JP6616559B2 - シート状細胞培養物の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、シート状細胞培養物の製造方法、および該製造方法によって製造されたシート状細胞培養物に関する。

近年、事故や病気によって失われた身体の細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的して、種々の細胞（iPS細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、体細胞など）を用いた再生医療が注目を集めている。
障害を受けた組織及び器官に所望の細胞を適応する方法として、細胞を細胞懸濁液の状態にして直接注入する方法が挙げられる。しかし、当該方法では、移植細胞の組織からの流出、レシピエント組織への穿刺による障害、広範囲な組織修復が困難であるといった問題のため、期待する治療効果を実現することができていない。
これらの欠点を解決する方法として、所望の細胞をシート状に培養したシート状細胞培養物（細胞シートとも称される）の開発が進められている。シート状細胞培養物は、所望の細胞を大量に損傷部位に定着させることができることに加え、レシピエント組織の特性に合わせて、適度に組織化させた細胞集団を移植することのできる、大変有用な治療手段である。

シート状細胞培養物は、所望の細胞を培養基材の表面上で培養を行い、細胞による層構造を形成させて得られるシート状の培養物を、その構造を壊さないように培養基材から剥離することによって製造される。一般に、細胞培養物によるシート状構造を形成させるために、細胞を基材に接着させる機能を有する成分を被覆した培養基材の表面上で細胞培養が行われる。このような成分としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、カドヘリン、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、インテグリン、ポリＬリジン、ヒアルロン酸、多血小板血漿、ポリビニルアルコール、特定の抗原を認識する抗体等が報告されている（特許文献１〜特許文献６）。また、細胞接着性を有する成分を複数含むものとして、血清（異種血清、同種血清若しくは自己血清など）も使用されている（特許文献７）。

従来、培養基材の培養表面に対する細胞の接着性を向上させるために血清を使用する場合、該表面上に万編無く血清を添加し、被覆する方法が行われていた。このような方法を行うと、使用する培養基材の全ての培養表面を血清で被覆することが必要となる。また、通常、シート状細胞培養物を患者の損傷部位に移植する際には、拒絶反応などを回避するため、その患者由来の血清（自己血清）を使用することから、患者に対する負担も大きい。
以上のように、自己血清を使用したシート状細胞培養物を調製する方法は、拒絶反応等の回避には非常に有効である一方で、大量の自己血清を必要である点に問題が存在していた。

特開２０１２−１０５５８７ 特開２０１１−２２４３９８ 特開２００９−１７８０５０ 特開２００９−５６３９ 特開２００６−２３８８４１ 特開平３−８７１７４ 特開２０１１−１１０３６８

本発明は、シート状細胞培養物を安定的に製造する方法を提供する。特に、培養基材の培養表面を被覆する血清の量を可能な限り少なくし、かつ、安定的にシート状細胞培養物を製造することを目的とする。

発明者らは、シート状細胞培養物の製造方法につき鋭意研究を行った結果、血清など、細胞を培養基材に接着させる成分（細胞接着成分と記載する）を１又は２以上含む物質と細胞を混合し、懸濁した後に、細胞を播種すると、従来使用されていた量よりも少ない量の細胞接着性成分を含む物質（血清など）の使用であっても、シート状細胞培養物を製造することができることを見出し、本発明を完成させた。

従って、本発明は以下の（１）〜（５）である。
（１）細胞接着成分を含む物質と細胞を混合して懸濁し、該懸濁した細胞を播種する工程を含む、該細胞のシート状細胞培養物を製造する方法。
（２）前記細胞接着成分を含む物質が血清であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）細胞接着成分を含む物質と細胞を混合し懸濁した後、該懸濁物を静置することを含む上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）懸濁した細胞を播種する前に該細胞を洗浄することを含む上記（１）又は（２）に記載の方法。
（５）細胞が骨格筋芽細胞であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法により製造されたシート状細胞培養物。

本発明によれば、少量の細胞接着成分を含む物質、例えば、少量の血清を使用することで、シート状細胞培養物を製造することができる。
従って、シート状細胞培養物を製造するにあたりコストを削減することができ、また、細胞由来以外の成分（血清成分など）の残留量の極めて少ない、安全性の高いシート状細胞培養物を提供することが可能となる。更に、シート状細胞培養物の培養に自己血清を使用する場合には、血清採取にかかる患者への負担を軽減することができる。

図１は、本発明のシート状細胞培養物の製造方法により形成された細胞層の顕微鏡写真である。

本発明は、細胞接着成分を含む物質と細胞を混合して懸濁した後、該細胞を播種する工程を含む点に特徴を有する。
細胞は、適当な培養基材上に播種し、シート状の細胞培養物を形成するまで培養を行う。
ここで、「培養基材」とは細胞がその表面上でシート状細胞培養物を形成し得るものであればいかなるものであってもよく、少なくとも、細胞が接着し得るような平坦な部分を具備し、典型的には、細胞培養皿、細胞培養ボトル（又はフラスコ）であり、市販される培養用ディッシュなどが使用可能であり、材質も特に限定されない。培養基材の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
また、「培養基材」の培養表面は、温度変化等によってその物性が変化する材料（温度応答性材料）で作製されているか、あるいは、該温度応答性材料によって培養基材の培養表面が層状に被覆されていてもよい。ここで、「温度応答性材料」は、温度変化に依存して、細胞の基材表面への接着性を変化させる材料のことで、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体などを挙げることができる（特開２０００−２１２１４４などを参照のこと）。

本発明で使用できる「細胞接着成分を含む物質」とは、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノゲン、フィブリン、ビトロネクチンなど細胞の培養基材へ接着させる成分を１以上含む物質のことで、典型的には、血清を挙げることができる。血清は、当業者が通常行う方法によって生体から取得したもの、あるいは、市販品などを使用することができ、血清の調製方法などは特に限定されない。また、シート状細胞培養物の使用目的に応じて、異種血清又は同種血清（自己血清を含む）のいずれであっても使用することができる。「異種血清」は、シート状細胞培養物の移植を受ける者とは異なる種の生物に由来する血清を意味し、例えば、移植を受ける者がヒトの場合、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清などが挙げられる。

本発明において、細胞接着成分を含む物質と細胞を混合する場合、例えば、細胞接着成分を含む物質が血清であれば、血清１ｍＬに対して、混合する細胞の数は、細胞の種類にも依存するが、１．０×１０^９個以下が好ましい。そして、細胞接着成分を含む物質に細胞を懸濁した後、そのまま培養基材上に播種してもよいが、播種前に該懸濁物を一定時間静置してもよい。静置の条件は、特に限定されるものではなく、血清等に含まれる細胞接着成分が細胞表面に接着するために必要な条件であればよく、例えば、０℃〜４０℃、好ましくは、３７℃程度で、１〜２４時間程度、好ましくは、１．５時間程度である。静置している間、適当な時間（例えば、２０〜３０分）毎に細胞懸濁液をタッピング等して、混合することが望ましい。また、播種する前に適当な溶液で洗浄してもよい。洗浄するための溶液は、例えば、培養液、PBS、生理食塩水などを挙げることができる。

本発明のシート状細胞培養物を製造する方法は、いかなる動物種、組織由来の細胞であっても使用することができる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、上皮細胞（例えば、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞）、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、歯根膜細胞、皮膚細胞などが挙げられる。シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。
シート状細胞培養物を製造するために細胞を培養する過程は、各細胞に適した通常の培養方法によって行うことができる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
細胞が骨格筋芽細胞の場合、例えば、特開２０１１−１１０３６８に記載された方法を用いることができる。播種密度は、細胞が分化状態へ移行しない程度の密度が好ましく、３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２〜３．５×１０^６細胞／ｃｍ^２程度の範囲である。また、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、播種時の細胞数の、例えば、３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは、１００％程度である。

本発明のシート状細胞培養物の製造方法において使用される培地は、培養する細胞に適した培地を適宜選択して使用することができる。例えば、一般的に使用可能な培地として、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などを挙げることができる。これらの培地は市販のものを購入して使用してもよい。また、これらの培地は単独で用いても、また、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
さらに、培地に対し、必要に応じて適当な添加物を加えて使用してもよい。添加物としては、例えば、アミノ酸類（例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トリオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンなど）、ビタミン類（例えば、葉酸、リボフラビン、チアミンなど）、その他、Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウムなどを含んでもよい。また、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＡＮＫ’Ｓなどの緩衝剤（液）を適宜培地に加えてもよい。さらに、培養する細胞の特性に応じて、適宜、細胞成長因子などを添加してもよい。

細胞の培養は、当該技術分野において通常実施される条件等で行うことができる。培養温度は３０〜４０℃、好ましくは３６〜３８℃、ＣＯ_２濃度は０〜１０％、好ましくは４〜６％の条件を挙げることができるが、この条件は限定されるものではなく、培養する細胞の特性に応じて、適宜、培養温度、ＣＯ_２濃度を選択することができる。培養時間は、所望のシート状細胞培養物が形成されるために必要な時間であれば、特に限定されるものではなく、例えば、１０時間〜３０時間、１２時間〜２６時間程度の培養時間を例示することができる。

細胞の培養後、所望の形状、構造等を備えたシート状細胞培養物が形成されたのち、該シート状細胞培養物を細胞培養基材の培養表面から剥離し、シート状細胞培養物の回収を行う。シート状細胞培養物の培養表面からの剥離は、シート状の構造が破損されないような方法で実施することができる。具体的には、例えば、シート状細胞培養物を直接ピンセットなどによって摘み培養表面から剥離する、あるいはピペッティングにより細胞を培養表面との間を機械的に剥離する、あるいは、シート状の構造が破損されない限り、トリプシン、コラゲナーゼなどの酵素処理等を行ってもよく、細胞の性質に応じて適切な方法を選択することができる。あるいは、シート状細胞培養物の上面に細胞に親和性を有する基材（例えば、PVDF膜、ニトロセルロース膜、フィブリンゲル、コラーゲンゲルなど）を被せて、細胞を膜に写し取ることによって細胞を剥離、回収することもできる。
温度応答性材料（例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体など）で表面を被覆した細胞培養基材を使用した場合には、容器の温度を、例えば、０〜３０℃程度に下げたのちに、上記、細胞の剥離、回収を実施してもよい。

本発明には、本発明の方法によって製造されるシート状細胞培養物も含まれる。本発明で製造されたシート状細胞培養物は、細胞由来の物質以外の物質（例えば、血清成分など）の残留量が従来技術による培養物と比べて極めて少ない。このため、レシピエントの組織内で感染、アレルギー反応が起こる可能性が低く、安全性の高いシート状細胞培養物を提供することが可能である。

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。

ヒト骨格筋芽細胞を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（ライフテクノロジージャパン社製）で増殖させた後、回収し、１０％DMSO（純正化学製）を含む凍結保存液を用いて凍結保存した。凍結保存した細胞を約３７℃に設定したウォーターバス内で解凍し、０．５％のヒト血清アルブミンを含む緩衝液で洗浄したものを以下の実施例に用いた。

実施例
50%v/vのヒト血清を含むDMEM/F12培地（ライフテクノロジージャパン社）1000μLに、1.76×10⁶個の骨格筋芽細胞を懸濁し、CO₂インキュベーター（設定値：37℃、5%CO₂）内で90分間インキュベートした。
インキュベートの間、細胞懸濁液は30分置きにタッピングにより攪拌した。インキュベート後、DMEM/F12基礎培地（血清を含まない）を12mLずつ加えて遠心し（240×g、4℃、7分）、上清を取り除き、500μLのDMEM/F12基礎培地（血清を含まない）を加え懸濁した後、全量を温度応答性培養皿（24well）に播種し、CO₂インキュベーター（設定値：37℃、5%CO₂）内で24時間培養した。培養後、培養上清を取り除き、シート形成の可否を顕微鏡及び目視下で観察した。
その結果、培養基材表面に敷石状の細胞層が形成され（図1）、細胞シートを調製することができた。

上記結果より、細胞のシート構造を形成するために必要な細胞接着性を有する成分を予め細胞表面に付着させておくことによって、培養工程で細胞接着性を有する成分を含む物質（血清等）を使うことなく、シート状細胞培養物の調製が可能であることが明らかとなった。すなわち、血清の使用量を減らすことができることが確認された。従来の一般的な製造方法を用いた場合、血清は細胞シート1枚(10cmディッシュを使用した場合)あたり3mLの血清が必要であるが、本発明の場合は500μL以下まで減らすことが可能である。

本発明は、細胞のシート構造を形成させるために必要な細胞接着成分（血清など）の使用量減らすことを可能ならしめ、また、自己血清を使用する場合の患者負担を軽減することができる。従って、再生医療の分野における利用性が高く、当該分野の発展にも貢献するものである。

Claims (6)

1. 細胞接着成分を含む物質と細胞を混合し懸濁することにより細胞接着成分を予め細胞表面に付着させる工程、前記細胞を洗浄して無血清培地に懸濁する工程、および培養表面が血清で被覆されていない培養基材上に前記懸濁した細胞を播種する工程を含む、細胞のシート状細胞培養物を製造する方法。
2. 前記細胞接着成分を含む物質が血清であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 細胞接着成分を含む物質と細胞を混合し懸濁した後、該懸濁物を静置することを含む請求項１又は２に記載の方法。
4. 懸濁した細胞を播種した後に、該細胞を無血清培地で培養することを含む請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
5. 細胞が骨格筋芽細胞であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
6. 細胞の洗浄が、培養液、PBSまたは生理食塩水を用いることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。