TW202237813A - 細胞層片製造用細胞培養器材、細胞層片製造用套組及細胞層片製造方法 - Google Patents

Abstract

提供用於製造再生醫療或藥物開發研究所用的細胞層片的細胞培養器材、細胞層片製造用套組。具體而言，該培養器材透過將無論有無刺激，與刺激反應區域相比具有強細胞黏著力而用於抑制細胞剝離的細胞剝離抑制區域直接設置於細胞培養面的周圍延綿一整圈，在細胞剝離抑制區域的內側配置根據外部刺激而針對細胞的黏著性會變化的刺激反應區域，而防止培養基交換等機械性刺激所導致的細胞剝離。又，透過用於回收具備指定特徴的細胞層片的回收用支持體，可容易回收細胞層片。

Description

細胞層片製造用細胞培養器材、細胞層片製造用套組及細胞層片製造方法

本發明是關於將用於再生醫療、藥物開發研究等領域的層片狀的細胞自器材剝離並回收之際所用的回收用支持體及細胞培養器材、及包含它們的細胞層片製造用套組。特別是關於以培養中的細胞容易剝離且面積比較大的培養器材來培養、或由具備容易剝離性質的細胞來製造細胞層片之際所用的細胞培養器材等。是關於具體的細胞種類為上皮細胞、間葉系幹細胞、成肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞、成骨細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、腎細胞、肝細胞所製成的細胞層片的製造所用的套組、細胞培養器材。

透過培養自具有正常功能的組織採取的細胞，移植於患者，而促進損傷的器官或組織的自我再生能力，組織修復及回復功能的再生醫療在近年備受矚目。再生醫療是透過將在患者體外培養的細胞、或自培養的細胞建構的組織移植於患者體內，使損傷的組織或器官再生，回復喪失的功能的醫療。細胞層片為用於再生醫療而培養成層片狀的細胞，用於移植於患者，建構組織。又，細胞層片不只對於臨床應用，對於醫藥品的安全性評價或醫藥品開發等基礎研究亦擔任重要角色。

使用再生醫療等製品的治療方法有如上所述將細胞培養成層片狀的細胞層片作移植的方法。黏著細胞若培養於培養器材上，則會附著於培養器材，同時細胞鄰居會黏著，變成匯合（Confluent）的層片狀的細胞集合體（細胞層片）。值得注意的是，「匯合」是指細胞覆蓋培養面的狀態。例如，上皮細胞層片用於大範圍燒傷、退化性關節炎、抑制食道癌的內視鏡黏膜下層剝離術（ESD）後切除部位食道狹窄、角膜再生，間葉系幹細胞用於失智症等腦疾病、乳房重建、退化性關節炎、剝脫性骨軟骨炎、缺血性心臟病，成肌細胞用於缺血性心臟病等，透過將它們移植於需要細胞再生的部位來進行治療。根據治療目的，需要準備用於培養的細胞、細胞層片的大小等各式各樣的東西。

在再生醫療中，移植細胞之際，需要將細胞保持層片狀自細胞培養器材剝離。自細胞培養器材剝離細胞層片的方法有使用分散酶等蛋白質分解酶來弱化培養器材的培養表面與細胞之間的結合的方法，或使用具備使細胞黏著力發生變化的培養表面的細胞培養器材的方法。

若使用蛋白質分解酶來回收，則不只細胞與細胞培養器材的培養表面的結合，連細胞之間的結合亦會弱化，故有造成細胞層片損傷，移植後植入性顯著劣化的問題。為了避免此問題，建議使用具備針對細胞的黏著力會變化的培養表面的細胞培養器材，不會破壞存在於細胞膜的蛋白質，來回收細胞的方法。

使用細胞黏著力會變化的培養表面來回收細胞層片的方法有使用刺激反應性聚合物的方法。刺激種類包括溫度、pH、離子、光、電位、磁性等，但使用溫度反應性聚合物所導致的溫度刺激，由於容易施加刺激，對於細胞亦無影響，故可適用。專利文獻1揭示將細胞培養器材被覆具有上限臨界溶解溫度、下限臨界溶解溫度的聚合物的培養器材。透過溫度反應性聚合物，加以變化環境溫度，可控制培養器材表面的疏水性、親水性平衡。

被覆溫度反應性聚合物的培養器材在細胞培養時的溫度下，由於水脫離自器材表面的聚合物，聚合物表面會收縮，表面容易黏著細胞。另一方面，在指定溫度以下，器材表面為親水性，由於細胞失去黏著的立基點，細胞自器材剝離。若是透過利用溫度反應性聚合物的方法，細胞、器材之間黏著性會消失，但細胞鄰居的黏著性不會消失，故可將細胞保持層片狀回收。

使用再生醫療等治療為使用上皮細胞、內皮細胞、及幹細胞的治療，根據治療區域來準備需要的細胞層片。根據治療所準備的細胞種類或細胞層片大小亦不同，隨之培養時的細胞的處理難易度亦不同。例如，在用於防止食道癌的內視鏡的黏膜下層剝離術（ESD）後的食道狹窄，或再生角膜或牙周組織等的情形下，不需要太大面積的細胞層片。另一方面，對於處理大範圍燒傷等，需要大面積的細胞層片。大面積的細胞層片相較於小面積的細胞層片，在製造過程中容易自培養器材剝離。又，存在成肌細胞等具備非常容易剝離的性質的細胞種類。在製造大面積的細胞層片的情形下，或者，根據細胞種類，隨著細胞增殖成匯合，透過在交換培養液之際操作移液器等所導致的機械刺激，細胞容易自培養器材的表面剝離。

在以細胞層片來回收的情形下，將細胞培養到達成匯合狀態，但在吸取培養基之際，若回收細胞層片時細胞會剝離，則對於移植亦會產生問題。儘管給予充分注意來進行作業，若在培養期間交換培養基等時，細胞會自邊緣剝離，則無法回收成細胞層片，而無法進行移植。特別是，在將細胞用於處理大範圍燒傷等情形下，移植面積大，故盡可能使用大培養面積的培養器材，需要將培養的細胞層片全部回收。如上所述，若培養面積大，則細胞容易剝離，故培養基交換等之際的細胞剝離是一大問題。

有揭示在使用具備刺激反應性表面的培養器材的方法中，在器材表面配置刺激反應性表面及無刺激反應性表面，以調整細胞黏著性的細胞培養容器（專利文獻2～4）。專利文獻2揭示即使在施加刺激後細胞層片仍然穩定保持在培養面上，而作為容易回收細胞層片之用的培養容器，且具有環繞刺激反應區域而具備細胞黏著性的細胞黏著區域的細胞培養器材。專利文獻3揭示為了提供可容易觀察作為與細胞的立基點（培養器材表面）黏著之側的內面的細胞培養器材，具備刺激反應區域、細胞黏著區域、及細胞非黏著區域，在刺激反應區域的外緣的至少一部分具備與細胞非黏著區域之間的邊界的細胞培養器材。專利文獻4揭示在培養操作中的細胞層片不會在意外的時機點剝離，而可在所需的時機點使細胞層片自基材剝離的細胞層片的製作方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 特開平05-192138號公報 [專利文獻2] 特開2019-24350號公報 [專利文獻3] 特開2012-105608號公報 [專利文獻4] 特開2015-70797號公報

[發明所欲解決的課題]

然而，專利文獻2所記載的容器是透過確保細胞可黏著的區域，在施加刺激，細胞自刺激反應區域剝離後，細胞層片仍然保持於培養表面，再透過移液器或鑷子來將黏著部位剝離，簡單回收細胞之用的容器。亦即，專利文獻2所記載的細胞培養容器是以在施加刺激後，將細胞層片的一部分保持於培養器材表面，透過移液器等，使細胞層片容易剝離的方式來構成。因此，它並未假設在培養期間，亦即施加刺激前，細胞因培養基交換等之際的機械刺激而剝離，其目的並非防止在細胞培養期間細胞剝離導致無法回收成細胞層片。

專利文獻3所記載的培養器具是透過施加刺激，使一部分區域的細胞剝離成層片狀，自內面觀察之用。因此，它假設作為觀察細胞表面之側的細胞黏著區域保持堅固地黏著於培養器材。因此，並未考慮到在培養途中因機械刺激而導致的細胞剝離。

專利文獻4所記載的細胞層片的製作方法是在隣接於刺激反應性區域的位置形成無刺激反應性區域，而在該些區域表面培養細胞，使細胞層片剝離之際，將兩區域表面的細胞自各基材彼此切開而分離的方法。有記載藉此不必使用載體（回收用支持體）即可輸送細胞。有揭示由於自各基材切斷來製造細胞層片，較佳態樣是在薄膜狀、板狀等細胞黏著性基材表面的一部分形成功能性區域，在細胞培養容器底面以黏著劑來固定使用。由於需要切開而分離，在培養容器底面直接形成含有刺激反應性聚合物的區域的態樣並不現實。

課題是提供如實施形態所示，在培養基交換等作業中，具備在機械刺激下細胞難以剝離的細胞剝離抑制區域，可回收成細胞層片的培養器材。此外，在開發本實施形態的培養器材之際，透過具備細胞剝離抑制區域，可防止細胞在培養期間自培養器材剝離，但另一方面，顯然亦產生不容易進行細胞層片的回收的問題。為了解決此事，將使細胞保持層片狀剝離之際所使用的回收用支持體素材作加工。本發明的課題是提供可防止細胞層片剝離，同時，亦容易進行細胞層片的回收的細胞層片製造用套組。

又，用於再生醫療的基礎研究或藥物開發研究之際，尋求以各種方法來分析在相同條件下培養的細胞。例如，將細胞層片移植於動物模型，將在相同條件下培養的細胞層片的基因表現透過PCR或西方墨點法來分析，以顯微鏡來進行細胞形態的觀察。用於再生醫療的細胞並非通常細胞株，而是來自患者皮膚或黏膜等組織的細胞，故各培養器材所得的細胞性質可能未必相同。因此，存疑的情形是產生的變化是因細胞變異所致，還是因藥劑等的處理而導致的變化。在本實施形態中，課題是提供可自1個培養器材回收複數培養層片的細胞層片製造用套組、培養器材。透過分析以相同培養器材來培養的細胞，可使培養條件全部相同，可更精密地分析變化。 [解決課題的手段]

本發明包含下列細胞層片製造用細胞培養器材、細胞層片製造用套組、及細胞層片製造方法。 （1）一種細胞培養器材，其特徵在於：將無論有無刺激，與刺激反應區域相比具有強細胞黏著力而用於抑制細胞剝離的細胞剝離抑制區域設置於細胞培養面的周圍延綿一整圈，在前述細胞剝離抑制區域的內側配置根據外部刺激而針對細胞的黏著性會變化的刺激反應區域，即使在不施加刺激於前述刺激反應區域的狀態下，前述細胞剝離抑制區域相對於前述刺激反應區域具有3倍以上15倍以下的強細胞黏著性。 （2）如（1）所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞培養器材的容器形狀為培養皿、培養瓶、或多孔盤，在前述細胞培養器材的細胞培養表面直接設置刺激反應區域及細胞剝離抑制區域。 （3）如（1）或（2）所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞培養器材使用回收用支持體，並用於進行細胞層片的回收。 （4）如（1）～（3）任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞培養器材的前述細胞培養表面為3.5 cm ²以上300 cm ²以下。 （5）如（1）～（4）任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域在1℃以上50℃以下的溫度範圍中為細胞黏著性表面。 （6）如（5）所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞黏著性表面為對於外部刺激無反應的培養表面。 （7）如（1）～（6）任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述外部刺激為光、溫度、pH、或磁場。 （8）如（1）～（7）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述刺激反應區域為對於溫度所導致的刺激有反應的溫度反應性表面，且為在0℃以上32℃以下的溫度下細胞會剝離的表面。 （9）如（1）～（8）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞剝離抑制區域及刺激反應區域是在同一平面上作區分。 （10）如（1）～（9）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞剝離抑制區域為寬度2 mm以上10 mm以下。 （11）如（1）～（10）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞剝離抑制區域除了設置於細胞培養面的周圍之外，更設置成分割細胞培養面。 （12）如（1）～（11）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞剝離抑制區域及前述刺激反應區域是加工成透過目視即可區別。 （13）如（1）～（12）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：前述細胞剝離抑制區域及前述刺激反應區域具有透光性。 （14）如（1）～（13）任一項所記載的細胞培養器材，其特徵在於：是用於製造上皮細胞、間葉系幹細胞、或成肌細胞的細胞層片。 （15）如（1）～（14）任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述刺激反應區域及前述細胞剝離抑制區域是透過將溫度反應性單體被覆於前述細胞培養表面，將電子束、γ線、或紫外線只照射於前述刺激反應區域來形成刺激反應性層而製造。 （16）一種細胞層片製造用套組，具備：如（1）～（15）任一項所記載的細胞培養器材及用於細胞層片回收的回收用支持體。 （17）如（16）所記載的細胞層片製造用套組，其特徵在於：前述回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下、基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下的紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜。 （18）如（16）或（17）所記載的細胞層片製造用套組，其特徵在於：前述回收用支持體的直徑或垂直與水平的長度小於前述刺激反應區域。 （19）一種細胞層片的製造方法，其特徵在於：細胞層片的製造方法包含：以（1）～（15）任一項所記載的細胞培養器材來培養細胞以形成細胞層片的步驟，及以回收用支持體來回收細胞層片的步驟，前述回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下、基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下的紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜。 （20）一種細胞層片的製造方法，包含下列步驟：使用如（16）～（18）任一項所記載的細胞層片製造用套組，培養細胞以形成細胞層片，回收細胞層片。 （21）一種治療方法，其特徵在於：其為使用細胞層片的治療方法，使用（1）～（15）任一項所記載的細胞培養器材，培養細胞，以回收用支持體來回收成細胞層片，前述回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下、基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下的紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜，將附著有回收用支持體的細胞層片置於清潔後的患部，將回收用支持體剝離，以進行治療。 （22）一種治療方法，其特徵在於：使用（16）～（18）任一項所記載的細胞層片製造用套組的細胞培養器材來培養細胞，以回收用支持體來回收成細胞層片，將附著有回收用支持體的細胞層片置於清潔後的患部，將回收用支持體剝離，以進行治療。 （23）如（21）或（22）所記載的治療方法，其中，前述治療的對象為大範圍燒傷、白斑、潰瘍、褥瘡、肺氣漏、退化性關節炎、食道狹窄、大腸小腸狹窄、子宮內膜異位症、骨質疏鬆症、腎纖維化、肝纖維化、或缺血性心臟病。

如下所示的細胞培養器材直到細胞層片回收時，細胞都不會剝離，可簡便回收細胞層片，故可高效率製造用於再生醫療等治療的細胞層片。又，可適合當成再生醫療的研究開發或藥物開發研究所適用的細胞培養器材來使用。

細胞層片製造用套組所含有的細胞培養器材使用各種形狀皆可，可考慮所需的細胞層片的大小、形狀，適當作選擇。細胞培養器材凡是一般用於細胞培養者，各種形狀皆可，例如，培養皿、培養瓶、多孔盤等，但較佳是通常用於培養黏著細胞的容器形狀。在使用培養瓶的情形下，若是剝離型培養瓶或頂部可拆卸的培養瓶，由於可取下培養瓶頂部，亦可容易進行使用回收用支持體的細胞層片的回收。

配合如下列圖式所示來說明，但不限於下列實施形態。首先說明作為細胞層片製造用套組的構成要素的細胞培養器材。

［實施形態1］ 本發明的細胞培養器材的一實施形態為：培養器材的內緣具備細胞剝離抑制區域1，其內側具備刺激反應區域2的細胞培養器材。圖1為細胞培養器材的培養表面的示意圖。刺激反應區域2與細胞剝離抑制區域1隣接，故存在作為邊界部分的黏著／剝離邊界3。如圖1所示的細胞培養器材的培養表面示例為長方形及圓形，但亦可為正方形等各種形狀，又，根據大小及移植細胞層片的地方，可適當選定最佳大小。

細胞培養器材的中央配置有刺激反應區域2，其外緣配置有細胞剝離抑制區域1，而細胞剝離抑制區域1延綿刺激反應區域2一整圈，直接設置於細胞培養表面。培養基交換是自沿著培養器材邊緣的部分吸取來添加培養基。因此，若培養表面的外緣部的細胞黏著性很高，培養基交換之際的機械刺激難以引起細胞剝離。又，沿著培養器材的內緣全區設置細胞剝離抑制區域很重要。細胞剝離抑制區域設置成延綿一整圈，故培養基的吸取、添加在各種位置進行皆可防止細胞剝離。透過延綿一整圈存在的細胞剝離抑制區域1，細胞緊緊黏著於培養器材表面，可避免培養基交換時的機械刺激所導致的剝離。

細胞剝離抑制區域1為無論有無刺激，具體而言在1℃以上50℃以下的溫度範圍中抑制細胞剝離的表面所構成的區域。細胞剝離抑制區域較佳富有細胞黏著性，但細胞黏著性的程度是設定成在培養基的吸取、添加等機械刺激時，可確保細胞黏著性。又，較佳是針對細胞的黏著性高於不施加刺激的狀態的刺激反應區域的細胞黏著性。

例如，用於如下所示的實施形態的培養器材是加工成在將小鼠成神經細胞瘤細胞株Neuro2a以5×10 ³細胞／cm ²～1×10 ⁵細胞／cm ²來播種，使用含有10％ FBS或FCS的DMEM培養基來培養的情形下，在培養1小時後，細胞黏著伸展率在刺激反應區域為培養表面的5～20％，在細胞剝離抑制區域為其60～75％，在細胞剝離抑制區域具有更強細胞黏著伸展率。亦即，細胞剝離抑制區域即使在不施加刺激於刺激反應區域的狀態下，在將細胞黏著伸展率作為指標的情形下，相對於刺激反應區域具有3倍以上15倍以下的強細胞黏著性。這是因為雖然取決於培養器材的大小，但在將細胞黏著伸展率作為指標的情形下，若在細胞剝離抑制區域無3倍以上的黏著性，則細胞在培養中可能剝離。又，這是因為在超過15倍的強黏著性表面的情形下，在回收成細胞層片的情形下，無法將細胞層片邊緣剝離，細胞層片可能破損。細胞剝離抑制區域若相對於刺激反應區域為5倍以上的細胞黏著性，則即使在使用培養面積相對大的培養器材的情形下，亦可抑制培養中的細胞剝離。又，細胞剝離抑制區域若相對於刺激反應區域為9倍以下的黏著性表面，則即使在黏著性強的細胞或培養面積小的情形下，亦可以細胞層片不會破損的方式來回收。已知細胞黏著性亦根據細胞種類、培養期間、使用的培養基等、培養條件而不同，故可根據細胞黏著性的指標、培養器材的培養面的大小等來判斷，準備具有適合的細胞黏著性的細胞剝離抑制區域。

細胞剝離抑制區域可為提升細胞黏著性或增殖性的表面。因此，亦可由一般作為培養器材來使用的玻璃、進行表面處理的塑膠所構成。塑膠例如包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯等。又，表面處理可使用電暈放電處理、電漿處理、UV臭氧處理、電子束照射處理、雷射處理等通常使用於塑膠改質的方法。

又，為了更積極防止細胞剝離，亦可將在物理化學上提高細胞黏著性的物質，例如，親水化聚苯乙烯、聚賴氨酸等鹼性高分子、氨丙基三乙氧基矽烷、N-(2-氨乙基)-3-胺丙基三甲氧基矽烷等鹼性化合物或含有其等的縮聚物塗布於表面。又，亦可塗布根據生物化學特性而提高細胞黏著性的物質，例如，纖維蛋白、纖連蛋白、板素、肌腱蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白、去端胶原蛋白、明膠、含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列的肽、含有YIGSR（酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸）序列的肽及其等的混合物。

刺激反應區域2為細胞黏著性會根據刺激而變化的區域即可，較佳可使用上限或下限臨界溶解溫度為0～80℃的溫度反應性聚合物。溫度反應性聚合物較佳是：在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下的溫度下，對於周圍的水的親和性高，因聚合物吸水膨張而呈現細胞非黏著性，而在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上的溫度下，因水自聚合物脫離而呈現細胞黏著性。特別是，上限臨界溶解溫度較佳是通常培養細胞的溫度，即37℃以上，下限臨界溶解溫度（T）較佳是通常培養細胞的溫度，即37℃以下。具體而言，較佳是在0℃以上32℃以下的溫度範圍內，培養器材表面呈現細胞非黏著性的聚合物。

這種溫度反應性聚合物例如包括丙烯酸系聚合物或甲基丙烯酸系聚合物，更具體而言包括聚-N-異丙基丙烯醯胺（T＝32℃）、聚-N-正丙基丙烯醯胺（T＝21℃）、聚-N-正丙基甲基丙烯醯胺（T＝32℃）、聚-N-乙氧基乙基丙烯醯胺（T＝約35℃）、聚-N-四氫糠基丙烯醯胺（T＝約28℃）、聚-N-四氫糠基甲基丙烯醯胺（T＝約35℃）、聚-N,N-二乙基丙烯醯胺（T＝32℃）等。

用於形成該些聚合物的單體為透過γ線等放射線或電子束、紫外線照射等來聚合得到的單體，例如，(甲基)丙烯醯胺化合物、N-烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、N,N-二烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、具有環狀基的(甲基)丙烯醯胺衍生物、乙烯醚衍生物等，可單獨或混合2種以上來使用。

將上述聚合性單體被覆於細胞培養容器，透過照射電子束或放射線，單體聚合成聚合物層，形成刺激反應區域。細胞剝離抑制區域的形成有在培養面積整面形成刺激反應區域而去除刺激反應性層的方法、及細胞剝離抑制區域是透過遮蔽電子束等不會產生聚合來部分形成刺激反應性層的方法。在此，遮蔽欲形成細胞剝離抑制區域的部分，使聚合物不會形成。在去除刺激反應區域，形成細胞剝離抑制區域的情形下，不只需要把握形成聚合物的層的厚度並完全去除，還需要管理將去除的聚合物自培養表面去除等。若使用在細胞剝離抑制區域遮蔽電子束等的方法，則不需要去除刺激反應性層，可透過非常簡單的工程來形成細胞剝離抑制區域及刺激反應區域。

細胞剝離抑制區域1的寬度較佳是2 mm以上10 mm以下。培養基的吸取、添加所導致的機械刺激，無關於培養器材等的大小，會自培養器材的壁部達一定寬度的區域。細胞剝離抑制區域若寬度窄於2 mm，則無法得到充分的細胞黏著力，細胞層片可能剝離。因此，若細胞剝離抑制區域很窄，則無法防止細胞剝離。又，若寬度很寬，則可得到穩定的黏著力，但可回收的細胞面積卻減少。又，若寬度很寬，則細胞會無法自培養器材剝離，難以自培養器材上回收。因此，在充分確保穩定黏著力的同時，檢討細胞層片的回收效率的結果顯示，細胞剝離抑制區域的寬度較佳是2 mm以上10 mm以下，更佳是4 mm以上8 mm以下。如上所述，細胞剝離抑制區域的細胞黏著力可在細胞培養溫度下，與刺激反應區域相比有強細胞黏著力，但無論有無使細胞剝離的刺激，需要具備相同黏著力。

如上所述，在使用培養面積很廣的細胞培養器材的情形下，在培養基交換之際容易剝離。實際上，使用綿羊角質形成細胞的初代培養細胞，檢討根據培養面積，剝離難易度是否會不同。使用只有刺激反應區域的細胞培養器材、或在刺激反應區域的周圍5 mm的寬度處具有細胞剝離抑制區域的細胞培養器材來進行檢討。在使用任何一個培養容器的情形下，皆根據面積來調整細胞播種數，以在第4日、第7日作培養基交換、在第10日細胞層片回收的排程來作檢討。於細胞培養開始後，在第7日，在任何一個培養容器者皆為半匯合、在第10日細胞增殖直到匯合狀態為止。任何一個培養盤的材質皆為聚苯乙烯，被覆溫度反應性聚合物，在相同溫度反應性表面進行加工，以形成刺激反應區域。

[表1]

培養器材	12孔盤	Φ3.5 cm盤	Φ10 cm盤	單孔盤
培養面積(cm 2)	3.5	8.8	56.7	84
只具備刺激反應性區域的細胞培養器材	△	✕	✕	✕
第7日，12孔中有3孔剝離	第7日，培養基交換中剝離N=3	第7日，培養基交換中剝離	第7日，培養基交換中剝離N=3
具備細胞剝離抑制區域及刺激反應性區域的細胞培養器材	-	○	-	○
-	培養期間無剝離，第10日細胞層片回收N=3	-	培養期間無剝離，第10日細胞層片回收N=3

如表1所示，可確認即使培養面積為3.5 cm ²，在無細胞剝離抑制區域的培養容器中細胞剝離在12孔中有3孔的高發生頻率。此外，在培養面積大於8.8 cm ²的情形下，第7日的培養基交換中，細胞會剝離，無法以細胞層片來回收。在具備細胞剝離抑制區域及刺激反應區域的細胞培養器材的情形下，即使是8.8 cm ²的培養容器，細胞可毫無問題地回收，故雖然未進行培養面積3.5 cm ²的確認，仍然可毫無問題地以細胞層片來回收。又，在此，雖然使用的是培養面積84 cm ²的培養盤來進行比較檢討，但可確認即使培養面積為225 cm ²，亦可將細胞層片毫無問題地回收。上述結果顯示比起刺激反應區域具有更強細胞黏著性的細胞剝離抑制區域是必要的。

又，細胞剝離抑制區域及刺激反應區域是配置於同一平面上。這是因為考慮到若細胞剝離抑制區域、刺激反應區域有凹凸，則在回收成細胞層片而在臨床上以細胞層片來適用於患部的情形下，會產生不密合的部分，植入性會劣化。

透過培養各種細胞而得到的細胞層片可移植於患部來進行治療。例如，可使用表皮細胞層片用於大範圍燒傷、白斑、潰瘍、褥瘡，軟骨層片用於退化性關節炎的治療，間葉系幹細胞層片用於失智症等腦疾病、乳房重建、退化性關節炎、剝脫性骨軟骨炎、缺血性心臟病的治療，成纖維細胞層片用於肺氣漏的治療，口腔黏膜上皮細胞層片用於食道狹窄、大腸小腸狹窄、子宮內膜異位症的治療，成骨細胞層片用於骨質疏鬆症的治療，腎細胞層片用於腎纖維化，肝細胞層片用於肝纖維化的治療，成肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞層片用於缺血性心臟病的治療。值得注意的是，可以細胞層片來使用的細胞不限於上述，又，適用的疾病凡是認為可透過細胞移植來改善的疾患，各種疾患皆可使用。使用的細胞為自己（自體）或同種（異體）細胞皆可。細胞種類例如可含有皮膚角化細胞（Keratinocyte）、色素細胞（Melanocytes）、皮膚線維芽細胞（Fibroblast）、皮脂腺細胞（Sebocyte）、顆粒細胞、有棘細胞、基底細胞、蘭格漢氏細胞、默克爾細胞等。又，亦可使用含有人工多能幹細胞、胚胎幹細胞、或成體幹細胞的幹細胞來分化誘導。在自患者採取皮膚來培養細胞的情形下，需要約3週的培養期間，故若是分化誘導人工多能幹細胞等的株，可立即應付，對於治療重症燒傷患者很有用。

使用細胞層片的治療，例如可如下進行。使用細胞層片的治療有很多實績的是針對燒傷、白癜風、潰瘍、褥瘡使用來自上皮組織的細胞層片的治療法。使用細胞層片的治療是使用將來自上皮組織，例如口腔黏膜組織或皮膚組織的細胞自組織分離而得到的各個細胞及含有2種類以上的細胞群體來進行治療。

首先，自患者或他人的組織片採取細胞，加以培養。培養的細胞是以具有刺激反應區域、細胞剝離抑制區域的細胞培養器材來培養，以進行細胞層片製作的準備。細胞準備好後，去除患部表皮及感染、壞死組織，進行作為清潔傷口的外科處理的清創。培養到匯合為止的細胞是使用回收用支持體來回收成的細胞層片。細胞層片保持附著有回收用支持體，將細胞層片側置於患部。因此，是將細胞層片的黏著於細胞培養器材之面，亦即，相對於立基點為黏著性高之面，直接覆蓋患部。在數分～10分後，只將支持體緩慢移除，並只將細胞層片植入患部。在患部已移除至真皮的情形下，重疊於已移植人工真皮的部分來移植。又，與植皮片的貼片植皮相同，亦可利用凝血酶液、纖維蛋白原來固定植入。

過去並無為了防止細胞在細胞培養中剝離而在刺激反應區域周圍設置具備指定細胞黏著性及寬度的細胞剝離抑制區域的培養器材。為了移植，需要將細胞培養到匯合為止，但透過設置細胞剝離抑制區域，細胞可以在細胞培養期間無剝離地培養。

［實施形態2］ 接著，說明細分一個培養表面的培養器材。圖2的示意圖顯示培養表面細分化的培養器材的培養表面。在此顯示透過細胞剝離抑制區域11將培養器材的培養表面四分割（圖2左）或八分割（圖2右）的例子。雖然在此顯示細分長方形培養器材的例子，但即使是正方形、圓形等各種形狀的培養器材同樣亦可根據細胞剝離抑制區域11來細分。又，根據用途，除了等分地分割之外，分割區域亦可大小不同。在此形態中，細胞剝離抑制區域11沿著刺激反應區域12的外緣，且亦存在於培養表面內部。黏著／剝離邊界13是作為以細胞剝離抑制區域11來細分化的各刺激反應區域12的外緣而存在。

在培養表面細分化的培養器材的情形下，細胞剝離抑制區域11的寬度亦設定為2 mm以上10 mm以下，較佳是4 mm以上8 mm以下。在使用具備細分的區塊的培養器材的情形下，如上所述，不只各區塊可進行不同分析，各區塊亦可回收成細胞層片，適用於不同患部。此外，細胞剝離抑制區域不只存在於刺激反應區域的外緣，亦存在於內部，故可更強抑制細胞剝離。

本實施形態的培養器材的表面已透過細胞剝離抑制區域來細分割，故可以不同分析方法來分析在相同培養條件下培養的細胞。透過使用以相同培養器材來培養的細胞，可得到更正確的分析結果。又，根據本實施形態，以一個培養器材來培養的細胞層片可適用於複數患部。

［實施形態3］ 接著，說明含有回收培養器材21及細胞層片的回收用支持體22的細胞層片製造用套組23（圖3（A））。為了將培養的細胞保持層片狀回收，較佳使用回收用支持體22。透過將細胞附著於回收用支持體22，可容易以鑷子等來把持。

進行細胞層片的回收如下。細胞達成匯合後，吸取去除培養基。吸取培養基後，為了防止操作中的細胞乾燥，添加少量培養基。培養基的量可約5 μl／cm ²至30 μl／cm ²的量。接著，在細胞上載置回收用支持體22。回收用支持體22為小於刺激反應區域一圈的大小。例如，在長方形或正方形形狀的培養器材的情形下，刺激反應區域的垂直、水平長度可分別縮短約1 mm至5 mm。在圓形的情形下，直徑同樣可準備成縮短約1 mm至5 mm。

例如，在刺激反應區域為溫度反應性，下限臨界溶解溫度為32℃的情形下，在32℃以下的溫度，較佳是0℃～30℃下靜置約5～60分。靜置後，若以鑷子等來把持回收用支持體並提起，則細胞保持層片狀附著於回收用支持體，自細胞培養器材剝離。值得注意的是，在相對於細胞剝離抑制區域為黏著性高的細胞的情形下，在回收用支持體的周圍可透過鑷子等來剝離。附著於回收用支持體的細胞層片可直接載置於欲移植的部位。附著於回收用支持體之面的相反側之面，亦即暴露之面為黏著於培養器材表面之面。亦即，是附著於立基點之面，可將此面密合於需要移植之面。

又，回收用支持體22取決於其大小，較佳載置於形成刺激反應區域及細胞剝離抑制區域的黏著／剝離邊界24的內側1～2 mm處（圖3（C））。這是因為細胞剝離抑制區域的細胞不會因刺激而剝離，故須擔心細胞堅固地黏著於器材表面的情形導致細胞層片破裂。回收用支持體是準備成小於刺激反應區域一圈的大小，但將回收用支持體載置於黏著／剝離邊界的內側是非常困難的。特別是，在培養表面大的情形下，垂直及水平皆載置於內側需要細緻的技巧。

如圖3（B）及3（C）所示，透過設置可由目視來確認符合細胞剝離抑制區域的區域的邊界顯示標記25，可識別黏著／剝離邊界24。刺激反應區域及細胞剝離抑制區域的器材表面為無光學變化的表面，故不知道黏著／剝離邊界在哪裡。然而，透過邊界顯示標記25，可視覺確認須載置回收用支持體22的地方，故可確實將回收用支持體載置於黏著／剝離邊界24的內側。

邊界顯示標記25可在符合細胞剝離抑制區域或黏著／剝離邊界之處的培養器材表面或底面作冷加工或施加淺色彩。若有透光性加工，則在顯微鏡下觀察細胞增殖或形態的情形下，不會發生不良狀況。又，細胞增殖等可在刺激反應區域作確認，即使在細胞剝離抑制區域作加工或施加色彩，在進行培養上完全不會產生問題。只要加工是不會影響到細胞黏著的加工，加工面是細胞黏著面或是容器外側皆可。

［回收用支持體的檢討］ 細胞層片的回收是纖細的作業，故容易進行操作的回收用支持體很重要。回收用支持體22的紙可使用纖維素薄膜、塑膠薄膜等習知素材。由於針對細胞的黏著性佳，較佳使用紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜。然而，較佳是即使浸入培養液亦不會破損，或細緻的作業所需的有柔軟性而容易處理的素材。使用不同厚度、基重的回收用支持體，進行製作的細胞層片的轉移，來檢討回收用支持體的最佳範圍。

在下列條件下製作細胞層片。來自人類脂肪組織的間葉系幹細胞（human Adipose-derived Stem Cell，hADSC）及培養基自LONZA公司購得。細胞是使用來自人類脂肪的幹細胞專用培養基（ADSC-BulletKit ^TM）預先繼代培養2次後凍結保存者。將凍結保存的hADSC融解後，將細胞懸濁於加入抗壞血酸衍生物及FGF-2的來自人類脂肪的幹細胞專用培養基（ADSC-BulletKit ^TM），調製1.5×10 ⁵cells／mL的細胞懸濁液。將調製的細胞懸濁液2 mL播種於具備細胞剝離抑制區域的溫度反應性培養器材直徑3.5 cm的dish上，在37℃下培養5日。於培養期間，在第4日交換培養基1次。在第5日達到匯合狀態。使用下列厚度、基重的支持體來進行檢討。

[表2]

	厚度（μm）	基重（g／m 2）
實施例1	40	32
實施例2	240	240
比較例1	630	435

確認將hADSC細胞培養成匯合狀態後，吸取去除培養基。接著，將與培養器材的培養面為相同圓形狀的實施例1、2、及比較例1的回收用支持體預先以培養基來潤濕，置於匯合狀態的細胞上。在20℃下靜置10分鐘後，將回收用支持體的一端以鑷子來摘取1處，使回收用支持體彎曲，同時緩慢向上拉起。在實施例1及2的使用回收用支持體的情形下，可回收吸附於回收用支持體的細胞層片。此外，細胞層片轉移後，可只移除回收用支持體。反之，在比較例1的使用回收用支持體的情形下，將回收用支持體的一端以鑷子來摘取1處，試圖回收細胞層片，但回收用支持體難以捲起，故在直接拉起時，細胞層片是在一部分斷掉的狀態下回收。基於該些結果，得到結論是回收用支持體的上限為厚度400 μm以下、基重350 g／m ²以下。又，在檢討回收用支持體的下限時，若是基重未滿10 g／m ²的紙，將潤濕狀態的紙以鑷子來夾起，則一端會斷掉，非常難以處理。由於基重及厚度為關聯數值，可考慮回收用支持體的下限是厚度30 μm、基重10 g／m ²，得到結論是較佳使用其等以上的厚度、基重。

基於上述結果，回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下，此外，較佳是厚度30 μm以上300 μm以下。又，基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下，此外，較佳是20 g／m ²以上250 g／m ²以下。若是此範圍的厚度、秤量，容易以鑷子來把持，容易進行細緻的操作。又，素材的性質較佳是容易彎曲、柔軟。如上所述，素材較佳是紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜，具體的素材較佳可使用水合處理過的PTFE（聚四氟乙烯）、PGA（聚乙醇酸）樹脂薄膜、PLA（聚乳酸）樹脂薄膜、PLGA（聚乳酸、乙醇酸共聚合體）樹脂薄膜、硫酸紙、纖維素薄膜、滅菌紙。

本實施形態的細胞層片製造用套組可防止細胞在細胞培養期間剝離，同時，在回收細胞層片之際可容易回收。具備培養器材及回收支持體的細胞層片製造用套組是過去沒有的構造。透過使用細胞層片製造用套組，可將製造的細胞層片保持層片狀簡單固持。因此，過去細胞層片處理需要某程度訓練，但如今初學者亦可處理。

1、11:細胞剝離抑制區域 2、12:刺激反應區域 3、13、24:黏著/剝離邊界 21:培養器材 22:回收用支持體 23:細胞層片製造用套組 25:邊界顯示標記

圖1為一實施形態的細胞培養器材的培養表面的刺激反應區域及細胞剝離抑制區域的例子的示意圖。 圖2為其他實施形態的細胞培養器材的培養表面的刺激反應區域及細胞剝離抑制區域的例子的示意圖。 圖3為包含細胞培養器材、回收用支持體的細胞培養製造用套組的例子的示意圖。（A）顯示培養器材的斜視圖（左）、回收用支持體的平面圖（右）。（B）為取下蓋子的培養器材的平面圖，（C）顯示將回收用支持體載置於培養器材的情形。

1:細胞剝離抑制區域

2:刺激反應區域

3:黏著/剝離邊界

Claims (20)

1. 一種細胞培養器材，其特徵在於， 將無論有無刺激，與刺激反應區域相比具有強細胞黏著力而用於抑制細胞剝離的細胞剝離抑制區域設置於細胞培養面的周圍延綿一整圈， 在前述細胞剝離抑制區域的內側配置根據外部刺激而針對細胞的黏著性會變化的刺激反應區域， 即使在不施加刺激於前述刺激反應區域的狀態下，前述細胞剝離抑制區域相對於前述刺激反應區域具有3倍以上15倍以下的強細胞黏著性。
2. 如請求項1所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞培養器材的容器形狀為培養皿、培養瓶、或多孔盤，在前述細胞培養器材的細胞培養表面直接設置刺激反應區域及細胞剝離抑制區域。
3. 如請求項1或2所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞培養器材使用回收用支持體並用於進行細胞層片的回收。
4. 如請求項1至3任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞培養器材的前述細胞培養表面為3.5 cm ²以上300 cm ²以下。
5. 如請求項1至4任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域在1℃以上50℃以下的溫度範圍中為細胞黏著性表面。
6. 如請求項5所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞黏著性表面為對於外部刺激無反應的培養表面。
7. 如請求項1至6任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述外部刺激為光、溫度、pH、或磁場。
8. 如請求項1至7任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述刺激反應區域為對於溫度所導致的刺激有反應的溫度反應性表面，且為在0℃以上32℃以下的溫度下細胞會剝離的表面。
9. 如請求項1至8任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域及刺激反應區域是在同一平面上作區分。
10. 如請求項1至9任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域的為寬度2 mm以上10 mm以下。
11. 如請求項1至10任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域除了設置於細胞培養面的周圍之外，更設置成分割細胞培養面。
12. 如請求項1至11任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域及前述刺激反應區域是加工成透過目視即可區別。
13. 如請求項1至12任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述細胞剝離抑制區域及前述刺激反應區域具有透光性。
14. 如請求項1至13任一項所記載的細胞培養器材，是用於製造上皮細胞、間葉系幹細胞、或成肌細胞的細胞層片。
15. 如請求項1至14任一項所記載的細胞培養器材，其中，前述刺激反應區域及前述細胞剝離抑制區域是透過將溫度反應性單體被覆於前述細胞培養表面，將電子束、γ線、或紫外線只照射於前述刺激反應區域來形成刺激反應性層而製造。
16. 一種細胞層片製造用套組，具備： 如請求項1至15任一項所記載的細胞培養器材，及 用於細胞層片回收的回收用支持體。
17. 如請求項16所記載的細胞層片製造用套組，其中，前述回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下、基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下的紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜。
18. 如請求項16或17所記載的細胞層片製造用套組，其中，前述回收用支持體的直徑或垂直與水平的長度小於前述刺激反應區域。
19. 一種細胞層片的製造方法，其特徵在於： 細胞層片的製造方法包含：以如請求項1至15任一項所記載的細胞培養器材來培養細胞以形成細胞層片的步驟，及以回收用支持體來回收細胞層片的步驟， 前述回收用支持體為厚度30 μm以上400 μm以下、基重10 g／m ²以上350 g／m ²以下的紙、纖維素薄膜、或塑膠薄膜。
20. 一種細胞層片的製造方法，包含下列步驟： 使用如請求項16～18任一項所記載的細胞層片製造用套組， 培養細胞以形成細胞層片， 回收細胞層片。

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