TW202330026A - 用於療法之抗btn3a活化抗體及il2促效劑之組合 - Google Patents
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Abstract
本申請案係關於抗BTN3A活化抗體及IL-2促效劑之治療組合，其尤其適用於治療癌症。本發明更特定言之關於BTN3A活化抗體與IL-2促效劑之組合使用，該BTN3A活化抗體與BTN3A特異性結合且活化Vγ9Vδ2 T細胞之溶胞功能，該IL-2促效劑與IL-2受體βγ
c異二聚體結合但為α不依賴性。本申請案進一步關於一種治療癌症之方法，其包含投與和IL-2促效劑組合之抗BTN3A活化抗體，該IL-2促效劑與該IL-2受體βγ
c異二聚體結合但為α不依賴性。
Description
下文揭示抗BTN3A活化抗體與IL-2促效劑之治療組合，其尤其適用於治療癌症。本發明更特定言之關於BTN3A活化抗體與非天然存在之IL-2促效劑之組合使用，該BTN3A活化抗體與BTN3A特異性結合且活化Vγ9Vδ2T細胞之溶胞功能，該IL-2促效劑與IL-2受體βƔ
c異二聚體結合但為α不依賴性。
白血球為參與保衛身體對抗病原體之免疫系統的細胞。在此等細胞之中，可列舉淋巴球、單核球及樹突狀細胞。單核球可自血流轉移至其他組織且分化成組織駐留巨噬細胞或樹突狀細胞中。樹突狀細胞起活化淋巴球之抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)的作用。在淋巴球之中，T細胞可分為αβ T細胞及γδ T細胞。Vγ9Vδ2 (周邊血液中γδ T細胞之主要子集)為免疫防禦系統之重要效應子。其直接使受病原體感染的或異常細胞溶解。此外，其藉由誘導樹突狀細胞(dendritic cell，DC)成熟以及同型轉換及免疫球蛋白產生來調節免疫反應。免疫系統之此重要細胞子集由表面受體、趨化介素及細胞介素嚴格調節。
免疫學領域中之最新發現已指出嗜乳脂蛋白/類嗜乳脂蛋白分子(人類中之BTN/BTNL、小鼠中之Btn/Btnl)在調節γδ T細胞中的新興作用。特定言之，BTN3A蛋白(其屬於B7共刺激家族分子)已確認為藉由人類Vγ9Vδ2 T細胞感測磷酸抗原的關鍵介質。BTN3A，且尤其BTN3A1，可在磷酸抗原之情形下觸發Vγ9Vδ2 T細胞之活化(Harly C, 等人 Blood 2012 第120卷第11期第2269-79頁；Blazquez, J. L., 等人 Front Immunol 2018第9卷第1601頁)。
IL-2最初確認為用於保持T細胞穩態及適當免疫調節之關鍵組分(Nelson B等人 J Immunol 2004 第172卷第7期第3983-8頁)。IL-2 (Proleukin)作為癌症治療劑已有悠久歷史，其能夠引發一小部分患有轉移性腎細胞癌及轉移性黑色素瘤之患者的完全且持久緩解(Amin A等人 Oncology 2013第27卷第7期第680-91頁)。然而，高劑量IL-2療法與嚴重毒副作用相關，包括低血壓、血管滲漏症候群(vascular leak syndrome，VLS)、肝功能障礙及神經性病症(Schwartz R等人 Oncology 2002第16卷第11期增刊13第11-20頁)。因此，高劑量IL-2治療限於謹慎選擇之具有良好心肺功能之患者且僅在少數具有免疫療法經驗的中心中執行。
介白素-2受體(interleukin-2 receptor，IL-2R)為在某些免疫細胞(諸如淋巴球)表面上表現之異三聚體蛋白，其結合IL-2且對IL-2作出反應。IL-2R由三種不同蛋白之不同組合構成，通常稱為「鏈」：α (阿爾法) (亦稱為IL-2Rα，CD25)、β (貝塔) (亦稱為IL-2Rβ，或CD122)及Ɣ
c(伽馬) (亦稱為IL-2RƔ
c，CD132)。三個受體鏈分別及以不同方式在不同細胞類型上表現且可以不同組合及次序組裝以生成中等及高親和力IL-2受體。β與Ɣ鏈之組合形成以中等親和力結合IL-2的複合物且已知主要在記憶αβ T細胞及NK細胞上表現，然而全部三個受體鏈(α、β及γ)之組合形成以高親和力(Kd約10-11 M)結合IL-2的複合物，一般在經活化T細胞及調節T細胞(Treg)上表現。
早期研究表明T細胞為IL-2介導的毒性之關鍵細胞介質(Rosenstein M等人 J Immunol 1986 第137卷第5期第1735-42頁)。隨後，小鼠研究牽涉NK細胞(Peace D等人 J Exp Med 1989 第169卷第1期第161-73頁)及Treg穩態及功能之失調(Li Y等人 Nat Commun 2017 第8卷第1期第1762頁)。肺部內皮細胞亦展示表現功能性IL-2受體，表明其在VLS起始中之作用(Krieg C等人 Proc Natl Acad Sci U S A 2010 第107卷第26期第11906-11頁)。總而言之此等研究表明VLS之病因很複雜，其中造血及非造血細胞目標均可能參與。此外，如上文所提及，IL2藉由與IL-2R-α結合誘導免疫抑制性Treg的優先增殖，IL-2R-α在穩態下優先在此T細胞亞群上表現(Ahmadzadeh M等人 Blood 2006 第107卷第6期第2409-14頁)。Treg細胞之耗盡已展示增強IL-2誘導之抗腫瘤免疫力，表明Treg可能為IL-2介導之CTL擴增的主要障礙(Imai H等人 Cancer Sci 2007 第98卷第3期第416-23頁)。
總而言之，IL-2之較短活體內半衰期、嚴重毒性及擴增Treg細胞之傾向已限制其廣泛用於癌症治療。
先前研究已展示IL-2 (Proleukin®)在抗BTN3A抗體刺激(包括如WO2020025703中所描述之人類化抗BTN3A治療抗體)後促進Vγ9Vδ2 T細胞擴增。此可在臨床上有用，條件為在健康成年人類周邊血及癌症患者中Vγ9Vδ2 T細胞通常低於總T細胞之5%。與αβ T細胞相反，經活化Vγ9Vδ2 T細胞並不自身產生IL-2且因此需要外部來源以促進存活率及擴增。此外，促效劑抗BNT3A抗體觸發IL-2R (CD25)之α鏈在Vγ9Vδ2 T細胞上的表面表現增加。因此，假設與IL-2於組合將經由高親和力IL-2Rα上之IL-2結合促進Vγ9Vδ2 T細胞擴增。
出人意料地，本發明人現已展示使用與抗BTN3A促效劑抗體組合之IL-2Rα不依賴性促效劑(更具體地對IL-2 Rα具有消除的親和力或沒有結合位點之IL-2促效劑)不僅促進人類PBMC中之協同性及特異性Vγ9Vδ2 T細胞擴增且與臨床IL-2 (Proleukin®)相比亦顯著更穩固。此外，儘管用更高劑量的臨床IL-2保持Treg擴增，如本文所揭示之本發明抗BTN3A促效劑抗體與IL-2Rα不依賴性促效劑治療組合破壞免疫抑制性Treg之擴增。
由此本發明係關於抗BTN3A活化抗體與結合IL-2受體βƔ
c異二聚體之IL-2受體促效劑之治療組合，其用於治療有需要之個體的癌症；其中
IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含SEQ ID NO: 30中所述之胺基酸序列的肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含SEQ ID NO: 31中所述之胺基酸序列的肽；
(d) X4為包含SEQ ID NO: 32中所述之胺基酸序列的肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；及
其中多肽具有與IL-2天然多肽具有少於60%一致性的胺基酸序列。
或者，
IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含與序列KIQLHAEHALYDALMILNI (SEQ ID NO: 33)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含與序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG (SEQ ID NO: 34)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(d) X4為包含與序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間。
或者，
IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 37-49中任一項中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，以藉由表面電漿子共振所量測，抗BTN3A抗體以10 nM或更小之K
D，較佳地以5 nM或更小之K
D與人類BTN3A結合。
典型地，抗BTN3A抗體在與表現BTN3之細胞共培養中誘導γδ T細胞(典型地Vγ9Vδ2 T細胞)之活化，其中以在去顆粒檢驗中所量測EC
50低於5 µg/ml，較佳地1 µg/ml或更低。
在一些實施例中，抗BTN3A抗體：
- 包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；
- 包含SEQ ID NO: 12-14之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 15-17之LCDR 1-3；
- 包含SEQ ID NO: 18-20之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 21-23之LCDR 1-3，或
- 與選自以下之抗體競爭結合：藉由保藏於CNCM保藏號為I-4401之融合瘤所產生的mAb 20.1、藉由保藏於CNCM保藏號為I-4402的融合瘤所產生的mAb 7.2及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。
在一些實施例中，抗BTN3A抗體包含突變或經化學修飾IgG1恆定區，其中當與具有野生型IgG1同型恆定區之對應抗體相比時，該突變或經化學修飾IgG1恆定區使得不與Fcγ受體結合或減少與Fcγ受體結合。在一些實施例中，該突變IgG1恆定區為IgG1三重突變L247F、L248E及P350S。
在一些實施例中，抗BTN3A為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的mAb。
在一些實施例中，IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO: 30)之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO: 31)之肽；
(d) X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO: 32)之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；及
其中多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合。
在一些實施例中，IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含與SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含與SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及
(d) X4為包含與肽EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；且其中多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合。
在一些實施例中，IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽；及
(d) X4為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 35 (EDEQEEMANAIITILQSWIFS)之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；且其中多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合。
在一些實施例中，IL-2促效劑之X2域為包含與SEQ ID NO: 36 (KDEAEKAKRMKEWMKRIKT)至少90%、至少94%或100%一致的胺基酸序列之肽。
在一些實施例中，IL-2促效劑包含與選自SEQ ID NO: 38-49中任一項之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的多肽。
在一些實施例中，IL-2促效劑多肽與含有聚乙二醇(「PEG (polyethylene glycol)」)之部分連接，視情況其中含有PEG之部分在多肽中的半胱胺酸殘基處連接，視情況其中含有PEG之部分經由順丁烯二醯亞胺基與半胱胺酸殘基連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 43中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置62處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 46中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置73處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 45中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置69處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 44中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置66處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 48中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置82處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接。
在如本文所揭示之治療組合之一些實施例中，抗BTN3A抗體以介於0.1與10 mg/kg體重之間的劑量投與。
在如本文所揭示之治療組合之一些實施例中，抗BTN3A抗體以靜脈內輸注形式投與。
在如本文所揭示之治療組合之一些實施例中，IL-2促效劑以介於0.1 μg/kg至100 mg/kg體重之間的劑量投與。
在如本文所揭示之治療組合之一些實施例中，IL-2促效劑係在投與該抗BTN3A抗體之前或之後投與。
在如本文所揭示之治療組合之一些實施例中，癌症選自血液癌或實體腫瘤癌，較佳地選自由以下組成之群：B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)、B-NHL、T-NHL、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、NK細胞淋巴瘤、骨髓細胞系結腸瘤癌、乳癌、肺癌、腦癌、前列腺癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、胃癌、睾丸癌及皮膚癌。
本發明亦涵蓋一種治療有需要之患者之癌症的方法，其包含向該患者同時、依序或分開投與治療有效量之抗BTN3A活化抗體，
與治療有效量之結合IL-2受體βγc異二聚體的IL2促效劑的組合；
其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO: 30)之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO: 31)之肽；
(d) X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO: 32)之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；
或其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中：
(a) X1為包含與序列KIQLHAEHALYDALMILNI (SEQ ID NO: 33)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含與序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG (SEQ ID NO: 34)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(d) X4為包含與序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；或
或其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 37-49中任一項中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
在如本文所揭示之方法的一些實施例中，以藉由表面電漿子共振所量測，抗BTN3A抗體以10 nM或更小之K
D，較佳地以5 nM或更小之K
D與人類BTN3A結合。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，抗BTN3A抗體在與表現BTN3的細胞共培養中誘導γδ T細胞(典型地Vγ9Vδ2 T細胞)之活化，其中以在去顆粒檢驗中所量測EC
50低於5 μg/ml，較佳地1 μg/ml或更低。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，抗BTN3A抗體：
- 包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；
- 包含SEQ ID NO: 12-14之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 15-17之LCDR 1-3；
- 包含SEQ ID NO: 18-20之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 21-23之LCDR 1-3，或
- 與選自以下之抗體競爭結合：藉由保藏於CNCM保藏號為I-4401之融合瘤所產生的mAb 20.1、藉由保藏於CNCM保藏號為I-4402的融合瘤所產生的mAb 7.2或具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。
在如本文所揭示之方法一些實施例中，抗BTN3A抗體包含突變或經化學修飾IgG1恆定區，其中當與具有野生型IgG1同型恆定區之對應抗體相比時，該突變或經化學修飾IgG1恆定區使得不與Fcγ受體結合或減少與Fcγ受體結合。在具體實施例中，突變IgG1恆定區為IgG1三重突變L247F、L248E及P350S。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，抗BTN3A抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的單株抗體。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4的多肽，其中：
(a) X1為包含與SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含與SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及
(d) X4為包含與肽EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；且其中多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4的多肽，其中：
(a) X1為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽；及
(d) X4為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 35 (EDEQEEMANAIITILQSWIFS)之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間；且其中多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL-2促效劑之X2域為包含與SEQ ID NO: 36 (KDEAEKAKRMKEWMKRIKT)至少90%、至少94%或100%一致的胺基酸序列之肽。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL-2促效劑為包含與選自SEQ ID NO: 38-49中任一項的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列之多肽。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL-2促效劑多肽與含有聚乙二醇(「PEG」)之部分連接，視情況其中含有PEG之部分在多肽中的半胱胺酸殘基處連接，視情況其中含有PEG之部分經由順丁烯二醯亞胺基與半胱胺酸殘基連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 43中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置62處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 46中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置73處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 45中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置69處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 44中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置66處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接；
視情況其中IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 48中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置82處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，抗BTN3A抗體以介於0.1與10 mg/kg體重之間的劑量投與。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，抗BTN3A抗體以靜脈內輸注形式投與。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL2促效劑以介於0.1 μg/kg至100 mg/kg體重之間的劑量投與。
在如本文所揭示之方法之一些實施例中，IL2促效劑係在投與該抗BTN3A抗體之前或之後投與。
在如本文所揭示之治療癌症的方法之一些實施例中，癌症選自血液癌或實體腫瘤癌，較佳地選自由以下組成之群：B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B-NHL、T-NHL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、NK細胞淋巴瘤、骨髓細胞系結腸瘤癌、乳癌、肺癌、腦癌、前列腺癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、胃癌、睾丸癌及皮膚癌。
在如本文所揭示之治療癌症的方法之一些實施例中，IL-2促效劑與抗BTN3A抗體之組合在癌症治療中或對於抑制腫瘤細胞增殖提供協同效應。
在一些實施例中，IL-2促效劑為Neo-2/15。Neo-2/15已指定CAS登記號2407798-79-0。
在一些實施例中，IL-2促效劑為NL-201。NL-201係藉由在位置62處引入半胱胺酸殘基用於非分支鏈40 kDa聚乙二醇(PEG)分子之位點特異性結合自Neo-2/15產生。NL-201已指定CAS登記號2738533-90-7。
定義為了使本發明可更易於理解，首先定義某些術語。其他定義在整個實施方式中闡述。
術語「促效劑」在本文中用於與受體結合且活化該受體以產生生物反應之分子(例如較小有機分子或多肽，諸如抗體)。對於特定類型之受體選擇性促效劑為選擇性的。與受體結合可為例如以藉由表面電漿子共振所測定以生物學相關濃度特異性結合。
如本文所用，術語「親和力」意謂配體對其受體上之結合位點的結合強度。與受體結合之促效劑可針對可觸發多少生理學反應(即功效或效能)及針對為了產生生理學反應所需的促效劑濃度(通常以EC
50形式量測，亦即為了產生半最大反應所需的濃度)兩者進行表徵。舉例而言，高親和力配體結合意指需要相對較低的配體濃度來最大限度地佔據配體結合位點及觸發生理學反應。配體對其受體之結合親和力(K
D) (亦參見下文之定義)可藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)測定。
如本文所用之術語「Kon」或「Kass (Ka)」意欲指特定配體-受體相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「Kdis (Kd)」或「Koff」意欲指特定配體-受體相互作用之解離速率。
如本文所用，術語「K
D」意欲指平衡解離常數，其自k
off與k
on(亦即k
off/k
on)之比值獲得，且表述為莫耳濃度(M)。K
D值與配體之濃度(特定實驗所需之配體的量)相關，且因此，K
D值愈低(較低濃度)且因而配體對其受體的親和力愈高。
如本文所用，術語「多肽」、「蛋白」或「肽」係指胺基酸殘基之任何鏈，與其長度或轉譯後修飾(諸如糖基化)無關。
在本發明之上下文內，術語「IL-2」指示IL-2之任何來源，包括哺乳動物來源且可為天然的或藉由重組或合成技術獲得，包括由微生物宿主產生之重組IL-2多肽。如本文所用，術語「IL-2」具有其在此項技術中之一般含義且通常係指天然IL-2多肽。在一些例示性態樣中，IL-2多肽源自人類來源，且包括重組人類IL-2，尤其由微生物宿主產生之重組人類IL-2。在具體實施例中，術語「IL-2」係指SEQ ID NO: 50之人類IL-2 (介白素2)且揭示於例如Genbank ref P60568中。
如本文所用，術語IL-2 (IL-2)促效劑係指能夠活化IL-2受體介導之信號傳導的多肽。
術語「肽模擬物(peptide mimetic)」及「肽模擬物(peptidomimetic)」在本文中具有相同含義且係指多肽或生物學上模擬生物分子之活性配體的經修飾多肽。
如本文所用，術語「IL-2模擬物」係指多肽，其具有與天然IL-2序列(尤其與SEQ ID NO: 50之人類IL-2)具有少於60%、特別地少於50%；少於40%；少於30%；或少於20%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2模擬物與SEQ ID NO: 50之人類IL-2具有10%與60%之間、特別地10%與40%之間或10%與30%之間的一致性。本發明之IL-2肽模擬物與IL-2βƔ
c受體結合且能夠活化IL-2受體介導之信號傳導。用於本發明方法中之例示性IL-2模擬物誘導IL-2RβƔ
c之異二聚化，引起STAT5的磷酸化。
術語「IL-15」具有其一般含義且係指人類介白素-15。類似於IL-2，IL-15與由IL-2/IL-15受體β鏈(IL-2Rβ，亦稱為CD122)及共用伽馬鏈(IL-2RƔ
c，亦稱為CD132)構成的複合物結合並經由其傳信。在本發明之上下文內，術語「IL-15」指示IL-15之任何來源，包括哺乳動物來源且可為天然的或藉由重組或合成技術獲得，包括由微生物宿主產生之重組IL-15多肽。在一些例示性態樣中，IL-15多肽源自人類來源，且包括重組人類IL-15，尤其由微生物宿主產生之重組人類IL-15。在具體實施例中，其係指SEQ ID NO: 51之人類IL-15 (介白素15)。
如本文所用，術語「BTN3A」具有其在此項技術中之一般含義。在具體實施例中，其係指人類BTN3A多肽，包括SEQ ID NO: 24之BTN3A1、SEQ ID NO: 25之BTN3A2或SEQ ID NO: 26之BTN3A3。
如本文所用，術語「抗體」係指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有免疫特異性結合抗原之抗原結合位點的分子。術語「抗體」或「免疫球蛋白」具有相同含義，且將同樣用於本發明中。如此，術語抗體不僅涵蓋全抗體分子，且亦涵蓋抗體片段以及抗體之變體(包括衍生物)。如本文所用，術語「抗體」亦包括雙特異性或多特異性分子。可將抗體衍生為或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如受體之另一抗體或配體)，以生成與至少兩個不同結合位點或目標分子結合之雙特異性分子。實際上可將抗體衍生為或連接至多於一種其他功能分子，以生成與多於兩個不同結合位點及/或目標分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為了形成雙特異性分子，可將本發明之抗體功能性連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，從而得到雙特異性分子。另外，對於雙特異性分子為多特異性之實施例，除第一及第二目標抗原決定基之外，分子亦可進一步包括第三結合特異物。
在嚙齒動物及靈長類動物之天然抗體中，兩條重鏈藉由二硫鍵彼此連接，且每個重鏈藉由二硫鍵與輕鏈連接。存在兩種類型之輕鏈，拉姆達(λ)及卡帕(κ)。決定抗體分子之功能活性的重鏈有五種主要類別(或同型)：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。各鏈含有不同序列域。在典型IgG抗體中，輕鏈包括兩個域：可變域(VL)及恆定域(CL)。重鏈包括四個域：一個可變域(VH)及三個恆定域(CH1、CH2及CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)及重鏈(VH)二者之可變區決定對抗原之結合識別及特異性。輕鏈(CL)及重鏈(CH)之恆定區域賦予重要生物特性，諸如抗體鏈締合、分泌、反-胎盤遷移性、補體結合及與Fc受體(FcR)之結合。
Fv片段為免疫球蛋白之Fab片段的N端部分，且由一個輕鏈及一個重鏈之可變部分組成。抗體之特異性存在於抗體結合位點與抗原決定子之間的結構互補。抗體結合位點由主要來自高變區或互補決定區(CDR)之殘基構成。間或地，來自非高變區或構架區(FR)之殘基可參與抗體結合位點或影響總體域結構，且因此影響結合位點。互補決定區或CDR係指一起限定天然免疫球蛋白結合位點之天然Fv區之結合親和力及特異性的胺基酸序列。免疫球蛋白之輕鏈及重鏈各自具有三個CDR，分別稱為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3及H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原結合位點典型地包括六個CDR，六個CDR包含來自重鏈及輕鏈V區中之每一者的CDR集合。構架區(FR)係指插入於CDR之間的胺基酸序列。相應地，輕鏈及重鏈之可變區典型地包含以下序列之4個構架區及3個CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗體可變域中之殘基習知地根據Kabat等人所設計的系統進行編號。此系統闡述於Kabat等人，1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國衛生與公眾服務部(US Department of Health and Human Services), NIH, USA (Kabat等人, 1992，下文「Kabat等人」)中。此編號系統用於本說明書中。Kabat殘基名稱並不始終直接與SEQ ID序列中之胺基酸殘基的線性編號對應。對應於基本可變域結構之結構組分(無論構架或互補決定區(CDR))之縮短或插入，與嚴格Kabat編號相比，實際線性胺基酸序列可含有較少或另外的胺基酸。對於給定抗體，可藉由將抗體序列中之具有同源性之殘基與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定殘基之正確Kabat編號。根據Kabat編號系統重鏈可變域之CDR位於殘基31至35 (H-CDR1)、殘基50至65 (H-CDR2)及殘基95至102 (H-CDR3)。根據Kabat編號系統輕鏈可變域之CDR位於殘基24至34 (L-CDR1)、殘基50至56 (L-CDR2)及殘基89至97 (L-CDR3)。
目前在所屬領域中公認哺乳動物抗體之非CDR區可由同種特異性或異種特異性抗體之相似區替換同時保留原始抗體之抗原決定基特異性。此最清晰地體現於「人類化」抗體之進展及用途中，在人類化抗體中非人類CDR與人類FR及/或Fc/pFc'區共價接合以產生功能性抗體。
如本文所用，「人類化」描述其中CDR區外部之胺基酸的一些、大多數或全部用源自人類免疫球蛋白分子之對應胺基酸替換的抗體。人類化之方法包括(但不限於)美國專利第4,816,567、第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第5,859,205號中所描述之彼等方法，其以引用之方式併入本文中。以上美國專利第5,585,089號及第5,693,761號以及WO 90/07861亦提出四個可用於設計人類化抗體之可能性準則。第一條建議為對於受體，使用來自特定人類免疫球蛋白之構架，該特定人類免疫球蛋白與將人類化之供體免疫球蛋白罕見地同源；或使用來自多種人類抗體之共有構架。第二條建議為若人類免疫球蛋白之構架中之胺基酸為不常見的且彼位置處之供體胺基酸對於人類序列而言為典型的，則可選擇供體胺基酸而非受體。第三條建議為在人類化免疫球蛋白鏈中之緊鄰3個CDR之位置中，可選擇供體胺基酸而非受體胺基酸。第四條建議為使用存在於構架位置處的供體胺基酸，在該等構架位置處胺基酸經預測在抗體之三維模型中的CDR之3A內具有側鏈原子且經預測能夠與CDR相互作用。以上方法僅說明熟習此項技術者可用於製造人類化抗體之方法中的一些。一般熟習此項技術者將熟悉用於抗體人類化之其他方法。在抗體之一些人類化形式中，CDR區外部之胺基酸的一些、大多數或全部可用來自人類免疫球蛋白分子之胺基酸替換，但其中一或多個CDR區內之胺基酸的一些、大多數或全部不變。胺基酸之小添加、缺失、插入、取代或修飾為准許的，只要其不消除抗體結合給定抗原之能力即可。適合之人類免疫球蛋白分子將包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgM分子。「人類化」抗體保留與原始抗體類似之抗原特異性。然而，使用某些人類化方法，使用「定向演化」方法可提高抗體之結合親和力及/或特異性，如由Wu等人, Mol. Biol. 294:151, 1999所描述，其內容以引用之方式併入本文中。
對於大部分人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座，全人類單株抗體亦可藉由使轉殖基因小鼠免疫來製備。參見例如美國專利第5,591,669、第5,598,369號、第5,545,806號、第5,545,807號、第6,150,584號及其中所引用之參考文獻，其內容以引用之方式併入本文中。此等動物已經遺傳修飾從而使得內源性(例如鼠類)抗體之產物中存在功能性缺失。動物進一步經修飾以含有人類生殖系免疫球蛋白基因座之全部或一部分從而此等動物之免疫將引起相關抗原之完全人類抗體的產生。在此等小鼠((例如XenoMouse (Abgenix)、HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm)之免疫以後，單株抗體可根據標準融合瘤技術製備。此等單株抗體將具有人類免疫球蛋白胺基酸序列且因此當向人類投與時不會激起人類抗小鼠抗體(KAMA)反應。
亦存在用於產生人類抗體之活體外方法。此等方法包括噬菌體呈現技術(美國專利第5,565,332號及第5,573,905號)及人類B細胞之活體外刺激(美國專利第5,229,275號及第5,567,610號)。此等專利之內容以引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」(或簡稱「抗體片段」)係指抗體之全長或指抗體之一或多個片段，其保留與抗原(例如如上文所定義的BTN3A蛋白)特異性結合之能力。在具體實施例中，本文中所提供之抗體為抗體片段，且更特定言之，包括如本文所揭示之抗體之抗原結合域的任何蛋白。熟知抗體片段包含：Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，包含兩個由鉸鏈區的二硫橋鍵連接之Fab片段二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂的VL及VH域組成之Fv片段；dAb片段(Ward等人, 1989 Nature 341:544-546)，其由VH域或包含此類抗原結合片段之任何融合蛋白組成；雙功能抗體，其係指具有兩個抗原結合位點之較小抗體片段，該等片段包含與同一條多肽鏈中之輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH) (VH-VL)。藉由使用過短而使得同一條鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一條鏈之互補域配對且形成兩個抗原結合位點。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)經獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子能夠將其製造成VL及VH區配對以形成單價分子之單鏈蛋白(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人, 1988 Science 242:423-426；及Huston等人, 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋在術語抗體之「抗原結合片段」內(在本文中亦簡稱為抗體片段)。更一般而言，如本文中之抗體片段亦意欲涵蓋單域抗體，其為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來篩選供使用的片段。非常適合的抗體片段包括(但不限於)Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2及雙功能抗體。抗體片段可藉由如本文所描述之各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解分解以及藉由重組宿主細胞產生。
如本文所用，術語「單株抗體」係指具有單特異性之抗體分子的製品。單株抗體顯示對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。因此，術語「人類單株抗體」係指顯示單一結合特異性之抗體，其具有源自或基於人類生殖系免疫球蛋白序列或源自完全合成序列之可變區及恆定區。製備單株抗體之方法與結合特異性不相關。
「重組抗體」為藉由重組方式產生、表現、生成或分離之抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現的抗體；自重組組合性抗體庫分離之抗體；自因人類免疫球蛋白基因而為轉殖基因的動物(例如小鼠)分離之抗體；或以任何其他方式產生、表現、生成或分離之抗體，在該等方式中特定免疫球蛋白基因序列(諸如人類免疫球蛋白基因序列)與其他DNA序列一起組裝。重組抗體包括例如嵌合及人類化抗體。在一些實施例中，本發明之重組人類抗體具有與對應天然存在之人類抗體相同的胺基酸序列但與該天然存在之人類抗體結構上不同。舉例而言，在一些實施例中糖基化模式根據重組人類抗體之重組產物而不同。在一些實施例中，重組人類抗體藉由相對於在人類中天然存在之人類抗體之結構添加或減去至少一個共價化學鍵來化學修飾。
如本文所用，「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如與BTN3A特異性結合之經分離抗體實質上不含與BTN3A之外的其他抗原特異性結合之抗體)。然而，與BTN3A特異性結合之經分離抗體可以與其他抗原，諸如來自其他物種之相關BTN3A分子具有交叉反應。此外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學物質。
片語「識別抗原之抗體」及「對於抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「與抗原特異性結合之抗體」互換使用。術語「抗BTN3A抗體」或「BTN3A抗體」在本文中亦簡化使用，其具有「識別BTN3A之抗體」之含義。
如本文所用，術語「活化抗體」係指能夠直接地或間接地誘導效應細胞之免疫功能的抗體。特定言之，如本文所用，活化抗BTN3A抗體至少具有在與BTN3表現細胞共培養中誘導γδ T細胞(典型地Vγ9Vδ2 T細胞)之活化的能力，其中以在去顆粒檢驗中所量測EC
50低於5 μg/ml，較佳地1 μg/ml或更低(參見詳細檢驗WO/2020/025703)。
如本文所用，術語「結合」在抗體與預定抗原或抗原決定基(特別地BTN3)之結合的情形下典型地意謂具有一定親和力之結合，當藉由例如表面電漿子共振(SPR)技術在BIAcore 3000儀器中典型地使用抗原之可溶形式作為配體且抗體作為分析物測定時該親和力對應於約10
-7M或更小、諸如約10
-8M或更小、諸如約10
-9M或更小、約10
-10M或更小或約10
-11M或甚至更小之K
D。BIACORE® (GE Healthcare, Piscaataway, NJ)為常規用於單株抗體之抗原決定基組圖之各種表面電漿子共振檢驗型式中之一者。典型地，抗體以一定親和力與預定抗原結合，該親和力對應於比抗體與非特異性抗原(例如BSA，酪蛋白)結合之K
D低至少十倍，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍；諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000之K
D，其不與預定抗原一致或密切相關。若抗體之K
D極低(即抗體具有高親和力)，則抗體結合抗原之K
D典型地比其與非特異性抗原結合之K
D低至少10,000倍。
如本文所用，術語「親和力」在抗體之情形下意謂抗體與抗原決定基之結合強度。
如本文所用之術語「Kon」或「Kass (Ka)」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所用之術語「Kdis (Kd)」或「Koff」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。
如本文所用，術語「K
D」意欲指平衡解離常數，其自k
off與k
on(亦即k
off/k
on)之比值獲得，且表述為莫耳濃度(M)。K
D值與抗體之濃度(特定實驗所需之抗體的量)相關，且因此，K
D值愈低(較低濃度)且因而抗體的親和力愈高。可使用此項技術中公認的方法測定抗體之K
D值。用於測定mAb之K
D值的較佳方法可見於Harlow, 等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)、Coligan等人, 編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)及Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)中，該等參考文獻以全文引用之方式併入本文中。一種測定抗體之K
D之方法為藉由使用表面電漿子共振或藉由使用諸如Biacore® (亦參見關於親和力評定的詳細資訊Rich RL, Day YS, Morton TA, Myszka DG. High-resolution and high-throughput protocols for measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE®. Anal Biochem. 2001年9月15日; 296(2):197-207)或Octet®系統的生物感測器系統。Octet®平台係基於生物膜層干涉術(bio-layer interferometry，BLI)技術。BLI技術之原理係基於自兩個表面——固定蛋白層及內部參考層反射之白光的光學干涉圖案。固定於生物感測器尖端表面上之配體與溶液中之分析物之間的結合產生生物感測器尖端處之光學厚度增加，此導致以奈米為單位量測之干涉圖案移位。波長移位(Δλ)為生物層之光學厚度之變化的直接度量，當在一段時間內量測此移位且將其量值標繪為時間之函數時，獲得經典締合/解離曲線。即時量測此相互作用，從而允許監測結合特異性、締合速率及解離速率以及濃度。(參見Abdiche等人2008以及結果中之詳情)。親和力量測典型地在25℃下執行。
如本文所用，術語「特異性」係指抗體可偵測地結合呈遞於抗原(諸如BTN3A)上之抗原決定基的能力。在一些實施例中，意欲指與如在周邊血骨髓細胞(peripheral blood marrow cell，PBMC)上表現之人類BTN3A結合之抗體，較佳地以在實例(檢驗及方案典型地揭示於WO/2020/025703中，尤其參考表4)中所測定EC
50低於50 μg/ml且更佳地低於10 μg/ml。在其他實施例中，其以藉由如上文所提及但亦參見WO/2020/025703之表4的詳情之SPR量測所量測100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、100 pM或更低或10 pM或更低之K
D與抗原重組多肽結合。
「與除BTN3A之外的抗原交叉反應」抗體意欲指以10 nM或更低、1 nM或更低或100 pM或更低之K
D結合除BTN3A之外的抗原之抗體。「不與特定抗原交叉反應」之抗體意欲指以1 μM或更大之K
D或10 μM或更大之K
D與彼抗原結合之抗體。在某些實施例中，在標準結合檢驗中此類抗體不與抗原交叉反應，呈現針對此等蛋白之基本上不可偵測的結合。在具體實施例中，例如以在Biacore檢驗(特別參見例示於WO/2020/025703中參考表26的相關檢驗)中所量測本發明之人類化抗體(例如mAb1)分別與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 29之食蟹猴BTN3A1、BTN3A2及BTN3A3交叉反應。
特異性可進一步藉由例如約10:1、約20:1、約50:1、約100:1、10,000:1或更大之與特定抗原結合對比與其他不相關分子之非特異性結合(在此情形下特定抗原為BTN3A多肽)的親和力/親合力之比值來展現。
如本文所用，術語「親合力」係指抗體-抗原複合物之整體穩定性或強度的資訊性量度。其由三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體兩者之價數；以及相互作用部分之結構佈置。最終，此等因素界定抗體之特異性，亦即特定抗體與精確抗原之抗原決定基結合的可能性。
如本文所用，術語「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
如本文所用，術語「經最佳化」意謂已使用生產細胞或生物體(一般為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)或人類細胞)中較佳的密碼子改變核苷酸序列以編碼胺基酸序列。對經最佳化核苷酸序列進行工程改造以完全或儘可能多地保留原先由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列。由經最佳化核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為經最佳化。
如本文所用，關於多肽序列之術語「一致性」係指兩個分子之間的胺基酸序列一致性。若兩個分子中之一個胺基酸位置由相同胺基酸佔據時，則分子在彼位置處一致。兩個多肽之間的一致性為一致位置之數量的直接函數。一般而言，對序列進行比對從而獲得最高階匹配(必要時包括空隙)。在考慮為達成兩個序列之最佳比對而需引入之空隙的數目及各空隙之長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共用之一致位置之數目的函數(亦即一致性%=一致位置之數目/位置之總數目×100)。序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比測定可使用數學演算法實現，如下文所述。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E. Meyers及W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)之演算法(其已併入至ALIGN程式(2.0版)中)使用PAM120權重殘基表(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)測定。或者，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用公開技術及廣泛可用的電腦程式，諸如BLASTP、FASTA (Atschul等人, J. Molecular Biol. 215:403, 1990)或Needleman及Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)演算法，其已併入GCG套裝軟體中之GAP程式(Devereux等人, Nucleic Acids Res. 12:387, 1984，典型地可在http://www.gcg.com獲得)中，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣且空隙權重為16、14、12、10、8、6或4及長度權重為1、2、3、4、5或6來測定。
當測定本發明之一致性時，尤其IL-2促效劑之一致性，考慮與IL-2受體之結合界面的定位亦較為重要。若添加胺基酸或使胺基酸缺失，則應以實質上不干擾將蛋白呈遞至其結合配偶體且不干擾二級結構之方式進行。
一般而言但非必要地，較佳使相對於參考肽域之胺基酸取代為保守性胺基酸取代。
如本文所用，「保守性胺基酸取代」意謂所載胺基酸可由具有類似生理化學特徵之殘基替換，例如用一個脂族殘基取代另一脂族殘基(諸如用Ile、Val、Leu或Ala彼此取代)，或用一個極性殘基取代另一極性殘基(諸如Lys與Arg；Glu與Asp；或Gln與Asn之間取代)。已知其他此類保守性取代，例如具有類似疏水性特徵之整個區之取代。可在本文所述之檢驗中之任一者中測試包含保守性胺基酸取代的多肽以證實保持天然或參考多肽之所需活性，例如抗原結合活性及特異性。胺基酸可根據其側鏈特性之類似性分組(在A. L. Lehninger, in Biochemistry, 第二版, 第73-75頁, Worth Publishers, New York (1975)中)：(1)非極性：Gly (G)、Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)不帶電極性：Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。或者，天然存在之殘基可基於共同的側鏈特性來分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守性取代將必然伴有此等類別中之一者的成員換成另一個類別。尤其較佳保守性取代包括例如：Ala取代為Gly或Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Glu取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或Pro；His取代為Asn或Gln；Ile取代為Leu或Val；Leu取代為Ile或Val；Lys取代為Arg、Gln或Glu；Met取代為Leu、Tyr或Ile；Phe取代為Met、Leu或Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp；及/或Phe取代為Val、Ile或Leu。
核苷酸序列之間的一致性百分比亦可使用例如演算法(諸如用於核酸序列之BLASTN程式)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=4及兩股之對比作為默認來測定。
另外的抗體可在標準抗原結合檢驗(諸如ELISA結合檢驗)中基於其與本發明之其他抗體交叉競爭(例如以統計學上顯著之方式競爭性抑制結合)的能力來識別。測試抗體抑制本發明之抗體結合至目標之能力表明測試抗體可與彼抗體競爭結合至目標；根據非限制性理論，此類抗體可結合至目標上與其所競爭之抗體相同或相關(例如結構上類似或空間上接近)的抗原決定基。因此，本發明之另一態樣提供結合至與本文所揭示之抗體相同的抗原並與本文所揭示之抗體競爭的抗體。如本文所用，當在等莫耳濃度之競爭抗體存在下競爭抗體抑制本發明之抗體或抗原結合片段的目標結合超過50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%時，抗體「競爭」結合。
如本文所用，當與藥劑組合之功效的描述結合使用時，術語協同或協同效應意謂組合之任何量測效應大於根據個別藥劑之效應的總和所預測的效應(亦即大於相加效應)。在一些實施例中，腫瘤生長速率或腫瘤尺寸(例如腫瘤尺寸(例如體積、質量)之變化速率)用於確定藥物組合是否為協同性(例如若藥物組合產生相加效應，當腫瘤生長速率比所預期的速率慢時藥物組合為協同性)。在一些實施例中，存活時間用於確定藥物組合是否為協同性(例如若藥物組合產生相加效應，當個體或個體群體之存活時間比所預期的存活時間長時藥物組合為協同性)。在一些實施例中，T細胞擴增亦可用以確定藥物組合是否為協同性(例如若藥物組合產生相加效應，當特異性T細胞子集之擴增速率(以與基線值相比群體增加之百分比或增加的絕對細胞數目形式測定)比所預期的擴增速率高時藥物組合為協同性)。
活化 BTN3A 抗體 本發明之活化抗BTN3A抗體典型地展現以下特性中之一或多者：
(i) 以藉由SPR (例如如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)所量測，其以10 nM或更低之K
D，較佳地以1 nM或更低之K
D與BTN3A結合；
(ii) 以藉由SPR (例如如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)所量測，其以100 nM或更低之K
D，較佳地以10 nM或更低之K
D與食蟹猴BTN3A交叉反應；
(iii) 如流動式細胞測量術檢驗(如專利申請案WO2020025703之實例中所描述)中所量測，其以50 μg/ml或更低，較佳地10 μg/ml或更低之EC
50與人類PBMC結合；
(iv) 其在與表現BTN3之細胞共培養中誘導γδ-T細胞(典型地Vγ9Vδ2 T細胞)之活化，其中EC
50低於5 μg/ml，較佳地1 μg/ml或更低，如專利申請案WO2020025703之實例中所描述。
(v) 其誘導人類PBMC中之Vγ9Vδ2 T細胞的活體外活化，以藉由活化標記物CD69之表面表現所量測，EC
50低於0.1 μg/mL，較佳地0.01 μg/mL或更低，例如在100 pg/mL與0.1 μg/mL之間。
實例抗BTN3A活化抗體描述於下文段落中。在一些實施例中，抗BTN3A活化抗體選自由以下組成之群：諸如國際專利申請案WO2012080769；WO2012080351及WO2020025703中所描述之抗BTN3A抗體。在一些特定實施例中，BTN3活化抗體選自WO2020025703中所描述之人類化抗體或為WO2012080769及WO2012080351中所描述之BTN3A促效劑抗體的人類化型式。在一些實施例中，抗BTN3抗體可選自mAb 20.1及mAb 7.2，其可獲自諸如WO2012080769及WO2012080351中所描述之以CNCM保藏號I-4401及I-4402獲取的融合瘤中之一者或其人類化型式；以及選自WO2020025703中所描述之人類化mAb
1-6。
在一些實施例中，抗BTN3抗體包含WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或如WO2020025703中所描述的mAb
1-6之六個CDR (CDR1(亦稱為HCDR1)、VH CDR2 (亦稱為HCDR2)、VH CDR3 (亦稱為HCDR1)、VL CDR1 (亦稱為LCDR1)、VL CDR2 (亦稱為LCDR2)、VL CDR3 (亦稱為HCDR3))。在特定實施例中，抗BTN3A活化抗體包含如下
表 1中所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及HCDR3：
表 1 ：如WO2020025703中所定義根據Kabat編號之mAb1、mAb2、mAb4及mAb5、親本鼠類mAb 7.2及鼠類mAb 20.1抗體之CDR區。
| 原始抗體 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 |
| mAb 7.2 mAb1 mAb2 mAb4 mAb5 | SEQ ID NO: 12 | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 17 |
| mAb 20.1 | SEQ ID NO: 18 | SEQ ID NO: 19 | SEQ ID NO: 20 | SEQ ID NO: 21 | SEQ ID NO: 22 | SEQ ID NO: 23 |
在如本文所揭示之抗體之一些實施例中，6個CDR區與WO2012080769及WO2012080351中所描述的抗體20.1或7.2或WO2020025703中所描述之mAb
1-6的6個CDR區100%一致，特別地在一些實施例中，如本文所揭示之抗體的6個CDR區與
表 1(特別地mAb 7.2；1；2；4；及5)之6個CDR區100%一致。
如本文所揭示之其他抗體包括彼等抗體，其具有已藉由胺基酸缺失、插入或取代而突變但與WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或WO2020025703中所描述之mAb
1-6的6個CDR區相比，特別地與
表 1 中所定義之6個CDR區相比CDR區中仍具有至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸。在一些實施例中，按照本發明，與WO2012080769及WO2012080351中所描述之抗體20.1或7.2或者WO2020025703中所描述之mAb
1-6 之CDR序列相比，特別地與
表 1之CDR序列相比，更特定言之與mAb 7.2；1；2；4；及5之CDR序列相比，抗體的一或多個CDR中可具有在1、2、3或4個之間的胺基酸變化(包括缺失、插入或取代)。
本發明之抗體亦包括彼等與如
表 2中所定義之VH及VL區具有至少90%，特別地至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的抗體。更特定言之，本發明之抗體包括經選擇之人類化重組抗體mAb1、mAb2、mAb4及mAb5，其在結構上特徵在於如下
表 2中所描述的其可變重鏈及輕鏈胺基酸序列以及人類恆定區(同型)：
表 2：mAb1-mAb6之可變重鏈及輕鏈胺基酸序列
mAb3及mAb6為親本鼠類抗BTN3A抗體之人類化抗體，稱為WO2012/080351中所描述之mAb 20.1。
| 抗體 | VH 胺基酸序列 | VL 胺基酸序列 | 同型恆定區 |
| mAb1 | SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) | SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2) | 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S |
| mAb2 | SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) | SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2) | 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S |
| mAb3 | 來自20.1之人類化變體 | 來自20.1之人類化變體 | 沉默IgG1 L247F/L248E/P350S |
| mAb4 | SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) | SEQ ID NO:2 (Vk1 7.2) | IgG4 S241P/L248E |
| mAb5 | SEQ ID NO:1 (VH2 7.2) | SEQ ID NO:3 (Vk2 7.2) | IgG4 S241P/L248E |
| mAb6 | 與mAb3相同 | 與mAb3相同 | IgG4 S241P/L248E |
IgG1、IgG4及其突變型式IgG1 L247F/L248E/P350S及IgG4 S241P/L248E之恆定同型區的對應胺基酸及核苷酸編碼序列用於生成mAb1至mAb6為此項技術中熟知的(Oganesyan等人, 2008；Reddy等人, 2000)。發現於IgG之C端離胺酸可天然地裁掉且此修飾並不影響抗體之特性；因此，在mAb1至mAb6之構築體中可另外地使此殘基缺失。
mAb1、mAb2、mAb4及mAb5之全長輕鏈及重鏈以及對應編碼序列展示於下表3中。
表 3：全長重鏈及輕鏈DNA編碼序列
| 抗體 | 胺基酸序列 | DNA 編碼序列 |
| mAb1 | 重鏈：SEQ ID NO: 4 輕鏈：SEQ ID NO: 6 | 重鏈：SEQ ID NO: 8 輕鏈：SEQ ID NO: 10 |
| mAb2 | 重鏈：SEQ ID NO: 4 輕鏈：SEQ ID NO: 7 | 重鏈：SEQ ID NO: 8 輕鏈：SEQ ID NO: 11 |
| mAb4 | 重鏈：SEQ ID NO: 5 輕鏈：SEQ ID NO: 6 | 重鏈：SEQ ID NO: 9 輕鏈：SEQ ID NO: 10 |
| mAb5 | 重鏈：SEQ ID NO: 5 輕鏈：SEQ ID NO: 7 | 重鏈：SEQ ID NO: 9 輕鏈：SEQ ID NO: 11 |
在可與先前實施例組合之某些實施例中，本文所提供之抗體為上文所定義之抗體的抗體片段。抗體片段包括例如(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單功能抗體及scFv片段、雙功能抗體、單域或奈米抗體及其他片段。較佳地，其為單價抗體，諸如scFv片段之Fab。
在一些實施例中，本發明之抗體競爭結合至上文所述之BTN3抗體，尤其本發明之抗體與選自mAb 20.1及mAb 7.2 (其可獲自諸如WO2012080769及WO2012080351中所描述之以CNCM保藏號I-4401及I-4402可獲得的融合瘤中之一者)以及選自WO2020025703中所描述的mAb
1-6之抗體競爭結合。在更多特定實施例中，本發明之抗體與選自以下之抗體競爭結合：以藉由以保藏號I-4402保藏於CNCM的融合瘤所產生之mAb 7.2及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。
在一些實施例中，本發明之抗體為嵌合、人類化或人類抗體。在本發明之較佳實施例中，BTN3抗體為人類化抗體。典型地，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時具有至少親本非人類抗體之相同親和力(或優越親和力)。更特定言之，BTN3抗體為WO2012080351中所揭示之抗體20.1或7.2之人類化形式。在較佳實施例中，本發明之抗體為如WO2012080351中所揭示之親本抗體mAb 7.2人類化抗體。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其部分)源自非人類抗體(例如鼠類mAb 7.2)，且FR (或其部分)源自具有突變以降低免疫原性的鼠類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。較佳地，本發明之重組抗體為人類化沉默抗體，典型地人類化沉默IgG1或IgG4抗體。本發明之非常適合的人類化抗BTN3A抗體典型地描述於WO2020025703中且包括具有
表 2之VH/VL多肽序列的mAb及具有
表 3之輕/重鏈的mAb。
如本文所用，術語「沉默」抗體係指以在諸如WO2020025703中所描述之彼等結合檢驗中所量測不展現或展現較低FcγR結合及/或C1q結合的抗體。在一個實施例中，術語「不結合或低FcγR及/或C1q結合」意謂沉默抗體展現FcγR及/或C1q結合，該結合至少低於用對應抗體與野生型人類IgG1或IgG4同型所觀測到的FcγR及/或C1q結合50%，例如低80%。
構架或 Fc 工程改造本發明之抗體可包括對VH及VL內之構架殘基的修飾以降低其免疫原性。
在一些具體實施例中，本發明之抗體為親本鼠類抗體mAb 7.2之人類化單株抗體，其包括至少VH構架區中的以下胺基酸突變：V5Q；V11L；K12V；R66K；S74F；I75S；E81Q；S82AR；R82BS；R83T；D85E；T87S；L108S；及至少Vκ構架區中的以下胺基酸突變：T5N；V15L；R18T；V19I；K42N；A43I；D70G；F73L；Q100G。
在其他具體實施例中，本發明之抗體為親本鼠類抗體mAb 7.2之人類化單株抗體，與mAb 7.2相比其包括至少VH構架區中的以下胺基酸突變：V5Q；V11L；K12V；R66K；S74F；I75S；E81Q；S82AR；R82BS；R83T；D85E；T87S；L108S；及至少Vκ構架區中的以下胺基酸突變：T5N；V15L；R18T；V19I；K42N；A43I；S63T；D70G；F73L；Q100G。
除構架區內進行之修飾以外，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區內的修飾，典型地改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞細胞毒性。
此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學部分連接至抗體)，或經修飾以改變其糖基化，再改變抗體之一或多種功能特性。此等實施例中之各者進一步詳細描述於下文中。
如本文所用，術語「同型恆定區」或「Fc區」可互換使用來定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括天然序列Fc區及變體Fc區。人類IgG重鏈Fc區一般定義為包含自IgG抗體之位置C226或自P230至羧基端的胺基酸殘基，其中編號係根據EU編號系統。Fc區之C端離胺酸(殘基K447)可例如在抗體之產生或純化或其對應密碼子在重組構築體中缺失期間予以移除。因此，本發明之抗體的組成可包含移除所有K447殘基之抗體群、未移除K447殘基的抗體群及具有帶有或不帶有K447殘基之抗體之混合物的抗體群。
在一些具體實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或者提高或降低抗體之穩定性。
在其他實施例中，使抗體之Fc鉸鏈區突變以減少抗體之生物半衰期。更具體言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得抗體對葡萄球菌蛋白A (Staphylococcyl protein A；SpA)之結合相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在又其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基替換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可用不同胺基酸殘基替換以使得該抗體具有改變之針對效應子配體的親和力，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應子配體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸可用不同胺基酸殘基替換，以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，改變一或多個胺基酸殘基從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在其他實施例中，藉由修飾一或多種胺基酸對Fc區進行修飾以降低抗體介導抗體依賴性細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)之能力及/或減小抗體對Fcγ受體的親和力。此類具有降低的效應功能且尤其降低的ADCC之抗體包括沉默抗體。
在某些實施例中，使用IgG1同型之Fc域。在一些具體實施例中，使用IgG1 Fc片段之突變變體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或與Fcγ受體結合之能力的沉默IgG1 Fc。
在某些實施例中，使用IgG4同型之Fc域。在一些具體實施例中，使用IgG4 Fc片段之突變變體，例如降低或消除融合多肽介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或與Fcγ受體結合之能力的沉默IgG4 Fc。
沉默效應功能可藉由抗體之Fc恆定部分中的突變獲得且已描述於此項技術中(Baudino等人, J. Immunol. 2008；Strohl, CO Biotechnology 20 2009)。沉默IgG1抗體之實例包含三重突變變體IgG1 L247F, L248E, P350S。沉默IgG4抗體之實例包含雙重突變變體IgG4 S241P L248E。
在某些實施例中，Fc域為防止Fc域之位置314處糖基化的沉默Fc突變。舉例而言，Fc域在位置314處含有天冬醯胺之胺基酸取代。此類胺基酸取代之一實例為由甘胺酸或丙胺酸替換N314。
在另其他實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可製備非糖基化抗體(亦即，抗體缺乏糖基化)。可改變糖基化以例如提高抗體對抗原之親和力。此類碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個糖基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，以消除一或多個可變區構架糖基化位點，藉此消除該位點之糖基化。此類非糖基化可提高抗體對抗原之親和力。此類方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
本發明所涵蓋之對本文抗體的另一修飾為聚乙二醇化或羥乙基澱粉化或相關技術。抗體可經聚乙二醇化以例如延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，典型地使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG) (諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團變成與抗體或抗體片段連接之條件下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為非糖基化抗體。用於聚乙二醇化蛋白之方法為此項技術中所已知，且可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
另一可能性為本發明之抗體的至少抗原結合區與蛋白之融合物能夠與血清蛋白結合，如此人類血清白蛋白延長所得分子之半衰期。此類方法例如描述於Nygren等人, EP 0 486 525中。
在某些實施例中，使通常存在於人類IgG重鏈恆定域上之C端離胺酸工程改造出去以減小非均質性，此係由於此減小之裂解通常在製造或儲存期間觀測到。此類修飾並不可察覺地改變此等抗體之合乎需要的功能，同時賦予此等分子穩定性益處。
編碼本發明之抗體的核酸分子本文亦揭示編碼本發明之抗BTN3A抗體的核酸分子。可變輕鏈及重鏈核苷酸序列之實例為編碼mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者的可變輕鏈及重鏈胺基酸序列之彼等核苷酸序列，可變輕鏈及重鏈胺基酸序列容易地來源於
表 1及
表 2，且使用遺傳密碼並視宿主細胞物種而定視情況考慮密碼子偏差。
本發明亦係關於來源於可變輕鏈及重鏈胺基酸序列的核酸分子已經最佳化以便蛋白在哺乳動物細胞(例如CHO細胞系)中表現。
核酸可存在於全細胞、細胞溶解物中或可為以部分純化或基本上純的形式存在的核酸。當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl結合、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知的其他技術)使核酸與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白)分離純化時，核酸「經分離」或「呈現實質上純」 (Ausubel等人, 1988, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons))。本發明之核酸可為例如DNA或RNA且可含有或可不含有內含子序列。在一實施例中，核酸可存在於載體中，諸如噬菌體呈現載體或重組質體載體中。
本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。一旦獲得編碼例如VH及VL區段之DNA片段，則可藉由標準重組DNA技術進一步操控此等DNA片段，例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操控中，將編碼VL或VH之DNA片段(例如如表1中所定義之VL及VH)可操作地連接至另一DNA分子或編碼另一蛋白之片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如此上下文中所用，術語「可操作地連接」意欲意謂兩個DNA片段以例如功能性方式接合，從而由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持在框內，或從而在所需啟動子控制下表現蛋白。
編碼VH區之經分離DNA可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至另一編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之DNA分子而轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(Kabat等人, K.S. (1992). Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE Publishing))且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。在一些實施例中，重鏈恆定區選自IgG1同型，例如人類IgG1同型。在其他實施例中，重鏈恆定區選自IgG4同型，例如人類IgG4同型。對於Fab片段重鏈基因，可將編碼VH之DNA可操作地連接至另一僅編碼重鏈CH1恆定區之DNA分子。
編碼VL區之經分離DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至另一編碼輕鏈恆定區CL之DNA分子來轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為此項技術中已知的(Kabat等人, 1992，參見上文)且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為卡帕或拉姆達恆定區。
為了形成scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至另一編碼可撓性連接子(例如編碼胺基酸序列(Gly4 -Ser)
3)的片段，從而VH及VL序列可表現為相連單鏈蛋白，其中VL及VH區藉由可撓性連接子接合(Bird等人, 1988，參見上文；Huston等人, 1988，參見上文；McCafferty等人, 1990, McCafferty, J., 等人 1990. Nature
348, 552-554)。
生成產生單株抗體之轉移瘤本發明之抗體可使用例如此項技術中如所熟知的重組DNA技術及基因轉染方法之組合在宿主細胞轉染瘤中產生(Morrison, 1985; Science
229, 1202-1207)。
舉例而言，為了表現抗體或其抗體片段，編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學或生物化學技術(例如DNA化學合成、PCR擴增或使用表現所關注抗體之融合瘤進行cDNA選殖)且可將DNA插入表現載體中從而將基因可操作地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此情形下，術語「可操作地連接」意欲意謂抗體基因接合至載體中，使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入分開的載體中，或更典型地，將兩種基因插入同一表現載體中。藉由標準方法(例如抗體基因片段及載體上的互補限制位點之接合或若無限制位點存在時之鈍端接合)將抗體基因插入表現載體中。藉由插入已編碼所需同型之重鏈恆定及輕鏈恆定區的表現載體中，本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區可用於形成任何抗體同型之全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內之CH區段且VL區段可操作地連接至載體內之CL區段。另外或替代地，重組表現載體可編碼促進抗體鏈自宿主細胞分泌之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，使得信號肽與抗體鏈基因之胺基端框內連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(亦即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
除抗體鏈基因以外，本文所揭示之重組表現載體亦攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中之表現的調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。此類調控序列描述於例如Goeddel之公開案(Goeddel, D.V. (1990). [1] Systems for heterologous gene expression. In Methods in Enzymology, (Academic Press), 第3-7頁)中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計包括調控序列之選擇，可視諸如待轉型之宿主細胞之選擇、所需蛋白之表現量等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之調控序列包括在哺乳動物細胞中引導高蛋白表現量之病毒元件，諸如來源於細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)、猴病毒40 (Simian Virus 40，SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(adenovirus major late promoter，AdMLP))及多瘤病毒之啟動子及/或強化子。或者，可使用非病毒調控序列，諸如泛素啟動子或P-血球蛋白啟動子。再者，調控元件由來自不同來源之序列構成，諸如SRa啟動子系統，其含有來自SV40早期啟動子之序列及1型人類T細胞白血病病毒之長末端重複序列(Takebe等人, 1988, Mol. Cell. Biol.
8, 466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列以外，本發明之重組表現載體亦可攜帶另外的序列，諸如調控載體在宿主細胞中之複製之序列(例如複製起點)及可選標記基因。可選標記基因有助於已引入載體之宿主細胞的選擇(參見例如全部頒予Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，在已引入載體之宿主細胞上，可選標記基因典型地賦予對諸如G418、潮黴素或甲胺喋呤之藥物之抗性。可選標記基因包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因(用於具有甲胺喋呤選擇/擴增之dhfr-宿主細胞)及neo基因(用於G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，藉由標準技術，將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。理論上有可能在原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體。論述抗體在真核細胞(例如哺乳動物宿主細胞、酵母或絲狀真菌)中之表現，因為此類真核細胞且尤其哺乳動物細胞比原核細胞更可能組裝並分泌適當摺疊及免疫活性抗體。
在一個具體實施例中，本發明之選殖或表現載體包含可操作地連接至適合啟動子序列之mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者的重鏈及輕鏈之編碼序列中之一者。
用於表現本發明之重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)，包括與DHFR可選標記(如inKaufman及Sharp, 1982所描述)一起使用之dhfr-CHO細胞(描述於Urlaub及Chasin, 1980中)、CHOK1 dhfr+細胞系、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞，例如GS CHO細胞系連同GS Xceed
TM基因表現系統(Lonza)。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由培養宿主細胞持續足以在宿主細胞中表現該抗體及視情況，使抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中的時間而產生。在抗體分泌之後可使用標準蛋白純化方法例如自培養基回收及純化抗體(Shukla等人, 2007, J. Chromatogr. B
848, 28-39)。
在一個具體實施例中，本發明之宿主細胞為經表現載體轉染之宿主細胞，該表現載體具有分別適用於可操作地連接至適合的啟動子序列之mAb1、mAb2、mAb4及mAb5之表現的編碼序列。
舉例而言，本發明係關於一種宿主細胞，其至少包含分別編碼mAb1之重鏈及輕鏈的SEQ ID NO: 8及10之核酸。
隨後可在合適條件下進一步培養後面的宿主細胞以便表現及產生分別選自由mAb1、mAb2、mAb4及mAb5組成之群的本發明之抗體。
或者，可將無細胞表現系統用於產生mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者。典型地，已描述蛋白或抗體之無細胞表現的方法(Stech等人, 2017, Sci. Rep.
7, 12030)。
抗 BTN3A 免疫結合物在另一態樣中，本發明之特徵在於與治療部分結合的如本文所揭示之抗BTN3A抗體或其片段。此類結合物在本文中稱為「免疫結合物」。包括一或多種細胞毒素之免疫結合物稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死細胞)之任何藥劑。
可使用此項技術中可用的連接子技術使細胞毒素與本發明之抗體結合。用於使細胞毒素與抗體結合之連接子類型之實例包括(但不限於)腙、硫醚、酯、二硫化物及含肽連接子，諸如纈胺酸-瓜胺酸連接子。所選擇之連接子可例如易於藉由溶酶體隔室內之低pH裂解或易於藉由蛋白酶裂解，諸如優先在腫瘤組織中表現之蛋白酶，諸如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。
關於細胞毒素類型、連接子及用於使治療劑與抗體結合之方法的進一步論述，亦參見Panowski等人, 2013對於抗體藥物結合物之綜述。
本發明之抗體亦可與放射性同位素結合以生成細胞毒性放射性藥品，亦稱為放射性免疫結合物。可與抗體結合以便診斷或治療上使用之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘
131、銦
111、釔
90及鑥
177。用於製備放射性免疫結合物之方法為此項技術中確定的。
雙特異性或多特異性抗 BTN3A 抗體在另一態樣中，本文進一步揭示包含本發明之抗BTN3A抗體的雙特異性或多特異性分子。可將抗體衍生為或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如受體之另一抗體或配體)，以生成與至少兩個不同結合位點或目標分子結合之雙特異性分子。實際上可將抗體衍生為或連接至多於一種其他功能分子，以生成與多於兩個不同結合位點及/或目標分子結合之多特異性分子；此類多特異性分子亦意欲由如本文所用之術語「雙特異性分子」涵蓋。為形成雙特異性分子，本發明之抗體可功能性連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或以其他方式)至一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)，從而產生雙特異性分子。
因此，本發明包括雙特異性分子，該等雙特異性分子至少包含一個針對BTN3A之第一結合特異物，例如mAb1、mAb2、mAb4及mAb5中之任一者的一個抗原結合部分，及針對第二目標抗原決定基之第二結合特異物。
另外，對於雙特異性分子為多特異性之實施例，除第一及第二目標抗原決定基之外，分子亦可進一步包括第三結合特異物。
在一個實施例中，本文所揭示之雙特異性分子包含作為結合特異性的至少一種抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')
2、Fv、單功能抗體或單鏈Fv。如Ladner等人之美國專利案第4,946,778號中所描述，抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈構築體。
可用於本文所揭示之雙特異性分子中之其他抗體為鼠類、嵌合及人類化單株抗體。
本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將組成性結合特異物結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異物可分別生成且隨後彼此結合。當結合特異物為蛋白或肽時，各種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、鄰伸苯基二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-l-羧酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基-SMCC) (Karpovsky等人, 1984 J. Exp. Med.
160, 1686-1701；Liu等人, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci.
82, 8648-8652)。其他方法包括描述於Brennan等人, 1985, Science
229, 81-83；Glennie等人 1987. J. Immunol.
139, 2367-2375；及Paulus, 1985 Behring Inst. Mitt. 118-132中之彼等方法。
或者，兩種結合特異物可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')
2或配體×Fab融合蛋白的情況。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。
雙特異性分子與其特異性目標之結合可藉由例如酶聯免疫吸附檢驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、放射免疫檢驗(radioimmunoassay，REA)、FACS分析、生物檢驗(例如生長抑制及細胞凋亡)或西方墨點檢驗來確認。此等檢驗中之每一者一般藉由採用對所關注之複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來偵測備受關注的蛋白-抗體複合物之存在。
IL-2 促效劑 本發明之IL-2促效劑包括IL2模擬多肽，其包含域X1、X2、X3及X4，其中：
(a) X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO: 30)之肽；
(b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽；
(c) X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO: 31)之肽；
(d) X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO: 32)之肽；
其中X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序；
其中胺基酸連接子可存在於域中之任一者之間。
術語「肽模擬物(peptide mimetic)」及「肽模擬物(peptidomimetic)」在本文中具有相同含義且係指多肽、生物學上模擬生物分子之活性配體的經修飾多肽。IL-2肽模擬物與IL-2 βƔ
c受體結合且能夠活化IL-2βƔ
c受體介導之信號傳導。IL-2模擬物描述於Silva等人, Nature 2019年1月;565(7738):186-191中。用於本發明方法中之例示性IL-2模擬物誘導IL-2受體之β及γ鏈的異二聚化，引起STAT5之磷酸化(其可如先前所定義特別地參考Silva等人, 2019來評定)。簡言之將細胞用IL-2促效劑刺激且隨後固定、滲透及與抗STAT5p抗體(諸如結合Alexa Fluor® 647之抗STAT5 pY694 (BD Biosciences))一起培育。MFI可在流式細胞儀(Beckman-Coulter)上測定。可將劑量反應曲線擬合至邏輯模型且計算半數最大有效濃度(EC
50值)及對應的95%信賴區間。在一些實施例中，本發明之IL-2促效劑誘導STAT5之磷酸化，以藉由上文詳述之STAT5磷酸化檢驗所量測，EC
50為10 nM或更低，特別地1 nM或更低，0.5 nM或更低，0.1 nM或更低或0.05 nM或更低。在一些實施例中，本發明之IL-2促效劑誘導STAT5之磷酸化，以藉由上文詳述之STAT5磷酸化檢驗所量測，EC
50介於0.001 nM與100 nM之間，特別地0.01與100 nM之間，0.01與50 nM之間，0.05與50 nM之間，0.1與50 nM之間。
更特定言之，本發明之IL-2模擬物(i)與IL-2受體βƔ
c異二聚體結合及(ii)為阿爾法不依賴性。在本文中藉由「阿爾法不依賴性」意欲指IL-2 R促效劑無法可偵測地結合IL-2Rα且因此具有消除的對IL-2Rα (CD25)之親和力。典型地，本發明之IL-2模擬物經設計以不具有IL-2Rα結合界面。
在一些較佳實施例中，與天然IL-2相比本發明之IL-2模擬物對IL-2RβƔ
c之親和力增加至少5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一些實施例中，IL-2促效劑對IL-2RβƔ
c之結合親和力(亦即如典型地藉由表面電漿子共振SPR測定之K
D)為200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低或25 nM或更低。典型地，本發明所揭示之IL-2促效劑組合之結合親和力介於0.1與100 nM之間，特別地在1與100 nM、1與50 nM、5與100 nM、5與50 nM或10與100 nM之間。
在本發明之一些實施例中，IL-2模擬物為長效IL-2受體促效劑。「長效」意謂IL-2模擬物之血漿或血清半衰期為3小時或更長，較佳地4小時或更長。在一些態樣中，IL-2模擬物之血清或血漿半衰期將為9或10小時或更長或12小時或更長。多肽之半衰期係指以藉由適當檢驗所量測多肽濃度減少50%所需的時間。減少可能由多肽之活體內分解、清除或螯合所引起。鑒於本發明IL-2模擬物之半衰期可藉由此項技術中已知之任何方式測定，諸如藉由量測血液中IL-2模擬物之濃度。舉例而言，為了量測活體內多肽之半衰期，向溫血動物(即向人類或向另一適合的哺乳動物，諸如小鼠、兔、大鼠、豬、狗或靈長類動物)投與適合劑量之多肽；自動物收集血液樣品或其他樣品；測定樣品中多肽之含量或濃度；及基於所量測資料計算至多肽之含量或濃度已減少50%之時間。參見例如Kenneth, A等人, Chemical Half-life of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及Peters等人, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)。如本文所用，「半衰期延長」或「更長半衰期」係指與對照相比用於描述蛋白半衰期之參數中之任何一或多者增大，諸如tl/2-阿爾法、11/2-貝塔及曲線下面積(area under the curve，AUC)。IL-2模擬物之長效性質可歸因於與IL-2模擬物結合或融合之部分。
由此可使IL-2模擬物進一步與其他化合物連接以促成延長的活體內半衰期(亦稱為半衰期延長技術)。任何此類化合物可用於本發明，其限制條件為其對於向人類個體投與足夠安全。
提高蛋白之半衰期的代表性技術典型地描述於Tan H, Su W, Zhang W, Wang P, Sattler M, Zou P. 「
Recent Advances in Half-life Extension Strategies for Therapeutic Peptides and Proteins」. Curr Pharm Des. 2018;24(41):4932-4946中。化合物連接之典型實例包括白蛋白偶合，包括與白蛋白(例如人類血清白蛋白，HAS)或其衍生物(例如白蛋白結合域，ABD)化學結合或遺傳融合；與一或多種諸如PEG (以產生聚乙二醇化IL-2模擬物)或聚丙二醇之合成聚合物鏈化學偶合(關於更多細節參見例如WO 87/00056及Harris, J., Chess, R. Nat Rev Drug Discov 2, 214-221 (2003));與可生物降解羥乙基澱粉(HES,以典型地產生HES化IL-2模擬物)化學偶合(關於更多細節參見Liebner R, Mathaes R, Meyer M, Hey T, Winter G, Besheer A. Eur J Pharm Biopharm. 2014;87(2):378-385)；糖基化(典型地藉由引入另外的N-糖基化或含有糖基化位點之模塊(諸如羧基末端肽)來達成)及IgG Fc融合(包括二聚或單體Fc區及/或Fc變體)。
「PEG」為聚(乙二醇)分子，其為乙二醇之水溶性聚合物。PEG可以不同尺寸獲得，且亦可以用化學反應基衍生而能夠與蛋白共價結合的經化學活化形式商業上獲得。直鏈PEG以不同分子量產生，諸如重量平均分子量為5,000道爾頓、10,000道爾頓、20,000道爾頓、30,000道爾頓及40,000道爾頓之PEG聚合物。分支鏈PEG聚合物亦已研發出。常用經活化PEG聚合物為用N-羥基丁二醯亞胺基(用於與諸如離胺酸殘基及蛋白N端之一級胺結合)、用醛基(用於與N端結合)及用順丁烯二醯亞胺或碘乙醯胺基(用於與諸如半胱胺酸殘基之硫醇基偶合)衍生之彼等經活化PEG聚合物。設計IL-2模擬物部分以便與PEG結合之方法為此項技術中已知的。舉例而言，添加含有聚乙二醇(「PEG」)之部分可包含使連接至順丁烯二醯亞胺基的PEG基(例如PEG-MAL)與多肽之半胱胺酸殘基連接。PEG-MAL之適合實例包括(但不限於)甲氧基PEG-MAL 5 kD；甲氧基PEG-MAL 20 kD；甲氧基(PEG)2-MAL 40 kD；甲氧基PEG(MAL)2 5 kD；甲氧基PEG(MAL)2 20 kD；甲氧基PEG(MAL)2 40 kD；或其任何組合。亦參見美國專利第8,148,109號。
此類連接可為共價或非共價的。
典型地，本發明之IL-2促效劑與天然IL-15多肽(諸如SEQ ID 51之人類IL-15)具有小於60%的一致性，特別地小於50%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%的一致性。
在一些實施例中，本發明之IL-2促效劑不結合IL-15Rα (CD215)，尤其SEQ ID 52之人類IL-15Rα (CD215)。
在一些實施例中，本發明之IL-2促效劑不包含與IL-15Rα (CD215)，尤其SEQ ID 52之人類15Rα (CD215)具有大於60%，特別地大於65%；70%；75%；80%；85%；90%；91%；92%；93%；94%；95%；96%；97%；98%；或99%一致性的胺基酸序列。
例示性 IL2 模擬物胺基酸連接子可具有認為適合於預期用途的任何長度。胺基酸之例示性長度包括長度為1-200、1-100、1-50、1-20、1-15、1-10、2-20、2-15或2-10個胺基酸之間的連接子。
在一些實施例中，X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO:30)之肽；X2為長度為至少8個胺基酸之肽；X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO:31)之肽；及X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO:32)之肽。
X1、X3及X4可具有任何合適的長度，意謂除SEQ ID NO: 30、31及32之胺基酸以外每個域亦可分別含有任何合適數目個另外的胺基酸。典型地，X1、X3及X4中之各者包含至少8個胺基酸。在一些態樣中，X1、X3及X4中之各者包含至少19個胺基酸。在一些此類態樣中，X1、X3及X4中之各者之長度為不超過200或100或50個胺基酸。
在一些實施例中，X1為肽，其包含與序列KIQLHAEHALYDALMILNI (SEQ ID NO: 33)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列；X2為長度為至少8個胺基酸之肽；X3為肽，其包含與序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG (SEQ ID NO: 34)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列；及X4為肽，其包含與序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列。
對於所有此等實施例，X1、X2、X3及X4在多肽中可呈任何次序。例示性域次序為X1-X3-X2-X4。
在一些實施例中，(i) X1包括以下中之1、2、3、4或全部5個：殘基4處之L、殘基5處之H、殘基8處之H、殘基11之Y、殘基15處之M；及/或(ii)X3包括以下中之1、2、3、4、5、6、7或全部8個：殘基3處之D、殘基4處之Y、殘基6處之F、殘基7處之N、殘基10處之L、殘基11處之I、殘基13處之E或殘基14處之E。在又一實施例中，(iii) X4包括殘基19處之I。參考SEQ ID NO: 33對所提及之X1之位置進行編號；參考SEQ ID NO: 34對所提及之X3之位置進行編號；及參考SEQ ID NO: 35對所提及之X4之位置進行編號。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 33胺基酸取代並不發生在位置7E、10L、11Y、12D及14L處；相對於SEQ ID NO: 34胺基酸取代並不發生在位置1L、4Y、7N、10L、11I及15I處；相對於SEQ ID NO: 35胺基酸取代並不發生在位置12I、16Q及18W處。
在一些實施例中，X1為肽，其包含與胺基酸序列KIQLHAEHALYDALMILNI (SEQ ID NO: 33)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列；X2為長度為至少8個胺基酸之肽；X3為肽，其包含與胺基酸序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG (SEQ ID NO: 34)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列；及X4為肽，其包含與胺基酸序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列；其中與EHALYDAL (SEQ ID NO:30)一致之胺基酸序列包含於SEQ ID NO: 33內；與YAFNFELI (SEQ ID NO:31)一致之胺基酸序列包含於SEQ ID NO: 34內；及與ITILQSWIF (SEQ ID NO:32)一致之胺基酸序列包含於SEQ ID NO: 35內。
如本文提及，域X2為結構域，且因此可使用連接相關其他域(取決於域次序)且允許其摺疊之任何胺基酸序列。所需要之長度將取決於製得的蛋白之結構且可為8個胺基酸或更長，且在一些態樣中，為19個胺基酸或更長。在一些此類態樣中，X2之長度為不超過200或100或50個胺基酸。在本文所提供之IL-2模擬物之任何實施例中，X2可為肽，其包含與序列KDEAEKAKRMKEWMKRIKT (SEQ ID NO: 36)至少90%、至少94%或100%一致的胺基酸序列。在一些態樣中，SEQ ID NO: 36之胺基酸突變成半胱胺酸殘基。在一些態樣中，胺基酸在SEQ ID NO: 36之位置1、2、5、9、12或16中之一者處。
本發明之例示性IL-2受體促效劑包含與SEQ ID NO: 37中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
| SEQ ID NO: 37 (NEO 2-15)： | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARL FESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
在一些此類實施例中，以下中之至少10、11、12、13或全部14個不成立：位置7為I，位置8為T或M，位置11為E，位置14為K，位置18為S，位置33為Q，位置36為R，位置37為F，位置39為K，位置40為R，位置43為R，位置44為N，位置46為W及位置47為G。在又一實施例中，以下中之一或兩者不成立：位置68為I及位置98為F。
在一些態樣中，本文所揭示之任何實施例之IL-2模擬多肽與IL-2受體βƔ
c異二聚體(IL-2RβƔ
c)結合，結合親和力(以藉由如Silva等人, Nature 2019中詳述的SPR所量測之K
D)為200 nM或更低、100 nM或更低、50 nM或更低或25 nM或更低。在一些態樣中，結合親和力介於1與200 nM之間，特別地在5與100 nM之間，更特定言之在10與100 nM之間，在10與50 nM之間或在5與50 nM之間。
本文所述之IL-2模擬物中所存在之半胱胺酸殘基可用於部分(例如穩定性部分，諸如(例如)水穩定部分(諸如含有PEG之部分))與多肽之連接。半胱胺酸部分可在X1、X2、X3或X4中之任一者或視情況存在之連接子中。在一些態樣中，半胱胺酸部分在X2中。舉例而言，本發明之例示性IL-2受體促效劑為多肽，其中Neo-2/15之胺基酸突變成半胱胺酸殘基以便使部分(例如穩定性部分，諸如(例如)水穩定部分(諸如含有PEG之部分))連接至其上。在一些態樣中，相對於SEQ ID NO: 37之位置50、53、56、58、59、62、66、69、73、77、82或85中之一或多者處的胺基酸突變成半胱胺酸殘基以便使部分(例如含有PEG之部分)連接至其上。
本發明之例示性IL-2受體促效劑包含與如下表4中所示的SEQ ID NO: 38-49中之任一者中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
表 4
| R50C | SEQ ID NO: 38 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIACLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| E53C | SEQ ID NO: 39 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFCSGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| D56C | SEQ ID NO: 40 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGCQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| K58C | SEQ ID NO: 41 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQCDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| D59C | SEQ ID NO: 42 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKCEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| E62C | SEQ ID NO: 43 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEACKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| R66C | SEQ ID NO: 44 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKCMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| E69C | SEQ ID NO: 45 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKCWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| R73C | SEQ ID NO: 46 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKCIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| T77C | SEQ ID NO: 47 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTCASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| E82C | SEQ ID NO: 48 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDCQEEMANAIITILQSWIFS |
| E85C | SEQ ID NO: 49 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQECMANAIITILQSWIFS |
本發明之IL-2受體促效劑包括多肽，該等多肽包含與SEQ ID NO. 38-49中之任一者中所述的胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。在說明性此類實施例中，存在突變的半胱胺酸(即D56C；K58C；D59C；R66C；T77C；E85C；R50C；E53C；E62C；E69C；R73C；及/或E82C)且視情況使突變的半胱胺酸連接至穩定性部分，諸如(例如)水穩定部分(諸如含有PEG之部分)，如本文所闡述。在一些實施例中，以下中之至少10、11、12、13或全部14個不成立：位置7為I，位置8為T或M，位置11為E，位置14為K，位置18為S，位置33為Q，位置36為R，位置37為F，位置39為K，位置40為R，位置43為R，位置44為N，位置46為W及位置47為G (編號參考SEQ ID NO: 38-49中之任一者)。在又一實施例中，以下中之一或兩者不成立：位置68為I及位置98為F (編號參考SEQ ID NO: 38-49中之任一者)。
本發明之例示性PEG化IL-2受體促效劑包括包含SEQ ID NO: 43 (NEO 2-15 E62C)中所述之胺基酸序列的多肽，其中使位置62處的半胱胺酸PEG化。聚乙烯基團可經由任何合適的連接化學物質來連接，包括(例如)用順丁烯二醯亞胺(例如經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG(PEG-MAL) 5 kD；PEG-MAL 20 kD；或PEG-MAL 40 kD)。在一些實施例中，用PEG-MAL 30 kD來PEG化。在一些實施例中，用經修飾之PEG-MAL 40 kD來PEG化。在一些實施例中，SEQ ID NO:43之PEG化肽中的重複PEG單元之範圍為約800-1000。在一些實施例中，SEQ ID NO: 43之PEG化肽中的重複PEG單元之平均數目為約850-950。熟習此項技術者將理解PEG部分可為直鏈或分支鏈。
本發明之例示性PEG化IL-2受體促效劑包括包含SEQ ID NO: 48 (NEO 2-15 E82C)中所述之胺基酸序列的多肽，其中使位置82處的半胱胺酸PEG化。聚乙烯基團可經由任何合適的連接化學物質來連接，包括(例如)用經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG(PEG-MAL) 5 kD；PEG-MAL 20 kD；或PEG-MAL 40 kD。在一些實施例中，用PEG-MAL 30 kD來PEG化。在一些實施例中，用PEG-MAL 40 kD來PEG化。在一些實施例中，SEQ ID NO: 48之PEG化肽中的重複PEG單元之範圍為約800-1000。在一些實施例中，SEQ ID NO: 48之PEG化肽中的重複PEG單元之平均數目為約850-950。熟習此項技術者將理解PEG部分可為直鏈或分支鏈。
本發明之例示性PEG化IL-2受體促效劑包括包含SEQ ID NO: 45 (NEO 2-15 E69C)中所述之胺基酸序列的多肽，其中使位置69處之半胱胺酸PEG化。聚乙烯基團可經由任何合適的連接化學物質來連接，包括(例如)用經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG (例如PEG-MAL 5 kD；PEG-MAL 20 kD；或PEG-MAL 40 kD)。在一些實施例中，用PEG-MAL 30 kD來PEG化。在一些實施例中，用經修飾之PEG-MAL 40 kD來PEG化。在一些實施例中，SEQ ID NO: 45之PEG化肽中的重複PEG單元之範圍為約800-1000。在一些實施例中，SEQ ID NO: 45之PEG化肽中的重複PEG單元之平均數目為約850-950。熟習此項技術者將理解PEG部分可為直鏈或分支鏈。
本發明之例示性PEG化IL-2受體促效劑包括包含SEQ ID NO: 46 (NEO 2-15 R73C)中所述之胺基酸序列的多肽，其中使位置73處的半胱胺酸PEG化。聚乙烯基團可經由任何合適的連接化學物質來連接，包括(例如)用經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG(PEG-MAL) 5 kD；PEG-MAL 20 kD；或PEG-MAL 40 kD。在一些實施例中，用PEG-MAL 30 kD來PEG化。在一些實施例中，用經修飾之PEG-MAL 40 kD來PEG化。在一些實施例中，SEQ ID NO: 46之PEG化肽中的重複PEG單元之範圍為約800-1000。在一些實施例中，SEQ ID NO: 46之PEG化肽中的重複PEG單元之平均數目為約850-950。熟習此項技術者將理解PEG部分可為直鏈或分支鏈。
本發明之例示性PEG化IL-2受體促效劑包括包含SEQ ID NO: 44 (NEO 2-15 R66C)中所述之胺基酸序列的多肽，其中使位置66處之半胱胺酸PEG化。聚乙烯基團可經由任何合適的連接化學物質來連接，包括(例如)用經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG(PEG-MAL) 5 kD；PEG-MAL 20 kD；或PEG-MAL 40 kD。在一些實施例中，用PEG-MAL 30 kD來PEG化。在一些實施例中，用經修飾之PEG-MAL 40 kD來PEG化。在一些實施例中，SEQ ID NO: 46之PEG化肽中的重複PEG單元之範圍為約800-1000。在一些實施例中，SEQ ID NO: 46之PEG化肽中的重複PEG單元之平均數目為約850-950。熟習此項技術者將理解PEG部分可為直鏈或分支鏈。
本文所述之多肽及肽域可包括N端、C端或二者處之另外的殘基；此等另外的殘基並不包括於測定本發明之多肽或肽域相對於參考多肽之一致性百分比中。此類殘基可為適用於預期用途之任何殘基，包括(但不限於)偵測標記(即：螢光蛋白、抗體抗原決定基標記等)、轉接子、適用於純化目的之配體(His標記等)、添加官能基至多肽的其他肽域等。如美國專利第9,676,871號及第9,777,070號中所揭示，適用於此類基團之連接的殘基可包括半胱胺酸、離胺酸或對乙醯基苯丙胺酸殘基或可為標記物，諸如適用於與轉麩醯胺酸酶反應的胺基酸標記物。
組合套組及組合物 組合套組如先前所定義之包含抗BTN3A抗體及IL-2促效劑的本發明之組合可以組合套組形式呈現。如本文所用，術語「組合套組」或「分部分之套組」意謂用於投與之醫藥組合物或組合物，本發明之抗BTN3A抗體及IL-2促效劑。當兩種化合物同時投與時，組合套組可含有例如獨立醫藥組合物中之組分(適合地抗BTN3A抗體及IL-2促效劑)。當組分(適合地抗BTN3A抗體及IL-2促效劑)並不同時投與時，組合套組將在單獨醫藥組合物中(在單個套件中或在單獨套件中的單獨醫藥組合物中)含有活性劑。
在一個態樣中，提供一種分部分之套組，其包含：
與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑締合之抗BTN3A抗體，典型地如先前所定義之包含抗BTN3A抗體的組合物；及
與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑締合的IL-2促效劑，典型地如先前所定義之包含IL-2促效劑的組合物。
在本發明之一個實施例中，分部分之套組包含：
與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑締合之抗BTN3A抗體，典型地包含如先前所定義之抗BTN3A抗體的組合物；及
與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑締合之IL-2促效劑，典型地包含如先前所定義之IL-2促效劑的組合物
其中組分以適合於依序、分開及/或同步投與之形式提供。
在一個實施例中，分部分之套組包含：
第一容器，其包含與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑締合之抗BTN3A抗體，典型地包含如先前所定義之抗BTN3A抗體的組合物；及
第二容器及用於容納該等第一及第二容器之容器構件，該第二容器包含與醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑締合之IL-2促效劑，典型地包含如先前所定義之IL-2R促效劑的組合物。
組合套組亦可提供有說明書，諸如劑量及投與說明書。此類劑量及投與說明書可為提供給醫生之種類，或其可為由醫生所提供之種類，諸如向患者提供之說明書。
組合物因此，根據本發明，例如可將如本文所定義之抗BTN3A抗體及如本文所定義之IL-2促效劑分別調配成單獨的組合物(例如醫藥組合物)，其中該抗BTN3A抗體及/或IL-2促效劑與醫藥學上可接受的載劑一起調配。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」係指稀釋劑、助劑或賦形劑且包括生理學上相容之任何及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似物。除活性化合物(亦即抗BTN3A抗體及/或IL-2促效劑)以外組合物亦可進一步包含以下化合物中之一或多者。
載劑應適用於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。在一個實施例中，載劑應適合於皮下途徑或瘤內注射。視投與途徑而定，可將如先前所定義之抗BTN3A抗體包覆在材料中以保護化合物免於可能使化合物失活的酸作用及其他天然條件。
無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水為醫藥學上可接受之載劑之一個實例。其他適合之載劑為此項技術中所熟知。(Remington及Gennaro, 1995)調配物可進一步包括一或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩衝劑、白蛋白以預防小瓶表面上的蛋白損失等。
醫藥組合物之形式、投與途徑、劑量及方案天然地視待治療之病況、疾病之嚴重程度、患者之年齡、體重及性別等而定。
本發明之醫藥組合物可經調配以用於局部、經口、非經腸、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或眼內投與及類似投與方式。
較佳地，醫藥組合物含有對於能夠注射之調配物而言醫藥學上可接受之媒劑。此等媒劑尤其可為等張無菌生理鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及其類似者或此類鹽之混合物)，或乾燥，尤其經冷凍乾燥的組合物，其在視情況而添加滅菌水或生理鹽水時，准許復原成可注射溶液。
用於投與之劑量可根據各種參數予以調適，且尤其根據所用投與模式、相關病理學或可替代地所要治療持續時間予以調適。
為了製備醫藥組合物，可將有效量之抗BTN3A抗體及/或IL-2促效劑溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑或水性介質中。
可注射組合物較佳為無菌的。適用於可注射使用之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液；調配物，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；及用於無菌可注射溶液或分散液之即用製劑的無菌粉末或凍乾物。在所有情況下，形式必須為無菌的且必須為達到存在易於注射性程度之流體。形式必須在製造及儲存條件下穩定，且必須保護免遭微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。
可在水中適當地與界面活性劑(諸如羥丙基纖維素)混合製備呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式之活性化合物的溶液。亦可在丙三醇、液態聚乙二醇及其混合物中及在油中製備分散液。在普通的儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
載劑亦可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液態聚乙二醇及其類似物)、其適合的混合物及植物油。舉例而言，可藉由使用包衣(諸如卵磷脂)、藉由維持就分散液而言所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性。預防微生物作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在多數情況下，將較佳地包括等張劑，例如糖或氯化鈉。延長可注射組合物之吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
無菌可注射溶液係如下製備：將所需量之活性化合物視需要與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將各種滅菌活性成分併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有鹼性分散介質及來自上文所列舉之彼等成分的所需其他成分。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，由其先前無菌過濾溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。
亦涵蓋製備用於直接注射之更加或高度濃縮之溶液，其中設想使用DMSO作為溶劑產生極快滲透，遞送高濃度之活性劑至小腫瘤區域中。
在調配時，將以與劑量調配物相容之方式且以治療有效之量投與溶液。調配物易於以各種劑型(諸如上文所述之可注射溶液之類型)投與，但亦可採用藥物釋放膠囊及其類似劑型。
舉例而言，對於以水溶液形式進行非經腸投與而言，必要時溶液應經適當緩衝，且首先用充足的生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。此等特定水溶液尤其適合於靜脈內、肌肉內、皮下及腹膜內投與。在此方面，依據本發明，可採用之無菌水性介質將為熟習此項技術者已知的。舉例而言，單次劑量可溶解於1 ml等張NaCl溶液中，且添加至1000 ml皮下灌注流體，或在建議之輸注位點注射，(參見例如「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第15版，第1035-1038及1570-1580頁)。視所治療個體之病況而定，將必然出現一些劑量變化。在任何情況下，負責投與之人員將判定個別個體之適當劑量。非經腸組合物可封閉於由玻璃、塑膠或其他材料製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
除經調配用於非經腸投與(諸如靜脈內或肌肉內注射)之化合物以外，其他醫藥學上可接受之形式包括例如錠劑或用於經口投與之其他固體；延時釋放膠囊；及當前使用之任何其他形式。當組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時，除以上類型之材料之外，其亦可含有液體載劑，諸如聚乙二醇、環糊精或脂肪油。組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。液體可用於經口投與或用於藉由注射遞送。當意欲用於經口投與時，組合物可包含甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及增香劑中之一或多者。在用於藉由注射投與之組合物中，亦可包括界面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝液、穩定劑及等張劑中之一或多者。亦涵蓋延遲釋放膠囊，包括具有腸溶包衣之彼等延遲釋放膠囊。
在某些實施例中，涵蓋使用脂質體及/或奈米粒子將抗體引入宿主細胞中。脂質體及/或奈米粒子之形式及用途為熟習此項技術者已知。
奈米膠囊可一般以穩定及可複製方式裹住化合物。為避免由細胞內聚合物過載引起之副作用，此類超細粒子(尺寸為約0.1 µm)一般使用能夠在活體內降解之聚合物設計。涵蓋滿足此等要求之生物可降解聚氰基丙烯酸烷酯奈米粒子以用於本發明，且此類粒子可易於製得。
脂質體由磷脂形成，磷脂分散於水性介質中且自發形成多層同心雙層小泡(亦稱為多層小泡(multilamellar vesicle，MLV))。MLV一般具有25 nm至4 µm之直徑。MLV之音波處理使得形成直徑在200至500 Å範圍內且在核心含有水溶液之小單層小泡(small unilamellar vesicle，SUV)。脂質體之物理特徵視pH、離子強度及二價陽離子之存在而定。
IL-2促效劑及/或抗BTN3A抗體可為醫藥組合物中之唯一活性劑，或組合物可進一步包含一或多種適合於預期用途之其他活性劑。
包含抗 BTN3A 抗體之組合物及給藥方案在一些實施例中，如本文所定義之抗BTN3A抗體可由此以組合物(例如如上文所定義之醫藥組合物)形式調配，該組合物含有本文所揭示的抗體中之一種或組合，例如一種選自由mAb1、mAb2、mAb4及mAb5或其抗原結合部分以下組成之群的抗體，其與醫藥學上可接受之載劑一起調配。
本發明之抗體可以中性或鹽形式調配成如上文所定義之組合物。醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽(由蛋白之游離胺基形成)且其由無機酸(諸如(例如)鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及其類似酸)形成。用游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼，諸如(例如)氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因(procaine)及其類似鹼。用於輸注或皮下注射抗體之溶液的適合調配物已在此項技術中描述，且例如綜述於Cui等人(Drug Dev Ind Pharm 2017, 43(4): 519-530)中。在較佳實施例中，如上文所定義抗BTN3A抗體經調配以用於靜脈內輸注。
包含活化抗BTN3A抗體之醫藥組合物可以不同濃度調配。舉例而言，調配物可包含濃度在0.1 μΜ與1 mM之間，更佳地在1 μΜ與500 μΜ之間、在500 μΜ與1 mM之間、在300 μΜ與700 μΜ之間、在1 μΜ與200 μΜ之間、在100 μΜ與200 μΜ之間、在200 μΜ與300 μΜ之間、在300 μΜ與400 μΜ之間、在400 μΜ與500 μΜ之間、在500 μΜ與600 μΜ之間、在600 μΜ與700 μΜ之間、在800 μΜ與900 μΜ之間或在900 μΜ與1 mM之間的活化抗BTN3A抗體。典型地，調配物包含濃度在300 μΜ與700 μΜ之間的活化抗BTN3A抗體。
典型地，人類患者之活化抗BTN3A抗體的治療劑量將在每次投與100 pg至700 mg範圍內(基於70 kg之體重)。舉例而言，最大治療劑量可在每次投與0.1至10 mg/kg範圍內，例如在0.1與5 mg/kg之間或在1與5 mg/kg之間或在0.1與2 mg/kg之間。應瞭解，如由腫瘤學家/醫師所判定此類劑量可以不同間隔投與；舉例而言，劑量可為每日、每週兩次、每週一次、每兩週、每三週或每月投與。
典型地，在具體實施例中，該活化抗BTN3A抗體以介於每次劑量(典型地每21天)在20 μg與200 mg之間，特別地在1 mg與200 mg之間或在7 mg與200 mg之間的劑量靜脈內投與。
在具體實施例中，用於靜脈內投與活化抗BTN3A抗體之適合劑量可選自1、7、10、20、50、75、100、125、150、175及200 mg。
在具體實施例中，用於根據本發明方法使用之活化抗BTN3A抗體(較佳地如下文所描述之mAb1)以介於每次劑量20 μg與200 mg之間的劑量靜脈內投與，較佳地第二劑量在第一劑量之後至少15天(典型地在約21天之後)投與。
包含 IL-2 促效劑之 組合物及給藥方案包含本發明之IL-2促效劑的醫藥組合物可經調配以使得當向患者投與該組合物時IL-2促效劑為生物可用的。IL-2促效劑可呈溶液、懸浮液、乳液、微粒、錠劑、丸劑、小丸劑、膠囊、含有液體之膠囊、粉劑、持續釋放型調配物、栓劑、乳液、氣霧劑、噴霧劑、懸浮液之形式或適合使用之任何其他形式。適合的醫藥載劑之其他實例描述於E. W. Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。一般熟習此項技術者將顯而易見，醫藥組合物中之活性成分之最佳劑量將視各種因素而定。相關因素包括(但不限於)動物類型(例如人類)、IL-2受體促效劑之特定形式、投與方式及所用組合物。
如本文所定義之IL-2促效劑可藉由任何便利的途徑投與，例如藉由輸注或推注注射。可全身性或局部投與。典型投與途徑包括(但不限於)經口、局部、非經腸、舌下、經直腸、經陰道、經眼、瘤內及鼻內。非經腸投與包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦幹內注射或輸注技術。在一個態樣中，IL-2促效劑係非經腸投與。在另一態樣中，IL-2促效劑係靜脈內或皮下投與。在具體實施例中，需要將IL-2促效劑局部投與至需要治療的區域。在一個實施例中，投與可藉由直接注射在癌症、腫瘤或贅生性或前贅生性組織之部位(或形成部位)。在另一實施例中，投與可藉由直接注射在表現自體免疫疾病之部位(或形成部位)。局部投與之實例為經由導管輸注，例如膀胱內輸注。
用於IL-2R促效劑及特別地用於如本文所定義之IL-2模擬物的適合劑量範圍可(例如)為0.1 ug/kg-100 mg/kg體重；或者，其可為0.5 ug/kg至50 mg/kg；1 ug/kg至25 mg/kg或5 ug/kg至10 mg/kg體重。在一些實施例中，例示性劑量為約2 ug/mg至約15 ug/kg。在一些實施例中，投與方案包括基於21天週期提供IL-2受體促效劑，其中在21天週期期間給藥一次或兩次。
本發明之組合的用途及方法 本發明提供一種治療組合，其包含如先前所定義之抗BTN3A抗體及IL-2促效劑用於治療癌症。
本發明亦提供一種治療有需要之患者的癌症之方法，其包含向該患者組合、同時、依序或分開投與治療有效量之抗BTN3A活化抗體及治療有效量之IL2促效劑，該IL2促效劑與IL-2受體βγc異二聚體結合且(i)具有降低的對IL-2Rα (CD25)之親和力或(ii)沒有用於IL-2Rα之結合位點。
如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指以下中之一或多者：(1)抑制疾病；例如抑制正經歷或顯示疾病、病況或病症的病變或症狀之個體的疾病、病況或病症(亦即遏制病變及/或症狀之進一步進展)；及(2)減輕疾病；例如減輕正經歷或顯示疾病、病況或病症的病變或症狀之個體的疾病、病況或病症(亦即逆轉病變及/或症狀)，諸如降低疾病之嚴重程度或減少或緩解疾病之一或多個症狀。特定言之，參考腫瘤之治療，術語「治療」可指抑制腫瘤生長或減小腫瘤尺寸。
本發明之抗體為抗BTN3A活化抗體且可活化溶胞功能、細胞介素產生及/或Vγ9Vδ2 T細胞之增殖，且由此可用於克服癌症患者中(特別地參見WO2012080769、WO2012080351及WO2020025703)及在慢性感染期間所觀測到之免疫抑制機制。本發明之結果現展示本組合進一步促進人類PBMC中協同性及特異性Vγ9Vδ2 T細胞擴增，突出其治療重要性，特別地用於治療癌症。
如本文所用，術語「癌症」、「過度增殖」及「贅生性」係指細胞具有自主生長能力，亦即以快速增殖性細胞生長為特徵之異常狀態或狀況。過度增殖性及贅生性疾病病狀可分類為病理性，亦即表徵或構成疾病病狀，或可分類為非病理性的，亦即與正常之偏差但不與疾病病狀相關。該術語意欲包括所有類型之癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化細胞、組織或器官(與組織病理學類型或侵襲階段無關)。
術語「癌症」或「贅瘤」包括各種器官系統之惡性病，諸如影響肺、乳房、甲狀腺、淋巴、胃腸道及泌尿生殖道；以及腺癌，其包括惡性病，諸如大部分結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌及/或睾丸腫瘤、肺之非小細胞癌、小腸癌及食道癌。
癌症之實例包括(但不限於)血液惡性病，諸如B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B-NHL、T-NHL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、NK細胞淋巴瘤及骨髓細胞系瘤(包括急性骨髓白血病)。
非血液癌(亦即實體腫瘤)之實例包括(但不限於)結腸癌、乳癌、肺癌、腦癌、前列腺癌、頭頸癌、胰臟癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、口腔癌、食道癌、甲狀腺癌、腎癌、胃癌、睾丸癌及皮膚癌。
本發明之組合療法中的各治療劑(亦即如先前所定義之抗BTN3A抗體及IL-2促效劑)可同時(亦即在同一藥物中)、並行(亦即在單獨藥物中，以任何次序在一種藥物之後立刻投與另一藥物)或以任何次序依序投與。如先前所描述抗BTN3A抗體及IL-2促效劑典型地調配成單獨的組合物。一或多種組合物可經口或非經腸投與，包括如先前所詳述之靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下、經直腸、局部及經皮投與途徑。
在本發明之組合療法中，BTN3A抗體及IL-2促效劑可獨立地經口或非經腸投與，包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下、經直腸、局部及經皮投與途徑。
當組合療法中之治療劑呈不同劑型(一種藥劑為錠劑或膠囊而另一藥劑為無菌液體)及/或根據不同給藥時程投與(例如化學治療劑為至少每日投與而生物治療劑以更低頻率投與，諸如每週一次、每兩週一次或每三週一次)時，依序投與(例如在單獨醫藥組合物中)尤其適用。
在一些實施例中，抗BTN3A活化抗體係投與IL-2促效劑之前投與，而在其他實施例中抗BTN3A活化抗體係在投與IL-2促效劑之後投與。
選擇用於本發明之組合療法之給藥方案(在本文中亦稱為投與方案)取決於若干因素，包括實體之血清或組織周轉率、症狀之程度、實體之免疫原性及所治療個體中目標細胞、組織或器官之可接近性。較佳地，給藥方案根據副作用之可接受程度來使遞送至患者之各治療劑之量達至最大。因此，組合中之各生物治療劑及化學治療劑之劑量及給藥頻率部分地取決於特定治療劑、所治療癌症之嚴重程度及患者特徵。可獲得關於選擇抗體、細胞介素及小分子之適當劑量的指導。參見例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK；Kresina (編) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY；Bach (編) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY；Baert等人 (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608；Milgrom等人 (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973；Slamon等人 (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792；Beniaminovitz等人 (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619；Ghosh等人 (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32；Lipsky等人 (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602；Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 第57版)；Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版 (2002年11月)。適當的給藥方案可由臨床醫師判定，例如使用在此項技術中已知或懷疑影響治療或被預測為影響治療之參數或因素，且將視例如患者之臨床病史(例如先前療法)、待治療之癌症的類型及階段及對組合療法中之一或多種治療劑之反應的生物指標而定。
如由主治醫務人員所判定可使用任何適合的劑量範圍。可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。用於IL-2促效劑及特別地用於如本文所定義之IL-2模擬物的適合劑量範圍可(例如)為0.1 ug/kg-100 mg/kg體重；或者，其可為0.5 ug/kg至50 mg/kg；1 ug/kg至25 mg/kg或5 ug/kg至10 mg/kg體重。在一些實施例中，例示性劑量為約2 ug/mg至約15 ug/kg。在一些實施例中，投與方案包括基於21天週期提供IL-2受體促效劑，其中在21天週期期間給藥一次或兩次。
在一些實施例中，組合療法中之至少一種治療劑係使用當該藥劑用作治療相同癌症之單一療法時典型地採用之相同給藥方案(治療之劑量、頻率及持續時間)投與。在其他實施例中，與當藥劑用作單一療法時相比，患者接收較低總量(例如較小劑量、不太頻繁給藥及/或較短治療持續時間)的組合療法中之至少一種治療劑。
關於本治療組合之抗BTN3A抗體及IL-2促效劑的給藥方案，如由主治醫務人員所判定可使用任何適合的劑量範圍。
可調整給藥方案以提供最佳所需反應(例如治療性或預防性反應)。可將本發明之抗體調配在治療性混合物內以包含每劑量約0.0001至100.0毫克、或約0.001至10毫克、或約0.0001至1.0毫克、或約0.001至0.1毫克、或約0.1至1.0毫克或甚至1.0至約10毫克。亦可投與多次劑量。典型地，人類患者之活化抗BTN3A抗體的治療劑量將在每次投與100 pg至700 mg範圍內(基於70 kg之體重)。舉例而言，最大治療劑量可在每次投與0.1至10 mg/kg範圍內，例如在0.1與5 mg/kg之間或在1與5 mg/kg之間或在0.1與2 mg/kg之間。應瞭解，如由腫瘤學家/醫師所判定此類劑量可以不同間隔投與；舉例而言，劑量可為每日、每週兩次、每週一次、每兩週、每三週或每月投與。
典型地，在具體實施例中，該活化抗BTN3A抗體以介於每次劑量(典型地每21天) 20 μg與200 mg之間的劑量靜脈內投與。
在具體實施例中，用於靜脈內投與活化抗BTN3A抗體之適合劑量可選自1、7、10、20、50、75、100、125、150、175及200 mg。
在具體實施例中，用於根據本發明方法之用途的活化抗BTN3A抗體(較佳地如下文所描述之mAb1)以介於每次劑量20 μg與200 mg之間的劑量靜脈內投與，較佳地第二劑量在第一劑量之後至少15天(典型地在約21天之後)投與。
對於IL-2促效劑，用於多肽之適合劑量範圍可(例如)為0.1 ug/kg-100 mg/kg體重；或者，其可為0.5 ug/kg至50 mg/kg；1 ug/kg至25 mg/kg或5 ug/kg至10 mg/kg體重。在一些實施例中，例示性劑量為約2 ug/mg至約15 ug/kg。在一些實施例中，投與方案包括基於21天週期提供IL-2受體促效劑，其中在21天週期期間給藥一次或兩次。
不管呈混合式單一組合物或呈單獨組合物形式，如先前所定義之包含抗BTN3A抗體及IL-2促效劑之組合療法均可進一步與其他藥物結合投與(例如)用於治療或預防上述疾病。
在具體實施例中，如本文所揭示之組合療法(典型地如先前所描述之mAb1及IL-2促效劑，特別地IL-2模擬物)可與抗腫瘤劑組合投與。
在其他具體實施例中，如本文所揭示之組合療法(典型地如先前所描述之mAb1及IL-2促效劑，特別地IL-2模擬物)可與細胞療法(尤其γδT細胞療法)組合投與。
在其他具體實施例中，如本文所揭示之組合療法(典型地如先前所描述之mAb1及IL-2促效劑，特別地IL-2模擬物)可與免疫治療藥物一起投與，諸如免疫檢查點抑制劑(尤其抗-PD-1、抗PD-L1及抗CTLA-4抗體)。
如本文所用，術語「細胞療法」係指包含向有需要之個體活體內投與至少治療有效量之細胞組合物的療法。向患者投與之細胞可為同種異體的或自體的。術語「γδ T細胞療法」係指其中細胞組合物包括γδ T細胞(尤其Vγ9Vδ2 T細胞)作為活性成分之細胞療法。在具體實施例中，該等Vγ9Vδ2 T細胞已經活體外擴增及/或活化。
細胞療法產品係指出於治療目的向該患者投與之細胞組合物。該細胞療法產品包括治療有效劑量之細胞且視情況包括另外的賦形劑、佐劑或其他醫藥學上可接受之載劑。
術語「PD-1」具有其在此項技術中之一般含義且係指計劃性死亡-1受體。術語「PD-1」亦指I型跨膜蛋白，其屬於CD28-B7信號傳導受體家族，該家族包括CD28、細胞毒性T淋巴球相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)、誘導性共刺激因子(inducible costimulator，ICOS)及B及T淋巴球弱化因子(B- and T-lymphocyte attenuator，BTLA) (Greenwald RJ等人, 2005, Annual Review of Immunology第23卷第515-548頁)。
術語「抗PD-1抗體」或「抗PD-L1」具有其在此項技術中之一般含義且係指分別對PD-1或PD-L1具有結合親和力且對PD-1具有拮抗活性的抗體，亦即其抑制與PD-1相關之信號轉導級聯且抑制PD-1配體結合(PD-L1；PD-L2)。此類抗PD-1抗體或抗-PD-L1抗體較佳地分別以比其與CD28-B7信號傳導受體家族(CD28；CTLA-4；ICOS；BTLA)之其他亞型或同功異構物之相互作用更大的親和力及效能使PD-1失活。用於判定化合物是否為PD-1拮抗劑之測試及檢驗已為此項技術中之技術人員所熟知，諸如Shaabani S,等人 (2015-2018). Expert Opin Ther Pat. 2018年9月; 28(9):665-678；Seliger, B.
J. Clin. Med.2019,
8, 2168中所描述。
此類抗PD1或抗PDL1抗體之實例包括(但不限於)納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐魯單抗(durvalumab)、西米普利單抗(cemiplimab)或阿特珠單抗(atezolizumab)。
此類抗CTLA4抗體之實例包括(但不限於)伊派利單抗(ipilimumab)。
另一治療策略係基於利用本文所揭示之組合作為藥劑選擇性擴增及/或活化自人類個體樣品分離的Vγ9Vδ2 T細胞之特性。
由此本發明係關於一種用於治療有需要之個體的方法，其包含：
(a) 分離包含Vγ9Vδ2 T細胞之血細胞，例如來自個體之血液樣品的PBMC，
(b) 在適當細胞培養基中培養該等經分離血細胞，且可同時、並行或依序向細胞培養物添加有效量之抗BTN3A抗體及IL-2促效劑，並視情況添加其他腫瘤或附件細胞，且由此獲得經擴增的Vγ9Vδ2 T細胞，
(c) 收集經擴增的Vγ9Vδ2 T細胞，
(d) 視情況，調配經擴增的Vγ9Vδ2 T細胞且向個體投與治療有效量之該等Vγ9Vδ2 T細胞。
本發明進一步關於本文所揭示之組合的用途，其用於選擇性擴增嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR) Vγ9Vδ2 T細胞。CAR γδ T細胞及其在過繼性T細胞癌症免疫療法中之用途描述於例如Mirzaei等人 (Cancer Lett 2016, 380(2): 413-423)中。
本發明亦係關於如本文所定義之組合用於活體內使用以在有需要之個體(典型地罹患癌症)的γδ T細胞療法在中增強腫瘤細胞，其中抗BTN3A抗體及IL-2促效劑可同時、並行或依序向個體投與。
如本文所用，術語γδ T細胞療法係指包含向有需要之個體投與至少有效量之γδ T細胞的療法。此類γδ T細胞可為同種異體的或自體的。在具體實施例中，γδ T細胞可藉由特定基因之缺失或敲除或插入或敲入來進行基因工程改造。在具體實施例中，該等γδ T細胞包括表現嵌合抗原受體之γδ T細胞。γδ T細胞可已經活體外擴增及/或純化。或者，γδ T細胞亦可包含於細胞組合物中，該細胞組合物包含其他血細胞及(例如)免疫系統之其他細胞。關於γδ T細胞療法之參考文獻，請參見Pauza CD.等人, Front Immunol. 2018年6月8日;9:1305. doi: 10.3389，Saudemont A.等人, Front Immunol. 2018年2月5日;9:153. doi: 10.3389。
由此本發明係關於一種治療罹患癌症之個體之方法，該癌症包括實體腫瘤或血液惡性病，尤其白血病(諸如急性骨髓白血病)及具有腫瘤細胞(例如血液腫瘤細胞)，該方法包含：
i. 向該個體投與和有效量之IL-2促效劑組合之有效量之如本文所揭示的抗BTN3A抗體(典型地mAb1、mAb2、mAb4或mAb5)，其中該抗BTN3A抗體及IL-2促效劑可同時、並行或依序投與，及，
ii. 向該個體投與有效量之γδ T細胞組合物，
其中該有效量之抗BTN3A抗體與該有效量之IL-2促效劑的組合具有增強由該γδ T細胞組合物對抗該等腫瘤細胞介導之抗腫瘤細胞溶解的能力。
本發明進一步關於一種用於治療罹患癌症帶有實體腫瘤細胞(例如卵巢癌細胞)之個體之方法，該方法包含：
i. 向該個體投與有效量之如本文所揭示的抗BTN3A抗體(典型地mAb1、mAb2、mAb4或mAb5)與有效量之如本文所定義之IL-2促效劑之組合，其中該抗BTN3A抗體及IL-2促效劑可同時、並行或依序投與，及，
ii. 向該個體投與有效量之γδ T細胞組合物，
其中該有效量之抗BTN3A抗體與該有效量之IL-2促效劑的組合具有增強由該γδ T細胞組合物對抗該等腫瘤細胞介導之抗腫瘤細胞溶解的能力。
已充分描述之本發明現進一步藉由以下實例說明，該等實例僅為說明性且並不意欲受進一步限制。
表 5：本發明中所使用之序列
| SEQ ID NO: | 類型 | 序列之描述 | 序列 |
| 1 | aa | mAb 7.2之人類化重鏈可變區VH2 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSS |
| 2 | aa | mAb 7.2之人類化輕鏈可變區Vk1 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK |
| 3 | aa | mAb 7.2之人類化輕鏈可變區Vk2 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK |
| 4 | aa | mAb 1及mAb 2之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG1) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 5 | aa | mAb 4及mAb 5之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG4) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTRYYMYWVKQRPGQGLEWIGEINPNNGGTKFNEKFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCSREDDYDGTPFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG |
| 6 | aa | mAb 1及mAb 4之全長輕鏈(Vk1 7.2) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFTGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 7 | aa | mAb 2及mAb 5之全長輕鏈(Vk2 7.2) | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| 8 | nt | mAb 1及mAb 2之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG1) | CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTGA |
| 9 | nt | mAb 4及mAb 5之全長重鏈(VH2 7.2沉默IgG4) | CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACATCTTCACCAGATACTATATGTATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAAGTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAGGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCATCAGCACAGCATACATGGAGCTCAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCGGTCTATTATTGTTCAAGAGAGGATGATTACGACGGGACCCCCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAATGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTTGA |
| 10 | nt | mAb 1及mAb 4之全長輕鏈(Vk1 7.2) | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTACTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG |
| 11 | nt | mAb 2及mAb 5之全長輕鏈(Vk2 7.2) | GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTATCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAACTCTTGATCTATAAGGCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGATTTAGTGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAACTTATCCATACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG |
| 12 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR1 | RYYMY |
| 13 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR2 | EINPNNGGTKFNEKFKN |
| 14 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之HCDR3 | EDDYDGTPFAMDY |
| 15 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR1 | HASQNINVWLS |
| 16 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR2 | KASNLHT |
| 17 | aa | mAb 7.2、mAb 1、mAb 2、mAb 4及mAb 5之LCDR3 | QQGQTYPYT |
| 18 | aa | mAb 20.1之HCDR1 | RYYLY |
| 19 | aa | mAb 20.1之HCDR2 | EINPNNGGTKFNEKFKS |
| 20 | aa | mAb 20.1之HCDR3 | EDDYDGTPDAMDY |
| 21 | aa | mAb 20.1之LCDR1 | HASQNINLWLS |
| 22 | aa | mAb 20.1之LCDR2 | RASNLHT |
| 23 | aa | mAb 20.1之LCDR3 | QQGHSYPYT |
| 24 | aa | 人類BTN3A1 | MKMASFLAFLLLNFRVCLLLLQLLMPHSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHVDVKGYKDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNNKGENIPTVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTASISIADPFFRSAQRWIAALAGTLPVLLLLLGGAGYFLWQQQEEKKTQFRKKKREQELREMAWSTMKQEQSTRVKLLEELRWRSIQYASRGERHSAYNEWKKALFKPADVILDPKTANPILLVSEDQRSVQRAKEPQDLPDNPERFNWHYCVLGCESFISGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVQRKGWVKMTPENGFWTMGLTDGNKYRTLTEPRTNLKLPKPPKKVGVFLDYETGDISFYNAVDGSHIHTFLDVSFSEALYPVFRILTLEPTALTICPA |
| 25 | aa | 人類BTN3A2 | MKMASSLAFLLLNFHVSLLLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELKWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNAKGENIPAVEAPVVADGVGLYEVAASVIMRGGSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPILLLLLAGASYFLWRQQKEITALSSEIESEQEMKEMGYAATEREISLRESLQEELKRKKIQYLTRGEESSSDTNKSA |
| 26 | aa | 人類BTN3A3 | MKMASSLAFLLLNFHVSLFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIKWSDTKGENIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGGGVSCIIRNSLLGLEKTASISIADPFFRSAQPWIAALAGTLPISLLLLAGASYFLWRQQKEKIALSRETEREREMKEMGYAATEQEISLREKLQEELKWRKIQYMARGEKSLAYHEWKMALFKPADVILDPDTANAILLVSEDQRSVQRAEEPRDLPDNPERFEWRYCVLGCENFTSGRHYWEVEVGDRKEWHIGVCSKNVERKKGWVKMTPENGYWTMGLTDGNKYRALTEPRTNLKLPEPPRKVGIFLDYETGEISFYNATDGSHIYTFPHASFSEPLYPVFRILTLEPTALTICPIPKEVESSPDPDLVPDHSLETPLTPGLANESGEPQAEVTSLLLPAHPGAEVSPSATTNQNHKLQARTEALY |
| 27 | aa | 用於重組蛋白產生之食蟹獼猴 ( 食蟹猴)BTN3A1胞外域 | MGSSLAFLLLSFHVCVLLLQLLMPHSAQFAVVGPPGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSNLRQVVNVYADGKEVEDRQSAAYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIDVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIRWSNDKGENIPAVEAPVFVDGVGLYAVAASVILRGSSGEGVSCTIRSSLLGLEKTTSISIAG HHHHHH |
| 28 | aa | 用於重組蛋白產生之食蟹獼猴 ( 食蟹猴)BTN3A2胞外域 | MGSSLAFLLLNFHVSFFLVQLLTPCSAQFSVLGPSGPILAMVGEDADLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYADGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDDIAAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDADFYEKALVELKVAALGSNLHVEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPKIQWSNAKGQNIPAVEAPVVADGVGLYAVAASVIMRGGSGESVSCIIRNSVLGLEKTASISIADHHHHHH |
| 29 | aa | 用於重組蛋白產生之食蟹獼猴 ( 食蟹猴)BTN3A3胞外域 | MANFLAFLLLNFRVCLLLVQLLTPCSAQFAVLGPHGPILAMVGEDVDLPCHLFPTMSAETMELRWVSSSLRQVVNVYSDGKEVEDRQSAPYRGRTSILRDGITAGKAALRIHNVTASDSGKYLCYFQDGDFYEKALVELKVAALGSDLHIEVKGYEDGGIHLECRSTGWYPQPQIQWSNTKGQHIPAVKAPVVADGVGLYAVAASVIMRGSSGEGVSCIIRNSLLGLEKTASISITD HHHHHH |
| 30 | aa | 肽 | EHALYDAL |
| 31 | aa | 肽 | YAFNFELI |
| 32 | aa | 多肽 | ITILQSWIF |
| 33 | aa | 多肽 | KIQLHAEHALYDALMILNI |
| 34 | aa | 多肽 | LEDYAFNFELILEEIARLFESG |
| 35 | aa | 多肽 | EDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 36 | aa | 多肽 | KDEAEKAKRMKEWMKRIKT |
| 37 | aa | IL-2促效劑Neo-2/15 | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 38 | aa | IL-2促效劑R50C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIACLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 39 | aa | IL-2促效劑E53C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFCSGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 40 | aa | IL-2促效劑D56C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGCQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 41 | aa | IL-2促效劑K58C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQCDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 42 | aa | IL-2促效劑D59C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKCEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 43 | aa | IL-2促效劑E62C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEACKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 44 | aa | IL-2促效劑R66C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKCMKEWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 45 | aa | IL-2促效劑E69C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKCWMKRIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 46 | aa | IL-2促效劑R73C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKCIKTTASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 47 | aa | IL-2促效劑T77C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTCASEDEQEEMANAIITILQSWIFS |
| 48 | aa | IL-2促效劑E82C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDCQEEMANAIITILQSWIFS |
| 49 | aa | IL-2促效劑E85C | PKKKIQLHAEHALYDALMILNIVKTNSPPAEEKLEDYAFNFELILEEIARLFESGDQKDEAEKAKRMKEWMKRIKTTASEDEQECMANAIITILQSWIFS |
| 50 | aa | 人類IL2 (P60568|21-153) | APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| 51 | aa | 人類IL15 (P40933|49-162) | NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIH DTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS |
| 52 | aa | 人類IL15R亞單位阿爾法(UniProtKB/Swiss-Prot：Q13261) | MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL |
實例 本發明之方法及檢驗 表徵根據本發明使用之抗BTN3A活化抗體之方法
1.1 結合親和力檢驗 ： 多循環動力學檢驗 (SPR)可使用Biacore T200 (序列號1909913)儀器運行Biacore T200評估軟體V2.0.1 (Uppsala, Sweden)對抗BTN3A抗體進行多循環動力學分析。
將經純化抗體稀釋至於2% BSA/PBS中2 μg/ml之濃度。在每次循環開始時，在蛋白A上捕獲每個抗體，密度(RL)為約146.5 RU (理論值以獲得約50 RU之RMax)。在捕獲之後，在注射BTN3A1抗原(Sino Biological目錄號15973-H08H)之前使表面穩定化。將BTN3A1以兩倍稀釋度範圍介於25至0.78 nM滴定於0.1% BSA/HBS-P+ (操作緩衝液)中。監測締合期持續400秒且監測解離期持續35分鐘(2100秒)。使用50 μl/min之流動速率以使任何可能的質量轉移效應降至最低來獲得動力學資料。在每次循環結束時使用兩個10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5之注射液進行蛋白A表面之再生。對於每個測試抗體進行兩次空白(無BTN3A1)及一次單一濃度分析物之重複以檢查在動力學循環內表面及分析物之穩定性。自Fc2、Fc3及Fc4之信號減去來自參考通道Fc1之信號以校正非特異性結合至參考表面中之差異。另外，將空白運行減去各Fc以校正任何抗原不依賴性信號變量，諸如偏移。使用一對一結合數學模型用整體RMax參數且無主體信號(常數RI = 0 RU)來擬合感測圖譜。
1.2 藉由流動式細胞測量術對人類 PBMC 進行 結合檢驗根據本發明使用之抗BTN3A抗體亦可針對其與人類PBMC (自健康供體之血液分離)的結合進行表徵。使用淋巴細胞分離劑(Axis-shield, Dundee, UK)密度離心自白血球層分離出PBMC。隨後將PBMC冷凍且在-80℃下或在液氮中儲存直至需要時。
將100 μl細胞(1×10
6個細胞/ml)轉移至新製U形底96孔盤之各孔中，隨後將盤離心且棄去上清液。
在PBS 2 mM EDTA中製備一系列抗體稀釋液(0.001 μg /ml至150 μg /ml)。使人類PBMC再懸浮於50 μl所製備之經稀釋測試抗體滴定系列中。
在4℃下於暗處培育30分鐘之後，將盤離心且用150μl/孔之PBS 2 mM EDTA洗滌兩次，其後使孔再懸浮於50 μl於PBS 2 mM EDTA中之由經1/100稀釋的山羊抗人類抗體(經PE標記)及經1/500稀釋的Live/dead純IR構成之混合物中。
在4℃下於暗處培育15分鐘之後，將盤離心且用150 μl/孔PBS 2 mM EDTA洗滌一次，其後使孔再懸浮於200 μl PBS 2 mM EDTA中。在BD LSR Fortessa細胞計數器上分析細胞。使用FlowJo軟體(版本10, FlowJo, LLC, Ashland, USA)分析資料。
可對食蟹猴PBMC及對達烏迪伯基特氏淋巴瘤(Daudi Burkitt's lymphoma)細胞系執行相同方案。
1.3
活體外功能性功效 ： γδ-T 細胞 去顆粒檢驗檢驗由以下組成：量測抗BTN3A抗體對γδ-T細胞去顆粒對抗達烏迪伯基特氏淋巴瘤細胞系之活化或抑制效果(Harly等人, 2012)。藉由與唑來膦酸(1 μM)及IL2 (200 Ui /ml)一起培養11-13天來使γδ-T細胞自健康供體之PBMC擴增。在第5天、第8天添加IL2且其後每2天添加。在培養開始時測定γδ-T細胞之百分比且藉由流動式細胞測量術評定培養時間直至達到至少80%。隨後將冷凍或新制γδ-T細胞用於對抗達烏迪細胞系之去顆粒檢驗(E:T比值為1:1)，其中將細胞在37℃下在10 μg/ml 7.2及/或20.1人類化變體及/或其嵌合型式存在下共培養4小時。由PMA (20 ng/ml)加離子黴素(1 µg/ml)產生之活化充當γδ-T細胞去顆粒之陽性對照，且單獨培養基充當陰性對照。在4小時共培育結束時，藉由流動式細胞測量術分析細胞以評估對於CD107a (LAMP-1，溶酶體相關膜蛋白-1)+CD107b (LAMP-2)呈陽性的γδ-T細胞之百分比。在活化誘導之顆粒胞外分泌以後將CD107移動至細胞表面，由此表面CD107之量測為用於識別最近去顆粒之溶胞T細胞的敏感標誌。
可使用自患者分離之AML胚細胞代替達烏迪細胞作為目標細胞來執行相同方案。
1.4
活體外功能性功效 ： PBMC 中之 Vγ9Vδ2 T 細胞活化檢驗由以下組成：量測抗BTN3A抗體對PBMC中之Vγ9Vδ2 T細胞之活化效應。藉由周邊血(EDTA-白血球層或肝素化全血)之Ficoll密度梯度離心分離人類PBMC。當使用全血時，將RBC在室溫下使用1X RBC裂解緩衝液(eBioscience)消耗10分鐘且隨後用PBS 1% FBS洗滌。
在37℃下在5% CO
2下以200 μL之體積在圓底96孔盤中將PBMC或RBC耗盡細胞與濃度遞增之抗BTN3A抗體(劑量範圍在0.00001至100 μg/mL)一起在RPMI 1640 10% FBS、1% P/S中以1.5至3×10
6個細胞/mL培養。在培養兩天之後藉由活化標記物表面表現之流動式細胞測量術分析監測活化狀態。在PBS 2% FBS 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中洗滌細胞。將細胞以1800 rpm離心5分鐘且隨後在RT下與10 μl FcR阻斷反應劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，之後添加30至50 μL的適當抗體混合物，該抗體混合物係在FACS緩衝液中製備且含有至少螢光結合抗CD3、抗Vγ9或Vδ2 TCR及抗CD69抗體。在所有實驗中均添加存活性標誌物(LIVE/DEAD可固定死細胞染料)以便自分析排除死細胞。將細胞在4℃下培育30分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，之後在Cytofix固定緩衝液(BD Bioscience)中固定及進行流動式細胞測量術分析。用flowjo V-10.6軟體分析資料。經活化Vγ9Vδ2T細胞定義為CD3+Vδ2+ (或Vγ9+或Vδ2+Vγ9+) CD69+。
表徵根據本發明使用之IL-2促效劑的方法
2.1 製備例示性 PEG 化 IL-2 模擬物 ：藉由引入一個半胱胺酸殘基(其隨後與單個40 kDa經順丁烯二醯亞胺修飾之聚乙二醇結合)自Neo-2/15產生NL-201。將在位置62處具有單個突變之Neo-2/15儲備液滲析至磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中且調節至1.0-2.0 mg/ml。將TCEP以10:1之莫耳比添加至蛋白且在RT下培育10分鐘以還原二硫鍵。將經順丁烯二醯亞胺修飾之PEG40k (PEG40k-MA)或PEG30k (PEG30k-MA)粉末以10:1 PEG半胱胺酸之莫耳比直接添加至經還原蛋白溶液且在攪拌下培育2小時。自反應混合物直接取得SDS-PAGE之等分試樣。形成PEG40k-MA或PEG30k-MA與Neo-2/15半胱胺酸突變之間的快速、自發及幾乎定量的共價鍵。
2.2 STAT5 磷酸化研究 ：活體外研究：將大約2×10
5個YT-1、IL-2Rα
+YT-1或饑餓CTLL-2細胞塗覆於96孔盤之各孔中且再懸浮於含有hIL-2或經工程改造的IL-2模擬物之連續稀釋液之RPMI完全培養基中。將細胞在37℃下刺激15 min且緊接著藉由添加甲醛至1.5%及在室溫下培育10 min來固定。細胞之滲透係藉由在4℃下再懸浮於冰冷的100%甲醇中30 min來達成。將經固定及滲透之細胞用FACS緩衝液(含有0.1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝生理鹽水[PBS] pH 7.2)洗滌兩次且在室溫下與在FACS緩衝液中1:50稀釋之結合Alexa Fluor® 647的抗STAT5 pY694 (BD Biosciences)一起培育2小時。隨後將細胞在FACS緩衝液中洗滌兩次且在CytoFLEX流式細胞儀(Beckman-Coulter)上測定MFI。將劑量反應曲線擬合至對數模型且使用GraphPad Prism資料分析軟體在減去非刺激性細胞之平均螢光強度(MFI)並正規化至最大信號強度之後計算半數最大有效濃度(EC
50值)及對應的95%信賴區間。實驗重複進行三次且執行三次，具有類似結果。
2.3 結合檢驗表面電漿子共振(SPR)：對於IL-2受體親和力滴定研究，將經生物素標記之人類或小鼠IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2RƔ
c受體固定至塗佈有鏈黴抗生物素蛋白之晶片以便在Biacore T100儀器(GE Healthcare)上分析。將不相關的經生物素標記之蛋白固定於參考通道中以減去非特異性結合。固定少於100反應單位(RU)之各配體以使質量轉移效應降至最低。使hIL-2或經工程改造之IL-2模擬物的三倍連續稀釋液流動經過固定配體60 s且量測解離240 s。對於IL-2RβƔ
c結合研究，將飽和濃度之hIL-2Rβ (3 uM)添加至指示濃度之hIL-2中。所有相互作用之表面再生均使用曝露於1 M MgCl
2/10 mM醋酸鈉(pH 5.5)
15 s來進行。在25℃下在補充有0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)之HBS-P+緩衝液(GE Healthcare)中進行SPR實驗且所有結合研究均以50 L/min之流動速率執行以預防分析物再結合。資料係使用Biacore T100評估軟體2.0版本(GE Healthcare)觀測及處理。穩態滴定曲線擬合及穩態結合解離(K
D)值測定係使用GraphPad Prism假定所有結合相互作用均為一級來實施。SPR實驗再現三次，具有類似結果。生物層干涉術：結合資料係在Octet RED96 (ForteBio, Menlo Park, CA)中收集且使用儀器之整合式軟體使用1:1結合模型來處理。將經生物素標記之目標受體人類IL-2Rα、IL-2Rβ或Ɣ
c以於結合緩衝液(10 mM HEPES [pH 7.4]、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%界面活性劑P20、0.5%脫脂奶粉)中1 μg/ml功能化至塗佈有鏈黴抗生物素蛋白的生物感測器(SA ForteBio)持續300秒。將分析物蛋白自濃縮儲備液稀釋至結合緩衝液中。在單獨結合緩衝液中基線量測之後，藉由將生物感測器浸漬於含有指示濃度之目標蛋白的孔中(締合步驟)且隨後將感測器浸漬回基線/緩衝液(解離)中來監測結合動力學。對於IL-2RβƔ
c 之異二聚受體結合實驗，使Ɣ
c與感測器結合同時IL-2Rβ在飽和濃度(亦即相較於K
d至少約2.5倍莫耳過量)之溶液中。
結果 1. 靜止 V γ 9V δ 2 T 細胞表現 IL-2R β 及 γ 鏈介白素-2受體(IL-2R)為在某些免疫細胞(諸如淋巴球)表面上表現之異三聚體蛋白，其結合IL-2且對IL-2作出反應。IL-2R由α (CD25)、β (CD122)及γ (CD132)鏈之不同組合構成。三個受體鏈分別及以不同方式在不同細胞類型上表現且可以不同組合及次序組裝以生成中等及高親和力IL-2受體。β與γ鏈之組合形成結合具有中等親和力之IL-2的複合物且主要在記憶γδ T細胞及NK細胞上表現，然而全部三個受體鏈(α、β及γ)之組合形成結合具有高親和力(Kd約10-11 M)之IL-2的複合物，一般在經活化T細胞及調節T細胞(Treg)上表現。
使用對CD25、CD122及CD132具特異性之抗體及流動式細胞測量術分析來監測與αβ CD4及CD8 T細胞、Treg及NK細胞相比IL-2R鏈在靜止Vγ9Vδ2 T細胞上的表現。
周邊血液單核細胞(PBMC)係藉由來自健康供體(HD；n=3)之周邊血(EDTA-白血球層)的Ficoll密度梯度離心來分離。將細胞以1800 rpm離心5分鐘且隨後在室溫下與10 μl之FcR阻斷反應劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，之後添加50 μL在PBS 2% FBS 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備的以下抗體混合物：用於識別免疫亞群之CD3-APC-A700、CD8-BV395、CD4-V660、CD56-V605、Vd2-FITC、FoxP3-PE，及用於分別評定IL-2受體α、β及γ之表面表現的CD25-APC、CD122-PerCPCy5及CD132-mCherry。添加CD69-PC7以監測活化狀態且添加存活性標誌物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染料)以排除死細胞。將細胞在4℃下培育30分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，之後在Cytofix固定緩衝液(BD Bioscience)中固定及進行流動式細胞測量術分析。
圖1展示IL-2R-γ (CD132)在大多數T細胞亞群及NK細胞上以類似含量表現。IL-2R-β (CD122)在T細胞亞群上以低含量表現且在NK細胞上高度表現，而高親和力IL-2R-α (CD25)在靜止CD8、CD4、Vγ9Vδ2 T細胞及NK細胞上偵測不到但在靜止Treg上高度表現。
2. ICT01 介導之 V γ 9V δ 2 T 細胞 活化誘導 IL-2 -Rα 鏈 (CD25) 之 表現增加ICT01 (mAb1)為特異性活化Vγ9Vδ2 T細胞之抗BTN3A治療抗體。ICT01對IL-2R鏈α、β及γ在Vγ9Vδ2 T細胞、αβ CD8 T細胞、Treg及NK細胞上之表現的作用係使用對CD25、CD122及CD132具特異性之抗體及流動式細胞測量術分析來監測。
將來自健康供體(HD，n=3)之人類PBMC在完全培養基(補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素之RPMI 1640培養基)中培養且用以1 μg/mL使用之ICT01或其同型對照(hIgG1S)處理。收集靜止細胞(D0)或活化2天之細胞，以1800 rpm離心5分鐘且隨後在RT下與10 μl之FcR阻斷反應劑(Miltenyi Biotec)一起培育10分鐘，之後添加50 μL在PBS 2% FBS 2 mM EDTA (FACS緩衝液)中製備之以下抗體混合物：用於識別免疫亞群之CD3-APC-A700、CD8-BV395、CD4-V660、CD56-V605、Vd2-FITC、FoxP3-PE，及用於分別評定IL-2受體a、b、g之表面表現的CD25-APC、CD122-PerCPCy5及CD132-mCherry。添加CD69-PC7以監測活化狀態且添加存活性標誌物(LIVE/DEAD™可固定死細胞染料)以排除死細胞。將細胞在4℃下培育30分鐘且在FACS緩衝液中洗滌2次，之後在Cytofix固定緩衝液(BD Bioscience)中固定及進行流動式細胞測量術分析。
如所預期，ICT01誘導Vγ9Vδ2 T細胞之特異性活化，以藉由在處理2天之後增加CD69表現所展示。此外，ICT01觸發增加CD25在Vγ9Vδ2 T細胞上之表現然而其並不影響CD122及CD132在此免疫細胞亞群上之表現。未注意到IL-2R亞單位在CD8 T細胞、Treg及NK細胞上之恆定活化或調節。此結果表明ICT01可藉由增加高親和力IL-2R-α亞單位之表現來改變Vγ9Vδ2 T細胞對IL-2於反應。
3. IL-2 受體 a 不依賴性促效劑 NL-201 在免疫效應細胞群 ( 包括 Vγ9Vδ2 T 細胞 ) 上誘導 pSTAT5 信號傳導響應於IL-2 (Proleukin)或NL-201 (a不依賴性IL-2促效劑)之IL-2R信號傳導係藉由依據酪胺酸694 (Y694)在Stat5 (轉錄-5之信號轉導子及活化劑) (熟知的介導IL-2與其受體結合時之生物活性的轉錄因子)上之磷酸化在Vγ9Vδ2 T細胞、CD4及CD8 T細胞、Treg及NK細胞中評定。
將來自健康供體(HD，n=3)之人類PBMC在PBS中培育1小時，之後在濃度遞增之IL-2 (Proleukin)或NL-201以及以1 μg/mL使用的ICT01或其同型對照(hIgG1S)存在下在100 μL完全培養基(20 M個細胞/mL)中培養。在20分鐘之後，添加100 μL預溫熱之CytoFix溶液(BD Bioscience)，且將細胞在室溫下培育20分鐘。將細胞洗滌、再懸浮於冷滲透溶液(PermIII；BD Bioscience)中且在冰上培育30分鐘。在FACS緩衝液中洗滌之後將細胞用以下抗體混合物染色30分鐘：Vd2-FITC、CD56-BV605、CD4-BV785、CD3-PeCy7、FoxP3-PE、Pstat5-APC及FcR阻斷反應劑(Miltenyi Biotec)，且藉由流動式細胞測量術分析。Vγ9Vδ2 T細胞、CD4及CD8 T細胞、Treg及NK細胞對IL-2或NL-201之反應藉由監測每個群體中P-Stat5之染色強度(MFI)來評定。
結果展示在所有免疫亞群中響應於IL-2及a不依賴性IL-2促效劑NL-201之P-Stat5信號之濃度依賴性增加。然而，NL-201似乎比IL-2觸發Vγ9Vδ2 T細胞中之IL-2R信號傳導強約100X，比IL-2觸發CD8 T細胞及NK細胞中之IL-2R信號傳導強約50X及比IL-2觸發Treg中之IL-2R信號傳導弱約50X。NL-201及IL-2對習知CD4 T細胞具有類似活性。ICT01對靜態下之IL-2R信號傳導沒有顯著效應(圖3及表6)。
對用ICT01活化2天之PBMC執行類似實驗，之後與濃度遞增之IL-2或NL-201一起培育。在此等情況下，如圖2中所展示，Vγ9Vδ2 T細胞展現增加的高親和力IL-2R亞單位(CD25)之表面表現。結果展示(i)所有細胞亞群同等地對在靜態下及在培養物w/o ICT01中2天之後的NL-201敏感，(ii)培養PBMC 2天使得所有亞群對IL-2 (無關ICT01)敏感度增加(iii)與IL-2相比Treg保持對NL-201超過約150X不敏感，(iv) ICT01往往會降低對CD4 T細胞、CD8 T細胞及NK細胞上之IL-2的靈敏度。此最後一個效應對於NL-201較不明顯。
表 6 ： 靜止 g9d2 T 細胞 、 CD4 T 細胞、 CD8 T 細胞、 Treg 及 NK 細胞對 IL-2 及 NL-201 反應的 EC
50
表 7 ： 經 ICT01 活化之 g9d2 T 細胞、 CD4 T 細胞、 CD8 T 細胞、 Treg 及 NK 細胞對 IL-2 及 NL-201 反應之 EC
50
| EC 50(nM) | g9d2 T細胞 | Treg | CD4 Th細胞 | CD8 T細胞 | NK細胞 |
| hIgG1S+IL-2 | 7.4390 | 0.0010 | 1.4930 | 8.9640 | 0.7489 |
| ICT01+IL-2 | 6.9570 | 0.0006 | 1.5330 | 9.5960 | 0.9038 |
| hIgG1S+NL-201 | 0.0558 | 0.0919 | 0.4973 | 0.1767 | 0.0143 |
| ICT01+NL-201 | 0.0753 | 0.1035 | 0.7757 | 0.2373 | 0.0151 |
| EC 50(nM) | g9d2 T細胞 | Treg | CD4 Th細胞 | CD8 T細胞 | NK細胞 |
| hIgG1S+IL-2 | 0.0847 | 0.0008 | 0.0417 | 0.1181 | 0.0340 |
| ICT01+IL-2 | 0.1157 | 0.0005 | 0.2748 | 0.5926 | 0.1801 |
| hIgG1S+NL-201 | 0.0724 | 0.1307 | 0.2046 | 0.1102 | 0.0181 |
| ICT01+NL-201 | 0.0676 | 0.1159 | 0.2389 | 0.1173 | 0.0205 |
4. IL-2 受體 a 不依賴性促效劑 NL-201 活體外誘導 Vγ9Vδ2 T 細胞 擴增為進一步展現a不依賴性IL-2促效劑NL-201對Vγ9Vδ2 T細胞之活性，使用與濃度遞增之IL-2或NL-201 (7個劑量始於12 nM，連續稀釋3X)一起在hIgG1S (1 μg/mL)或ICT01 (0.01、0.1及1 μg/mL)存在下培養8天的人類PBMC來監測Vγ9Vδ2 T細胞之擴增。細胞在完全培養基中培養。在第0天添加ICT01及IL-2或NL-201且細胞介素在第4天更新。在8天之後，將細胞用抗體之混合物染色以在流動式細胞測量術分析之前識別Vγ9Vδ2 T細胞及Treg。向各孔添加計數珠粒以便推知絕對細胞數目。
如圖4A及圖4B中所展示，ICT01與IL-2或NL-201之組合誘導Vγ9Vδ2 T細胞之濃度依賴性協同性擴增，此特異性T細胞亞群達至總T細胞隔室之至多50%(對比將IL-2或NL-201用作單一藥劑情況下之少於5%及單獨ICT01情況下之約20%) (圖4B)。此外，在劑量＞0.2 nM時，NL-201與ICT01之組合展現與IL-2相比優越的觸發Vγ9Vδ2 T細胞擴增之能力，與以相同濃度使用的IL-2相比在與ICT01及NL-201之組合一起培養結束時回收1.2至3.8倍多的Vγ9Vδ2 T細胞(絕對數) (圖4A)。關於Treg隔室，對於誘導Treg擴增IL-2比NL-201強效約100X。ICT01不斷地鈍化IL-2及NL-201介導之Treg的擴增及活化。特定言之，NL-201與ICT01之組合似乎即使在高濃度下亦完全抑制Treg擴增，然而當ICT01以濃度＞1 nM與IL-2組合時Treg擴增持續。
因此，藉由誘導細胞毒性Vγ9Vδ2 T細胞之穩固擴增以及避免免疫抑制性Treg，ICT01與NL201之組合可為增強Vγ9Vδ2 T細胞介導之癌症免疫療法的新穎方法。
5. IL-2
受體
α
不依賴性促效劑
NL-201
在小鼠模型中活體內誘導
Vγ9Vδ2
T
細胞
擴增
為了證實ICT01+NL-201組合對Vγ9Vδ2 T細胞之藥理學，將來自兩個不同健康供體之人類PBMC移植至NOD CRISPR Prkdc Il2r Gamma (NCG)小鼠中。一天後，將小鼠用單獨ICT01(在第1天IV 1 mg/kg)或與IL-2 (在第1、2、3及4天IP 0.3 M IU/kg)或NL-201 (在第1天IV1、3及10 μg/kg)組合處理(圖5)。一週後重複處理。每日監測小鼠之未預期痛苦跡象。每週監測體重及全面臨床評分。在第7天執行對血細胞之流動式細胞測量術分析以監測Vγ9Vδ2 T細胞數目及出現率。
在經PBMC移植之NCG小鼠中ICT01與IL-2或NL-201之組合並不觸發表觀毒性(圖6A)。在PBMC移植後第7天抽取之小鼠血液樣品之免疫表型分型在ICT01+IL-2組合小組中展現Vγ9Vδ2 T細胞隔室之少量擴增(與單獨ICT01相比ICT01+IL-2小組中約1.5倍多的細胞)。相比之下，ICT01+NL-201組合誘導Vγ9Vδ2 T細胞隔室之穩固劑量依賴性擴增，與單獨ICT01相比在1、3及10 μg/kg之ICT01+NL-201中分別具有約4.3、20.8及23倍多的細胞，且在1、3及10 μg/kg之ICT01+NL-201小組中Vγ9Vδ2 T細胞出現率分別達至總T細胞之22%、34%及42%的平均值(圖6B)。
圖 1 ： 靜止 V γ 9V δ 2 T 細胞 表現 IL-2-Rβγ 。(A)用以識別CD4 (CD3+、Vd2-、CD4+)、CD8 (CD3+、Vd2-、CD8+)及Vγ9Vδ2 (CD3+、Vd2+)T細胞、Treg (CD3+、Vd2-、CD4+、FoxP3+)及NK細胞(CD3-、CD56+)的閘控策略之實例。(B)在各細胞亞群上分析CD122 (IL-2Rβ)、CD132 (IL-2Rγ)及CD25 (IL-2Rα)之表面表現。展示各細胞亞群之FACS特徵曲線(B)以及表現量及出現率(C)的定量之實例。
圖 2 ：經ICT01活化之Vγ9Vδ2 T細胞表現高親和力IL-2Rα鏈。免疫亞群經識別為CD8 (CD3+、Vd2-、CD8+)及Vγ9Vδ2 (CD3+、Vd2+) T細胞、Treg (CD3+、Vd2-、CD4+、FoxP3+)及NK細胞(CD3-、CD56+)。在基線(D0)及與ICT01或其同型對照(hIgG1S)一起培養2天之後在各細胞亞群上分析CD122 (IL-2Rβ)、CD132 (IL-2Rγ)、CD25 (IL-2Rα)及CD69之表面表現。圖表展示在各亞群內對於CD25、CD122、CD132及CD69表現呈陽性之細胞的百分比(A)及整個指示群體(B)內各標誌物之相對平均螢光強度值。
圖 3 ：α不依賴性IL-2促效劑NL-201在靜止免疫細胞群體上誘導P-STAT5信號傳導。對於各細胞群體分析P-Stat5染色之平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity，MFI)值。圖表表示3個PBMC之供體的MFI之平均值±SEM。資料使用GraphPad Prism軟體列表及標繪。用S形4PL公式獲得曲線擬合。
圖 4 ： α 不依賴性 IL-2 促效劑 NL-201 與 ICT01 之 組合活體外誘導 V γ 9V δ 2 T 細胞之 擴增與濃度遞增之IL-2或NL-201單獨或其與以0.01、0.1及1μg/mL使用的ICT01組合一起培養PBMC 8天之後Vγ9Vδ2 T細胞(A、B)及Treg (C、D)之絕對數量(A、C)及出現率(B、D)。圖表表示3個PBMC之供體的值之平均值±SEM。資料使用GraphPad Prism軟體列表及標繪。用S形4PL公式獲得曲線擬合。
圖 5 ： 活體內藥理學研究設計 圖 6 ： ICT01+NL-201 組合觸發經 PBMC 移植之 NCG 小鼠的血液中之 V γ 9V δ 2 T 細胞 擴增。(A)個別小鼠之體重相對於處理時程。(B)在PBMC移植入用ICT01或同型對照(hIgG1S) w/o IL-2 (Proleukin)或NL-201處理的NCG小鼠中之後7天Vγ9Vδ2 T細胞之絕對數量(細胞數目/mL血液)及出現率(總T細胞之%)。圖表表示各組動物之個別值及平均值。資料使用GraphPad Prism軟體列表及標繪。
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Claims (16)
- 一種抗BTN3A活化抗體之用途，其用於製造用於治療有需要之個體的癌症之藥物， 其中該抗BTN3A抗體與結合IL-2受體βƔ c異二聚體(IL-2RβƔ c)之IL2促效劑同時、依序或分開組合投與； 其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中： (a) X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO: 30)之肽； (b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽； (c) X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO: 31)之肽； (d) X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO: 32)之肽； 其中X1、X2、X3及X4在該多肽中可呈任何次序； 其中胺基酸連接子可存在於該等域中之任一者之間； 或其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中： (a) X1為包含與序列KIQLHAEHALYDALMILNI (SEQ ID NO: 33)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽； (b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽； (c) X3為包含與序列LEDYAFNFELILEEIARLFESG (SEQ ID NO: 34)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽； (d) X4為包含與序列EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽； 其中X1、X2、X3及X4在該多肽中可呈任何次序； 其中胺基酸連接子可存在於該等域中之任一者之間； 或其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 37-49中任一項中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列。
- 如請求項 1之用途，其中以藉由表面電漿子共振所量測，該抗BTN3A抗體以10 nM或更低之K D，較佳地以5 nM或更低之K D與人類BTN3A結合。
- 如請求項 1 或 2中任一項之用途，其中該抗BTN3A抗體在與表現BTN3A之細胞共培養中誘導γδ T細胞，典型地Vγ9Vδ2 T細胞的活化，其中以在去顆粒檢驗中所量測EC 50低於5 μg/ml，較佳地1 μg/ml或更低。
- 如請求項 1 至 3中任一項之用途，其中該抗BTN3A抗體： 包含(a)可變重鏈(VH)多肽，其包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)可變輕鏈(VL)多肽，其包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列； 包含SEQ ID NO: 12-14之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 15-17之LCDR 1-3； 包含SEQ ID NO: 18-20之HCDR 1-3及SEQ ID NO: 21-23之LCDR 1-3，或 與選自以下之抗體競爭結合：藉由保藏於CNCM保藏號為I-4401之融合瘤所產生的mAb 20.1、藉由保藏於CNCM保藏號為I-4402的融合瘤所產生的mAb 7.2及具有SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的抗體。
- 如請求項 1 至 4中任一項之用途，其中該抗BTN3A抗體包含突變或經化學修飾IgG1恆定區，其中當與具有野生型IgG1同型恆定區之對應抗體相比時，該突變或經化學修飾IgG1恆定區賦予不與Fcγ受體結合或減少與Fcγ受體結合。
- 如請求項 1 至 5中任一項之用途，其中該突變IgG1恆定區為IgG1三重突變L247F、L248E及P350S。
- 如請求項 1 至 6中任一項之用途，其中該抗BTN3A抗體為包含SEQ ID NO: 4之重鏈及SEQ ID NO: 6之輕鏈的mAb。
- 如請求項 1 至 7中任一項之用途，其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中： (a) X1為包含胺基酸序列EHALYDAL (SEQ ID NO: 30)之肽； (b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽； (c) X3為包含胺基酸序列YAFNFELI (SEQ ID NO: 31)之肽； (d) X4為包含胺基酸序列ITILQSWIF (SEQ ID NO: 32)之肽； 其中X1、X2、X3及X4在該多肽中可呈任何次序； 其中胺基酸連接子可存在於該等域中之任一者之間；及 其中該多肽與IL-2受體βƔ c異二聚體(IL-2RβƔ c)結合。
- 如請求項 1 至 8中任一項之用途，其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中： (a) X1為包含與SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽； (b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽； (c) X3為包含與SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及 (d) X4為包含與肽EDEQEEMANAIITILQSWIFS (SEQ ID NO: 35)至少90%、至少95%或100%一致的胺基酸序列之肽；及 其中X1、X2、X3及X4在該多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於該等域中之任一者之間；且其中該多肽與IL-2受體βƔ c異二聚體(IL-2RβƔ c)結合。
- 如請求項 1 至 8中任一項之用途，其中該IL-2促效劑為包含域X1、X2、X3及X4之多肽，其中： (a) X1為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 33 (KIQLHAEHALYDALMILNI)之肽； (b) X2為長度為至少8個胺基酸之肽； (c) X3為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 34 (LEDYAFNFELILEEIARLFESG)之肽；及 (d) X4為包含胺基酸序列SEQ ID NO: 35 (EDEQEEMANAIITILQSWIFS)之肽； 其中X1、X2、X3及X4在該多肽中可呈任何次序；其中胺基酸連接子可存在於該等域中之任一者之間；且其中該多肽與IL-2受體βƔ c異二聚體(IL-2RβƔ c)結合。
- 如請求項 1 至 10中任一項之用途，其中該IL-2促效劑之該X2域為包含與SEQ ID NO: 36 (KDEAEKAKRMKEWMKRIKT)至少90%、至少94%或100%一致的胺基酸序列之肽。
- 如請求項 1 至 11中任一項之用途，其中該IL-2促效劑包含與選自SEQ ID NO: 38-49中任一項之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的多肽。
- 如請求項 1 至 12中任一項之用途，其中該IL-2促效劑多肽與含有聚乙二醇(「PEG」)之部分連接，視情況其中該含有PEG之部分在該多肽中之半胱胺酸殘基處連接，視情況其中該含有PEG之部分經由順丁烯二醯亞胺基與該半胱胺酸殘基連接； 視情況其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 43中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置62處的半胱胺酸存在並與含有PEG之部分連接； 視情況其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 46中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置73處的半胱胺酸存在並與該含有PEG之部分連接； 視情況其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 45中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置69處的半胱胺酸存在並與該含有PEG之部分連接； 視情況其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 44中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置66處的半胱胺酸存在並與該含有PEG之部分連接； 視情況其中該IL-2促效劑包含與SEQ ID NO: 48中所述之胺基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致的胺基酸序列，且位置82處的半胱胺酸存在並與該含有PEG之部分連接。
- 如請求項 1 至 13中任一項之用途，其中該抗BTN3A抗體以介於0.1與10 mg/kg體重之間的劑量投與。
- 如請求項 1 至 14中任一項之用途，其中該IL-2促效劑以介於0.1 μg/kg至100 mg/kg體重之間的劑量投與。
- 如請求項 1 至 15中任一項之用途，其中該IL-2促效劑為NL-201。
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