARCSCISTSRGTIHYKSLKDLKQFAPSPNCNKTEIIATLKNGDQTCLDPDSANVKKLMKEWEKKISQKKKQKRGKKHQKNMKNRKPKTPQSRRRSRKTT
27	muXCL1	NP_032536.1	MRLLLLTFLGVCCLTPWVVEGVGTEVLEESSCVNLQTQRLPVQKIKTYIIWEGAMRAVIFVTKRGLKICADPEAKWVKAAIKTVDGRASTRKNMAETVPTGAQRSTSTAITLTG
28	muXCL1-V21C/A59C	不可獲得	MRLLLLTFLGVCCLTPWVVEGVGTEVLEESSCVNLQTQRLPCQKIKTYIIWEGAMRAVIFVTKRGLKICADPEAKWVKACIKTVDGRASTRKNMAETVPTGAQRSTSTAITLTG
29	muIL-28A（干擾素λ 2）	NP_001019844.2	MLLLLLPLLLAAVLTRTQADPVPRATRLPVEAKDCHIAQFKSLSPKELQAFKKAKDAIEKRLLEKDLRCSSHLFPRAWDLKQLQVQERPKALQAEVALTLKVWENMTDSALATILGQPLHTLSHIHSQLQTCTQLQATAEPRSPSRRLSRWLHRLQEAQSKETPGCLEASVTSNLFRLLTRDLKCVANGDQCV
30	muIL-28B（干擾素λ 3）	NP_796370.1	MLLLLLPLLLAAVLTRTQADPVPRATRLPVEAKDCHIAQFKSLSPKELQAFKKAKGAIEKRLLEKDMRCSSHLISRAWDLKQLQVQERPKALQAEVALTLKVWENINDSALTTILGQPLHTLSHIHSQLQTCTQLQATAEPKPPSRRLSRWLHRLQEAQSKETPGCLEDSVTSNLFQLLLRDLKCVASGDQCV

表 3 ：經編碼之免疫刺激性蛋白質之小鼠核酸序列。

SEQ ID	肽或片段	NCBI 編號	核苷酸序列（ DNA ）
31	muIL-21同功異構物1	NM_001291041.1	ATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCTGGTAGTCATCTTCTTGGGGACAGTGGCCCATAAATCAAGCCCCCAAGGGCCAGATCGCCTCCTGATTAGACTTCGTCACCTTATTGACATTGTTGAACAGCTGAAAATCTATGAAAATGACTTGGATCCTGAACTTCTATCAGCTCCACAAGATGTAAAGGGGCACTGTGAGCATGCAGCTTTTGCCTGTTTTCAGAAGGCCAAACTCAAGCCATCAAACCCTGGAAACAATAAGACATTCATCATTGACCTCGTGGCCCAGCTCAGGAGGAGGCTGCCTGCCAGGAGGGGAGGAAAGAAACAGAAGCACATAGCTAAATGCCCTTCCTGTGATTCGTATGAGAAAAGGACACCCAAAGAATTCCTAGAAAGACTAAAATGGCTCCTTCAAAAGGTATGCACCTTAAATGCATTTCTTTCACTTCCATGTTGTGTCCGGGTACCTCCTGTGCCCAGTGACTCATAG
32	muIL-21同功異構物2	NM_021782.3	ATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCTGGTAGTCATCTTCTTGGGGACAGTGGCCCATAAATCAAGCCCCCAAGGGCCAGATCGCCTCCTGATTAGACTTCGTCACCTTATTGACATTGTTGAACAGCTGAAAATCTATGAAAATGACTTGGATCCTGAACTTCTATCAGCTCCACAAGATGTAAAGGGGCACTGTGAGCATGCAGCTTTTGCCTGTTTTCAGAAGGCCAAACTCAAGCCATCAAACCCTGGAAACAATAAGACATTCATCATTGACCTCGTGGCCCAGCTCAGGAGGAGGCTGCCTGCCAGGAGGGGAGGAAAGAAACAGAAGCACATAGCTAAATGCCCTTCCTGTGATTCGTATGAGAAAAGGACACCCAAAGAATTCCTAGAAAGACTAAAATGGCTCCTTCAAAAGATGATTCATCAGCATCTCTCCTAG
33	muIL-7	NM_008371.5	ATGTTCCATGTTTCTTTTAGATATATCTTTGGAATTCCTCCACTGATCCTTGTTCTGCTGCCTGTCACATCATCTGAGTGCCACATTAAAGACAAAGAAGGTAAAGCATATGAGAGTGTACTGATGATCAGCATCGATGAATTGGACAAAATGACAGGAACTGATAGTAATTGCCCGAATAATGAACCAAACTTTTTTAGAAAACATGTATGTGATGATACAAAGGAAGCTGCTTTTCTAAATCGTGCTGCTCGCAAGTTGAAGCAATTTCTTAAAATGAATATCAGTGAAGAATTCAATGTCCACTTACTAACAGTATCACAAGGCACACAAACACTGGTGAACTGCACAAGTAAGGAAGAAAAAAACGTAAAGGAACAGAAAAAGAATGATGCATGTTTCCTAAAGAGACTACTGAGAGAAATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGAAGGGCAGTATATAA
34	mu4-1BB-L (tnfsf9)	NM_009404.3	ATGGACCAGCACACACTTGATGTGGAGGATACCGCGGATGCCAGACATCCAGCAGGTACTTCGTGCCCCTCGGATGCGGCGCTCCTCAGAGATACCGGGCTCCTCGCGGACGCTGCGCTCCTCTCAGATACTGTGCGCCCCACAAATGCCGCGCTCCCCACGGATGCTGCCTACCCTGCGGTTAATGTTCGGGATCGCGAGGCCGCGTGGCCGCCTGCACTGAACTTCTGTTCCCGCCACCCAAAGCTCTATGGCCTAGTCGCTTTGGTTTTGCTGCTTCTGATCGCCGCCTGTGTTCCTATCTTCACCCGCACCGAGCCTCGGCCAGCGCTCACAATCACCACCTCGCCCAACCTGGGTACCCGAGAGAATAATGCAGACCAGGTCACCCCTGTTTCCCACATTGGCTGCCCCAACACTACACAACAGGGCTCTCCTGTGTTCGCCAAGCTACTGGCTAAAAACCAAGCATCGTTGTGCAATACAACTCTGAACTGGCACAGCCAAGATGGAGCTGGGAGCTCATACCTATCTCAAGGTCTGAGGTACGAAGAAGACAAAAAGGAGTTGGTGGTAGACAGTCCCGGGCTCTACTACGTATTTTTGGAACTGAAGCTCAGTCCAACATTCACAAACACAGGCCACAAGGTGCAGGGCTGGGTCTCTCTTGTTTTGCAAGCAAAGCCTCAGGTAGATGACTTTGACAACTTGGCCCTGACAGTGGAACTGTTCCCTTGCTCCATGGAGAACAAGTTAGTGGACCGTTCCTGGAGTCAACTGTTGCTCCTGAAGGCTGGCCACCGCCTCAGTGTGGGTCTGAGGGCTTATCTGCATGGAGCCCAGGATGCATACAGAGACTGGGAGCTGTCTTATCCCAACACCACCAGCTTTGGACTCTTTCTTGTGAAACCCGACAACCCATGGGAATGA
35	muIgGk信號肽-mu IL-15Ra sushi (aa34-103)-GS連接子-IL-15 (aa49-162)	不可獲得	ATGGAGACCGACACCTTGCTATTGTGGGTTTTGCTTCTGTGGGTCCCCGGCAGCACTGGGGACACCACATGTCCTCCACCGGTGAGCATCGAGCACGCAGATATCAGAGTCAAAAACTATAGCGTGAACTCAAGGGAGAGATATGTGTGCAATTCTGGATTCAAGAGGAAGGCCGGTACCTCTACCCTGATCGAATGTGTTATCAACAAGAACACCAATGTGGCACACTGGACTACACCTTCTCTTAAATGTATACGCGACCCTTCCCTTGCCGGTGGATCCGGGGGATCCGGCGGATCCGGAGGGAGCGGAGGGAGTGGGGGTAGTGGGGGAAATTGGATTGACGTGAGGTATGATCTAGAGAAGATTGAATCCCTGATTCAATCCATCCATATTGACACAACTCTGTATACCGACTCAGACTTCCACCCGTCCTGTAAGGTGACCGCAATGAATTGCTTTCTGTTGGAACTTCAAGTAATCCTTCATGAATATAGCAACATGACGCTGAACGAGACCGTGAGGAACGTGCTCTACCTGGCGAATTCCACACTTTCTTCCAACAAGAACGTCGCGGAGTCAGGATGTAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAAAAGACCTTCACAGAGTTCCTCCAGAGTTTTATTAGGATCGTACAGATGTTCATCAACACATCCTGA
36	muIL-18 WT	NM_008360.2	ATGGCTGCCATGTCAGAAGACTCTTGCGTCAACTTCAAGGAAATGATGTTTATTGACAACACGCTTTACTTTATACCTGAAGAAAATGGAGACCTGGAATCAGACAACTTTGGCCGACTTCACTGTACAACCGCAGTAATACGGAATATAAATGACCAAGTTCTCTTCGTTGACAAAAGACAGCCTGTGTTCGAGGATATGACTGATATTGATCAAAGTGCCAGTGAACCCCAGACCAGACTGATAATATACATGTACAAAGACAGTGAAGTAAGAGGACTGGCTGTGACCCTCTCTGTGAAGGATAGTAAAATGTCTACCCTCTCCTGTAAGAACAAGATCATTTCCTTTGAGGAAATGGATCCACCTGAAAATATTGATGATATACAAAGTGATCTCATATTCTTTCAGAAACGTGTTCCAGGACACAACAAGATGGAGTTTGAATCTTCACTGTATGAAGGACACTTTCTTGCTTGCCAAAAGGAAGATGATGCTTTCAAACTCATTCTGAAAAAAAAGGATGAAAATGGGGATAAATCTGTAATGTTCACTCTCACTAACTTACATCAAAGTTAG
37	高斯信號肽-muIL-18	不可獲得	ATGGGAGTGAAAGTTCTTTTTGCCCTTATTTGTATTGCTGTGGCCGAGGCCAACTTCGGCCGCCTGCACTGCACTACCGCCGTGATCAGAAACATCAACGATCAGGTGCTTTTCGTGGATAAGCGCCAGCCCGTGTTTGAGGATATGACTGACATTGATCAGAGCGCCTCTGAGCCACAGACCCGCCTGATTATCTATATGTATAAGGACTCCGAAGTCAGAGGCCTTGCGGTTACTCTGTCCGTGAAGGACTCCAAGATGTCTACGCTGTCCTGTAAGAATAAGATTATCAGCTTCGAAGAGATGGACCCTCCAGAGAACATCGACGATATTCAGAGCGATCTTATCTTTTTCCAGAAGCGTGTGCCCGGCCATAACAAGATGGAGTTTGAATCTAGTCTGTATGAGGGACACTTCCTGGCCTGCCAGAAGGAGGACGATGCGTTCAAGCTGATCCTGAAGAAAAAGGACGAAAACGGCGATAAGAGTGTCATGTTCACCCTGACGAATCTTCACCAATCT
38	muIL-18突變CS2（誘餌受體）	不可獲得	ATGGCTGCCATGTCAGAAGACTCTTGCGTCAACTTCAAGGAAATGATGTTTATTGACAACACGCTTTACTTTATACCTGAAGAAAATGGAGACCTGGAATCAGACCATTTTGGCCGACTTCACTGTACAACCGCAGTAATACGGAATATAAATGACCAAGTTCTCTTCGTTGACAAAAGACAGCCTGTGTTCGAGGATATGACTGATATTGATCAAAGTGCCAGTGAACCCCAGACCAGACTGATAATATACGCGTACGGCGACAGTCGCGCCAGAGGAAAAGCTGTGACCCTCTCTGTGAAGGATAGTAAAATGTCTACCCTCTCCTGTAAGAACAAGATCATTTCCTTTGAGGAAATGGATCCACCTGAAAATATTGATGATATACAAAGTGATCTCATATTCTTTCAGAAACGTGTTCCAGGACACAACAAGATGGAGTTTGAATCTTCACTGTATGAAGGACACTTTCTTGCTTGCCAAAAGGAAGATGATGCTTTCAAACTCATTCTGAAAAAAAAGGATGAAAATGGGGATAAATCTGTAATGTTCACTCTCACTAACTTACATCAAAGTTAG
39	高斯信號肽-muIL-18突變CS2（誘餌受體）	不可獲得	ATGGGAGTGAAAGTTCTTTTTGCCCTTATTTGTATTGCTGTGGCCGAGGCCCACTTCGGCCGCCTGCATTGCACGACCGCAGTTATTCGCAATATTAACGACCAGGTCCTGTTCGTCGACAAGCGCCAGCCGGTGTTCGAGGACATGACAGACATCGACCAGTCAGCTAGCGAACCCCAGACAAGATTGATTATCTACGCGTACGGCGACTCACGCGCTAGGGGCAAAGCCGTGACCCTGAGCGTGAAAGATTCTAAGATGAGTACTCTGAGCTGTAAGAACAAGATTATCTCTTTCGAAGAGATGGACCCTCCAGAGAACATCGACGATATCCAGAGTGACTTGATTTTTTTCCAGAAGAGAGTGCCCGGACACAACAAGATGGAGTTTGAATCTAGCCTGTATGAGGGCCACTTCCTGGCATGTCAGAAGGAGGATGACGCGTTTAAACTGATCCTGAAGAAAAAGGACGAAAACGGGGATAAGAGCGTGATGTTCACTCTGACTAACCTCCACCAGTCC
40	muCCL5	NM_013653.3	ATGAAGATCTCTGCAGCTGCCCTCACCATCATCCTCACTGCAGCCGCCCTCTGCACCCCCGCACCTGCCTCACCATATGGCTCGGACACCACTCCCTGCTGCTTTGCCTACCTCTCCCTCGCGCTGCCTCGTGCCCACGTCAAGGAGTATTTCTACACCAGCAGCAAGTGCTCCAATCTTGCAGTCGTGTTTGTCACTCGAAGGAACCGCCAAGTGTGTGCCAACCCAGAGAAGAAGTGGGTTCAAGAATACATCAACTATTTGGAGATGAGCTAG
41	muCCL19	NM_011888.4	ATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCCTGGCCTTCAGCCTGCTGGTTCTCTGGACCTTCCCAGCCCCAACTCTGGGGGGTGCTAATGATGCGGAAGACTGCTGCCTGTCTGTGACCCAGCGCCCCATCCCTGGGAACATCGTGAAAGCCTTCCGCTACCTTCTTAATGAAGATGGCTGCAGGGTGCCTGCTGTTGTGTTCACCACACTAAGGGGCTATCAGCTCTGTGCACCTCCAGACCAGCCCTGGGTGGATCGCATCATCCGAAGACTGAAGAAGTCTTCTGCCAAGAACAAAGGCAACAGCACCAGAAGGAGCCCTGTGTCTTGA
42	muCXCL9	NM_008599.4	ATGAAGTCCGCTGTTCTTTTCCTCTTGGGCATCATCTTCCTGGAGCAGTGTGGAGTTCGAGGAACCCTAGTGATAAGGAATGCACGATGCTCCTGCATCAGCACCAGCCGAGGCACGATCCACTACAAATCCCTCAAAGACCTCAAACAGTTTGCCCCAAGCCCCAATTGCAACAAAACTGAAATCATTGCTACACTGAAGAACGGAGATCAAACCTGCCTAGATCCGGACTCGGCAAATGTGAAGAAGCTGATGAAAGAATGGGAAAAGAAGATCAGCCAAAAGAAAAAGCAAAAGAGGGGGAAAAAACATCAAAAGAACATGAAAAACAGAAAACCCAAAACACCCCAAAGTCGTCGTCGTTCAAGGAAGACTACATAA
43	muXCL1	NM_008510.2	ATGAGACTTCTCCTCCTGACTTTCCTGGGAGTCTGCTGCCTCACCCCATGGGTTGTGGAAGGTGTGGGGACTGAAGTCCTAGAAGAGAGTAGCTGTGTGAACTTACAAACCCAGCGGCTGCCAGTTCAAAAAATCAAGACCTATATCATCTGGGAGGGGGCCATGAGAGCTGTAATTTTTGTCACCAAACGAGGACTAAAAATTTGTGCTGATCCAGAAGCCAAATGGGTGAAAGCAGCGATCAAGACTGTGGATGGCAGGGCCAGTACCAGAAAGAACATGGCTGAAACTGTTCCCACAGGAGCCCAGAGGTCCACCAGCACAGCGATAACCCTGACTGGGTAA
44	muXCL1-V21C/A59C	不可獲得	ATGAGACTGCTGCTGCTGACATTCCTGGGCGTGTGCTGTCTGACACCCTGGGTTGTCGAAGGCGTGGGAACAGAGGTGCTGGAAGAGTCCAGCTGCGTGAATCTGCAGACCCAGAGACTGCCCTGCCAGAAGATCAAGACCTACATCATCTGGGAGGGCGCCATGAGAGCCGTGATCTTCGTGACAAAGAGAGGCCTGAAGATCTGCGCCGATCCTGAGGCCAAATGGGTCAAAGCCTGCATCAAGACCGTGGACGGCAGAGCCAGCACCAGAAAGAACATGGCCGAGACAGTGCCTACAGGCGCCCAGAGATCTACCAGCACAGCCATCACACTGACCGGCTAA
45	muIL-28A（干擾素λ 2）	NM_001024673.2	ATGCTCCTCCTGCTGTTGCCTCTGCTGCTGGCCGCAGTGCTGACAAGAACCCAAGCTGACCCTGTCCCCAGGGCCACCAGGCTCCCAGTGGAAGCAAAGGATTGCCACATTGCTCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCAAAAGAGCTGCAGGCCTTCAAAAAGGCCAAGGATGCCATCGAGAAGAGGCTGCTTGAGAAGGACCTGAGGTGCAGTTCCCACCTCTTCCCCAGGGCCTGGGACCTGAAGCAGCTGCAGGTCCAAGAGCGCCCCAAGGCCTTGCAGGCTGAGGTGGCCCTGACCCTGAAGGTCTGGGAGAACATGACTGACTCAGCCCTGGCCACCATCCTGGGCCAGCCTCTTCATACACTGAGCCACATTCACTCCCAGCTGCAGACCTGTACACAGCTTCAGGCCACAGCAGAGCCCAGGTCCCCGAGCCGCCGCCTCTCCCGCTGGCTGCACAGGCTCCAGGAGGCCCAGAGCAAGGAGACCCCTGGCTGCCTGGAGGCCTCTGTCACCTCCAACCTGTTTCGCCTGCTCACCCGGGACCTCAAGTGTGTGGCCAATGGAGACCAGTGTGTCTG
46	muIL-28B（干擾素λ 3）	NM_177396.1	ATGCTCCTCCTGCTGTTGCCTCTGCTGCTGGCCGCAGTGCTGACAAGAACCCAAGCTGACCCTGTCCCCAGGGCCACCAGGCTCCCAGTGGAAGCAAAGGATTGCCACATTGCTCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCAAAAGAGCTGCAGGCCTTCAAAAAGGCCAAGGGTGCCATCGAGAAGAGGCTGCTTGAGAAGGACATGAGGTGCAGTTCCCACCTCATCTCCAGGGCCTGGGACCTGAAGCAGCTGCAGGTCCAAGAGCGCCCCAAGGCCTTGCAGGCTGAGGTGGCCCTGACCCTGAAGGTCTGGGAGAACATAAATGACTCAGCCCTGACCACCATCCTGGGCCAGCCTCTTCATACACTGAGCCACATTCACTCCCAGCTGCAGACCTGTACACAGCTTCAGGCCACAGCAGAGCCCAAGCCCCCGAGTCGCCGCCTCTCCCGCTGGCTGCACAGGCTCCAGGAGGCCCAGAGCAAGGAGACTCCTGGCTGCCTGGAGGACTCTGTCACCTCCAACCTGTTTCAACTGCTCCTCCGGGACCTCAAGTGTGTGGCCAGTGGAGACCAGTGTGTCTGA

實施例

現將藉助於以下合成及生物實施例說明本發明，該等實施例不以任何方式限制本發明之範圍。 材料及方法 ： mRNA 試管內轉錄

藉由T7介導之轉錄自經線性化之DNA模板（peTheRNAvs3載體）試管內製備編碼多種細胞介素（IL-21、IL-7及IL-15sushi）、共刺激性分子（mu4-1BBL）或螢火蟲螢光素酶或奈米螢光素酶之mRNA，其合併有5'端及3'端UTR及聚A尾。最終mRNA使用端帽1且用N1-甲基-假-尿苷100%置換尿苷。 基於 mRNA 脂質之奈米粒子合成及純化

基於脂質之奈米粒子係藉由使用NanoAssemblr Benchtop（Precision Nanosystems）以9 mL/min之速度，將於乙酸鈉緩衝液中之mRNA溶液（100 mM，pH4）及脂質溶液以2:1之體積比進行微流混合來產生。脂質溶液含有適合之可離子化脂質、DSPC（Avanti）、膽固醇（Sigma）及DMG-PEG2000（Sunbright GM-020，NOF公司）之混合物。以50/10/38.5/1.5之標準比率混合4種脂質（可離子化脂質、輔助型脂質、膽固醇、PEG脂質）。使用slide-a-lyzer透析盒（20K MWCO，3 mL，ThermoFisher）針對TBS來透析LNP（TBS體積比LNP體積大10000倍）。用Zetasizer Nano（Malvern）量測尺寸、聚合度分佈性及ζ電位。藉由標準Ribogreen RNA分析法（Invitrogen）來量測mRNA囊封。 細胞 株 ：

包括生長培養基、轉種比率及培養基更新建議之最佳培養條件概述於下文中。為了收集貼附型細胞，丟棄用過之生長培養基且用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）（Sigma）沖洗細胞兩次，隨後添加胰蛋白酶-EDTA（0.05%）（Gibco，Thermo Fisher Scientific）以使細胞鬆散。需要每2至3天，在細胞達到約70%匯合度（confluency）時進行培養基更新。使用Vi-Cell XR細胞存活率分析儀（Beckman Coulter）測定細胞存活率。 表 4. 細胞類型特異性培養條件

細胞類型	描述	來源	生長培養基	轉種
MC38	貼附型之小鼠大腸纖維母細胞	Kerafast	DMEM高葡萄糖+2 mM L-麩醯胺酸+100單位青黴素+40.1 mg/ml之克拉黴素（均來自Sigma）+10% FBS（PAN）	1:4至1:10

縮寫：DMEM：達爾伯克氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）；FBS：胎牛血清 腫瘤接種及 腫 瘤內注射

在 C57/BL6小鼠中接種MC38腫瘤細胞。雌性C57BL/6J小鼠係購自Charles River Laboratories（法國）且圈養於含有標準墊料之個別通風籠具中。動物係根據機構（UGhent）及歐盟動物實驗指南（European Union guidelines for animal experimentation）進行維持及處理。小鼠能任意獲取食物及水。實驗在小鼠為大約7至9週齡時開始。為了準備皮下腫瘤接種，使用2.5%異氟醚麻醉小鼠且將注射部位刮毛。注射部位通常位於左下腹之後側/外側上。出於接種目的，細胞需要培養約1週且在解凍之後其介於第3代與第5代之間。將冷的腫瘤細胞溶液以0.5×10e6個細胞/50微升PBS之劑量皮下注射至左側腹中。使用測徑規裝置（Caliper device）每2至3天量測腫瘤生長。使用以下公式來計算腫瘤尺寸：（腫瘤寬度×腫瘤寬度×腫瘤長度）/2。當腫瘤達到50至100 mm³之平均體積時，將小鼠隨機分配至媒劑（vehicle）治療組及mRNA治療組中（每組8至10隻小鼠）且開始治療。使用U-100胰島素針（BD Biosciences, San Diego, CA, USA），以單一藥物療法（或組合療法）形式將腫瘤與含有mRNA之LNP（於20 µl TBS緩衝液中之5至15 µg mRNA劑量）或對照緩衝液（TBS）一起注射。在注射之後，持續監測小鼠5至10分鐘直至完全甦醒而未顯示任何疼痛或併發症之跡象。在治療之後，每隔一天監測小鼠且每週2至3次用測徑規量測腫瘤體積且隨後量測體重。

對於組合療法，亦在s-Ac7-犬LNP中調配編碼不同細胞介素之mRNA。當腫瘤體積達到50至75 mm ³時，用3個腫瘤內劑量之mRNA（10 μg或15 µg總mRNA/劑量；如所指示）治療動物。在隨機分組當天（DR）、DR+3及DR+7注射劑量。用等效劑量之無關mRNA（NanoLuc）治療對照動物。使用測徑規在指定時間點量測腫瘤體積且以立方毫米記錄。測試IL-21與其他免疫調節分子（諸如Il-7、IL-15sushi、4-1BBL）之組合的組合療法之功效。 數據分析

所有原始數據均使用Graph Pad Prism版本7軟體進行分析。 結果 實施例 1- 在 MC38 （ 大腸癌 ） 模型中之 mRNA 單一藥物療法功效

在MC38大腸腺癌模型中評估了使用IL-21 mRNA單一藥物療法之單一藥物療法功效。在C57BL/6小鼠中皮下建立了5×10 ⁵個MC-38大腸腫瘤細胞。如M&M中所描述來製備編碼IL-21之mRNA及作為無關分子之編碼Fluc之mRNA且調配於LNP中。當腫瘤體積達到50至75 mm ³時，用3個腫瘤內劑量之mRNA（15 μg總mRNA/劑量）治療動物。在隨機分組當天（DR）、DR+3及DR+7注射劑量。用等效劑量之陰性對照mRNA治療對照動物。使用測徑規在指定時間點量測腫瘤體積且以立方毫米記錄。

在用Fluc mRNA對照物（3×15 µg總mRNA/劑量）進行治療之8名個體中之2名（20%）中觀測到完全反應（「CR」）（ 圖 1A）。用IL-21 mRNA（3×15 μg總mRNA/劑量）進行之治療在8名個體中之6名（75%）中引發完全反應（ 圖 1B）。 圖 1C、 圖 1D及 圖 1E分別展示IL-7、4-1BBL或IL-15sushi mRNA單一藥物療法治療（3×15 μg總mRNA/劑量）之功效不足。類似於對照組，在用IL-15sushi進行治療之8名個體中之2名（20%）中觀測到完全反應（「CR」）（ 圖 1E）。 實施例 2- 組合 mRNA 療法在 MC38 （ 大腸癌 ） 模型中之協同功效 IL-7 及 IL-21

將IL-7添加至編碼IL-21之mRNA中增加在MC38大腸癌模型中之治療功效。用NanoLuc mRNA對照物（3×10 μg mRNA）進行之治療表明功效不足（ 圖 2A）。用編碼IL-21之mRNA單一藥物療法（3×5 μg總mRNA/劑量）及填充劑RNA NanoLuc（3×5 µg總mRNA/劑量）進行之治療表明8名個體中之2名（20%）出現完全反應（「CR」）且8隻動物中之2隻（20%）出現部分反應（ 圖 2B）。用編碼IL-7之mRNA單一藥物療法（3×5 μg總mRNA/劑量）及填充劑RNA NanoLuc（3×5 µg總mRNA/劑量）進行之治療表明8名個體中之1名（20%）出現完全反應（「CR」）且8隻動物中之2隻（20%）出現部分反應（ 圖 2C）。

用編碼IL-7及IL-21之mRNA（各3×5 μg；10 µg總mRNA/劑量）進行之組合療法在8名個體中之3名（37.5%）中引起完全反應（「CR」）且在8隻動物中之2隻（20%）中引起部分反應（ 圖 2D）。數據表明當與單一藥物療法治療相比時，IL-21/IL-7組合產生改良之功效。 IL-15sushi 及 IL-21

用編碼IL-21及IL-15sushi mRNA之mRNA（各3×7.5 μg；15 µg總mRNA/劑量）進行之治療似乎不會增加在MC38大腸癌模型中之治療功效，其在單獨用IL-21時觀測到（對應 圖 3B及 圖 3A）。在兩種治療療法中，在8隻動物中之6隻（75%）中觀測到完全反應。 IL-7 、 4-1BBL 及 IL-21

合併使用編碼IL-21、IL-7及4-1BBL（3×5 μg各mRNA/劑量）之mRNA在所有動物中均引起100%反應（ 圖 3C）。 IL-15sushi 、 4-1BBL 及 IL-21

合併使用編碼IL-21、IL-15sushi及4-1BBL之mRNA（3×5 μg各mRNA/劑量）在8隻動物中之6隻（75%）中產生完全反應（ 圖 3D）。 實施例 3- 在用 IL-21 單一藥物療法或基於 IL-21 之混合療法治療之後全身性記憶免疫反應之產生

評估用IL-21單一藥物療法或組合API療法治療之動物中之記憶免疫反應。用IL-21單一藥物療法治療接種有5×10 ⁵MC38腫瘤細胞之小鼠。如先前實施例中所描述，腫瘤內注射十五微克之總mRNA（3次）。在腫瘤接種後第80天，在相對側用5×10 ⁵個MC38大腸腫瘤經再攻擊來自治療組之完全反應者。作為對照，12隻未經治療之動物亦注射MC38癌症。 在用 IL-21 單一藥物療法治療之後

未經治療之動物（n=12）不能夠控制腫瘤生長（ 圖 4A）。相比之下，用相同癌細胞經再攻擊接受腫瘤內治療之完全反應動物（n=6），至少直至接種後第22天在任何經再攻擊之小鼠（6隻動物中之6隻）中未觀測到腫瘤生長（ 圖 4B）。對於用單一藥物療法IL-21治療之小鼠，觀測到在局部療法之後產生全身性抗癌記憶。 在組合 API 治療之後

用相同癌細胞經再攻擊接受腫瘤內治療之完全反應動物，至少直至接種後第26天在任何經再攻擊之小鼠中未觀測到腫瘤生長：在IL-21/4-1BBL/IL-15sushi治療組中之6隻動物中之6隻（ 圖 4C）及在IL-21/4-1BBL/IL-7治療組中之8隻動物中之8隻（ 圖 4D）。此等結果表明，編碼IL-21/4-1BBL/IL-15sushi或IL-21/4-1BBL/IL-7之mRNA之腫瘤內注射誘導具有抗腫瘤功效之記憶免疫反應。 實施例 4- 在 MC38 （ 大腸癌 ） 模型中之 IL-21 與 IL-7 及 4-1BBL mRNA 療法在 10 µg 劑量下之協同功效

在MC38大腸腺癌模型中評估單一藥物療法對比2或3種mRNA之組合療法。在C57BL/6小鼠中皮下建立5×10 ⁵MC-38大腸腫瘤細胞。編碼ntrIL-21（非轉譯IL-21）、IL-21、IL-7及4-1BBL之mRNA係如M&M中所描述來製備且調配於LNP中。當腫瘤體積達到50至75 mm ³時，動物用3次腫瘤內劑量之mRNA（每劑量1 API之3.33 μg mRNA，每劑量2 API之6.66 μg mRNA及每劑量3 API之10 μg總mRNA）治療。在隨機分組當天（DR）、DR+3及DR+7注射劑量。用等效劑量之非轉譯IL-21 mRNA治療對照動物。使用測徑規在指定時間點量測腫瘤體積且以立方毫米記錄。

用IL-21 mRNA（3×3.3 μg總mRNA/劑量）進行之治療在7名個體中之3名（42%）中引起完全反應（「CR」）且在7隻動物中之1隻（14%）中引起部分反應（ 圖 5B）。IL-7或4-1BBL mRNA單一藥物療法進行之治療（3×3.33 μg總mRNA/劑量）表明對於經TBS、空LNP及非轉譯之IL-21 mRNA LNP治療之動物的功效不足（ 圖 5A）。

用編碼IL-21及IL-7之mRNA（各3×3.33 μg；6.66 µg總mRNA/劑量）進行之組合療法在7名個體中之4名（57%）中引起完全反應且在7隻動物中之2隻（28%）中引起部分反應（ 圖 5C）。數據表明當與單一藥物療法治療相比時，IL-21/IL-7組合產生改良之功效。合併編碼IL-21及4-1BBL之mRNA或編碼IL-7及4-1BBL之mRNA似乎不會顯著增加7名中有一名CR（14%）之MC38大腸癌模型中之治療功效（ 圖 5C）。

合併編碼所有3種分子（IL-21、IL-7及4-1BBL）之mRNA（3×3.33 μg各mRNA/劑量，10 µg總mRNA/劑量）產生85%之反應速率（ 圖 5D）。 參考文獻

Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. & Weissman, D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Res. 39, e142 (2011)。此研究表明純化IVT mRNA以實現有效蛋白質轉譯及遏制發炎反應之重要性。

無

[ 圖 1.] 在 MC38 大腸 （ 大腸癌 ） 模型中 用 IL-21 、 IL-7 、 IL-15sushi 或 4-1BBL 進行 之 mRNA 單一藥物療法。展示在隨機分組之後量測腫瘤時的各時間點之腫瘤體積（mm ³）。圖A展示在隨機分組後第0天、第3天及第7天用螢火蟲螢光素酶mRNA對照物（在LNP中調配之3×15 μg mRNA/劑量）進行之治療，而圖B、圖C、圖D、圖E展示在相同劑量及治療方案下用分別編碼IL-21同功異構物2、IL-7、4-1BBL及IL-15sushi之mRNA進行之治療。對於對照組及IL-15sushi，在8名個體中之2名（20%）中觀測到完全反應（「CR」），而用IL-21 mRNA進行之治療則在8隻動物中之6隻（75%）中引發完全反應。用IL-7或4-1BBL進行治療之單一藥物療法表明其對腫瘤體積無影響。 [ 圖 2.] 在 MC38 （ 大腸癌 ） 模型中用 IL-7 及 IL-21 進行 之組合 mRNA 療法。展示在隨機分組之後量測腫瘤時的各時間點之腫瘤體積（mm ³）。圖A展示在隨機分組後第0天、第3天及第7天用NanoLuc mRNA對照物（在LNP中調配之3×10 μg mRNA/劑量）進行之治療，而圖B及圖C展示用具有分別編碼IL-21或IL-7之mRNA（對於各mRNA/劑量，3×5 μg之減少劑量）的NanoLuc對照mRNA進行之治療。圖D表示用編碼IL-7及IL-21之mRNA（對於各mRNA/劑量，3×5 μg之劑量）進行之組合療法。 [ 圖 3.] 在 MC38 （ 大腸癌 ） 模型中用 IL-15sushi 及 IL-21 進行之組合 mRNA 療法。展示在隨機分組之後量測腫瘤時的各時間點之腫瘤體積（mm ³）。圖A展示用編碼IL-21之mRNA（3×15 μg總mRNA/劑量）進行治療之單一藥物療法，而圖B展示用編碼IL-21及IL-15sushi mRNA之mRNA（3×7.5 μg各mRNA/劑量）進行之組合療法；圖C展示用編碼IL-21、IL-7及4-1BBL mRNA之mRNA（3×5 μg各mRNA/劑量）進行之組合療法，且圖D展示用編碼IL-21、4-1BBL及IL-15 sushi之mRNA（3×5 μg各mRNA/劑量）進行之組合療法。 [ 圖 4.] 在用 IL-21 單一藥物療法或基於 IL 之混合療法治療之後全身性記憶免疫反應之產生。展示在隨機分組之後量測腫瘤時的各時間點之腫瘤體積（mm ³）。評估用IL-21單一藥物療法之療法（圖A及圖B）或組合療法（圖C及圖D）治療之動物中之記憶免疫反應的存在。圖A描繪重新注射MC238癌細胞株之未經治療之動物（n=12）的腫瘤生長。圖B描繪先前用Il-21單一藥物療法來治療之經再攻擊（rechallenged）小鼠（n=6）中之腫瘤生長；圖C描繪先前用IL-21/4-1BBL/IL-15sushi之組合療法治療之經再攻擊小鼠（n=6）中之腫瘤生長。圖D描繪先前用IL-21/4-1BBL/IL-7之組合療法來治療之經再攻擊小鼠（n=8）中之腫瘤生長。 [ 圖 5.] 在用 IL-21 單一藥物療法或基於 IL 之混合療法治療之後全身性記憶免疫反應之產生。展示在隨機分組之後量測腫瘤時的各時間點之腫瘤體積（mm ³）。圖A描繪經TBS、空LNP及未轉譯之IL-21 mRNA LNP治療之動物的腫瘤生長。圖B描繪經IL-21、IL-7或4-1BBL mRNA LNP治療之動物的腫瘤生長。圖C描繪用IL-21/IL-7 mRNA LNP組合、IL21/4-1BBL mRNA LNP組合或IL-7/4-1BBL mRNA LNP組合進行治療之動物的腫瘤生長。圖D描繪IL-21/IL-7/4-1BBL mRNA LNP組合之腫瘤生長。

Claims (18)

1. 一種組成物，其包含一或多種編碼功能性免疫刺激性蛋白質IL-21且編碼共刺激性分子之經分離之非病毒核酸分子。
2. 如請求項1之組成物，其中該共刺激性分子係選自包含以下之清單：4-1BBL、OX40L、ICOS配體及CD40L；尤其係4-1BBL。
3. 如請求項1或2之組成物，其進一步包含一或多種編碼細胞介素及/或趨化介素之核酸分子。
4. 如請求項3之組成物，其中： 該細胞介素係選自包含以下之清單：IL-7、IL-12、IL-18、IFNλ、IL-15sushi、IL-23、I型IFN、II型IFN、III型IFN；及/或 該趨化介素係選自包含以下之清單：CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CCL5及XCL1。
5. 如請求項1或4中任一項之組成物，其進一步包含標靶特異性抗原及/或檢查點抑制劑中之一或多者。
6. 如請求項5之組成物，其中該標靶特異性抗原為腫瘤相關抗原或新抗原。
7. 如請求項5之組成物，其中該檢查點抑制劑係選自包含以下之清單：PD-1、PD-L1、CTLA4、TIGIT、TIM3、LAG6及VISTA之抑制性分子；較佳為PD-1、PD-L1或CTLA4之抑制性分子。
8. 如請求項1之組成物，其包含一或多種編碼以下組合中之任一者的經分離之非病毒核酸分子：  IL-21、4-1BBL及IL-7； IL-21、4-1BBL及IL-15sushi； IL-21、4-1BBL及IL-18；或 IL-21、4-1BBL及IFNλ。
9. 如請求項1至8中任一項之組成物，其中該一或多種核酸分子為線性或環狀核酸。
10. 如請求項1至9中任一項之組成物，其中該一或多種核酸分子係選自包含RNA及DNA之群，較佳為RNA，更佳為mRNA。
11. 如請求項1至10中任一項之組成物，其中該一或多種核酸分子包含以下中之一或多者：5'端帽（5'CAP）、聚（A）尾及/或經修飾之核苷；該經修飾之核苷較佳為N1-甲基假尿苷。
12. 如請求項1至11中任一項之組成物，其中該一或多種核酸分子係呈裸核酸分子或囊封於奈米粒子，諸如脂質奈米粒子或聚合物奈米粒子，尤其脂質奈米粒子中之核酸形式。
13. 一種脂質奈米粒子，其包含如請求項1至12中任一項之組成物。
14. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至12中任一項之組成物或如請求項13之脂質奈米粒子及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
15. 如請求項1至12中任一項之組成物、如請求項13之脂質奈米粒子或如請求項14之醫藥調配物，其係用於非經腸投予，更特定言之，用於靜脈內、腫瘤內、皮內、腹膜內、肌肉內或淋巴結內投予，較佳為腫瘤內投予。
16. 如請求項1至12中任一項之組成物、如請求項13之脂質奈米粒子或如請求項14之醫藥調配物，其係用於人類醫學或獸醫學中。
17. 如請求項1至12中任一項之組成物、如請求項13之脂質奈米粒子或如請求項14之醫藥調配物，其係與包括放射線療法、靶向療法及化學療法之標準照護癌症療法組合使用。
18. 如請求項1至12中任一項之組成物、如請求項13之脂質奈米粒子或如請求項14之醫藥調配物，其係用於預防及/或治療細胞增殖病症。