TW202110880A - 抗結締組織生長因子抗體及其應用 - Google Patents

Abstract

本公開涉及抗結締組織生長因子抗體及其應用。具體地，本公開涉及一種包含輕鏈和重鏈可變區的抗CTGF抗體，以及其作為藥物的用途，尤其在製備用於治療CTGF相關疾病或病症的藥物中的用途。

Description

抗結締組織生長因子抗體及其應用

本申請要求申請號為201910480169.4的中國專利申請(名稱為：抗結締組織生長因子抗體及其應用，優先權日2019年6月4日)的優先權。

本公開屬於生物醫藥領域，具體涉及結合結締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)的抗體及其應用。

這裡的陳述僅提供與本公開有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

CTGF表達由轉化生長因子β(TGFβ)超家族的成員誘導。該超家族包括TGFβ-1、-2、和-3、骨形態發生蛋白(BMP)-2和活化素。許多調節劑包括地塞米松、凝血酶、血管內皮生長因子(VEGF)和血管緊張肽II；以及環境刺激包括高血糖和高血壓也誘導CTGF的表達(參見例如，Franklin(1997)Int J Biochem Cell Biol 29：79-89；Wunderlich(2000)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238：910-915；Denton and Abraham(2001)Curr Opin Rheumatol 13：505-511；和Riewald(2001)Blood 97：3109-3116；Riser等人(2000)J Am SocNephrol 11：25-38；和國際公開WO 00/13706)。

TGFβ對CTGF表達的刺激是快速且長期的，無需持久施加TGFβ(Igarashi et al.(1993)Mol BiolCell 4：637-645)。TGFβ藉由CTGF啟動子中的DNA調控元件進行的轉錄激活，導致的CTGF的增強表達(Grotendorst et al.(1996)Cell Growth Differ 7：469-480；Grotendorst和Bradham，U.S.專利No.6,069，006；Holmes等人(2001)J Biol Chem 276：10594-10601)。

在腎小球性腎炎、IgA腎病、間灶性和節段性腎小球硬化症和糖尿病性腎病中，CTGF的表達被上調(參見例如，Riser et al.(2000)J Am Soc Nephrol 11：25-38)。在慢性腎小管間質(tubulointerstitial)損傷部位也觀察到表達CTGF的細胞數增加，並且CTGF水平與損傷程度相關(Ito等人(1998)Kidney Int 53：853-861)。另外，在與腎實質瘢痕化和硬化相關的各種腎病中，CTGF在腎小球和腎小管間質中的表達也增加。CTGF的升高水平也與肝纖維化、心肌梗死和肺纖維化相關。例如，在患有自發性肺纖維化(IPF)患者中，在生物活檢和支氣管肺泡灌洗液細胞中，CTGF被強烈上調(Ujike等人(2000)Biochem Biophys Res Commun 277：448-454；Abou-Shady等人(2000)Liver 20：296-304；Williams等人(2000)J Hepatol 32：754-761)。因此，在如上所述的疾病中，CTGF代表了有效的治療靶。

然而，目前仍無有效靶向CTGF的抗體藥物應用於臨床，仍需研發新的安全、有效的CTGF抗體藥物。

本公開提供一種抗CTGF抗體。該抗CTGF抗體包括抗人CTGF全長抗體及其抗原結合片段。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

i)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

ii)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

ii-i)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：69所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：70所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

ii-ii)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：85所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：70所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

iii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別 如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

iv)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

iv-i)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

iv-ii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

(v-1)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：6、27、28或29具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：7、22、23、24、25或26具有至少90%的序列同一性：

(vi-1)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：8、33、34、35或36具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：9、30、31或32具有至少90%的序列同一性；或

(vi-i)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：69、81、82、83、84或85具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：70、77、78、79或80具有至少90%的序列同一性。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

(v)該重鏈可變區與SEQ ID NO：6、27、28或29中所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：7、22、23、24、25或26中所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；或

(vi)該重鏈可變區與SEQ ID NO：8、33、34、35或36所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：9、30、31或32所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；或

該重鏈可變區與SEQ ID NO：6中所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：7中所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；

該重鏈可變區與SEQ ID NO：27、28或29中所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：22、23、24、25或26中所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；

該重鏈可變區與SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；

該重鏈可變區與SEQ ID NO：33、34、35或36所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：30、31或32所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

(vi-ii)該重鏈可變區與SEQ ID NO：69、81、82、83、84或85中所示的重鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，和該輕鏈可變區與SEQ ID NO：70、77、78、79或80中所示的輕鏈可變區具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其中該抗CTGF抗體為人源化抗體，該人源化抗體包含人抗體的框架區或其框架區變體，該框架區變體在人抗體的輕鏈框架區和/或重鏈框架區上分別具有至多10個的回復突變；

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下所述的重鏈可變區和輕鏈可變區：

(a)該輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且包含選自4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一個或更多個胺基酸回復突變，和/或該重鏈可變區，其包含序列分別如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且包含選自28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一個或更多個胺基酸回復突變；或

(b)該輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的輕鏈可變區中包含選自36V、44F、46G或49G中的一個或更多個回復突變，和/或該重鏈可變區，其包含序列分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且包含44G、49G、27F、48L、67L、71K、78V或80F中的一個或更多個回復突變。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下所述的重鏈可變區和輕鏈可變區：

(b-i)輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及選自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一個或更多個回復突變，和重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一個或更多個回復突變；或

(b-ii)輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且包含選自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一個或更多個回復突變，和重鏈可變區，其 包含分別如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且包含27F、38K、481、67K、68A、70L或72F中的一個或更多個回復突變。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：

(vii)該重鏈可變區序列如SEQ ID NO：6所示和該輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：7所示；

(viii)該重鏈可變區序列如SEQ ID NO：27、28或29所示和該輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：22、23、24、25或26所示；

(ix)該重鏈可變區序列如SEQ ID NO：8所示和該輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：9所示；或

(x)該重鏈可變區序列如SEQ ID NO：33、34、35或36所示和該輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：30、31或32所示。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：

(xi)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或

(xii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：81、82、83、84或85所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：77、78、79或80所示。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下表a、表b和表c所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：

表a：mab147來源的人源化抗體輕鏈可變區和重鏈可變區組合

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：

(xiii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：27所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示；

(xiv)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示；或

(xv)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示；和所述輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其中所述抗體進一步包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；較佳地，該重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其常規變體；更較佳地，該抗體包含序列如SEQ ID NO：37或38所示的重鏈恆定區和序列如SEQ ID NO：39或40所示的輕鏈恆定區。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含：

(c)與序列如SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48所示的重鏈具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的重鏈和與序列如SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53所示的輕鏈具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的輕鏈；

(d)與序列如SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63所示的重鏈具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%的同一性的重鏈和與序列如SEQ ID NO：55、64、65或66所示的輕鏈具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的輕鏈；

(e)序列如SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53所示的輕鏈；或

(f)序列如SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：55、64、65或66所示的輕鏈。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含：

(g)與SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重鏈，和與SEQ ID NO：87、98、99、100或101具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的輕鏈；或

(h)如SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97所示的重鏈和如SEQ ID NO：87、98、99、100或101所示的輕鏈。

在一些實施方案中，該抗CTGF抗體，其包含：

(j)如SEQ ID NO：46所示的重鏈和如SEQ ID NO：49所示的輕鏈；

(k)如SEQ ID NO：61所示的重鏈和如SEQ ID NO：64所示的輕鏈；或

(l)如SEQ ID NO：97所示的重鏈和如SEQ ID NO：98所示的輕鏈。

本公開另一些方面提供一種抗CTGF抗體，該抗體與如前所述的抗CTGF抗體或其抗原結合片段競爭性結合人CTGF。

本公開另一些方面提供一種核酸分子，其編碼如前所述的抗CTGF抗體。

本公開另一些方面提供一種宿主細胞，其包含如前所述的核酸分子。

本公開另一些方面提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量或預防有效量的如前所述的抗CTGF抗體，或如前所述的核酸分子，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。

在一些具體的實施方案中，該治療有效量或預防有效量為單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗CTGF抗體。

本公開另一些方面提供一種用於免疫檢測或測定CTGF的方法，該方法包括使用如前所述的抗CTGF抗體的步驟。

本公開另一些方面提供一種用於免疫檢測或測定CTGF的方法，該方法包括使如前所述的抗CTGF抗體接觸受試者或其樣品的步驟。

本公開另一些方面提供一種試劑盒，其包含如前所述的抗CTGF抗體。

本公開另一些方面提供一種治療與CTGF相關的疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的抗CTGF抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的醫藥組成物，其中該疾病較佳為纖維性疾病(纖維性疾病較佳自發性肺纖維化、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病骨關節炎、硬皮病、慢性心衰竭、肝硬化或腎纖維化)、高血壓、糖尿病、心肌梗死、關節炎、CTGF相關細胞增殖性疾病、動脈粥樣硬化、青 光眼或癌症(癌症較佳急性淋巴母細胞性白血病、皮膚纖維瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、結締組織生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌、胃腸道癌症或肝癌)。

本公開另一些方面提供如前所述的抗CTGF抗體，或如前所述的核酸分子，或如前所述的醫藥組成物在製備用於治療CTGF相關疾病的藥物中的用途，該CTGF相關疾病包括纖維性疾病(纖維性疾病較佳自發性肺纖維化、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病骨關節炎、硬皮病、慢性心衰竭、肝硬化或腎纖維化)、高血壓、糖尿病、心肌梗死、關節炎、CTGF相關細胞增殖性疾病、動脈粥樣硬化、青光眼或癌症(癌症較佳急性淋巴母細胞性白血病、皮膚纖維瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、結締組織生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌、胃腸道癌症或肝癌)。

本公開另一些方面提供用於治療CTGF相關疾病的如前所述的抗CTGF抗體，或編碼如前所述的抗CTGF抗體的核酸分子，或如前所述的醫藥組成物；該CTGF相關疾病包括纖維性疾病(纖維性疾病較佳自發性肺纖維化、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病骨關節炎、硬皮病、慢性心衰竭、肝硬化或腎纖維化)、高血壓、糖尿病、心肌梗死、關節炎、CTGF相關細胞增殖性疾病、動脈粥樣硬化、青光眼或癌症(癌症較佳急性淋巴母細胞性白血病、皮膚纖維瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、結締組織生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌、胃腸道癌症或肝癌)。

圖1為藉由ELISA檢測，源自mab164的人源化抗體與人CTGF的親和力。

圖2為源自mab147或源自mab164的人源化抗體對SU86.86小鼠移植瘤的抑制實驗結果。

發明詳述

術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

結締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)是一種最初分離自人臍靜脈內皮細胞的36kD富含半胱胺酸的肝素結合分泌糖蛋白(參見例如，Bradham et al.(1991)J Cell Biol114：1285-1294；Grotendorst and Bradham，美國專利No.5,408,040)。CTGF屬於蛋白質CCN(CTGF，Cyr61，Nov)家族(分泌糖蛋白)，該家族包括血清誘導的立即早期基因產物Cyr61、推斷的癌基因Nov、ECM相關蛋白FISP-12、src誘導的基因CEF-10、Wnt誘導的分泌蛋白WISP-3以及抗增殖蛋白HICP/rCOP(Brigstock(1999)Endocr Rev 20：189-206；O'Brian et al.(1990)Mol Cell Biol 10：3569-3577；Joliot et al.(1992)Mol Cell Biol 12：10-21；Ryseck et al.(1990)Cell Growth andDiff 2：225-233；Simmons et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：1178-1182；Pennica et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，95：14717-14722；和Zhang et al.(1998)Mol Cell Biol 18：6131-6141)。CCN蛋白的特徵在於保守的38個半胱胺酸殘基，該38個半胱胺酸殘基占總胺基酸含量10%以上並且形成具有N-末端和C-末端結構域的模塊結構(modular structure)。CTGF模塊結構包括在N-末端結構域的針對胰島素樣生長因子結合蛋白(IGF-BP)和von Willebrand因子(VWC)的保守基序，以及在C-末端結構域的血小板反應蛋白(TSP1)和半胱胺酸結基序。

本公開所述的“抗體”指免疫球蛋白，全長抗體是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig如其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到接基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3， FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體和人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本公開中為如本領域知識和技能製備的針對人CTGF的單株抗體。製備時用CTGF抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個較佳的實施方案中，該鼠源抗CTGF抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再如需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個較佳的實施方案中，該嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該CTGF嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變，和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序 列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持或增強活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由酵母菌展示對CDR進行親和力成熟突變後的人源化抗體。

由於抗原的接觸殘基，CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以可能是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查動物單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞類共有序列或具有高相似性百分數的動物抗體序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。

在本公開一個的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段，可進一步包含人源或鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區；可以包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(例如L234A和/或L235A突變、和/或S228P突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

本公開中所述人抗體重鏈恆定區和人抗體輕鏈恆定區的“常規變體”是指現有技術已公開的來源於人的不改變抗體可變區結構和功能 的重鏈恆定區或輕鏈恆定區的變體，示例性變體包括對重鏈恆定區進行定點改造和胺基酸替換的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區變體，具體替換如現有技術已知的YTE突變，L234A和/或L235A突變，S228P突變，和/或獲得knob-into-hole結構的突變(使得抗體重鏈具有knob-Fc和hole-Fc組合)，這些突變已被證實使得抗體具有新的性能，但不改變抗體可變區的功能。

“人抗體”(HuMAb)、“人源抗體”、“全人抗體”、“完全人抗體”可以互換使用，可以是源於人的抗體或者是從一種轉基因生物體中獲得的抗體，該轉基因生物體經“改造”以響應於抗原刺激而產生特異性人抗體並且可以藉由本領域已知的任何方法產生。在某些技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元素元件引入到源於胚胎幹細胞系的生物體的細胞株中，這些細胞系中的內源性重鏈和輕鏈基因座被靶向破壞這些細胞系中包含靶向的內源性重鏈和輕鏈基因座破壞。轉基因生物可以合成對人抗原特異的人抗體，並且該生物可以用於產生人抗體-分泌融合瘤。人抗體還可以是一種抗體，其中重鏈和輕鏈是由源於一個或更多個人DNA來源的核苷酸序列編碼的。完全人抗體還可以藉由基因或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術來構建，或者由體外活化的B細胞構建，所有的這些都是本領域已知的。

術語“全長抗體”、“完整抗體”、“完全抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與下文定義的抗原結合片段相區分。該術語特別指輕鏈和重鏈包含恆定區的抗體。

本公開的“抗體”包含“全長抗體”及其“抗原結合片段”。

在一些實施方案中，本公開的全長抗體包括由以下表1、表2和表3中輕重鏈可變區組合中的輕鏈可變區與輕鏈恆定區連接和重鏈可變區與重鏈恆定區連接後所形成的全長抗體。本領域技術人員可以如實際需 要選擇不同的抗體來源的輕鏈恆定區、重鏈恆定區，例如人抗體來源的輕鏈恆定區和重鏈恆定區。同時，表1、表2和表3中不同輕鏈可變區和重鏈可變區組合可以形成單鏈抗體(scFv)、Fab或其他包含scFv或Fab的抗原結合片段形式。

術語“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，CTGF)的能力的一個或更多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的穩定的抗原結合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也包括在術語抗體 的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

F(ab')₂是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

Fab'是藉由切割上述F(ab')₂的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50，000並具有抗原結合活性的抗體片段。本公開的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本公開的特異性識別CTGF並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')₂來生產。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產所述Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

雙抗體是其中scFv或Fab被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。

雙特異性抗體和多特異性抗體是指能同時結合兩個或多個抗原或抗原決定簇的抗體，其中包含能結合CTGF的scFv或Fab片段。

本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人CTGF並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將所述DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將所述表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。

dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering，7，697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。

本公開的全長抗體或抗原結合片段可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人CTGF並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的抗體的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入 到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。

術語“胺基酸差異”或“胺基酸突變”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上發生1個、2個、3個或更多個胺基酸的插入、缺失或替換。

術語“抗體框架”或“FR區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“互補決定區”、“CDR”或“高變區”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50- 52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。除非另有說明，本公開實施例涉及的抗體可變區和CDR序列均適用“Kabat”編號規則。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，CTGF分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-8M，例如大約小於10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更小的親和力(KD)結合。

術語“KD”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本公開的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M或10^-9M的解離平衡常數(KD)結合CTGF，例如，在本公開中抗體與細胞表面抗原的親和力採用FACS法測定KD值。

當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭， 其藉由以下測定法來測定：在所述測定法中，待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如CTGF抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用結合荷有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白任一種的固態表面或細胞的純化的抗原。藉由測量在所測抗原結合蛋白存在下結合固態表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。通常所測抗原結合蛋白過量存在。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白；和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結 合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。

本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，較佳是雙鏈DNA或單鏈mRNA或修飾的mRNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。

胺基酸序列“同一性”指在比對胺基酸序列及必要時引入間隙，以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基同一的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的，比對可以藉由屬於本領域技術的範圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“表達載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人CTGF或 其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。公開所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或更多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)、293細胞和NS0細胞。

本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人CTGF特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常 規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“施用”、“給予”和“處理”，當其應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理，”當其應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可如多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是如本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra 檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代於下方陳述。

“有效量”或“有效劑量”指指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本公開靶抗原相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本公開靶抗原相關病症的進展。

“外源性”指如情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指如情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。通常，當比對兩個序列時進行比較以給出最大百分比同源性。例如，可以藉由BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。以下參考文獻涉及經常用於序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常規BLAST算法也為本領域技術人員所熟知。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“分離的”指純化狀態，並且在這種情況下意味著在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他材料，例如細胞碎片和生長培養基。通常，術語“分離的”並不意圖指完 全不存在這些材料或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以顯著干擾如本文所述的化合物的實驗或治療用途的量存在。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥學上可接受的載體”指適合用於製劑中用於遞送抗體或抗原結合片段的任何無活性物質。載體可以是抗黏附劑、黏合劑、包衣、崩解劑、充填劑或稀釋劑、防腐劑(如抗氧化劑、抗菌劑或抗真菌劑)、增甜劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適的藥學上可接受的載體的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝的鹽水和等滲劑例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化鈉。

此外，本公開包括用於治療與目標抗原(例如CTGF)陽性細胞相關的疾病的藥劑，該藥劑包含本公開的抗CTGF抗體或其抗原結合片段作為活性成分。活性成分以治療有效量施與受試者，可以治療受試者CTGF陽性細胞相關疾病。該治療有效量為單位劑量的組成物中含有0.1-3000mg的如前所述的特異性結合人GCGR的全長抗體或其抗原結合片段。

本公開中與CTGF相關的疾病沒有限制，只要它是與CTGF相關的疾病即可，例如利用本公開的分子誘導的治療反應可藉由結合人類CTGF，然後阻遏CTGF與其受體/配體的結合，或殺傷過表達CTGF的腫 瘤細胞。因此，當處於適於治療應用的製備物和製劑中時，本公開的分子對這樣一些人是非常有用的，他們患有腫瘤或癌症，可選地包括肺纖維化、腎纖維化、腫瘤形成和生長、青光眼、細胞增殖性疾病、白內障、脈絡膜新血管形成、視網膜剝脫、增生性玻璃體視網膜病變、黃斑變性、糖尿病性視網膜病、角膜瘢痕形成和角膜渾濁、囊腫、減少血管鈣化、胰腺導管腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、放射性纖維化(radiation-induced fibrosis(RIF))、特發性肺纖維化、肺重塑疾病選自集團構成的哮喘、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纖維化、肺氣腫等，較佳胰腺癌、肺纖維化、腎纖維化。

此外，本公開涉及用於免疫檢測或測定目標抗原(例如CTGF)的方法、用於免疫檢測或測定目標抗原(例如CTGF)的試劑、用於免疫檢測或測定表達目標抗原(例如CTGF)的細胞的方法和用於診斷與目標抗原(例如CTGF)陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別目標抗原(例如人CTGF)並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的抗體或抗體片段作為活性成分。

在本公開中，用於檢測或測定目標抗原(例如CTGF)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。

免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。

上述與CTGF陽性細胞相關的疾病可以藉由用本公開的抗體或抗體片段檢測或測定表達CTGF的細胞來診斷。

為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。

在本公開中，對用於檢測或測定目標抗原(例如CTGF)的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達目標抗原(例如CTGF)的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。

根據所需的診斷方法，含有本公開的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與所述標記對應的受質等。

在以上說明書中提出了本公開一種或多種實施方式的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本公開，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本公開的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本公開所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本公開的較佳實施方式。這些實施例不應以任何方式理解為限制本公開的範圍，本公開的範圍由申請專利範圍限定。

實施例

實施例1. CTGF抗原、抗體的製備

一、抗原的設計及表達

以人CTGF蛋白(Genbank編號：NM_001901.2)作為模板，設計抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在CTGF蛋白或者片段上融合不同的標簽，分別選殖到pTT5載體上或pXC載體上，在293細胞瞬轉表達或LONZA CHO細胞穩定表達，獲得編碼本公開抗原及檢測用蛋白。以下CTGF抗原未特殊說明的均指人CTGF。

人CTGF全長蛋白(用於免疫)，SEQ ID NO：1)

CTGF-his(人CTGF成熟蛋白與his標簽的融合蛋白)，可用於檢測，SEQ ID NO：2

(備註：單下劃線為信號肽，斜體為人CTGF編碼區，雙下劃線為his標簽。)

mCTGF-mFc(小鼠CTGF編碼區與小鼠Fc標簽的融合蛋白，可用於檢測)SEQ ID NO：3

(備註：單下劃線為信號肽，斜體為小鼠CTGF編碼區，雙下劃線為mFc標簽。)

小鼠CTGF蛋白-His標簽，SEQ ID NO：4

(備註：單下劃線為信號肽，斜體為小鼠CTGF編碼區，雙下劃線為his標簽。)

食蟹猴CTGF-Fc(食蟹猴CTGF編碼區與Fc的融合蛋白，可用於檢測)，SEQ ID NO：5

(備註：單下劃線為信號肽，斜體食蟹猴CTGF編碼區，雙下劃線為Fc標簽。)

二、CTGF相關重組蛋白的純化，以及抗人CTGF融合瘤抗體、重組抗體的純化

1. ProteinG親和層析分離純化融合瘤上清

對於小鼠融合瘤上清純化，首選ProteinG進行親和層析，將培養所得融合瘤離心取上清，根據上清體積加入10-15%體積的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)調節上清pH至中性。利用6M鹽酸胍，將ProteinG管柱洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積；利用如1×PBS(pH7.4)對層析管柱平衡3-5倍管柱體積；細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間；利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線；利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節沖提產物的pH至5-6。可以利用本領域技術人員熟知的方法，對沖提產物進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣品純度。

2. Protein A親和層析純化抗體

首先將表達抗體的細胞培養上清進行高速離心收取上清。利用6M鹽酸胍將ProteinA親和管柱洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積。利用如1×PBS(pH7.4)對層析管柱平衡3-5倍管柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸 收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0-3.5)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節沖提產物的pH至5-6。可以利用本領域技術人員熟知的方法，對沖提產物進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣品純度。

3. 鎳管柱純化人CTGF-his等CTGF相關重組蛋白

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品上管柱結合，介質可以選擇不同公司的鎳管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。

收集的沖提產物濃縮後可用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS，去除聚體及雜蛋白峰，收集目的產物沖提峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑒定為正確後分裝備用。

4. Protein A親和層析純化人CTGF-Fc，食蟹猴CTGF-Fc等CTGF相關重組蛋白

首先將培養上清進行高速離心收取上清。利用6M鹽酸胍將ProteinA親和管柱洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積。利用如1×PBS(pH7.4)對層析管柱平衡3-5倍管柱體積。細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後利用 1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0-3.5)緩衝液進行樣品沖提，如紫外檢測收集沖提峰。

收集的沖提產物濃縮後可用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS，去除聚體及雜蛋白峰，收集目的產物沖提峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑒定為正確後分裝備用。

實施例2. 抗人CTGF單株抗體的製備

一、免疫

抗人CTGF單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6-8週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為CTGF(R&D)和mCTGF-mFc。

免疫方案：用CTGF蛋白進行小鼠免疫，25微克/隻/次，腹腔內注射。第0天腹膜內(IP)注射100μl/隻，之後每14天進行一次加強免疫。於第21、35、49、63天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在7-9次免疫以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射25μg/只的生理鹽水配製的CTGF蛋白抗原溶液。

二、脾細胞融合

採用PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×10⁶/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI 的IMDM培養基)重新懸浮，100μl/孔接種於96孔板中，37℃，5%CO₂孵育3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成針尖般純株。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的IMDM培養基)，37℃，5%CO₂培養3天後進行ELISA檢測。

三、融合瘤細胞的篩選

如融合瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清與猴CTGF/小鼠CTGF/人CTGF蛋白結合實驗(具體方法實施例3相同)。對蛋白ELISA結合實驗為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種及2到3次亞選殖直至獲得單細胞純株。

每次亞選殖細胞也均需進行CTGF結合ELISA。藉由以上實驗篩選得到融合瘤純株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

四、融合瘤陽性純株序列測定

從陽性融合瘤中選殖序列的過程如下。收集對數生長期的融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後，將擴增產物送測序公司測序。經測序得到鼠源抗CTGF抗體：mab147、mab164、mab95的可變區胺基酸序列如下：

mab147 VH胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，

mab147 VL胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，

mab164 VH胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，

mab164 VL胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，

mab95 VH胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示，

mab95 VL胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示，

上述mab147、mab164、mab95抗體可變區序列中，斜體為FR序列，下劃線斜體為CDR序列，序列順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

五、人IgG1嵌合抗體製備

mab147、mab164、mab95候選分子經過擴增測序可得到可變區編碼基因序列，以測序所得序列設計首尾引子，以測序基因為模板，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG1/hkappa/hlambda恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組，構建重組嵌合抗體的全長表達質粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr，形成Ch147、Ch164、Ch95三個嵌合抗體。

六、鼠源抗人CTGF抗體的人源化

藉由比對IMGT(http：//imgt.cines.fr)人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE(Molecular Operating Environment，分子操作環境)軟體，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。

1. mab147的人源化改造

鼠源抗體mab147的人源化輕鏈模板為IGKV3-11*01和IGKJ2*01或IGKV1-39*01和IGKJ2*01，人源化重鏈模板為IGHV3-72*01和IGHJ1*01，將鼠源抗體mab147的CDR分別移植到其人源模板中，進而，對人源化抗體的FR部分胺基酸進行回復突變改造，其中輕鏈可變區回復突變包括4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一個或更多個，重鏈可變區回復突變包括28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一個或更多個(輕鏈可變區和重鏈可變區中的回復突變位點的位置如Kabat編號規則確定)，得到具有不同序列的輕鏈可變區和重鏈可變區。即獲得含有mab147的CDR的人源化抗體，其可變區序列如下：

mAb147人源化抗體可變區具體序列如下：

Hu147-VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示：

Hu147-VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示：

Hu147-VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示：

Hu147-VL4胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示：

Hu147-VL5胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示：

Hu147-VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：27所示：

Hu147-VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示：

Hu147-VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示：

註：下劃線為以Kabat規則定義的CDR序列，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

2. mab164的人源化改造

鼠源抗體mab164的人源化輕鏈模板分別由IGLV7-43*01和IGLJ2*01、IGLV8-61*01和IGLJ2*01，或IGLV1-40*02和IGLJ2*01構成，人源化重鏈模板分別由IGHV2-26*01和IGHJ6*01，或IGHV4-31*02和IGHJ6*01構成，將鼠源抗體mab164的CDR分別移植到其人源模板中，進而，對人源化抗體的FR部分胺基酸進行回復突變改造，其中輕鏈可變區回復突變包括36V、44F、46G或49G中的一個或更多個，重鏈可變區回復突變包括44G、49G、27F、48L、67L、71K、78V或80F中的一個或更多個(其中的回復突變位點的位置如Kabat編號規則確定)，即獲得mab164的人源化抗體重鏈，人源化抗體輕鏈，其可變區序列如下：

mAb164人源化抗體可變區具體序列如下：

Hu164-VL7胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示：

Hu164-VL8胺基酸序列如SEQ ID NO：31所示：

Hu164-VL9胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示：

Hu164-VH5胺基酸序列如SEQ ID NO：33所示：

Hu164-VH6胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示：

Hu164-VH7胺基酸序列如SEQ ID NO：35所示：

Hu164-VH8胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示：

註：上述Hu164抗體序列中，下劃線為CDR序列，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中的CDR序列如Kabat規則進行定義。

3. mab95的人源化改造

鼠源抗體mab95的人源化輕鏈模板為IGKV3-20*02和IGKV1-40*01，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01，將鼠源抗體mab95的CDR分別移植到其人源模板中，進而，對人源化抗體的FR部分胺基酸進行回復突變改造，其中輕鏈可變區回復突變包括45P、46W、48Y、69S或70Y中的一個或更多個，重鏈可變區回復突變包括27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一個或更多個(輕鏈可變區和重鏈可變區中的回復突變位點的位置如Kabat編號規則確定)，得到具有不同序列的輕鏈可變區和重鏈可變區。即獲得含有mab95的CDR的人源化抗體，其可變區序列如下：

mAb95人源化抗體可變區具體序列如下：

Hu95-VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示：

Hu95-VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示：

Hu95-VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示：

Hu95-VL4胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示：

Hu95-VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：81所示：

Hu95-VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：82所示：

Hu95-VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示：

Hu95-VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示：

Hu95-VH5胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示：

註：下劃線為以Kabat規則定義的CDR序列，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

其中，Hu95-VH5的CDR區進行了進一步的修飾，其HCDR1如SEQ ID NO：102(NYAIH)所示，HCDR2如SEQ ID NO：103(LVYPYTGGTAYNQKFKD)所示，HCDR3如SEQ ID NO：104(WGMIPGTNSYFDV)所示。

4. 抗CTGF人源化全長抗體的構建和表達

設計引子PCR搭建各人源化抗體VH/VL基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH-pHr/VL-CL-pHr。該人源化抗體的恆定區可選自人κ、λ鏈輕鏈恆定區，以及選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，非限制性實施包括對人IgG1、IgG2、IgG4的恆定區進行優化設計，改善抗體功能，如恆定區的M252Y/S254T/T256E(”YTE”)位點突變可以延長抗體的半衰期，S228P、F234A和L235A等其他恆定區位點突變等。

示例性的抗CTGF人源化抗體恆定區序列如下：

重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示(所形成的全長抗體重鏈的名稱後綴為w)：

YTE改造抗體的重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示(所形成全長抗體重鏈的名稱後綴為y)：

抗CTGF人源化抗體的輕鏈kappa恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：39所示(所形成全長抗體重鏈的名稱後綴為k)：

抗CTGF人源化抗體輕鏈lambda恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示(所形成全長抗體重鏈的名稱後綴為1)：

人源化抗體的重鏈可變區與SEQ ID NO：37所示的重鏈恆定區連接，以及人源化抗體的輕鏈可變區與SEQ ID NO：39所示的輕鏈kappa恆定區連接形成的來源自mab147的全長人源化抗體包括：

人源化抗體重鏈的可變區與SEQ ID NO：38所示的重鏈恆定區YTE變體連接，以及人源化抗體的輕鏈可變區與SEQ ID NO：39所示的輕鏈kappa恆定區連接形成的來源自mab147的全長人源化抗體包括：

人源化抗體重鏈可變區與SEQ ID NO：37所示的重鏈恆定區連接，以及人源化抗體輕鏈可變區與SEQ ID NO：40所示的輕鏈lambda恆定區連接形成的來源自mab164的全長人源化抗體包括：

人源化抗體重鏈可變區與SEQ ID NO：38所示的重鏈恆定區YTE變體連接，以及人源化抗體輕鏈可變區與SEQ ID NO：40所示的輕鏈lambda恆定區連接形成的來源自mab164的全長人源化抗體包括：

人源化抗體重鏈可變區與SEQ ID NO：37所示的重鏈恆定區連接，以及人源化抗體輕鏈可變區與SEQ ID NO：39所示的輕鏈kappa恆定區連接形成的來源自mab95的全長人源化抗體包括：

人源化抗體重鏈可變區與SEQ ID NO：38所示的重鏈恆定區YTE變體連接，以及人源化抗體輕鏈可變區與SEQ ID NO：39所示的輕鏈kappa恆定區連接形成的來源自mab95的全長人源化抗體包括：

示例性的抗CTGF抗體全長胺基酸序列如下：

作為陽性對照的CTGF抗體mAb1(來源自CN1829740B，抗體名稱為pamrevlumab，又名為FG-3019)的序列如下：

重鏈：(SEQ ID NO：67)

輕鏈：(SEQIDNO：68)

實施例3. CTGF抗體的結合活性檢測

一、CTGF抗體結合人CTGF蛋白的ELISA實驗

抗人CTGF抗體的結合力藉由抗體與人CTGF蛋白的ELISA實驗和Biacore來檢測。用CTGF重組蛋白直接包被在96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和CTGF的結合活性。具體實驗方法如下：

用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)緩衝液將CTGF蛋白(R&D，Cat No.9190-CC)稀釋至0.2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置2小時或4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD skim milk,Cat No.232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束 後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(含0.1% Tween-20的PBS，pH7.4)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板3次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算CTGF抗體對人CTGF蛋白的結合EC50值。實驗結果見圖1及表12所示。

實驗結果顯示，本公開的人源化全長抗CTGF抗體均與人CTGF蛋白有很好的結合作用。

二、CTGF抗體結合食蟹猴CTGF蛋白的ELISA實驗

抗猴CTGF抗體的結合力藉由抗體與猴CTGF蛋白的ELISA實驗來檢測。用抗-mFc蛋白直接包被在96孔酶標板中，後續用帶有Fc標簽的cyno-CTGF蛋白與板子結合，然後加入抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和cyno-CTGF的結合活性。具體實驗方法如下：

用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)緩衝液將抗-mFc蛋白(Sigma,Cat No.M4280)稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD skim milk,Cat No.232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(含0.1% Tween-20的PBS，pH7.4)洗板3次後，每孔加入50μl的1μg/ml的cyno-CTGF-mFc蛋白，37℃孵育箱孵育1小時後，用PBST緩衝液(含0.1% Tween-20的PBS，pH7.4)洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算CTGF抗體對食蟹猴CTGF蛋白的結合EC50值。實驗結果見表13所示。

三、CTGF抗體與小鼠CTGF蛋白的ELISA實驗

抗小鼠CTGF抗體的結合力藉由抗體與小鼠CTGF蛋白的ELISA實驗來檢測。用小鼠-CTGF融合蛋白直接包被在96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和小鼠-CTGF的結合活性。具體實驗方法如下：

用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)緩衝液將小鼠CTGF-his蛋白稀釋至0.5μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD skim milk,Cat No.232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(pH7.4 PBS含0.1% tween-20)洗板3次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算CTGF抗體對小鼠CTGF蛋白的結合EC50值。實驗結果見表14所示。

實施例4. CTGF抗體的功能阻斷實驗

該試驗用Biacore儀器檢測待測人源化抗CTGF抗體對人TGF-β1功能的阻斷活性。

首先將抗原人CTGF以胺基偶聯的方式固定到CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1005-30,GE)上，固化水平1500 RU，然後於芯片表面流經高濃度的CTGF抗體(150μg/ml)150s，再進樣50nM TGF-β1蛋 白120s，用Biacore T200儀器實時檢測反應信號獲得結合和解離曲線。在每個試驗循環解離完成後，用再生緩衝液將生物傳感芯片洗淨再生。

試驗得到的數據用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0軟體進行統計分析。

阻斷效率(Blocking efficiency)=[1-(樣品響應值/空白對照響應值)]×100%。具體結果見表15所示。

試驗結果表明，本公開的人源化抗CTGF抗體均具有高功能阻斷活性。

抗CTGF抗體親和力的Biacore測定

該試驗用Biacore儀器測定待測人源化抗CTGF抗體與人CTGF、小鼠CTGF的親和力。

分別用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556,GE)親和捕獲一定量的待測抗體，然後於芯片表面流經一定濃度的人、鼠CTGF 抗原，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，pH1.5的甘胺酸-鹽酸再生溶液(Cat.# BR-1003-54,GE)將生物芯片洗淨再生。試驗運行緩衝液為1×HBS-EP緩衝溶液(Cat.# BR-1001-88，GE)。

試驗得到的數據用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0軟體以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出親和力數值，具體見表16、17所示。

試驗結果表明，來源自鼠源抗體mAb147和mAb164的嵌合抗體Ch147和Ch164及人源化抗CTGF抗體均能與人CTGF和小鼠CTGF以高親和力結合，多種人來源抗體種系FR區的替換和回復突變改造均不影響人源化抗體的親和力，部分改造甚至會增強抗體與抗原的親和力。

實施例5. CTGF抗體對TGFβ誘導的C2C12細胞體外遷移抑制實驗

C2C12細胞(小鼠成肌細胞，中科院細胞庫，#GNM26)用0.25%胰酶(Gibco，#25200-072)消化，離心後用無血清的DMEM培養基(Gibco，#10564-029)重新懸浮。用無血清的DMEM培養基配製細胞-抗體混合物及TGFβ1-抗體混合物，細胞密度為2×10⁵/ml，重組人TGFβ1(Cell signaling Technology，#8915LC)濃度為10ng/ml，待測抗體濃度均為30μg/ml。

打開ChemoTx® Disposable Chemotaxis System(Neuro Probe，#106-8)的上蓋及過濾膜，將TGFβ-抗體混合物加入下室中，每孔30μl，每組4副孔。蓋上過濾膜，在膜上加細胞-抗體混合物，每孔加入50μl，每組4副孔。蓋上上蓋，置於培養箱(37℃，5% CO₂)中。

孵育48小時後，用乾淨紙巾吸去過濾膜上液體，打開過濾膜，向下室中每孔加入10μl預冷的0.25%胰酶，蓋上過濾膜。消化5分鐘後，1000rpm離心1分鐘。打開過濾膜，向下室中每孔加入20μl Cell Titer-Glo溶液(Promega，#G7573)，室溫孵育10分鐘。將液體轉移至384孔白底板(Thermo Scientific，#267462)中，用酶標儀(BMG，#PheraStar)採用化學發光法讀板。用Graphpad Prism 6對數據進行分析處理。

抑制率=[(TGFβ平均值-樣品組平均值)/(TGFβ組平均值-未處理組平均值)]×100%

實驗結果見表18。

結果表明，本公開的人源化抗CTGF抗體可抑制TGFβ1誘導後C2C12細胞在體外的遷移能力，對C2C12細胞遷移能力的抑制均比陽性對照抗體mAb1強。

實施例6. CTGF抗體對TGFβ誘導PANC1細胞體外遷移抑制實驗

PANC-1細胞(人胰腺癌細胞，ATCC，#CRL-1469)用0.25%胰酶(Gibco，#25200-072)消化，離心後用含0.1%胎牛血清(Gibco，# 10099-141)的DMEM培養基(Gibco，#10564-029)重新懸浮。用含0.1%胎牛血清的DMEM培養基配製細胞-抗體混合物及TGFβ-抗體混合物，細胞密度為4x10⁵/ml，重組人TGFβ(Cell signaling Technology，#8915LC)濃度為10ng/ml，待測抗體濃度均為30μg/ml。

打開ChemoTx® Disposable Chemotaxis System(Neuro Probe，#106-8)的上蓋及過濾膜，將TGFβ-抗體混合物加入下室中，每孔30μl，每組4副孔。蓋上過濾膜，在膜上加細胞-抗體混合物，每孔加入50μl，每組4副孔。蓋上上蓋，置於培養箱(37℃，5% CO₂)中。

孵育48小時後，用乾淨紙巾吸去過濾膜上液體，打開過濾膜，向下室中每孔加入10μl預冷的0.25%胰酶，蓋上過濾膜。消化5分鐘後，1000rpm離心1分鐘。在倒置顯微鏡(Leica，#DMIL LED)下計數沉於板底的細胞。用Graphpad Prism 6對數據進行分析處理。

抑制率=[(TGFβ平均值-樣品組平均值)/(TGFβ組平均值-未處理組平均值)]×100%

實驗結果見表19。

結果表明，本公開的人源化抗CTGF抗體均可抑制TGFβ1誘導後PANC1細胞在體外的遷移能力。

實施例7. CTGF抗體抑制PANC1軟瓊脂體外增殖實驗

在瓊脂(BD，#214220)中加入去離子水，加熱配製成1.4%的凝膠溶液。將2×DMEM培養基(Thermo，#12100046)與凝膠溶液按照1：1的體積比混合，在24孔板(Costar，#3524)中每孔加入500μl，4度放置使其凝固。

PANC-1細胞(人胰腺癌細胞，ATCC，#CRL-1469)用0.25%胰酶(Gibco，#25200-072)消化，離心後用含4%胎牛血清(Gibco，# 10099-141)的DMEM培養基(GE，#SH30243.01)調整細胞密度至5×10⁴個/ml。用2×DMEM培養基配製抗體至2mg/ml。將細胞、抗體及1.4%的凝膠溶液按照2：1：1的體積比混合，在鋪了下層膠的24孔板中每孔加入200μl。待上層膠凝固後，在24孔板中再加入200μl含2%胎牛血清的DMEM培養基。在 培養箱中(37℃，5% CO2)培養28天後，用高內涵分析系統(Molecular Devices，ImageXpress)拍照，並分析形成的細胞純株面積。

抑制率=(1-樣品組平均值/未處理組平均值)×100%。實驗結果見表20。

結果表明，來自mAb147和mAb164純株的人源化抗體對人胰腺癌細胞(PANC-1細胞)的體外增殖具有顯著的抑制作用。

實施例8. CTGF抗體的動物體內生物學活性

一、CTGF抗體對博萊黴素誘導的小鼠肺纖維化抑制試驗

實驗方法：將40隻小鼠按照體重隨機分成以下4組：正常對照組(PBS，ip，qod)、mAb1組(10mg/kg，ip，qod)、Hu164-67wl(10mg/kg，ip，qod)組、Hu164-67yl(10mg/kg，ip，qod)組。每組10隻，具體分組見下表21。實驗第1天按照體重腹腔注射相應溶劑和抗體(10ml/kg，正常對照和模型組給予PBS)，2小時後進行博萊黴素霧化(50mg/8ml霧化30min並停留5min)造模。然後按照上述組別每隔日一次腹腔注射溶劑或抗體，實驗週期21天，累計腹腔給藥共11次。實驗第22天，小鼠腹腔內注射1%戊 巴比妥鈉(10ml/kg)麻醉後，將小鼠仰臥固定在操作臺上，沿頸部正中線切開1cm皮膚，切口下緣至胸腔入口處，用止血鉗鈍性分離皮下結締組織和肌肉，暴露氣管，分離氣管兩側及氣管與食管間結締組織，游離氣管，插入靜脈留置針，使用手術縫線在套管進入氣管處結紮固定。以1ml注射器抽吸0.8ml PBS，接在靜脈套管針進液端，將PBS緩緩注入氣管，停留30s後將PBS緩緩回抽，可見回抽出帶乳白色泡沫狀液體，重複灌洗三次，將灌洗液轉移至EP管中，再吸取0.5ml PBS，重複以上步驟。將兩次灌洗液混合後1500rpm離心5min，保存上清液-20℃待測，BALF上清再次10000rpm離心10min後取上清檢測可溶性膠原(試劑盒：Biocolor，批號AA883)。

使用Excel統計軟體：平均值以avg(Average，平均值)計算；SD(Standard diviation，標准偏差)值以STDEV(Standard diviation，標準差)計算；SEM(Standard Error of Mean，樣本均數的標準差)值以STDEV/SQRT(Square root，開平方根)(每組動物數)計算；GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA(雙因素方差分析)或One-way ANOVA(單因素方差分析)對數據進行統計學分析。

實驗結果見表22。

結果顯示，Hu164-67wl或Hu164-67yl顯示出很強的小鼠肺纖維化抑制作用。

二、CTGF抗體對Su86.86人胰腺癌細胞皮下移植瘤的抑制實驗

實驗方法：將SU86.86細胞(ATCC,CRL-1837、3.0×10⁶個)200μl接種於Nu/Nu裸鼠右肋部皮下，接種11天後，待腫瘤體積在~140mm³後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為5組，每組10隻，當天開始給藥。藉由腹腔注射抗體，每週注射2次，共18天。每週測1-2次瘤體積，稱體重，記錄數據。分組及給藥情況見表23。

使用Excel統計軟體記錄數據：平均值以avg計算；SD值以STDEV計算；SEM值以STDEV/SORT(每組動物數)計算；採用 GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA或One-way ANOVA對數據進行統計學分析。

腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L_長×L_短 ²

相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T_t-T₀)/(C_t-C₀)×100，其中T_t、C_t為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T₀、C₀為實驗開始時的腫瘤體積。

抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。

實驗結果：

D1-18天，每週皮下注射給藥2次，檢測CTGF抗體對SU86.86腫瘤的生長抑制作用。試驗結果見表24和圖2所示。與同型人IgG的空白對照組相比，mAb1-40mg/kg、Hu164-67yl-40mg/kg、Hu164-67yl-20mg/kg、Hu147-33wk(40mg/kg)組抑瘤率分別為45%、53%、47%和54%，mAb1-40mg/kg、Hu164-67yl-40mg/kg、Hu164-67yl-20mg/kg、Hu147-33wk(40mg/kg)組能夠顯著抑制Su86.86腫瘤的生長(p<0.001)，且對SU86.86腫瘤的抑制作用具有一定劑量依賴性。另外，各組小鼠體重沒有明顯變化。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 抗結締組織生長因子抗體及其應用

<160> 104

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> 肽

<223> 人CTGF全長蛋白

<400> 1

<210> 2

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> CTGF-his

<400> 2

<210> 3

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> mCTGF-Fc

<400> 3

<210> 4

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 小鼠CTGF蛋白-His標簽

<400> 4

<210> 5

<211> 574

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 食蟹猴CTGF-Fc

<400> 5

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 VH

<400> 6

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 VL

<400> 7

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 VH

<400> 8

<210> 9

<211> 109

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 VL

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 HCDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 HCDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 HCDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 LCDR1

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 LCDR2

<400> 14

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab147 LCDR3

<400> 15

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 HCDR1

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 HCDR2

<400> 17

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 HCDR3

<400> 18

<210> 19

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 LCDR1

<400> 19

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 LCDR2

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<223> mab164 LCDR3

<400> 21

<210> 22

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VL1

<400> 22

<210> 23

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VL2

<400> 23

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VL3

<400> 24

<210> 25

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VL4

<400> 25

<210> 26

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VL5

<400> 26

<210> 27

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VH1

<400> 27

<210> 28

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VH2

<400> 28

<210> 29

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu147-VH3

<400> 29

<210> 30

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VL7

<400> 30

<210> 31

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VL8

<400> 31

<210> 32

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VL9

<400> 32

<210> 33

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VH5

<400> 33

<210> 34

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VH6

<400> 34

<210> 35

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VH7

<400> 35

<210> 36

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu164-VH8

<400> 36

<210> 37

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 重鏈恆定區w

<400> 37

<210> 38

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 重鏈恆定區y

<400> 38

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 人源化抗體輕鏈kappa恆定區

<400> 39

<210> 40

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 人源化抗體輕鏈1ambda恆定區

<400> 40

<210> 41

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch147重鏈

<400> 41

<210> 42

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch147輕鏈

<400> 42

<210> 43

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-11wk重鏈

<400> 43

<210> 44

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-21wk重鏈

<400> 44

<210> 45

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-31wk重鏈

<400> 45

<210> 46

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-11yk重鏈

<400> 46

<210> 47

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-21yk重鏈

<400> 47

<210> 48

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-31yk重鏈

<400> 48

<210> 49

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-11wk輕鏈

<400> 49

<210> 50

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-12wk輕鏈

<400> 50

<210> 51

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-13wk輕鏈

<400> 51

<210> 52

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-14wk輕鏈

<400> 52

<210> 53

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu147-15wk輕鏈

<400> 53

<210> 54

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch164重鏈

<400> 54

<210> 55

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch164輕鏈

<400> 55

<210> 56

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-57wl重鏈

<400> 56

<210> 57

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-67wl重鏈

<400> 57

<210> 58

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-77wl重鏈

<400> 58

<210> 59

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-87wl重鏈

<400> 59

<210> 60

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-57yl重鏈

<400> 60

<210> 61

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-67yl重鏈

<400> 61

<210> 62

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-77yl重鏈

<400> 62

<210> 63

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-87yl重鏈

<400> 63

<210> 64

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-57wl輕鏈

<400> 64

<210> 65

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-58wl輕鏈

<400> 65

<210> 66

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu164-59wl輕鏈

<400> 66

<210> 67

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> mAb1重鏈

<400> 67

<210> 68

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> mAb1輕鏈

<400> 68

<210> 69

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> mab95 VH

<400> 69

<210> 70

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 VL

<400> 70

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 HCDR1

<400> 71

<210> 72

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 HCDR2

<400> 72

<210> 73

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 HCDR3

<400> 73

<210> 74

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mab95 LCDR1

<400> 74

<210> 75

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 LCDR2

<400> 75

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> mab95 LCDR3

<400> 76

<210> 77

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VL1

<400> 77

<210> 78

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VL2

<400> 78

<210> 79

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VL3

<400> 79

<210> 80

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VL4

<400> 80

<210> 81

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VH1

<400> 81

<210> 82

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VH2

<400> 82

<210> 83

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VH3

<400> 83

<210> 84

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VH4

<400> 84

<210> 85

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-VH5

<400> 85

<210> 86

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch95重鏈

<400> 86

<210> 87

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Ch95輕鏈

<400> 87

<210> 88

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-11wk重鏈

<400> 88

<210> 89

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-21wk重鏈

<400> 89

<210> 90

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-31wk重鏈

<400> 90

<210> 91

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-41wk重鏈

<400> 91

<210> 92

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-51wk重鏈

<400> 92

<210> 93

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-11yk重鏈

<400> 93

<210> 94

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-21yk重鏈

<400> 94

<210> 95

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-31yk

<400> 95

<210> 96

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-41yk重鏈

<400> 96

<210> 97

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-51yk重鏈

<400> 97

<210> 98

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-11wk輕鏈

<400> 98

<210> 99

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-12wk輕鏈

<400> 99

<210> 100

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-13wk輕鏈

<400> 100

<210> 101

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> Hu95-14wk輕鏈

<400> 101

<210> 102

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu95-VH5 HCDR1

<400> 102

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu95-VH5 HCDR2

<400> 103

<210> 104

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> Hu95-VH5 HCDR3

<400> 104

Claims (15)

1. 一種抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

   i)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   ii)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   ii-i)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：69所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：70所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

   ii-ii)該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：85所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：70所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2. 如請求項1之抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

   iii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   iv)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別 如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   iv-i)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

   iv-ii)該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
3. 如請求項1或2之抗CTGF抗體，其中該抗CTGF抗體是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
4. 如請求項1至3中任一項之抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

   (v)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：6、27、28或29具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：7、22、23、24、25或26具有至少90%的序列同一性；

   (vi)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：8、33、34、35或36具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：9、30、31或32具有至少90%的序列同一性；或

   (vi-i)該重鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：69、81、82、83、84或85具有至少90%的序列同一性，和該輕鏈可變區，其胺基酸序列與SEQ ID NO：70、77、78、79或80具有至少90%的序列同一性。
5. 如請求項2之抗CTGF抗體，其中該抗CTGF抗體為人源化抗體，該人源化抗體包含人抗體的框架區或其框架區變體，該框架區變體在人抗體的輕鏈框架區和/或重鏈框架區上分別具有至多10個回復突變；

   較佳地，該人源化抗體包含選自以下(a)、(b)或(b-i)該的輕鏈可變區和重鏈可變區：

   (a)輕鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及選自4L、36F、43S、45K、47W、58V或71Y中的一個或更多個回復突變，和

   重鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及選自28S、30N、49A、75E、76S、93V、94E或104D中的一個或更多個回復突變；

   (b)輕鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及選自36V、44F、46G或49G中的一個或更多個回復突變，和

   重鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及選自44G、49G、27F、48L、67L、71K、78V或80F中的一個或更多個胺基酸回復突變的重鏈可變區；

   (b-i)輕鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及選自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一個或更多個回復突變，和

   重鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及選自27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一個或更多回復突變：或

   (b-ii)輕鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及選自45P、46W、48Y、69S或70Y中的一個或更多個回復突變，和

   重鏈可變區，其包含：

   分別如SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及選自27F、38K、48I、67K、68A、70L或72F中的一個或更多個回復突變。
6. 如請求項5之抗CTGF抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：

   (vii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

   (viii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：27、28或29所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：22、23、24、25或26所示；

   (ix)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

   (x)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：33、34、35或36所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：30、31或32所示；

   (xi)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示；或

   (xii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：81、82、83、84或85所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：77、78、79或80所示；

   較佳地，其包含如下所示的重鏈可變區和輕鏈可變區：

   (xiii)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：27所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示；

   (xiv)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示；或

   (xv)該重鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示；和該輕鏈可變區，其胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示。
7. 如請求項1至6中任一項之抗CTGF抗體，其中該抗體進一步包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；較佳地，該重鏈恆定區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其變體，該輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈的恆定區及其變體；更較佳地，該抗體包含如SEQ ID NO：37或38所示的重鏈恆定區和如SEQ ID NO：39或40所示的輕鏈恆定區。
8. 如請求項1至7中任一項之抗CTGF抗體，其包含：

   (c)與SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48具有至少85%序列同一性的重鏈，和與SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53具有至少85%序列同一性的輕鏈；

   (d)與SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63具有至少85%序列同一性的重鏈，和與SEQ ID NO：55、64、65或66具有至少85%同一性的輕鏈；

   (e)如SEQ ID NO：41、43、44、45、46、47或48所示的重鏈和如SEQ ID NO：42、49、50、51、52或53所示的輕鏈；

   (f)如SEQ ID NO：54、56、57、58、59、60、61、62或63所示的重鏈和如SEQ ID NO：55、64、65或66所示的輕鏈；

   (g)與SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97具有至少85%序列同一性的重鏈，和與SEQ ID NO：87、98、99、100或101具有至少85%序列同一性的輕鏈；或

   (h)如SEQ ID NO：86、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97所示的重鏈和如SEQ ID NO：87、98、99、100或101所示的輕鏈；

   較佳地，其包含：

   (j)如SEQ ID NO：46所示的重鏈和如SEQ ID NO：49所示的輕鏈；

   (k)如SEQ ID NO：61所示的重鏈和如SEQ ID NO：64所示的輕鏈；或

   (l)如SEQ ID NO：97所示的重鏈和如SEQ ID NO：98所示的輕鏈。
9. 一種分離的抗CTGF抗體，其中該分離的抗CTGF抗體與如請求項1至8中任一項之抗CTGF抗體競爭性結合人CTGF。
10. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至9中任一項之抗CTGF抗體。
11. 一種宿主細胞，其包含如如請求項10之核酸分子。
12. 一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如請求項1至9中任一項之抗CTGF抗體，或如請求項10之核酸分子，以及一種或更多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、緩衝劑或賦形劑。
13. 一種用於免疫檢測或測定CTGF的方法，該方法包括使如請求項1至9中任一項之抗CTGF抗體接觸受試者或其樣本的步驟。
14. 一種試劑盒，其包含如請求項1至9中任一項之抗CTGF抗體。
15. 一種治療或預防與CTGF相關的疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量或預防有效量的如請求項1至9中任一項之抗CTGF抗體，或如請求項10之核酸分子，或如請求項12之醫藥組成物，其中該與CTGF相關的疾病較佳為纖維性疾病、高血壓、糖尿病、心肌梗死、關節炎、CTGF相關細胞增殖性疾病、動脈粥樣硬化、青光眼或癌症；

    較佳地，該纖維性疾病選自：自發性肺纖維化、糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病骨關節炎、硬皮病、慢性心衰竭、肝硬化或腎纖維化；

    較佳地，該癌症選自：急性淋巴母細胞性白血病、皮膚纖維瘤、乳腺癌、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、結締組織生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌、胃腸道癌症或肝癌。

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