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TW202120686A - 用以治療鐮狀細胞疾病之重組血基質加氧酶-1 (ho-1) - Google Patents

用以治療鐮狀細胞疾病之重組血基質加氧酶-1 (ho-1) Download PDF

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TW202120686A
TW202120686A TW109125172A TW109125172A TW202120686A TW 202120686 A TW202120686 A TW 202120686A TW 109125172 A TW109125172 A TW 109125172A TW 109125172 A TW109125172 A TW 109125172A TW 202120686 A TW202120686 A TW 202120686A
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rho
protein
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seq
amino acid
Prior art date
Application number
TW109125172A
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English (en)
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阿奎赫 所羅門 歐菲利
薩米特 戈什
喬瑟夫 賽佩克
柏弘 章
秀霞 孫
克拉克 Ｑ 潘
丹尼爾 米納德 拉喬伊
川 沈
Original Assignee
美商舒爾人類基因療法公司
美國匹茲堡大學
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Publication date
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Abstract

本發明尤其提供用於製造且使用用以治療鐮狀細胞疾病之重組血基質加氧酶之方法及組成物。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白為具有經延長半衰期及/或經減少聚集之截短變異體或者Fc融合蛋白。

Description

用以治療鐮狀細胞疾病之重組血基質加氧酶-1　(HO-1)
本發明有關一種用以治療鐮狀細胞疾病之重組血基質加氧酶-1 (HO-1)。
鐮狀細胞疾病(SCD)為具有作為體染色體隱性特質之遺傳性之慢性危及生命血液病症。SCD與部分因由嚴重溶血所致之過量游離血紅素(Hb)及游離血基質造成之許多急性及慢性併發症相關聯。
患有SCD之患者具有存放於小血管中，阻塞血液及氧流入身體主要器官之鐮形紅血球。該等堵塞導致嚴重疼痛、器官損傷、中風及包括經增加易感染性、疲勞及生長延遲之其他併發症。大部分患有該疾病之人之壽命縮短。需要用於治療患有由SCD導致之併發症之患者之有效療法。
本發明提供用於治療SCD之有效方法。本發明部分地係基於以下發現：在SCD小鼠模型中，重組血基質加氧酶(例如經截短HO-1蛋白或者HO-1-Fc融合蛋白)之全身投與減輕或者改善鐮狀細胞疾病之症狀。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，預期HO-1特異性地靶向游離血基質且藉由將游離血基質轉化成細胞保護性/消炎副產物來降解游離血基質。在SCD疾病模型中，重組血基質加氧酶之投與增強血漿中之HO-1活性，減輕貧血，預防急性胸部症候群(ACS)、肺性高血壓及急性肺損傷。此外，本文所描述之SCD療法利用內源性HO-1蛋白具有偏離目標作用且可潛在地將偏離目標作用降至最低之生理學特異性。本文描述重組治療性HO-1蛋白，其與天然存在之HO-1蛋白相比保留酶活性，同時延長半衰期，增加穩定性且減少聚集。
在一個態樣中，本發明提供治療鐮狀細胞疾病之方法，其包含向需要治療之個體投與重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白。
在一些具體例中，該方法包含投與包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少85%一致性之胺基酸序列之rHO-1蛋白(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，該方法包含投與包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少90%一致性之胺基酸序列之rHO-1蛋白(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，該方法包含投與包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少95%一致性之胺基酸序列之rHO-1蛋白(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，該方法包含投與包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有一致性之胺基酸序列之rHO-1蛋白(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，該方法包含投與包含SEQ ID NO: 1之rHO-1蛋白。
在一些具體例中，該方法包含投與包含K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179及F207 (對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置)之rHO-1蛋白。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白在對應於SEQ ID NO: 1之M9之殘基處之N端處經截短。在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-225。在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-226。在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-261。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白在對應於K226、A233、R237、T261及/或A265之殘基處經截短。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白在對應於K226之殘基處經截短。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少85%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少90%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少95%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含在對應於SEQ ID NO: 1之33之位置處之胺基酸取代。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含F33L取代。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中Fc域之N端融合至rHO-1蛋白域之C端。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中Fc域之C端融合至rHO-1蛋白域之N端。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白包含介於rHO-1蛋白域與Fc域之間之連接子。
在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之序列。在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之重複序列。在一些具體例中，連接子包含1、2、3、4或者5個GGGGS (SEQ ID NO: 61；「GGGGS」如SEQ ID NO: 10所揭示) 之重複序列。在一些具體例中，連接子包含(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 21)之序列。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白為含有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之至少一個單體之多聚體。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中多聚體為二聚體。在一些具體例中，多聚體含有包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之單體。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白為具有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之一個單體及包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之另一單體的二聚體。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中Fc域包含用於增強半衰期、減少聚集且/或減弱效應功能之一或者多個突變。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變包含在對應於IgG1 Fc域之234、235、251、252、254、255、256、308、309、311、312、314、347、349、350、351、354、360、366、385、386、387、389、392、394、399、405、405、407、409、428、433、434、435及/或436 (根據EU編號)之一或者多個位置處之胺基酸取代。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變包含IgG1 Fc域之L234A及L235A胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變包含選自IgG1 Fc域之L234A、L235A、Q347R、Y349C、T350V、L351Y、L351V、S354C、E356K、E357K、K360E、T366L、T366W、T366S、K370D、L368A、K392L、K392D、T394W、D399V、D399K、F405T、F405A、Y407V、K409W及K409D(根據EU編號)之胺基酸取代。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變在一個單體鏈上包含IgG1 Fc域之K360E、K409W及Y349C胺基酸取代且在第二單體鏈上包含IgG1 Fc域之Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變在一個單體鏈上包含IgG1 Fc域之T350V、L351Y、F405A及Y407V胺基酸取代且在第二單體鏈上包含IgG1 Fc域之T350V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變包含IgG1 Fc域之K360E、K409W、Y349C、Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中一或者多個突變包含IgG1 Fc域之T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白係靜脈內投與。在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中rHO-1蛋白係皮下投與。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中與對照相比，投與rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中投與rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少至低於約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM、約3.0 mM。如前述技術方案中任一項之方法，其中投與rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少至低於約12 mM、約10 mM、約8 mM、約6 mM、約4 mM或者約2 mM。如前述技術方案中任一項之方法，其中投與rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少至低於約15 mM、約10 mM、約5 mM或者約1 mM。在一些具體例中，投與rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少至低於約10 mM。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中與對照相比，投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性增加。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之10%。在一些具體例中，投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之12%。在一些具體例中，投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之15%。在一些具體例中，投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之20%。在一些具體例中，投與rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之25%。
在一些具體例中，該方法包含投與rHO-1蛋白，其中投與rHO-1蛋白引起包括貧血、血管阻塞性危象(VOC)、急性胸部症候群(ACS)、肺性高血壓或者器官損傷之一或者多種症狀減輕或者發作延遲。
在一個態樣中，本發明提供包含融合至Fc域之rHO-1蛋白域之重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域之C端融合至Fc域之N端。在一些具體例中，rHO-1蛋白域之N端融合至Fc域之C端。
在一些具體例中，rHO-1蛋白包含介於rHO-1蛋白域與Fc域之間之連接子。
在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之序列。在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之重複序列。在一些具體例中，連接子包含1、2、3、4或者5個GGGGS (SEQ ID NO: 61；「GGGGS」如SEQ ID NO: 10所揭示) 之重複序列。在一些具體例中，連接子包含(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 21)之序列。
在一些具體例中，rHO-1蛋白為含有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之至少一個單體之多聚體。
在一些具體例中，多聚體為二聚體。在一些具體例中，多聚體含有包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之單體。
在一些具體例中，rHO-1蛋白為具有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之一個單體及包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之另一單體的二聚體。
在一些具體例中，其中rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少85%一致性之胺基酸序列(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少90%一致性之胺基酸序列(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少95%一致性之胺基酸序列(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有一致性之胺基酸序列(野生型全長rHO-1蛋白)。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含SEQ ID NO: 1。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含SEQ ID NO: 1之K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179及F207。
在一些具體例中，其中rHO-1蛋白在對應於M9之殘基處之N端處經截短。在一些具體例中，rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-225。在一些具體例中，rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-226。在一些具體例中，rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1之殘基10-261。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域進一步包含K226、A233、R237、T261及A265。
在一些具體例中，rHO-1蛋白在對應於K226之殘基處經截短。
在一些具體例中，rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少85%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少90%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少95%一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有一致性之胺基酸序列。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含在對應於SEQ ID NO: 1之33之位置處之胺基酸取代。
在一些具體例中，rHO-1蛋白域包含F33L取代。
在一些具體例中，Fc域包含用於增強半衰期、減少聚集且/或減弱效應功能之一或者多個突變。
在一些具體例中，一或者多個突變包含在對應於IgG1 Fc域之234、235、251、252、254、255、256、308、309、311、312、314、385、386、387、389、428、433、434、435及436 (根據EU編號)之一或者多個位置處之胺基酸取代。
在一些具體例中，一或者多個突變包含IgG1 Fc域之L234A及L235A胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，一或者多個突變在一個鏈上包含IgG1 Fc域之K360E、K409W及Y349C胺基酸取代且在第二鏈上包含IgG1 Fc域之Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，一或者多個突變在一個鏈上包含IgG1 Fc域之T350V、L351Y、F405A及Y407V胺基酸取代且在第二鏈上包含IgG1 Fc域之T350V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，一或者多個突變在一個鏈上包含IgG1 Fc域之K360E、K409W、Y349C、Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代(根據EU編號)。
在一些具體例中，一或者多個突變在一個鏈上包含IgG1 Fc域之T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代(根據EU編號)。
在一個態樣中，本發明提供編碼本文所描述之重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白之核酸。
在一個態樣中，本發明提供包含編碼本文所描述之重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白之核酸之細胞。定義
為使本發明更易於理解，首先在下文定義某些術語。隨附術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書記載。
一 (a 或an) ：冠詞「一(a及an)」在本文中用以指該冠詞之一個或者超過一個(亦即至少一個)文法賓語。舉例而言，「一元素」意謂一個元素或者超過一個元素。
改善：如本文所使用之術語「改善」意謂個體狀態之預防、減輕或者緩和或者個體狀態之好轉。改善包括但不需要疾病病況之完全恢復或者完全預防。
動物：如本文所使用之術語「動物」係指動物界之任何成員。在一些具體例中，「動物」係指處於發育之任何階段之人類。在一些具體例中，「動物」係指處於發育之任何階段之非人類動物。在某些具體例中，非人類動物為哺乳動物(例如嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物及/或豬)。在一些具體例中，動物包括但不限於哺乳動物、鳥、爬蟲類、兩棲動物、魚、昆蟲及/或蠕蟲。在一些具體例中，動物可為基因轉殖動物、經基因工程改造之動物及/或純系。
大約或者約：如本文所使用，如應用於所關注之一或者多個值之術語「大約」或者「約」係指類似於所陳述參考值之值。在某些具體例中，除非另外說明或者另外自上下文顯而易見，否則術語「大約」或者「約」係指在任一方向(大於或者小於)上處於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或者更小百分比之內之一系列值(但該等數值將超出可能性值之100%的情況除外)。
相關聯：當「相關聯」在本文中使用時，若一個事件或者實體之存在、程度及/或形式與另一事件或者實體之存在、程度及/或形式相關，則兩個事件或者實體彼此「相關聯」。舉例而言，若特定實體(例如多肽)之存在、程度及/或形式與特定疾病、病症或者病況之發生率和/或者易感性相關(例如在相關群體中)，則其視為與該疾病、病症或者病況相關聯。在一些具體例中，若兩個或者更多個實體直接或者間接相互作用，以使得其彼此物理上接近且保持物理上接近，則其彼此物理上「相關聯」。在一些具體例中，彼此物理上相關聯之兩個或者更多個實體彼此共價連接；在一些具體例中，彼此物理上相關聯之兩個或者更多個實體彼此不共價連接，但以非共價形式相關聯，例如藉助於氫鍵、凡得瓦交互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。
生物可用性：如本文所使用之術語「生物可用性」一般係指到達個體血流之所投與劑量百分比。
生物活性：如本文所使用之片語「生物活性」係指在生物系統中且特定言之在生物體中具有活性之任何藥劑之特徵。舉例而言，當向生物體投與時對該生物體具有生物作用之藥劑視為具生物活性。在特定具體例中，在肽具生物活性之情況下，共享肽之至少一種生物活性之該肽之一部分通常稱為「生物活性」部分。
結合部分：如本文所使用之「結合部分」為能夠特異性結合例如所關注之目標(例如FcR、FcRn)之目標之任何分子或者分子之一部分。結合部分包括例如抗體、其抗原結合片段、Fc區或者其Fc片段、抗體模擬物、肽及適體。
恆定區：如本文所使用之術語「恆定區」係指對應於或者來源於抗體之一或者多個恆定區免疫球蛋白域之多肽。恆定區可包括隨附免疫球蛋白域中之任一者或者全部：CH1域、鉸鏈區、CH2域、CH3域(來源於IgA、IgD、IgG、IgE或者IgM)及CH4域(來源於IgE或者IgM)。
Fc 區：如本文所使用之術語「Fc區」係指具有兩個「Fc多肽」之二聚體，各「Fc多肽」包含不包括第一恆定區免疫球蛋白域之抗體之恆定區。在一些具體例中，「Fc區」包括藉由一或者多個二硫鍵、化學連接子或者肽連接子連接之兩個Fc多肽。「Fc多肽」係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域或者IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域，且亦可包括此等域之可撓性鉸鏈N端之部分或者全部。對於IgG，「Fc多肽」包含免疫球蛋白域Cγ2 (Cgamma2)及Cγ3 (Cgamma3)以及介於Cγ1 (Cgamma1)與Cγ2之間之鉸鏈之下部部分。儘管Fc多肽之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc多肽通常經界定以包含在T223或者C226或者P230處起始、至其羧基端之殘基，其中編號係根據如Kabat等人 (1991, NIH Publication 91-3242, 國家技術資訊服務中心(National Technical Information Services), Springfield, VA)中之EU指數。除非另外規定，否則Fc域殘基之編號係根據EU編號。對於IgA，Fc多肽包含免疫球蛋白域Cα2 (Calpha2)及Cα3 (Calpha3)以及介於Cα1 (Calpha1)與Cα2之間之鉸鏈之下部部分。Fc區可合成、重組或者由諸如IVIG之天然來源生成。
功能等效物或者衍生物：如本文所使用之術語「功能等效物」或者「功能衍生物」在胺基酸序列之功能衍生物之情形下指示保持與原始序列之生物活性實質上類似之生物活性(功能或者結構)的分子。功能衍生物或者等效物可為天然衍生物或者以合成方式製備。例示性功能衍生物包括具有一或者多個胺基酸之取代、刪除或者添加之胺基酸序列，其限制條件為蛋白質之生物活性保守。取代胺基酸合乎需要地具有與經取代胺基酸之化學-物理特性類似之化學-物理特性。所需類似化學-物理特性包括電荷類似性、膨鬆度、疏水性、親水性及其類似特性。
融合蛋白：如本文所使用之術語「融合蛋白」或者「嵌合蛋白」係指經由接合兩個或者更多個原先獨立之蛋白質或者其部分產生之蛋白質。在一些具體例中，連接子或者間隔子存在於各蛋白質之間。融合蛋白之非限制性實施例為Fc融合蛋白。融合蛋白之非限制性實施例為血基質加氧酶1 (HO-1)-Fc融合蛋白。
半衰期：如本文所使用之術語「半衰期」為如在一定時間段開始時所量測之一定數量(諸如蛋白質濃度或者活性)降至其值之一半所需的時間。
血基質加氧酶或者重組血基質加氧酶：除非另外規定，否則如本文所使用之術語「血基質加氧酶(HO)」、「重組血基質加氧酶」、「HO-1」或者「rHO-1」係指保留實質性血基質加氧酶生物活性之任何野生型或者經修飾血基質加氧酶蛋白或者多肽(例如具有胺基酸突變、刪除、插入之血基質加氧酶蛋白及/或融合蛋白)。
改進、增加或者減少：如本文所使用之術語「改進」、「增加」或者「減少」或者文法等效物指示相對於諸如同一個體中在起始本文所描述之治療前之量測值或者對照個體(或者多個對照個體)中在不存在本文所描述之治療情況下之量測值的基線量測值而言的值。「對照個體」為罹患與所治療個體相同之疾病形式、年齡與所治療個體大約相同之個體。
抑制：如本文所使用之術語「抑制(inhibition、inhibit及inhibiting)」係指降低或者減少所關注之蛋白質或者基因之活性及/或表現之過程或者方法。通常，抑制蛋白質或者基因係指如藉由本文所描述之一或者多種方法所量測或者此項技藝中所辨識，使蛋白質或者基因之表現或者相關活性減少至少10%或者更多，例如20%、30%、40%或者50%、60%、70%、80%、90%或者更多，或者使表現或者相關活性降低大於1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或者更多。
活體外：如本文所使用之術語「活體外」係指事件發生在人工環境中(例如試管或者反應容器中)、細胞培養物中等而非多細胞生物體內。
活體內：如本文所使用之術語「活體內」係指事件發生在諸如人類及非人類動物之多細胞生物體內。在基於細胞之系統之情形下，該術語可用於指事件發生在活細胞內(與例如活體外系統相反)。
Ka ：如本文所使用之「Ka 」係指特定結合部分與目標用於形成結合部分/目標複合物之締合速率。
Kd ：如本文所使用之「Kd 」係指特定結合部分/目標複合物之解離速率。
KD ：如本文所使用之「KD 」係指解離常數，其自Kd 與Ka 之比(亦即Kd /Ka )獲得且以莫耳濃度(M)表示。KD 值可使用此項技藝中良好確立之方法(例如藉由使用表面電漿子共振)或者使用生物感測器系統(諸如Biacore®系統)來測定。
連接子：如本文所使用之術語「連接子」係指在融合蛋白中除出現在天然蛋白中之特定位置處之胺基酸序列以外的胺基酸序列，且一般設計成具可撓性或者設計成在兩個蛋白質部分之間插入諸如α-螺旋之結構。連接子亦稱為間隔子。連接子或者間隔子就其自身而言通常不具有生物功能。
多肽：如本文所使用之術語「多肽」係指經由肽鍵連接在一起之胺基酸之連續鏈。該術語用於指任何長度之胺基酸鏈，但一般熟悉本技藝者應理解，該術語不限於超長鏈且可指包含經由肽鍵連接在一起之兩個胺基酸之最小鏈。如熟悉本技藝者已知，多肽可經加工及/或修飾。如本文所使用之術語「多肽」及「肽」可互換使用。
預防：如本文所使用之術語「預防(prevent或prevention)」當與疾病、病症及/或病況之出現結合使用時係指降低罹患疾病、病症及/或病況之風險。參見「風險」之定義。
蛋白質：如本文所使用之術語「蛋白質」係指充當離散單元之一或者多個多肽。若單一多肽為離散運作單元且不需要與其他多肽永久性或者暫時性物理締合以便形成離散運作單元，則術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用。若離散功能單元由彼此物理上締合之超過一個多肽構成，則術語「蛋白質」係指物理上偶合且一起充當離散單元之多個多肽。
參考：「參考」實體、系統、量、條件集合等為如本文所描述相較於測試實體、系統、量、條件集合等而言之實體、系統、量、條件集合等。舉例而言，在一些具體例中，「參考」抗體為如本文所描述未經工程改造之對照抗體。
個體：如本文所使用之術語「個體」意謂需要診斷、預後或者療法之任何個體。舉例而言，個體可為哺乳動物，例如人類或者非人類靈長類動物(諸如猿、猴、紅毛猩猩或者黑猩猩)、狗、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛或者母牛。在特定具體例中，術語「個體」指人類患者，例如兒童、青年或成人。
實質同源性：片語「實質同源性」在本文中用於指胺基酸或者核酸序列之間之比較。如一般熟悉本技藝者應瞭解，若兩個序列在對應位置含有同源殘基，則其一般視為「實質上同源」。同源殘基可為一致殘基。可替代地，同源殘基可為具有適當類似之結構及/或功能特徵之不一致殘基。舉例而言，如一般熟悉本技藝者所熟知，某些胺基酸通常分類為「疏水性」或者「親水性」胺基酸且/或分類為具有「極性」或者「非極性」側鏈。使一種胺基酸經同一類型之另一胺基酸取代可常常視為「同源」取代。
如此項技藝中所熟知，胺基酸或者核酸序列可使用各種演算法中之任一種來比較，該等演算法包括可以諸如用於核苷酸序列之BLASTN以及用於胺基酸序列之BLASTP、gapped BLAST及PSI-BLAST之商業電腦程式獲得的演算法。例示性該等程式描述於Altschul等人, Basic local alignment search tool,J. Mol. Biol. , 215(3): 403-410, 1990；Altschul等人,Methods in Enzymology ；Altschul等人, 《Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs》,Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, 1997；Baxevanis等人,Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wiley, 1998；及Misener等人, (編),Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 第132卷), Humana Press, 1999中。除識別同源序列以外，上文所提及之程式通常亦提供同源性程度之指示。在一些具體例中，若兩個序列之對應殘基之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多在相關殘基延伸段上同源，則該等兩個序列視為實質上同源。在一些具體例中，相關延伸段為完整序列。在一些具體例中，相關延伸段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或者更多個殘基。
實質一致性：片語「實質一致性」在本文中用於指胺基酸或者核酸序列之間之比較。如一般熟悉本技藝者應瞭解，若兩個序列在對應位置含有一致殘基，則其一般視為「實質上一致」。如此項技藝中所熟知，胺基酸或者核酸序列可使用各種演算法中之任一種來比較，該等演算法包括可以諸如用於核苷酸序列之BLASTN以及用於胺基酸序列之BLASTP、gapped BLAST及PSI-BLAST之商業電腦程式獲得的演算法。例示性該等程式描述於Altschul等人, Basic local alignment search tool,J. Mol. Biol. , 215(3): 403-410, 1990；Altschul等人,Methods in Enzymology ；Altschul等人,Nucleic Acids Res . 25:3389-3402, 1997；Baxevanis等人,Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wiley, 1998；及Misener等人, (編),Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 第132卷), Humana Press, 1999中。 除識別一致序列以外，上文所提及之程式通常亦提供一致性程度之指示。在一些具體例中，若兩個序列之對應殘基之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多在相關殘基延伸段上一致，則該等兩個序列視為 在一些具體例中，相關延伸段為完整序列。在一些具體例中，相關延伸段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或者更多個殘基。
目標：如本文所使用之「目標」為由多特異性結合分子之結合部分特異性結合之任何分子。在一些具體例中，目標為FcR (例如FcRn)。術語「第一目標」及「第二目標」在本文中用於指兩個不同分子物種之分子，而非相同分子物種之兩個分子。舉例而言，在一些具體例中，第一目標為血清蛋白且第二目標為FcRn。
治療有效量：如本文所使用之術語「治療有效量」係指治療性分子(例如本文所描述之經工程改造之抗體)以適用於任何醫學治療之合理效益/風險比賦予所治療個體治療效果之量。治療效果可為客觀的(亦即可藉由某種測試或者標記量測)或者主觀的(亦即個體給出效果指示或者感覺到效果)。詳言之，「治療有效量」係指治療性分子或者組成物可有效治療、改善或者預防特定疾病或者病況或者可有效諸如藉由改善疾病相關症狀、預防或者延遲疾病發作及/或亦減輕疾病症狀之嚴重程度或者頻率來展現可偵測治療或者預防效果之量。治療有效量可在可包含多種單位劑量之給藥方案中投與。對於任何特定治療性分子，治療有效量(及/或有效給藥方案內之適當單位劑量)可例如視投與途徑、與其他醫藥劑之組合而變化。此外，特定於任何特定個體之治療有效量(及/或單位劑量)可視包括以下之各種因素而定：所治療之病症及病症之嚴重程度；所用特定醫藥劑之活性；所用特定組成物；個體之年齡、體重、一般健康、性別及膳食；所用特定治療性分子之投與時間、投與途徑及/或排泄或者代謝速率；治療持續時間；以及如醫學技藝中熟知之類似因素。
治療：如本文所使用之術語「治療(treatment、treat或treating)」)係指部分或者完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症及/或病況之一或者多種症狀或者特點、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其發生率之治療性分子(例如本文所描述之經工程改造之抗體)的任何投與。該治療可屬於不展現相關疾病、病症及/或病況之徵象之個體及/或僅展現疾病、病症及/或病況之早期徵象之個體。可替代地或者另外，該治療可屬於展現相關疾病、病症及/或病況之一或者多種已確立徵象之個體。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年7月26日申請之美國臨時專利申請案序號62/879,131；及2020年7月8日申請之63/049,285之優先權，該等案中之各者以全文引用之方式併入本文中聯邦資助研究聲明
本發明係根據國立衛生研究院(the National Institutes of Health)所授與之授權U01HL117721在具有美國政府支持之情況下製得。美國政府具有本發明之某些權利。序列表 此申請案包含之序列表已以ASCII格式電子提交並以全文引用之方式併入本文中。該ASCII文本係於2020年7月17日創建，名稱為SHR-2009WO_SL.txt且大小為200,037位元組。
本發明尤其提供使用作為治療性蛋白之重組血基質加氧酶-1 (HO-1)來治療鐮狀細胞疾病之方法及組成物。在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與可改善急性病例中之鐮狀細胞疾病之症狀。在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與可為長期預防提供治療模態。
本發明之各種態樣在隨附章節中得以詳細描述。章節之使用不意欲限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另外說明，否則「或者」之使用意謂「及/或」。鐮狀細胞疾病
鐮狀細胞疾病(SCD)為由以下造成之溶血性疾病：在染色體11上之β-血球蛋白基因中發生單鹼基對取代，在血紅素之β-血球蛋白鏈之位置六中導致麩胺酸向纈胺酸之胺基酸轉換。此舉導致經去氧血紅素經由疏水相互作用與其他血紅素分子聚合，在紅血球內形成剛性聚合物聚集物(血紅素S)，使該等紅血球之形狀歪曲，將其壽命自120天縮短至15天，且促使血管內溶血。當紅血球(erythrocyte)溶解時，胞外血紅素(Hb)得以釋放且自Fe2+ 氧化成三價鐵Fe3+ 血紅素(變性血紅素)，該變性血紅素將血基質釋放至循環中。Hb之氧化釋放胞外血基質，促使血管發炎及包括疼痛性血管阻塞性危象(VOC)及急性胸部症候群(ACS)之SCD損傷。患有嚴重症狀之患者之血基質含量可能高達2.2 mM。(Ghosh等人, 2013J Clin Invest . 2013;123(11):4809-4820)。
SCD患者之血管內溶血造成氧化損傷且觸發發炎級聯反應。游離血基質增加內皮黏附分子及細胞凋亡標記物之表現，促使經活化白血球及RBC附著至血管壁。慢性溶血可能導致經降低之紅血球計數及貧血。慢性貧血可能導致心肌梗塞及經增加之心輸出量。梗塞可能導致骨壞死及關節損壞。
血管阻塞可能導致腿部潰瘍及肌筋膜症候群，且導致約25%之45歲患者中風。SCD患者罹患諸如血管阻塞性危象(VOC)之併發症，該等VOC之特徵在於嚴重疼痛，係由血管阻塞造成，該血管阻塞係由剛性鐮狀RBC、經活化白血球及可能性血小板附著至底層經活化受損血管內皮導致。
脂肪栓塞或者骨缺血可能導致急性胸部症候群(ACS)。急性胸部症候群(ACS)為鐮狀細胞疾病(SCD)之主要肺部併發症。在其之前通常存在急性血管阻塞性危象及急性溶血。ACS診斷與血紅素(Hb)濃度降低、低血氧症及多小葉肺浸潤相關聯。ACS中之肺損傷之特徵主要在於水腫形成。來源於紅血球溶解之危險相關分子模式分子可能最終造成ACS中之肺損傷。氯化血紅素(Hb之經氧化輔成部分)為TLR4之強效發炎性促效劑及活化劑。溶血必然導致氯化血紅素釋放至胞外空間中。此過程有可能在SCD中加速，此係歸因於鐮狀細胞氧血紅素之自動氧化增強及鐮狀紅血球內部存在高濃度(∼1 μM)游離氯化血紅素。已顯示在小鼠模型中氯化血紅素誘發ACS。
肝缺血可能導致肝功能障礙。腎衰竭可能發生在約20% SCD患者中。受損脾功能導致高感染發生率。器官損傷為SCD患者之關鍵死因。在美國，類鴉片(例如嗎啡、氫嗎啡酮、芬太尼(fentanyl))通常用於控制VOC疼痛，其帶有成癮風險及明顯副作用。
在新生兒中，紅血球含有大比例之胎血紅素，亦即血紅素F，該血紅素F以比成人血紅素更大之親和力結合至氧。在生育之後，成人血紅素，亦即血紅素A表現增加。在患有鐮狀細胞貧血之兒童中，缺陷性血紅素S產生且持續至成年。由於生育時之胎血色素含量升高，故生育之後6個月之前患者通常不展現鐮狀細胞疾病徵象。除血管阻塞以外，SCD之常見症狀亦體現為因貧血所致之疲勞、運動不耐及呼吸短促。小兒患者可能經受生長遲緩及發燒，而成人可能呈現潰瘍或者骨損傷。其他症狀包括黃疸、排尿頻繁及肌無力。
與HO-1活性增加有關之HO-1基因啟動子多形現象與患有SCD之兒童當中之ACS發生率降低相關聯(Bean等人, 2012)。患有多次ACS發作之兒童相較於年齡匹配之不具有ACS病史之對應者而言具有顯著較高之血漿血基質含量(Adisa等人, 2013)。此種情況可能導致急性溶血、嚴重低血氧症及大量肺浸潤。諸如對動脈氧飽和度(SpO2 %)、血紅素(Hb)、總血漿血基質(TPH)及膽紅素含量、肺重量、組織病理學以及血管阻塞之影響之生物標記可用於診斷中。僅兩種改善SCD疾病口服療法，亦即羥脲(HU)及恩達里(Endari) (L-麩醯胺酸)得到批准，且替代性長期輸血為唯一選項。羥脲原先在1998年僅在成人中得到FDA批准，且對於兒童，歷經2年在2017年12月得到批准。此舉幫助紅血球保持其形狀及可撓性，減少併發症及頻繁輸注需要。羥脲之常見副作用包括低血液計數、胃腸道症狀及食慾缺乏。另外，預防性羥脲之有效性受因可變有效性、副作用及需要頻繁血球計數監測之毒性所致之不良患者順適性限制。恩達里(L-麩醯胺酸)在2017年7月批准用於5歲及更年長患者以減少包括稱為鐮狀細胞危象之突發嚴重疼痛之SCD急性併發症。恩達里之常見副作用包括便秘、噁心、頭痛、腹痛、咳嗽、肢痛、背痛及胸痛。使用L-麩醯胺酸進行之預防僅具有適度臨床效果。沃塞洛托(Voxelotor)已經批准用於治療貧血，但其不降低VOC發生率。克里贊珠單抗(Crizanlizumab)需要每月IV輸注，此舉可能導致不良順適性。骨髓或者幹細胞移植可為患有嚴重SCD之較年輕患者之選項，但此種情況使找到匹配骨髓或者幹細胞捐贈者成為必要且相關移植手術風險可能嚴重且潛在地危及生命。定期輸血常用於治療貧血且預防長期併發症。此項技藝中需要研發用於治療患有鐮狀細胞疾病且經受VOC之患者之治療性分子。重組血基質加氧酶 -1
血基質加氧酶保護內皮及組織免於溶血及氧化應激。誘導HO-1表現可保護組織及細胞免於缺血、氧化應激、發炎、移植排斥、細胞凋亡及細胞增殖。血基質加氧酶1 (HO-1)在血基質解毒中藉由將血基質降解成鐵、一氧化碳及膽綠素而發揮重要作用。HO-1特異性地靶向游離血基質且將其降解成細胞保護性/消炎副產物。因為rHO-1基於內源蛋白，故其可將偏離目標作用顯著地降至最低。
在一些具體例中，如本文所使用，適用於本發明之重組血基質加氧酶蛋白包括保持實質性血基質加氧酶生物活性之任何野生型及經修飾血基質加氧酶蛋白(例如具有胺基酸突變、刪除、插入之血基質加氧酶蛋白及/或融合蛋白)。通常，重組血基質加氧酶蛋白係使用重組技術產生。然而，自天然來源純化或者以化學方式合成之血基質加氧酶蛋白(野生型或者經修飾)可根據本發明來使用。
在一些具體例中，合適重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶融合蛋白之活體內半衰期為或者長於約1分鐘、2分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、12小時或者24小時。在一些具體例中，合適重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶融合蛋白之活體內半衰期為或者長於約24小時、30小時、36小時、42小時、48小時、54小時或者60小時。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白之活體內半衰期介於0.5小時與24小時之間、介於1天與10天之間、介於1天與9天之間、介於1天與8天之間、介於1天與7天之間、介於1天與6天之間或者介於1天與5天之間。
在一些具體例中，本文呈現經工程改造之重組血基質加氧酶變異體。在一些具體例中，經工程改造之重組HO變異體融合至IgG Fc。在一些具體例中，經工程改造之重組HO變異體融合至人類IgG1 Fc。
在一些具體例中，本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白包含SEQ ID NO: 1。 MERPQPDSMPQDLSEALK18 EAT21 KEVH25 TQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAY134 TRYLGDLSG143 GQVL147 KKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFK179 QLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAF207 LLNIQLFEELQELLTHDTK226 DQ S22 9 PSRA233 PGLR237 QRASNKVQDSAPVETPRGKPPLN T261 RSQA265 PLLRWVLTLSFLVATVAVGLYAM (SEQ ID NO: 1)。
在一些具體例中，重組HO-1含有包含SEQ ID NO: 1之殘基18、21、25、134、143、147、179、207 之血基質結合袋。在一些具體例中，重組HO-1在SEQ ID NO: 1之殘基S229 處 經磷酸化。在一些具體例中，重組HO-1包含用於促進大腸桿菌(E coli)表現之在殘基261處之取代。在一些具體例中，殘基261為蘇胺酸(T)。在一些具體例中，重組HO-1在殘基K226 、A233 、R237 、A265 處具有經截短HO-1表現。在一些具體例中，重組HO-1包含內質網(ER)膜結合區。在一些具體例中，ER膜結合區包含胺基酸序列PLLRWVLTLSFLVATVAVGLYAM (SEQ ID NO: 40)。
在一些具體例中，本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白包含SEQ ID NO: 2。 MERPQPDSMPQDLSEALK18 EAT21 KEVH25 TQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAY134 TRYLGDLSG143 GQVL147 KKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFK179 QLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAF207 LLNIQLFEELQELLTHDTK226 DQS229 PSRA233 PGLR237 QRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT261 HHHHHH (SEQ ID NO: 2)。
在一些具體例中，本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白包含SEQ ID NO: 3。 MERPQPDSMPQDLSEALK18 EAT21 KEVH25 TQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAY134 TRYLGDLSG143 GQVL147 KKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFK179 QLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAF207 LLNIQLFEELQELLTHDTK226 DQS229 PSRA233 PGLR237 QRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT261 (SEQ ID NO: 3)。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或者SEQ ID NO: 3具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%序列一致性之序列。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶包含經截短HO-1，其中HO-1包含選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之1-226、1-229、1-233、1-239及1-265。缺少該ER膜結合區之經截短HO-1係特別有用於此處揭示的治療應用，例如包含殘基SEQ ID NO: 1之1-226或SEQ ID NO: 1之1-261的經截短HO-1，其適合實施所請發明。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 1之約1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10個殘基之N端刪除之經截短HO-1。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 1之約1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10個殘基之C端刪除之經截短HO-1。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 1之殘基10-225之經截短HO-1。在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 1之殘基10-226之經截短HO-1。在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 1之殘基10-261之經截短HO-1。在一些具體例中，重組血基質加氧酶包含選自由以下組成之群之經截短HO-1：殘基10-226、10-229、10-233、10-239及10-265。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白含有包含K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179及/或F207 (根據SEQ ID NO: 1)之胺基酸殘基。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白含有包含K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179、F207之胺基酸殘基且進一步包含K226、A233、R237、T261及/或A265 (根據SEQ ID NO: 1)。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白包含一或者多個胺基酸取代，其中胺基酸取代為F33L (根據SEQ ID NO: 1)。HO-1 融合蛋白
預期合適重組HO-1蛋白可呈融合蛋白組構。舉例而言，適用於本發明之重組HO-1蛋白可為介於HO-1域與另一域或者部分之間之融合蛋白，該另一域或者部分通常可例如藉由增強或者增加HO-1蛋白之穩定性、效力及/或遞送、或者降低或者消除免疫原性或者清除率來促進HO-1之治療效果。該等適用於HO-1融合蛋白之域或者部分包括但不限於Fc域、XTEN域或者人類白蛋白融合體。Fc 域
在一些具體例中，合適重組HO-1蛋白包含結合至FcRn受體之Fc域或者其部分。作為非限制性實施例，合適Fc域可來源於諸如IgG之免疫球蛋白子類。在一些具體例中，合適Fc域來源於IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4。在一些具體例中，合適Fc域來源於IgM、IgA、IgD或者IgE。尤其合適之Fc域包括來源於人類或者人類化抗體之Fc域。在一些具體例中，合適Fc域為諸如經修飾人類Fc部分之經修飾Fc部分。
在一些具體例中，合適Fc域包含如表 1 中所提供之胺基酸序列。 表1. 例示性Fc域
序列 ID 號 ( 說明 ) Fc 域 *
SEQ ID NO:15 (野生型人類IgG1 Fc) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:16 (人類IgG1 Fc-LALA)    DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:17 (人類IgG1 Fc-NHance)    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKF HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:18 (人類IgG1 Fc-LALA + NHance)    DKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALKF HYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:19 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:20    KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
*LALA及NHance突變加底線。
在一些具體例中，合適Fc域包含與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19或者SEQ ID NO: 20具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同源性或者一致性之胺基酸序列。
預期Fc域與FcRn受體之間之經改進結合引起重組蛋白之血清半衰期延長。因此，在一些具體例中，合適Fc域包含引起與FcRn之結合改進之一或者多個胺基酸突變。實現與FcRn之結合改進之Fc域內之各種突變為此項技藝中已知的且可適合於實踐本發明。在一些具體例中，合適Fc域包含在對應於根據EU編號之人類IgG1之Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His 433及/或Asn 434之一或者多個位置處的一或者多個突變。
在一些具體例中，合適Fc域包含在對應於根據EU編號之人類IgG1之L234、L235、H433及N434之一或者多個位置處的一或者多個突變。
重組融合蛋白之Fc部分可引起表現Fc受體之細胞之靶向，導致促發炎作用。Fc域中之一些突變減少重組蛋白與Fc γ受體之結合且藉此抑制效應功能。在一個具體例中，效應功能為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。舉例而言，合適Fc域可含有L234A突變(Leu234Ala)及/或L235A突變(Leu235Ala) (EU編號)。在一些具體例中，L234A及L235A突變亦稱為LALA突變。作為非限制性實施例，合適Fc域可含有突變L234A及L235A (EU編號)。例示性包含L234A及L235A突變之Fc域序列顯示為表1中之SEQ ID NO: 16。
在一些具體例中，合適Fc域可含有H433K突變(His433Lys)及/或N434F突變(Asn434Phe) (EU編號)。作為非限制性實施例，合適Fc域可含有突變H433K及N434F (EU編號)。在一些具體例中，H433K及N434F突變亦稱為NHance突變。例示性併有突變H433K及N434F之Fc域序列顯示為表1中之SEQ ID NO: 17。
在一些具體例中，合適Fc域可含有L234A突變(Leu234Ala)、L235A突變(Leu235Ala)、H433K突變(His433Lys)及/或N434F突變(Asn434Phe) (EU編號)。作為非限制性實施例，合適Fc域可含有突變L234A、L235A、H433K及N434F (EU編號)。在一些具體例中，合適Fc域可包含突變L234A/L235A、T350V、T366L、K392L、T394W。例示性併有突變L234A、L235A、H433K及N434F之Fc域序列顯示為表1中之SEQ ID NO: 18。
在一些具體例中，合適Fc域的鏈A及鏈B可含有互補突變組。該等組包括，例如(i)鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，鏈B：T350V/T366L/K392L/T394W；(ii)鏈A：T366W、S354C；鏈B：T366S、L368A、Y407V、Y349C；(iii)鏈A：K392D、K409D；鏈B：D399K、E356K；(iv)鏈A：K360E、K409W、Y349C；鏈B：Q347R、D399V、F405T、S354C；(v)鏈A：T366W；鏈B：T366S、L368A、Y407V；(vi)鏈A：K360E、K409W，鏈B：Q347R、D399V、F405T；及(vii)鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，鏈B：T350V/T366L/K392L/ T394W。
可包括於Fc域中之額外胺基酸取代包括例如以下中所描述之胺基酸取代：美國專利第6,277,375號、第8,012,476號及第8,163,881號；T.S. Von Kreutenstein等人 Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design mAbs, 5 (2013), 第646-654頁；及Ha J-H, Kim J-E及Kim Y-S (2016) Immunoglobulin Fc Heterodimer Platform Technology: From Design to Applications in Therapeutic Antibodies and Proteins. Front. Immunol. 7:394；該等案及參考文獻以引用之方式併入本文中。例示性 HO-1 融合蛋白
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白在N端處融合至Fc。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白融合至C端。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白包含多聚體，其含有包含融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域之至少一個單體。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白包含多聚體，其含有包含不融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域之至少一個單體。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白為二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或者更大聚集物。
在一些具體例中，一重組血基質加氧酶二聚體蛋白含有包含融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域（通常為人類Fc域）之一個單體及包含不融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域（通常為人類Fc域）之另一單體。該Fc域可融合至重組血基質加氧酶蛋白域之N端或是C端，可選擇性地經由一連接子。該可選擇性的連接子可包含胺基酸序列GGGGS的多個（例如1至4）重複。該血基質加氧酶蛋白域可為一血基質加氧酶蛋白之酶活性片段，例如適合用於該發明之酶活性片段可包含一具有SEQ ID NO:1之殘基1-261或1-226的胺基酸序列。於一特定具體例中，一Fc域係融合至該血基質加氧酶蛋白域之C端，其通常不存在有連接子。
在一些具體例中，Fc域包含用於增強半衰期、減少聚集且/或更改效應功能之一或者多個突變。
在一些具體例中，IgG1 Fc區包含在位置234、235、251、252、254、255、256、308、309、311、312、314、385、386、387、389、428、433、434、435及/或436 (根據EU編號)處之胺基酸取代。
在一些具體例中，Fc區包含L234A及L235A胺基酸取代。
在一些具體例中，該Fc域係融合至重組血基質加氧酶蛋白域，且該Fc域未融合至一包含幫助異二聚體形成的互補突變，該等位於兩個Fc域（分別作為鏈A及鏈B）中之突變的互補組可包括，例如(i)鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，鏈B：T350V/T366L/K392L/T394W；(ii)鏈A：T366W、S354C；鏈B：T366S、L368A、Y407V、Y349C；(iii)鏈A：K392D、K409D；鏈B：D399K、E356K；(iv)鏈A：K360E、K409W、Y349C；鏈B：Q347R、D399V、F405T、S354C；(v)鏈A：T366W；鏈B：T366S、L368A、Y407V；(vi)鏈A：K360E、K409W，鏈B：Q347R、D399V、F405T；及(vii)鏈A：T350V/L351Y/F405A/Y407V，鏈B：T350V/T366L/K392L/T394W。於血基質加氧酶域（通常為酶活性片段，其包含一具有SEQ ID NO:1之殘基1-261或1-226的胺基酸序列）為單價之重組異二聚體蛋白，其包括具有上述突變之互補組（例如所列舉的組(i)、(iv)或(vii)）的Fc域，展現穩健酶活性且可以高產率純化。
在其他具體例中，該包含融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域的單體及該包含不融合至重組血基質加氧酶蛋白域之Fc域的單體係經連接（例如經由一連接子，其包含胺基酸序列GGGGS的多個（例如6至10）重複），因而形成一單鏈重組血基質加氧酶蛋白。在一特定具體例中，兩個經連接的Fc域係融合至該血基質加氧酶蛋白域的C端。通常不需要連接子將兩個經連接的Fc域融合至該血基質加氧酶蛋白域。為了更大的穩定性，該兩個經連接的Fc域（分別作為鏈A及鏈B）可包括逆電荷突變，例如鏈A：E357K；鏈B：K370D。
在另一具體例中，一重組血基質加氧酶二聚體蛋白包含兩個單體，其各包含一Fc域融合至一重組血基質加氧酶蛋白域。在此具體例中，該兩個單體可為相同，而導致血基質加氧酶二價同二聚體之形成。該Fc域可融合至重組血基質加氧酶蛋白域之N端或是C端，可選擇性地經由一連接子。該可選擇性的連接子可包含胺基酸序列GGGGS的多個（例如1至4）重複。該血基質加氧酶蛋白域可為一血基質加氧酶蛋白之酶活性片段，例如適合用於該發明之酶活性片段可包含一具有SEQ ID NO:1之殘基1-261或1-226的胺基酸序列。於一些具體例中，一Fc域係融合至該血基質加氧酶蛋白域之C端（例如包含具有SEQ ID NO:1之殘基1-226的胺基酸序列之酶活性片段），其通常不存在有連接子。已發現將一Fc域融合至血基質加氧酶蛋白域的C端以產生重組血基質加氧酶同二聚體蛋白，其具有可以高產率純化的穩健酶活性。
在某些具體例中，如本文所描述之經工程改造之蛋白質可經PEG化以包括單或者聚(例如2-4) PEG部分。與未經PEG化參考蛋白，例如具有相同胺基酸序列但具有不同PEG化、不同量之PEG化或者不具有PEG化之蛋白質相比，該等經PEG化蛋白可展現經延長半衰期。用於製備經PEG化蛋白之方法一般可包括(a)使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或者醛衍生物)在條件下反應，由此多肽變得連接至一或者多個PEG基團；及(b)獲得一或者多種反應產物。一般而言，反應條件可基於已知參數及所需結果逐案確定。多種PEG連接方法可供熟悉本技藝者使用。舉例而言，PEG化本文所描述之多特異性結合分子之步驟可經由用反應性聚乙二醇分子進行之醯化反應或者烷基化反應來實施。
在一些具體例中，血清半衰期係藉由結合至同源胺基酸聚合物(HAP化)、結合至脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS，PAS化)或者結合至彈性蛋白樣肽(ELP化)或者與人工GLK融合來延長。
在一些具體例中，經工程改造之蛋白質之血清半衰期得到延長。舉例而言，經工程改造之蛋白質與FcRn之結合使抗體之血清半衰期延長至約4天至約45天，例如約5天至約30天、約10天至約30天或者約20天至約30天。在某些具體例中，本文所描述之經工程改造之抗體之血清半衰期為約5天、約10天、約15天、約20天、約25天、約30天、約35天、約40天、約45天、約50天或者更長時間。
在一些具體例中，血清半衰期係藉由結合至人類血清白蛋白或者運鐵蛋白或者人類IgG、經由基因融合或者藉由非共價結合或者化學接合來延長。
在一些具體例中，血清半衰期係藉由與諸如羧基末端肽(CTP，屬於絨毛膜促性腺激素β鏈)之陰離子型高度唾液酸化肽融合來延長。
在一些具體例中，血清半衰期係藉由使用連接子來延長。
在一些具體例中，聚集係藉由使用連接子來減少。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之連接子序列。
在一些具體例中，聚集係藉由使用單體或者單鏈部分來減少。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 4之Fc融合體(1-261-Fc V1)： MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQEL LTHDTKDQSP SRAPGLRQRASNKVQDSAPV ETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4)。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 4之1-161 Fc及含MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RC (SEQ ID NO: 9)信號肽之Fc融合體。
在一些具體例中，重組HO-1包含野生型HO-1之胺基酸1-261。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體包含具有LALA突變之IgG1 Fc。參見 Hezareh等人,J. Virol. 75, 12161-12168 (2001)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 4具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 5之Fc融合體(1-261-Fc V2)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 5具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQEL LTHDTKDQSP SRAPGLRQRASNKVQDSAPV ETPRGKPPLNT GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5)
在一些具體例中，rHO-1包含信號肽。在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 5之1-161 Fc及含MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RC (SEQ ID NO: 9)信號肽之Fc融合體。
在一些具體例中，rHO-1包含連接子肽。在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 62；「GGGGS」如SEQ ID NO:10所揭示)。在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 10)之兩個或者更多個重複序列。在一些具體例中，連接子包含GGGGS (SEQ ID NO: 21；「GGGGS」如SEQ ID NO:10所揭示)之4個重複序列。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶含有包含SEQ ID NO: 6之Fc融合體(1-261-Fc V3)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 6具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS ERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSS GEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQEL LTHDTKDQSP SRAPGLRQRASNKVQDSAPV ETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 6)
在一些具體例中，rHO-1包含信號肽。在一些具體例中，信號肽包含MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RC (SEQ ID NO: 9)。在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 6之1-161 Fc及含MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RC (SEQ ID NO: 9)信號肽之Fc融合體。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 7之Fc融合體(1-261-Fc V4鏈A)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 7具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVY PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFA LV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 7)
在一些具體例中，rHO-1包含信號肽。在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 7之1-161 Fc及含MDMRVPAQLL GLLLLWFPGS RC (SEQ ID NO: 9)信號肽之Fc融合體。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 7之Fc融合體(1-261-Fc V4鏈A)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 41)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 41具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。METPAQLLFLLLLWLPDTTG MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 41)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 8之Fc融合體(1-261-Fc V4鏈B)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 8具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 8)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 8之Fc融合體(1-261-Fc V4鏈B)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 42)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 42具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。METPAQLLFLLLLWLPDTTG DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 42)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 22之Fc融合體(1-261-Fc V5鏈A、T366W及S354C；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 22具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 22)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 22之Fc融合體(1-261-Fc V5鏈A、T366W及S354C；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 43)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 43具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 43)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 23之Fc融合體(1-261-Fc V5鏈B、T366S、L368A、Y407V及Y349C)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 23具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLS CA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 23)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 23之Fc融合體(1-261-Fc V5鏈B、T366S、L368A、Y407V及Y349C)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 44)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 44具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTKNQVSLS CA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 44)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 24之Fc融合體(1-261-Fc V6鏈A、K392D、K409D，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 24具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。S DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYD TTPPVLDSDGSFFLYSD LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 24)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 24之Fc融合體(1-261-Fc V6鏈A、K392D、K409D)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 45)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 45具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 45)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 25之Fc融合體(1-261-Fc V6鏈B、D399K、E356K，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 25具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRK ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLK SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 25)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 25之Fc融合體(1-261-Fc V6鏈B、D399K、E356K)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 46)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 46具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 46)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 26之Fc融合體(1-261-Fc V7鏈A、K360E、K409W、Y349C，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 26具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 26)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 26之Fc融合體(1-261-Fc V7鏈A、K360E、K409W、Y349C)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 47)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 47具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT (SEQ ID NO: 47)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 27之Fc融合體(1-261-Fc V7鏈B、Q347R、D399V、F405T、S354C，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 27具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 27)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 27之Fc融合體(1-261-Fc V7鏈B、Q347R、D399V、F405T、S354C)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 48)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 48具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPC RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 48)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 28之Fc融合體(1-261-Fc V8鏈A、T366W，加粗；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 28具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLW CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 28)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 28之Fc融合體(1-261-Fc V8鏈A、T366W)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 49)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 49具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 49)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 29之Fc融合體(1-261-Fc V8鏈B、T366S、L368A、Y407V，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 29具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLS CA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 29)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 29之Fc融合體(1-261-Fc V8鏈B、T366S、L368A、Y407V)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 50)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 50具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 50)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 30之Fc融合體(1-261-Fc V9鏈A、K360E、K409W，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 30具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:30)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 30之Fc融合體(1-261-Fc V9鏈A、K360E、K409W)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 51)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 51具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTE NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSW LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:51)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 31之Fc融合體(1-261-Fc V9鏈B、Q347R、D399V、F405T，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 31具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPR VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLV SDGSFT LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 31)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 31之Fc融合體(1-261-Fc V9鏈B、Q347R、D399V、F405T)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 52)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 52具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 52)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 32之Fc融合體(1-226-Fc V10鏈A、T350V、L351Y、F405A、Y407V，加粗；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 31具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVY PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFA LV SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 32)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 32之Fc融合體(1-226-Fc V10鏈A、T350V、L351Y、F405A、Y407V)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 53)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 53具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。METPAQLLFLLLLWLPDTTG MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 53)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 33之Fc融合體(1-226-Fc V10鏈B、T350V、T366L、K392L、T394W，加粗)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 33具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYV LPPSRDELTKNQVSLL CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYL TW PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 33)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 33之Fc融合體(1-226-Fc V10鏈B、T350V、T366L、K392L、T394W)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 54)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 54具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。METPAQLLFLLLLWLPDTTG DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYV LPPSRDELTKNQVSLL CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYL TW PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 54)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 34之Fc融合體(1-226-Fc V11；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 34具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK (SEQ ID NO: 34)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 34之Fc融合體(1-226-Fc V11)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 55)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 55具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGMERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK (SEQ ID NO: 55)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 35之Fc融合體(1-226-Fc V12；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 35具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 35)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 35之Fc融合體(1-226-Fc V12)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 56)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 56具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 56)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 36之Fc融合體(1-261-Fc V13；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 36具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 36)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 36之Fc融合體(1-261-Fc V13)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 57)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 57具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 57)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 37之Fc融合體(1-261-Fc V14；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 37具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 37)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 37之Fc融合體(1-261-Fc V14)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 58)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 58具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNT PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 58)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 38之Fc融合體(1-226-Fc V15；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 38具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 38)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 38之Fc融合體(1-226-Fc V15)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 59)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 59具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 59)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 39之Fc融合體(1-226-Fc V16；HO-1加底線)。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與SEQ ID NO: 39具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100% 一致性之序列。MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTK PAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 39)
在一些具體例中，重組血基質加氧酶為包含SEQ ID NO: 39之Fc融合體(1-226-Fc V16)。在一些具體例中，rHO-1 Fc融合體係經信號肽(SEQ ID NO: 60)表現。在一些具體例中，信號肽裂解。在一些具體例中，rHO-1-Fc融合體包含與包括下文加粗顯示之信號肽之SEQ ID NO: 60具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或者100%一致性之序列。MGWSCIILFLVATATGVHS MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYHIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQRYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDKLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 60)連接子或者間隔子
HO-1域可直接地或者間接地連接至Fc域。在一些具體例中，合適重組HO-1蛋白包含連接HO-1域與Fc域之連接子或者間隔子。胺基酸連接子或者間隔子一般設計成具可撓性或者設計成在兩個蛋白質部分之間插入諸如α-螺旋之結構。連接子或者間隔子可相對短，或者可較長。通常，連接子或者間隔子在長度方面包含例如3-100 (例如5-100、10-100、20-100、30-100、40-100、50-100、60-100、70-100、80-100、90-100、5-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20)個胺基酸。在一些具體例中，連接子或者間隔子之長度等於或者長於2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者100個胺基酸。通常，較長連接子可減少位阻。在一些具體例中，連接子包含甘胺酸及絲胺酸殘基之混合物。在一些具體例中，連接子可另外包含蘇胺酸、脯胺酸及/或丙胺酸殘基。因此，在一些具體例中，連接子包含介於10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、10-15個之間之胺基酸。在一些具體例中，連接子包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或者95個胺基酸。
作為非限制性實施例，適用於本發明之連接子或者間隔子包括但不限於： GGGGS (SEQ ID NO:10) (GGGGS)n (SEQ ID NO:10) GGG (SEQ ID NO:11); GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG連接子，SEQ ID NO:12)；GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG2連接子，SEQ ID NO:13)；GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP (GAG3連接子，SEQ ID NO:14)；及 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 65)。
合適連接子或者間隔子亦包括具有與上文例示性連接子(例如GAG連接子(SEQ ID NO: 12)、GAG2連接子(SEQ ID NO: 13)或者GAG3連接子(SEQ ID NO: 14))具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多同源性或者一致性之胺基酸序列的連接子或者間隔子。適用於與一些具體例一起使用之額外連接子可在2012年3月2日申請之US20120232021中找到，該案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些具體例中，提供締合HO-1多肽與Fc域且不實質上影響HO-1多肽結合至其同源配位體中之任一者(例如血基質)之能力的連接子。在一些具體例中，提供連接子以使得HO-1肽與血基質之結合相較於單獨HO-1多肽而言未受到更改。核苷酸序列
本發明包括編碼以下之核苷酸序列：一或者多個信號肽、輕鏈、重鏈、重鏈恆定域、輕鏈恆定域或者其他免疫球蛋白樣序列、抗體、連接子序列、包含血基質加氧酶蛋白之序列或者其片段，包括本文所揭示之變異體或者結合分子。在各種情況下，該等核苷酸序列可存在於載體中。在各種情況下，該等核苷酸可存在於細胞之基因體中，該細胞為例如需要治療之個體之細胞或者用於產生經截短蛋白或者融合蛋白之細胞，例如用於產生經截短蛋白或者融合蛋白之哺乳動物細胞。在一些具體例中，用於HO-1 (例如經截短HO-1及HO-1 Fc融合蛋白)之蛋白質表現之核苷酸序列經密碼子最佳化。在一些具體例中，核苷酸序列經密碼子最佳化以用於蛋白質表現來促進HO-1之大腸桿菌表現。在一些具體例中，核苷酸序列經密碼子最佳化以用於蛋白質表現來促進HO-1 Fc融合蛋白(例如1-261-Fc V1-V4)之CHO細胞表現。
如本文所使用之術語「Fc片段」係指保持本文所描述之Fc功能及/或活性，諸如與Fc受體之結合之Fc區的一或者多個片段。
在一些具體例中，本文所描述之多特異性分子為經工程改造之抗體(例如經工程改造以具有與抗原及FcRn之pH敏感性結合)。
在一些具體例中，結合部分為或者包括抗體(例如IgG抗體，例如IgG1、IgG2或者IgG3抗體)或者抗原結合片段，該抗體或者抗原結合片段相對於參考抗體或者抗原結合片段而言以經更改方式(例如以pH敏感性方式，例如以或者高或者低pH敏感性方式)經工程改造以結合至目標(亦即抗原)。舉例而言，抗體可藉由修飾(例如藉由添加、刪除或者取代)一或者多個抗體CDR內及/或抗體CDR結構中所涉及之位置處之胺基酸來進行工程改造。例示性非限制性可經修飾之抗體之位點包括以下(基於Kabat編號指示胺基酸位置(Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH))。
重鏈：H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、H100b及H102。
輕鏈：L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92及L94。
在一些具體例中，此等所揭示之胺基酸中之一或者多者可經組胺酸、精胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸或者麩醯胺酸取代。在不希望受理論束縛之情況下，咸信用組胺酸取代此等位置中之一或者多個處之胺基酸可產生具有pH依賴性抗原結合特性之抗體。在一些具體例中，非組胺酸殘基經組胺酸殘基取代。在一些具體例中，組胺酸殘基經非組胺酸殘基取代。額外經工程改造之抗原結合區包括例如美國公開 第20110229489號中所描述之經工程改造之抗原結合區。
在一些情況下，結合部分為或者包括結合一或者多個Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcγRIV或者FcRn受體)之抗體恆定區、Fc區或者Fc片段。在一些具體例中，相對於參考恆定區、Fc區或者Fc片段而言，恆定區、Fc區或者Fc片段以經更改方式(例如以pH敏感性方式，例如以或者高或者低pH敏感性方式)經工程改造以結合至目標(例如Fc受體)。
在一些情況下，結合部分可為或者包括經工程改造以包括本文所描述之胺基酸殘基中之一或者多者(例如251-256、285-290、308-314、385-389及428-436 (Kabat編號(Kabat等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)))之胺基酸添加、刪除或者取代之IgG抗體的恆定區、Fc區或者Fc片段。重組基因技術
根據本發明，可在此項技藝內採用習知分子生物學、微生物學及重組DNA技術。該等技術描述於文獻中(參見例如, Sambrook, Fritsch及Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；DNA Cloning: A Practical Approach, 第I及II卷(D. N. Glover編1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編(1985))；Transcription And Translation (B. D. Hames及S. J. Higgins編(1984))；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編(1986))；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986))；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F. M. Ausubel 等人 (編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
諸如編碼多肽(諸如本文所描述之經工程改造之抗體)之核酸之基因之重組表現可包括含有編碼多肽之核酸之表現載體的構築。一旦已獲得多核苷酸，則用於產生多肽之載體可藉由重組DNA技術使用此項技藝中已知之技術來產生。可使用已知方法以構築含有編碼多肽之序列以及適當轉錄及轉譯控制信號之表現載體。此等方法包括例如活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。
表現載體可藉由習知技術轉移至宿主細胞，且隨後經轉染細胞可藉由習知技術進行培養以產生多肽。治療方法
本發明亦提供發明之重組血基質加氧酶-1（rHO-1），其係用於治療需要此治療之個體中之鐮狀細胞疾病的方法。如本文所描述，本發明提供治療鐮狀細胞疾病之方法，其包含向需要治療之個體投與重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)。本發明亦提供發明之重組血基質加氧酶-1（rHO-1），其係用於製造治療需要此治療之個體中之鐮狀細胞疾病的藥物。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白係靜脈內投與。
在一些具體例中，與對照樣品相比，重組血基質加氧酶之投與至一個體引起血清中之游離血基質含量減少95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或者50%。該對照樣品可為取自以重組血基質加氧酶治療前之個體的血清樣品。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與引起血清中之游離血基質含量減少。在一些具體例中，血清中之游離血基質含量減少約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或2%。在一些具體例中，游離血基質含量減少5 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、16 μM、17 μM、18 μM、19 μM、20 μM或者更多，以接近健康成人（例如約20 μM）之含量。
在一些具體例中，相對於對照個體而言，重組血基質加氧酶之投與至一個體引起血清中之重組血基質加氧酶活性增加2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或者更多。在一些具體例中，相對於對照個體而言，重組血基質加氧酶之投與至一個體引起血清中之重組血基質加氧酶活性增加2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、或者更多。該對照個體可為投與重組血基質加氧酶前之個體。
在一些具體例中，對照個體之內源性HO-1含量為大約1 ng/ml (參見例如, Bao等人PLoS, 2010)。
在一些具體例中，相對於健康個體中之正常血清HO-1活性而言，重組血基質加氧酶之投與引起血清中之重組HO-1活性增加或者增加超過2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或者更多。
在一些具體例中，投與重組血基質加氧酶至需要治療之個體引起血清中之HO-1活性為健康個體中之正常血清HO-1活性的2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或者以上。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與引起鐮狀細胞疾病之症狀改善，包括貧血、血管阻塞性危象(VOC)、急性胸部症候群(ACS)、肺性高血壓或者器官損傷減輕或者發作延遲。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與引起末梢血液氧飽和度值超過90%、92%、94%、96%、98%或者99%。
在一些具體例中，與對照組相比，重組血基質加氧酶之投與至一個體引起末梢血液氧飽和度值增加至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或者95%。該對照組可為取自以重組血基質加氧酶治療前之個體的末梢血液氧飽和度值。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與引起每分鐘之呼吸增加20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%，接近正常健康人類中12-18次之每分鐘呼吸。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶之投與引起每分鐘之心率改進20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%，接近正常健康人類中之60-100 bpm。醫藥組成物及投與
本發明進一步提供包含本發明之治療活性組分(例如重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶融合蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白)以及一或者多種醫藥學上可接受之載劑或者賦形劑之醫藥組成物。該等醫藥組成物可選擇地包含一或者多種額外治療活性物質。
儘管本文所提供之醫藥組成物之描述大體上關於適用於倫理投與至人類之醫藥組成物，但熟悉本技藝者應理解，該等組成物一般適用於投與至所有類型之動物。應充分理解，為使組成物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組成物進行修改，且一般熟練之獸醫學藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計且/或執行該修改。
本文所描述之醫藥組成物之調配物可藉由藥理學技藝中已知或者此後研發之任何方法來製備。一般而言，該等準備方法包括以下步驟：使活性組分與稀釋劑或者另一賦形劑或者載劑及/或一或者多種其他附屬組分締合，且隨後必要及/或需要時，將產物塑形且/或封裝成所需單劑量單位或者多劑量單位。
本發明之醫藥組成物可以單一單位劑量及/或複數個單一單位劑量形式散裝製備、封裝及/或出售。如本文所使用之「單位劑量」為包含預定量之活性組分之醫藥組成物之離散量。活性組分之量一般等於向個體投與之活性組分之劑量及/或此類劑量之適宜分數，諸如此類劑量之二分之一或者三分之一。
本發明之醫藥組成物中之活性組分、醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑及/或任何額外組分之相對量視所治療之個體的身分、身材及/或病況而變化且進一步視組成物的投與途徑而變化。舉例而言，組成物可包含介於0.1% (w/w)與100% (w/w)之間之活性組分。
醫藥調配物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑，如本文所使用，該醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑包括如適合於所需特定劑型之任何及全部溶劑、分散介質、稀釋劑或者其他液體媒劑、分散液或者懸浮液助劑、界面活性劑、等張劑、增稠劑或者乳化劑、防腐劑、固體黏合劑、潤滑劑及其類似試劑。Remington之The Science and Practice of Pharmacy , 第21版, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006年；以引用之方式併入本文中)揭示用於調配醫藥組成物之各種賦形劑及用於製備其之已知技術。除非任何習知賦形劑介質或者載劑諸如因產生任何非所需生物作用或者另外以有害方式與醫藥組成物之一或者多種任何其他成分相互作用而與物質或者其衍生物不相容，否則預期該任何習知賦形劑介質或者載劑之使用介於本發明範疇內。
在一些具體例中，醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或者100%純度。在一些具體例中，賦形劑或者載劑經批准用於人類中且用於獸醫學用途。在一些具體例中，賦形劑或者載劑經美國食品藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些具體例中，賦形劑或者載劑為醫藥級。在一些具體例中，賦形劑或者載劑滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
用於製造醫藥組成物之醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑包括但不限於惰性稀釋劑、分散劑及/或成粒劑、界面活性劑及/或乳化劑、崩解劑、結合劑、防腐劑、緩衝劑、潤滑劑及/或油。該等賦形劑或者載劑可選擇地包括於醫藥調配物中。根據調配者之判斷，諸如可可脂及栓劑蠟、著色劑、塗佈劑、甜味劑、調味劑及/或芳香劑之賦形劑或者載劑可存在於組成物中。
合適醫藥學上可接受之賦形劑或者載劑包括但不限於水、鹽溶液(例如NaCl)、鹽水、緩衝鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠(gum arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉或者澱粉)、糖(諸如甘露糖醇、蔗糖或者其他糖)、右旋糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、香料油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等以及其組合。醫藥製劑可需要時與不會有害地與活性化合物反應或者干擾其活性之輔助劑(例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色物質、調味物質及/或芳族物質以及其類似物)混合。在一較佳具體例中，使用適用於靜脈內投與之水溶性載劑。
合適醫藥組成物或者藥劑需要時亦可含有少量潤濕劑或者乳化劑或者pH緩衝劑。組成物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或者散劑。組成物亦可用諸如三酸甘油酯之傳統黏合劑及載劑調配為栓劑。口服調配物可包括諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等之 標準載劑。
醫藥組成物或者藥劑可根據常規程序調配為適合於向人類投與之醫藥組成物。舉例而言，在一些具體例中，用於靜脈內投與之組成物通常為於無菌等張水性緩衝劑中之溶液。必要時，組成物亦可包括助溶劑及用於減弱注射部位處之疼痛之局部麻醉劑。一般而言，組分係單獨供應或者以單位劑型，例如以於指示活性劑數量之氣密密封容器(諸如安瓿或者藥囊)中之乾燥凍乾粉末或者無水濃縮物形式混合在一起。在組成物係藉由輸注投與之情況下，可用含有無菌醫藥級水、鹽水或者右旋糖/水之輸注瓶分配組成物。在組成物係藉由注射投與之情況下，可提供具有注射用無菌水或者鹽水之安瓿以使得組分可在投與之前混合。
本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白可調配為中性或者鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括用游離胺基形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及用游離羧基形成之鹽，諸如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之鹽。
調配及/或製造醫藥劑之一般考慮因素可在例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第21 版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式併入本文中)中找到。投與途徑
本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白(或者含有本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白之組成物或者藥劑)係藉由任何適當途徑投與。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白或者含有其之醫藥組成物係全身投與。全身投與可為靜脈內、皮內、吸入、經皮(局部)、眼內、肌內、皮下、肌內、經口及/或經黏膜投與。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白或者含有其之醫藥組成物係皮下投與。如本文所使用之術語「皮下組織」定義為緊接在皮膚下方之一層鬆散不規則結締組織。舉例而言，皮下投與可藉由將組成物注射至包括但不限於大腿區、腹部區、臀部區或者肩胛區之區域中來執行。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白或者包含其之醫藥組成物係靜脈內投與。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白或者含有其之醫藥組成物係經口投與。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白、重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白或者含有其之醫藥組成物係肌內投與。在一些具體例中，可同時使用超過一種途徑。
在一些具體例中，投與僅在個體中產生局部效果，而在其他具體例中，投與在整個個體之多個部分中產生效果，例如全身效果。通常，投與引起重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之全身遞送。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白經遞送至包括但不限於心、腦、脊髓、橫紋肌(例如骨骼肌)、平滑肌、腎、肝、肺及/或脾之一或者多個目標組織。劑型及給藥方案
在一些具體例中，組成物係以治療有效量及/或根據與特定所需結果(例如伴以治療鐮狀細胞疾病或者降低鐮狀細胞疾病風險)相關之給藥方案投與。
待根據本發明投與之特定劑量或者量可例如視所需結果之性質及/或程度、投與途徑及/或時序之細節及/或一或者多個特徵(例如體重、年齡、個人病史、基因特徵、生活方式參數等或者其組合)而變化。該等劑量或者量可由一般技藝者測定。在一些具體例中，適當劑量或者量係根據標準臨床技術來測定。可替代地或者另外，在一些具體例中，適當劑量或者量係經由使用一或者多個活體外或者活體內分析以幫助識別所需或者最佳待投與劑量範圍或者量來測定。
在各種具體例中，重組血基質加氧酶蛋白係以治療有效量投與。一般而言，治療有效量足以達成對個體有意義之效益(例如治療、調節、治癒、預防及/或改善潛在疾病或者病況)。在一些特定具體例中，待投與之適當劑量或者量可自衍生自活體外或者動物模型測試系統之劑量反應曲線外推得出。
在一些具體例中，所提供之組成物係以醫藥調配物形式提供。在一些具體例中，醫藥調配物為或者包含根據與鐮狀細胞疾病之發生率或者風險降低之達成相關之給藥方案的投與用單位劑量。
在一些具體例中，包含本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之調配物係以單次劑量投與。在一些具體例中，包含本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之調配物係以規則間隔投與。如本文所使用之「間隔」投與指示治療有效量係定期投與(區別於單次劑量)。間隔可藉由標準臨床技術來測定。在一些具體例中，包含本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之調配物係兩月一次、每月一次、每月兩次、三週一次、兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每天一次、每天兩次或者每六小時一次投與。單個個體之投與間隔不必為固定間隔，但可視個體需要而定隨時間推移而變化。
如本文所使用之術語「兩月一次」意謂投與一次/兩個月(亦即每兩個月一次)；術語「每月一次」意謂投與一次/月；術語「三週一次」意謂投與一次/三週(亦即每三週一次)；術語「兩週一次」意謂投與一次/兩週(亦即每兩週一次)；術語「每週一次」意謂投與一次/週；且術語「每天一次」意謂投與一次/天。
在一些具體例中，包含本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之調配物係以規則間隔無限期投與。在一些具體例中，包含本文所描述之重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之調配物係以規則間隔投與規定時段。
如本文所描述之術語「治療有效量」很大程度上基於本發明之醫藥組成物中所含有之治療劑之總量來確定。治療有效量通常在可包含多個單位劑量之給藥方案中投與。對於任何特定組成物，治療有效量(及/或有效給藥方案內之適當單位劑量)可例如視投與途徑或者與其他醫藥劑之組合而變化。
在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之投與降低至少一種鐮狀細胞疾病徵象或者症狀之強度、嚴重程度或者頻率，或者延遲其發作。在一些具體例中，重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之投與降低選自由血管阻塞、急性胸部症候群或者器官損傷組成之群之至少一種鐮狀細胞疾病徵象或者症狀之強度、嚴重程度或者頻率，或者延遲其發作。
在一些具體例中，如藉由即時末梢動脈血氧飽和度、呼吸速率、心率、脈搏膨脹增加及肺濕/乾比降低所量測，重組血基質加氧酶蛋白或者重組血基質加氧酶-Fc融合蛋白之投與引起臨床結果改進。 表2：rHO-1-Fc融合蛋白
名稱 HO-1 序列 連接子 IgG1 FcLALA 位置 IgG1 FcLALA 上之異二聚突變 格式
HO1-Fc-v1 1 - 261 無連接子 C端融合 野生型    同二聚體 Fc二價
HO1-Fc-v2 1 - 261 (GGGGS)4 連接子(SEQ ID NO: 21) C端融合 野生型    同二聚體 Fc二價
HO1-Fc-v3 1 - 261 (GGGGS)4 連接子(SEQ ID NO: 21) N端融合 野生型    同二聚體 Fc二價
HO1-Fc-v4 1 - 261 無連接子 C端融合 野生型 鏈 A ：T350V/L351Y/F405A/Y407V鏈 B ：T350V/T366L/K392L/T394W 單價
HO1-Fc-v5 1 - 261 無連接子 N端融合 杵-臼（Knob-Hole）S-S 鏈 A ： T366W、S354C；鏈 B ：T366S、L368A、Y407V、Y349C 單價
HO1-Fc-v6 1 - 261 無連接子 N端融合 DD-KK 鏈 A ：K392D、K409D；鏈 B ：D399K、E356K 單價
HO1-Fc-v7 1 - 261 無連接子 N端融合 EW-RVT S-S 鏈 A ：K360E、K409W、Y349C；鏈 B ：Q347R、D399V、F405T、S354C 單價
HO1-Fc-v8 1 - 261 無連接子 C端融合 杵-臼 鏈 A ：T366W；鏈 B ：T366S、L368A、Y407V 單價
HO1-Fc-v9 1 - 261 無連接子 C端融合 EW-RVT 鏈 A ：K360E、K409W鏈 B ：Q347R、D399V、F405T 單價
HO1-Fc-v10 1 - 226 無連接子 C端融合    鏈 A ：T350V/L351Y/F405A/Y407V鏈 B ：T350V/T366L/K392L/T394W 單價
HO1-Fc-v11 1 - 226 無連接子 N端融合 野生型   同二聚體Fc
HO1-Fc-v12 1 - 226 無連接子 C端融合 野生型   同二聚體Fc
HO1-Fc-v13 1 - 261 無連接子 C端融合 野生型    單鏈(G4S)8 (SEQ ID NO: 63)單價
HO1-Fc-v14 1- 261 無連接子 C端融合 K-D 逆電荷突變：鏈 A ：E357K；鏈 B ：K370D 單鏈(G4S)13 (SEQ ID NO: 64)單價
HO1-Fc-v15 1 - 226 無連接子 C端融合 野生型    單鏈(G4S)8 (SEQ ID NO: 63)單價
HO1-Fc-v16 1- 226 無連接子 C端融合 K-D 逆電荷突變：鏈 A ：E357K；鏈 B ：K370D 單鏈(G4S)13 (SEQ ID NO: 64)單價
實施例
隨附實施例描述製造且實踐本發明之較佳模式中之一些。然而，應理解此等實施例僅出於例示之目的且不意圖限制本發明之範疇。實施例 1. 產生經截短重組人類血基質加氧酶 1 (rHO-1)
此實施例例示重組血基質加氧酶(rHO-1)之表現。一系列重組血基質加氧酶(rHO)經截短蛋白在C端末端處經His標籤工程改造。對五個經截短變異體(1-226、1-233、1-237、1-261、1-265)在大腸桿菌中之表現進行評估。所有經截短HO-1構築體顯示穩定表現及溶解度。選擇His-1-261以進行進一步純化及評估。
將2 L表現rHO-1之BL21 (DE3)細胞培養物離心且在存在蛋白酶抑制劑之情況下溶解於含有5 mM咪唑之PBS緩衝液中。使用經500 mM咪唑PBS溶離緩衝液溶離之Ni-FF XK 16/20管柱對His標籤rHO-1進行親和力純化。彙集rHO-1-His溶離份且進行去鹽。
使用Superdex 75 SEC管柱對rHO-1-His進行進一步純化。使經純化rHO-1蛋白到達Detoxi-Gel內毒素移除凝膠管柱上以產生1.10 Eu/mg之最終內毒素含量。藉由SDS-PAGE測定純度為95%，且在4.02 mg/ml之最終濃度中達成160 mg之蛋白質產量。實施例 2. 經純化 rHO-1 之酶活性
此實施例證實經純化rHO-1之酶活性。將rHO-1與氯化血紅素、BSA及過氧化氫酶一起培育。將大鼠腎胞溶質溶離份添加至反應中，得到足夠膽綠素還原酶。藉由添加1 mM β-NADPH開始反應且在37 ℃下培育30分鐘。藉由置放於冰上終止反應。
將氯仿在冰上渦旋，添加至反應混合物中，在暗處混合3次，在1000 rpm下離心2分鐘以純淨地分離有機相。將所形成之膽紅素在氯仿相中萃取且自管底部收集至冰上之新鮮琥珀色管中。在1 cm路徑長度石英光析管中量測到分光光度法吸光度介於420-540 nm之間。
使用作為58 mM/cm之膽紅素消光係數將血基質加氧酶活性計算為所形成之膽紅素產物(奈莫耳)/毫克蛋白質/小時。經截短rHO-1之酶活性示於圖1A及1B以及表3中。 表3：1-261-His及His-1-261之酶活性
米氏(Michaelis-Menten) (最佳擬合值) 1-261-His (R&D) 1-261-His His-1-261
Vmax 0.3332 0.3456 0.3523
Km 0.1401 0.1767 0.1874
實施例 3. 小鼠中之 rHO-1-His 之藥物動力學 (PK) 概況及活體內功效
此實施例例示小鼠中之重組血基質加氧酶(HO-1)之全身投與顯示氯化血紅素攻擊之後存活增加及鐮狀細胞疾病之症狀改善之趨勢。
使用基因轉殖Townes鐮狀小鼠模型(SS小鼠)，此係因為其重演SCD，詳言之血管阻塞性危象(VOC)及急性胸部症候群(ACS)之許多主要病理生理態樣(參見Ghosh等人, 2013J Clin Invest . 2013;123(11):4809-4820)。在鐮狀細胞小鼠中游離血基質觸發伴以嚴重低血氧症及死亡之急性胸部症候群。SS基因轉殖鐮狀細胞疾病小鼠模型模擬見於人類疾病中之慢性貧血。類似地，在SS小鼠中胞外血基質觸發溶血及VOC/ACS。
年輕(4-6週)及成年(12週或者/及更年長) SS小鼠兩者在經靜脈內氯化血紅素(35微莫耳/千克bw)攻擊時罹患溶血危象。然而，年輕小鼠不罹患急性肺損傷(ALI)，而成年小鼠患呼吸衰竭。年輕小鼠自循環迅速地清除過量血基質表明此可能為其耐靜脈內氯化血紅素之原因。引起關注地，與不包括針對其耐藥性之經典血基質清除路徑之成年小鼠相比，年輕小鼠具有顯著較低之血漿凝血酵素含量。
SS小鼠全身性地靜脈內投與有5 mg/kg單次劑量之1-261-His或者媒劑對照。在注射rHO-1-His之後5分鐘、1小時、2小時、4小時、12小時及48小時收集血液，且分離血漿以進行分析。如圖2中所示，1-261-His展現半衰期為69.4分鐘之一階段衰變。在48 h內在注射有HO-1-His之動物中觀測到血漿HO-1含量中之2對數差異。(圖2)。
評估在經1-261-His治療後SS小鼠中之存活及血基質誘發之急性胸部症候群。具有人類HbS之基因轉殖SS小鼠全身注射有5 mg/kg 1-261-His或者媒劑對照，且監測在遞送之後至多120分鐘之在靜脈內投與35 µmol/kg血基質之後之存活。75%接受血基質加氧酶之小鼠在遞送之後120分鐘存活(圖3)。
藉由評估作為替代臨床結果之即時氧飽和度、呼吸速率、心率、脈搏膨脹及肺濕/乾比來監測在經1-261-His活體內治療之後之反應(圖4A-4E)。
在經氯化血紅素處理後至多120分鐘藉由脈搏血氧飽和度(pulse oximetry)即時量測血液中之末梢動脈氧飽和度(SpO2 %)。脈搏血氧飽和度使用分光光度法以測定末梢動脈血中之飽和有氧之血紅素(亦即經氧化血紅素；氧血紅素)之比例。在兩個獨立波長下之光照明血液中之經氧化血紅素及經去氧血紅素。計算氧血紅素之間之吸光度與氧血紅素加去氧血紅素總和之比且與動脈氧飽和度(SaO2)之經先前校準直接量測結果作比較來建立末梢動脈氧飽和度(SpO2)之估計量度。脈搏血氧定量計探針由兩個發光二極體及光偵測器組成。去氧血紅素最大限度地吸收光譜紅譜帶(600 nm至750 nm)中之光，且氧血紅素最大限度地吸收紅外線譜帶(850 nm至1000 nm)中之光。因此，發射體發射在660 nm及940 nm處之光以最佳偵測此兩種物質。使用末梢動脈氧飽和度作為組織氧合之生物標記。在此例示性研究中，在35 µmol/kg氯化血紅素攻擊之後之SS小鼠中觀測到氧飽和度增加。
在經氯化血紅素處理後至多120分鐘藉由脈搏血氧飽和度即時量測每分鐘之呼吸速率。在甦醒條件下使用MouseOx脈搏血氧定量計(Starr Life Sciences)以量測即時SpO2 (功能動脈Hb百分比)及每分鐘之呼吸速率。在實際量測之前1天使用去毛劑自頸圈區(頸部背面)移除毛髮。將連接至脈搏血氧定量計之拋棄式感測頸圈夾具置放於無毛區上，且當資料顯示器不具有錯誤代碼時經由MouseOx軟體(6.3版；由製造商提供)開始量測。彙集所記錄值達各連續5分鐘間隔，且在呈現連續篩檢之情況下使用平均值以進行分析。呼吸速率係自呼吸道工作量且非氣流推導出且即使動物經受阻塞性呼吸中止亦存在。
在經氯化血紅素處理後至多120分鐘以即時心臟脈搏率(bpm)形式量測每分鐘之心率。使用MouseOx脈搏血氧定量計(Starr Life Sciences)以實施量測。在經氯化血紅素處理後至多120分鐘即時量測脈搏膨脹。脈搏膨脹為因心輸出脈搏所致之駐存於感測器墊之間之動脈血管之膨脹變化的量度。其為伴隨各心臟脈搏之局部血容量變化之直接量度。對於給定血管相容性，脈搏膨脹亦可提供脈搏壓替代物。
在經氯化血紅素處理後至多120分鐘即時量測脈搏膨脹。脈搏膨脹為穿過動脈或者脈動血液且具有µm真線性距離單位之光之效應路徑長度變化之量度。脈搏膨脹提供可用於作出針對諸如血氧飽和度、心率及呼吸速率之參數之血氧定量量測之動脈血量度。
在經氯化血紅素處理後至多120分鐘量測肺濕/乾比。較高肺濕重/乾重比指示肺水腫，且為急性胸部症候群之生物標記。在死亡之後立即或者在氯化血紅素注射之後2小時自小鼠收穫完整肺臟，且使用等比例轉換器稱重。隨後，在80℃下在含有乾燥晶體之烘箱中乾燥肺臟24小時，測定乾重，且計算肺濕重/乾重比。
經1-261-His治療之小鼠顯示HO-1含量及69.4 min半衰期。在35 µmol/kg氯化血紅素攻擊之後之SS小鼠中，經1-261-His治療之小鼠顯示經增加之存活、經增加之氧飽和度、呼吸速率、心率及經減小之肺濕/乾比。實施例 4. HO-1-Fc 融合蛋白之活體外活性及 PK 分析
此實施例例示設計成延長重組HO-1之半衰期之HO-1融合蛋白之發展。
使用與Fc域融合之經截短rHO-1蛋白對四個Fc融合構築體進行工程改造。使用HEK293細胞產生1-261-Fc V1 (SEQ ID NO: 3)。使用ExpiCHO細胞產生V2 (SEQ ID NO: 4)、V3 (SEQ ID NO: 5)及V4 (SEQ ID NO: 6) (圖5A-5E)。
編碼1-261-Fc融合構築體(V1、V2及V3)之表現質體或者兩個分別編碼鏈A及B之質體(V4)經PEI轉染。在轉染之後9天藉由離心及過濾收穫改良性培養基。藉由由MabSelect SuRe進行結合及溶離來自改良性培養基純化1-261-Fc蛋白。使用Superdex 200管柱進一步純化來自MabSeclect SuRe之溶離液，且彙集含有1-261-Fc之溶離份。藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC分析經純化蛋白質。
此實施例例示小鼠中之1-261-Fc融合蛋白之全身投與顯示經延長半衰期。
活體外量測V1、V2、V3及V4 Fc融合蛋白之酶活性。將rHO-1 (80 µg/ml)與氯化血紅素(60 µM)、BSA (4 mg/mL)、細胞色素P450還原酶 (80 µg/mL )、膽綠素還原酶A (80 µg/mL)及過氧化氫酶(1000 U/mL)一起培育。藉由添加1 mM β-NADPH開始反應之後在37 ℃下持續5分鐘之動力學模式中之468 nm處吸光度讀取(底部讀取)。1-261-Fc融合蛋白V1、V2、V3及V4具有與1-261-His蛋白類似之活性概況。V2及V3聚集物顯示比1-261-His對照低之活性(圖6)。
為評估HO-1 Fc融合蛋白之藥物動力學概況，投與WT CD1小鼠(每時間點4隻小鼠)以V2、V3、V4及1-261-His之靜脈內注射物。藉由如實施例3中所描述之ELISA分析量測血漿rHO-1含量。如表4中所示，V2、V3及V4展現所顯示之半衰期延長且可在168小時時偵測，且1-261-His之半衰期為大約40 min (0.67 h) (圖7)。 表4：rHO-1蛋白之活體內PK參數
構築體 末端 半衰期(小時) C0 (微克/毫升) AUC0-168 小時. (小時*微克/毫升) 清除率 (毫升/小時/千克)
1-261-Fc V2 85 84 3321 1.15
1-261-Fc V3 92 129 5053 0.730
1-261-Fc V4 101 128 5568 0.641
1-261-His 0.67 173 15.9 14
實施例 5. Fc 融合血基質加氧酶經截短蛋白之活體內功效
此實施例例示重組血基質加氧酶Fc融合蛋白在延長接受治療之小鼠中之存活中之活體內功效。年輕SS小鼠具有比成年小鼠高2倍之血漿HO-1。溶離化實驗顯示，HO-1與血基質降解所需之酶及輔因子機制共定位於血漿中，肯定血基質可在血漿中降解。為確定年輕SS小鼠是否使用HO-1以迅速地降解循環血基質，用HO-1抑制劑(原卟啉錫(SnPP))或者媒劑治療3週齡動物。七天之後，用氯化血紅素攻擊動物以誘發ALI/ACS。大部分(10/12；83%)經媒劑治療之小鼠存活，而經SnPP治療之小鼠(10/14；71%)罹患致死性ALI/ACS。
用Nrf2活化劑治療年輕SS小鼠三個月至成年以刺激HO-1表現，且隨後用媒劑或者SnPP治療，之後進行ALI/ACS誘發。經SnPP治療組罹患致死性ALI/ACS，而在成年具有經升高之HO-1之經媒劑治療之SS小鼠存活。最後，同時誘發成年SS小鼠罹患ALI/ACS且輸注新穎HO-1重組體或者媒劑。HO-1重組體與一個變異V4一起減弱肺損傷且改進存活，從而在通常患致死率為70%之呼吸衰竭之成年SS小鼠同屬性群當中提供100%保護。
SS小鼠投與有與1-261-His (5 mg/kg)等效之莫耳量之V3 (9.2 mg/kg)及V4 (13.9 mg/kg)。在用於誘發ACS之靜脈內氯化血紅素攻擊之後至多120分鐘量測小鼠之存活。100%接受1-261-Fc V3或者1-261-Fc V4之小鼠存活(圖8A)，而僅20%接受媒劑對照之小鼠存活。
在經氯化血紅素靜脈內攻擊之後量測血氧飽和度、肺濕重/乾重比、每分鐘之呼吸速率、每分鐘之心率及脈搏膨脹。相對於媒劑對照而言，在投與1-261-Fc V3或者1-261-Fc V4治療之後末梢動脈血氧飽和度顯著地增加(圖8B)。經1-261-Fc V3 (區外生物包括2個具有低SpO2之明顯患病小鼠)及1-261-Fc V4治療之小鼠顯示經減小之肺濕/乾比(圖8C)。
相對於心率量測為600 bpm之經媒劑治療之對照小鼠而言，經1-261-Fc V3或者1-261-Fc V4治療之小鼠顯示約700 bpm之經增加之心率(圖9A)。相對於經媒劑治療之對照小鼠而言，經1-261-Fc V3或者1-261-Fc V4治療之小鼠顯示約125 bpm之持續呼吸速率(圖9B)。相對於經媒劑治療之對照小鼠而言，經1-261-Fc V4治療之小鼠顯示約600 µm之經增加且持續之脈搏膨脹。相較於經媒劑治療之對照小鼠而言，用1-261-Fc V3進行之治療顯示持續但僅為約300 µm之脈搏膨脹(圖9C)。
相對於媒劑對照而言，經1-261-Fc V3或者1-261-Fc V4治療之小鼠在氯化血紅素攻擊之後顯示經改進之存活。另外，在經重組血基質加氧酶治療之小鼠中血氧飽和度增加且肺濕重/乾重比減小。用V3或者V4進行之治療亦改進小鼠之心率及呼吸速率。V4治療亦改進脈搏膨脹。實施例 6. rHO-1 酶動力學
此實施例例示用於量測rHO-1酶動力學之敏感性分析之使用。可在量測膽紅素吸光度之酶聯分析中量測rHO-1催化活性。然而，量測膽紅素吸光度分析之酶聯分析需要大量微克量產品及試劑。此外，劑量依賴性線性及批間再現性保持具有挑戰性。使用為來自日本鰻肌肉之以1:1化學計量結合膽紅素以產生在480 nm處激發且在~520 nm處發射之複合物之16 kDa螢光蛋白的UnaG的螢光分析係用於測定rHO-1-Fc構築體的酶動力學。此舉提供用於偵測產品以評估rHO-1酶動力學之敏感性報告體(圖11)。
加His標籤之UnaG在大腸桿菌中由表現載體表現且藉由使用鎳管柱進行之親和力純化及達到約＞90%純之滲析來進行純化。分析條件包括呈10 µL分析體積之100 nmol HO-1-Fc構築體、10 µM氯化血紅素+ BSA、250 µM NADPH、0.5 µM膽綠素還原酶、2 µM UnaG。UnaG分析證實HO-1之劑量依賴性活性(圖12A)且不具有背景螢光(圖12B)。
血基質加氧酶(HO)與向反應供給電子之NADPH細胞色素P450還原酶(CPR)合作降解血基質。P450氧化還原酶(POR)將電子自NADPH運輸至細胞色素P450。如圖13A (有過氧化氫酶及POR)及13B (無過氧化氫酶及POR)中所示，執行有或者無P450細胞色素(POR)/過氧化氫酶之rHO-1-Fc構築體之莫耳比較。
如表5中所示，無過氧化氫酶且無POR之以螢光單位/分鐘量測之HO-1酶活性之平均速率介於60-80 min之間。有過氧化氫酶且有POR之螢光單位/分鐘之平均速率計算為介於0-20 min.之間，且值示於表5中。此等結果表明，分析高度可再現，使用少得多之試劑，且可以高通量方式進行。 表5：HO-1酶活性之平均速率(螢光單位/分鐘)
無過氧化氫酶及POR 有過氧化氫酶及POR
樣品 平均速率FU/min 平均速率FU/min SD
1-261-His -- 342.32 45.27
V1 55.23 880.22 74.11
V2 86.15 1815.81 232.02
V3 44.13 477.60 45.43
V4 22.53 382.31 21.72
V4 (10 L製備物) 25.96 306.14 39.11
V5 17.90 217.80 26.23
V6 16.12 221.54 39.68
V7 19.39 241.70 51.72
V8 4.73 35.15 5.07
V9 28.60 386.86 63.07
V10 22.80 283.54 24.00
V11 17.93 150.15 2.68
V12 40.83 469.79 40.68
V15 14.45 180.76 5.31
實施例 7. rHO-1(1-261)-Fc V4 融合血基質加氧酶經截短蛋白之活體內功效
此實施例例示不同劑量之重組血基質加氧酶Fc融合蛋白在延長接受治療之小鼠中之存活中之活體內功效。
為測定rHO-1-Fc V4之功效，投與SS小鼠以1.4 mg/kg、4.7 mg/kg或者13.9 mg/kg (分別等莫耳於1/10、1/3或者5 mg/kg總劑量之rHO-1 [1-261]-His)之單次靜脈內劑量之rHO-1-Fc v4或者載劑媒劑。在用於誘發ACS之靜脈內氯化血紅素攻擊之後至多120分鐘量測小鼠之存活。在此研究中，約80%接受13.9 mg/kg(等莫耳於5 mg/kg劑量) 1-261-Fc V4之小鼠存活且約40%接受4.7 mg/kg (1/3) 1-261-Fc V4之小鼠存活，而僅約30%接受媒劑對照之小鼠存活(圖10A)。
給與SS小鼠以13.9 mg/kg之單次靜脈內劑量之rHO-1-Fc V4 (等莫耳於5 mg/kg劑量之rHO-1 [1-261]-His)或者載劑媒劑。在用於誘發ACS之靜脈內氯化血紅素攻擊之後至多120分鐘量測小鼠之存活。90%接受rHO-1-Fc V4之小鼠存活(圖10B)，而僅25%接受媒劑對照之小鼠存活。
在經氯化血紅素靜脈內攻擊之後量測血氧飽和度、肺濕重/乾重比、每分鐘之呼吸速率、每分鐘之心率及脈搏膨脹。對於投與有13.9 mg/kg或者4.7 mg/kg V4之小鼠，相對於媒劑對照而言，在投與1-261-Fc V4治療之後末梢動脈血氧飽和度顯著地增加(圖10C)。媒劑資料及投與有4.7 mg/kg或者1.4 mg/kg V4之小鼠之資料係來自在氯化血紅素輸注之後2小時內死亡之SS小鼠。相對於經媒劑對照治療之小鼠而言，經13.9 mg/kg或者4.7 mg/kg rHO-1-Fc V4治療之小鼠顯示經減小之肺濕/乾比(圖10D)。實施例 8. 具有經減少之聚集之 rHO-1(1-261)-Fc 嵌合體
研發與單獨重組HO-1相比具有經改進特性之rHO (1-261)-Fc嵌合構築體(圖5A-5Q)。構築體設計成在無轉譯後修飾之情況下改進CHO細胞株中之批間再現性。另外，rHO-1 Fc融合變異體展現全長(1-261) rHO-1-Fc在親和力純化及於PBS中之SEC期間經減少之聚集。
構築體v1-v16經暫時轉染且在100 mL EBNA1細胞中經表現。在例示性表現方案中，將1:1比率之各Fc鏈、經剪切鮭魚精子DNA (填充DNA)及XBP1S (經共表現以改進摺疊及分泌)負載至Maxcyte CL1.1卡匣上且進行電穿孔。在轉染後48小時，添加0.125% N,N二甲基乙醯胺，且每天提供一次進料有3% SAFC高級進料1之細胞直至第8天為止。使用檸檬酸鹽梯度純化構築體，接著在於PBS中之SEC上進行拋光步驟。
若構築體在兩輪純化之後達成＞95%純度，則對其進行篩檢及選擇，且其對熱應力具有抗性(3次冷凍解凍分析)。在活體外分析中測試血基質分解之酶活性以識別相對於游離(cf) HO-1而言達成類似穩健性及活性之構築體。如表6中所示，評估相對於V4構築體而言之rHO-1-Fc構築體之HO-1活性。V12、V10及V7展現穩健酶活性且以高產量經純化。 表6：相對於V4而言之rHO-1構築體之酶倍差。
rHO-1-Fc 名稱 V4 10 L 製備物莫耳當量之酶倍差 V4 10 L 製備物之酶倍差 HO-1 化合價當量
V1 0.47 0.94
V2 0.3 0.6
V3 0.59 1.18
V4 1.15 1.15
V5 1.45 1.45
V6 1.61 1.61
V7 (3) 1.34 1.34
V8 5.49 5.49
V9 0.91 0.91
V10 (2) 1.14 1.14
V11 1.45 2.9
V12 (1) 0.64 1.27
V15 1.8 1.8
實施例 9. rHO-1 V7 、 V10 及 V12 融合蛋白之藥物動力學概況
為評估rHO-1-Fc融合蛋白之藥物動力學概況，投與雄性C57BL/6 (Jax)小鼠(每時間點4隻小鼠)以5 mg/kg V7、V10、V12或者V4 (對照)靜脈內注射物。在5 m、6 h、24 h、72 h、168 h、240 h及336 h收集血清rHO-1。藉由ELISA分析量測血漿rHO-1。實施例 10. 活體內 rHO-1-Fc V4 融合蛋白
此實施例例示HbSS及HbAA小鼠模型中之rHO-1-Fc V4融合蛋白之投與。雄性及雌性HbSS及HbAA小鼠每週一次靜脈內注射有rHO-1-Fc V4融合蛋白或者作為對照之PBS。HbSS小鼠靜脈內投與有週劑量13.9 mg/kg HO-1、5 mL/kg HO-1 V4。如實施例3中所描述，藉由評估作為替代臨床結果之即時氧飽和度、呼吸速率、心率、脈搏膨脹及肺濕/乾比來監測在經rHO-1 V4活體內治療之後之反應。
如表7中所示，在10週、12週、16週及20週收集用於血液學評估之血液及用於組織病理學、免疫組織化學及定量血漿分析之器官。血液學終點評估量測血紅素、紅血球平均微粒體積(MCV)、白血球及差異網狀紅血球、具有顯微鏡圖片之鐮狀紅血球%、spo2 、心率、血漿游離血基質、血漿游離血紅素、血漿凝血酵素、血漿結合球蛋白及d-二聚體定量。組織病理學研究評估肝、肺(無灌洗)、包括重量(體重%)之脾、腎、腦及心臟。執行免疫組織化學分析以評估H&E、鐵、p-選擇蛋白、ICAM、V-CAM、淋巴球、氧化應激標記及腎儲存物C3/C5。定量血漿分析係用於使用多重細胞介素釋放來量測鐵蛋白、鐵、運鐵蛋白、膽紅素、AST、ALT、LDH、NO及促發炎細胞介素。在來自第11及12組之HbAA小鼠中執行rHO-1 V4融合蛋白投與之藥物動力學研究。 表7：血液及器官收集時刻表
群組 基因型 注射物 血液及器官收集時間點
0 HbSS PBS 10週
1 HbSS PBS 12週
2 HbSS 13.9 mg/kg HO-1 V4：5 mL/kg 12週
3 HbSS PBS 16週
   HbSS 13.9 mg/kg HO-1 V4：5 mL/kg 16週
5 HbSS PBS 20週
   HbSS 13.9 mg/kg HO-1 V4：5 mL/kg 20週
7 HbAA PBS 10週
8 HbAA PBS 12週
9 HbAA PBS 16週
10 HbAA PBS 20週
11 HbAA 13.9 mg/kg HO-1 V4：5 mL/kg 2天，第11、13、15、17、19週
12 HbAA 13.9 mg/kg HO-1 V4：5 mL/kg 2 h，4天，第12、14、16、18、20週
rHO-1-Fc V4 融合蛋白之毒性概況
為量測rHO-1-Fc V4融合蛋白之毒性，投與14-16週齡HbSS及HbAA小鼠(成熟SCD表現型)以選自隨附劑量之單次遞增劑量之rHO-1-Fc V4：0、15、50或者150 mg/kg。在研究中投與每個性別6隻小鼠以所測試各劑量之rHO-1。在2 h靜脈內暴露於rHO-1-Fc之後，量測膽紅素毒性終點，接著在注射之後7天量測血清及組織鐵含量。 表8：用於測定rHO-1-Fc V4之活體內毒性概況之條件。
群組 基因型 rHO-1-Fc V4 (mg/kg) 體積(mL/kg) 濃度(mg/mL)
1 HbSS 0 5 0
2 HbSS 15 5 3
3 HbSS 50 5 10
4 HbSS 150 5 30
5 HbAA 0 5 0
6 HbAA 150 5 30
實施例 11. SCD 患者中與 ACS 風險相關聯之 HO-1 含量
先前基因相關研究使兒童中之高血基質加氧酶-1 (HO-1)表現與低ACS風險相關。評估SCD患者之HO-1含量。本發明研究首次顯示，1-9歲SCD兒童中之血漿HO-1之濃度比20歲及更年長成年人高2倍(23.6±1.1，n=191對平均10.7±0.6，n=67)。以引用之方式進行之併入
所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考文獻均以全文引用之方式併入。另外，材料、方法及實施例僅為例示性的且不意欲為限制性的。除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技藝人員通常所理解之含義相同之含義。儘管與本文所描述之方法及材料類似或者等效之方法及材料可用於實踐或者測試本發明，但本文描述合適方法及材料。等效方案及範疇
熟悉本技藝者將認識到或者能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定具體例之許多等效方案。本發明之範疇並不意欲受限於以上描述，而實際上係如隨附申請專利範圍中所記載。
圖式僅出於例示之目的；不具有限制性。
圖1A顯示藉由奈莫耳所形成之膽紅素產物/毫克重組血基質加氧酶/小時量測之例示性HO-1酶活性結果。
圖1B顯示氯化血紅素受質上相對於1-261-His (R&D)而言之1-261-His及His-1-261之例示性血基質加氧酶酶動力學結果。
圖2顯示基因轉殖Townes鐮狀小鼠(SS小鼠)中1-261-His之例示性藥物動力學分析結果。
圖3顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性存活結果。
圖4A顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性即時氧飽和度結果。
圖4B顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性呼吸速率量測結果。
圖4C顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性心率量測結果。
圖4D顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性脈搏膨脹量測結果。
圖4E顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-His或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性肺濕重/乾重比。S及D指示在ACS中存活(S)或者死亡(D)之小鼠。
圖5A-5Q顯示所生成之HO-1 1-261-His及1-261-Fc融合構築體V1-V16之經延長半衰期及/或經減少聚集之示意圖。圖5C揭示SEQ ID NO: 21，圖5D揭示SEQ ID NO: 21，圖5O揭示SEQ ID NO: 64，圖5P揭示SEQ ID NO: 63及圖5Q揭示SEQ ID NO: 64。
圖6顯示相對於1-261-His而言之1-261-Fc融合形式之例示性酶活性結果且亦比較V2及V3聚集物之活性。
圖7顯示SS小鼠中相對於1-261-His而言之1-261-Fc V2、V3及V4融合構築體之例示性藥物動力學概況結果。
圖8A顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性存活結果。
圖8B顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性血氧飽和度位準(亦即攜氧血紅素)結果。
圖8C顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性肺濕重/乾重比量測結果。
圖9A顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性心率量測結果。
圖9B顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性呼吸速率量測結果。
圖9C顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經1-261-Fc V3、1-261-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性脈搏膨脹。
圖10A顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經不同劑量之rHO-1-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性存活結果。
圖10B顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經不同劑量之rHO-1-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性存活結果。
圖10C顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS之經不同劑量之rHO-1-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性血氧飽和度位準(亦即攜氧血紅素)結果。
圖10D顯示輸注有經純化氯化血紅素以誘發ACS且經不同劑量之rHO-1-Fc V4或者媒劑對照治療之基因轉殖SCD小鼠之例示性肺濕重/乾重比量測結果。
圖11顯示用於量測HO-1酶活性之具有高敏感性之UnaG分析之示意圖。HO-1催化由血基質進行之膽綠素產生，藉由膽綠素還原酶將該膽綠素轉化成膽紅素。UnaG為結合膽紅素而產生複合物之螢光蛋白，該螢光蛋白係藉由在~520 nm處發射之螢光來量測。
圖12A顯示如藉由UnaG分析所量測，量為至多約1000 nM HO-1之HO-1酶活性之線性劑量-反應曲線。
圖12B顯示，因為螢光僅在存在膽綠素還原酶及rHO-1酶之情況下獲得，故UnaG分析具有特殊性。分析實質上不含背景螢光。在不存在rHO-1之情況下，由於缺乏膽綠素受質，故未觀測到螢光。在不存在膽綠素還原酶之情況下，因為膽紅素不可結合UnaG，故未觀測到螢光。
圖13A顯示在存在過氧化氫酶及P450氧化還原酶(POR)之情況下之rHO-1酶活性跡線。圖13B顯示在不存在過氧化氫酶及POR之情況下之rHO-1酶活性跡線。
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Claims (72)

  1. 一種治療鐮狀細胞疾病之方法，其包含向需要治療之個體投與重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白。
  2. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少85%一致性之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少90%一致性之胺基酸序列。
  4. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有一致性之胺基酸序列。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含SEQ ID NO: 1。
  7. 如請求項1至4中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179及F207。
  8. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1蛋白在SEQ ID NO: 1之殘基M9處之N端處經截短。
  9. 如請求項7或8之方法，其中，該rHO-1蛋白在對應於K226、A233、R237、T261及/或A265之殘基處經截短。
  10. 如請求項8之方法，其中，該rHO-1蛋白在對應於K226之殘基處經截短。
  11. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少85%一致性之胺基酸序列。
  12. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少90%一致性之胺基酸序列。
  13. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  14. 如請求項1之方法，其中，該rHO-1包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有一致性之胺基酸序列。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含在對應於33之位置處之胺基酸取代。
  16. 如請求項15之方法，其中，該rHO-1蛋白包含F33L取代。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域。
  18. 如請求項17之方法，其中，該Fc域之N端融合至該rHO-1蛋白域之C端。
  19. 如請求項17之方法，其中，該Fc域之C端融合至該rHO-1蛋白域之N端。
  20. 如請求項17至19中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白包含介於該rHO-1蛋白域與該Fc域之間之連接子。
  21. 如請求項20之方法，其中，該連接子包含(GGGGS)4 （SEQ ID NO: 21）之序列。
  22. 如請求項17至21中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白為含有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之至少一個單體之多聚體。
  23. 如請求項22之方法，其中，該多聚體為二聚體。
  24. 如請求項22或23之方法，其中，該多聚體含有包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之單體。
  25. 如請求項22之方法，其中，該rHO-1蛋白為具有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之一個單體及包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之另一單體的二聚體。
  26. 如請求項17至25中任一項之方法，其中，該Fc域包含用於增強半衰期、減少聚集且/或減弱效應功能之一或者多個突變。
  27. 如請求項26之方法，其中，該一或者多個突變包含在對應於IgG1 Fc域之234、235、251、252、254、255、256、308、309、311、312、314、347、349、350、351、354、360、366、385、386、387、389、392、394、399、405、407、409、428、433、434、435及436之一或者多個位置處之胺基酸取代。
  28. 如請求項27之方法，其中，該一或者多個突變包含L234A及L235A胺基酸取代。
  29. 如請求項27之方法，其中，該一或者多個突變包含選自IgG1 Fc域之L234A、L235A、Q347R、Y349C、T350V、L351Y、L351V、S354C、E356K、E357K、K360E、T366L、T366W、T366S、K370D、L368A、K392L、K392D、T394W、D399V、D399K、F405T、F405A、Y407V、K409W及K409D之胺基酸取代。
  30. 如請求項27之方法，其中，該一或者多個突變在一個單體鏈上包含K360E、K409W及Y349C胺基酸取代且在第二單體鏈上包含Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代。
  31. 如請求項27之方法，其中，該一或者多個突變在一個單體鏈上包含T350V、L351Y、F405A及Y407V胺基酸取代且在第二單體鏈上包含T350V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代。
  32. 如請求項27之方法，其中，該一或者多個突變包含K360E、K409W、Y349C、Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代。
  33. 如請求項27之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變包含T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代。
  34. 如前述請求項中任一項之方法，其中，該rHO-1蛋白係靜脈內或者皮下投與。
  35. 如前述請求項中任一項之方法，其中，與對照相比，投與該rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少。
  36. 如前述請求項中任一項之方法，其中，投與該rHO-1蛋白引起血漿中之游離血基質含量減少至低於約10 mM。
  37. 如前述請求項中任一項之方法，其中，與對照相比，投與該rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性增加。
  38. 如前述請求項中任一項之方法，其中，投與該rHO-1蛋白引起血漿中之HO-1活性等於或者高於健康個體中之正常血清HO-1活性之10%。
  39. 如前述請求項中任一項之方法，其中，投與該rHO-1蛋白引起包括貧血、血管阻塞性危象(VOC)、急性胸部症候群(ACS)、肺性高血壓或者器官損傷之一或多種症狀之減輕或者發作延遲。
  40. 一種重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白，其包含融合至Fc域之rHO-1蛋白域。
  41. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域之C端融合至該Fc域之N端。
  42. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域之N端融合至該Fc域之C端。
  43. 如請求項40至42中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白包含介於該rHO-1蛋白域與該Fc域之間之連接子。
  44. 如請求項43之rHO-1蛋白，其中，該連接子包含GGGGS（SEQ ID NO: 10）之序列。
  45. 如請求項40至44中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白為含有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之至少一個單體之多聚體。
  46. 如請求項45之rHO-1蛋白，其中，該多聚體為二聚體。
  47. 如請求項45之rHO-1蛋白，其中，該多聚體含有包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之單體。
  48. 如請求項46或47之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白為具有包含融合至rHO-1蛋白域之Fc域之一個單體及包含不融合至rHO-1蛋白域之Fc域之另一單體的二聚體。
  49. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少85%一致性之胺基酸序列。
  50. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少90%一致性之胺基酸序列。
  51. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  52. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-261具有一致性之胺基酸序列。
  53. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含SEQ ID NO: 1。
  54. 如請求項40至53中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含K18、T21、H25、Y134、G143、L147、K179及F207。
  55. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白在對應於M9之殘基處之N端處經截短。
  56. 如請求項54或55之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域進一步包含K226、A233、R237、T261及A265。
  57. 如請求項56之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1在對應於K226之殘基處經截短。
  58. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少85%一致性之胺基酸序列。
  59. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少90%一致性之胺基酸序列。
  60. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  61. 如請求項40之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1包含與SEQ ID NO: 1之殘基1-226具有一致性之胺基酸序列。
  62. 如請求項40至48中任一項之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含在對應於33之位置處之胺基酸取代。
  63. 如請求項62之rHO-1蛋白，其中，該rHO-1蛋白域包含F33L取代。
  64. 如請求項40至63中任一項之rHO-1蛋白，其中，該Fc域包含用於增強半衰期、減少聚集且/或減弱效應功能之一或者多個突變。
  65. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變包含在對應於IgG1 Fc域之234、235、251、252、254、255、256、308、309、311、312、314、347、349、350、351、354、360、366、385、386、387、389、392、394、399、405、407、409、428、433、434、435及436之一或者多個位置處之胺基酸取代。
  66. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變包含L234A及L235A胺基酸取代。
  67. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變在一個鏈上包含K360E、K409W及Y349C胺基酸取代且在第二鏈上包含Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代。
  68. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變在一個鏈上包含T350V、L351Y、F405A及Y407V胺基酸取代且在第二鏈上包含T350V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代。
  69. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變包含K360E、K409W、Y349C、Q347R、D399V、F405T及S354C胺基酸取代。
  70. 如請求項64之rHO-1蛋白，其中，該一或者多個突變在一個鏈上包含T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366L、K392L及T394W胺基酸取代。
  71. 一種核酸，其編碼請求項40至70中任一項之重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白。
  72. 一種細胞，其包含編碼請求項40至70中任一項之重組血基質加氧酶-1 (rHO-1)蛋白之核酸。
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US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
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US7504243B2 (en) * 2004-03-19 2009-03-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods for the production of biliverdin
US8163881B2 (en) 2005-05-31 2012-04-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Immunoglobulin molecules with improved characteristics
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US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same

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