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TW202245824A - Fgf21多肽及其融合多肽的應用 - Google Patents

Fgf21多肽及其融合多肽的應用 Download PDF

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TW202245824A
TW202245824A TW111109984A TW111109984A TW202245824A TW 202245824 A TW202245824 A TW 202245824A TW 111109984 A TW111109984 A TW 111109984A TW 111109984 A TW111109984 A TW 111109984A TW 202245824 A TW202245824 A TW 202245824A
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林樹珊
李玉
高相雷
謝燦
燕江雨
劉亮
李曉平
陳小鋒
李文佳
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大陸商廣東東陽光藥業有限公司
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Abstract

本發明提供了FGF21多肽，FGF21融合蛋白或FGF21多肽與GLP-1或其功能性變體的雙融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。

Description

FGF21多肽及其融合多肽的應用
本發明屬於生物醫藥領域，具體地，本發明涉及FGF21多肽及其融合多肽的應用。
胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由小腸L細胞分泌的腸促胰素，其可以刺激胰島β細胞分泌胰島素，從而維持病患體內胰島素的平衡。GLP-1通過胰島素間接起作用，僅對二型糖尿病起作用，限制了其應用範圍及效果；同時有報導指出GLP-1存在潛在的致甲狀腺癌風險。
FGF21屬於FGF家族(成纖維細胞生長因數，FGFs)成員之一。FGF21可以促進脂肪細胞對葡萄糖的吸收，增強胰島素敏感性，同時與胰島素相比，FGF21不會引起低血糖等副作用，更能有效保護β胰島細胞，促進胰島β細胞的再生與修復，而且由於沒有促分裂活性，也不會導致潛在的腫瘤風險。FGF21有希望成為治療1型糖尿病的藥物。此外，FGF21也有很好的降脂作用，是一個很有潛力的降脂藥。 然而，FGF21在成藥性方面也面臨著巨大的挑戰。這一方面是由於FGF21的半衰期很短，在小鼠模型中其半衰期僅為一小時左右(Xu et al .，2009)。另一方面，FGF21在體內的生物學活性也有限。因此，亟需對FGF21進行改造。
中國發明專利申請CN111662373A中公開了FGF21多肽，融合蛋白，以及包含FGF21多肽，Fc結構域，和GLP-1或其功能性變體的融合蛋白；還公開了這些多肽以及融合蛋白在製備用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病的藥物中的用途，所述疾病包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎，在實施例中給出了降空腹血糖，降體重，降攝食量，降血脂的實驗資料。
NASH（nonalcoholic steatohepatitis），即非酒精性脂肪性肝炎，也稱代謝性脂肪性肝炎，是病理變化與酒精性肝炎相似但無過量飲酒史的臨床綜合征，其主要特徵為肝細胞大泡性脂肪變性伴隨肝細胞損傷和炎症，嚴重者可發展為肝臟纖維化，肝硬化，肝衰竭以及肝臟腫瘤。由於患者在早期不會顯露出明顯症狀，所以被稱為「沉默的殺手」。在過去20年裡，其前驅疾病非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發病率已翻倍，成為導致發達國家和地區人們患慢性肝病及肝酶異常的首要原因。據統計，全球約有3-5%的人患有NASH，而且據《自然》雜誌2017年的一篇文章，NASH即將成為繼慢性丙型肝炎之後美國肝移植的最主要原因。雖然，NASH藥物具有巨大的市場前景，也有眾多的研究機構或醫藥公司專注於NASH藥物的研發，但是在過去的幾十年時間裡，由於NASH的發病機制非常複雜，科學家們在開發藥物的過程中遭遇了許多挫折和失敗，有多款重磅NASH候選藥都以失敗告終，直至2020年世界上才有了第一款上市的藥品。因此，NASH藥品的研發任重道遠。
本發明提供了FGF21多肽或其融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
第一方面，本發明提供了FGF21多肽在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
在一些實施方案中，所述FGF21多肽具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或其變體。優選地，所述FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，在下述位置處包含胺基酸取代：L98、S167和P171。在本發明中，所述L98、S167和P171可分別指SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的第98位殘基L，第167位殘基S和第171位殘基P。
優選地，所述FGF21多肽還可在選自下組的一個或多個位置處包含胺基酸取代：R175、R19、A180、A31和G43。在本發明中，所述R175、R19、A180、A31和G43可分別指SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的第175位殘基R，第19位殘基R，第180位殘基A，第31位殘基A和第43位殘基G。
在一些實施方案中，所述FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，其可在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：
(1)L98、S167、P171和R175；
(2)L98、S167、P171、R175和R19；
(3)L98、S167、P171、R175、R19和A180；
(4)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43。
優選地，所述FGF21多肽在L98處的胺基酸取代可為L98R，
優選地，所述FGF21多肽在S167處的胺基酸取代可為S167H，
優選地，所述FGF21多肽在P171處的胺基酸取代可選自P171A和P171G，
優選地，所述FGF21多肽在R175處的胺基酸取代可為R175L，
優選地，所述FGF21多肽在R19處的胺基酸取代可為R19V，
優選地，所述FGF21多肽在A31處的胺基酸取代可為A31C。
在一些實施方案中，所述的FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，可包含選自下組的胺基酸取代：(1)L98R、S167H和P171A；(2)L98R、S167H、P171A和R175L；(3)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(5)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E；(7)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C。
在本發明中，所述的FGF21多肽可包含下組中任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO: 2-7。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的FGF21多肽，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
所述FGF21多肽可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病可包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
第二方面，本發明提供了FGF21融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
所述FGF21融合蛋白包含FGF21多肽以及Fc結構域，其中，所述FGF21多肽如第一方面所述。
所述FGF21多肽經連接子與所述Fc結構域連接構成FGF21融合蛋白，在本發明中也稱為單靶FGF21融合蛋白。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽的C末端連接。在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域為人IgG的Fc或其功能性變體。優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域可為人IgG的Fc(參見UniProt KB或Swiss-Prot中登錄號為P01861 .1的蛋白質)。所述人IgG的Fc可包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域也可為人IgG的Fc的功能性變體。例如，所述人IgG的Fc的功能性變體可以為在所述人IgG1或IgG4（優選IgG4）的Fc的胺基酸序列基礎上，利用天然或非天然存在的胺基酸在特定的胺基酸殘基處進行修飾而獲得的多肽或蛋白質。例如，所述修飾可基於在特定位置插入、替換或刪除保守或非保守的一個或多個胺基酸來產生，也可包含在特定位置引入非胺基酸結構的修飾。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域的功能性變體為IgG-Fc-PAAK，其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列。所述IgG-Fc-PAAK可包含S228P，F234A，L235A和/或R409K的突變，以及K447的刪除。也就是，與SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列相比，所述IgG-Fc-PAAK的第228位殘基S被殘基P取代，第234位殘基F被殘基A取代，第235位殘基L可被殘基A取代，第235位殘基L可被殘基A取代，且第447位殘基K可被刪除。
在一些實施方案中，所述FGF21融合蛋白還包含連接子，將FGF21多肽與Fc結構域連接。優選地，所述連接子為肽連接子。優選地，所述連接子的N末端與所述的C末端連接，且所述連接子的C末端與所述FGF21多肽的N末端連接。優選地，所述連接子包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
優選地，所述單靶融合FGF21蛋白具有選自如下的任一種胺基酸序列：SEQ ID NO:13-18。
優選地，所述單靶FGF21融合蛋白為選自如下的任一種單靶FGF21融合蛋白：
單靶FGF21融合蛋白1#，其包含SEQ ID NO:13所示的胺基酸序列；
單靶FGF21融合蛋白2#，其包含SEQ ID NO:14所示的胺基酸序列；
單靶FGF21融合蛋白4#，其包含SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列；
單靶FGF21融合蛋白7#，其包含SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列；
單靶FGF21融合蛋白9#，其包含SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列；
單靶FGF21融合蛋白12#，其包含SEQ ID NO:18所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述FGF21融合蛋白為二聚體融合蛋白。優選地，從N端至C端分別為兩個重鏈IgG-Fc-PAAK，兩條連接子和兩個FGF21多肽。
所述單靶FGF21融合蛋白1#、2#、4#、7#、9#、12#，分別包含的胺基酸序列SEQ ID NO:13- SEQ ID NO:18是單體FGF21多肽以及單個連接子和單個免疫球蛋白Fc結構域的胺基酸序列。
所述單靶FGF21融合蛋白可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病包括糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的FGF21融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
第三方面，本發明提供了包含FGF21多肽和GLP-1或其功能性變體的雙融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
包含FGF21多肽和GLP-1或其功能性變體的雙融合蛋白在本發明中也稱作雙靶融合蛋白。
所述融合蛋白包含第一方面所述的FGF21多肽以及GLP-1或其功能性變體。
在一些實施方案中，所述GLP-1或其功能性變體包含下組中任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO:10-11。
在一些實施方案中，所述GLP-1或其功能性變體為人GLP-1(其在UniProt KB或Swiss-Prot中登錄號為P0C6A0 .1)。優選地，所述GLP-1為人GLP-1的功能性變體。優選地，所述人GLP-1的功能性變體為GLP-1-GEG，其可包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列。例如，所述GLP-1-GEG可包括A8G，G22E和R36G突變。優選地，與SEQ ID NO:10所示的胺基酸序列相比，所述GLP-1-GEG的第8位殘基A可被殘基G取代，第22位殘基G可被殘基E取代，第36位殘基R可被殘基G取代。
所述融合蛋白還可包含免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域位於所述FGF21多肽與所述GLP-1或其功能性變體之間。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽的N末端連接，並且與所述GLP-1或其功能性變體的C末端連接；或者，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽的C末端連接，並且與所述GLP-1或其功能性變體的N末端連接。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域為人IgG的Fc或其功能性變體。優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域可為人IgG的Fc(參見UniProt KB或Swiss-Prot中登錄號為P01861 .1的蛋白質)。所述人IgG的Fc可包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域也可為人IgG的Fc的功能性變體。例如，所述人IgG的Fc的功能性變體可以為在所述人IgG1或IgG4（優選IgG4）的Fc的胺基酸序列基礎上，利用天然或非天然存在的胺基酸在特定的胺基酸殘基處進行修飾而獲得的多肽或蛋白質。例如，所述修飾可基於在特定位置插入、替換或刪除保守或非保守的一個或多個胺基酸來產生，也可包含在特定位置引入非胺基酸結構的修飾。
在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc結構域的功能性變體為IgG-Fc-PAAK，其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列。所述IgG-Fc-PAAK可包含S228P，F234A，L235A和/或R409K的突變，以及K447的刪除。也就是，與SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列相比，所述IgG-Fc-PAAK的第228位殘基S被殘基P取代，第234位殘基F被殘基A取代，第235位殘基L可被殘基A取代，第235位殘基L可被殘基A取代，且第447位殘基K可被刪除。
在一些實施方案中，所述融合蛋白還包含連接子，將所述FGF21多肽與Fc結構域或其功能性變體連接和/或將GLP-1或其功能性變體與Fc結構域或其功能性變體連接。優選地，所述連接子為肽連接子。
優選地，所述連接子包含第一連接子和第二連接子。優選地，所述第一連接子將GLP-1或其功能性變體與Fc結構域或其功能性變體連接，所述第二連接子將所述FGF21多肽與Fc結構域或其功能性變體連接。
優選地，所述第一連接子的N末端與GLP-1或其功能性變體的C末端連接，所述第一連接子的C末端與所述Fc結構域或其功能性變體的N末端連接；所述第二連接子的C末端與所述FGF21多肽的N末端連接，所述第二連接子的N末端與所述Fc結構域或其功能性變體的C末端連接。
所述雙靶融合蛋白從N端至C端分別為所述GLP-1或其功能性變體、所述第一連接子、所述免疫球蛋白Fc結構域、所述第二連接子和所述FGF21多肽。
或者，所述第一連接子的C末端與GLP-1或其功能性變體的N末端連接，所述第一連接子的N末端與所述Fc結構域或其功能性變體的C末端連接；所述第二連接子的N末端與所述FGF21多肽的C末端連接，所述第二連接子的C末端與所述Fc結構域或其功能性變體的N末端連接。
所述雙靶融合蛋白從N端至C端分別為所述FGF21多肽、所述第二連接子、所述免疫球蛋白Fc結構域、所述第一連接子和所述GLP-1或其功能性變體。
優選地，所述第一連接子和/或所述第二連接子包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
優選地，所述雙靶融合蛋白從N端至C端可分別為所述FGF21多肽、所述第二連接子、所述免疫球蛋白Fc結構域、所述第一連接子和所述GLP-1或其功能性變體，其中，所述FGF21多肽具有選自下組中任一項所示的胺基酸序列:SEQ ID NO:2-7；所述免疫球蛋白Fc結構域具有選自下組中任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO:8-9；所述GLP-1或其功能性變體具有選自下組中任一項所示的胺基酸序列SEQ ID NO:10-11；所述第一連接子和/或所述第二連接子具有SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
優選地，所述雙靶融合蛋白為選自如下的任一種的雙靶融合蛋白：
雙靶融合蛋白1#，其包含SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列)，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-1(其包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列)；
雙靶融合蛋白2#，其包含SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列)，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-2(其包含SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列)；
雙靶融合蛋白4#，其包含SEQ ID NO:21所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列) ，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-4(其包含SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列)；
雙靶融合蛋白7#，其包含SEQ ID NO:22所示的胺基酸序列，其從N端至C端可分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列)，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-7(其包含SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列)；
雙靶融合蛋白9#，其包含SEQ ID NO:23所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和IgG-Fc-PAAK (其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列)，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-9(其包含SEQ ID NO:6所示的胺基酸序列)；
雙靶融合蛋白12#，其包含SEQ ID NO:24所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列) ，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-12(其包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列)。
在一些實施方案中，所述雙靶融合蛋白為二聚體融合蛋白。優選地，從N端至C端分別為兩個GLP-1-GEG，兩條第一連接子，兩個重鏈IgG-Fc-PAAK，兩條第二連接子和兩個FGF21多肽。
所述雙靶融合蛋白1#、2#、4#、7#、9#、12#，分別包含的胺基酸序列SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:24是從N端至C端分別為單體GLP-1-GEG，單條第一連接子，單個重鏈IgG-Fc-PAAK，單條第二連接子和單個FGF21多肽的胺基酸序列。
例如，雙靶融合蛋白1#，為二聚體融合蛋白，從N端至C端分別為兩個GLP-1-GEG，兩條第一連接子，兩個重鏈IgG-Fc-PAAK，兩條第二連接子和兩個FGF21，其中，單個GLP-1-GEG，單條第一連接子，單個重鏈IgG-Fc-PAAK，單條第二連接子和單個FGF21具有SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列，其從N端至C端分別為GLP-1-GEG(其包含SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列)，第一連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)，IgG-Fc-PAAK(其包含SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列)，第二連接子(其包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列)和FGF21-1(其包含SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列)。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的雙靶融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
所述雙靶融合蛋白可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病為糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
第四方面，本發明提供給了一種分離的核酸分子在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述分離的核酸分子可編碼第一方面所述的FGF21多肽、第二方面所述的FGF21融合蛋白、或第三方面的雙融合蛋白。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的雙靶融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
所述雙靶融合蛋白可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病為糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
第五方面，本發明提供了一種載體在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述載體包含第四方面的分離的核酸分子。
所述載體可以為質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，所述載體為表達載體。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的雙靶融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
所述雙靶融合蛋白可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病為糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
第六方面，本發明提供了一種宿主細胞在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述宿主細胞可包含或表達本發明第一方面所述的FGF21多肽、第二方面所述的FGF21融合蛋白、第三方面所述的雙融合蛋白、第四方面所述的分離的核酸分子或第五方面所述的載體。
所述藥物還可以是藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的雙靶融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。所述藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
所述藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或通過皮下儲存庫給藥。
所述雙靶融合蛋白可用於治療由FGF21的代謝失調引起的疾病。所述FGF21的代謝失調引起的疾病為糖尿病、脂肪肝、肥胖和/或胰腺炎。優選地，所述FGF21多肽可用於治療與脂肪肝相關的疾病，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化。優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
在最近20年，隨著肥胖在全世界範圍內流行，越來越多既不酗酒也無病毒性肝炎的人群患上了晚期肝臟疾病，NASH才逐漸得到了人們的重視。NASH這種“沉默的疾病”其實很可怕，如果不及時治療，它會引起肝臟纖維化，最終可能會發展成為肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。除了肝移植外，患者們別無他法。2020年以後，NASH將成為美國肝臟移植的最主要原因。然而，全球範圍內，獲批上市的治療NASH的藥物只有1到2個，究其原因，NASH的發病率非常複雜，有學者提出“二次打擊”和“多次打擊”等學說，然而到目前為止，尚不知道NASH的具體發病機理。
本發明發現並且證實了本發明的雙融合蛋白不僅可以發揮持久的降血糖和減重效果，還可以改善血脂和肝功能，具體而言，可以顯著降低肝功指標：ALT（丙胺酸轉胺酶）和AST（天門冬胺酸轉胺酶）的水平，降低肝中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的水平。此外本發明的融合蛋白還可以顯著降低肝組織脂肪變、炎性浸潤、肝臟氣球樣變以及NAS評分，尤其是，顯著降低肝纖維化得分，這些指標顯示本發明的融合蛋白可以顯著改善NASH的指標，這些顯著的效果是基於現有技術公開的內容完全預料不到的。
定義：
在本發明中，術語「蛋白質」和「多肽」可互換使用，並且在其最廣泛的意義下，是指兩個或更多個胺基酸、胺基酸類似物或肽類比物亞單位組成的化合物。
在本發明中，術語「組合物」通常是兩種或更多種物質的組合，例如，活性劑與其它惰性或活性化合物的組合。
在本發明中，術語「治療有效量」通常指對受試者產生治療益處所需的活性成分的最小劑量。例如，對於表現出患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代謝綜合征的患者或為預防其發病的患者而言，「治療有效量」是指能夠誘導、改進或者造成與上述紊亂相關或因與之對抗所致的病理症狀、疾病進展、生理情況改善的劑量。
本發明中，術語「受試者」或「患者」可為人，但也可為非人動物，更具體而言可為伴侶動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、羊、豬、馬等)或者實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)等。
在本發明中，術語「連接子」通常是指可通過肽鍵連接兩個或多個多肽的功能性結構。在本發明中，術語“連接子”、“linker” 和“接頭”可互換使用。當形成本發明的融合蛋白時，可以使用連接子。連接子可由通過肽鍵連接在一起的胺基酸構成。本發明的連接子可為任何長度或組成的連接子。在某些實施方案中，連接子可由通過肽鍵連接的1-20個胺基酸構成。例如，所述胺基酸可選自20種天然存在的胺基酸。在某些實施方式中，所述胺基酸可選自甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸和離胺酸。在某些實施方案中，所述連接子由空間上不受阻礙的多個胺基酸構成。例如，所述空間上不受阻礙的胺基酸可以為甘胺酸和丙胺酸。所述連接子可以為富含G的多肽，例如，其可以選自(G)3-S(即“GGGS”)、(G) 4-S (即“GGGGS”) 和(G) 5-S (即“GGGGGS”)。在一些實施方案中，所述連接子可以為：GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS或GGGGSGGGGSGGGGSA。其它合適的連接子可以為：GGGGGSGGGSGGGGS、GGGKGGGG、GGGNGSGG、GGGCGGGG和GPNGG等。本發明中所述的連接子還可以為非肽連接子。例如，可以使用烷基連接子，例如-NH-(CH2)S-C(O)-，其中S＝2-20。這些烷基連接子可被任何無空間位阻的基團進一步取代，所述無空間位阻的基團可包括但不限於低級烷基(例如C1-C6)、低級醯基、鹵素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。示例性的非肽連接子還可以為聚乙二醇連接子，其中連接子的分子量可以為100-5000kD，例如100-500kD。
在本發明中，術語「雙融合蛋白」通常指由兩個或更多個蛋白或多肽融合得到的蛋白。在本發明中，所述的雙融合蛋白可包含所述的FGF21多肽。編碼所述兩個或更多個蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此連接而形成融合基因或融合的核酸分子，該融合基因或融合的核酸分子可編碼所述雙融合蛋白。所述雙融合蛋白可通過用於生物學研究或治療的重組DNA技術人工創造。在本發明中，所述雙融合蛋白還可包含除所述FGF21多肽以外的結構域。在本發明中，所述的雙融合蛋白還可以包含連接所述FGF21多肽和所述除FGF21多肽以外的結構域的連接子，和/或其他結構域。
在本發明中，術語「免疫球蛋白Fc結構域」通常是指包含免疫球蛋白(例如，抗體)的CH2和CH3恆定區部分的結構域。例如，所述免疫球蛋白Fc結構域可以為由免疫球蛋白(例如，抗體)的鉸鏈區、CH2和CH3恆定區部分組成的結構域。例如，所述免疫球蛋白可以為人免疫球蛋白。例如，所述免疫球蛋白可以為人IgG1。
在本發明中，術語「功能性變體」通常是指在目標蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫綴合物、所述免疫球蛋白Fc結構域或所述GLP-1)的胺基酸序列的基礎上進行取代、缺失或添加一個或多個胺基酸，然而仍保留至少一個該目標蛋白的生物學特性的蛋白質或多肽。在本發明中，所述「一個或多個」胺基酸替換中的“多個”通常是指大於1個胺基酸的替換。例如，1～30個、1～20個、1～10個、1～5個、如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、或30個胺基酸的替換。例如，所述功能性變體可包含已經通過至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。所述功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白質或所述多肽的生物學特性。例如，所述功能性變體可保持改變之前的所述蛋白質或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物學活性。例如，所述取代可以為保守取代。
在本發明中，所述功能性變體還可以為所述目標蛋白(例如所述FGF21多肽、所述融合蛋白或免疫綴合物、所述免疫球蛋白Fc結構域或所述GLP-1)的同源物。在本發明中，所述同源物可以為，例如，與所述目標蛋白的胺基酸序列具有至少約85％(例如，具有至少約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本發明中，所述同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以通過以下方式計算「序列同源性百分比」：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。
本發明所述的「FGF21多肽」，在一些實施例中是野生型FGF21，在一些實施例中是FGF21變體。
本發明所述的「GLP-1」，在一些實施例中是野生型GLP-1，在一些實施例中是GLP-1變體。
本發明所述的「雙靶融合蛋白1# FGF21」，既包含雙靶融合蛋白1# 在體內代謝後游離的FGF21 +Fc，又包含未代謝的或完整的雙靶融合蛋白1#。
本發明所述的「雙靶融合蛋白1# GLP-1」，既包含雙靶融合蛋白1# 在體內代謝後游離的GLP-1+Fc，又包含未代謝的或完整的雙靶融合蛋白1#。
以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限於以下優選實施方式。應當指出，對於本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和改進，都屬於本發明的保護範圍。所用試劑未注明生產商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例 1 表達載體質粒 -X2 的構建
委託蘇州金唯智生物科技有限公司合成目的基因，所述目的基因編碼雙靶融合蛋白1#（其包含SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列）。在37 ℃條件下，利用內切酶HindⅢ和EcoRⅠ（TAKARA，Japan）消化處理目的基因序列和載體質粒pXC17.4，採用Gel Extraction Kit試劑盒按廠商說明純化回收消化產物。利用DNA Ligation Kit Ver.2.1（TAKARA，Japan）按廠商說明將純化回收的目的基因和載體連接，16 ℃恆溫處理1小時，得到重組表達質粒。
將上述重組表達質粒轉化到感受態細胞DH5a中，取菌體塗布胺苄平板。挑取平板上的單克隆於1ml LB培養基（蛋白腖10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉10 g/L和瓊脂2％，抗生素含量100 μg/L）中培養後提取質粒，經廣州艾基生物技術有限公司測序驗證正確，採用Invitrogen質粒大提試劑盒提取一系列經驗證正確的表達載體，用限制性內切酶Pvu Ⅰ 酶切（TAKARA，Japan），進行線性化後利用乙醇沉澱方法純化回收，-20 ℃保藏備用。
實施例 2 載體轉染及在細胞中表達
將CHO宿主細胞用Cellvento CHO-200培養基（Merck）復蘇培養後，當細胞密度約4.76×10 6cells/mL時收集細胞進行轉染。轉染細胞約1×10 7cell，質粒約40 μg，通過電擊方法轉染（Bio-Rad，Gene pulser Xcell）。電擊後細胞於20 mL Cellvento CHO-200培養基中培養。培養第二天，離心收集細胞，並在加入L-Methionine sulfoximine(Sigma-aldrich)至終濃度50 μM的20 mL Cellvento CHO-200培養基中重懸培養。當細胞密度約0.6×10 6cell/mL時，對獲得的混合克隆株用Cellvento CHO-200培養基進行傳代，傳代細胞密度約0.2×10 6cell/mL。當細胞存活率約90%時，收集細胞培養液。
實施例 3 融合蛋白純化及檢測
將細胞培養液在200 g下離心10 min，取上清在8000 rpm下離心30 min後，收集上清，利用Protein A層析柱（EzFast Protein A Diamond，柏格隆）對離心後的細胞培養液上清進行親和純化，平衡液為20 mM PBS，0.15 M NaCl，pH7.4；洗脫液為 0.1 M 甘胺酸緩衝液 pH3.2，收集目標吸收峰下蛋白洗脫液，用20 mM PBS pH7.4緩衝液透析後取部分樣品經非還原（參見圖1）與還原（參見圖2）後通過10% SDS-PAGE電泳檢測。同時取部分樣品進行質譜檢測，質譜（Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型號G6530，Agilent Technologies）檢測分子量，與理論分子量一致，且為同源二聚體形式（參見圖3）。
實施例 4 雄性 C57BL/6 小鼠單次靜脈注射或皮下注射藥代動力學
雄性C57BL/6小鼠6隻（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），隨機平均分為2組，3隻/組，按1 mg/kg分別靜脈注射或皮下注射給予雙靶融合蛋白1#。分別於給藥後1、5、7、24、48、72、120、168、240、336 h採血並分離血漿（EDTA-K2抗凝），靜脈給藥組增加0.25 h採血。採用3種ECLA法（均基於雙抗夾心原理）分析各樣本中雙靶融合蛋白1#、雙靶融合蛋白1# FGF21（Fc+FGF21）和雙靶融合蛋白1# GLP-1（GLP-1+Fc）的濃度。根據血漿藥物濃度計算藥代動力學參數，主要PK參數結果見表1，藥時曲線見圖4。
C57BL/6小鼠皮下注射雙靶融合蛋白1#後，雙靶融合蛋白1#、雙靶融合蛋白1# FGF21和雙靶融合蛋白1# GLP-1平均血漿半衰期分別為7.2、12和38 h；平均達峰時間分別為5.7、7.0和6.3 h，平均C max分別為3.24、3.96和4.45 μg/mL，平均AUC last分別為60.7、119和230 μg•h/mL，絕對生物利用度分別為75%、77%和95%。 [表1] C57BL/6小鼠單次靜脈或皮下注射給藥後主要藥代動力學參數總結（均值）
組別 受試物 給藥方式 劑量 分析物 AUC last C max T max t 1/2 MRT Vz 或 Vz/F CL 或 CL/F F
mg/kg μg·h/ mL μg/mL h h h mL/kg mL/h/kg %
1 雙靶融合蛋白1# i.v. 1 雙靶融合蛋白1# 80.5 4.89 5.0* 7.0 11 126 12.4 /
雙靶融合蛋白1# FGF21 155 6.77 5.7* 11 18 102 6.45 /
雙靶融合蛋白1# GLP-1 243 6.50 5.0* 39 37 228 4.11 /
2 雙靶融合蛋白1# s.c. 1 雙靶融合蛋白1# 60.7 3.24 5.7 7.2 14 189 18.2 75
雙靶融合蛋白1# FGF21 119 3.96 7.0 12 23 154 8.67 77
雙靶融合蛋白1# GLP-1 230 4.45 6.3 38 43 237 4.37 95
*靜脈注射過程中可能部分藥液誤注入皮下組織，導致出現吸收峰。
實施例 5 雙靶融合蛋白 1# 在高脂誘導的 C57BL/6 小鼠模型中發揮持久的降低血糖和減重效果
C57BL/6小鼠（購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）在高脂飼料（D12492,Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ）餵養16週後，根據測定的血糖和體重進行隨機分組成溶媒組或治療組。在研究中包括普通飼料對照組(Control)、高脂飼料模型組(Model)給予溶媒PBS、索馬魯肽（Semaglutide）皮下注射一天一次（QD）10 nmol/kg、雙靶1#每週兩次給藥（BIW）低劑量為3 nmol/kg和高劑量10 nmol/kg ，每組7隻，藥物組按照給藥頻率給予相應藥物，連續給藥16週，給藥期間繼續喂予高脂飲食至實驗結束。監測小鼠隨機血糖、體重及腹腔糖耐量IPGTT。
整個試驗階段監測動物隨機血糖，結果（參見圖5A）顯示與對照組相比，各組血糖升高幅度較小。雙靶融合蛋白1# 10 nmol/kg在給藥階段平均血糖維持在7.04 mmol/L左右，相比模型組降低22.4%，處於各組中最低，但動物狀態良好，未出現低血糖症狀。首次給藥後，與模型組相比，陽性藥索馬魯肽和雙靶融合蛋白1# 10 nmol/kg均能顯著降低血糖AUC0-72h (p＜0.05)（參見圖5B）。
實驗第2(參見圖6A)、8（參見圖6B）、16（參見圖6C）週分別進行IPGTT實驗，從圖6可以看出，腹腔糖耐量（IPGTT） 與對照組相比， 模型組動物在給予葡萄糖糖前或後血糖均有顯著增加，0-90 min血糖曲線下面積增加也明顯，即模型組動物糖耐量異常高。與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和索馬魯肽均能顯著降低給糖後30-90 min或15-90 min時間點血糖及血糖-曲線下面積，雙靶融合蛋白1#的降低效應具有良好量效，且等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低更為顯著。
試驗結束時動物測空腹血糖，同時取血清檢測血清胰島素水平並計算HOMA-IR指數，圖7結果顯示：與對照組相比，模型組動物空腹血糖（參見圖7A）、胰島素（參見圖7B）和HOMA-IR（穩態模型胰島素抵抗指數）（參見圖7C）指數均顯著升高，即模型組動物表現為胰島素抵抗。相比於模型組，雙靶融合蛋白1#在低、高劑量下均顯著降低空腹血糖水平（P＜0.001），等摩爾劑量下降低空腹血糖效果優於索馬魯肽；雙靶融合蛋白1#、陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低胰島素水平和HOMA-IR指數（P＜0.001），且雙靶融合蛋白1#降低程度量效顯著，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#對HOMA-IR降低幅度與索馬魯肽相當。
給藥階段監測動物體重並計算體重變化率，圖8結果顯示：與對照組相比，模型組動物體重遠高於對照組，且體重持續增加。與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和索馬魯肽均能顯著降低動物體重增長率（P＜0.001），且雙靶融合蛋白1#減重效應量效顯著，10 nmol/kg劑量下體重下降幅度達42.4%，而等摩爾劑量下索馬魯肽體重降低幅度為24.3%(參見圖8A)。動物解剖時取動物皮下脂肪、附睾脂肪及腎周脂肪，並計算總脂肪質量，表2的結果顯示：與對照組相比，模型組體脂質量顯著升高，包括皮下脂肪、附睾脂肪、腎周脂肪及總脂肪。與模型組相比，雙靶融合蛋白1#、陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低體脂質量（P＜0.001），且雙靶融合蛋白1#降低體脂程度呈明顯的量效關係，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低幅度優於索馬魯肽（參見圖8B）。 [表2]高脂飲食誘導C57BL/6小鼠脂肪質量（平均值±SD，n=6-7）
組別 劑量（nmol/kg ） 皮下脂肪（g ） 附睾脂肪（g ） 腎周脂肪（g ） 總脂肪脂肪（g ）
對照組 0 0.2±0.1 0.4±0.3 0.1±0.1 0.6±0.4
模型組 0 2.9±0.5 ### 1.8±0.4 ### 1.7±0.4 ### 6.4±1.2 ###
索馬魯肽 10 0.9±1.0 ** 1.0±0.5 ** 0.6±0.6 ** 2.6±2.1 **
雙靶融合蛋白1# 3 1.1±0.6 *** 0.7±0.5 *** 0.5±0.2 *** 2.3±1.2 ***
雙靶融合蛋白1# 10 0.4±0.1 *** 0.5±0.2 *** 0.2±0.0 *** 1.1±0.3 ***
### P＜0.001 vs 對照組; *, **, *** P＜0.05, 0.01, 0.001 vs 模型組。
實施例 6 雙靶蛋白高脂飲食誘導 C57BL/6 小鼠模型可顯著改善血脂及肝功能作用
實施例4試驗結束時即給藥第16週，動物過夜禁食不禁水，稱重後眼眶採血，分離血清全自動生化儀檢測血清脂質（TG（甘油三酯）， TC（總膽固醇））和肝功指標ALT（丙胺酸轉胺酶）/AST（天門冬胺酸轉胺酶）。採用Elisa試劑盒檢測血清胰島素水平，根據公式計算HOMA-IR指數，即HOMA-IR=空腹血糖第16週IPGTT 0時血糖值）×空腹胰島素/22.5。動物取血完畢後，解剖取其肝臟、皮下脂肪、附睾脂肪以及腎周脂肪進行稱重。稱取約40-60 mg肝組織置於勻漿管中，加入1 mL無水乙醇進行勻漿，勻漿後取勻漿液，4 ℃，3,500 rpm，離心10 min，取上清，用全自動生化檢測儀檢測上清中TG及TC的濃度，隨後根據稱取的肝重進行計算，得出TG及TC的含量。
圖9顯示，與對照組相比，模型組動物總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平均顯著升高，屬於高血脂動物模型，與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低血清TG，且雙靶融合蛋白1#降低效應量效顯著，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低TG幅度略優於索馬魯肽；雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低血清TC，且雙靶融合蛋白1#降低效應量效顯著，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低TC幅度略優於索馬魯肽（參見圖9A和9B）。
圖10顯示，與對照組相比，模型組動物血清肝功ALT和AST水平均顯著升高，與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低ALT和AST水平，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低幅度與索馬魯肽相當（參見圖10A和10B）。
圖11顯示，與對照組相比，模型組動物肝絕對重量顯著升高，與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低肝絕對重量，且雙靶融合蛋白1#降低程度量效顯著，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低幅度略大於索馬魯肽（參見圖11）。
圖12顯示，與對照組相比，模型組動物肝勻漿總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平均顯著升高，屬於高血脂動物模型，與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低肝勻漿TG水平，且雙靶融合蛋白1#降低效應量效顯著，等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#降低TG幅度略優於索馬魯肽；與對照組相比，模型組肝勻漿TC升高不明顯，且除雙靶融合蛋白1#-10 nmol/kg組與模型組相比TC顯著降低之外，其餘各組無明顯差異（參見圖12A和12B）。
實施例 7 雙靶蛋白高脂飲食誘導 C57BL/6 小鼠模型可顯著改善肝臟 NASH 指標
對實施例5解剖獲取的肝臟左大葉浸泡在裝有福馬林的50 mL離心管中製備肝病切片，將福馬林肝組織進行蠟塊的製作、切片、HE染色，將HE染色片郵寄到蘇州凱斯艾有限公司進行NAS評分；採用天狼星紅染色評估纖維化程度，根據纖維化的嚴重程度進行打分，分值在1-3分。光鏡觀察肝組織病理學改變並進行NAS/纖維化評分。
圖13顯示，與對照組相比，模型組動物肝組織發生嚴重的脂肪樣變，肝細胞普遍出現空泡化現象，多處出現炎性病灶，並出現輕至中度纖維化。
圖14以及下表3顯示，與模型組相比，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低肝組織脂肪變、炎性浸潤以及NAS評分；在纖維化改善上，雙靶融合蛋白1#和陽性對照組索馬魯肽均能顯著降低肝纖維化得分。 [表3] 高脂飲食誘導C57BL/6小鼠肝組織NAS及纖維化評分（平均值±SD，n=6-7）
組別 劑量（nmol/kg ） 脂肪變性 炎症 氣球樣變性 NAS 總分 纖維化人工評分
對照組 0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 1.1±0.2
模型組 0 2.6±0.5 ### 1.0±0.0 ### 0.0±0.0 3.6±0.5 ### 2.6±0.4 ###
索馬魯肽 10 0.0±0.0 *** 0.0±0.0 *** 0.0±0.0 0.0±0.0 *** 1.5±0.5 **
雙靶融合蛋白1# 3 0.0±0.0 *** 0.0±0.0 *** 0.0±0.0 0.0±0.0 *** 1.1±0.2 ***
雙靶融合蛋白1# 10 0.0±0.0 *** 0.3±0.8 * 0.0±0.0 0.3±0.8 *** 1.3±0.4 ***
##, ### P＜0.01, 0.001 vs 對照組; *, **, *** P＜0.05, 0.01, 0.001 vs 模型組。
實施例 8 ob/ob 小鼠模型給藥 6 週降低血糖的效果
採用雄性ob/ob小鼠（常州卡文斯實驗動物有限公司），共70隻，體重43-45克左右，飼喂高脂飼料（D12492,Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ）9週以建立非酒精性脂肪肝（NASH）模型，並在開始HFD飼喂3週後測試化合物雙靶融合蛋白1#、Fc-FGF21（單靶1#）、度拉糖肽（Dulaglutide）在為期6週給藥後的治療性藥效。實驗動物在HFD飼養2週後根據體重和血糖隨機分成5組，分別為：模型組（組-1, n=10），雙靶融合蛋白1#-3 nmol/kg組（組-2, n=10）；雙靶融合蛋白1#-10 nmol/kg組（組-3, n=10g）；Fc-FGF21-10 nmol/kg組（組-4, n=10）；度拉糖肽-10 nmol/kg（組-5, n=10）。其中，模型組給予PBS，雙靶融合蛋白1#、Fc-FGF21、度拉糖肽每週給藥2次，共給藥6週。開始HFD飼喂後每兩天記錄動物採食量，採水量及體重，持續到實驗終點。至第一次給藥開始檢測0、2、7、24、48、72小時血糖，隨後一週兩次檢測血糖。實驗終點動物禁食檢測空腹血糖。
圖15顯示，從長期給藥隨機血糖水平來看，受試化合物雙靶融合蛋白1#、Fc-FGF21在給藥後7 h至整個試驗週期血糖值均低於模型組動物，且雙靶融合蛋白1#呈現出劑量依賴性的降低血糖，低、高劑量的平均降糖率分別為36.9%和47.2%。陽性藥物度拉糖肽D5（5天）之後血糖值水平與模型組相比差異較小（P＞0.05）；等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#在給藥早期降糖幅度大於Fc-FGF21，給藥後期降糖大於度拉糖肽。
實施例 9 雙靶融合蛋白 1# 給藥 6 週能夠顯著降低 ob/ob 小鼠體重變化率
模型組動物在給予高脂飲食至實驗結束時體重持續上升，體重增長幅度高達20.23%。圖16顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠血脂改善，與模型組相比，陽性對照度拉糖肽、雙靶融合蛋白1#高劑量組在D1-D43整個給藥期體重增長率顯著下降，平均減重幅度分別達到8.9%和22.7%（p＜0.01或0.001）；雙靶融合蛋白1#低劑量在給藥前期（D1-D37）（第1天-第37天）動物體重增長率顯著下降（p＜0.05或0.001），給藥後期仍有下降趨勢；Fc-FGF21在給藥D5-D21動物體重增長率顯著下降（p＜0.05~0.001），後期體重仍增長緩慢。等摩爾劑量下雙靶融合蛋白1#體重增長率低於陽性對照度拉糖肽和Fc-FGF21。
實施例 10 雙靶融合蛋白 1# 給藥 6 週對 ob/ob 小鼠血脂改善
圖17顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠血脂改善，與模型組相比，受試化合物雙靶融合蛋白1#低、高劑量組及Fc-FGF21組均顯著性降低血清TC水平（分別p＜0.05, p＜0.001, p＜0.01），且雙靶融合蛋白1#呈現良好劑量依賴性；陽性對照度拉糖肽組血清TC降低不明顯；等摩爾劑量下，雙靶融合蛋白1#對TC的降低幅度大於度拉糖肽和Fc-FGF21。受試化合物雙靶融合蛋白1#低劑量組、陽性對照度拉糖肽組顯著性降低血清TG水平（p＜0.01，p＜0.001）；雙靶融合蛋白1#高劑量組及Fc-FGF21組對血清TG改善不顯著。
實施例 11 雙靶融合蛋白 1# 給藥 6 週對 ob/ob 小鼠肝重及 NASH 指標的改善
圖18-21以及下表4顯示了雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠肝重及NASH指標的改善：
圖18顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠肝重和肝臟指數的影響，與模型組相比，所有組動物的肝重和肝臟指數均有顯著性降低（p＜0.001），且雙靶融合蛋白1#呈現良好劑量依賴性；等摩爾劑量下，雙靶融合蛋白1#對肝重和肝臟指數的降低幅度大於度拉糖肽和Fc-FGF21；
圖19顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠血清ALT/AST/ALP水平的影響，與模型組相比，各給藥組血清ALT/AST/ALP水平均顯著性降低（p＜0.05, p＜0.01, p＜0.001），且雙靶融合蛋白1#呈現良好劑量依賴性；等摩爾劑量下，雙靶融合蛋白1#對ALT/AST/ALP的降低幅度大於度拉糖肽和Fc-FGF21；
圖20顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠肝臟TG，TC含量的影響，相對於模型組，各給藥組的肝臟TG，TC含量均有顯著降低（P＜0.01~P＜0.05），且雙靶融合蛋白1#呈現良好劑量依賴性；等摩爾劑量下，雙靶融合蛋白1#對肝組織TG的降低幅度大於度拉糖肽和Fc-FGF21，對肝組織TC的降低幅度大於度拉糖肽，與Fc-FGF21相當；
圖21顯示雙靶融合蛋白1#給藥6週對ob/ob小鼠肝臟病理評分的影響，與對照組相比，模型組動物肝組織發生嚴重的脂肪樣變，肝細胞普遍出現空泡化現象，多處出現炎性病灶，並出現輕至中度纖維化。與模型組相比，雙靶融合蛋白1#高低劑量組呈現出劑量依賴性地降低肝臟脂肪變、肝臟炎症細胞浸潤、肝臟氣球樣變以及NAS評分，且降低程度大於度拉糖肽和Fc-FGF21； [表4] 雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-肝臟病理評分(平均值 ± SEM，n=10)
組別 劑量(nmol/kg) 脂肪變性評分 炎症評分 氣球樣變評分 NAS 評分
模型組 0 3.00±0.00 1.10±0.07 1.30±0.20 5.40±0.17
雙靶融合蛋白1# 3 2.27±0.12 *** 0.40±0.11 ** 0.50±0.21 * 3.17±0.28 ***
雙靶融合蛋白1# 10 0.23±0.20 *** 0.03±0.03 *** 0.00±0.00 *** 0.27±0.20 ***
Fc-FGF21 10 1.90±0.11 *** 0.43±0.13 ** 0.23±0.20 ** 2.57±0.34 ***
度拉糖肽 10 2.80±0.07 0.57±0.13 ** 0.43±0.26 3.80±0.41 **
*, **, *** p＜0.05, 0.01, 0.001 vs. 模型組
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附請求項的範圍。目前本發明所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的請求項和其等同方案的範圍內。
圖1顯示了雙靶融合蛋白1#（簡稱雙靶1#）非還原處理SDS-PAGE檢測圖。 圖2顯示了雙靶融合蛋白1#（簡稱雙靶1#）還原處理SDS-PAGE檢測圖。 圖3顯示了雙靶融合蛋白1#（簡稱雙靶1#）的質譜檢測圖。 圖4顯示了平均血漿藥物濃度-時間曲線。 圖5A-B顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠隨機血糖變化及首次給藥後顯著降低血糖。 圖6A-C顯示了藥物對高脂飲食誘導C57BL/6小鼠腹腔糖耐量IPGTT的影響。 圖7顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠空腹血糖、胰島素水平及HOMA-IR。 圖8顯示了藥物對高脂飲食誘導C57BL/6小鼠體重變化率及體脂質量的影響。 圖9顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠-血清脂質水平。 圖10顯示高脂飲食誘導C57BL/6小鼠-血清肝功指標ALT/AST水平。 圖11顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠-肝絕對重量。 圖12顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠-肝勻漿脂質水平。 圖13顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠肝臟組織病理學照片(400 um)。 圖14顯示了高脂飲食誘導C57BL/6小鼠肝臟組織病理評分。 圖15顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗的隨機血糖。 圖16顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-體重增長率。 圖17顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-血清TC/TG。 圖18 顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-肝臟濕重和肝臟指數。 圖19顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-肝功指標。 圖20顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-肝臟脂質。 圖21顯示了雙靶融合蛋白1#對ob/ob小鼠6週給藥實驗-肝臟病理評分。 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  廣東東陽光藥業有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  FGF21多肽及其融合多肽的應用]]>
          <![CDATA[<130>  CP21072YGUC]]>
          <![CDATA[<160>  24]]>
          <![CDATA[<170>  SIPOSequenceListing 1.0]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  181]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  1]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 
                          165                 170                 175     
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 
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          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 
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          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
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          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
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                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      180     
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      180     
          <![CDATA[<210>  4]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Glu Ser 
                      180     
          <![CDATA[<210>  5]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  5]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      180     
          <![CDATA[<210>  6]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      180     
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  181]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 
                      20                  25                  30          
          Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 
                      100                 105                 110         
          Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Pro Ser Tyr Glu Ser 
                      180     
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  229]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Lys 
          225                 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  228]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly 
          225             
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 
                      20                  25                  30      
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30      
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  424]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      420                 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  424]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      420                 
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 
                      420                 
          <![CDATA[<210>  16]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      420                 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  424]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Cys His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
                      420                 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  424]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                      100                 105                 110         
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
              130                 135                 140                 
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gln Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 
                      260                 265                 270         
          Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 
                  275                 280                 285             
          Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 
              290                 295                 300                 
          Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 
                          325                 330                 335     
          Ser Phe Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 
                      340                 345                 350         
          Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 
                  355                 360                 365             
          Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln 
                          405                 410                 415     
          Gly Leu Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 
                      420                 
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
          465                 470 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
          465                 470 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 
          465                 470 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
          465                 470 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Cys 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Cys Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 
          465                 470 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  470]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                      100                 105                 110         
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
                  115                 120                 125             
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
              130                 135                 140                 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
              210                 215                 220                 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                          245                 250                 255     
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                      260                 265                 270         
          Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  275                 280                 285             
          Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 
          305                 310                 315                 320 
          His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 
                          325                 330                 335     
          Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 
                      340                 345                 350         
          Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 
              370                 375                 380                 
          Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 
          385                 390                 395                 400 
          His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 
                          405                 410                 415     
          Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 
                      420                 425                 430         
          Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 
                  435                 440                 445             
          Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu His Met Val Gly Ala Ser Gln Gly Leu 
              450                 455                 460                 
          Ser Pro Ser Tyr Glu Ser 
          465                 470
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023

Claims (26)

  1. 一種FGF21多肽在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
  2. 如請求項1所述的應用，其中，所述FGF21多肽具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列或其變體，優選地，所述FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，在下述位置處包含胺基酸取代：L98、S167和P171。
  3. 如請求項2所述的應用，其中，所述FGF21多肽還可在選自下組的一個或多個位置處包含胺基酸取代：R175、R19、A180、A31和G43。
  4. 如請求項1所述的應用，其中，所述FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，其可在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代： (1)L98、S167、P171和R175； (2)L98、S167、P171、R175和R19； (3)L98、S167、P171、R175、R19和A180； (4)L98、S167、P171、R175、R19、A31和G43； 優選地，所述FGF21多肽在L98處的胺基酸取代可為L98R， 優選地，所述FGF21多肽在S167處的胺基酸取代可為S167H， 優選地，所述FGF21多肽在P171處的胺基酸取代可選自P171A和P171G， 優選地，所述FGF21多肽在R175處的胺基酸取代可為R175L， 優選地，所述FGF21多肽在R19處的胺基酸取代可為R19V， 優選地，所述FGF21多肽在A31處的胺基酸取代可為A31C。
  5. 如請求項1所述的應用，其中，所述的FGF21多肽與SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列相比，包含選自下組的胺基酸取代：(1)L98R、S167H和P171A；(2)L98R、S167H、P171A和R175L；(3)L98R、S167H、P171A、R175L和R19V；(4)L98R、S167H、P171G、R175L和R19V；(5)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V和A180E；(6)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V和A180E；(7)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；(8)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C；(9)L98R、S167H、P171A、R175L、R19V、A31C和G43C；和(10)L98R、S167H、P171G、R175L、R19V、A31C和G43C。
  6. 如請求項1所述的應用，其中，所述的FGF21多肽具有下組中任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO:2-7。
  7. 一種FGF21融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述FGF21融合蛋白包含FGF21多肽以及免疫球蛋白Fc結構域，其中，所述FGF21多肽如請求項1至6中任一項中所述。
  8. 如請求項7所述的應用，其中，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽的N末端連接， 優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域為人IgG的Fc或其功能性變體， 更優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項7所述的應用，其中，所述FGF21多肽經連接子與所述Fc結構域連接， 優選地，所述連接子為肽連接子， 更優選地，所述連接子的N末端與所述免疫球蛋白Fc結構域的C末端連接，且所述連接子的C末端與所述FGF21多肽的N末端連接， 更優選地，所述連接子包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項7所述的應用，其中，所述FGF21融合蛋白包含選自如下的任一種胺基酸序列：SEQ ID NO:13-18。
  11. 如請求項9所述的應用，其中，所述FGF21融合蛋白為二聚體融合蛋白，從N端至C端分別為兩個重鏈IgG-Fc-PAAK，兩條連接子和兩個FGF21多肽。
  12. 如請求項10所述的應用，其中，所述SEQ ID NO:13-18任一項的胺基酸序列是單體FGF21多肽以及單個連接子和單個重鏈Fc區的胺基酸序列。
  13. 一種包含請求項1至6中任一項中所述的FGF21多肽和GLP-1或其功能性變體的雙融合蛋白在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用。
  14. 如請求項13所述的應用，其中，所述GLP-1或其功能性變體包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項13所述的應用，其中，所述雙融合蛋白還可包含免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體。
  16. 如請求項15所述的應用，其中，所述免疫球蛋白Fc結構域位於所述FGF21多肽與所述GLP-1或其功能性變體之間， 優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽的N末端連接，並且與所述GLP-1或其功能性變體的C末端連接；或者，所述免疫球蛋白Fc結構域與所述FGF21多肽C末端連接，並且與所述GLP-1或其功能性變體的N末端連接， 優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域為人IgG的Fc或其功能性變體， 更優選地，所述免疫球蛋白Fc結構域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的胺基酸序列。
  17. 如請求項15所述的應用，其中，所述雙融合蛋白還包含連接子，將所述FGF21多肽與免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體連接和/或將GLP-1或其功能性變體與免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體連接，優選地，所述連接子為肽連接子。
  18. 如請求項17所述的應用，其中，所述連接子包含第一連接子和第二連接子，所述第一連接子將GLP-1或其功能性變體與免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體連接，所述第二連接子將所述FGF21多肽與免疫球蛋白Fc結構域或其功能性變體連接， 優選地，所述第一連接子的N末端與GLP-1或其功能性變體的C末端連接，所述第一連接子的C末端與所述Fc結構域或其功能性變體的N末端連接；所述第二連接子的C末端與所述FGF21多肽的N末端連接，所述第二連接子的N末端與所述Fc結構域或其功能性變體的C末端連接；或者， 所述第一連接子的C末端與GLP-1或其功能性變體的N末端連接，所述第一連接子的N末端與所述Fc結構域或其功能性變體的C末端連接；所述第二連接子的N末端與所述FGF21多肽的C末端連接，所述第二連接子的C末端與所述Fc結構域或其功能性變體的N末端連接， 優選地，所述第一連接子和/或所述第二連接子包含SEQ ID NO:12所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項17所述的應用，其中，所述雙融合蛋白包含下組中任一項所示的胺基酸序列：SEQ ID NO:19-24。
  20. 如請求項17所述的應用，其中，所述雙融合蛋白為二聚體融合蛋白，優選地，從N端至C端分別為兩個GLP-1-GEG，兩條第一連接子，兩個重鏈IgG-Fc-PAAK，兩條第二連接子和兩個FGF21多肽。
  21. 如請求項19所述的應用，其中，所述胺基酸序列SEQ ID NO:19-24中的任一項是從N端至C端分別為單體GLP-1-GEG，單條第一連接子，單個重鏈IgG-Fc-PAAK，單條第二連接子和單個FGF21多肽的胺基酸序列。
  22. 一種分離的核酸分子在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述分離的核酸分子編碼如請求項1至6中任一項所述的FGF21多肽、請求項7至12中任一項所述的FGF21融合蛋白、或請求項13至21中任一項所述的雙融合蛋白。
  23. 一種載體在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述載體包含請求項22中所述的分離的核酸分子。
  24. 一種宿主細胞在製備用於治療與脂肪肝相關的疾病的藥物中的應用，所述宿主細胞可包含或表達請求項1至6中任一項所述的FGF21多肽、請求項7至12中任一項所述的FGF21融合蛋白、請求項13至21中任一項所述的雙融合蛋白、請求項22中所述的分離的核酸分子或請求項23中所述的載體。
  25. 如請求項13至24中任一項的應用，其中，所述藥物為藥物組合物，其可包含治療有效量的所述的雙融合蛋白，以及任選地藥學上可接受的佐劑。
  26. 如請求項1至25中任一項的應用，其中，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），非酒精性脂肪性肝炎（NASH），肝纖維化或肝硬化， 優選地，所述與脂肪肝相關的疾病為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
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