KR20150122136A

KR20150122136A - 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(fgr3) 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20150122136A
Application number: KR1020157022078A
Authority: KR
Inventors: 엘비르 구즈
Original assignee: 인썸(인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르); 위니베르씨떼 뽈 싸바띠에 뚤루즈 3
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2015-10-30
Anticipated expiration: 2034-01-16
Also published as: PL2945967T3; US11814654B2; US20210032608A1; CA2896978A1; CN105121464B; WO2014111744A1; DK2945967T3; CA2898415A1; SI2945967T1; US20210032607A1; EP2945967A1; KR20210054026A; HK1217959A1; US10724014B2; KR102249454B1; US20150344855A1; MX2019013857A; SG11201505140XA; JP2019107006A; US20200199545A1

Abstract

본 발명은 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)의 비정상적으로 증가된 활성화를 나타내는 환자에 의해, 특히 FGFR3의 연장된 활성화된 돌연변이체의 발현에 의해 발생하는 골격 성장 지연 질환, 특히 골격 질병의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 연골무형성증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 FGFR3에 관한 것이다.

Description

골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGR3) 폴리펩티드{A SOLUBLE FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (FGR3) POLYPEPTIDE FOR USE IN THE PREVENTION OR TREATMENT OF SKELETAL GROWTH RETARDATION DISORDERS}

본 발명은 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)의 비정상적으로 증가된 활성화를 나타내는 환자에 의해, 특히 FGFR3의 구성적으로 활성화된 돌연변이체의 발현에 의해 발생하는 골격 성장 지연 질환, 특히 골격 질병 및 두개유합증의 예방 또는 치료에 관한 것이다.

인간에서 골격 발달은 다수의 성장 인자들에 의해 조절된다.

이들 가운데 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)(Fibroblast Growth Factor Receptor 3)는 연골내골화의 음의 조절인자로서 개시되었다. 상기 FGFR3을 암호화하는 유전자의 돌연변이는 치사성이형성증(TDI 및 TDII)(2), 및 단축된 사지 왜소증의 가장 흔한 형태인 연골무형성증(3)을 포함하여, 다수의 골격 연골이형성증(1)의 표현형의 원인인 것으로 나타났다. 연골무형성증에 걸린 아동은 두개골 및 척추골의 기형 및 비정상적인 장골 발달을 앓으며, 작은 신장 및 심한 신경학적 및 정형외과적 합병증이 발생한다(4,5). 기존의 치료들은 단지 상기 합병증 중 일부를 개선하도록 설계되어 있으며, 침습적이고 극단적이다(6,7).

연골무형성증은 FGFR3에 대한 유전자(Fgfr3ach)의 점 돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 우성 질환이다(8). 병든 환자 중 약 97%에서, 연골무형성증은 상기 수용체의 막관통 도메인 중의 G380R 치환에 의해 야기된다(9,10). 이러한 FGFR3에서의 돌연변이는 상기 수용체의 티로신 키나제 활성의 활성화를 연장시키는 기능획득(11)을 생성시킨다(12,13). 상기 G380R 돌연변이 FGFR3은 그의 이량체화 및 활성화를 위해 여전히 리간드 의존성으로 남아있지만(12,14); 상기 돌연변이의 존재는 상기 리간드/수용체 복합체를 안정화시키고(15) 수용체 내면화를 지연시켜(12), 후속의 세포내 Ras/MAPK 경로 신호발생(12)을 연장시킨다. 상기 생성되는 FGFR3 신호발생은 연장되어 성장판에서 연골세포 증식 및 분화를 끊임없이 억제한다(16). 상기 돌연변이 수용체를 발현하는 세포는 성숙하지 못하고 무기질화된 골 기질에 의해 대체되지 않아, 연골내골화에 의해 형성되는 모든 골의 연장을 방해한다(17,18). 여기에는 부속 골격의 장골뿐만 아니라, 척추골, 흉골, 두개골 기반, 및 골 성장이 연골결합(안정 연골세포의 공통 대역을 갖는 2개의 대향된 성장판으로 이루어지는 연골로 된 구조이다)에서 발생하는 경우 두개골 중의 일부 뼈가 포함된다. 상기 장골에서 연골내 성장판의 경우처럼, 연골결합 또한 뼈에 의해 대체되어 진다.

골 성장 방해의 원인 기전을 해독하는 증가된 수의 연구에도 불구하고, 여전히 치료법을 획득할 수가 없다. 다수의 치료학적 접근법들은 돌연변이 FGFR3 및 그의 하류 신호발생을 표적화함을 고려한다(16). 최근에, 진(Jin) 등은 TDII의 쥐 모델에서 FGFR3 신호발생을 억제하는 신규의 펩티드를 시험하였다(19). 상기 연구는 자궁내 치료에 따른 TDII 마우스의 신생아 치사성의 역전을 입증하고 세포외 구획에서 FGFR3의 표적화가 FGFR3-관련된 골격 이형성증의 치료에 유효한 전략일 수 있다는 개념증명을 설명한다.

연골무형성증의 현행 치료법들은 다리 연장 및 성장 호르몬 요법과 같은 정형외과술을 포함한다. 그러나, 다리 연장은 환자에게 큰 고통을 입히며, 성장 호르몬 치료법은 어린 시절에 시작하는 주기적인 성장 호르몬 주사에 의해 신장을 증가시킨다. 더욱이, 주사를 중단하면 성장이 멈춘다.

결과적으로, 신규의 연골무형성증 치료법뿐만 아니라 FGFR3-관련된 골격 질병을 포함한 다른 골격 성장 지연 질환의 치료법을 개발하는 것이 바람직하다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 분리된 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3)(soluble Fibroblast Growth Factor Receptor 3) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물에 관한 것이다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 또한 분리된 sFGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

세 번째 측면에서, 본 발명은 또한 분리된 sFGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 골격 성장 지연 질환 FGFR3-관련된 골격 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 골격 성장 지연 질환 FGFR3-관련된 골격 질병의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 sFGFR3 폴리펩티드 또는 상기와 같은 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

더욱 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 분리된 sFGFR3 면역접합체 그 자체뿐만 아니라 약물로서 그의 용도에 관한 것이다.

도 1: FLAG - sFGFR3 존재하에 ATDC5 세포에서 유효 FGF 결합 및 감소된 Erk 인산화. (a) 고정량의 인간 또는 쥐 염기성 FGF(100 ng)를 증가하는 농도의 FLAG-sFGFR3과 배양시켰다. 2시간 후에, 남아있는 결합되지 않은 FGF가 ELISA에 의해 검출되었다. 선형 회귀 분석은 2개 기울기, hFGF, 인간 FGFb; mFGF, 마우스 FGFb 간의 통계학적 차이를 보이지 않았다. 실험을 3회 중복하여 수행하였으며 5회 반복하였다. (b) Erk 인산화를 증가하는 용량의 FLAG-sFGFR3과의 배양에 이은 ATDC5 세포상의 면역블럿팅에 의해 평가하였다. 그래프는 처리되지 않은 세포의 인산화 수준과 비교된 인산화 변화의 백분율을 나타낸다. 실험을 6회 반복하였다. 정규성의 검증에 따라, 통계학적 비교를 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. *p<0.05, ***p<0.001. 값들은 평균±SD를 나타낸다.
도 2: 전체적인 골격 성장에 대한 FLAG - sFGFR3 처리 효과. (a) 골격 성장에 대한 처리 효과를 예시하는 X-선 방사선사진. 나타낸 골격은 PBS 또는 5 ng의 FLAG-sFGFR3의 피하 주사를 받은 wt 및 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스를 나타낸다. 성장은 체중(b), 신체 및 꼬리 길이(c), 및 장골 측정(d)에 의해 특성화되었다. (정규 분포에 따른 데이터; 스튜던츠 t 검정을 사용하여 데이터를 처리되지 않은 마우스에 대해 획득된 측정치와 비교하였다. 그룹당 n을 표 1에 나타낸다; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 대 처리되지 않은 wt; ##p<0.01; ###p<0.001 대 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach/+ 마우스. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스
도 3: 척추골 성숙화에 대한 FLAG - sFGFR3 처리의 효과. (a) 척추후만 지수(KI)를 우측 측면 횡와위로 놓인 마우스의 방사선사진으로부터 측정하였다. 로스(Laws) 등(28)에 의해 정의된 바와 같이, 라인 AB는 C7의 후방 테두리로부터 L6의 후방 테두리까지 그은 라인의 길이이다. 라인 CD는 라인 AB로부터 상기 라인에서 가장 먼 척추 몸통의 등쪽 경계까지의 거리이다. 임상적으로, 척추후만증은 KI<4를 특징으로 한다. (b) 처리되지 않은 wt, 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스 및 5 ng의 FLAG-sFGFR3을 받은 트랜스제닉 마우스로부터의 전형적인 척추골의 사진. 표에서 미성숙 C7, T11 및 요추에 대한 상이한 처리 그룹들 중 동물의 백분율을 나타낸다. ^§요추 압박은 대마비 또는 이동 결함을 특징으로 하였다. 정규 분포에 따른 데이터; 스튜던츠 t 검정을 사용하여 데이터를 처리되지 않은 마우스에 대해 획득된 측정치와 비교하였다. 그룹당 n을 표 1에 나타낸다; *p<0.05; ***p<0.001 대 처리되지 않은 wt; ##p<0.01; ###p<0.001 대 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.
도 4: 두개골 발달에 대한 FLAG - sFGFR3 처리 효과. (a) 두개골 길이(L) 및 너비(W)를 측정하고 비 L/W를 계산하였다. 정규 분산 및 분포의 검증에 따라 스튜던츠 t 검정을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 그룹당 n을 표 1에 나타낸다; p<0.001 대 처리되지 않은 wt; #p<0.05 대 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스. (b) PBS 또는 5 ng의 FLAG-sFGFR3을 받은 wt 및 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스로부터의 두개골의 전형적인 X-선. 이들은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스상에서 전형적으로 관찰되는 두개 연골결합의 조기 마감의 치료 예방을 나타낸다. 이를 화살표로 가리킨다. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.

발명자들은 골 성장을 복원시킴으로써 연골무형성증에 유효한 치료학적 접근법을 설계하였다. 본 발명에 나타낸 바와 같이, Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스(연골내골화에 의해 형성된 모든 뼈의 단축화를 갖는, 인간 병리학에 필수적으로 동일한 표현형을 나타내는 연골무형성증의 쥐 모델)에 대한 유인용 수용체로서 작용하는 재조합 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3)의 출생 후 투여는 정상적인 골격 성장을 생성시켜 연골무형성증 증상 및 합병증의 개시를 예방한다.

본 발명에 개시된 바와 같이, 성장기간 전체를 통한 재조합 sFGFR3의 반복된 피하 주사는 트랜스제닉 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 정상적인 골격 성장을 복원시킬 수 있고, 이는 정상적인 신체 길이 및 관련 합병증의 현저한 감소를 생성시킨다. 성장판 연골세포의 유효 성숙화가 처리된 마우스의 뼈에서 복원되었으며, 이는 Fgfr3 ^ach/+ 마우스에서 골격 성장의 용량-의존적인 증대를 생성시켰다. 이는 독성의 어떠한 증거도 없이, 합병증의 수 및 강도의 현저한 감소와 관련된 정상 신장을 생성시킨다. 이러한 결과는 골 성장을 복원시키기 위한 용해성 FGFR3의 용도를 입증하며, 연골무형성증 및 관련된 골격 질환에 대한 유망한 치료법으로서의 그의 가능성을 가리킨다.

치료 방법 및 용도:

본 발명은 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법 및 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 제공한다.

따라서 본 발명은 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 분리된 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물에 관한 것이다.

하나의 실시형태에서, 상기 골격 성장 지연 질환은 특발성 골격 성장 지연 질환이다.

또 다른 실시형태에서, 상기 골격 성장 지연 질환은 FGFR3-관련된 골격 질병이다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "섬유아세포 성장 인자 수용체 3"("FGFR3") 또는 "FGFR3 수용체"란 용어들은 임의의 고유 또는 변형 FGFR3 폴리펩티드를 지칭한다. 염색체 4의 원위의 짧은 가지상에 위치하는 FGFR3 유전자는 806 아미노산 단백질 전구체(섬유아세포 성장 인자 수용체 3 동형 1 전구체)를 암호화한다. 상기 FGFR3 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 천연 인간 FGFR3 유전자는 진뱅크(Genbank) 수납 번호 NM_000142.4에 도시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 가지며 천연 인간 FGFR3 단백질은 진뱅크 수납 번호 NP_000133에 도시되고 하기에 서열번호 3에 의해 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다):

본 발명에 사용되는 바와 같이, "FGFR3의 세포외 도메인" 또는 "FGFR3의 세포외 도메인"이란 용어들은 서열번호 3의 1 내지 375번(상기에서 밑줄 그은 서열) 범위의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 지칭한다.

"폴리펩티드"란 용어는 본 발명에서 불특정 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 이들 용어는 명세서뿐만 아니라 청구범위 전체를 통해 호환적으로 사용된다. "폴리펩티드"란 용어는 비제한적으로 인산화, 아세틸화, 글리코실화 등을 포함한 번역후 변형을 제외하지 않는다.

"분리된" 폴리펩티드는, 상기 폴리펩티드가 살아있는 유기체 내에, 예를 들어 인체 내에 존재하지 않음을 의미한다. 그러나, 상기 분리된 폴리펩티드는 조성물 또는 키트의 부분일 수 있다. 상기 분리된 폴리펩티드는 바람직하게는 정제된다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "용해성"이란 용어는 세포막에 결합되지 않은 폴리펩티드를 지칭한다. 대개, 수용체는 그의 아미노산 서열에 막관통 도메인이 없는 경우 용해성 형태로 존재한다. 이와 관련하여, 한 형태는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상적인 분석을 사용하여, 상기 형태의 대부분이 막과 결합되지 않은 분획 중에서, 예를 들어 세포 상등액 또는 혈청 중에서 검출될 수 있는 경우, 용해성일 것이다.

"고유 서열" 폴리펩티드는 자연으로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 따라서, 고유 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물(인간 포함)로부터의 천연 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기와 같은 고유 서열 폴리펩티드를 자연으로부터 분리하거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성시킬 수 있다. "고유 서열" 폴리펩티드란 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연의 절두되거나 분비된 형태(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 천연 변이체 형태(예를 들어, 선택적 스플라이싱 형태(alternatively spliced form)) 및 천연 대립유전자 변이체를 포함한다.

폴리펩티드 "변이체"는 상기 고유 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80% 아미노산 서열 일치성을 갖는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 지칭한다. 상기와 같은 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 첨가되거나 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 상기 고유 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80% 아미노산 서열 일치성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 아미노산 서열 일치성, 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 95% 아미노산 서열 일치성을 가질 것이다.

본 발명의 문제의 아미노산 서열에 적어도, 예를 들어 95% "일치하는" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 주 폴리펩티드의 아미노산 서열이 상기 문제 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 5개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있음을 제외하고, 상기 주 폴리펩티드 서열이 상기 문제 서열과 일치함을 의미한다. 즉, 문제 아미노산 서열에 적어도 95% 일치하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 획득하기 위해서, 상기 주 서열 중의 아미노산 잔기의 5%(100 중 5) 이하가 삽입되거나, 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

본 출원의 틀 내에서, 일치성의 백분율을 전체적인 정렬을 사용하여 계산한다(즉 2개의 서열을 그들의 전체 길이에 걸쳐 비교한다). 2개 이상 서열의 일치성 및 상동성을 비교하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 2개 서열의 전체 길이를 고려할 때 상기 두 서열의 최적의 정렬(틈 포함)을 찾기 위해 예를 들어 니들맨-분취(Needleman-Wunsch) 전체 정렬 연산(문헌[Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453])을 사용하는 "니들" 프로그램을 사용할 수 있다. 상기 니들 프로그램은 예를 들어 www.ebi.ac.uk 사이트에서 입수할 수 있다. 본 발명에 따른 일치성의 백분율을 바람직하게는 10.0인 "틈 개방(Gap Open)" 매개변수, 0.5인 "틈 연장(Gap Extend)" 매개변수, 및 블로섬(Blosum)62 매트릭스와 함께 EMBOSS::니들(전체적) 프로그램을 사용하여 계산한다.

기준 서열에 "적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는" 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 상기 기준 서열에 비해 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 돌연변이들을 포함할 수도 있다. 기준 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 상기 기준 서열의 대립유전자 변이체에 상응할 수 있다. 상기는 예를 들어 상기 기준 서열에 비해 단지 치환만을 포함할 수도 있다. 상기 치환은 바람직하게는 하기 표에 나타낸 바와 같은 보존적 치환에 상응한다.

용해성 FGFR3 폴리펩티드는 FGF 단백질에 결합함으로써 상기 단백질의 생물 활성에 억제 영향을 발휘하고, 이에 의해 상기 단백질이 표적 세포의 표면상에 존재하는 FGFR3에 결합하는 것을 방지한다. 용해성 FGFR3 폴리펩티드가 세포막과 결합되는 것은 바람직하지 않다.

바람직한 실시형태에서, 상기 용해성 FGFR3 폴리펩티드는 상기 FGFR3 폴리펩티드가 유래되는 막관통 및/또는 세포내 도메인에 상응하는 어떠한 아미노산 서열도 없다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "용해성 FGFR3 폴리펩티드" 또는 "sFGFR3"이란 용어는 상기 FGFR3 수용체, 또는 그의 변이체 또는 단편의 세포외 영역을 포함하거나 또는 상기 영역으로 이루어지는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, sFGFR3(즉 하기 서열번호 1에 의해 도시되는 바와 같은, 인간 FGFR3 수용체로부터 유래되는 694 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지는 폴리펩티드)은, FGFR3의 제3 Ig-유사 도메인(Ig IIIb) 및 막관통 도메인의 두 번째 절반을 제외하고 인간 FGFR3의 모든 세포외 도메인을 포함할 수 있다:

하나의 특정한 실시형태에서, 상기 sFGFR3 폴리펩티드는 하기 서열번호 2에 의해 정의되는 핵산 서열에 의해 암호화된다:

상기와 같은 핵산은 mRNA 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라 서브-클로닝을 촉진하기 위해서(고유 폴리펩티드 서열은 암호화하지만) GC 함량이 감소하도록 최적화되었다.

"기능적 균등물"은 모 폴리펩티드의 생물 활성 및 특이성을 유지하는 분자(예를 들어, 재조합 폴리펩티드)이다. 따라서, "sFGFR3의 기능적 균등물"이란 용어는 상기 기능적 균등물이 기준 폴리펩티드의 생물 활성들 중 적어도 하나, 바람직하게는 전부를 나타내는 한, 예를 들어 상기 FGF 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기가 지칭하는 폴리펩티드(즉 sFGFR3 폴리펩티드)의 변이체 및 단편을 포함한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합하는"은 생물 활성 단편이 FGF에 대해 높은 친화성을 갖지만 대조용 단백질에는 갖지 않음을 의미한다. 특이적 결합을 다수의 기법들, 예를 들어 ELISA, 유식 세포측정, 웨스턴 블럿팅, 또는 면역침전에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게, 상기 기능적 균등물은 FGF에 나노몰 또는 피코몰 수준으로 특이적으로 결합한다.

따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 FGFR3의 세포외 영역의 단편을 포함하거나 또는 상기 단편으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하나, 단 상기 단편은 생물학적으로 활성이어야 한다. 본 발명의 틀 내에서, 상기 생물 활성 단편은 예를 들어 상기 FGFR3 수용체의 세포외 영역의 적어도 300, 325, 350개의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 FGFR3 수용체의 세포외 영역의 기능적 균등물의 "생물 활성"은 (i) FGF에 결합하는 능력; 및/또는 (ii) FGF 세포내 신호발생을 감소시키는 능력(예를 들어, FGF와의 결합에 의해 FGFR3 수용체 활성화에 따른 Erk 인산화); 및/또는 (iii) 생체내에서(예를 들어, Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서) 골 성장을 복원시키는 능력을 의미한다.

당해 분야의 숙련가는 상기 FGFR3의 세포외 영역의 기능적 균등물이 생물 활성인지의 여부를 쉽게 측정할 수 있다. 새로 생성된 폴리펩티드가 처음에 특성화된 폴리펩티드 sFGFR3(서열번호 1에 묘사된 서열로 이루어지는 폴리펩티드)와 동일한 방식으로 FGF에 결합하고/하거나 FGF 세포내 신호발생을 감소시키는지의 여부를 검사하기 위해서, 결합 분석, FGF 활성 분석 또는 ERK 활성화 분석(실시예를 참조하시오)을 각각의 폴리펩티드에 대해 수행할 수 있다. 또한, 시험관내 또는 생체내에서 수행된(예를 들어, 실시예 섹션에 개시된 바와 같이 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스를 사용함으로써) 시간-과정 및 용량-반응은 각각의 폴리펩티드에 최적인 조건들을 결정할 것이다.

더욱이, 상기 FGFR3 수용체의 기능적 활성화를 당해 분야의 숙련가에 의해 공지된 방법에 따라 쉽게 평가할 수 있음을 또한 주목해야 한다. 실제로, 활성화된 FGFR3 수용체는 세포질 도메인을 향해 위치한 티로신 잔기들 상에서, 즉 Tyr⁶⁴⁸ 및 Tyr⁶⁴⁷ 상에서 인산화되기 때문에, 상기 FGFR3 수용체의 기능적 활성화를 예를 들어 그의 인산화를 측정함으로써 평가할 수 있다.

예를 들어, 상기 FGFR3 수용체의 리간드-유도된 인산화의 분석을 문헌[Le Corre et al., Org. Biomol. Chem., 8: 2164-2173, 2010]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다.

한편으로, 세포에서 수용체 인산화를 상기 변형을 특이적으로 인식하는 항체들을 사용하여 면역세포화학, 면역조직화학 및/또는 유식 세포측정에 의해 쉽게 검출할 수 있다. 예를 들어 Tyr⁶⁴⁸ 및 Tyr⁶⁴⁷ 잔기 상에서 FGFR3의 인산화를 인산화된 Tyr⁶⁴⁸ 및 Tyr⁶⁴⁷-FGFR3에 대한 단클론 또는 다클론 항체를 사용하여 면역세포화학, 면역조직화학 및/또는 유식 세포측정에 의해 검출할 수 있다.

더욱이, FGFR3은 그의 리간드와 결합시, ERK 및 p38 MAP 키나제 경로, 및 STAT 경로를 활성화시킴으로써 신호발생을 매개한다. 따라서 FGFR3 수용체의 활성화를 또한 문헌[Horton et al., Lancet, 370: 162-172, 2007]에 개시된 바와 같이 상기 특정한 경로들의 활성화를 측정함으로써 평가할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 태그를 포함할 수 있다. 태그는 상기 폴리펩티드의 정제에 유용할 수 있는 에피토프-함유 서열이다. 상기 태그를 친화성 크로마토그래피와 같은 다양한 기법들에 의해, 면역표지화 기법을 사용하는 세포 또는 조직 샘플 내의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드의 위치측정을 위해, 면역블럿팅에 의한 상기 폴리펩티드의 검출 등을 위해 부착시킨다. 당해 분야에 통상적으로 사용되는 태그의 예는 GST(글루타치온-S-트랜스퍼라제-태그, FLAG(상표)-태그, 스트렙-태그(상표), V5 태그, myc 태그, His 태그(전형적으로 6개의 히스티딘 잔기들로 이루어진다) 등이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 그의 안정성 및/또는 생물학적 적용도를 개선시키는 화학적 변형을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 화학적 변형은 생체내에서 효소 분해에 대한 상기 폴리펩티드의 증가된 보호, 및/또는 막 장벽을 가로지르는 증가된 능력을 갖는 폴리펩티드를 수득하고, 따라서 그의 반감기를 증가시키고 그의 생물 활성을 유지 또는 개선시키는 것을 목표로 한다. 당해 분야에 공지된 임의의 화학적 변형을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 상기와 같은 화학적 변형은 비제한적으로 하기를 포함한다:

- 아미노산의 변형된 및/또는 통상적이지 않은 아미노산에 의한 치환(들), 예를 들어 아미노산의 Nle, Nva 또는 Orn과 같은 통상적이지 않은 아미노산에 의한 치환; 및/또는

- 상기 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 단부의 변형, 예를 들어 N-말단 아실화(바람직하게는 아세틸화) 또는 탈아민화, 또는 C-말단 카복실기의 아미드 또는 알콜기로의 변형;

- 2개 아미노산 간의 아미드 결합에서의 변형: 2개 아미노산을 연결하는 아미드 결합의 질소 원자 또는 알파 탄소에서의 아실화(바람직하게는 아세틸화) 또는 알킬화(바람직하게는 메틸화);

- 2개 아미노산을 연결하는 아미드 결합의 알파 탄소에서의 변형, 예를 들어 2개 아미노산을 연결하는 아미드 결합의 알파 탄소에서의 아실화(바람직하게는 아세틸화) 또는 알킬화(바람직하게는 메틸화);

- 키랄성 변화, 예를 들어 하나 이상의 천연 아미노산(L 거울상 이성질체)의 상응하는 D-거울상 이성질체에 의한 치환;

- 하나 이상의 천연 아미노산(L-거울상 이성질체)을, 아미노산 쇄의 전환(C-말단 단부로부터 N-말단 단부로의)과 함께, 상응하는 D-거울상 이성질체로 치환시키는 레트로-전환;

- 하나 이상의 알파 탄소가 질소 원자로 치환된 아자펩티드; 및/또는

- 하나 이상의 아미노산의 아미노기가 α 탄소보다는 β 탄소에 결합된 베타펩티드.

또 다른 실시형태에서, 다이펩티드 첨가는 내인성 운반체를 사용함으로써 혈액 망막 장벽을 관통하는 눈에서의 순환제의 침투를 개선시킬 수 있다.

약물 실행가능성을 개선시키는 또 다른 전략은 수용성 중합체의 사용이다. 다양한 수용성 중합체들이 생체분포를 변형시키고, 세포 흡수 방식을 개선시키고, 생리학적 장벽을 관통하는 투과성을 변화시키고; 신체로부터의 제거율을 변형시키는 것으로 나타났다. 표적화 또는 서방성 효과를 성취하기 위해서, 말단기로서, 주쇄의 부분으로서, 또는 중합체쇄상의 펜던트기로서 약물 부분을 함유하는 수용성 중합체를 합성하였다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 고도의 생체적합성 및 변형 용이성을 제공하므로 약물 담체로서 널리 사용되어 왔다. 다양한 약물, 단백질 및 리포솜에의 부착은 체류 시간을 개선시키고 독성을 감소시키는 것으로 나타났다. PEG는 상기 쇄의 단부에서 하이드록실기를 통해서 및 다른 화학 방법을 통해 활성제에 결합될 수 있으나; PEG 자체는 분자당 2개 이하의 활성제로 제한된다. 상이한 접근법에서, PEG 및 아미노산의 공중합체가, PEG의 생체적합성 성질을 유지하지만 분자당 다수의 부착점의 부가된 이점을 갖고(더 큰 약물 부하를 제공한다), 다양한 용도에 적합하도록 합성적으로 설계될 수 있는 신규의 생물물질로서 탐구되었다.

당해 분야의 숙련가들은 약물의 유효한 변형을 위한 PEG화 기법을 알고 있다. 예를 들어, PEG 및 삼작용성 단량체, 예를 들어 리신의 교번 중합체들로 이루어지는 약물 전달 중합체가 벡트라메드(VectraMed)(미국 뉴저지주 플레인스보로 소재)에 의해 사용되었다. 상기 PEG 쇄(전형적으로 2000 달톤 이하)는 안정한 우레탄 결합을 통해 리신의 a- 및 e-아미노기에 연결된다. 상기와 같은 공중합체는 PEG의 바람직한 성질을 유지하면서, 상기 중합체 쇄를 따라 엄격하게 조절되는 소정의 간격으로 반응성 펜던트기(리신의 카복실산기)를 제공한다. 상기 반응성 펜던트기는 유도체화, 가교결합, 또는 다른 분자와의 접합에 사용될 수 있다. 이들 중합체는 상기 중합체의 분자량, 상기 PEG 분절의 분자량, 및 상기 약물과 중합체 간의 절단 가능한 연결을 변화시킴으로써 안정한, 장기간 순환되는 전구약물을 생성시키는데 유용하다. 상기 PEG 분절의 분자량은 상기 약물/연결기의 간격 및 접합체의 분자량당 약물의 양에 영향을 미친다(보다 작은 PEG 분절이 보다 큰 약물 부하를 제공한다). 일반적으로, 상기 블록 공-중합체 접합체의 전체 분자량을 증가시키는 것은 상기 접합체의 순환 반감기를 증가시킬 것이다. 그럼에도 불구하고, 상기 접합체는 쉽게 분해 가능하거나 또는 사구체 여과 허용 한계 이하의 분자량(예를 들어, 60 kDa 미만)을 가져야 한다.

또한, 순환 반감기, 및 생체 분포의 유지에 중요한 중합체 주쇄 외에, 링커를 사용하여 치료제를, 특정한 촉발제, 전형적으로는 표적화된 조직에서 효소 활성에 의해 상기 주쇄 중합체로부터 방출될 때까지 전구-약물 형태로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 유형의 조직 활성화된 약물 전달은, 특정한 생체분포 부위로의 전달이 요구되고 상기 치료제를 병리 부위에 또는 그 부근에 방출시키는 것이 요구될 때 특히 유용하다. 활성화된 약물 전달에 사용하기 위한 연결기 라이브러리들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 효소 동역학, 활성 효소의 우세, 및 선택된 질병-특이성 효소의 절단 특이성을 기본으로 할 수 있다. 상기와 같은 링커들을, 치료학적 전달을 위해 본 발명에 개시된 단백질 또는 상기 단백질의 단편을 변형시키는데 사용할 수 있다.

더욱 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 이종 폴리펩티드(즉 관련되지 않은 단백질, 예를 들어 면역글로불린 단백질로부터 유래된 폴리펩티드)에 융합시킬 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "융합된" 및 "융합"이란 용어는 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하여 어떠한 수단에 의해서든 2개 이상의 요소 또는 성분을 함께 결합시킴을 지칭한다. "인-프레임 융합"은 원래의 개방 판독 프레임(ORF)의 정확한 번역 판독 프레임을 유지하는 방식으로, 연속적인 보다 긴 ORF를 형성하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 ORF의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF(분절들이 사실상 통상적으로 그렇게 결합되지 않는다)에 의해 암호화된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 분절들을 함유하는 단일 단백질일 수 있다. 따라서 상기 판독 프레임이 상기 융합된 분절 전체를 통해 연속적으로 만들어지지만, 상기 분절들은 예를 들어 인-프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수도 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "sFGFR3 융합 단백질"이란 용어는 이종 폴리펩티드에 융합된 FGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 FGFR3 융합 단백질은 일반적으로 상기 FGFR3 폴리펩티드(상술한 바와 같다)와 마찬가지로 하나 이상의 생물학적 성질을 공유할 것이다.

sFGFR3 융합 단백질의 일례는 sFGFR3 면역접합체이다.

본 발명의 추가의 측면은 분리된 sFGFR3 면역접합체 그 자체뿐만 아니라 약물로서 그의 용도에 관한 것임을 또한 주목해야 한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "면역접합체"란 용어는 이종 단백질("부착소")의 결합 특이성과 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능을 겸비하는 항체-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 면역접합체는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌(즉 "이종"인) 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역접합체 분자의 부착소 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 연속적인 아미노산 서열이다. 상기 면역접합체 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열을 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 하위유형, IgA(IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 획득할 수 있다.

상기 면역글로불린 서열은 바람직하게는, 반드시는 아니지만, 면역글로불린 불변 도메인(Fc 영역)이다. 면역접합체는 인간 항체의 귀중한 화학적 및 생물학적 성질들 중 다수를 가질 수 있다. 면역접합체를 적합한 인간 면역글로불린 힌지 및 불변 도메인(Fc) 서열에 연결된 목적하는 특이성을 갖는 인간 단백질 서열로부터 제작할 수 있기 때문에, 전적으로 인간 성분들만을 사용하여 관심의 결합 특이성을 성취할 수 있다. 상기와 같은 면역접합체는 환자에게 최소로 면역원성이며, 만성 또는 반복된 사용에 안전하다. 하나의 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 변형 Fc 영역이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 상기 Fc 영역은 기능성 Fc 영역이다. 상기 sFGFR3 면역접합체의 sFGFR3 부분 및 면역글로불린 서열 부분은 최소 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 면역글로불린 서열은 바람직하게는, 반드시는 아니지만, 면역글로불린 불변 도메인이다. 본 발명의 키메라 중에서 면역글로불린 부분을 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터, 그러나 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3로부터 획득할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "Fc 영역"이란 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226번 위치의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카복실-말단까지의 신장부로 정의되는다.

sFGFR3 융합 단백질의 또 다른 예는 문헌[Konterman et al. 2012 AlbudAb^TM Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Lives]에 개시된 바와 같은 AlbudAb(상표) 테크놀로지 플랫폼에 따른 인간 혈청 알부민-결합 도메인 항체(AlbudAb)와의 sFGFR3 폴리펩티드의 융합물이다.

본 발명의 폴리펩티드를 당해 분야의 숙련가들에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 수단에 의해 생성시킬 수 있다. 충분량의 sFGFR3 또는 그의 기능적 균등물, 또는 sFGFR3 융합 단백질, 예를 들어 본 발명에 따라 사용하기 위한 sFGFR3 면역접합체를 생성시키기 위해서, 발현을 편의상 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 재조합 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양함으로써 성취할 수 있다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드를 재조합 수단에 의해서, 암호화 핵산 분자로부터의 발현에 의해 생성시킨다. 여러가지 상이한 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 널리 공지되어 있다.

상기 폴리펩티드를, 재조합 형태로 발현시, 바람직하게는 숙주 세포에서 암호화 핵산으로부터의 발현에 의해 생성시킨다. 임의의 숙주 세포를, 특정 시스템의 개별적인 요건에 따라 사용할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 세균 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당해 분야에서 입수할 수 있는 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 세포 및 다수의 다른 세포들(예를 들어, HEK 293 세포)을 포함한다. 세균이 또한, 용이하게 조작되고 증식될 수 있기 때문에, 재조합 단백질의 생성에 바람직한 숙주이다. 통상적인 바람직한 세균 숙주는 에스케리키아 콜라이이다.

더욱이, 단백질-기재 생물약제의 대부분은 일부 형태의 번역후 변형을 드러내며 이는 그의 치료학적 용도에 적합한 단백질 성질들에 크게 영향을 미칠 수 있음에 주목해야 한다. 단백질 글리코실화가 가장 통상적인 변형을 나타낸다(인간 단백질의 약 50%는 글리코실화된다). 글리코실화는 단백질 조성물 내 단백질상의 상이한 글리칸 구조의 생성을 통해 상당한 이종성을 상기 조성물에 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 글리칸 구조는 상기 당단백질이 소포체(ER) 및 골지체를 운송하기 때문에(당단백질 캐스케이드) 상기 글리코실화 기구의 다양한 효소들의 작용에 의해 만들어진다. 단백질의 글리칸 구조(들)의 성질은 상기 단백질의 폴딩, 안정성, 수명, 수송, 약역학, 약동학 및 면역원성에 영향을 미친다. 상기 글리칸 구조는 상기 단백질의 주요 기능 활성에 큰 영향을 미친다. 글리코실화는 국소 단백질 구조에 영향을 미칠 수 있으며 상기 폴리펩티드 쇄의 폴딩을 지시하는데 도움이 될 수 있다. 한 가지 중요한 종류의 글리칸 구조는 소위 N-글리칸이다. 상기는 초기 폴리펩티드 쇄의 공통 서열 NXS/T 중 아스파라진 잔기의 아미노(N)-기에 대한 올리고사카라이드의 공유 결합에 의해 생성된다. N-글리칸은 또한 단백질의 그의 최종 표적으로의 분류 또는 지시에 참여할 수 있다: 예를 들어 항체의 N-글리칸은 보체 성분(complement component)과 상호작용할 수 있다. N-글리칸은 또한 당단백질을, 예를 들어 그의 용해도를 증대시키고, 그의 표면상의 소수성 패치를 차폐시키고, 단백질분해로부터 보호하고, 쇄-내 안정화 상호작용을 지시함으로써 안정화시키는 작용을 한다. 글리코실화는 단백질 반감기를 조절할 수도 있다. 예를 들어 인간에서 N-글리칸 중의 말단 시알산의 존재는 혈류 중에서 순환하는 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "당단백질"이란 용어는 하나 이상의 N-글리칸이 부착된 임의의 단백질을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 당해 분야에서 당단백질로서 일반적으로 인식되는 단백질 및 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하도록 유전자 조작된 단백질 모두를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "N-글리칸" 및 "글리코폼(glycoform)"이란 용어는 호환적으로 사용되며 N-연결된 올리고사카라이드, 예를 들어 아스파라진-N-아세틸글루코스아민 연결에 의해 폴리펩티드의 아스파라진 잔기에 부착된 올리고사카라이드를 지칭한다. N-연결된 당단백질은 상기 단백질 중의 아스파라진 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코스아민 잔기를 함유한다. 당단백질상에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, N-아세틸갈락토스아민(GalNAc), N-아세틸글루코스아민(GlcNAc) 및 시알산(예를 들어, N-아세틸-뉴라민산(NANA))이다. 상기 당 그룹의 가공은 ER의 관강(lumen)에서 공-번역적으로 발생하며 N-연결된 당단백질의 경우 골지체에서 번역-후 계속된다.

다수의 효모, 예를 들어 피키아 파스토리스, 야로위아 리포리티카 및 사카로마이세스 세레비지아에가 최근, 상기와 같은 시스템의 이점은 이용하지만 글리코실화에 관한 단점은 제거하기 위해 개발 중에 있다. 여러 균주들이 단백질상에 정의된, 인간-유사 글리칸 구조를 생성시키기 위해 유전학적 개발 중에 있다. 인간-유사 N-글리칸의 생성을 위한 효모의 유전자 조작 방법이, 미국 공개 출원 제 20040230042, 20050208617, 20040171826, 20050208617, 및 20060286637 호에 개시된 방법들과 함께, 미국특허 제 7,029,872 호 및 제 7,449,308 호에 개시되어 있다. 이들 방법을 사용하여 효모 유형 N-글리칸 대신에 인간-유사 복합체 또는 하이브리드 N-글리칸을 우세하게 갖는 치료학적 당단백질을 생성시킬 수 있는 재조합 효모들을 제작하였다. 앞서 개시된 바와 같이, 인간-유사 글리코실화는 주로 N-아세틸글루코스아민, 갈락토스, 퓨코스 및/또는 N-아세틸뉴라민산을 함유하는 "복합" N-글리칸 구조를 특징으로 한다. 따라서, 다수의 효모 균주들을 유전자 조작하여 하나 이상의 인간-유사 복합체 또는 인간-유사 하이브리드 N-글리칸, 예를 들어 GlcNAcMan3GlcNAc2를 포함하는 당단백질을 생성시켰다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "골격 성장 지연 질환"이란 용어는 뼈의 기형 및/또는 불구를 특징으로 하는 골격 질병을 지칭한다.

이러한 질환은 비제한적으로 성장판(성장판) 골절에 의해 야기되는 골격 성장 지연 질환, 특발성 골격 성장 지연 질환 및 FGFR3-관련된 골격 질병을 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "특발성 골격 성장 지연 질환"이란 용어는 원인을 모르고 예를 들어 외인성 성장 호르몬(GH), 예를 들어 재조합 인간 GH(rhGH)에 의한 치료가 효과가 없는 것으로 나타난 골격 질병을 지칭한다.

본 발명과 관련하여, "FGFR3-관련된 골격 질병"이란 용어는 FGFR3의 이상 증가된 활성화에 의해, 특히 상기 FGFR3 수용체의 기능획득 돌연변이의 발현에 의해 야기되는 골격 질병을 의미하고자 한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "기능획득 FGFR3 수용체 변이체", "FGFR3의 기능획득 돌연변이체" 또는 "연장된 활성을 나타내는 돌연변이 FGFR3"는 호환적으로 사용되며 FGF 리간드의 존재하에서 상응하는 야생형 수용체의 생물 활성보다 더 높은 생물 활성을 나타내는(즉 하류 신호발생을 촉발하는) 상기 수용체의 돌연변이체를 지칭한다.

상기 FGFR3-관련된 골격 질병은 바람직하게는 FGFR3-관련된 골격 이형성증 및 FGFR3-관련된 두개유합증이다.

본 발명에 따른 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 유전병 또는 돌발형 질병에 상응할 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "FGFR3-관련된 골격 이형성증"이란 용어는 비제한적으로 치사성이형성증 유형 I, 치사성이형성증 유형 II, 연골저형성증, 연골무형성증 및 SADDAN(발달 지체 및 흑색가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증)을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 대상체에서 상기 정의한 바와 같은 기능획득 FGFR3 수용체 변이체의 발현에 의해 야기된다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 상기 FGFR3 수용체의 G380R 기능획득 돌연변이체의 발현에 의해 야기되는 연골무형성증이다.

한편으로, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 상기 FGFR3 수용체의 G375C, G346E 또는 S279C의 발현에 의해 야기되는 연골무형성증이다.

또한 장차 확인하게 될 것인 상기 FGFR3 수용체의 또 다른 돌연변이체에 의해 야기되는 연골무형성증도 또한 포함됨을 주목해야 한다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 상기 FGFR3 수용체의 N540K, K650N, K650Q, S84L, R200C, N262H, G268C, Y278C, V381E, 기능획득 돌연변이체의 발현에 의해 야기되는 연골저형성증이다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 R248C, S248C, G370C, S371C; Y373C, X807R, X807C, X807G, X807S, X807W 및 K650M FGFR3 수용체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 FGFR3 수용체의 기능획득 돌연변이체의 발현에 의해 야기되는 치사성이형성증 유형 I이다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 상기 FGFR3 수용체의 K650E 기능획득 돌연변이체의 발현에 의해 야기되는 치사성 이형성증 유형 II이다.

바람직한 실시형태에서, 상기 FGFR3-관련된 골격 이형성증은 상기 FGFR3 수용체의 K650M 기능획득 돌연변이체의 발현에 의해 야기되는 발달 지체 및 흑색가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증이다.

본 발명은 또한 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 용해성 FGFR3(sFGFR3) 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상술한 바와 같은 sFGFR3의 "치료 유효량"은 FGFR3-관련된 골격 질병(예를 들어, 연골무형성증)의 예방 또는 치료에 충분한 길항물질의 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단 범위내에서 주치의에 의해 결정됨을 알 것이다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정한 치료학적 유효 용량 수준은 치료하려는 질환 및 상기 질환의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물, 상기 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 상기 사용되는 특정 화합물의 투여시간, 투여경로, 및 배출속도; 치료 지속기간; 상기 사용되는 특정 폴리펩티드와 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 의학 분야에 널리 공지된 유사한 인자들을 포함한 다수의 인자들에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 목적하는 치료 효과를 성취하는데 필요한 경우보다 낮은 수준의 상기 화합물의 용량으로 시작하여 상기 목적하는 효과가 성취될 때까지 상기 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다. 그러나, 상기 생성물의 1일 투여량을 하루에 성인당 0.01 내지 1,000 ㎎의 넓은 범위에 걸쳐 변화시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 치료하려는 대상체에 대한 투여량의 징후적 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 약제는 전형적으로 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 상기 약물의 유효량은 통상적으로 하루에 0.0002 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏ 체중, 특히 하루에 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏ 체중의 투여량 수준으로 공급된다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "대상체"란 용어는 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 설치류, 고양이, 개, 말, 또는 영장류를 나타낸다. 바람직하게, 상기 대상체는 인간, 보다 바람직하게는 아동(즉, 성장기 아동)이다.

성장판의 연골성 기질은 성인에서보다 신생아 또는 아동에서 덜 치밀함을 생각해야 한다. 따라서, 상기 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 폴리펩티드가 신생아 또는 아동의 연골성 기질에 더 양호하게 침투할 것을 예상할 수 있다.

하나의 실시형태에서, 상기 대상체는 FGFR3-관련된 골격 질병을 앓고 있는 것으로 진단되었다. 앞서 개시된 바와 같이, 상기 FGFR3-관련된 골격 질병은 상기 대상체에서 구성적으로 활성인 FGFR3 수용체 변이체, 예를 들어 G380R 구성적으로 활성인 돌연변이체의 발현에 의해 야기된다.

본 발명과 관련하여, "치료하는"이란 용어는 본 발명에서 (1) 상기와 같은 용어가 적용되는 질병 상태 또는 병의 증상의 진행, 악화, 또는 저하를 지연시키거나 정지시키고; (2) 상기와 같은 용어가 적용되는 질병 상태 또는 병의 증상을 경감시키거나 또는 상기 증상의 개선을 일으키고; 및/또는 (3) 상기와 같은 용어가 적용되는 질병 상태 또는 병을 역전시키거나 치유하는 것을 목표로 하는 치료학적 방법 또는 과정을 특성화하기 위해 사용된다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "예방하는"이란 용어는 상기와 같은 용어가 적용되는 질환 또는 병의 개시를 지연시키거나 또는 예방하는 것을 목표로 하는 예방학적 방법 또는 과정을 특성화하고자 한다.

본 발명의 약학 조성물:

상술한 바와 같은 분리된 용해성 FGFR3 폴리펩티드(sFGFR3)를 약학적으로 허용 가능한 부형제, 및 임의로 서방성 기질, 예를 들어 생분해성 중합체와 합하여 치료 조성물을 형성시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 분리된 sFGFR3 폴리펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 sFGFR3 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

하나의 실시형태에서, 상기 골격 성장 지연 질환은 특발성 성장 지연 질환이다.

"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용 가능한"은 적합한 경우, 포유동물, 특히 인간에게 투여시 부작용, 알러지 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무독성의 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 지칭한다.

상기 약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 섭생은 당연히 치료하려는 증상, 상기 병증의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별 등에 따라 변한다. 본 발명의 약학 조성물을 국소, 경구, 비내, 안내, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여 등을 위해 제형화할 수 있다.

바람직하게, 상기 약학 조성물은 주사될 수 있는 제형에 대한 약학적으로 허용 가능한 비히클을 함유한다. 상기 조성물은 특히, 경우에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사액의 조성을 허용하는 등장성, 멸균, 염수 용액(모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 또는 상기와 같은 염들의 혼합물), 또는 건조한, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.

상기 투여에 사용되는 용량을 다양한 매개변수의 함수로서, 및 특히 사용되는 투여 방식, 관련된 병리학, 또는 한편으로 목적하는 치료 지속기간의 함수로서 적합화할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물의 용량을 목적하는 치료 효과를 성취하는데 필요한 경우보다 낮은 수준으로 시작하여 상기 목적하는 효과가 성취될 때까지 상기 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다. 그러나, 상기 생성물의 1일 투여량을 하루에 성인당 0.01 내지 1,000 ㎎의 넓은 범위에 걸쳐 변화시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 치료하려는 대상체에 대한 투여량의 징후적 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 약제는 전형적으로 약 0.01 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 상기 약물의 유효량은 통상적으로 하루에 0.0002 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏ 체중, 특히 하루에 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏ 체중의 투여량 수준으로 공급된다.

약학 조성물을 제조하기 위해서, 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해시키거나 분산시킬 수 있다.

주사용으로 적합한 약제 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균성이어야 하고 쉽게 주사가능한 정도로 유동성이어야 한다. 상기 형태는 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 유리 염기 또는 약물학적으로 허용 가능한 염으로서 상기 활성 화합물의 용액을 계면활성제, 예를 들어 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 수중에서 제조할 수 있다. 분산액을 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 생육을 방지하기 위해서 보존제를 함유한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산부가염(상기 단백질의 유리 아미노기와 함께 형성됨)을 포함하고 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성되는 염을 포함한다. 상기 유리 카복실기와 함께 형성되는 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물, 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.

상기 담체는 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성을 예를 들어 코팅제, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사용 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 발생될 수 있다.

멸균 주사액을, 상기 활성 화합물을 필요한 양으로 적합한 용매 중에, 필요한 경우 상기 열거된 다른 성분들 중 다수와 함께 혼입한 다음, 여과 살균함으로써 제조한다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 용액으로부터의 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.

직접 주사를 위한 보다 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 고려되며, 이때 용매로서 DMSO의 사용은 대단히 신속한 침투를 생성시켜, 고농도의 활성제를 작은 종양 영역에 전달할 것이 상상된다.

제형화시, 용액을 투여 제형과 적합한 방식으로 및 치료학적으로 유효한 바와 같은 용량으로 투여할 것이다. 상기 제형을 다양한 투여형, 예를 들어 상술한 주사액의 유형으로 쉽게 투여하지만, 약물 방출 캡슐 등을 또한 사용할 수 있다.

수용액 중의 비경구 투여를 위해서, 예를 들어 상기 용액을 적합하게 완충시키고 상기 액체 희석제를 먼저 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성으로 만든다. 이러한 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액 중에 용해시키고 1000 ㎖의 피하주입액에 가하거나 제시된 주입 부위에 주사할 수 있었다(예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]을 참조하시오). 투여량의 약간의 변화가 치료되는 대상체의 조건에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 맡은 사람은 어쨌든 상기 대상체에 적합한 용량을 결정할 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 분리된 sFGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물이다.

본 발명은 또한 골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 sFGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명을 하기의 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시할 것이다. 그러나, 이들 실시예 및 도면은 어떠한 식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.

실시예 :

물질 & 방법

sFGFR3 서브클로닝 및 재조합 단백질 생산: 서브클로닝을 용이하게 하기 위해서, FGFR3ΔTM(2.1 kb)(35)(일본 교토 산업 대학의 쿠로가와-서(Kurokawa-Seo) 박사로부터의 관대한 선물)을 암호화하는 완전길이 cDNA 서열을, 원래 단백질 서열을 암호화하면서 GC 함량이 감소하도록 최적화하였다(진옵티마이저(GeneOptimizer)(등록상표) 프로세스, 진아트(GeneArt)). 상기 합성된 단편을 HindIII 및 KpnI 클로닝 부위를 사용하여 pFLAG-CMV3_G727(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))내로 서브클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 농도를 UV 분광학에 의해 측정하였다. 최종 구조물을 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 사용된 제한 부위내의 서열 상동성은 100%이었다.

재조합 FLAG-sFGFR3 단백질을, 모든 필요한 번역-후 변형을 허용하는 HEK 293 세포에서 진주스(GeneJuice) 형질감염 시약(머크 밀리포어(Merck Millipore))을 사용하여 일시적인 형질감염에 의해 생산하였다. 각각의 형질감염을 2 mM 글루타민(깁코(Gibco), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 및 1% 항생제(깁코, 라이프 테크놀로지스)가 보충된, 페놀 레드 부재의 100 ㎖ DMEM(깁코, 라이프 테크놀로지스)에서 80% 융합 HEK 293을 이용하여, 세포 공장(하이(High) 플라스크 T600, 머크 밀리포어)에서 수행하였다. 600 ㎕의 진주스 및 240 ㎍의 pFLAG-sFGFR3을 30 ㎖의 OptiMEM(깁코, 라이프 테크놀로지스)에 재현탁시키고, 실온에서 30분 배양하고, 이어서 5% CO₂ 중에서 37 ℃에서 상기 세포상에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 배지를 페놀 레드 없이, 2 mM 글루타민 및 1% 항생제가 보충된 120 ㎖ DMEM에 의해 교체하였다. 72시간 후에, 생산 배지를 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하고 아미콘 울트라-15 60 kDa(머크 밀리포어) 상에 농축시켰다. 이어서 재조합 단백질을 제조사의 설명에 따라 친화성 컬럼(ANTI-FLAG M2 친화성 젤, 시그마 알드리치)상에서 정제하였다. FLAG-sFGFR3 양을 제조사의 설명에 따라 특수 ELISA(R&D 시스템스)에 의해 측정하였다. 이어서 FLAG-sFGFR3을 50% 글리세롤 용액 중에서 0.5 ㎍/㎖의 농도로 보관하였다.

FGF 와의 FLAG - sFGFR3 배양: 고정량의 인간 또는 쥐 FGF(100 pg)(R&D 시스템스)를 PBS 1% BSA 중의 증가하는 용량의 FLAG-sFGFR3(0 내지 250 ng/㎖)과 함께 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 특수한 상업적인 ELISA 키트(R&D 시스템스)를 사용하여 남아있는 결합되지 않은 FGF를 정량분석하였다. 모든 실험을 3회 중복하여 수행하였으며 5회 반복하였다.

sFGFR3 의 반감기: sFGFR3의 반감기를 측정하기 위해서, 8주 된 WT 마우스에게 50 ㎎/㎏의 FLAG-sFGFR3의 정맥내 일시주사(bolus injection)를 제공하였다. 15분, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간째에, 헤파린 카테터를 사용하여 안와뒤 천자(retro-orbital puncture)에 의해 혈액을 채혈하였다(n=4). FLAG-sFGFR3의 농도를 항 FLAG ELISA(시그마)에 의해 측정하였다. 종말 단계의 반감기를 하기의 약동학식을 사용하여 계산하였다: t_1/2 = 0.693/λ_z, 여기에서 0.693은 2의 자연로그이고 λ_z는 상기 종말 단계의 기울기이다.

면역블럿팅 분석: 면역블럿팅을 ATDC5 세포상에서 수회 용량의 FLAG-sFGFR3의 배양에 이어 수행하였다. 이를 위해서, ATDC5 세포를 6 웰 플레이트에서 2x10⁶의 밀도로 도말하고, 부착에 이어서, 1% 항생제를 함유하는 DMEM-F12(깁코, 라이프 테크놀로지스)에서 0.5% BSA 중에서 48시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 증가하는 용량의 FLAG-sFGFR3(0, 12.5, 125, 1250, 12500 pg/㎖)와 함께 37 ℃에서 2시간 동안 미리-배양한 100 pg/㎖의 쥐 FGF와 10분간 배양하였다. 상기 배양 기간의 끝에서, 남아있는 결합되지 않은 FGF를 특수 ELISA(R&D 시스템스)에 의해 측정하였다. 이어서 세포를 4 ℃에서 45분 동안 용해 완충제(20 mM 트리스, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaF, 2 mM 나트륨 오쏘바나데이트, 10 mM 피로포스페이트, 프로테아제 억제제, 및 1% 트리톤 X-100)에 용해시켰다. 용해물을 등명화하고(14000 rpm, 10분) 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 앞서 개시된 바와 같이 면역블럿팅하였다(36). 상기 단백질을 항-포스포 p42/44 MAPK(4370S, 셀 시그널링(Cell Signaling), 항-전체 p42/44 MAPK(4696S, 셀 시그널링) 및 항-hsp60(sc1722, 산타 크루즈 바이오테크놀로지) 항체(1 ㎍/㎖)로 탐침분석하였다. 모든 실험을 6회 수행하였다.

FLAG - sFGFR3 의 면역조직화학: FLAG-sFGFR3의 면역조직화학을 3일 된 Fgfr3 ^ach/+ 마우스 및 그의 야생형 한배 새끼의 경골상에서 수행하였다. 이를 위해서, 갓난 마우스를 참수한 다음, 경골을 조심스럽게 수확하고 5% CO₂ 중에서 37 ℃에서 24시간 동안 5 ng FLAG-sFGFR3의 존재하에 24 웰 플레이트에서 배양하였다. 이어서 경골을 PBS에서 헹구고 10% 포르말린 중에서 24시간 동안 고정시켰다. EDTA 중에서 2일 동안 탈회한 다음, 뼈를 파라핀 매몰시키고 5 ㎛ 단편을 5 ㎍/㎖ 항-FLAG M2-FITC 단클론 항체(시그마 알드리치)와 함께 배양하였다. 단편을 훽스트 용액으로 대비염색하고 형광 현미경하에서 가시화하였다. 항-IgG 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다.

동물 및 처리: 매번 실험 동물 보호 원칙(NIH 공보 제 85-23 호, 1985년 개정; http://grants1.nih.gov/grants/olaw/references/phspol.htm) 및 과학 목적으로 사용되는 동물의 보호에 대한 유럽 위원회 지침( http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm)에 따랐다. 모든 과정은 실험 동물의 사용에 대한 제도 윤리 위원회(CIEPAL Azur)(승인# NCE-2012-52)에 의해 승인되었다.

실험들을 상기 돌연변이 FGFR3의 발현이 Col2al 프로모터/인헨서에 의해 구동되는 트랜스제닉 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스 상에서 수행되었다(22). 마우스를 12시간 명/암 주기에 노출시키고 표준 실험용 먹이 및 물에 자유롭게 접근시켰다. 모든 측정 및 분석을 맹검으로 수행하였으며 모든 분석을 360 bp의 상기 FGFR3 트랜스유전자를 증폭시키는 게놈 DNA의 PCR에 의해 수행한 후에 유전자형을 분석하였다(22). 2회 용량의 FLAG-sFGFR3(50% 글리세롤이 있는 10 ㎕ PBS 중의 0.5 ng 및 5 ng)을 시험하였다. 3일째에, 단일 한배 새끼(litter)로부터의 모든 갓난 마우스에게 동일한 용량을 제공하였다. 대조용 한배 새끼에게는 50% 글리세롤을 함유하는 PBS 10 ㎕를 제공하였다. 그 후에 3주동안 1주일에 2회, 등의 좌우측을 번갈아 피하 주사하였다. 마우스를 이동 및 배뇨 변화를 특히 주목하면서 매일 관찰하였다. 22일째에, 그룹당 2마리의 한배 새끼를 제외하고, 모든 동물을 CO₂ 질식에 의해 죽이고; 속 및 유전자형을 측정하였다. 체중을 측정하였다. 혈액을 심장 천자에 의해 채혈하고 50 ㎕의 0.5M EDTA와 혼합하고; 상기 샘플의 절반을 벡크만(Beckman) AU 2700 분석기를 사용하여 생화학적 평가를 위해 원심분리하고(전해질(Na⁺, K⁺, Cl^-), 락테이트 데하이드로게나제(LDH), 콜레스테롤, 크레아티닌, 크레아티닌 키나제(CK), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아밀라제, 총 빌리루빈(BLT)); 다른 절반은 혈액 계산을 위해 원심분리없이 분석하였다(Hemavet 950FS, Mascot Hematology). 시체를 조심스럽게 박피하고 내장을 제거하며 전자 디지털 캘리퍼스(피셔 사이언티픽)를 사용하여 골격 측정치(몸통 및 꼬리 길이)를 획득하였다. 전체 몸통 길이를 코에서부터 마지막 미추골의 끝까지 측정하고; 꼬리는 처음 미추골에서 시작하여 측정하였다. 기관(심장, 폐, 간, 신장, 비장)을 수확하고, 칭량하고, 표준 파라핀-매몰 기법을 사용하여 차후 조직학적 분석을 위해 10% 포르말린 중에서 보관하였다. 모든 골격의 X-선을 팍시트론(Faxitron) X-선 기계(에디멕스(Edimex))를 사용하여 촬영하였다. 확립된 방법(28)을 사용하여, 척추후만 지수를 상기 X-선상에서 각 동물에 대해 측정하였다. 이어서 깨끗이 한 골격을 표준 과정을 사용하여 알시안 블루 및 알리자린 레드로 동시에 염색하고 분석 전에 글리세롤 중에서 보관하였다. 염색된 장골들(경골, 대퇴골, 상완골)을 해부하고 전자 디지털 캘리퍼스를 사용하여 측정하고; 척추골 및 두개골을 또한 해부하고 분석하였다.

번식을 이론적으로 절반 야생형 및 절반 잡종 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스를 갖는 한배 새끼를 생성시키기 위해 마련하였다. 표현형 침투도의 변화로 인한 편향을 피하기 위해서, 실험을 동일한 종축으로부터 발생하는 적어도 2마리의 한배 새끼(하나는 처리된 것 및 하나는 대조군)상에서 수행하였다. 총 312마리의 새끼를 나타내는 총 15, 9 및 11마리의 한배 새끼들을 각각 PBS, 0.5 ng 또는 5 ng의 FLAG-sFGFR3으로 처리하였다. 그룹당 n은 표 1에 나타낸다.

처리된 동물의 번식력에 대한 FLAG - sFGFR3 의 영향: 골격 측정에 사용되지 않은 한배 새끼로부터의 동물을 번식 나이에 도달할 때까지 유지시켰다. 8주령 되었을 때, 상기 동물을 챨스 리버로부터의 8 주 된 FVB/N 마우스와 교미시켰다. 각각의 처리 및 대조용 수컷 및 암컷에 대해 출생시 갓난 마우스를 카운트하고, 선행 세대의 번식력 통계와 비교하였다. 22주령에서, 새끼들을 안락사시키고 성장을 상술한 바와 같이 평가하였다.

증식 및 분화 분석: 증식에 대한 sFGFR3 영향을 ATDC5 세포에서 측정하였다. 이를 위해서, ATDC5 세포를 24 웰 플레이트에서 5x10⁴의 밀도로 도말하고 48시간 동안 DMEM-F12 0.5% BSA(라이프 테크놀로지스) 중에서 배양하였다. 이어서 세포를 72시간 동안 100 pg/㎖의 FGF2, FGF9 또는 FGF18로, 0 또는 20 ng/㎖의 FLAG-sFGFR3의 존재하에서 공격하였다. 증식을 540 ㎚에서의 흡광도 측정에 의해 MTT(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드) 증식 분석을 사용하여 평가하였다.

연골세포 분화에 대한 처리 영향을 측정하기 위해서, 융합에 가까운 ATDC5 세포를 연골세포 분화 배지(DMEM F12 중의 37.5 ㎍/㎖ L-아스코르브산; 1 mM 나트륨 피루베이트; 1% 인슐린-트랜스페린-나트륨 셀레나이트; 100 nM 덱사메타손) 중에서 100 pg/㎖의 FGF 및 0 또는 20 ng/㎖의 FLAG-sFGFR3의 존재하에 7일 동안 24 웰 플레이트 중에서 배양하였다. 배양 7일 후에, 상기 웰의 절반을 3% 아세트산 중의 알시안 블루(pH 2.5)로 염색하였다. 남은 웰에서, 총 RNA를 RNeasy 미니 키트(퀴아겐(Qiagen))를 사용하여 추출하였다. 총 RNA(1 ㎍)를 역-전사시키고, 실시간 PCR을 수행하였다(ABI PRISM 7500). TaqMan 유전자 발현 분석을 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)로부터 구입하였다: Col10a1(Mm00487041_ml), Col2a1(Mm01309565_ml), Sox9(Mm00448840_ml), Fgfr3(Mm00433294_m1), RPLP0(리보솜 인단백질 큰 P0, Mm00725448_sl). 유전자 발현 값을 하우스키핑 유전자 RPLP0의 발현 값에 표준화하고 앞서 개시한 바와 같이 비교 주기 한계 Ct 방법(2^- ^ΔCt)을 기본으로 계산하였다.

통계학적 분석: 모든 실험 및 데이터 측정을 항상 맹검 실험에 의해 수행하였다. 통계학적 분석을 그래프패드 프리즘 6.0 소프트웨어로 수행하였다. 사용되는 통계 검정을 측정하기 위해서, 필요한 가정을 확인하였다. 정규성 및 등분산을 확인하기 위해서, 각각 아고스티노 및 피어슨(Agostino and Pearson) 옴니버스 정규성 검정 및 브라운-폴시테(Brown-Forsythe) 검정을 수행하였다. 모든 골격 측정 데이터 세트는 정규성 및 등분산 요건을 충족하였으므로, 2개의 독립적인 그룹의 비교를 위한 양방 스튜던츠 t 검정을 상이한 통계학적 분석에 사용하였다. 처리된 및 대조용 그룹 간의 정규성 검정의 비교를 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 사용하여 수행하였다. 인간 및 쥐 FGF에 대한 FLAG-sFGFR3 결합의 비교를 선형 회귀에 의해 수행하였다. 면역블럿팅 데이터 분포는 정규성에 따랐으며 따라서 이를 홈-시닥(Holm-Sidak)의 다중 비교 검정을 사용하는 일원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 기관 중량 교정 분석의 경우, 데이터 세트가 정규 분포를 따르거나 따르지 않은 경우 각각 피어슨 또는 스피어맨 검정을 사용하였다. 모든 통계학적 검정은 p<0.05의 오차 수준에서 유의수준인 것으로 간주되었다. 모든 도면에서, p의 값들을 하기와 같이 나타낸다: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. 데이터는 평균±SD로서 나타낸다.

결과

ATDC5 세포에서 FLAG - sFGFR3 은 FGF 와 유효하게 결합하고 MAPK 신호발생을 감소시킨다: FGFR3의 용해성 형태를 FGFR3ΔTM 서열을 암호화하는 플라스미드의 일시적인 형질감염에 의해 생성시켰다. 생체내 재조합 용해성 FGFR3을 검출하기 위해서, 발명자들은 FLAG 태그로 표지된 FGFR3의 용해성 형태를 사용하였다. 상기 태그는 그의 정제 및 검출을 위한 시약의 유효성으로 인해 사용되었다(23,24). 상기는 또한 면역계에 의한 상기 태그된 단백질의 조기 제거의 유도 없이 이미 생체내에서 사용되었다(25,26). 본 실험에서, 재조합 FLAG-sFGFR3을, 모든 필요한 번역후 변형을 허용하는 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에서 일시적인 형질감염에 의해 생성시키고, 친화성 컬럼을 사용하여 정제시키고, 50% 글리세롤 중에 0.5 ㎍/㎖의 농도로 보관하였다. 마우스에서, sFGFR3의 반감기는 16시간이다.

FLAG-sFGFR3이 유리 FGF에 유효하게 결합했는지를 확인하기 위해서, 고정량의 인간 FGF를 증가량의 FLAG-sFGFR3과 배양하였다. 도 1A에서 보이는 바와 같이, FLAG-sFGFR3은 hFGF에 용량-의존적인 방식으로 유효하게 결합하였다. 상기 사용된 FGFR3ΔTM 서열은 인간 기원의 것이며, 발명자들은 상기가 또한 쥐 FGF에 결합할 수 있음을 확인하였다. 유사한 결과가 획득되었으며 FLAG-sFGFR3은 유사한 양의 쥐 FGF에 결합할 수 있었다. 이는 쥐와 인간 FGFR3 사이에 90% 서열 상동성이 존재하기 때문에 예상되었다. sFGFR3은 쥐 연골세포(ATDC5 세포)상의 내인성 FGFR3과 hFGF 결합에 대해 경쟁하였으며, 이는 유인용 수용체 기전을 설명한다.

이어서 발명자들은 FGF와 FLAG-sFGFR3의 복합체 형성이 Erk 인산화시 감소된 세포내 FGF 신호발생을 생성시킴을 확인하였다. ATDC5 세포를 연골세포 생물학을 연구하기 위해 쥐 연골세포 세포주로서 사용하였다(27). 도 1B에서 보이는 바와 같이, Erk 인산화의 연저한 감소가 FLAG-sFGFR3의 용량과 관련하여 나타났다. 이는 도 1A에서 관찰된 경우와 유사하게, 콘디셔닝된 배지에서 유리 FGF의 감소와 상관되었다. 이러한 결과는 FLAG-sFGFR3이 인간 및 쥐 기원의 FGF에 유효하게 결합하고, 따라서 FGF 세포내 신호발생을 감소시킴을 설명한다. sFGFR3 처리는 또한 마우스 ATDC5 세포의 증식 및 분화를 복원시켰으며 FGF 단독에 비해 콜라겐 유형 2, 콜라겐 유형 10 및 Sox 9 유전자 발현을 현저하게 증가시켰다(P<0.05, 스튜던츠 t 검정). 대조용 단백질의 존재하에서 번식, 분화 또는 유전자 발현에 대한 효과는 관찰되지 않았다.

FGF-독립적인 기전이 또한 탐구되었다. Stat1은 sFGFR3으로 처리된 Fgfr3 ^ach/+ 연골세포에서 인산화되지 않았다. 더욱이, fgfr3 유전자 발현은 Fgfr3 ^ach/+ 동물로부터 분리된 연골세포에서 sFGFR3 처리에 의해 FGF-만의 대조군으로부터 변하지 않았다. 이들 데이터는 함께, sFGFR3 효과가 단지 FGF-의존적인 경로를 통해서만 매개됨을 암시한다.

Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 용해성 FGFR3은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스의 생존을 증가시키고 골 성장을 유효하게 복원시킨다: 생체내에서 FLAG-sFGFR3 처리 효과를 시험하기 전에, 발명자들은 상기가 성장판의 치밀한 연골성 기질을 침투할 수 있고 표적 연골세포에 도달할 수 있음을 확인하였다. 3일 된 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스 및 그의 야생형(wt) 한배 새끼로부터 분리된 장골을 5 ng의 FLAG-sFGFR3의 존재하에서 24시간 동안 배양하였다. 도 2에서 보이는 바와 같이, 재조합 단백질이 상기 wt 및 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스의 경골 성장판의 연골세포 부근의 기질 내에서 검출되었으며, 이는 상기 단백질이 상기 성장판의 치밀한 연골성 기질을 효율적으로 침투하여 표적 연골세포에 도달함을 나타낸다.

Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 골격골 성장에 대한 FLAG-sFGFR3 처리의 생물학적 영향을 평가하기 위해서, 한 마리의 한배 새끼로부터의 모든 갓난 마우스를 그들의 표현형을 알지 못하면서 동일하게 처리하였다. 이들 마우스에게 3주 동안 1주일에 2회, 0.5 또는 5 ng의 FLAG-sFGFR3, 또는 대조군에서 PBS를 피하 주사하였다. 첫 번째 관찰은 처리되지 않은 한배 새끼에 비해 처리된 경우 사망률의 현저한 감소였다. 상기 처리 기간의 끝에서, 대조군은 트랜스젠닉 동물의 대략 1/3이 살아있었던 반면, 상기 두 처리된 그룹들 모두에서는 대략 50% wt 마우스 및 50% Fgfr3 ^ach ^/+ 가 존재하였다(표 1). 더욱이, 상기 대조용 한배 새끼에서, 상기 실험이 끝나기 전에, 0.5 ng 및 5 ng의 FLAG-sFGFR3 처리된 한배 새끼에서의 각각 11.8% 및 6.7%에 비해, 동물의 31%가 죽었다. 이러한 그룹 크기의 감소는 조기 사망 또는 대마비 동물의 안락사에 기인하였다. 가능한 경우, 부검을 수행하였으며 폐내 혈액의 존재에 의해 나타나는 바와 같이 호흡 부전으로 인한 사망이 확인되었다. 2마리의 동물이 장 폐색의 결과로 죽었다. 이들 동물은 모두 유전형질분석에 의해 확인된 바와 같이, Fgfr3 ^ach ^/+ 이었다. 야생형 동물은 조기에 죽지 않았다. 대조군에서, 병든 Fgfr3 ^ach/+ 마우스의 대부분이 호흡 부전으로부터 죽은 반면, 5 ng FLAG-sFGFR3 처리 그룹에서 이들은 대개 대마비를 앓았으며 단지 몇 마리만이 호흡 곤란이 있었음을 강조하는 것은 주목할만하다(표 1). 이들 데이터는 함께, 처리에 의해 보다 적은 동물이 죽었으며, 죽은 동물은 덜 심한 표현형을 가졌음을 가리킨다.

[표 1]

3일 및 22일째 상이한 처리 그룹들에서 새끼의 수.

한배 새끼는 단일의 존재로서 간주되었으며 동일한 우리로부터의 갓난 마우스는 모두 동일한 처리를 받았다. 죽은 동물 및 산 동물을 매일 카운트하였다. 부검은 2마리의 동물이 호흡 부전 및 장 폐색에 의해 죽었음을 밝혀냈다. 대마비가 있는 동물은 발견시 안락사시켰으며 사망 동물군으로 기록하였다. 모든 죽은 동물은 Fgfr3 ^ach ^/+ 이었다. 대조군에 대한 통계학적 비교를 크루스칼-왈리스 검정을 사용하여 수행하였다. **p<0.01. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.

22일째에, 이유시기에 동물을 죽이고 성장을 평가하였다. 발명자들은 먼저 수컷과 암컷간에 통계학적 차이가 있는지를 확인하고(표 S1) 이들을 모든 후속 분석을 위해 재편성하였다. 도 2a에 예시된 바와 같이, FLAG-sFGFR3 처리는 전체적인 골격 성장에 영향을 미쳤다. Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스는 그의 wt 한배 새끼보다 평균 20% 더 가벼웠지만, FLAG-sFGFR3으로 처리된 동물은 용량 의존적인 체중 증가를 나타내었으며, 이는 처리되지 않은 트랜스제닉 마우스 체중의 33%에 달하였다(도 2b). 용량 의존적인 처리 효과가 또한 wt 동물의 체중에 대해서도 관찰되었다. 도 2c에서 보이는 바와 같이, 처리는 Fgfr3 ^ach ^/+ 및 wt 동물 모두에서 몸통 및 꼬리 길이의 용량 의존적인 증가를 유도하였다. 처리된 트랜스제닉 마우스는 처리되지 않은 wt 대조군의 경우와 그다지 상이하지 않은 신장을 가졌으며, 이는 트랜스제닉과 wt 마우스간의 초기 불일치를 교정하는 고 용량에서 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 동물 키의 10%에 달한다.

유사한 결과가 장골 길이에 대해 획득되었다. 처리된 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스로부터의 상완골, 대퇴골 및 경골은 처리되지 않은 트랜스제닉 마우스의 경우보다 더 길었으며 wt 뼈의 길이와 통계학적으로 동일하였다(도 2d). FLAG-sFGFR3 처리가 또한 wt 마우스로부터의 장골의 성장에 용량 의존적인 영향을 미쳤다. 조직학은 연골세포 성숙화에 대한 치료 효과를 입증하였다. 처리된 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스는 wt 마우스와 유사하게 그의 성장판에서 조직화되고 비대한 연골세포를 나타내었다.

sFGFR3 처리는 또한 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 가슴 우리 발달을 교정하였다. 이들 결과는 함께, Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스 신생아에의 FLAG-sFGFR3의 만성적인 경피 투여에 따라, 정상적인 골 성장의 복원을 보이며, 또한 FGFR3 활성화 돌연변이를 촉발하지 않는 동물의 골격 성장에 또한 유효했음을 보인다. 실제로, sFGFR3으로 처리된 Fgfr3 ^ach/+ 및 WT 마우스는 그들 각 그룹 중의 비히클-처리된 동물에 비해 더 큰 흉골 골화 및 길이를 보였다.

[표 S1 ]

상이한 처리 그룹에서 수컷과 암컷간의 신체 측정의 통계학적 비교. 3주의 처리(PBS, 0.5 ng 또는 5 ng FLAG-sFGFR3)에 이어서, 동물을 22일의 나이에 죽였다. 체중, 몸통 길이 및 꼬리 길이를 측정하였다. 속 및 유전자형을 측정하였다. 각 데이터 세트에서 정규성 변화의 확인에 이어서, 동일한 처리 및 유전자형 그룹내 수컷과 암컷간에 측정치들을 비교하였다. 데이터는 정규 분포에 따랐으며; 스튜던츠 t 검정을 사용하여 데이터를 처리되지 않은 마우스상에서 획득된 측정치와 비교하였다. 임의의 그룹에서 통계 차이는 발견되지 않았다. ns = 유의수준 아님. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.

Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 FLAG - sFGFR3 처리는 연골무형성증과 관련된 척추 및 두개골 기형을 감소시킨다: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서, 특히 척추후만 지수(KI)의 계산에 의해 특성화될 수 있는 척추후만증의 존재에 의해 척추 이상이 인지된다. 로스(Laws) 등(28)에 의해 확립된 상기 득점 시스템에서, KI<4.0을 갖는 마우스는 척추후만증을 나타낸다(보다 상세한 내용에 대해서 도 3의 범례를 참조하시오). 본 연구에서, wt 동물은 척추 기형을 나타내지 않았지만, 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스의 80%가 3.46±0.65의 평균 KI를 갖는 경추후만증을 나타내었다(도 3a). FLAG-sFGFR3 처리에 의해서, 상기 백분율은 상기 0.5 ng 및 5 ng 그룹에서 각각 17% 및 6%로 현저하게 감소하였다.

척추 성숙화를 추가로 특성화하기 위해서, 발명자들은 C7 및 T11의 골화를 분석하였다. 도 3b에서 보이는 바와 같이, 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서, 7번째 경부 및 11번째 흉부는 중선에서 각각 88.9% 및 70.1%로 융합되지 않았다. 처리에 이어서, 미성숙 척추골 수의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 성숙화가 복원되었다. 임의의 그룹에서 wt 동물은 미성숙 척추골을 나타내지 않았다.

전형적으로 확대된 머리를 갖는 연골무형성증 환자와 유사하게, Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스는 두개골 기형을 앓는다. 두개 너비(W)는 트랜스제닉 및 wt 마우스(각각 10.35±0.28 ㎜ 대 10.17±0.32 ㎜)에서 통계학적으로 상이하지 않지만, 길이(L)는 Fgfr3 ^ach/+ 마우스에서 현저하게 더 짧다(18.11±0.75 ㎜ 대 wt 마우스에서 20.05±0.51 ㎜). 이는 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 1.75±0.77 및 대조용 wt 마우스에서 1.94±0.05의 L/W 비를 도출한다(도 4a). FLAG-sFGFR3 처리는 상기 두개 길이의 용량-의존적인 교정을 유도하였으며, 상기 L/W 비는 FLAG-sFGFR3의 최고 용량에서 처리되지 않은 wt의 경우와 그다지 다르지 않았다.

도 4b에서 보이는 바와 같이, 처리는 또한 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스에서 전형적으로 관찰되는 두개 연골결합의 조기 마감을 방지하였다.

이들 결과는 함께, FLAG-sFGFR3 처리가 연골무형성증과 관련된 골격 기형의 발달을 방지하는데 유효함을 보인다.

처리된 동물에서 독성 효과는 검출되지 않는다: 발명자들은 재조합 용해성 FGFR3의 전달에 전신 접근법을 사용하기 때문에, 가능한 불필요한 부작용에 특히 주의하였다. 모두 255마리 동물의 기관을 분석하였으며, 생화학적 및 혈액 계수 시험을 수행하였고, 상기 동물들의 새끼의 정규성을 포함하여 일부 처리된 동물(그룹당 2마리의 한배 새끼)의 번식력을 확인하였다.

잠재적인 처리 부작용을 먼저, 희생시 다수의 기관(간, 폐, 심장, 비장, 신장)상에서 평가하였다. 기관들을 거시적으로 관찰하고, 칭량하고, 조직학에 의해 미시적으로 무작위 분석하였다. FLAG-sFGFR3 또는 PBS의 만성적인 피하 주사를 받은 상기 255마리 동물 중 어느 것도 거시적인 이상을 나타내지 않았다. 조직학을 모든 그룹 중에서 무작위로 선택된 기관에서 수행하였으며 데이터를 병리해부학자에 의해 맹검으로 분석하였다. 임의의 조직 슬라이드상에서 어떠한 독성 징후도 관찰되지 않았다. 모든 대조군들에서, 기관 중량은 마우스 체중과 상관되었다(표 2). 상기 처리된 그룹에서, 기관은 증대된 골 성장에 따라 증가하였다. 일례로서, 처리되지 않은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스의 폐는 156.0±88.7 ㎎이었다. 이는 상기 5 ng 처리 그룹에서 172.5±67.5 ㎎으로 증가하여, 처리되지 않은 wt 마우스의 폐 중량(170.5±36.3 ㎎)에 도달하였다. 유사한 결과들이 모든 기관에 대해서 발견되었으며 이러한 중량 증대는 모든 그룹에서 체중 증가와 통계학적으로 상관되었다(표 2). 기관 기능을 평가하기 위해서, 전해질 적정, 간, 신장 및 비장 효소 분석을 포함한 생화학적 혈액 시험을 수행하였다. 모든 시험은 상기 처리된 그룹 및 대조용 그룹에서 Fgfr3 ^ach ^/+ 와 wt 동물 간에 통계학적으로 동일함을 입증하였다(표 S2). 혈구수를 또한 분석하였으며 유사하게, 혈액 제형들 간에 차이가 처리된 그룹과 대조용 그룹들 간에서 인지되지 않았다(표 S3).

[표 2]

상이한 처리 그룹들에서 기관과 체중 간의 상관 계수(r). 피어슨 또는 스피어맨 검정을 각 처리 그룹에서 기관/체중 상관성의 통계학적 분석에 사용하였다; *p<0.05; **p<0.01;***p<0.001. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach/+ 마우스.

[표 S2 ]

혈액 생화학적 매개변수들은 FLAG - sFGFR3 처리에 의해 변형되지 않았다. 처리 독성을 평가하기 위해서, 희생 시 상기 PBS 및 5 ng FLAG-sFGFR3 그룹으로부터의 혈장을 벡크만 AU 2700 분석기를 사용하여 분석하였다. 전체적인 건강을 전해질(Na⁺, K⁺, Cl^-), 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 및 콜레스테롤의 측정에 의해 평가하였다. 신장 기능을 크레아티닌 및 크레아티닌 키나제(CK) 분석에 의해 평가하였다. 간 및 췌장 기능을 각각 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 총 빌리루빈(BLT) 및 아밀라제에 의해 평가하였다. 통계학적 비교를 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 임의의 그룹에서 통계학적 차이는 발견되지 않았다. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.

[표 S3 ]

혈구수는 FLAG - sFGFR3 처리에 의해 변형되지 않았다. 혈구수에 대한 FLAG-sFGFR3의 영향을, 희생 시 혈장 샘플상에서 평가하였다. 분석은 헤모글로빈(Hb), 헤마토크릿(Ht), 백혈구(WBC), 적혈구(RBC) 및 혈소판(PLT) 수를 포함하였다. 상이한 백혈구 집단의 백분율을 평가하였다(NE: 호중구; LY: 림프구, MO: 단핵구, EO: 호산구; BA: 호염기구). 통계학적 비교를 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 임의의 그룹에서 통계학적 차이는 발견되지 않았다. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스.

생식력에 대한 불필요한 부작용을 평가하기 위해서, 3주 처리 후에, 동물들을 이유시키고 8주령에 챨스 리버로부터의 wt FVB 수컷 또는 암컷과 교미시켰다. 표 3에서 보이는 바와 같이, 모든 처리된 동물은 가임성이었으며 그들의 새끼는 대략 50% wt/50% Fgfr3 ^ach ^/+ 자손을 갖는 정상적인 크기였다. Fgfr3 ^ach ^/+ 암컷은 대개 wt 암컷의 경우에 비해 크기가 약간 감소된 첫 번째 한배 새끼를 갖지만, 흥미롭게도 초산의 처리된 트랜스제닉 암컷은 wt 초산 암컷과 동일한 크기의 한배 새끼를 가짐이 주목되었으며, 이는 처리에 따른 골반의 확대를 입증한다(표 3).

[표 3]

FLAG - sFGFR3 처리는 처리된 마우스의 번식력에 영향을 미치지 않는다. 그룹당 2마리의 한배 새끼로부터의 새끼를 3주 처리 후 이유시켰다. 이들을 8주령일 때 챨스 리버로부터의 wt 동물과 교미시켰다. 첫 번째 한배 새끼의 새끼 수를 각 초산 암컷에 대해서 카운트하였다. 22일의 나이에서 동물들을 안락사시켰다. 이들의 신체 성장을 앞서와 같이 평가하였다. 스튜던츠 t 검정을 사용하여 데이터를 대조용 부모로부터 생성된 처리되지 않은 wt 동물의 측정치와 비교하였다. ***p<0.001 대 처리되지 않은 wt. N/A: 적용가능하지 않음. wt: 야생형 마우스; ach: Fgfr3 ^ach/+ 마우스.

이들 실험은 함께, 상기 처리된 동물의 혈액 제형, 기관 기능 및 발달이나 번식력에 상기 FLAG-sFGFR3 처리 자체로부터의 어떠한 합병증도 현저하지 않았으며, 이는 용해성 형태의 FGFR3의 사용이 임상 용도를 위한 실행가능한 치료 접근법일 수 있음을 암시한다.

논의:

본 연구는 용해성 형태의 FGFR3의 사용을 기본으로 하는 치료학적 전략이 연골무형성증 돌연변이를 갖는 마우스에서 이상 골 성장을 예방할 수 있다는 개념 증명을 확인한다. 치료제를 상기 동물에게 성장기간 전체를 통해 피하주사에 의해 1주일에 2회 투여하였다. 상기 3주의 처리 기간에 이어서, 이어지는 연골내 골 성장은 정상적인 조화로운 신장에 이르게 하였다. 중요하게, 이러한 효과는 용량-의존적이었으며; 0.5 ng FLAG-sFGFR3의 용량이면 처리되지 않은 wt 마우스의 경우와 동일한 체중 및 키를 유도하기에 충분하였고, 5 ng의 용량에서는 처리된 왜소증 마우스가 처리되지 않은 wt 동물보다 훨씬 더 무거웠으며 더 긴 길이의 뼈를 가졌다. 맨 먼저, 본 결과는 연골무형성증 돌연변이가 리간드 결합의 활성화를 요구함을 강조한다. 실제로, 상기 G380R 돌연변이의 경우에, FGFR3 활성화는 리간드-의존성임이 입증되었으나(12), 문헌(29-31)에서는 여전히 명확한 합의가 없으며, 이는 연장된 세포내 신호발생에 이르는 기전이 하나가 아니고 다수임을 암시한다.

상기 치료가 유효하기 위해서는 장골 성장을 복원시키는 것이 필수적이지만, 골격 기형으로 인한 합병증의 개시에 현저한 영향을 미치는 것도 또한 중요하였다. 발명자들에게, 임상 치료의 개발을 원하는 경우 이는 필수불가결하다. 처리된 Fgfr3 ^ach/+ 마우스에서 척추골 성숙화의 복원 및 두개 연골결합의 정상적인 마감은 이들 동물에게 수많은 영향을 미쳤다. 첫 번째 결과는 상기 트랜스제닉 집단들에서 감소된 사망률이었다. 상기 결과 섹션에 서술된 바와 같이, 부검은 상기 사례의 대부분에서 호흡 부전을 밝혀내었다. 왜소증 마우스의 두개골 및 척추골의 해부학적 특징을 근거로, 발명자들은 상기 호흡 부전이 연골무형성증 환자에서 관찰될 수 있는 것과 유사한, 뇌간 압박에 따른 결과인 것으로 여긴다.

치료 효과의 두 번째 성과는 상기 표현형의 침투도의 이동이었다. 측정치들은 마치 치료 효과가 전적으로 용량-의존적인 것은 아니며 보다 중요하게는 체중을 근거로 예상될 수 있는 만큼 유효하지는 않은 것처럼 보일 수 있지만, 발명자들은 최고 용량에서, 치료가 가장 작은 Fgfr3 ^ach ^/+ 마우스를 뇌간 압박 및 호흡 부전으로부터 구한 것으로 여긴다. 처리되지 않은 상기 동물들은 1주 또는 2주 넘게 생존하지 못했을 것이다. 상기 처리 그룹에서, 발명자들은 상기 동물들은 덜 심한 합병증을 갖는다 하더라도 매우 작은 채로 있는 동물들일 것이라 가정한다.

연골무형성증 및 관련된 골격 이형성증에 근원하는 기전을 연구하는 증가하는 수의 보고서들에도 불구하고, 연골이형성증을 갖는 마우스에서 유효하게 시험된 치료학적 접근법들을 나타내는 단지 3개의 연구만이 공개되었다. 시에(Xie) 등은 최근에 간헐적인 PTH 처리가 연골무형성증을 갖는 마우스에서 골 성장을 부분적으로 구제한다는 보고서를 공개하였다(32). 그들의 연구에서, PTH를 출생 후 4주 동안 하루에 100 ㎍/㎏ 체중의 용량으로 피하 투여하였다. PTH가 FGFR3 세포내 신호발생에 영향을 미치는 기전은 명확히 확립되지 않고 있지만, 골 성장은 처리된 트랜스제닉 마우스에서 부분적으로 구제되었으며; PTH 처리된 트랜스제닉 마우스는 여전히 그의 wt 한배 새끼보다 더 작았다. 이 연구에서, 두개 연골결합의 부분적인 구제를 제외하고, 단지 매우 적은 정보만이 연골무형성증 합병증과 관련되어 언급되었다. TDII 마우스의 치사성 표현형이 또한 임신한 암컷의 만성적인 PTH 처리에 의해 구제되었다. FGFR3 신호발생의 또 다른 잠재적인 치료학적 길항물질은 C-나트리유레틱 펩티드(CNP)이다(33). 이 논문에서, 저자는 연골무형성증이 있는 트랜스제닉 마우스를 4주령에 시작하여 3주 동안 합성 CNP의 연속적인 정맥내 주입에 의해 처리하였다. CNP는 성장판의 너비를 증가시켜 성장판 활성을 가속화하는 것으로 여겨진다. 인간에 사용하기에 가장 큰 방해는 CNP의 매우 짧은 반감기로, 혈장에서 2.6분인 것으로 추정된다(34).

12마리의 새끼에 대해 관찰된, TDII 마우스에서 치사성 표현형을 구제하고 성장판의 구조적 비틀림을 부분적으로 복원시키는 신규의 FGFR3-결합 펩티드의 용도를 개시하는 연구가 매우 최근에 공개되었다(19). 이 연구에서, MAPK 신호발생 및 골 성장 교정에 대한 효과는 단지 부분적일 뿐이었으며 추정 상 상기 펩티드의 짧은 반감기로 인해 매일 투여가 필요하였다. 여기에서, sFGFR3의 효과는 매우 큰 크기를 가지며, 정상 신장을 완전히 복원시켰다. 발명자들은 IgG 유사 도메인을 함유하는 용해성 형태의 FGFR3의 반감기가 현저하게 연장되는 것으로 여긴다. 실제로, 86마리의 처리된 Fgfr3ach/+ 마우스에서 골 성장의 완전한 복원에 단지 6회의 주사만이(출생시 내지 이유시까지) 필요하였다. 외래 환자로서 연골무형성증 아동을 치료하는데, 첫 해 동안 시작하여 사춘기까지 단지 수회의 주사만이 필요할 것임을 상상할 수 있다. 이는 전형적으로 매일 주사 섭생의 경우 발견되는 주사 부작용의 발생에 실질적으로 영향을 미칠 것이다. 용해성 재조합 단백질의 사용은 또한 안전성 문제가 제기되는 치료기간 중에 및 골 성장이 멈추는 사춘기에 빠른 종료를 허용한다. 필요한 경우, 치료와 휴식 기간을 번갈아 사용하는 것도 또한 가능하다. 합병증을 예방함으로써, sFGFR3 치료는 수술적 중재의 필요성을 피할 것이며 또한 입원으로 인한 임의의 스트레스를 감소시킬 것이다. 더욱 또한, 우리의 연구는 처리된 동물의 혈액 또는 번식력 및 자손에 대해 어떠한 독성 효과도 나타내지 않았다. 현행 연구들은 3주 sFGFR3 처리가 상기 처리된 마우스의 장기간 건강에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해 진행 중에 있다. 오늘 현재로, 처리된 마우스는 6개월 됐으며 명백한 부작용을 볼 수 없고 혈액 시험도 정상이다.

결론적으로, 본 연구는 연골무형성증에서 성장판 성숙화를 복원시키고 정상적인 골 성장을 유도하기에 유효한 치료제로서, 세포외 구획에서의 표적화 FGFR3의 실행가능성을 설명한다. 불필요한 부작용의 부재는 FGF 수용체의 돌연변이를 활성화시킴으로써 야기되는 상기 연골무형성증 및 관련된 연골이형성증에 유망한 치료법으로서의 그의 용도를 입증한다. 더욱 또한, 본 연구에서, 발명자들은 또한 wt 동물의 성장에 대한 sFGFR3 처리의 긍정적인 효과를 보고한다. 이는 특발성 성장 지연의 치료, 또는 저인산증과 같은 다른 희귀병에서 중증 합병증의 예방에 대한 가능한 관심을 제안하는데 중요하다.

참고문헌

본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 참고문헌이 본 발명의 기술분야를 개시한다. 이러한 참고문헌의 개시내용은 본 명세서에서 본 발명의 참조로서 포함된다.

<110> INSERM(INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III <120> A SOLUBLE FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (FGFR3) POLYPEPTIDE FOR USE IN THE PREVENTION OR TREATMENT OF SKELETAL GROWTH RETARDATION DISORDERS <130> IPA150711-US(후출원) <150> PCT/IB2013/001480 <151> 2013/01/16 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 694 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human soluble FGFR3 polypeptide (sFGFR3) <400> 1 Met Gly Ala Pro Ala Cys Ala Leu Ala Leu Cys Val Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Leu Gly Thr Glu Gln Arg Val Val 20 25 30 Gly Arg Ala Ala Glu Val Pro Gly Pro Glu Pro Gly Gln Gln Glu Gln 35 40 45 Leu Val Phe Gly Ser Gly Asp Ala Val Glu Leu Ser Cys Pro Pro Pro 50 55 60 Gly Gly Gly Pro Met Gly Pro Thr Val Trp Val Lys Asp Gly Thr Gly 65 70 75 80 Leu Val Pro Ser Glu Arg Val Leu Val Gly Pro Gln Arg Leu Gln Val 85 90 95 Leu Asn Ala Ser His Glu Asp Ser Gly Ala Tyr Ser Cys Arg Gln Arg 100 105 110 Leu Thr Gln Arg Val 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ggagcagcgc gtcgtggggc gagcggcaga agtcccgggc 120 ccagagcccg gccagcagga gcagttggtc ttcggcagcg gggatgctgt ggagctgagc 180 tgtcccccgc ccgggggtgg tcccatgggg cccactgtct gggtcaagga tggcacaggg 240 ctggtgccct cggagcgtgt cctggtgggg ccccagcggc tgcaggtgct gaatgcctcc 300 cacgaggact ccggggccta cagctgccgg cagcggctca cgcagcgcgt actgtgccac 360 ttcagtgtgc gggtgacaga cgctccatcc tcgggagatg acgaagacgg ggaggacgag 420 gctgaggaca caggtgtgga cacaggggcc ccttactgga cacggcccga gcggatggac 480 aagaagctgc tggccgtgcc ggccgccaac accgtccgct tccgctgccc agccgctggc 540 aaccccactc cctccatctc ctggctgaag aacggcaggg agttccgcgg cgagcaccgc 600 attggaggca tcaagctgcg gcatcagcag tggagcctgg tcatggaaag cgtggtgccc 660 tcggaccgcg gcaactacac ctgcgtcgtg gagaacaagt ttggcagcat ccggcagacg 720 tacacgctgg acgtgctgga gcgctccccg caccggccca tcctgcaggc ggggctgccg 780 gccaaccaga cggcggtgct gggcagcgac gtggagttcc actgcaaggt gtacagtgac 840 gcacagcccc acatccagtg gctcaagcac gtggaggtga atggcagcaa ggtgggcccg 900 gacggcacac cctacgttac cgtgctcaag gtgtccctgg agtccaacgc gtccatgagc 960 tccaacacac cactggtgcg catcgcaagg ctgtcctcag gggagggccc cacgctggcc 1020 aatgtctccg agctcgagct gcctgccgac cccaaatggg agctgtctcg ggcccggctg 1080 accctgggca agccccttgg ggagggctgc ttcggccagg tggtcatggc ggaggccatc 1140 ggcattgaca aggaccgggc cgccaagcct gtcaccgtag ccgtgaagat gctgaaagac 1200 gatgccactg acaaggacct gtcggacctg gtgtctgaga tggagatgat gaagatgatc 1260 gggaaacaca aaaacatcat caacctgctg ggcgcctgca cgcagggcgg gcccctgtac 1320 gtgctggtgg agtacgcggc caagggtaac ctgcgggagt ttctgcgggc gcggcggccc 1380 ccgggcctgg actactcctt cgacacctgc aagccgcccg aggagcagct caccttcaag 1440 gacctggtgt cctgtgccta ccaggtggcc cggggcatgg agtacttggc ctcccagaag 1500 tgcatccaca gggacctggc tgcccgcaat gtgctggtga ccgaggacaa cgtgatgaag 1560 atcgcagact tcgggctggc ccgggacgtg cacaacctcg actactacaa gaagacaacc 1620 aacggccggc tgcccgtgaa gtggatggcg cctgaggcct tgtttgaccg agtctacact 1680 caccagagtg acgtctggtc ctttggggtc ctgctctggg agatcttcac gctggggggc 1740 tccccgtacc ccggcatccc tgtggaggag 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Claims

골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 분리된 용해성 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(sFGFR3)(soluble Fibroblast Growth Factor Receptor 3) 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물.
제1항에 있어서,
골격 성장 지연 질환이 특발성 성장 지연 질환인 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
골격 성장 지연 질환이 FGFR3-관련된 골격 질병인 폴리펩티드.
제3항에 있어서,
FGFR3-관련된 골격 질병이 치사성이형성증 유형 I, 치사성이형성증 유형 II, 발달 지체 및 흑색가시세포증을 갖는 중증 연골무형성증, 연골저형성증, 연골무형성증, 및 흑색가시세포증을 갖는 무엔케(Muenke) 증후군 및 크루존(Crouzon) 증후군과 같은 FGFR3-관련된 두개유합증으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 폴리펩티드.
제4항에 있어서,
FGFR3-관련된 골격 질병이 연골무형성증인 폴리펩티드.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
FGFR3-관련된 골격 질병이 대상체에서 구성적으로 활성인 FGFR3 수용체 돌연변이체(constitutively active FGFR3 receptor mutant)의 발현에 의해 야기되는 폴리펩티드.
제6항에 있어서,
FGFR3-관련된 골격 질병이 연골무형성증이고 구성적으로 활성인 FGFR3 수용체 돌연변이체가, 380번 위치의 글리신 잔기가 아르기닌으로 치환된 돌연변이체(G380R이라 명명함)인 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
FGFR3 수용체, 또는 그의 변이체 또는 단편의 세포외 영역을 포함하거나 또는 상기 영역으로 이루어지는 폴리펩티드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1에 의해 정의되는 폴리펩티드 서열 또는 서열번호 1에 적어도 80% 일치하는 폴리펩티드 서열을 갖는 그의 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 1에 의해 정의되는 폴리펩티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드.
제10항에 있어서,
폴리펩티드 서열이 서열번호 2에 의해 정의되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드.
분리된 sFGFR3 폴리펩티드 또는 그의 기능적 균등물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
제12항에 있어서,
sFGFR3 폴리펩티드의 기능적 균등물이 sFGFR3 면역접합체인 약학 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
골격 성장 지연 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 치료 유효량의 sFGFR3 폴리펩티드 또는 상기와 같은 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법.
분리된 sFGFR3 면역접합체.
약물로서 사용하기 위한 분리된 sFGFR3 면역접합체.