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TW202143996A - 使用可溶性ｃｄ２４治療病毒性肺炎之方法 - Google Patents

使用可溶性ｃｄ２４治療病毒性肺炎之方法 Download PDF

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TW202143996A
TW202143996A TW110105190A TW110105190A TW202143996A TW 202143996 A TW202143996 A TW 202143996A TW 110105190 A TW110105190 A TW 110105190A TW 110105190 A TW110105190 A TW 110105190A TW 202143996 A TW202143996 A TW 202143996A
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TW
Taiwan
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protein
hours
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human
amino acid
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TW110105190A
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English (en)
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陽 劉
盼 鄭
馬汀 戴芬波特
田仁榮
鄭永唐
Original Assignee
美商昂科免疫公司
中國科學院昆明動物研究所
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Publication date
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Abstract

本發明係關於CD24蛋白用於治療病毒性肺炎之用途。

Description

使用可溶性CD24治療病毒性肺炎之方法
本發明係關於用於治療或預防病毒性肺炎之組合物及方法。
病毒性肺炎為全身與呼吸道感染之死亡率之主要原因，其中抗病毒劑為主要治療選項。然而，由於肺炎可在病毒清除之後持續存在，因此應考慮其他非抗病毒治療選項。引人興趣之可能性為病毒性肺炎效應可導致危險相關分子模式(亦稱為損傷相關分子模式或DAMP)之釋放，引起自傳播炎性反應與持續肺損傷。因此，測試靶向DAMP誘導之發炎以用於治療病毒性肺炎之免疫治療劑受到關注。
本文提供一種治療或預防有需要之個體之病毒性肺炎的方法。該方法可包含向個體投與有效量之CD24蛋白。本文亦提供CD24蛋白用於製造供治療病毒性肺炎用之藥劑的用途。在本發明之實施例中，肺炎由流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合性病毒或人類免疫缺乏病毒中之一或多者引起。在本發明之另一實施例中，肺炎由繼發性感染引起，該繼發性感染可為病毒感染後之細菌感染。
在所揭示之方法之一個實施例中，CD24蛋白包含成熟CD24多肽或其變異體。在另一實施例中，CD24蛋白包含成熟人類CD24多肽或其變異體。在另一實施例中，成熟人類CD24多肽為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2之多肽。在另一實施例中，成熟人類CD24多肽為SEQ ID NO. 1之多肽。在另一實施例中，成熟人類CD24多肽為SEQ ID NO. 1之多肽，其中C末端胺基酸為纈胺酸。在另一實施例中，成熟人類CD24多肽為SEQ ID NO. 1之多肽，其中C端胺基酸為丙胺酸。在另一實施例中，成熟人類CD24多肽為SEQ ID NO. 2之多肽。
在所揭示之方法之另一實施例中，CD24蛋白包含蛋白質標籤。此實施例之態樣係在蛋白質標籤融合至成熟CD24多肽或其變異體之N端或C端時實現。當蛋白質標籤包含哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分時，實現此實施例之另一態樣。當哺乳動物Ig蛋白之一部分為Fc區時，實現此實施例之另一態樣。在所揭示之方法之另一實施例中，CD24蛋白包含融合至成熟人類CD24多肽或其變異體之N端或C端的蛋白質標籤。當蛋白質標籤包含人類免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分時，實現此實施例之另一態樣。當人類Ig蛋白之一部分為Fc區時，實現此實施例之另一態樣。當Fc區包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群的人類Ig蛋白之鉸鏈區及CH2及CH3域時，實現此實施例之另一態樣。當Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域時，實現此實施例之另一態樣。當CD24蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列時，此實施例之又另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 6中所闡述之序列時，此實施例之另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11中所闡述之序列時，此實施例之另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12中所闡述之序列時，此實施例之另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列組成時，此實施例之又一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 6中所闡述之序列組成時，此實施例之另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 11中所闡述之序列組成時，此實施例之另一態樣實現。當CD24蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 12中所闡述之序列組成時，此實施例之另一態樣實現。
如本文所示，個體可患有或診斷患有病毒性肺炎。在本發明之另一實施例中，CD24蛋白係經靜脈內投與30分鐘至8小時之時間。在一類此實施例之中，CD24蛋白係經靜脈內投與30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分鐘，或至多3、4、5、6、7或8小時之時間。在另一類此實施例中，CD24蛋白係經靜脈內投與約60分鐘之時間。在本發明之另一實施例中，CD24蛋白在適當媒劑中稀釋。在此實施例之一個態樣中，媒劑為磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或標準生理食鹽水(NS)。在一類此實施例中，CD24蛋白之劑量稀釋至適當媒劑(諸如PBS)中。在又一類別中，CD24蛋白之劑量在適當媒劑(諸如PBS)中稀釋至100 mL。在本發明之某些實施例中，CD24蛋白與第二療法(諸如作為病毒性肺炎之標準照護療法的療法)一起投與。第二療法可為氧氣療法、機械式呼吸器、體外膜式氧合、無創呼吸器、高流量氧氣裝置、瑞德西韋(remdesivir)、皮質類固醇及免疫調節劑中之一或多者。
相比於使用安慰劑與標準照護療法治療之病毒性肺炎患者，作為所揭示之方法之一部分投與CD24蛋白可引起以下中之一或多者：降低之死亡風險；減少之機械式呼吸器治療持續時間、減少之體外膜式氧合治療持續時間、減少之無創呼吸器治療持續時間、減少之升壓藥物治療持續時間、減少之高流量氧氣裝置治療持續時間、降低之疾病惡化速率、增加之臨床復發時間、減少之補充供氧持續時間、減少之住院時間、減少之絕對淋巴球計數、降低之一或多種發炎標誌物含量。
在本發明之一個實施例中，作為所揭示之方法之一部分投與的CD24蛋白係可溶的。在所揭示之方法的另一實施例中，CD24蛋白經糖基化。
在本發明之一個實施例中，藉由本文所描述之方法投與的CD24蛋白係使用真核表現系統產生。在此實施例之一個態樣中，表現系統包含中國倉鼠卵巢細胞株中所含之載體或複製缺陷型反轉錄病毒載體。在一類此實施例中，複製缺陷型反轉錄病毒載體穩定整合至真核細胞之基因體中。
本發明人已發現CD24蛋白之可溶性形式對治療病毒性肺炎高度有效。當CD24蛋白為成熟人類CD24多肽(SEQ ID NO. 1)或成熟人類CD24多肽之變異體(其中成熟CD24多肽之最後一個(C端)胺基酸(A或V)已缺失)時，實現本發明之一個態樣。如本文所使用之成熟人類CD24蛋白有時亦稱為成熟人類CD24多肽。當該成熟人類CD24多肽或其變異體與IgG1 Fc域融合時，本發明之另一態樣實現。該效應可經由DAMP介導。模式辨識涉及由病原體相關分子模式與組織損傷相關分子模式(分別稱為PAMP及DAMP)觸發的炎性反應。本發明人已意識到近期研究已表明，宿主對DAMP之反應加劇可以在炎性及自體免疫疾病之發病機制中起部分作用(Chen, G. Y.等人, CD24 and Siglec-10 selectively repress tissue damage induced immune responses, Science, 第323卷, 第1722-1725頁(2009)；Liu, Y.等人, CD24-Siglec G/10 discriminates danger-from pathogen-associated molecular patterns, Trends Immunol, 第30卷, 第557-561頁(2009)；Fang, X.等人, CD24: from A to Z. Cell Mol Immunol, 第7頁, 第100-103頁(2010))。發現DAMP在動物模型中促進炎性細胞介素及自體免疫疾病產生，且因此發現DAMP抑制劑(諸如HMGB1及HSP90)改善類風濕性關節炎(RA)。TLR、RAGE-R、DNGR(由Clec9A編碼)及Mincle已表明為負責介導由多種DAMP起始之發炎的受體。
本發明人之近期著作表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用使針對DAMP之先天免疫力有別於針對PAMP之先天免疫力。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素蛋白為鑑別多種含唾液酸結構之膜相關免疫球蛋白(Ig)超家族。大部分唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素具有細胞內免疫酪胺酸抑制基序(ITIM)，該基序與SHP-1、SHP-2及Cbl-b締合以控制炎性反應之關鍵調節子。發明人已報導CD24為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素、小鼠中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G及人體中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之第一天然配位體。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G與唾液酸化CD24相互作用以經由SHP-1/2傳訊機制抑止TLR介導之針對DAMP (諸如HMGB1)之宿主反應。
人類CD24為一種經糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定的小分子，其由CD24基因中之240個鹼基對之開放閱讀框架編碼。在80個胺基酸中，蛋白質之NH2 端的前26個胺基酸構成信號肽，而COOH端之最後23個胺基酸充當裂解信號以允許GPI尾部連接。因此，成熟人類CD24多肽僅具有31個胺基酸，其亦表示人類CD24蛋白之細胞外域。31個胺基酸中之一者在人類群體中係多態性的。CD24基因開放閱讀框架之核苷酸170處的胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)核苷酸過渡導致丙胺酸(A)經纈胺酸(V)之胺基酸取代[在成熟CD24蛋白之胺基酸殘基31處]。因為此殘基之N端緊接裂解位點，且因為置換係非保守性，所以此兩個對偶基因可依不同效率表現於細胞表面上。實際上，cDNA轉染研究證實，CD24v 對偶基因更有效地表現於細胞表面上。據此，CD24v / v PBL尤其在T細胞上表現更高程度之CD24。人類CD24為GPI錨定的小蛋白質，其由CD24基因中之240個核苷酸鹼基對之開放閱讀框架編碼。在80個胺基酸中，NH2 端之前26個胺基酸構成信號肽，而COOH端之最後23個胺基酸充當裂解信號，以便連接GPI尾部。因此，成熟人類CD24蛋白僅具有31個胺基酸，其亦代表CD24蛋白之細胞外域。31個胺基酸中有一者在人類群體中係多態性。CD24基因開放閱讀框架之核苷酸170處的胞嘧啶(C)轉換為胸腺嘧啶(T)核苷酸引起丙胺酸(A)經纈胺酸(V)之胺基酸取代。因為此胺基酸殘基緊接GPI信號裂解位點之N端，且因為該置換係非保守性，所以此等兩個對偶基因可依不同效率表現於細胞表面上。實際上，cDNA轉染研究證實，CD24v 對偶基因(含有纈胺酸殘基)更有效率地表現於細胞表面上。據此，CD24v / v PBL尤其在T細胞上表現更高程度之CD24。
本發明人已證實CD24負向調節針對細胞DAMP的宿主反應，該細胞DAMP係因組織或器官損傷所致而釋放，且至少兩種重疊機制可解釋此活性(Chen, G. Y.,等人，CD24 and Siglec-10 selectively repress tissue damage-induced immune responses, Science, 第323卷, 第 1722-1725頁(2009))。首先，CD24結合至若干DAMP，包括HSP70、HSP90、HMGB1及核仁素(nucleolin)，且抑制針對此等DAMP之宿主反應。為此，推測CD24可截留炎性刺激，以防止與其受體TLR或RAGE發生相互作用。其次，使用乙醯胺苯酚誘導之肝臟壞死且確保發炎之小鼠模型，本發明人證實CD24經由與其受體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生的相互作用，為宿主針對組織損傷的反應提供強力的負向調節。為獲得此活性，CD24可結合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G且由唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G刺激傳訊，其中由唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G締合之SHP1觸發負向調節。兩種機制均可一致作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的炎性反應。實際上，由CD24-/-或Siglec G-/-小鼠之骨髓培養而得的樹突狀細胞當用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生更高量之炎性細胞介素。CD24蛋白似乎係能夠制止DAMP觸發之發炎之唯一抑制性DAMP受體，且特異性靶向針對組織損傷之宿主炎性反應之藥物目前不可獲得。此外，本發明人已使用RA、多發性硬化症(MS)及移植體對抗宿主疾病(GvHD)之小鼠模型表明外源可溶性CD24蛋白能夠緩解DAMP介導之自體免疫疾病。
因為CD24Fc為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素之促效劑且可以強化CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素固有免疫檢查點，所以本發明人評估CD24Fc是否可改良接受安慰劑(標準生理食鹽水，NS)或CD24Fc之感染SIV的恆河猴的肺病變。特定言之，其表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素路徑可以防止由細胞死亡觸發之破壞性發炎。因為肺細胞死亡為病毒誘發之肺炎之顯著特徵，所以可溶性形式之CD24Fc可以用作對病毒性肺炎之療法，包括HIV、流行性感冒、副流行性感冒及呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎。
在本發明之實施例中，藉由本文所描述之方法投與的CD24蛋白可包含成熟人類CD24多肽，該多肽構成CD24蛋白之細胞外域(ECD)或其變異體。成熟人類CD24多肽或其變異體係由SEQ ID NO: 1或2表示。CD24蛋白可包含蛋白質標籤，該蛋白質標籤可在CD24蛋白之N端或C端融合。蛋白質標籤可包含哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分，且該部分可為Fc區。Ig蛋白可為人類的。Fc區可包含人類Ig蛋白之鉸鏈區及CH2及CH3域，該人類Ig蛋白選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群。Fc區可包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。CD24蛋白之胺基酸序列可包含或由SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列組成。
1.  定義.
本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的且並不意欲為限制性的。除非上下文另有明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。
對於本文中數值範圍之敍述，明確地涵蓋具有相同精確程度之其間的每一間插數值。舉例而言，對於6-9之範圍，除6與9以外涵蓋數值7與8，且對於6.0-7.0之範圍，明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。
「肽」或「多肽」為連接之胺基酸序列且可為天然的、合成的，或天然與合成之修飾或組合。
「基本上一致」可意謂第一與第二胺基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個胺基酸之區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
當提及防止動物患病時，「治療(Treatment或treating)」意謂預防、抑制、抑止或完全消除疾病及/或感染。預防疾病涉及在疾病發作之前向動物投與本發明之組合物。抑制疾病涉及在疾病誘發之後，但在其臨床顯現之前，向動物投與本發明之組合物。抑制疾病涉及在疾病臨床顯現之前向動物投與本發明之組合物。
「變異體」可意謂胺基酸序列因胺基酸之插入、缺失或保守取代而不同、但保留至少一種生物活性之肽或多肽。「生物活性」之代表性實例包括結合至toll樣受體及由特異性抗體結合之能力。變異體亦可意謂胺基酸序列與保留至少一種生物活性之參考蛋白之胺基酸序列基本上一致的蛋白。胺基酸保守取代(亦即，胺基酸被具有類似特性(例如帶電區之親水性程度及分佈)之不同胺基酸置換)在此項技術中公認為典型地涉及微小變化。如此項技術中所理解，此等微小變化可以部分地藉由考慮胺基酸之親水指數而鑑別。Kyte等人, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。胺基酸之親水指數係基於其疏水性及電荷之考慮。此項技術中已知具有類似親水指數之胺基酸可以經取代且仍保留蛋白功能。在一個態樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可以用於揭示將產生保留生物功能之蛋白的取代。在肽之情形下考慮胺基酸之親水性允許計算彼肽之最大局域平均親水性，此為已報導與抗原性及免疫原性充分關聯的一種適用量度。美國專利第4,554,101號，其以引用之方式完全併入本文中。如此項技術中所理解，具有相似親水性值之胺基酸的取代可以產生保留生物活性(例如免疫原性)之肽。可使用親水值在彼此±2內的胺基酸進行取代。胺基酸之疏水性指數及親水性值均受該胺基酸之特定側鏈影響。與彼觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代理解為視胺基酸且尤其彼等胺基酸之側鏈之如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性揭示之相對相似性而定。
如本文所使用之成熟人類CD24蛋白有時亦稱為成熟人類CD24多肽及人類CD24 ECD。
如本文所使用，胺基酸修飾係指胺基酸之取代，包括用通常發現於人類蛋白中之20種胺基酸中之任一者或經非典型或非天然存在之胺基酸取代，或藉由向/自胺基酸添加及/或移除化學基團以衍生胺基酸。非典型胺基酸之商業來源包括Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI)、ChemPep Inc. (Miami, FL)及Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA)。非典型胺基酸可購自商業供應商，重新合成，或經化學修飾或自天然存在之胺基酸衍生。
如本文所使用，胺基酸取代係指一個胺基酸殘基經不同胺基酸殘基(包括非典型或非天然存在之胺基酸)置換。
如本文所使用，保守性胺基酸取代定義為以下五組胺基酸中之一者內的交換：
I.小脂族、非極性或輕度極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.極性帶負電殘基及其醯胺：Asp、Asn、Glu、Gln、氧化半胱胺酸及高氧化半胱胺酸；
III.極性帶正電殘基：His、Arg、Lys；鳥胺酸(Orn)；
IV.大、脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val、Cys、正白胺酸(Nle)、高半胱胺酸；
V.大、芳族殘基：Phe、Tyr、Trp、乙醯基苯丙胺酸。 2.  CD24
本文提供包括投與CD24蛋白之方法。CD24蛋白可包含成熟CD24多肽或其變異體。CD24蛋白之成熟形式對應於細胞外域(ECD)。作為本發明之一部分所投與之成熟CD24蛋白可衍生自人類或另一哺乳動物。如上文所描述，成熟人類CD24蛋白長達31個胺基酸且在其C端具有可變丙胺酸(A)或纈胺酸(V)殘基，如下：
SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK (V/A) (SEQ ID NO: 1)
如SEQ ID NO: 1中所展示之C端纈胺酸或丙胺酸可為免疫原性的且當自本文所提供之CD24蛋白中省略時，可降低其免疫原性。因此，本文所提供之CD24蛋白可包含缺乏C端纈胺酸或丙胺酸胺基酸之成熟人類CD24之胺基酸序列，如下：
SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK (SEQ ID NO: 2) 儘管來自小鼠及人類之成熟CD24蛋白之細胞外域的胺基酸序列存在相當大的序列變化，但其為功能上等效的，因為已展示人類CD24之可溶性形式在小鼠中具有活性。人類CD24之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)與對應小鼠蛋白(GenBank寄存編號NP_033976)39%一致。然而，並不出人意料的係，由於CD24長度僅為27-31個胺基酸(視物種而定)，因此一致性百分比不會更高，且結合至其一些受體(諸如唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集10/G)由其唾液酸及/或醣蛋白之半乳糖糖類介導。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10 (GenBank寄存編號AF310233)之細胞外域與其鼠類同系物唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-G (GenBank寄存編號NP_766488)受體蛋白之間的胺基酸序列一致性為63% (圖2)。因為小鼠與人類成熟CD24蛋白之間的序列保守主要在蛋白之C端且細胞外域存在大量潛在糖基化位點(S及T殘基)，所以本文所提供之CD24蛋白可耐受如SEQ ID NO: 1中所展示之成熟CD24序列發生顯著變化，尤其是彼等變異不影響C端及/或糖基化位點中之保守殘基。因此，本文所提供之CD24蛋白可包含成熟鼠類CD24之胺基酸序列：
NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG (SEQ ID NO: 3)
人類CD24 ECD之胺基酸序列展示與食蟹獼猴形式之蛋白存在之序列保守性(52%一致性；UniProt寄存編號UniProtKB-I7GKK1)大於小鼠。此外，鑒於以下情形，其並不出人意料：由於ECD在此等物種中之長度僅為29-31個胺基酸，因此一致性百分比不會更高，且糖殘基之作用為結合至其受體。獼猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10受體之胺基酸序列尚未測定，但人類與恆河猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10 (GenBank寄存編號XP_001116352)蛋白之間的胺基酸序列一致性係89%。因此，本文所提供之CD24蛋白亦可包含成熟獼猴(或恆河猴) CD24之胺基酸序列：
TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA (SEQ ID NO: 10)
作為所揭示之方法的一部分所投與之CD24蛋白可為可溶的。CD24蛋白可進一步包含N端信號肽，以允許自表現蛋白之細胞分泌。信號肽序列可包含胺基酸序列：MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS (SEQ ID NO: 4)。或者，信號序列可為其他跨膜或所分泌蛋白上所發現之彼等信號序列或此項技術中已知之現有信號肽經修飾的彼等信號序列中之任一者。 a.        融合
藉由本文所描述之方法所投與之CD24蛋白可在其N端或C端與蛋白質標籤融合，該蛋白質標籤可包含可為人類或小鼠或另一物種之哺乳動物Ig蛋白的一部分。該部分可包含Ig蛋白之Fc區。Fc區可包含Ig蛋白之鉸鏈區、CH2、CH3及CH4域中之至少一者。Ig蛋白可為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA，且Fc區可包含Ig之鉸鏈區及CH2及CH3域。Fc區可包含人類免疫球蛋白G1 (IgG1)同型SEQ ID NO: 7。Ig蛋白亦可為IgM，且Fc區可包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。蛋白質標籤可為有助於蛋白質純化之親和標籤，及/或增強功能性蛋白質之溶解性及回收率之溶解性增強標籤。蛋白質標籤亦可提高CD24蛋白之價數。蛋白質標籤亦可包含GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、硫氧還蛋白(TRX)、小泛素樣調節劑(SUMO)、泛素(Ub)、白蛋白或駱駝科Ig。用於製備融合蛋白且純化融合蛋白之方法在此項技術中已熟知。
為了構築實例中所鑑別之融合蛋白CD24Fc，已使用如SEQ ID NO: 2所表示之具有30個胺基酸之成熟CD24多肽之截短形式，缺乏成熟人類CD24多肽之最後(C端)多態性胺基酸(位於全長CD24蛋白之GPI信號裂解位點之前)。成熟人類CD24多肽序列之此變異體與由SEQ ID NO: 7所表示之人類IgG1 Fc域融合。CD24Fc融合蛋白之「全長」形式提供於SEQ ID NO: 5中(圖1A)，其含有30個胺基酸成熟CD24變異多肽及融合至CD24多肽之C端的IgG1 Fc域的CD24信號肽。自細胞分泌之全長CD24Fc融合蛋白之經處理形式(亦即，缺乏分裂的信號序列)提供於SEQ ID NO: 6中，其僅含有融合至IgG1 Fc域之30個胺基酸成熟CD24變異多肽。融合至IgG1 Fc之成熟CD24多肽之經處理多態性變異體(亦即，具有SEQ ID NO: 1之成熟CD24多肽)可包含SEQ ID NO: 11或12中所闡述之胺基酸序列。
因此，如本文所使用，「CD24Fc」為對應於成熟人類CD24多肽之變異體的融合物，其中成熟人類CD24多肽之最後(C端)胺基酸(A或V)已缺失，且其中成熟人類CD24多肽變異體與IgG1 Fc域融合。SEQ ID NO: 6為此類CD24融合蛋白之實例，其中IgG1 Fc域與人類成熟CD24多肽變異體之C端融合。 b.   生產
藉由本文所描述之方法所投與之CD24蛋白(包括如所描述之CD24之Fc融合蛋白)可經大量糖基化，且可涉及CD24蛋白之功能，諸如免疫細胞之共刺激及與損傷相關分子模式分子(DAMP)的相互作用。CD24蛋白可使用真核表現系統製備。表現系統可需要載體在哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現。系統亦可為病毒載體，諸如可用於感染真核細胞之複製缺陷型反轉錄病毒載體。CD24蛋白亦可由穩定細胞株產生，該細胞株經由已整合至細胞基因體中之載體或載體之一部分表現CD24蛋白。穩定細胞株可經由所整合之複製缺陷型反轉錄病毒載體表現CD24蛋白。表現系統可為GPEX™ (Catalent Biotechnology, Somerset, NJ)。 c.        醫藥組合物
包括如所描述之CD24之Fc融合蛋白的藉由本文所描述之方法所投與之CD24蛋白可包含於醫藥組合物中，該醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之量的CD24蛋白。醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可包含使CD24蛋白在延長期間保持穩定之溶劑。溶劑可為PBS，其可使CD24蛋白在-20℃(-15~-25℃)下保持穩定至少66個月。溶劑能夠容納CD24蛋白與其他藥物之組合。
醫藥組合物可經調配用於非經腸投與，包括(但不限於)注射或連續輸注。注射用調配物可呈於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且可含有包括(但不限於)懸浮劑、穩定劑及分散劑之調配劑。組合物亦可呈粉末形式提供，以便用包括(但不限於)無菌無熱原質水之適合的媒劑復原。在一個實例中，醫藥組合物包含標準生理食鹽水溶液，可在其中稀釋CD24蛋白。生理食鹽水溶液之體積可為100 mL。在一個實例中，用於靜脈內投與之醫藥組合物包含480 mg之CD24蛋白，包括如所描述之成熟人類CD24之Fc融合蛋白。
醫藥組合物亦可調配為儲積式製劑，其可藉由植入或藉由肌內注射投與。該組合物可用適合的聚合物質或疏水性物質(例如呈含於可接受之油中之乳液)、離子交換樹脂，或呈難溶性衍生物(例如呈難溶性鹽)調配。 d.        劑量
藉由本文所描述之方法所投與之CD24蛋白(包括如所描述之成熟CD24之Fc融合蛋白)的劑量最終可經由臨床試驗確定具有可接受之毒性及臨床功效之劑量。初始臨床劑量可經由嚙齒動物及非人類靈長類動物之藥物動力學及毒性研究來估計。視對irAE或GvHD之所需作用及投與途徑而定，CD24蛋白之劑量可為0.01 mg/kg至1000 mg/kg，且可為1至500 mg/kg。CD24蛋白可藉由靜脈內輸注或皮下、壁內(亦即，空腔或器官之壁內)或腹膜內注射投與，且劑量可為10-1000 mg、10-500 mg、10-240 mg、10-120 mg，或10、30、60、120、240 mg或480 mg，其中個體為人類。 3.        治療方法  a.        肺炎
病毒肺炎占人類中之肺炎之超過1/3且因此為死亡之主要原因。病毒性肺炎之最常見病因為流行性感冒病毒。此外，副流行性感冒及呼吸道融合性病毒常為病因。
因此，CD24蛋白可用於治療或預防有需要之個體之病毒性肺炎感染。肺炎可由流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合性病毒或人類免疫缺乏病毒中之一或多者引起。肺炎可由可在病毒感染之後的繼發性細菌感染引起。特定言之，葡萄球菌(Staphylococci)為繼發性肺炎之最常見原因。用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎感染，或病毒感染後的繼發性細菌感染的CD24蛋白可包含成熟人類CD24多肽或其變異體，如SEQ ID NO: 1或2中所闡述之序列中所說明。用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎感染，或病毒感染後的繼發性細菌感染的CD24蛋白可包含蛋白質標籤，其中蛋白質標籤在CD24蛋白之N端或C端融合。蛋白質標籤可包含哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分，其中哺乳動物Ig蛋白之一部分可為Fc區。Ig蛋白可為人類的。Fc區可包含人類Ig蛋白之鉸鏈區及CH2 及CH3 域，該人類Ig蛋白選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群。Fc區可包含IgM之鉸鏈區及CH2 、CH3 及CH4 域。用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎感染，或病毒感染後的繼發性細菌感染的CD24蛋白之胺基酸序列可包含SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列。用於治療或預防病毒性肺炎感染的CD24蛋白之胺基酸序列可包含SEQ ID NO: 6中所闡述之序列。用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎感染，或病毒感染後的繼發性細菌感染的CD24蛋白之胺基酸序列可包含SEQ ID NO: 11中所闡述之序列。用於治療或預防病毒性肺炎感染的CD24蛋白之胺基酸序列可包含SEQ ID NO: 12中所闡述之序列。用於治療或預防如本文所描述之病毒性肺炎的CD24蛋白之胺基酸序列亦可由SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列組成。
用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒引起之病毒性肺炎感染，或病毒感染後的繼發性細菌感染的CD24蛋白可以使用真核蛋白質表現系統產生，其中表現系統可包含中國倉鼠卵巢細胞株中所含之載體或複製缺陷型反轉錄病毒載體，且其中複製缺陷型反轉錄病毒載體穩定整合至真核細胞之基因體中。用於治療或預防由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒或病毒感染之後的繼發性細菌感染引起之病毒性肺炎的CD24蛋白為可溶的且經糖基化的。實施例包括如本文所描述之CD24蛋白之用途，其用於製造用以治療或預防個體之由流行性感冒病毒、副流行性感冒或呼吸道融合性病毒或病毒感染之後的繼發性細菌感染引起之病毒性肺炎的藥劑。
個體可為哺乳動物。特定言之，哺乳動物可為猴子或猿。猿可為黑猩猩、大猩猩或人類。
在原發性及繼發性肺炎中，病毒及細菌可引起受感染細胞死亡，其還可能觸發肺中之發炎。因此，抑制組織損傷誘導之發炎的治療劑亦可用於治療病毒及細菌肺炎。 b.        投與
本文所描述之CD24蛋白醫藥組合物之投與途徑可為非經腸的。非經腸投與包括(但不限於)靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌內、鞘內、關節內及直接注射。組合物可每天投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次。組合物可投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，或3、4、5、6、7、8、9、10、11或12週之時間。
在一個實例中，本文所描述之CD24蛋白可以480 mg劑量投與。在一個實施例中，CD24蛋白可靜脈內輸注，該CD24蛋白可投與至多30、40、50、60、70、80、90、100、110或120分鐘，或至多3、4、5、6、7或8小時之時間。CD24蛋白可在標準生理食鹽水中稀釋以靜脈內投與，包括例如至100 mL體積。 c.        組合療法
因為病毒及細菌感染為病毒性肺炎之主要原因，所以抗病毒劑及抗生素頻繁用作治療選擇。然而，由於肺炎為可以由感染之後的組織損傷引起之肺發炎，因此其他治療可以與主要抑制感染之試劑組合使用，此類試劑包括常用抗病毒劑(例如瑞德西韋或莫那比拉韋)以及如由特定病原體所指示之抗生素。在一個實例中，在治療病毒性肺炎中，個體可用瑞德西韋與CD24蛋白之組合治療。在另一個實例中，在治療病毒性肺炎中，個體可用莫那比拉韋與CD24蛋白之組合治療。
如本文所描述之CD24蛋白可與其他療法同時或有節奏地投與。如本文所使用，術語「同時」或「同時地」意謂CD24蛋白與另一療法在彼此48小時內投與，較佳24小時，更佳12小時，然而更佳6小時，且最佳3小時或更少。如本文所使用，術語「有節奏地」意謂藥劑與另一療法在不同時間且以特定頻率(相對於重複投與)投與。
如本文所描述之CD24蛋白可在另一療法之前的任何時間點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50hr, 48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘或1分鐘。CD24蛋白可在CD24蛋白之第二療法之前的任何時間點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘或1分鐘。
如本文所描述之CD24蛋白可在另一療法之後的任何時間點投與，包括約1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、38小時、40小時、42小時、44小時、46小時、48小時、50小時、52小時、54小時、56小時、58小時、60小時、62小時、64小時、66小時、68小時、70小時、72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、82小時、84小時、86小時、88小時、90小時、92小時、94小時、96小時、98小時、100小時、102小時、104小時、106小時、108小時、110小時、112小時、114小時、116小時、118小時或120小時。CD24蛋白可在先前CD24療法之後前的任何時間點投與，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘或1分鐘。實例 1 CD24 在小鼠中之藥物動力學
將由SEQ ID NO. 6表示之1 mg CD24Fc 注射至未處理C57BL/6小鼠中且在不同時間點(5分鐘、1小時、4小時、24小時、48小時、7天、14天及21天)收集來自3隻小鼠在每個時間點的所收集之血液樣本。將血清1:100稀釋且使用夾心ELISA、使用經純化之抗人類CD24 (3.3 μg/ml)作為捕獲抗體及過氧化酶結合之山羊抗人類IgG Fc (5 μg/ml)作為偵測抗體來偵測CD24Fc之含量。如圖3A中所示。CD24Fc之衰變曲線揭露蛋白之典型兩相衰減。第一生物分佈相具有12.4小時之半衰期。第二相依循自中樞隔室發生一級消除之模型。第二相之半衰期為9.54天，其類似於活體內抗體半衰期。此等資料表明融合蛋白在血流中非常穩定。在皮下注射融合蛋白之其他研究中，觀測到幾乎相同之9.52天半衰期(圖3B)。更重要的係，雖然CD24Fc在血液中耗費大約48小時達到峰值程度，但如藉由AUC所量測，任一注射途徑所引起之融合蛋白在血液中的總量基本上相同。因此，自治療觀點，使用不同的注射途徑不應影響藥物之治療效果。此觀測結果大大簡化了用於靈長類動物毒性及臨床試驗之實驗設計。實例 2 CD24 - 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素 10 在針對組織損傷之宿主反應中相互作用
將近二十年前，Matzinger提出：何為通常所謂的危險理論(P. Matzinger, 「Tolerance, danger, and the extended family,」 Annual Review of Immunology, 第12卷, 第991-1045頁, 1994)。本質上，她辯稱免疫系統在其感測到宿主存在危險時開啟。雖然危險性質不能及時明確界定，但已確定壞死與細胞內組分(諸如HMGB1及熱休克蛋白，稱為DAMP，即危險相關分子模式)之釋放相關。發現DAMP促進炎性細胞介素產生及自體免疫疾病。在動物模型中，發現HMGB1及HSP90之抑制劑改善類風濕性關節炎(RA)。DAMP之參與提高了可以探究針對DAMP之宿主反應之負向調節用於RA療法的前景。
使用乙醯胺苯酚誘導之肝臟壞死及確保發炎，觀測到CD24經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用向針對組織損傷之宿主反應提供強大的負向調節。CD24為GPI錨定分子，其廣泛地表現於造血細胞及其他組織幹細胞中。對人類之多種自體免疫疾病(包括多發性硬化症、全身紅斑狼瘡、RA及巨細胞關節炎)進行之遺傳分析表明，CD24多態性與自體免疫疾病風險之間存在顯著的關聯。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G係I-凝集素家族之成員，此根據其識別含唾液酸結構之能力界定。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G識別CD24上之含唾液酸結構且負向調節樹突狀細胞(DC)產生炎性細胞介素。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10及小鼠唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G就其與CD24相互作用之能力而言，在功能上為等效的。然而，不清楚小鼠與人類同系物之間是否存在一對一相關性。儘管機制仍待充分闡明，但唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G締合之SHP1可能涉及負向調節。此等資料產生一種新模型，其中CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10相互作用可在區分病原體相關分子模式(PAMP)與DAMP方面起關鍵作用(圖4)。
至少兩種重疊機制可解釋CD24之功能。首先，藉由結合至多種DAMP，CD24可以截留炎性刺激以防止其與TLR或RAGE發生相互作用。此觀點由如下觀測結果支持：CD24與若干DAMP分子(包括HSP70、90、HMGB1及核仁素)締合。其次，或許在與DAMP結合之後，CD24可刺激唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之傳訊。兩種機制均可協同作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的炎性反應。實際上，由CD24-/-或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/-小鼠之骨髓培養而得的DC當用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生更高量之炎性細胞介素。相比之下，未發現其對PAMP，諸如LPS及PolyI:C之反應。此等資料不僅提供一種用於先天性免疫系統區分病原體與組織損傷之機制，且亦表明CD24及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G作為與組織損傷相關之疾病的潛在治療標靶。儘管CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素相互作用不控制感染，但其亦可以影響在病毒及細菌感染期間之炎性反應。舉例而言，許多感染引起組織損傷。此外，許多傳染劑可破壞CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素相互作用，因為其編碼自CD24移除唾液酸且藉此滅活由組織損傷所引起之發炎的負向調節的唾液酸酶。實例 3 CD24Fc 與 HMGB1 、 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素 10 相互作用且誘導 唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素 G 與 SHP - 1 之間締合
為了量測CD24Fc與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之間之相互作用，吾人將CD24Fc固定至CHIP上且使用Biacore量測不同濃度之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10Fc之結合。如圖5A中所示，CD24Fc以1.6×10- 7 M之Kd結合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10。其親和力為對照Fc之100倍。CD24Fc與HMGB1之間之相互作用藉由使用CD24Fc結合之蛋白G珠粒的吸引實驗、隨後藉由使用抗IgG或抗HMGB1的西方墨點法證實。此等資料表明CD24Fc(而非Fc)結合至HMGB1且此結合具有陽離子依賴性(圖5B)。為了確定CD24Fc是否為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之小鼠對應物)之促效劑，吾人用CD24Fc、對照Fc或媒劑(PBS)對照刺激CD24-/-脾細胞30分鐘。隨後使唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生免疫沈澱且用抗磷酸化酪胺酸或抗SHP-1探測。如圖5C中所示，CD24Fc誘導唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生實質磷酸化且誘導SHP-1 (後天與先天免疫力之公認抑制劑)締合。
CD24Fc之試管內功效研究。
為了研究CD24Fc對人類T細胞產生炎性細胞介素之影響，人類PBML中之成熟T細胞在不同濃度之CD24Fc或人類IgG1 Fc存在下用抗CD3抗體(OKT3)(常用的T細胞受體促效劑)活化。四天後，收集上清液且藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)量測IFN-γ及TNF-α之產生以證實活化。圖6中之結果表明相比於對照IgG Fc對照物，來自兩個不同製造批次之CD24Fc使經活化之人類PBML的IFN-γ及TNF-α產生顯著減少。此外，當添加CD24Fc時，細胞介素產生以劑量依賴性方式受到抑制。因此，CD24Fc可以在試管內抑制抗CD3誘導之人類PBML活化。此研究不僅表明CD24Fc之作用機制可經由T細胞活化之抑制，而且為藥物效能及穩定性測試確立了可靠的生物分析。
為了確定CD24Fc是否調節人類細胞株產生炎性細胞介素，吾人首先使用RNAi使人類急性單核球性白血病THP1細胞株中之CD24靜默，且隨後藉由PMA處理其而誘導分化成巨噬細胞。如圖7A中所示，CD24靜默使TNFα、IL-1β及IL-6之產生實質上增加。此等資料表明內生人類CD24在限制炎性細胞介素產生方面起主要作用。重要的係，CD24Fc恢復TNFα在CD24靜默細胞株中之抑制(圖7B)，以及IL-1β及IL-6。此等資料不僅表明CD24在人類細胞炎性反應中之相關性，而且提供評估CD24Fc之生物活性的簡單分析。
綜合而言，此等資料表明CD24Fc能夠抑制後天及先天刺激所觸發之細胞介素產生。然而，由於藥物在藉由固有效應子減少細胞介素產生方面有效得多，因此吾人認為其預防功能之主要機制為在移植早期防止組織損傷觸發發炎。實例 4 CD24 及治療或預防病毒性肺炎
此實例表明本文所描述之CD24蛋白可以用於治療或預防病毒性肺炎。此藉由使用猴免疫缺乏病毒(SIV)模型實現，其中受感染之動物出現肺炎。如圖8A中所圖解，12隻中國恆河猴經由靜脈內輸注4000 50%組織培養感染性劑量的SIVmac239感染SIVmac239，且隨機分成測試組及對照組，分別在感染第56天接受3次CD24Fc或標準生理食鹽水(NS)注射。五個月後，對存活的猴給與另一輪治療，在最後一次給藥之後的一週終止，用於生物標記物研究。分析包括來自所有隨機分組動物 (不管其是否完成所有給藥)之肺切片，如下表1中所詳述。 表1在用CD24Fc或對照物治療之後的SIV感染動物資訊之概述
動物ID 治療 1輪 56-66 dpi 2輪 176-186 dpi 組織收集dpi 症狀/診斷/病理學發現
06031 PBS + + 190 頑固性腹瀉、消耗症候群/AIDS/肺炎
06047 PBS + - 80 消耗症候群/死亡/肺炎
06329 PBS + + 190 AIDS/肺炎/消耗症候群
07023 PBS + + 190 AIDS/肺炎
07099 PBS + - 119 頑固性腹瀉、消耗症候群/死亡/肺炎
08331 PBS + + 190 頑固性腹瀉/消耗症候群/AIDS/正常
06089 CD24Fc + + 190 健康/正常
06093 CD24Fc + + 190 AIDS/正常/消耗症候群
06343 CD24Fc + + 190 健康/肺炎
07029 CD24Fc + - 174 死亡/消耗症候群/肺炎
08343 CD24Fc + + 190 健康/正常
08365 CD24Fc + + 190 健康/正常
用4%多聚甲醛固定來自屍檢或剖檢之肺切片且用蘇木精及伊紅(H&E)染色。對H&E切片不知情並且由兩名研究人員獨立地針對病毒性肺炎評分。不知情評分揭示5或6隻(83%)對照動物出現重度肺炎，而2或6隻經CD24Fc處理之動物出現重度肺炎，此表明肺炎之實質性減少。兩組猴中共有之最顯著發現為間質性肺炎(NS組中之06031、06047、06329及07099；CD24Fc組中之06343及07029)。
除肺炎發生率降低以外，亦觀測到病理學特徵在對照組與CD24Fc處理組之間存在實質性差異。兩隻對照猴在第一輪PBS處理完成後9週內死亡(表1)。兩隻猴具有急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之病理學特徵，包括第06047號猴之肺泡壁內層之透明膜(圖9)及第07099號猴中形成透明肺泡及肺細胞脫落(圖10)。因為在CD24Fc組中未觀測到此等特徵，所以此等資料表明CD24Fc可保護猴抵禦ARDS。對照組而非CD24FcFc處理組中發現之其他特徵包括出血(06031、06047及07023)、巨細胞形成(對照組中之06047，圖11)及血管周發炎(對照組中之06329及7099)。
綜上所述，資料揭示CD24Fc不僅降低病毒性肺炎之發生率，而且定性地改變肺之免疫病理學性質。先前研究已表明經SIV感染之恆河猴在2-4週內出現肺病變(Baskin, G. B.等人. Lentivirus-induced pulmonary lesions in rhesus monkeys (Macacamulatta) infected with simian immunodeficiency virus, Vet Pathol, 第28卷, 第506-513頁(1991))。截至8週，基本上所有猴已出現肺病變，包括血管周發炎、脈管炎及間質性肺炎及融合細胞。由於CD24治療在感染之後第8週時開始，因此資料表明CD24Fc對SIV誘導之肺炎病變具有治療效果，且本文所描述之CD24蛋白可用於治療或預防病毒性肺炎。
圖1A-C.圖1A展示含有信號肽(在本文中亦稱為CD24Ig)之CD24融合蛋白(CD24Fc)之全長形式(SEQ ID NO: 5)的胺基酸組成。加下劃線的26個胺基酸(SEQ ID NO: 4)表示信號肽，該信號肽在自表現蛋白之細胞分泌期間分裂且因此自如SEQ ID NO: 6所示之CD24蛋白之處理形式缺失。序列(SEQ ID NO: 2)之粗體部分為經處理之CD24蛋白之細胞外域，通常存在於成熟CD24蛋白中之最後一個(C端)胺基酸(A或V)已自融合蛋白構築體缺失以降低免疫原性。未加下劃線之非粗體字母為包括鉸鏈區及CH2及CH3域的IgG1 Fc序列(SEQ ID NO: 7)。圖1B展示CD24V Fc之序列(SEQ ID NO: 8)，其中成熟人類CD24蛋白(粗體)係SEQ ID NO: 1之纈胺酸多態性變異體。圖1C展示CD24A Fc之序列(SEQ ID NO: 9)，其中成熟人類CD24蛋白質(粗體)係SEQ ID NO: 1之丙胺酸多態性變異體。圖1B及1C中之融合蛋白之多個部分如圖1A中所標記，且變異體纈胺酸/丙胺酸胺基酸加雙下劃線。
圖2展示小鼠(SEQ ID NO: 3)與人類(SEQ ID NO: 1及2)之成熟CD24蛋白之間的胺基酸序列變化。潛在的O-糖基化位點加粗，且N-糖基化位點加下劃線。
圖3A-C. 對CD24IgG1 (CD24Fc)之藥物動力學進行的WinNonlin隔室模型化分析。空心圓表示3隻小鼠之平均值，且線條為預測藥物動力學曲線。圖3A.靜脈內(i.v.)注射1 mg CD24IgG1 (CD24Fc)。圖3B.皮下(s.c.)注射1 mg CD24IgG1 (CD24Fc)。圖3C.血液中之抗體總量的比較，如藉由曲線下面積(AUC)、半衰期及最大血液濃度所量測。應注意，總體而言，皮下注射之AUC及Cmax係靜脈內注射之約80%，但差異在統計學上不顯著。
圖4A-B. CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G(Siglec G.) (10)相互作用區分病原體相關分子模式(PAMP)與DAMP。圖4A.宿主對PAMP之反應不受CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (10)相互作用影響。圖4B. CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (10)相互作用抑制宿主對DAMP之反應，此可能經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10締合之SHP-1達成。
圖5A-C. CD24Fc結合至唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10及HMGB1且活化唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之小鼠同系物)。圖5A. CD24Fc-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10相互作用之親和力量測。圖5B. CD24Fc以陽離子依賴性方式與HMGB-1特異性相互作用。在陽離子螯合劑EDTA之存在或不存在下，將CD24Fc與HMGB1一起在0.1 mM之CaCl2 及MgCl2 中培育。CD24Fc被蛋白G珠粒吸引，且藉由西方墨點法測定HMGB1、CD24Fc或對照Fc之量。圖5C. CD24Fc藉由誘導酪胺酸磷酸化(中間圖)且與SHP-1締合(上圖)來活化小鼠唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之量展示於下圖中。CD24-/- 脾細胞用1 µg/ml CD24Fc、對照Fc或媒劑(磷酸鹽緩衝生理食鹽水，PBS)對照物刺激30分鐘。隨後使唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生免疫沈澱且用抗磷酸化酪胺酸或抗SHP-1探測。
圖6A-B. CD24Fc藉由抗CD3活化之人類T細胞抑制TNF-α(圖6A)及IFN-γ(圖6B)之產生。在CD24Fc存在或不存在下，用抗CD3刺激人類末梢血液單核淋巴細胞(PBML) 4天，且藉由ELISA量測細胞培養物之上清液中釋放的IFN-γ及TNF-α之量。所示資料為三次之平均值。誤差條，SEM。
圖7A-B. CD24抑制人類巨噬細胞產生炎性細胞介素。圖7A. CD24之ShRNA沉默引起TNF-α、IL-1β及IL-6之自發產生。THP1細胞用編碼雜亂或兩個獨立CD24 shRNA分子之慢病毒載體轉導。藉由用12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(15 ng/ml)培養4天來將經轉導之細胞分化成巨噬細胞。洗掉PMA及未黏附細胞之後，將細胞另培養24小時以便藉由細胞介素珠粒陣列量測炎性細胞介素。圖7B.如圖7A中一般，但在最後24小時向巨噬細胞中添加既定濃度之CD24Fc或對照IgG Fc。圖7A中所展示之數據為來自三個獨立實驗之平均值及S.D.，而圖7B中之彼等數據表示至少3個獨立實驗。
圖8A-B. CD24Fc保護經SIV感染之中國恆河猴抵禦病毒性肺炎。圖8A.實驗方案。研究活動之時刻表展示於頂部。在感染之後的第8週，將恆河猴隨機分為兩週。在過早死亡之後剖檢或在研究結束時屍檢收穫肺組織。黑線描繪接受標準生理食鹽水之個別猴之存活期，而灰色線描繪接受CD24Fc之猴之存活期。圖8B.接受標準生理食鹽水(左)或CD24Fc之個別動物中病理學病變之代表性影像。尺寸條：50 µm。
圖9.經標準生理食鹽水處理之動物(編號06047)之肺的肺泡中形成透明質。四個代表性病變用箭頭指示。
圖10.在經標準生理食鹽水處理之動物(編號07099)之肺切片的肺泡中形成透明質(左側之灰色箭頭)及肺細胞之脫屑(右側之黑色箭頭)。
圖11.在經標準生理食鹽水處理之動物(編號06047)之肺切片中形成巨細胞。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (41)

  1. 一種治療或預防有需要之個體之病毒性肺炎的方法，其包含向該個體投與CD24蛋白。
  2. 如請求項1之方法，其中該肺炎由流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合性病毒或人類免疫缺乏病毒引起。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該肺炎由病毒感染之後的繼發性細菌感染引起。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該CD24蛋白包含成熟人類CD24多肽或其變異體。
  5. 如請求項4之方法，其中該成熟人類CD24多肽或其變異體包含SEQ ID NO: 1或2中所闡述之序列。
  6. 如請求項4或5之方法，其中該CD24蛋白包含蛋白質標籤，其中該蛋白質標籤在該CD24蛋白之N端或C端融合。
  7. 如請求項6之方法，其中該蛋白質標籤包含哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分。
  8. 如請求項7之方法，其中該哺乳動物Ig蛋白之該部分為Fc區。
  9. 如請求項8之方法，其中該Ig蛋白為人類的。
  10. 如請求項9之方法，其中該Fc區包含人類Ig蛋白之鉸鏈區及CH2及CH3域，該人類Ig蛋白選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群。
  11. 如請求項9之方法，其中該Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。
  12. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該CD24蛋白之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列。
  13. 如請求項12之方法，其中該CD24蛋白之胺基酸序列由SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列組成。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該CD24蛋白使用真核蛋白質表現系統產生。
  15. 如請求項14之方法，其中該表現系統包含中國倉鼠卵巢細胞株中所含之載體或複製缺陷型反轉錄病毒載體。
  16. 如請求項15之方法，其中該複製缺陷型反轉錄病毒載體穩定整合至真核細胞之基因體中。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該CD24蛋白係可溶性。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該CD24蛋白經糖基化。
  19. 一種以CD24蛋白於製造供治療或預防個體之病毒性肺炎之藥劑上的用途。
  20. 如請求項19之用途，其中該肺炎由流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合性病毒或人類免疫缺乏病毒引起。
  21. 如請求項19或20之用途，其中該肺炎由病毒感染之後的繼發性細菌感染引起。
  22. 如請求項19至21中任一項之用途，其中該CD24蛋白包含成熟人類CD24多肽或其變異體。
  23. 如請求項22之用途，其中該成熟人類CD24多肽或其變異體包含SEQ ID NO: 1或2中所闡述之序列。
  24. 如請求項22之用途，其中該成熟人類CD24多肽包含SEQ ID NO: 1中所闡述之序列。
  25. 如請求項22之用途，其中該成熟人類CD24多肽包含SEQ ID NO: 2中所闡述之序列。
  26. 如請求項22至25中任一項之用途，其中該CD24蛋白包含蛋白質標籤，其中該蛋白質標籤在該CD24蛋白之N端或C端融合。
  27. 如請求項26之用途，其中該蛋白質標籤包含哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之一部分。
  28. 如請求項27之用途，其中該哺乳動物Ig蛋白之該部分為Fc區。
  29. 如請求項28之用途，其中該Ig蛋白為人類的。
  30. 如請求項29之用途，其中該Fc區包含人類Ig蛋白之鉸鏈區及CH2及CH3域，該人類Ig蛋白係選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及IgA組成之群。
  31. 如請求項29之用途，其中該Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。
  32. 如請求項19至30中任一項之用途，其中該CD24蛋白之該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之序列。
  33. 如請求項32之用途，其中該CD24蛋白之該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 6中所闡述之序列。
  34. 如請求項32之用途，其中該CD24蛋白之該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 11中所闡述之序列。
  35. 如請求項32之用途，其中該CD24蛋白之該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 12中所闡述之序列。
  36. 如請求項32之用途，其中該CD24蛋白之該胺基酸序列由SEQ ID NO: 6、11或12中所闡述之該序列組成。
  37. 如請求項19至36中任一項之用途，其中該CD24蛋白使用真核蛋白質表現系統產生。
  38. 如請求項37之用途，其中該表現系統包含中國倉鼠卵巢細胞株中所含之載體或複製缺陷型反轉錄病毒載體。
  39. 如請求項38之用途，其中該複製缺陷型反轉錄病毒載體穩定整合至真核細胞之基因體中。
  40. 如請求項19至39中任一項之用途，其中該CD24蛋白係可溶性。
  41. 如請求項19至40中任一項之用途，其中該CD24蛋白經糖基化。
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