TW202015753A

TW202015753A - 以cd24預防及治療移植物抗宿主病及黏膜炎之方法

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Publication number: TW202015753A
Application number: TW108119240A
Authority: TW
Inventors: 陽劉; 盼鄭; 馬汀戴芬波特
Original assignee: 美商昂科免疫公司
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2020-05-01
Also published as: SG11202011964SA; CN112512640A; CN112752766A; MA52810A; IL279205A; KR20210021317A; AU2019282530A1; US11911441B2; US20210228680A1; MA52811A; EP3801773A1; EP3802583A4; JP2021527056A; AU2019282044A1; SG11202011963UA; EP3802583A1; IL279204A; EP3801773A4; MX2020013100A; MX2020013103A

Abstract

本發明係關於一種CD24蛋白質用於預防或治療移植物抗宿主病及黏膜炎之用途。

Description

以CD24預防及治療移植物抗宿主病及黏膜炎之方法

本發明係關於用於預防及治療移植物抗宿主病及黏膜炎之組合物及方法。

同種異體造血幹細胞移植(HCT)係成人中各種高風險白血病及骨髓發育不良之唯一確定之治癒療法。同種異體移植之重要功能係使用供者T細胞消除同種異體白血病細胞，此作用稱為GVL。然而，移植物抗宿主病(GVHD)係在來自供者幹細胞移植物之免疫勝任細胞針對宿主發動免疫攻擊時發生之危及生命之併發症。活化供者T細胞在以預備療法開始之發炎級聯反應之後會損傷宿主上皮細胞。確切風險視幹細胞來源、患者年齡、處理及所用GVHD預防法而定。發病率與人類白血球抗原(HLA)差異程度直接相關。急性GVHD之平均發作通常係在移植之後21至25天。發病率之範圍介於完全組織相容的相關供者移植物之接受者中之30-65%至不匹配造血細胞或來自無相關供者之造血細胞的接受者中之60%-80%。臍帶血移植與嗜中性球恢復較慢相關聯，且急性GVHD之發病率較低且發作較晚。使發病率增加之因素包含使用周邊血液而非骨髓作為造血細胞之來源及接受者年齡較大。慢性GVHD之平均診斷時間係在HLA相合同胞移植之後4.5個月及在無相關供者移植之後4個月。重生慢性GVHD在同種異體HCT之後2年後幾乎從不發生。

20多年來，鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如環孢靈(cyclosporine)及他克莫司(tacrolimus))與甲胺喋呤之組合仍為預防GVHD之護理標準。儘管常規施與免疫預防，但在大致30至65%之經歷HLA匹配之相關HCT之患者及60至80%之接受無相關供者HCT之患者中發生臨床上顯著的GVHD (II-IV級)。急性GVHD係HCT後之早期事件，且平均發作時間大致25至30天。在具有極重GVHD之患者中，死亡率超過90%。此情況之一種解釋係，一旦確定，則大於50%之患者對一線療法出現無效反應且皮質類固醇劑量高。表明具類固醇不應性或需要長期治療之患者存活率顯著減小。即使在結果良好時，高劑量之皮質類固醇仍為主要發病原因，因為感染及使患者處於顯著TRM風險下之失調均有增加。

因HCT處理療法(包含高劑量化學療法及/或全身照射(TBI))所致之宿主組織損傷被視為是發展成急性GVHD的第一個步驟。因處理療法所致之宿主組織損傷會導致釋放促炎性細胞介素(諸如TNF-α、IL-1β及IL-6)，且亦釋放損傷相關之分子模式(DAMP)及病原體相關分子模式(PAMP)。DAMP與PAMP可藉由結合至模式識別受體(PRR)活化抗原呈遞細胞(APC)，諸如樹突狀細胞(DC)。宿主APC隨後活化供者T細胞及免疫級聯反應，使得釋放促炎性細胞介素且擴增靶向宿主組織之抗原特異性同種異體反應性T細胞，從而產生GVHD。因此，特別關注的是，探究GVHD是否可藉由靶向宿主對組織損傷之反應及預防APC之活化(啟動GVHD中之關鍵過程)而減輕。

迄今為止，GVHD之治療及預防主要集中於經由活體內或離體方法藥理學抑制或消耗T細胞以限制介導組織損傷之同種異體反應性T細胞之擴增。儘管非選擇性T細胞消耗策略(例如抗胸腺細胞球蛋白)有效預防GVHD，但由於對復發、感染及移植排斥反應之抵消風險故其並不改良存活率。相反，藉由靶向單一促炎性細胞介素之更具選擇性的抑制尚未表明在治療GVHD上之臨床益處。因而，除消耗T細胞之抗體之外，並無生物製品被批准用於GVHD，且他克莫司與甲胺喋呤之組合仍為預防GVHD之護理標準。顯著未滿足之醫藥需求需要用於預防與治療GVHD之更具選擇性的生物學產物。

黏膜炎係導致消化道內層之黏膜發炎及潰瘍的用於癌症之化學療法及放射線療法治療之常見疼痛性副作用。其係由輻射/放射線療法(RT)或化學療法所致之組織損傷之結果。黏膜炎可發生於沿胃腸(GI)道之任何地方，但口腔黏膜炎係指發生於口腔中之特定發炎及潰瘍。經口及胃腸(GI)黏膜炎影響經歷阿糖胞苷及高劑量5-氟尿嘧啶、烷基化劑及基於鉑之化合物的高劑量化學療法之幾乎所有患者，及接受放射線療法之患有頭頸惡性疾病之大多數患者。輻射誘發之口腔黏膜炎(RIOM)發生於100%之非常規分次放射線療法頭頸癌患者中。罹患口腔黏膜炎之患者經歷可顯著妨礙患者之吞咽能力的重度疼痛、發炎、潰瘍及流血，由於癌症治療中斷，其亦可限制腫瘤控制。因此，口腔黏膜炎係見於經頭頸之化學療法及/或輻射療法的癌症患者中之重要不良作用。消化道黏膜炎增加死亡率及發病率且促使健康照護成本升高。在美國，每一患有頭頸癌之患者的RIOM經濟成本估算達至17,000.00 USD。

作為用於造血幹細胞移植(HCT)之處理療法之結果，經歷最深刻的黏膜炎負荷。HCT之治療療法包括預備療法，包括有或無全身照射(TBI)之高黏膜毒性化學療法，其需要在移植之前殺光接收者之癌性造血細胞。此預備療法在整個消化道中導致嚴重損傷。低級黏膜炎包括黏膜之紅斑及絮狀潰瘍或假膜。重度黏膜炎(等級≥3)與匯合潰瘍或假膜及微小外傷下之流血相關聯，其可進展為組織壞死、顯著自發性流血及危及生命之後果。接受HCT之患者中與黏膜炎相關之另一指示係口腔移植物抗宿主病(GVHD)，其係一種慢性GVHD之形式。如同化學療法及輻射誘發之黏膜炎一樣，口腔GVHD包括黏膜紅斑、潰瘍及疼痛性落屑性口腔病變。然而，口腔急性GVHD之真實臨床病例定義係由於若干因素故而尤其缺乏有或無同時輻射之處理化學療法，促使在HCT之後的前28天期間顯現口腔病變。

如所指示，GVHD、黏膜炎及相關適應症均涉及組織損傷要素。為對抗此等挑戰，在此項技術中需要有效治療及預防GVHD及黏膜炎之方法。

本文提供一種預防或治療有需要個體之移植物抗宿主病(GvHD)或黏膜炎之方法，其可包含向個體投與CD24蛋白質。本文亦提供CD24蛋白質於製造用於預防或治療個體之GvHD或黏膜炎之藥劑中之用途。該方法或用途可降低個體之III-IV級急性GvHD之風險。該個體可為人類。該個體可經歷或已經歷造血幹細胞移植(HCT)。該個體罹患癌症，該癌症可為急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓單核細胞性白血病(CMML)。

CD24蛋白質可以240 mg或480 mg之劑量投與。CD24蛋白質可在HCT之前或之後投與，且可在HCT之前一天投與。CD24蛋白質可投與多於一次，且可以每兩週一次之劑量投與。劑量可包含HCT之前一天的劑量、在HTC之後第14天的劑量及在HCT之後第28天的劑量，且劑量可分別為480 mg、240 mg及240 mg。

CD24蛋白質可包含在其N端或C端與哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之Fc區融合之成熟人類CD24多肽。成熟人類CD24多肽可包含以SEQ ID NO: 1或2所示序列。Ig蛋白質可為人類的。Fc區可包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA之鉸鏈區及CH2及CH3域。Fc區可包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。CD24蛋白質可包含以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列。CD24蛋白質之胺基酸序列可由以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列組成。CD24蛋白質可為可溶性的，且可醣基化。CD24蛋白質可使用真核表現系統製備，該真核表現系統可包含自哺乳動物細胞中之載體之表現。該細胞可為中國倉鼠卵巢細胞。

組織損傷可使得釋放促炎性細胞介素(諸如TNF-α、IL-1β及IL-6)，且亦釋放損傷相關之分子模式(DAMP)及病原體相關分子模式(PAMP)。DAMP與PAMP可藉由結合至模式識別受體(PRR)活化抗原呈遞細胞(APC)，諸如樹突狀細胞(DC)。宿主APC隨後活化供者T細胞及免疫級聯反應，使得釋放促炎性細胞介素且擴增靶向宿主組織之抗原特異性同種異體反應性T細胞。其係此等顯現GVHD且加重黏膜炎效應之事件。舉例而言，RIOM以放射線療法後之急性口腔黏膜、舌頭及咽發炎開始，其與多種發炎細胞之募集及發炎性細胞介素、趨化性介體及生長因子之釋放一致。

黏膜炎及GVHD中組織損傷之參與提供可探究藉由CD24Fc不利地調節宿主對DAMP之反應以用於GVHD療法的前景。發明人之臨床前研究已表明，CD24Fc特異性靶向小鼠模型，包括人類化小鼠模型中之DAMP介導之炎症且預防GVHD。重要的是，藥物具有優於習知免疫抑制劑之優勢，因為其不產生通用免疫抑止且使用高劑量之CD24Fc不阻斷非人類靈長類動物中之抗體反應。資料亦表明CD24Fc預防GVHD，但保留移植物抗白血病(GVL)效應，從而使其成為預防白血病患者中之GVHD之理想藥物。最終，發明人在非人類靈長類動物中之研究表明CD24Fc不抑止抗原特異性免疫反應，其表明CD24Fc不可能增加感染風險。

本發明人已發現，CD24之可溶形式對於預防移植物抗宿主病(GVHD)及相關病狀(諸如黏膜炎)以及預防HCT後之白血病復發非常有效。發明人亦發現在接受HCT療法之患者之中，CD24Fc產生重度黏膜炎(等級≥3)之劑量依賴性減小。此等效應可經由DAMP介導。模式識別與藉由PAMP及DAMP觸發之發炎反應有關。本發明人已意識到，近期研究已表明宿主對DAMP之反應加劇可能在發炎及自體免疫疾病之發病機制中起部分作用。發現DAMP在動物模型中促進發炎性細胞介素及自體免疫疾病產生，且因此發現DAMP抑制劑(諸如HMGB1及HSP90)改善類風濕性關節炎(RA)。TLRs、RAGE-R、DNGR(由Clec9A編碼)及巨噬細胞誘導C型凝集素(Mincle)已表明為負責介導由多種DAMP起始之發炎的受體。

發明人之近期著作表明CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用使針對DAMP之先天免疫力有別於針對PAMP之先天免疫力。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素蛋白質為識別多種含唾液酸結構之膜相關免疫球蛋白(Ig)超家族成員。大部分唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素具有細胞內免疫酪胺酸抑制基元(ITIM)，所述基元與SHP-1、SHP-2及Cbl-b締合以控制發炎反應之關鍵調節子。發明人已報導CD24為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(小鼠中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G及人體中之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10)之第一天然配位體。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G與唾液酸化CD24發生相互作用以經由SHP-1/2信號傳導機制抑止TLR介導之針對DAMP (諸如HMGB1)之宿主反應。

人類CD24為GPI錨定之小分子，其由CD24基因中240個鹼基對之開放閱讀框架編碼。在80個胺基酸中，最前面的26個構成信號肽，而最後23個充當裂解信號以實現GPI尾連接。因而，成熟人類CD24分子僅具有31個胺基酸。31個胺基酸中之一者在人類群體中係多晶型的。開放閱讀框架之核苷酸170處發生的C向T轉換引起成熟蛋白之殘基31處用纈胺酸(V)取代丙胺酸(A)。因為此殘基緊接裂解位點之N端，且因為置換係非保守的，所以此等兩個等位基因可以不同效率表現於細胞表面上。實際上，cDNA轉染研究表明，CD24^v 對偶基因更有效率地表現於細胞表面上。據此，CD24^v ^/ ^v PBL尤其在T細胞上表現更高量之CD24。

發明人已表明CD24負向調節針對細胞DAMP之宿主反應，所述細胞DAMP作為組織或器官損傷之結果而釋放，且至少兩種重疊機制可以解釋此活性。首先，CD24結合至若干DAMP，包括HSP70、HSP90、HMGB1及核仁素(nucleolin)，且抑制針對此等DAMP之宿主反應。為此，假定CD24可以截留發炎刺激以防止與其受體TLR或RAGE發生相互作用。其次，使用乙醯胺苯酚(acetaminophen)誘導之肝臟壞死及確保發炎之小鼠模型，發明人表明CD24經由與其受體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生的相互作用向針對組織損傷的宿主反應提供強大的負向調節作用。為獲得此活性，CD24可結合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G且由唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G刺激信號傳導，其中唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G締合之SHP1觸發負向調節。兩種機制均可協同作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的發炎反應。實際上，由CD24^-/- 或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G^-/- 小鼠之骨髓培養而得的DC當用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生更高量之發炎性細胞介素。據發明人所知，CD24係能夠制止DAMP觸發之發炎的唯一抑制性DAMP受體，且特異性靶向針對組織損傷之宿主發炎反應的藥物目前不可獲得。此外，發明人已使用RA、MS及GvHD之小鼠模型表明外源可溶性CD24蛋白質能夠緩解DAMP介導之自身免疫性疾病。 1. 定義.

本文所用之術語僅處於描述特定實施例之目的，且並不意欲限制本發明。除非上下文另有明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。

對於本文中數值範圍之敍述，明確涵蓋具有相同精確程度之在其之間的各間插數值。舉例而言，對於6-9之範圍，除6與9以外涵蓋數值7與8，且對於6.0-7.0之範圍，明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。

「肽」或「多肽」係連接之胺基酸序列且可為天然的、合成的，或天然與合成之修飾或組合。

「基本上一致」可意謂第一與第二胺基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個胺基酸之區域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。

當提及防止動物患病時，「治療(Treatment或treating)」意謂預防、抑止、抑制或完全消除疾病。預防疾病涉及在疾病發作之前向動物投與本發明組合物。抑止疾病涉及在疾病誘發之後，但在其臨床顯現之前，向動物投與本發明組合物。抑制疾病涉及在疾病臨床顯現之前向動物投與本發明組合物。

「變異體」可意謂胺基酸序列因胺基酸之插入、缺失或保守性取代而不同、但保持至少一種生物活性之肽或多肽。「生物活性」之代表性實例包括結合至鐸樣受體(toll-like receptor)及由特異性抗體結合之能力。變異體亦可意謂胺基酸序列與保持至少一種生物活性之參考蛋白質之胺基酸序列基本上一致的蛋白質。胺基酸保守性取代(亦即胺基酸由具有類似特性(例如帶電區域之親水性程度及分佈)之不同胺基酸置換)在此項技術中公認為通常涉及微小變化。如此項技術中所理解，此等微小變化可部分地藉由考慮胺基酸之親水指數而鑑別。Kyte等人, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。胺基酸之親水指數係基於其疏水性及電荷之考慮。此項技術中已知具有類似親水指數之胺基酸可經取代且仍保留持蛋白質功能。在一個態樣中，親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可用於展現將產生保持生物功能之蛋白的取代。在肽之情形下考慮胺基酸之親水性允許計算彼肽之最大局部平均親水性，此為已報導與抗原性及免疫原性充分關聯之一種適用量度。美國專利第4,554,101號，其以引用的方式完全併入本文中。如此項技術中所理解，具有類似親水性值之胺基酸的取代可產生保持生物活性(例如免疫原性)之肽。可使用親水值在彼此±2內的胺基酸進行取代。胺基酸之疏水指數與親水值均受彼胺基酸之特定側鏈影響。與彼觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代應理解為視胺基酸且尤其彼等胺基酸之側鏈的如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性展現之相對相似性而定。 2. CD24

本文提供一種CD24蛋白質，其可包含成熟CD24或其變異體。成熟CD24對應於CD24之細胞外域(ECD)。成熟CD24可來自人類或其他哺乳動物。如上文所述，成熟人類CD24蛋白質長達31個胺基酸且在其C末端具有可變丙胺酸(A)或纈胺酸(V)殘基。成熟CD24蛋白質可包含以下序列：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A) (SEQ ID NO: 1)

C末纈胺酸或丙胺酸可具有免疫原性且可自CD24蛋白質省去，由此可降低其免疫原性。因此，CD24蛋白質可包含缺乏C端胺基酸之成熟人類CD24之胺基酸序列：

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK (SEQ ID NO: 2)

儘管來自小鼠及人類之成熟CD24蛋白質之胺基酸序列存在相當大的序列變化，但其為功能等效物，因為人類CD24Fc已表明在小鼠中具有活性。人類CD24 ECD之胺基酸序列展示與小鼠蛋白質存在一些序列保守性(39%一致性；Genbank寄存編號NP_033976)。然而，不令人驚訝的是，由於CD24 ECD長度僅為27-31個胺基酸(視物種而定)，因此一致性百分比不會更高，且結合至其一些受體(諸如唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10/G)由其唾液酸及/或醣蛋白之半乳糖糖類介導。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10 (GenBank寄存編號AF310233)之胞外域與其鼠類同源物唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-G (GenBank寄存編號NP_766488)受體蛋白質之間的胺基酸序列一致性為63% (圖2)。由於小鼠與人類CD24之間的序列保守主要存在於C端及大量醣基化位點中，因此使用CD24蛋白質時可耐受成熟CD24蛋白質之顯著變異，尤其是彼等變異不影響C端之保守殘基或不影響小鼠或人類CD24之醣基化位點。因此，CD24蛋白質可包含成熟鼠類CD24之胺基酸序列：

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG (SEQ ID NO: 3)。

人類CD24 ECD之胺基酸序列展示與食蟹獼猴蛋白質存在之序列保守性(52%一致性；UniProt寄存編號UniProtKB-I7GKK1)大於小鼠。另外，鑒於以下情形，此不會令人驚訝：由於ECD在此等物種中之長度僅為29-31個胺基酸，因此一致性百分比不會更高，且糖殘基之作用為結合至其受體。獼猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10受體之胺基酸序列尚未測定，但人類與恆河猴唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10 (GenBank寄存編號XP_001116352)蛋白質之間的胺基酸序列一致性係89%。因此，CD24蛋白質亦可包含成熟獼猴(或恆河猴) CD24之胺基酸序列：

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA (SEQ ID NO: 10)

CD24蛋白質可具有可溶性。CD24蛋白質可進一步包含N端信號肽，該N端信號肽可自表現蛋白質之細胞分泌蛋白質。信號肽序列可包含胺基酸序列MGRAMVARLGLGLLLLALLLPTQIYS (SEQ ID NO: 4)。或者，信號序列可包含其他跨膜或所分泌蛋白質上所發現之彼等信號序列或此項技術中已知之現有信號肽經修飾的彼等信號序列中之任一者。 a. 融合物

CD24蛋白質可在其N或C末端與蛋白質標籤融合，該蛋白質標籤可包含可來自人類或小鼠或其他物種之哺乳動物Ig蛋白質的一部分。該部分可包含Ig蛋白質之Fc區。Fc區可包含Ig蛋白質之鉸鏈區、CH2、CH3及CH4域中之至少一者。Ig蛋白質可為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA，且Fc區可包含Ig之鉸鏈區及CH2及CH3域。Fc區可包含人類免疫球蛋白G1 (IgG1)同型SEQ ID NO: 7。Ig蛋白質亦可為IgM，且Fc區可包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。蛋白質標籤可為有助於蛋白質純化之親和標籤，及/或增強功能性蛋白溶解性及回收率之溶解性增強標籤。蛋白質標籤亦可提高CD24蛋白質之價數。蛋白質標籤亦可包含GST、His、FLAG、Myc、MBP、NusA、硫氧還蛋白(TRX)、小泛素樣調節劑(SUMO)、泛素(Ub)、白蛋白或駱駝科Ig。用於製備融合蛋白且純化融合蛋白之方法在此項技術中已熟知。

根據臨床前研究，對於實例中所鑑別之融合蛋白CD24Fc之構築，使用30個胺基酸之天然CD24分子之截短形式，其在GPI信號裂解位點之前缺乏最終多晶型胺基酸(亦即具有SEQ ID NO: 2之成熟CD24蛋白質)。使成熟人類CD24序列融合至人類IgG1 Fc域(SEQ ID NO: 7)。全長CD24Fc融合蛋白之序列以SEQ ID NO: 5提供(圖1A)，且自細胞分泌之CD24Fc融合蛋白之經處理版本的序列(亦即缺乏裂解開之信號序列)以SEQ ID NO: 6提供。與IgG1 Fc融合之成熟CD24之經處理多晶型變異體(亦即，具有SEQ ID NO: 1之成熟CD24蛋白質)可以SEQ ID NO: 11或12所示之包含胺基酸序列。 b. 產生

CD24蛋白質可在很大程度上醣基化，且可涉及CD24功能，諸如免疫細胞之協同刺激及與損傷相關分子模式分子(DAMP)之相互作用。CD24蛋白質可使用真核表現系統製備。表現系統可需要載體在哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現。系統亦可為病毒載體，諸如可以用於感染真核細胞之複製缺乏型反轉錄病毒載體。CD24蛋白質亦可由穩定細胞株產生，該細胞株經由已整合至細胞基因組中之載體或載體之一部分表現CD24蛋白質。穩定細胞株可經由所整合之複製缺乏型反轉錄病毒載體表現CD24蛋白質。表現系統可為GPEx™。 c. 醫藥組合物

CD24蛋白質可包含於醫藥組合物中，該醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之量的CD24蛋白質。醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物可包含使CD24蛋白質在延長的時段保持穩定的溶劑。該溶劑可為PBS，其可使CD24蛋白質在-20℃(-15至-25℃)下保持穩定至少66個月。溶劑能夠容納CD24蛋白質與其他藥物之組合。

醫藥組合物可經調配用於非經腸投與，包括(但不限於)注射或連續輸注。注射用調配物可呈於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且可含有包括(但不限於)懸浮劑、穩定劑及分散劑之調配劑。該組合物亦可以粉末形式提供，以便用包括(但不限於)無菌無熱原質水之適合的媒劑復原。

醫藥組合物亦可調配成儲槽式製劑，其可藉由植入或藉由肌肉內注射投與。該組合物可用適合的聚合物質或疏水性物質(例如呈可接受之油中之乳液)、離子交換樹脂或微溶性衍生物(例如呈微溶性鹽)調配。皮下注射用調配物對於如狼瘡之適應症及其相關病症與併發症係特別適合的。 3. 治療方法 a. GVHD

本文進一步提供一種藉由向有需要個體投與CD24蛋白質來預防、減輕或治療個體中移植物抗宿主病(GVHD)之方法。個體具有GVHD或處於發展GVHD之風險。個體可經歷或正經歷造血幹細胞移植(HCT)。CD24蛋白質可以預防性方式用以預防經歷HCT之個體的GVHD。GVHD可為急性GVHD。CD24蛋白質可降低個體中III至IV級急性GVHD之風險。GVHD可為慢性GVHD，包括口腔GVHD。

個體可能罹患癌症。癌症可為急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓單核細胞性白血病(CMML)。 b. 黏膜炎

本文提供一種藉由向有需要個體投與CD24蛋白質中預防、減輕或治療個體中黏膜炎之方法。本文亦描述一種藉由向有需要個體投與CD24蛋白質預防、減輕或治療個體中與GVHD或HCT相關聯之其他病狀之方法。相關病狀可為黏膜炎，其可為口腔黏膜炎。黏膜炎係消化道內層之黏膜之疼痛性發炎及潰瘍，通常為HCT之預備化學療法及/或放射線療法之副作用。黏膜炎可發生於沿胃腸(GI)道之任何地方。口腔黏膜炎係指口腔中發生之特定發炎及潰瘍。口腔黏膜炎係癌症治療之常見且通常虛弱的併發症。許多造血幹細胞移植接受者經歷黏膜炎，其口腔黏膜炎最常見且最虛弱。

個體可能罹患黏膜炎或處於發展黏膜炎之風險，該黏膜炎可為口腔黏膜炎。個體可經歷或正經歷化學療法及輻射療法中之至少一者。CD24蛋白質可以預防性方式用以預防個體之黏膜炎。CD24蛋白質可降低個體中重度黏膜炎之風險。 c. 藥物

亦提供CD24蛋白質於製造用於如本文所述用途之藥劑中之用途。 d. 給藥方案

視對GVHD或黏膜炎之所需作用及投與途徑而定，投與之CD24蛋白質之劑量可為0.01 mg/kg至1000 mg/kg，且可為1至500 mg/kg。CD24蛋白質可藉由靜脈內(IV)輸注或藉由皮下、壁內(亦即在腔室或器官壁內)或腹膜內注射投與。劑量可為10-1000 mg、10-500 mg、240 mg或480 mg，當個體係人類之情況下其尤其適合。

CD24蛋白質可在幹細胞移植之前或之後投與。CD24蛋白質可在幹細胞移植之前1-4天，尤其1天投與。CD24蛋白質亦可在幹細胞移植之前或之後以多次劑量投與。CD24蛋白質可以2、3、4、5或6個每兩週一次劑量投與。CD24蛋白質之各劑量可為240 mg或480 mg。第一劑量可相對於幹細胞移植當天(第0天)在第-4天至第0天投與，且尤其可在第-1天投與。後續劑量可在此後每9-19或11-17天投與。第二劑量可相對於幹細胞移植當天在第+9至+19天或第+11至+17天，尤其第+14天投與。第三劑量可相對於幹細胞移植當天在第+18至+38天、第+23至+33天或第+22至+34天，尤其第+28天投與。詳言之，CD24蛋白質可每兩週一次分別相對於幹細胞移植當天在第-1天、第+14天及第+28天投與480 mg、240 mg及240 mg，投與三次。CD24蛋白質尤其可為CD24Fc。

CD24蛋白質可在向個體投與之化學療法及輻射療法中之至少一者之前或之後投與。可投與CD24蛋白質以使得其在DAMP釋放時存在。 e. 組合治療

可向個體投與CD24蛋白質與GVHD預防之護理標準組合。GVHD預防之護理標準可包含投與甲胺喋呤加鈣調神經磷酸酶抑制劑，諸如他克莫司(普樂可複(Prograf)，FK506)或環孢靈(山地明(Sandimmune)，Neoral)。他克莫司可相對於幹細胞移植當天在第-3天投與，且可藉由靜脈內或經口(PO/orally)投與。對於呈不斷輸注形式之靜脈內給藥，起始劑量根據經調節體重可為0.03 mg/kg/天。對於經口給藥，起始劑量可為每劑量0.045 mg/kg，每天兩次。若個體不可耐受他克莫司，則可向個體靜脈內投與劑量為靜脈內他克莫司劑量之100倍的環孢靈(例如3 mg/kg/天之起始劑量)。亦可經口投與劑量為靜脈內劑量之3倍的環孢靈。當使用Neoral品牌時，由於生物可用性較大，故可經口投與靜脈內劑量之2倍的環孢靈。

在不存在GVHD下，可監測僅在移植後的前100天期間用於治療性給藥之他克莫司含量。他克莫司之治療目標最低含量可為5-15 ng/mL。在CD24蛋白質輸注後的第一週(第0天至第7天)可監測他克莫司含量最少三次(例如每48-72小時)。在不存在GVHD或復發下，在移植後第+100天他克莫司可開始逐漸減少。在存在GVHD下，他克莫司可以治療性給藥持續。

甲胺喋呤可與他克莫司組合用於標準GVHD預防。可在HCT之後第1天每天一次靜脈內投與劑量為每劑量15 mg/m² ，且在HCT之後第3、6及11天劑量為每劑量10 mg/m² 之甲胺喋呤。

對於黏膜炎，可投與CD24蛋白質與至少一種免疫調節劑(亦即非CD24蛋白質)以使惡化的發炎組分減至最小。CD24蛋白質可與別嘌呤醇組合投與以用於用5-氟尿嘧啶治療之個體。

CD24蛋白質可與以下清髓性處理療法中之一或多者組合投與，且可在處理療法之前或期間投與。可投與CD24蛋白質以使得其在響應於清髓性處理療法及HCT中之至少一者釋放DAMP時存在。

白消安 ( Busulfan ) 及氟達拉賓 ( fludarabine )

白消安可相對於幹細胞移植當天在第-5至-2天投與。劑量可為3.2 mg/kg/天或130 mg/m² /天，且可靜脈內投與。總劑量可為12.8 mg/kg或520 mg/m² 。氟達拉賓可相對於幹細胞移植當天在第-5至-2天投與。劑量可為30-45 mg/m² /天，且總劑量可為120-180 mg/m² 。白消安及氟達拉賓之序列及時序可根據用於此項技術中已知之清髓性處理之機構標準實現。

白消安及環磷醯胺 ( cyclophosphamide )

布舒凡(Bulsulfan)可相對於幹細胞移植當天在第-7至-4天投與。劑量可為3.2 mg/kg/天或130 mg/m² /天，且可靜脈內投與。總劑量可為12.8 mg/kg或520 mg/m² 。環磷醯胺可相對於幹細胞移植當天在第-3至-2天投與。劑量可為60 mg/kg/天，且總劑量可為120 mg/kg。

環磷醯胺及全身照射

全身照射(TBI)可相對於幹細胞移植在第-7至-4天投與。環磷醯胺可相對於幹細胞移植當天在第-3至-2天投與。劑量可為60 mg/kg/天，且總劑量可為120 mg/kg。環磷醯胺、TBI及用於清髓性療法之TBI投與實踐之序列可根據用於此項技術中已知之清髓性處理之機構標準實現。

CD24蛋白質亦可由上文所述之個別清髓性治療或其組合投與。實例1 小鼠中之CD24藥物動力學

將1 mg CD24Fc(CD24Fc)注射至未處理C57BL/6小鼠中且在不同時間點(5分鐘、1小時、4小時、24小時、48小時、7天、14天及21天)收集3隻小鼠在每個時間點的血液樣品。將血清1:100稀釋且使用夾心ELISA、使用純化抗人類CD24(3.3 μg/ml)作為捕獲抗體及過氧化酶結合之山羊抗人類IgG Fc (5 μg/ml)作為偵測抗體來偵測CD24Fc含量。如圖3a中所示。CD24Fc之衰減曲線揭露蛋白質出現典型雙相衰減。第一生物分佈相具有12.4小時之半衰期。第二相遵循自中樞腔室發生一級消除之模型。第二相之半衰期為9.54天，其與活體內抗體半衰期類似。此等資料表明融合蛋白在血流中極穩定。在皮下注射融合蛋白之其他研究中，觀測到幾乎相同之9.52天半衰期(圖3b)。更重要的是，儘管CD24Fc在血液中耗費約48小時達至峰值含量，但如藉由AUC所量測，任一注射途徑所引起之融合蛋白在血液中的總量基本上相同。因此，自治療觀點，使用不同的注射途徑不應影響藥物之治療效果。此觀察結果大大簡化了用於靈長類動物毒性及臨床試驗之實驗設計。實例2 CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10在針對組織損傷之宿主反應中相互作用

近二十年前，Matzinger提出何物通俗地稱為危險理論。本質上，她辯稱免疫系統在其感測到宿主存在危險時開啟。儘管危險性質不能及時明確界定，但已確定壞死與細胞內組分(諸如HMGB1及熱休克蛋白質，稱為DAMP，即危險相關分子模式)之釋放相關。發現DAMP促進發炎性細胞介素產生及自體免疫疾病。在動物模型中，發現HMGB1及HSP90之抑制劑改善RA。DAMP之參與提高了可探究針對DAMP之宿主反應之負向調節用於RA療法的前景。

使用乙醯胺苯酚誘發之肝臟壞死及確保發炎，觀測到CD24經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G相互作用向針對組織損傷之宿主反應提供強大的負向調節。CD24為GPI錨定分子，其廣泛地表現於造血細胞及其他組織幹細胞中。對人類之多種自體免疫疾病(包括多發性硬化症、全身紅斑狼瘡、RA及巨細胞關節炎)進行之遺傳分析表明，CD24多形現象與自體免疫疾病風險之間存在顯著的關聯。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G係I-凝集素家族之成員，此根據其識別含唾液酸結構之能力界定。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G識別CD24上之含唾液酸結構且負向調節樹突狀細胞產生發炎性細胞介素。人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10及小鼠唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G就其與CD24相互作用之能力而言，在功能上為等效的。然而，不清楚小鼠與人類同源物之間是否存在一對一相關性。儘管機制仍待充分闡明，但唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集G締合之SHP1可能涉及負向調節。此等資料產生一種新模型，其中CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10相互作用可在區分病原體相關分子模式(PAMP)與DAMP方面起關鍵作用(圖4)。

至少兩種重疊機制可解釋CD24之功能。首先，藉由結合至多種DAMP，CD24可截留發炎刺激以防止其與TLR或RAGE發生相互作用。此觀點由如下觀測結果支持：CD24與若干DAMP分子(包括HSP70、90、HMGB1及核仁素)締合。其次，或許在與DAMP締合之後，CD24可刺激唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之信號傳導。兩種機制均可協同作用，因為任一基因發生靶向突變之小鼠產生強得多的發炎反應。實際上，由CD24-/-或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G-/-小鼠之骨髓培養而得的DC在用HMGB1、HSP70或HSP90刺激時產生高得多的發炎性細胞介素。相比之下，發現在其針對PAMP (諸如LPS及PolyI:C)之反應方面無作用。此等資料不僅提供先天免疫系統區分病原體與組織損傷的機制，而且表明CD24及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G為與組織損傷相關之疾病的潛在治療目標。實例3 CD24Fc與HMGB1、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10相互作用且誘導唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G與SHP-1之間締合

為了量測CD24Fc與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之間的相互作用，吾人將CD24Fc固定於CHIP上且使用Biacore量測不同濃度之唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-10Fc的結合情況。如圖5a中所示，CD24Fc以1.6×10^- ⁷ M之Kd結合唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10。其親和力為對照Fc的100倍。CD24Fc與HMGB1之間的相互作用藉由使用CD24Fc結合之蛋白質G珠粒的吸引實驗、隨後藉由使用抗IgG或抗HMGB1的西方墨點法證實。此等資料表明CD24Fc(而非Fc)結合至HMGB1且此結合具有陽離子依賴性(圖5b)。為了確定CD24Fc是否為唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之小鼠對應物)之促效劑，吾人用CD24Fc、對照Fc或媒劑(PBS)對照刺激CD24-/-脾細胞30分鐘。接著使唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生免疫沈澱且用抗磷酸化酪胺酸或抗SHP-1探測。如圖5c中所示，CD24Fc誘導唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生實質磷酸化且誘導SHP-1 (後天與先天免疫力的公認抑制劑)締合。

CD24Fc之活體外功效研究.

為了研究CD24Fc對人類T細胞產生發炎性細胞介素的影響，人類PBML中的成熟T細胞在不同濃度之CD24Fc或人類IgG1 Fc存在下用抗CD3抗體(OKT3)(常用的T細胞受體促效劑)活化。四天後，收集上清液且藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測IFN-γ及TNF-α之產生以證實活化。圖6中之結果表明相較於對照IgG Fc對照物，來自兩個不同製造批次之CD24Fc使活化人類PBML的IFN-γ及TNF-α產生顯著減少。另外，當添加CD24Fc時，細胞介素產生以劑量依賴性方式受到抑制。因此，CD24Fc可在活體外抑制抗CD3誘導之人類PBML活化。此研究不僅表明CD24Fc之作用機制可經由T細胞活化之抑制，而且為藥物效能及穩定性測試確立了可靠的生物分析。

為確定CD24Fc是否調節人類細胞株產生發炎性細胞介素，吾人首先使用RNAi使人類急性單核球性白血病THP1細胞株中之CD24靜默，且接著藉由PMA處理其而誘導分化成巨噬細胞。如圖7a中所示，CD24靜默使TNFα、IL-1β及IL-6之產生大幅度增加。此等資料表明內源人類CD24在限制發炎性細胞介素產生方面起主要作用。重要的是，CD24Fc恢復抑制CD24靜默細胞系中之TNFα (圖7b)以及IL-1β及IL-6。此等資料不僅表明CD24在人類細胞發炎反應中之相關性，而且為評定CD24Fc生物活性提供了簡單分析。

綜合而言，此等資料表明CD24Fc能夠抑制後天及先天刺激所觸發之細胞介素產生。然而，由於藥物在藉由固有效應子減少細胞介素產生方面有效得多，因此吾人認為其預防功能之主要機制為在移植早期防止組織損傷觸發發炎。實例4 CD24在人類中之藥物動力學

此實例展示CD24蛋白質在人類中之藥物動力學分析。此來源於I期、隨機分組、雙盲、安慰劑對照、單次遞增劑量研究，以評定CD24Fc在健康男性及女性成年個體中之安全性、耐受性及PK。此研究中招募了總計40位個體，分5組，每組8位個體。每組8位個體中有六位接受研究藥物且2位個體接受安慰劑(0.9%氯化鈉生理食鹽水)。第一組給與10 mg。後續幾組接受30 mg、60 mg、120 mg及240 mg CD24Fc或匹配安慰劑且間隔至少3週給藥，以便審查先前每組之安全性及耐受性資料。僅當安全性及耐受性已得到充分證明時才允許向新一組個體投與下一個較高劑量。

第1天，各組中初始2位個體1位係研究藥物接受者且1位係安慰劑接受者。第7天之後(各子組之間最少相隔24小時)，向第3至第5位個體及第6至第8位個體給藥。同一子組中之各個體相隔至少1小時給藥。必要時，其餘個體延遲給藥，對給藥後期間可能出現之涉及彼組之第一或第二子組的任何重大安全問題審查後再定。前一組之後至少3週，向後一組給藥。

篩檢期 ：

主動治療期開始之前至多21天進行篩檢問診(第1次問診)。個體在提供知情同意書之後，進行合格篩檢程序。

治療期 ：

個體在第-1天獲准進入臨床藥理單元(Clinical Pharmacology Unit，CPU)(第2次問診)，且隨機化治療期始於最短10小時隔夜禁食之後的第1天。個體隨機分配以CD24Fc或安慰劑單次劑量治療。個體被禁閉直至第4日晨。

隨訪：

所有個體在第7天、第14天、第21天、第28天及第42天(±1天)返回至CPU接受隨訪問診(第3次問診、第4次問診、第5次問診、第6次問診及第7次問診)。第7次問診係所有個體之最後一次問診。

治療持續時間 ：各個體之總研究持續時間係至多63天。在第1天投與單次劑量。

個體數目：

計劃：40位個體

篩檢：224位個體

隨機：40位個體

完成：39位個體

中斷：1位個體

診斷及主要納入準則 ：此研究用之群體係年齡在18歲與55歲之間(包括端值)的健康男性及女性，其身體質量指數在18 kg/m² 與30 kg/m² 之間(包括端值)。

研究產品及比較資訊：

CD24Fc：經由靜脈內輸注投與之10 mg、30 mg、60 mg、120 mg或240 mg單次劑量；批號：09MM-036。CD24Fc係完全人類化融合蛋白，其由人類CD24之成熟序列及人類免疫球蛋白G1之可結晶片段區(IgG1Fc)組成。CD24Fc作為無菌、透明、無色、無防腐劑水溶液供應用於靜脈內投與。CD24Fc調配為單次劑量注射溶液，其濃度為10 mg/mL且pH為7.2。各CD24Fc小瓶含有於16 mL ± 0.2 mL CD24Fc中之160 mg CD24Fc、5.3 mg氯化鈉、32.6 mg磷酸氫二鈉七水合物及140 mg磷酸二氫鈉單水合物。CD24Fc在具有氯丁基橡膠塞及易拉鋁密封蓋之透明硼矽酸鹽玻璃小瓶中供應。

經由靜脈內輸注投與之匹配安慰劑(0.9%氯化鈉生理食鹽水)；批號：P296855、P311852、P300715、P315952。

治療意願(ITT)群體由接受至少1次劑量之研究藥物的所有個體組成。ITT群體係用於個體資訊及安全性評估之主要分析群體。

臨床實驗室評估(化學、血液學及尿分析)係依據治療及問診來概述。亦概述相對於基線之改變。藉由治療及時間點概述生命徵象(血壓、心跳速率、呼吸速率及溫度)。亦概述相對於基線之改變。列舉所有身體檢查資料。概述心電圖參數及相對於基線之改變。列舉總體解釋。

血漿 CD24Fc 濃度

如圖8中所示，CD24Fc之平均血漿濃度按比例增加至所投與之CD24Fc劑量。對於除120 mg外之所有劑量組而言，CD24Fc在給藥後1小時達至最大平均血漿濃度。對於120 mg組而言，在給藥後2小時下達至CD24Fc之最大平均血漿濃度。截至第42天(984個小時)，所有群組之CD24Fc之平均血漿濃度已降低至最大平均血漿濃度之2%與4%之間。

表1概述PK可評估群體經治療之血漿CD24Fc PK參數。表1 經治療之血漿CD24Fc藥物動力學參數之概述 - PK可評估群體

血漿 CD24Fc 劑量比例分析

圖9展示PK可評估群體之CD24Fc C_max 相對於劑量的劑量比例圖。圖10展示PK可評估群體之CD24Fc AUC₀ _- _42d 相對於劑量之劑量比例圖。圖11展示PK可評估群體之CD24Fc AUC₀ _- _inf 相對於劑量之劑量比例圖。表2展示劑量比例之冪分析。表2 劑量比例之冪分析：血漿CD24Fc藥物動力學參數 - PK可評估群體

C_max 斜率估算值係1.172，90% CI係1.105至1.240。AUC₀ _- _42d 斜率估算值係1.088，90% CI係1.027至1.148。AUC₀ _- _inf 斜率估算值係1.087，90% CI係1.026至1.1。

藥物動力學結論

在小鼠、猴及人類中，血漿CD24Fc之C_max 及AUC相對於所投與劑量按比例增加。血漿CD24Fc在1.01與1.34小時之間達到T_max 。血漿CD24Fc之t_½ 範圍在280.83與327.10小時之間。實例5 CD24可用以治療人類個體之移植物抗宿主病

執行多中心、前瞻性、雙盲、隨機分組、安慰劑對照IIa期劑量遞增試驗以評估將CD24蛋白質CD24Fc添加至經歷同種異體清髓性造血幹細胞移植(HCT)之癌症患者的急性GVHD預防之護理標準中。試驗設計展示於圖12中。

IIa期研究之主要目的包含評定患者中CD24Fc與甲胺喋呤及他克莫司預防之組合的安全性及耐受性，其中該患者清髓性處理之後經歷匹配之無關供者HCT，且界定出2期推薦劑量(RP2D)或最大耐受劑量(MTD)。另外，IIa期研究中之次要功效目的包含：

• 確定在HCT之後第100天，將CD24Fc添加至標準GVHD預防甲胺喋呤及他克莫司中是否降低II-IV級aGVHD之累積發病率

• 估算在HCT之後，第180天無II-IV級aGVHD之存活率(GFS)，

• 描述第1年cGVHD (cGVHD)之發病率

• 描述HCT之後一年的復發發病率

• 描述HCT之後一年的移植相關死亡(TRM)之發病率

• 描述HCT之後第100天的感染比率

• 評估HCT之後一年的總存活率(OS)、不存在III-IV級GVHD及未復發存活率

• 評估包括口腔黏膜炎及器官衰竭之處理毒性

其他目的包含評定CD24Fc之物動力學(PK)概況、檢查CD24Fc及安慰劑組中HCT後之免疫細胞概況及APC及T細胞之功能反應、及評定CD24Fc及安慰劑組中之藥效動力學(PD)生物標記，諸如促炎性細胞介素、DAMP、脂質及GVHD生物標記之血漿濃度。

試驗招募病患，該等病患係根據機構實踐來接受來自經歷同種異體HCT匹配之無相關供者的移植物。經歷用於惡性血液病狀之匹配之無相關供者同種異體HCT且卡諾夫斯基效能評分≥70%的年齡在18與70歲之間的患者符合研究條件。無相關供者與HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1之接受者之間需要8/8 HLA等位基因匹配。限制對接受來自無相關供者之HCT的患者之研究預計會限制異源性且有助於用於後續功效評定之aGVHD發病率之統計學評估，在此群體中得到II-IV級aGVHD (60-80%)及III-IV級aGVHD (20-35%)之較大發病率。

此試驗排他性地採用清髓性處理療法及包括他克莫司及甲胺喋呤之預防之護理標準(SOC)，因為此等患者經歷最嚴重的組織損傷且在此環境中藥物可能具有最強生物效應。所有患者根據IIa期方案接受清髓性處理及用甲胺喋呤及他克莫司之GVHD預防之護理標準。如由治療醫師所判定，患者接受由氟達拉賓及白消安(Flu/Bu 4)或環磷醯胺及全身照射(Cy/TBI)組成之清髓性處理療法，之後在第0天輸注幹細胞。將GVHD預防施與所有患者，且由他克莫司(在移植之前第-3天開始)及甲胺喋呤(在移植之後第+1天開始)與治療組中之CD24Fc或安慰劑組中之生理食鹽水之組合組成。在不存在GVHD下，在第+100天他克莫司開始逐漸減少。供者幹細胞之來源係周邊血液幹細胞(PBSC)或骨髓(BM)。

IIa期試驗除GVHD預防之SOC以外包含CD24Fc之兩個單次遞增劑量組(240 mg及480 mg)及單一多次劑量組，如以下表3中所概述。如圖13中所示，在單次劑量組中，研究藥劑CD24Fc相對於幹細胞移植當天在第-1天靜脈內投與。在多次劑量組中，患者接受480 mg (第-1天)、240 mg (第+14天)及240 mg (第+28天)之3個每兩週一次投與CD24Fc。基於CD24Fc之PK資料，此每兩週一次給藥時段將經過多於兩個半衰期。給藥係根據固定量，並非根據重量或BSA。各給藥組使用3:1比率(6為CD24Fc個體及2為安慰劑個體)隨機分組設計招募8位個體，總計招募24位患者。表3 2a期劑量遞增計劃

表4列舉CD24Fc及安慰劑組中之患者的人口統計學資訊及臨床特徵，其在諸如年齡、惡性病及共同罹病率之風險因素上相對平衡。CD24Fc與安慰劑組中之最常見惡性病係AML/MDS (66.7%及83.3%)。CD24Fc組中72%及安慰劑組中50%之患者具有中等或高之共同罹病指數。在兩個組中，與骨髓相比，PBSC更常用作移植物來源，且兩個組上Flu/Bu 4係最常見的處理療法。對均在CD24Fc組中之四位患者進行Cy/TBI處理。表4 2a期患者特徵

研究之主要目的係：評估CD24Fc在經歷清髓性同種異體造血細胞移植(HCT)之個體中的之安全性及耐受性；及確定CD24Fc在經歷HCT之患者中的II期推薦劑量(RP2D)或最大耐受劑量(MTD)。

研究中招募之所有患者已完成治療期，該治療期對於單劑量組係用CD24Fc治療之第一天直至HCT之後30天，或對於多次劑量組直至HCT之後60天(確切天數可視投與研究藥物之最後一天而不同，不構成偏差)，且係不良事件(AE)(包括可能與研究藥物相關之劑量限制毒性)之評定及報導時段。表5提供2a期試驗中觀測到之毒性之概述。總體而言，此研究表明在治療意願(ITT)群體中，靜脈內投與多達480 mg之CD24Fc一般具有良好耐受性。尚未觀測到可歸因於或可能可歸因於研究藥物之輸注毒性、劑量限制性毒性(DLT)或SAE，且並未自研究移除患者。

所有24位招募之個體均在移植之後植入，如圖14中所示。在CD24Fc暴露及安慰劑患者中，嗜中性球分別在HCT之後平均13.0及15.5天植入。在CD24Fc暴露及安慰劑患者中，血小板分別在HCT之後平均13.0及15.0天植入，但其中安慰劑組中有一位患者之血小板並未植入且在第49天死亡。並無移植失敗之病例。在CD24Fc暴露患者中，第+30天之平均CD3嵌合係82.5% (38-100%之範圍)且在安慰劑組中係82.0% (62-91%之範圍)(圖15)。在CD24Fc暴露患者中，第100天之平均供者CD3嵌合增加至86% (42%-100%之範圍)，且在安慰劑組中係84% (17%-100%之範圍)。在CD24Fc與安慰劑組中，第30天及100天之供者CD33嵌合係100%。表5 毒性之概述

2a期研究之功效分析視為次要的且包括以下：描述HCT之後第180天的無III-IV級急性GVHD存活率(GFS)；描述HCT之後第100天的II-IV級急性GVHD之累積發病率；描述HCT之後第180天的III-IV級GVHD未復發存活率；描述HCT之後第180天的II-IV級急性GFS；描述HCT之後一年的慢性GVHD之發病率；描述HCT之後一年的復發發病率；描述HCT之後一年的移植相關死亡(TRM)之發病率；描述HCT之後第100天的感染比率；評估HCT之後一年的總存活率(OS)及無疾病存活率(DFS)。

除包括IIa期研究中之安慰劑組以外，在2012年1月至2017年11月之時段，自在相同清髓性處理及GVHD預防療法之後經歷匹配之無相關供者HCT的相同機構(減去實驗療法CD24Fc)收集同期對照(N = 92)之資料。包括同期對照組，在安慰劑對照組中提供小數目之患者。同期對照組中92位成年患者之人口統計學資料概述於表6中。表6 同期對照組中招募之患者的特徵

表7及8提供2a期研究之臨床結果之概述。急性GVHD根據國際CIBMTR招募處及血液及骨髓移植臨床試驗網路所採用之共識準則分級且每週進行記錄。在HCT之後在第0天至第100天評估患者接受HCT後之aGVHD。表7 臨床結果之概述，包括II-IV級及III-IV級aGVHD之累積發病率.

*在180天之後死亡(n=2)：1組，肺炎2/2感染(d 210)；及2組，CMML之復發(d 196) 表8 臨床結果之概述

第 100 天之 II 至 IV 級急性移植物抗宿主病之發病率

表9概述mITT群體之第100天之II至IV級急性GVHD之累積發病率。總計，接受CD24Fc之7位(38.9%)患者(240 mg CD24Fc單次劑量組中之2位[33.3%]患者，480 mg CD24Fc單次劑量組中之3位[50.0%]患者，及960 mg CD24Fc多次劑量組中之2位[33.3%]患者)及1位(16.7%)接受安慰劑之患者具有第100天之II至IV級急性GVHD。另外，1位(16.7%)接受安慰劑之患者死亡但無第100天之II至IV級急性GVHD。在第100天當天或之前，在其最後一次急性GVHD評定時設限存活且不發生第100天II至IV級急性GVHD之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。表9 第100天之II至IV級急性移植物抗宿主病之累積發病率 - mITT群體

總體而言，對於CD24Fc治療組，第100天之II至IV級GVHD之累積發病率(具有95% CI)係38.9%(16.8%，60.7%)，且對於安慰劑組係16.7% (0.5%，54.9%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係2.6 (0.5，14.7)。在同期對照中，II-IV級aGVHD之累積發病率係50%。在CD24Fc治療組中，四個II級aGVHD病例僅涉及皮膚且兩個病例涉及皮膚及上部胃腸(GI)道。在安慰劑組中不存在II級aGVHD之病例。

第 180 天之無 II - IV 級急性移植物抗宿主病之存活率

表10概述mITT群體之第180天之II至IV級急性GFS。在任何治療組中均未達到中值II至IV級急性GFS卡本-麥爾估算值。總體而言，CD24Fc治療組之第180天之II至IV級急性GFS比率(具有95% CI)係61.1% (35.3%，79.2%)，且安慰劑組係50.0% (11.1%，80.4%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.8 (0.3，2.5)。在第180天當天或之前，在其最後一次急性GVHD時評定期設限存活且無記錄在資料截止日期發生II至IV級急性GVHD之患者。除小樣本量以外，設限各治療組中至少50.0%之患者。表10 第180天之無II至IV級急性移植物抗宿主病存活率 - mITT群體

mITT 群體之第 180 天之 III 至 IV 級急性 GFS

如表11中所示，總計，1位(5.6%)接受CD24Fc之患者(480 mg CD24Fc單次劑量組中之1位[16.7%]患者)及2位(33.3%)接受安慰劑之患者具有第180天之III至IV級急性GVHD。總體而言，CD24Fc治療組之第180天之III至IV級急性GFS比率(具有95% CI)係94.4% (66.6%，99.2%)，且安慰劑組係50.0% (11.1%，80.4%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.1 (0.0，0.7)。在第180天當天或之前，在其最後一次急性GVHD評定期設限存活且無記錄在資料截止日期發生III至IV級急性GVHD之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。同期對照組之第180天之III至IV級急性GFS比率係24%。圖25展示與安慰劑對照組(圖25A)及同期對照組(圖25B)相比，CD24Fc組之第180天無III-IV級GVHD存活率。表11 第180天之無III至IV級急性移植物抗宿主病存活率 - mITT群體

與同期組對照中觀測到之50%反應速率相比，在研究中資料截止時顯現aGVHD之所有患者對類固醇治療有反應。在HCT後前一百天之後，每季評估患者之晚發型aGVHD (定義為第100天後之急性GVHD發作)或cGVHD，直至HCT之後一年。在移植後第100天之後，在CD24Fc組中未觀測到額外aGVHD事件。

圖16展示治療(CD24Fc)組中之II-IV級及III-IV級急性GVHD之累積發病率。詳言之，僅一位患者具有涉及下部GI之III級GVHD，且未觀測到肝臟GVHD。在CD24Fc組中，HCT之後第180天之III-IV級aGVHD之累積發病率傾向於低於同期對照中第180天之III-IV級aGVHD (P=0.097)。在第182天存在III級aGVHD之額外病例，其導致安慰劑組中之患者在第184天死亡。此患者在第145天白血病復發。此等結果表明除甲胺喋呤及他克莫司預防以外，CD24Fc降低在接受清髓性處理之後經歷HCT之患者顯現更嚴重III及IV級aGVHD之風險。

造血幹細胞移植之後 1 年的 無病存活率

表12概述mITT群體在HCT後1年之無病存活率(DFS)。任何治療組均未達到中值DFS卡本-麥爾估算值。總體而言，對於CD24Fc治療組，HCT後1年之DFS比率(具有95% CI)係83.3% (56.8%，94.3%)，且對於安慰劑組係50.0% (11.1%，80.4%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.2 (0.1，0.9)。在最後一次評估期時設限在隨訪時段結束時存活但不經歷疾病復發之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。圖26展示與安慰劑對照組(圖26A)及同期對照組(圖26B)相比，CD24Fc組中之無復發存活率。表12 造血幹細胞移植之後1年的無病存活率 - mITT群體

造血幹細胞移植之後 1 年的 總存活率

表13概述mITT群體在HCT之後1年的總存活率(OS)。任何治療組均未達到中值OS時間卡本-麥爾估算值。總體而言，對於CD24Fc治療組，1年之OS比率(具有95% CI)係83.3% (56.8%，94.3%)，且對於安慰劑組係50.0% (11.1%，80.4%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.2 (0.1，1.0)。將在已知存活之最後一日設限在隨訪時段結束時存活之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。表13 造血幹細胞移植之後1年的無病存活率 - mITT群體

IIa期研究中患者之HCT後約800天之總存活率(OS)之估算值亦令人鼓舞。對於CD24Fc組中之患者，總存活率(OS)係約80%，安慰劑組中之患者係50% (p=0.06)(圖20)，且對於同期對照中之患者係50% (p=0.05)(圖21)。與安慰劑及同期對照患者相比，CD24Fc暴露患者中之OS改良支持其他上文所述之研究結果，其展示在清髓性處理之後經歷HCT之患者投與CD24Fc與甲胺喋呤及他克莫司之組合可對結果產生顯著改良。

第 180 天之無急性移植物抗宿主病存活率及無復發存活率 ( aGRFS )

經設計以預防GVHD之治療性策略由於移植物抗白血病(GVL)作用減小故可導致白血病復發增加。如表7中所示，HCT後第180天暴露於CD24Fc之患者的白血病復發發病率(11%)低於安慰劑組(33%)及同期對照(23%)中之患者。480 mg CD24Fc組中之一位個體在第146天經歷CMML復發，且多次劑量960 mg CD24Fc組中之一位個體在HCT後第100天經歷ALL復發。具有CMML之患者由於白血病在第196天去世。具有ALL復發之患者用布林莫單抗治療，達到完全緩解，且直至2018年8月8日之資料截止時仍存活。在安慰劑組中，一為患者在第94天經歷CMML復發且一為具有MDS之患者在第146天復發(具有CMML之患者在第316天去世且具有MDS之患者在第184天去世)。此等結果表明CD24Fc不干擾有益移植物抗腫瘤(GVT)過程，且甚至可降低白血病復發之風險。

在移植後第180天CD24Fc組中之死亡數目低於安慰劑及同期對照組(表7)。在HCT後第180天，在任一CD24Fc組中並無死亡，安慰劑組中有一例歸因於肺炎之死亡(16.7%)，且在同期對照中有22例死亡(23.9%)。與HCT後第180天之安慰劑組(33%)(P=0.011，參見圖18)及HCT後第180天之同期對照(53%)(P=0.017，參見圖19)相比，在CD24Fc組中觀測到III-IV級aGVHD無復發存活率(RFS)之複合終點的統計學顯著改良(83%)。此種終點日益普遍，因為在理論上其不僅概述介入對GVHD抑止之作用，亦概述對潛在影響毒性、感染及復發之作用。支持以上觀察結果，III-IV級aGVHD RFS之改良展示在清髓性處理療法之後投與CD24Fc與護理標準甲胺喋呤及他克莫司之組合有益於預防患者之aGVHD發生，但不影響移植物之GVL效應。

HCT後第180天之aGRFS係事後分析複合終點，其中事件包括任何原因引起之III至IV級急性GVHD、復發或死亡。表14概述mITT群體之第180天之III至IV級急性GRFS。

CD24Fc治療組未達到中值III至IV級急性GRFS之卡本-麥爾估算值。對於安慰劑組，中值III至IV級急性GRFS之卡本-麥爾估算值(具有95% CI)係120.0 (46.0，不可估算)。總體而言，對於CD24Fc治療組，第180天之III至IV級急性GRFS比率(具有95% CI)係83.3% (56.8%，94.3%)，且對於安慰劑組係33.3% (4.6%，67.6%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.2 (0.0，0.6)。在最後一次評定日期設限存活且無記錄在資料截止日期發生III至IV級急性GVHD、需要全身免疫抑止療法之慢性GVHD或復發之患者。表14 第180天之無III至IV級急性移植物抗宿主病存活率 - mITT群體

造血幹細胞移植之後 1 年的 復發發病率

表15概述mITT群體在HCT之後1年的復發累積發病率。總體而言，對於CD24Fc治療組在HCT之後1年的復發累積發病率(具有95% CI)係11.1% (1.7%，30.4%)，且對於安慰劑組係33.3% (2.9%，71.1%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.3 (0.1，1.4)。在最後一次評估期時設限在隨訪時段結束時(第365天[1年])存活但不經歷復發之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。表15 造血幹細胞移植之後1年的復發累積發病率活 - mITT群體

造血幹細胞移植之後 1 年的無移植物抗宿主病存活率及無復發存活率 ( GRFS )

此HCT後1年之GRFS係複合終點，其中事件包括任何原因引起之III至IV級急性GVHD、需要全身免疫抑止療法之慢性GVHD、復發或死亡。表16概述mITT群體之HCT後1年之III至IV級急性GRFS。

對於整個CD24Fc治療組，中值GRFS之卡本-麥爾估算值(具有95% CI)係229.0天(141.0，不可估算)：對於240 mg CD24Fc單次劑量組係247.0天(129.0，不可估算)，對於480 mg CD24Fc單次劑量組係287.0天(24.0，不可估算)且對於960 mg CD24Fc多次劑量組係193.5天(100.0，不可估算)。對於安慰劑組，中值GRFS之卡本-麥爾估算值(具有95% CI)係120.0天(46.0，不可估算)。總體而言，對於CD24Fc治療組，HCT後1年之GRFS比率(具有95% CI)係32.4% (12.7%，54.0%)，且對於安慰劑組係33.3% (4.6%，67.6%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.7 (0.3，1.7)。在最後一次評定日期設限存活且無記錄在資料截止日期發生III至IV級急性GVHD、需要全身免疫抑止療法之慢性GVHD或復發之患者。表16 造血幹細胞移植之後1年的無移植物抗宿主病存活率及無復發存活率 - mITT群體

造血幹細胞移植之後 1 年的無 復發死亡之發病率

表17概述mITT群體在HCT後1年之NRM累積發病率。總體而言，對於CD24Fc治療組在第1年之NRM累積發病率(具有95% CI)係5.6% (0.3%，23.1%)，且對於安慰劑組係16.7% (0.5%，54.9%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係0.3 (0.0，2.8)。將在已知存活之最後一日設限在隨訪時段結束時(第365天[1年])存活但未復發之患者。設限各治療組中至少50.0%之患者。對於CD24Fc治療組第180天之NRM累積發病率(具有95% CI)係0.0%，且對於安慰劑組係16.7% (0.5%，54.9%)。表17 造血幹細胞移植之後1年的無復發死亡之累積發病率 - mITT群體

造血幹細胞之後 1 年的 慢性移植物抗宿主病之發病率 表18概述mITT群體在HCT之後1年的慢性GVHD累積發病率。總體而言，對於CD24Fc治療組，HCT後1年之慢性GVHD之累積發病率(具有95% CI)係63.3% (34.1%，82.4%)，且對於安慰劑組係33.3% (2.5%，72.0%)。CD24Fc相對於安慰劑之風險比(具有90% CI)係2.1 (0.6，7.4)。在240 mg CD24Fc單次劑量組中有3例中度慢性GVHD，在480 mg CD24Fc單次劑量組中有3例輕度及1例中度慢性GVHD，且在960 mg CD24Fc多次劑量組中有2例輕度及3例中度慢性GVHD。在安慰劑組中兩位患者具有輕度慢性GVHD。總體而言，不存在嚴重慢性GVHD之實例。在最後一次評估期時設限在隨訪時段結束時(第365天[1年])存活但不經歷慢性GVHD之患者。表18 造血幹細胞移植之後1年的慢性移植物抗宿主病之累積發病率 - mITT群體

第 100 天之感染比率

如同對GVL之作用一般，經設計以經由總體免疫抑止來預防GVHD之治療性策略可導致增加感染比率，包括細菌感染及CMV再活化。

表19概述mITT群體在第100天之感染發病率。總計，接受CD24Fc之13位(72.2%)患者(240 mg CD24Fc單次劑量組中之5位[83.3%]患者、480 mg CD24Fc單次劑量組中之2位[33.3%]患者及960 mg CD24Fc多次劑量群組中之6位[100.0%]患者)及2位(33.3%%)接受安慰劑之患者具有第100天之感染。

認為大多數感染得以控制及消退。安慰劑組中之患者103-001死於肺炎。安慰劑組中之患者102-002具有報導為恢復/解決之結膜炎。480 mg CD24Fc單次劑量組中之患者101-010與480 mg CD24Fc單次劑量組中之患者101-011具有報導為未恢復/為消退之膿皰型皮疹。960 mg CD24Fc多次劑量組中之患者102-006具有報導為持續介入之上呼吸道感染及艱難梭菌(Clostridium difficile )結腸炎。

大多數感染係細菌性的(9位[50.0%]接受CD24Fc之患者及2位[33.3%]接受安慰劑之患者)或病毒性的(7位[38.9%]接受CD24Fc之患者及1位[16.7%]接受安慰劑之患者)。大多數感染發生於血液(8位[44.4%]接受CD24Fc之患者及1位[16.7%]接受安慰劑之患者)、尿液(4位[22.2%]接受CD24Fc之患者且無接受安慰劑之患者)或糞便(2位[11.1%]接受CD24Fc之患者及2位[33.3%]接受安慰劑之患者)中。大多數自血液培養物回收之細菌係常見皮膚習居菌及低毒性病原體(亦即凝固酶陰性葡萄狀球菌)。表19 第100天之感染發病率之概述 - mITT群體

如表20中所示，CD24Fc組中有9位患者具有高CMV再活化風險(HCT之前的供者/接受者CMV狀態：D+/R+，5；D-/R+，3；未知D/R+，1)。CD24Fc組中之一位具有D+/R-之患者具有中等CMV再活化風險。CD24Fc組中之八位患者具有D-/R-之狀態，認為其係低風險的。在第42天及第48天，兩位D-/R+患者經受CMV再活化，表示在高風險組中在第100天CMV再活化之累積發病率係22.2%。兩位患者在偵測CMV再活化之前接受全身類固醇治療。相比而言，安慰劑組中之2位患者係高CMV再活化風險的(D+/R+，1；D-/R+，1)。在用於急性GVHD之全身類固醇治療之前在第47天，安慰劑組中之一位患者經受CMV再活化(高風險組中之50.0%)。表20 在移植之前藉由供者及接受者CMV狀態分級之HCT患者中之CMV感染比率。D = 供者，R = 接受者，+係陽性，-係陰性，U係未知的。

總體而言，在IIa期研究中，CD24Fc具有良好耐受性。不存在輸注相關之毒性。在暴露於CD24Fc之患者中在高血糖症之480 mg組中存在一例可能的藥物相關之TEAE (≥III級)，其用胰島素處理。在安慰劑組中觀測到一例劑量限制性毒性(DLT)，且在CD24Fc組中未觀測到DLT。在180天內(在最後一次給藥CD24Fc之後至少150天)，在投與CD24Fc之患者中不存在導致死亡之不良事件。在第48天，在安慰劑組中存在一例導致個體死亡之肺炎之不良事件。在HCT之後7個月CD24Fc組中之一位患者死亡，但確定該死亡不大可能與研究藥物相關。在24位患者中之任一者中在任何點至HCT之後第100天均未偵測到抗藥物抗體(ADA)。

最常見TEAE (≥III級) (＞10%)包括血小板計數減少(83.3%安慰劑及94.4% CD24Fc)、WBC計數減少(66.7%安慰劑及88.9% CD24Fc)、嗜中性球計數減少(50%安慰劑及83.3% CD24Fc)、淋巴細胞計數減少(50%安慰劑及77.8% CD24Fc)、貧血(50%安慰劑及66.7% CD24Fc)、口腔炎(83.3%安慰劑及50% CD24Fc)及噁心(0%安慰劑及11.1% CD24Fc)。此等SAE與HCT中所用之清髓性處理療法之已知安全型態一致。

用於HCT之清髓性處理通常與嚴重的療法相關之毒性相關聯，包括器官衰竭。器官衰竭係早期發作之移植相關死亡(TRM)或無復發死亡(NRM)之最常見原因。在18位患者之CD24Fc組中，在HCT後之前100天內無患者死亡，在第48天安慰劑組中之6位中之1位因呼吸衰竭而死亡。

藥物動力學結果

圖22-23展示來自2a期試驗之三個遞增群組之PK資料。240及480 mg單次劑量組之半衰期(圖22)係約14天，其與健康個體中所見之資料一致。在480 mg下，在14天(可見GVHD發病及移植之時間)之後，有較高cmx但無實際的暴露增加。在最終多次劑量組中，如所預期在第60天(患者最容易顯現GVHD之時段)存在暴露增加(圖23)。

表21概述單次劑量組中PK群體之血漿CD24Fc PK參數。240及480 mg CD24Fc單次劑量組之幾何平均C_max _,- _1d 值分別係52,145.41及84,155.08 ng/mL，幾何平均AUC₀ _- _最後 _,- _1d 值係10,156,549.9及15,522,686.2 ng h/mL，幾何平均AUC₀ _- _42d 值係9,275,562.3及13,903,718.4 ng h/mL，且幾何平均AUC₀ _- _inf 值係10,383,503.9及15,716,616.4 ng h/mL。240與480 mg CD24Fc單次劑量組之中值t_max _,- _1d 係2.10 h。對於240及480 mg CD24Fc單次劑量組，t½平均值分別係414.739及406.648 h且λz平均值係0.0018及0.0017 h-1。對於240及480 mg CD24Fc單次劑量組，平均Vz值分別係13.83及18.18 L，且平均CL值係0.024及0.031 L/h。表21 CD24Fc之血漿藥物動力學參數之概述 - PK群體 - 單次劑量組

表22概述多次劑量組中PK群體在第-1天、第28天及第-1天至第100天之CD24 Fc之血漿PK參數。960 mg CD24Fc多次劑量組之幾何平均C_max _,- _1d 及C_max _, _28d 值分別係96,942.71 ng/mL及62,563.05 ng/mL。960 mg CD24Fc多次劑量組之全部幾何平均AUC₀ _- _最後 _,- _1d 、AUC₀ _- _14d 、AUC₀ _- _100d 及AUC₀ _- _最後值分別係12,317,971.2 ng h/mL、9,688,933.9 ng h/mL、37,736,555.1 ng h/mL及37,363,953.5 ng h/mL。960 mg CD24Fc多次劑量組之中值t_max _,- _1d 及t_max _, _28d 分別係2.13 h及2.52 h。表22 CD24Fc之血漿藥物動力學參數之概述 - PK群體 - 多次劑量組 - 第1天、第28天及第-1天至第100天

IIa期研究之臨床證據強烈表明，CD24Fc與甲胺喋呤及他克莫司組合投與藉由降低嚴重aGVHD之可能性(III-IV級)與白血病復發之可能性大大改良經歷清髓性同種異體HCT之白血病患者之結果。如上文所述，與安慰劑組(生理食鹽水加甲胺喋呤及他克莫司)中之16.7%及同期對照組(單獨甲胺喋呤及他克莫司)中之24%相比，在CD24Fc暴露患者中，III-IV級aGVHD之累積發病率係5.6%。此等資料表明，投與CD24Fc與作為預防之甲胺喋呤及他克莫司之組合降低HCT患者之III-IV級aGVHD(與無復發死亡之風險增加相關聯之最嚴重等級之aGVHD)之風險。與安慰劑組(33.3%)與同期對照(23%)相比，觀測到接受CD24Fc之患者比不接受CD24Fc之患者的復發發病率有減小之趨勢(11.1%)，表明CD24Fc不影響移植物之GVT效應，且甚至可降低白血病復發之風險。在標準GVHD預防療法中包括CD24Fc之益處進一步由以下支持：與安慰劑(16.7%)相比CD24Fc暴露患者(5.6%)中之較佳NRM、較佳1.5年總存活率(89%相對於50%，CD24Fc相對於安慰劑對照)、III-IV級aGVHD RFS之統計學上顯著的改良(分別83%相對於33%，CD24Fc相對於安慰劑對照)、嚴重黏膜炎之劑量依賴性減輕及在研究中僅觀測到一例藥物相關TEAE(III級)之良好安全型態。

降低aGVHD與白血病復發風險之預防藥劑將為新穎的且對於在清髓性處理之後經歷同種異體HCT之白血病患者極為有益。如上文所述，本申請案中之早期臨床資料強烈表明，投與CD24Fc與甲胺喋呤及他克莫司之組合比現有預防療法顯著改良III-IV級aGVHD預防及白血病復發之臨床上顯著的終點，且因此應適合於突破性認定。在臨床研究之IIb期部分中進一步研究IIa期部分中觀測到之CD24Fc之效應，其經設計以確定預防性CD24Fc投與在降低在清髓性處理之後經歷同種異體HCT之白血病患者之III-IV級aGVHD及白血病復發中之功效。實例6 CD24可用以減輕經歷HCT之人類個體之黏膜炎

用於HCT之清髓性處理通常與嚴重療法相關之毒性相關聯，包括3-4級黏膜炎。HCT患者已報導嚴重口腔黏膜炎為其經歷之最令人苦惱的症狀。作為實例5中描述之IIa期GVHD預防試驗中CD24Fc治療對個體之黏膜炎之作用的量度，吾人產生組合黏膜炎評分系統以研究結果。此資料示於圖24A中且包含患者患嚴重(3或4級)黏膜炎之天數的幾倍。評分以條柱提供，以及圓括號中係具有黏膜炎之患者數目。根據CTCAE 4.01對口腔黏膜炎評分。如圖24B中所示，與安慰劑(R = -0.9983；P = 0.0009)相比，在所有CD24Fc組上觀測到黏膜炎等級-天數評分之劑量依賴性減小，且在多次劑量組中觀測到在統計學上顯著的減小(安慰劑相對於960 mg多次劑量：P = 0.035，斯圖登氏t檢驗)。

圖1A展示全長CD24融合蛋白CD24Fc (在本文中亦稱為CD24Ig) (SEQ ID NO:5)之胺基酸組成。加下劃線的26個胺基酸為CD24 (SEQ ID NO: 4)之信號肽，其在自表現蛋白質之細胞分泌期間裂解開，且因此自蛋白質(SEQ ID NO: 6)之經處理版本缺失。所述序列之粗體部分係融合蛋白(SEQ ID NO: 2)中所用之成熟CD24蛋白質之細胞外域。為了避免免疫原性，通常存在於成熟CD24蛋白質中之最後一個胺基酸(A或V)已缺失於構築體中。未加下劃線的非粗體字母為IgG1 Fc之序列，其包括鉸鏈區及CH1及CH2域(SEQ ID NO: 7)。圖1B展示CD24^V Fc(SEQ ID NO: 8)之序列，其中成熟人類CD24蛋白質(粗體)係SEQ ID NO: 1之纈胺酸多態性變異體。圖1C展示CD24^A Fc (SEQ ID NO: 9)之序列，其中成熟人類CD24蛋白質(粗體)係SEQ ID NO: 1之丙胺酸多態性變異體。圖1B及1C中之融合蛋白之多個部分如圖1A中所標記，且變異型纈胺酸/丙胺酸胺基酸加雙下劃線。

圖2展示來自小鼠(SEQ ID NO: 3)及人類(SEQ ID NO: 2)之成熟CD24蛋白質之間的胺基酸序列變化形式。將可能的O-醣基化位點加粗，且N-醣基化位點加下劃線。

圖3A-C. 對CD24IgG1(CD24Fc)之藥物動力學進行的WinNonlin隔室模型化分析。空心圓表示3隻小鼠之平均值，且線條為預測藥物動力學曲線。圖3A. 靜脈內注射1 mg CD24IgG1。圖3B. 皮下注射1 mg CD24IgG1 (CD24Fc)。圖3C. 血液中之抗體總量的比較，如藉由曲線下面積(AUC)、半衰期及最大血液濃度所量測。應注意，總體而言，皮下注射之AUC及Cmax係靜脈內注射之約80%，但差異在統計學上不顯著。

圖4A-B. 區別PAMP與DAMP之間的CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G(10) (CD24-Siglec G(10))相互作用。圖4A. 宿主對PAMP之反應不受CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G(10)相互作用影響。圖4B. CD24-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G(10)相互作用抑制宿主對DAMP之反應，此可能經由與唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G/10締合之SHP-1達成。

圖5A-C. CD24 Fc結合至唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10及HMGB1且活化唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G (人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10之小鼠同源物)。圖5A. 對CD24Fc-唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素10相互作用進行之親和力量測。圖5B. CD24Fc以陽離子依賴性方式與HMGB-1發生特異性相互作用。在陽離子螯合劑EDTA之存在或不存在下，將CD24Fc與HMGB1一起在0.1 mM之CaCl₂ 及MgCl₂ 中培育。CD24Fc被蛋白質G珠粒吸引，且藉由西方墨點法測定HMGB1、CD24Fc或對照Fc之量。圖5C. CD24Fc藉由誘導酪胺酸磷酸化(中間圖)且與SHP-1締合(上圖)來活化小鼠唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G之量示於下圖中。用1 µg/ml之CD24Fc、對照Fc或媒劑(PBS)對照刺激CD24^-/- 脾臟細胞30分鐘。接著使唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素G發生免疫沈澱且用抗磷酸化酪胺酸或抗SHP-1探測。

圖6A-B. CD24Fc抑制藉由抗CD3活化之人類T細胞產生TNF-α及IFN-γ。人類PBML在CD24Fc存在或不存在下用抗CD3刺激4天，且藉由ELISA量測細胞培養物之上清液中所釋放之IFN-γ及TNF-α的量。所示數據為三次重複之平均值。誤差條，SEM。

圖7A-B. CD24抑制人類巨噬細胞產生發炎性細胞介素。圖7A. CD24之ShRNA靜默引起TNF-α、IL-1β及IL-6自發產生。THP1細胞經編碼零亂或兩個獨立的CD24 shRNA分子的慢病毒載體轉導。經轉導之細胞藉由與PMA(15 ng/ml)一起培養4天而分化成巨噬細胞。洗掉PMA及未黏附細胞之後，將細胞再培養24小時以便藉由細胞介素珠粒陣列量測發炎性細胞介素。圖7B. 如圖7A中一般，但其中改在最後24小時向巨噬細胞中添加既定濃度之CD24Fc或對照IgG Fc。圖4A中所示之數據為來自三個獨立實驗之平均值及S.D.，而圖4B中之彼等數據表示至少3個獨立實驗。

圖8展示人類個體中之PK可評估群體經治療之平均血漿CD24Fc濃度(±SD)之曲線圖。PK = 藥物動力學；SD = 標準差。

圖9展示PK可評估群體之CD24Fc C_max 相對於劑量之劑量比例圖。

圖10展示PK可評估群體之CD24Fc AUC₀ _- _42d 相對於劑量之劑量比例圖。

圖11展示PK可評估群體之CD24Fc AUC₀ _- _inf 相對於劑量之劑量比例圖。

圖12展示隨機分組之安慰劑對照之IIa期劑量遞增試驗之試驗設計，進行該試驗以評估在經歷同種異體清髓性造血幹細胞移植(HCT)之癌症患者中將CD24Fc添加至急性GVHD預防之護理標準中。

圖13展示IIa期試驗中之單次劑量及多次劑量組之給藥流程。

圖14展示試驗中招募之患者之平均植入時間。

圖15展示試驗中招募之患者之骨髓供者嵌合。

圖16展示治療(CD24Fc)組中之II-IV級及III-IV級急性GVHD之發病率。

圖17展示與接受甲胺喋呤/他克莫司之同期對照患者相比，接受甲胺喋呤/他克莫司+ CD24Fc之患者中HCT後第180天III-IV級aGVHD之累積發病率。

圖18展示比較接受CD24Fc或安慰劑對照之患者中之180天III-IV級aGVHD未復發存活率的卡本-麥爾存活率分析。

圖19展示比較接受CD24Fc與同期對照之患者中之180天III-IV級aGVHD未復發存活率的卡本-麥爾存活率分析。

圖20展示移植後800天比較接受CD24Fc或安慰劑對照之患者之總存活率的卡本-麥爾存活率分析。

圖21展示移植後800天比較接受CD24Fc或同期對照之患者之總存活率的卡本-麥爾存活率分析。

圖22A-B展示240及480 mg單次劑量組之PK資料。圖22A線性標度之相對於時間之平均(±標準差)血漿CD24Fc濃度(ng/mL)。圖22B. 半對數標度之相對於時間之平均(±標準差)血漿CD24Fc濃度(ng/mL)。

圖23A-B展示多次劑量組之PK資料。圖23A線性標度之相對於時間之平均(±標準差)血漿CD24Fc濃度(ng/mL)。圖23B. 半對數標度之相對於時間之平均(±標準差)血漿CD24Fc濃度(ng/mL)。

圖24A-B展示CD24Fc治療對口腔黏膜炎之作用。圖24A. 組合黏膜炎評分。作為對黏膜炎之作用的量度，產生患者患嚴重(3或4級)黏膜炎之天數的幾倍，且此評分以條柱提供，以及圓括號中係具有黏膜炎之患者數目。圖24B. 藉由CD24Fc實現黏膜炎評分之劑量依賴性減小。展示個別黏膜炎評分之平均值及標準差。患者之藥物劑量與黏膜炎評分之間的相關係數及P - 值使用皮爾森方法(Pearson method)測定。R = -0.9983，P = 0.0009。

圖25A-B展示與安慰劑對照組(圖25A)及同期對照組相比(圖25B)，CD24Fc組之180天無III-IV級GVHD存活率。

圖26A-B展示與安慰劑對照組(圖26A)及同期對照組(圖26B)相比，CD24Fc組中之未復發存活率。

Claims

一種治療或預防有需要個體中移植物抗宿主病(GVHD)之方法，其包含向該個體投與CD24蛋白質。
如請求項1之方法，其中該方法降低該個體之III至IV級急性GVHD之風險。
一種治療或預防有需要個體中黏膜炎之方法，其包含向該個體投與CD24蛋白質。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體罹患癌症。
如請求項4之方法，其中該癌症係急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓單核細胞性白血病(CMML)。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該CD24蛋白質以240 mg或480 mg之劑量投與。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該個體將經歷或已經歷造血幹細胞移植(HCT)。
如請求項7之方法，其中該CD24蛋白質係在該HCT之前或之後投與。
如請求項8之方法，其中該CD24蛋白質在該HCT之前一天投與。
如請求項8或9之方法，其中該CD24蛋白質經投與超過一次。
如請求項10之方法，其中該CD24蛋白質以每兩週一次劑量投與三次，其包含在該HCT之前一天的劑量、在該HCT之後第14天之劑量及在該HCT之後第28天之劑量。
如請求項11之方法，其中該CD24蛋白質之劑量分別係480 mg、240 mg及240 mg。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該CD24蛋白質包含在其N端或C端與哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之Fc區融合之成熟人類CD24多肽。
如請求項13之方法，其中該成熟人類CD24多肽包含以SEQ ID NO: 1或2所示序列。
如請求項14之方法，其中該Ig蛋白質係人類Ig蛋白質，且其中該Fc區包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA之鉸鏈區及CH2及CH3域。
如請求項14之方法，其中該Ig蛋白質係人類Ig蛋白質，且其中該Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。
如請求項15之方法，其中該CD24蛋白質包含以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列。
如請求項17之方法，其中該CD24蛋白質之胺基酸序列由以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列組成。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該CD24蛋白質係可溶性的。
如請求項1至19中任一項之方法，其中該CD24蛋白質經醣基化。
如請求項1至20中任一項之方法，其中該CD24蛋白質係使用真核表現系統製備。
如請求項21之方法，其中該真核表現系統包含自哺乳動物細胞中之載體表現。
如請求項22之方法，其中該等哺乳動物細胞係中國倉鼠卵巢細胞。
一種CD24蛋白質之用途，其係用於製造用於治療或預防個體中移植物抗宿主病(GVHD)之藥劑。
如請求項24之用途，其中該用途降低該個體中III至IV級急性GVHD之風險。
一種CD24蛋白質之用途，其係用於製造用於治療或預防個體之黏膜炎之藥劑。
如請求項24至26中任一項之用途，其中該個體罹患癌症。
如請求項27之用途，其中該癌症係急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓單核細胞性白血病(CMML)。
如請求項24至28中任一項之方法，其中該CD24蛋白質以240 mg或480 mg之劑量投與。
如請求項24至29中任一項之用途，其中該個體將經歷或已經歷造血幹細胞移植(HCT)。
如請求項30之用途，其中該CD24蛋白質係在該HCT之前或之後投與。
如請求項31之用途，其中該CD24蛋白質在該HCT之前一天投與。
如請求項31或32之用途，其中該CD24蛋白質經投與超過一次。
如請求項33之用途，其中該CD24蛋白質以每兩週一次劑量投與三次，其包含在該HCT之前一天的劑量、在該HCT之後第14天之劑量及在該HCT之後第28天之劑量。
如請求項34之用途，其中該CD24蛋白質之劑量分別係480 mg、240 mg及240 mg。
如請求項24至35中任一項之用途，其中該CD24蛋白質包含在其N端或C端與哺乳動物免疫球蛋白(Ig)蛋白質之Fc區融合之成熟人類CD24多肽。
如請求項36之用途，其中該成熟人類CD24多肽包含以SEQ ID NO: 1或2所示序列。
如請求項37之用途，其中該Ig蛋白質係人類Ig蛋白質，且其中該Fc區包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA之鉸鏈區及CH2及CH3域。
如請求項37之用途，其中該Ig蛋白質係人類Ig蛋白質，且其中該Fc區包含IgM之鉸鏈區及CH2、CH3及CH4域。
如請求項38之用途，其中該CD24蛋白質包含以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列。
如請求項40之用途，其中該CD24蛋白質之胺基酸序列由以SEQ ID NO: 6、11或12所示序列組成。
如請求項24至41中任一項之用途，其中該CD24蛋白質係可溶性的。
如請求項24至42中任一項之用途，其中該CD24蛋白質經醣基化。
如請求項24至43中任一項之用途，其中該CD24蛋白質係使用真核表現系統製備。
如請求項44之用途，其中該真核表現系統包含自哺乳動物細胞中之載體表現。
如請求項45之用途，其中該等哺乳動物細胞係中國倉鼠卵巢細胞。