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TW202043287A - 用於部位專一性接合之抗體和抗體片段 - Google Patents

用於部位專一性接合之抗體和抗體片段 Download PDF

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TW202043287A
TW202043287A TW109127593A TW109127593A TW202043287A TW 202043287 A TW202043287 A TW 202043287A TW 109127593 A TW109127593 A TW 109127593A TW 109127593 A TW109127593 A TW 109127593A TW 202043287 A TW202043287 A TW 202043287A
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Abstract

本發明關於包含用於部位專一性接合之經取代的半胱胺酸之多肽、抗體及彼之抗原結合片段。

Description

用於部位專一性接合之抗體和抗體片段
本發明關於經建構以導入用於部位專一性接合之胺基酸的抗體及彼等之抗原結合片段。
抗體已被接合至多種細胞毒性藥物，包括烷化DNA(例如雙聯黴素(duocarmycin)及卡利奇黴素(calicheamicin))、擾亂微管(例如類美坦素(maytansinoid)及耳抑素(auristatin))或結合DNA(例如蒽環(anthracycline))之小分子。一種包含接合卡利奇黴素的人化抗CD33抗體的這類抗體-藥物接合物(antibody-drug conjugate,ADC)-MylotargTM(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin))，已經獲准用於治療急性骨髓性白血病。AdcetrisTM(布吐西單抗維多汀(brentuximab vedotin))是一種包含接合耳抑素單甲基耳抑素E(monomethyl auristatin E,MMAE)之抗CD30嵌合抗體的ADC，其已經核准用於治療霍奇金氏淋巴瘤及退行性大細胞淋巴瘤。
儘管ADC用於癌症治療的前景看好，細胞毒性藥物通常經由離胺酸側鏈來接合抗體，或者藉由將存在於抗體中之鏈間雙硫鍵還原，以提供經活化之半胱胺酸氫硫基來接合抗體。然而，此非專一性接合之方式具有許多缺點。舉例來說，藥物接合抗體離胺酸殘基受到抗體中有許多個可供接合之離胺酸殘基(約30個)的事實影響而複雜化。由於藥物對抗體比例(DAR)的理想數目遠遠較低(例如約4：1)，因此離胺酸接合通常產生非常異質的接合特性。另外，許多離胺酸位於CDR區的關鍵抗原結合部位，藥物接合可能導致抗體親和性降低。另一方面，雖然硫醇媒介之接合主要是以八個與絞鏈雙硫鍵有關的半胱胺酸為目標，但仍難以預測及識別八個半胱胺酸中的哪四個能在不同製劑中一致地接合。
最近，游離半胱胺酸殘基之基因工程已經使得部位專一性接合能夠利用基於硫醇之化學來進行。部位專一性ADC具有同質特性及定義良好的接合部位，且顯示有效的試管內(in vitro)細胞毒性及高度活體內(in vivo)抗腫瘤活性。
WO 2013/093809揭示在特定部位包含胺基酸取代以導入用於接合之半胱胺酸殘基的經建構之抗體恆定區(Fc、Cγ、Cλ、Cκ)或其片段。數個在IgG重鏈及λ/κ輕鏈恆定區之Cys突變部位係經揭示。
成功使用經導入之Cys殘基於部位專一性接合，有賴於選擇適當部位的能力，其中Cys取代不改變蛋 白結構或功能。另外，使用不同接合部位導致不同特徵，諸如ADC的生物穩定性或可接合性。因此，利用部位專一性接合策略來產製具有經定義之接合部位及所欲之ADC特徵的ADC將是高度有用的。
本發明關於包含用於部位專一性接合之經取代的半胱胺酸之多肽、抗體及彼之抗原結合片段。
所屬技術領域中具有通常知識者將認可或使用不多於例行實驗可確定本文所述之本發明的特定實施例之許多均等物。該等均等物意欲由下列實施例(E)涵蓋。
E1.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的位置290上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E2.如E1之多肽，其中該恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域。
E3.如E2之多肽，其中該IgG係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E4.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：61併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：61之殘基60的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E5.如E4之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域之根據卡巴之EU指數編號的位置 290上。
E6.如E5之多肽，其中該IgG係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E7.如E1或E4之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)重鏈CH2結構域。
E8.如E1或E4之多肽，其中該恆定結構域包含IgD重鏈CH2結構域。
E9.如E1或E4之多肽，其中該恆定結構域包含IgE重鏈CH2結構域。
E10.如E1或E4之多肽，其中該恆定結構域包含IgM重鏈CH2結構域。
E11.如E1至E10中任一項之多肽，其中該恆定結構域係人抗體恆定結構域。
E12.如E1至E11中任一項之多肽，其中該恆定結構域在選自由根據卡巴之EU指數編號的118、246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、444及彼等之任何組合所組成之群組的位置上進一步包含經建構之半胱胺酸殘基。
E13.如E1至E12中任一項之多肽，其中該恆定結構域在選自由根據卡巴之EU指數編號的118、334、347、 373、375、380、388、392、421、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上進一步包含經建構之半胱胺酸殘基。
E14.如E1至E13中任一項之多肽，其中該恆定結構域在根據卡巴之EU指數編號的位置334上進一步包含經建構之半胱胺酸殘基。
E15.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含如E1至E14中任一項之多肽。
E16.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
(a)如E1至E14中任一項之多肽，及
(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的位置183上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基76的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
E17.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
(a)如E1至E14中任一項之多肽，及
(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63(κ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基4、42、81、100、103或彼等之任何組合的位置上 之經建構之半胱胺酸殘基；或(iii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：64(λ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：64之殘基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
E18.如E16或E17之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區包含κ輕鏈恆定結構域(CLκ)。
E19.如E16或E17之抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區包含λ輕鏈恆定結構域(CLλ)。
E20.一種化合物，其包含如E1至E14中任一項之多肽，或如E15至E19中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該多肽或抗體係經由該經建構之半胱胺酸部位接合一或多種治療劑。
E21.如E20之化合物，其中該治療劑係經由連接子接合該多肽或該抗體或其抗原結合片段。
E22.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、375、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E23.如E22之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E24.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、145、162或彼等之任何組合 的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E25.如E24之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置334、375、392或彼等之任何組合上。
E26.如E22或E24之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E27.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的347、388、421、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E28.如E27之多肽，其中恆定結構域包含IgG CH3結構域。
E29.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之117、158、191、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E30.如E29之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH3結構域之根據卡巴之EU指數編號的位置347、388、421、443或彼等之任何組合上。
E31.如E27或E29之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH3結構域。
E32.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的347、388、421及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E33.如E32之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH3結構域。
E34.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基117、158、191或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E35.如E34之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH3結構域之根據卡巴之EU指數編號的位置347、388、421或彼等之任何組合上。
E36.如E32或E34之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH3結構域。
E37.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的290、334、392、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E38.如E37之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E39.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應 SEQ ID NO：62之殘基60、104、162、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E40.如E39之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置290、334、392、443或彼等之任何組合上。
E41.如E37或E39之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E42.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、388、421、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E43.如E42之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E44.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之104、158、191、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E45.如E44之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置334、388、421、443或彼等之任何組合上。
E46.如E42或E44之多肽，其中該恆定結構域包含 IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E47.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、392、421及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E48.如E47之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E49.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之104、162、191或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E50.如E49之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置334、392、421或彼等之任何組合上。
E51.如E47或E49之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E52.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的位置392上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E53.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的位置290、443 或二者上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E54.如E52或E53之多肽，其中該恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E55.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基162的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E56.如E55之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH3結構域之根據卡巴之EU指數編號的位置392上。
E57.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基60、213或二者的位置上包含經建構之殘基。
E58.如E57之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置290、443或二者上。
E59.如E52、E53、E55、及E57中之任一項之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E60.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的290、388、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E61.如E60之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E62.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基60、158、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E63.如E62之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的殘基290、388、443或彼等之任何組合上。
E64.如E60或E62之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E65.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、375、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E66.如E65之多肽，其中恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E67.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、145、162或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E68.如E67之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係 位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置334、375、392或彼等之任何組合上。
E69.如E65或E67之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E70.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，該恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、347、375、380、388、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E71.如E70之多肽，其中該恆定結構域包含IgG重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E72.一種多肽，其包含抗體重鏈恆定結構域，當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、117、145、150、158、162或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E73.如E72之多肽，其中該經建構之半胱胺酸殘基係位於IgG CH2結構域、CH3結構域、或二者之根據卡巴之EU指數編號的位置334、347、375、380、388、392或彼等之任何組合上。
E74.如E70或E72之多肽，其中該恆定結構域包含IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、或IgM重鏈CH2結構域、CH3結構域、或二者。
E75.如E23、E25、E28、E30、E33、E35、E38、 E40、E43、E45、E48、E50、E54、E56、E58、E61、E63、E66、D68、E71、及E73中任一例之多肽，其中該IgG係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
E76.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含選自E21至E75中任一項之多肽。
E77.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
(a)如E21至E75中任一項之多肽，及
(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的位置183上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基76的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
E78.一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：
(a)如E21至E75中任一項之多肽，及
(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63(κ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基4、42、81、100、103或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(iii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：64(λ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：64之殘基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、 97、98、99、101或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
E79.一種化合物，其包含如E21至E75中任一項之多肽，或如E76至E78之抗體或其抗原結合片段，其中該多肽或抗體係經由該經建構之半胱胺酸部位接合治療劑。
E80 如E79之化合物，其中該治療劑係經由連接子接合該多肽或該抗體或其抗原結合片段。
E81.如E79或E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、375、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、145、162或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)該化合物相對於該多肽或未接合抗體之疏水性變化，以HIC相對滯留時間測量時係介於約1.0至約1.5、
介於約1.0至約1.4、介於約1.0至約1.3或介於約1.0至約1.2。
E82.如E79或E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的347、388、421、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基117、158、191、213或彼等之任 何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)該化合物相對於該多肽或未接合抗體之疏水性變化，以HIC相對滯留時間測量時係約1.5或更大、約1.6或更大、約1.7或更大、約1.8或更大、約1.9或更大或約2.0或更大。
E83.如E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的347、388、421及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基117、158、191或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；
(b)該連接子包含琥珀醯亞胺基團；且
(c)琥珀二醯胺在血漿中在37℃下在5% CO2下在72小時之水解百分比係至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%。
E84.如E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的347、388、421及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基117、158、191或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；
(b)該連接子包含琥珀醯亞胺基團；且
(c)琥珀二醯胺在0.5mM麩胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小時之水解百分比係至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%。
E85.如E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的290、334、392、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基60、104、162、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；
(b)該連接子包含琥珀醯亞胺基團；且
c)琥珀二醯胺在血漿中在37℃下在5% CO2下在72小時之水解百分比係約50%或更少、約45%或更少、約40%或更少、約35%或更少或約30%或更少。
E86.如E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的290、334、392、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基60、104、162、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；
(b)該連接子包含琥珀醯亞胺基團；且
(c)琥珀二醯胺在0.5mM麩胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小時之水解百分比係約50%或更少、約45%或更少、約40%或更少、約35%或更少或約30%或更少。
E87.如E79或E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、388、421、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、158、191、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)藥物對抗體比例(DAR)在血漿中在37℃下在5% CO2下在72小時之損失百分比係不大於約10%、不大於約9%、不大於約8%、不大於約7%、不大於約6%、不大於約5%、不大於約4%、不大於約3%、不大於約2%或不大於約1%。
E88.如E79或E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、392、421及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、162、191或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)DAR在0.5mM麩胱甘肽(pH 7.4)中在37℃下在72小時之損失百分比係不大於約10%、不大於約9%、不 大於約8%、不大於約7%、
不大於約6%、不大於約5%、不大於約4%、不大於約3%、不大於約2%或不大於約1%。
E89.如E82之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的290、388、443及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基60、158、213或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)細胞自溶酶媒介性連接子切割(200至20000ng/mL細胞自溶酶)在37℃下在20分鐘之百分比係至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%或至少約90%。
E90.如E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、375、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、145、162或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)細胞自溶酶媒介性(200至20000ng/mL細胞自溶酶)連接子切割在37℃下在4小時之百分比係約50%或更 少、約45%或更少、約40%或更少、約35%或更少、約30%或更少、約25%或更少、約20%或更少或約15%或更少。
E91.如E79或E80之化合物，其中：
(a)該重鏈恆定結構域在選自由根據卡巴(Kabat)之EU指數編號的334、347、375、380、388、392及彼等之任何組合所組成之群組的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；或當該恆定結構域與SEQ ID NO：62併列時，該恆定結構域在對應SEQ ID NO：62之殘基104、117、145、150、158、162或彼等之任何組合的位置上包含經建構之半胱胺酸殘基；且
(b)呈單體形式化合物在5mg/mL濃度下在45℃下在第21天之百分比係約96.0%或更多、約96.5%或更多、約97.0%或更多、約97.5%或更多約98.0%或更多。
E92.如E21及E80至E91中任一項之化合物，其中該連接子係可切割。
E93.如E21及E80至E92中任一項之化合物，其中該連接子包含vc、mc、MalPeg6、m(H20)c、m(H20)cvc或彼等之組合。
E94.如E21及E80至E93中任一項之化合物，其中該連接子包含vc。
E95.如E20至E21及E79至E94中任一項之化合物，其中該治療劑係選自由下列所組成之群組：細胞毒性劑、細胞靜止劑、化學治療劑、毒素、放射性核種、 DNA、RNA、siRNA、微小RNA、肽核酸、非天然胺基酸、肽、酶、螢光標籤、生物素、微管溶素(tubulysin)及彼等之任何組合。
E96.如E20至E21及E79至E95中任一項之化合物，其中該治療劑係選自由下列所組成之群組：耳抑素(auristatin)、類美坦素(maytansinoid)、卡利奇黴素(calicheamicin)、微管溶素(tubulysin)及彼等之任何組合。
E97.如E20至E21及E79至E96中任一項之化合物，其中該治療劑係耳抑素(auristatin)。
E98.如E97之化合物，其中該耳抑素係選自由0101、8261、6121、8254、6780、0131、MMAD、MMAE、MMAF及彼等之任何組合所組成之群組。
E99.如E20至E21及E79至E96中任一項之化合物，其中該治療劑係微管溶素(tubulysin)。
E100.一種式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中(a)Ab係E76至E78中任一項之抗體；(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物。
E101.如E100之抗體藥物接合物，其中L-D包含琥珀醯亞胺基團、順丁烯二醯亞胺基團、水解的琥珀醯亞胺基團或水解的順丁烯二醯亞胺基團。
E102.如E100或E101之抗體藥物接合物，其中L-D包含順丁烯二醯亞胺基團或水解的順丁烯二醯亞胺基團。
E103.如E100至E102中任一項之抗體藥物接合物，其中L-D包含6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)、順丁烯 二醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對胺基苄氧羰基(PAB)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基4(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(SMCC)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)或6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧羰基(MC-vc-PAB)。
E104.如E100至E102中任一項之抗體藥物接合物，其包含式I之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0022-451
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0022-452
W係
R1係氫或C1-C8烷基；
R2係氫或C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(i)R3A係氫或C1-C8烷基；R3B係C1-C8烷基；
(ii)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0023-453
，
Figure 109127593-A0101-12-0023-454
或
Figure 109127593-A0101-12-0023-455
；且
R5係
且R6係氫或-C1-C8烷基。
E105.如E100至E102中任一項之抗體藥物接合物，其包含式IIa之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0023-456
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0023-457
W係
Figure 109127593-A0101-12-0023-458
R1係
Figure 109127593-A0101-12-0024-459
Y係選自下列之一或多個基團：-C2-C20伸烷基-、-C2-C20雜伸烷基-、-C3-C8碳環-、-伸芳基-、-C3-C8雜環-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)-、-(C3-C8碳環)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)-或-(C3-C8雜環)-C1-C10伸烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-及-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-；
Figure 109127593-A0101-12-0024-460
Z係或-NH2；
G係鹵素、-OH、-SH或-S-C1-C6烷基；R2係氫或 C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(i)R3A係氫或C1-C8烷基；且R3B係C1-C8烷基；或
(ii)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0025-462
R5係
R6係氫或C1-C8烷基；
R10係氫、-C1-C10烷基、-C3-C8碳環基、-芳基、-C1-C10雜烷基、-C3-C8雜環、-C1-C10伸烷基-芳基、-伸芳基-C1-C10烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)、-(C3-C8碳環)-C1-C10烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)或-(C3-C8雜環)-C1-C10烷基，其中R10上的芳基包含經[R7]h可選地取代之芳基；
R7每次出現時係獨立選自由F、Cl、I、Br、NO2、CN及CF3所組成之群組；且h係1、2、3、4或5。
E106.如E100至E102中任一項之抗體藥物接合物，其包含式IIb之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0025-461
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0026-464
W係
Figure 109127593-A0101-12-0026-465
R1係
Figure 109127593-A0101-12-0026-463
Y係-C2-C20伸烷基-、-C2-C20雜伸烷基-、-C3-C8碳環-、-伸芳基-、-C3-C8雜環-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)-、-(C3-C8碳環)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)-或-(C3-C8雜環)-C1-C10伸烷基-；
Figure 109127593-A0101-12-0026-466
Z係
Figure 109127593-A0101-12-0027-470
 或-NH-Ab；
Ab係抗體；
R2係氫、或C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(i)R3A係氫或C1-C8烷基；R3B係C1-C8烷基；
(ii)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0027-467
，
Figure 109127593-A0101-12-0027-468
或
Figure 109127593-A0101-12-0027-469
；且
R5係
R6係氫或-C1-C8烷基。
E107.一種醫藥組成物，其包含：如E20至E21及E79至E99中任一項之化合物，或如E100至E107中任一項之抗體藥物接合物；及醫藥上可接受之載劑。
E108.一種治療癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、 或感染性疾病之方法，該方法包含對有需要治療之個體投予治療有效量之如E20至E21及E79至E99中任一項之化合物、如E100至E107中任一項之抗體藥物接合物、或如E108之組成物。
E109.如E20至E21及E79至E99中任一項之化合物、如E100至E107中任一項之抗體藥物接合物、或如E108之組成物，其係用於治療癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病或感染性疾病。
E110.一種如E20至E21及E79至E99中任一項之化合物、如E100至E107中任一項之抗體藥物接合物、或如E108之組成物用於治療癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病或感染性疾病之用途。
E111.一種如E20至E21及E79至E99中任一項之化合物、如E100至E107中任一項之抗體藥物接合物、或如E108之組成物於製造用於治療癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病或感染性疾病的藥物之用途。
E112.一種式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中：
(a)Ab係與HER2結合之抗體且包含
(1)重鏈可變區，其包含三個包含SEQ ID NO：2、3及4之CDR；
(2)重鏈恆定區，其具有SEQ ID NO：17、5、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39中之任一者；
(3)輕鏈可變區，其包含三個包含SEQ ID NO：8、9及10之CDR；
(4)輕鏈恆定區，其具有SEQ ID NO：41、11或43中之任一者；且
(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物，
唯當該重鏈恆定區係SEQ ID NO：5時，該輕鏈恆定區不是SEQ ID NO：11。
E113.如E112之抗體藥物接合物，其中
(a)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：17且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：41；
(b)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：5且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：41；
(c)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：17且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(d)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：21且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(e)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：23且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(f)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：25且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(g)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：27且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(h)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：23且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：41；
(i)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：25且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：41；
(j)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：27且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：41；
(k)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：29且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(l)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：31且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(m)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：33且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：43；
(n)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：35且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(o)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：37且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；
(p)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：39且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：11；或
(q)該重鏈恆定區係SEQ ID NO：13且該輕鏈恆定區係SEQ ID NO：43。
E114.如E112之抗體藥物接合物，其中
(a)該重鏈包含SEQ ID NO：18、6、14、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40中之任一者；且
(b)該輕鏈包含SEQ ID NO：42、12、或44中之任一者，
唯當該重鏈係SEQ ID NO：6時，該輕鏈不是SEQ ID NO：12。
E115.如E114之抗體藥物接合物，其中
(a)該重鏈係SEQ ID NO：18且該輕鏈係SEQ ID NO：42；
(b)該重鏈係SEQ ID NO：6且該輕鏈係SEQ ID NO：42；
(c)該重鏈係SEQ ID NO：18且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(d)該重鏈係SEQ ID NO：22且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(e)該重鏈係SEQ ID NO：24且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(f)該重鏈係SEQ ID NO：26且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(g)該重鏈係SEQ ID NO：28且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(h)該重鏈係SEQ ID NO：24且該輕鏈係SEQ ID NO：42；
(i)該重鏈係SEQ ID NO：26且該輕鏈係SEQ ID NO：42；
(j)該重鏈係SEQ ID NO：28且該輕鏈係SEQ ID NO：42；
(k)該重鏈係SEQ ID NO：30且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(l)該重鏈係SEQ ID NO：32且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(m)該重鏈係SEQ ID NO：34且該輕鏈係SEQ ID NO：44；
(n)該重鏈係SEQ ID NO：36且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(o)該重鏈係SEQ ID NO：38且該輕鏈係SEQ ID NO：12；
(p)該重鏈係SEQ ID NO：40且該輕鏈係SEQ ID NO：12；或
(q)該重鏈係SEQ ID NO：14且該輕鏈係SEQ ID NO：44。
E116.如E112至E115中任一項之抗體藥物接合物，其中該連接子係選自由vc、mc、MalPeg6、m(H20)c及m(H20)cvc所組成之群組。
E117.如E116之抗體藥物接合物，其中該連接子係可切割。
E118.如E116或E117之抗體藥物接合物，其中該連接子係vc。
E119.如E112至E118中任一項之抗體藥物接合物，其中該藥物具膜穿透性。
E120.如E112至E119中任一項之抗體藥物接合物，其中該藥物係耳抑素(auristatin)。
E121.如E120之抗體藥物接合物，其中該耳抑素 (auristatin)係選自由下列所組成之群組：
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧 基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽；
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；及
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，
或彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
E122.如E120之抗體藥物接合物，其中該耳抑素(auristatin)係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
E123.一種式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中：
(a)Ab係與HER2結合之抗體且包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：18且該輕鏈包含SEQ ID NO：42；且
(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係vc之連接子且D係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺之耳抑素(auristatin)或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
E124.一種醫藥組成物，其包含如E112至E123中任一項之抗體藥物接合物及醫藥上可接受之載劑。
E125.一種式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中Ab係與纖網蛋白(FN)之外結構域B(EDB)結合之抗體，且L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物。
E126.如E125之抗體藥物接合物，其中該抗體包含：
(i)重鏈可變區(VH)，其包含：
(a)VH互補決定區一(CDR-H1)，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：66或67，
(b)VH CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：68或69；及
(c)VH CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：70；及
(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含：
(a)VL互補決定區一(CDR-L1)，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：73，
(b)VL CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74；及
(c)VL CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
E127.如E125或E126之抗體藥物接合物，其中該連接子係選自由vc、mc、MalPeg6、m(H20)c及m(H20)cvc所組成之群組。
E128.如E127之抗體藥物接合物，其中該連接子係可切割。
E129.如E127或E128之抗體藥物接合物，其中該連接子係vc。
E130.如E125至E129中任一項之抗體藥物接合物，其中該藥物具膜穿透性。
E131.如E125至E130中任一項之抗體藥物接合物，其中該藥物係耳抑素(auristatin)。
E132.如E131之抗體藥物接合物，其中該耳抑素(auristatin)係選自由下列所組成之群組：
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，三氟乙酸鹽；
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；及
N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，
或彼等之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
E133.如E132之抗體藥物接合物，其中該耳抑素(auristatin)係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
E134.一種醫藥組成物，其包含如E125至E133中任一項之抗體藥物接合物及醫藥上可接受之載劑。
E135.一種核酸，其編碼如E1至E14及E22至E75中任一項之多肽。
E136.一種核酸，其編碼如E15至E19及E76至E78中任一項之抗體。
E137.一種核酸，其編碼如E20、E21、及E79至E99中任一項之化合物的抗體部分。
E138.一種核酸，其編碼如E100至E106、E112至E123、及E125至E133中任一項之抗體藥物接合物的抗體部分。
E139.一種核酸，其編碼包含抗體重鏈恆定結構域之多肽，其中該重鏈恆定結構域在根據卡巴(Kabat)之EU指 數編號的位置290上包含經建構之半胱胺酸殘基。
E140.一種經單離之核酸，其編碼抗體或彼之抗原結合片段，其中該抗體或彼之抗原結合片段包含：
(i)重鏈可變區(VH)，其包含：
(a)VH互補決定區一(CDR-H1)，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：66或67，
(b)VH CDR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：68或69；及
(c)VH CDR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：70；及
(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含：
(a)VL互補決定區一(CDR-L1)，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：73，
(b)VL CDR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74；及
(c)VL CDR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
E141.一種宿主細胞，其包含如E135至E140中任一項之核酸。
E142.一種產製多肽或抗體之方法，該方法包含在表現該多肽或抗體的適當條件下培養如E141之宿主細胞，以及單離該多肽或抗體。
圖1A至1B說明(A)T(kK183C+K290C)-vc0101及(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101 ADC。
各黑色圓點代表接合單株抗體之連接子/載荷物。每個ADC顯示一個此類連接子/載荷物之結構。畫底線之實體係由抗體上之胺基酸殘基供應，而接合即經由該殘基發生。
圖2A至2E說明選定ADC之疏水性交互作用層析(HIC)圖譜，其顯示當曲妥珠單抗衍生抗體接合不同連接子載荷物時滯留時間的變化。
圖3A至3B說明ADC結合至HER2之曲線。(A)直接結合至HER2陽性BT474細胞及(B)與PE標示曲妥珠單抗競爭結合至BT474細胞。這些結果指出在這些ADC中之抗體的結合性質不受接合製程之改變。
圖4說明曲妥珠單抗衍生ADC之ADCC活性。
圖5說明數個曲妥珠單抗衍生ADC對數個HER2表現水準不同的細胞系之試管內細胞毒性資料(IC50)，報告單位為nM載荷物濃度。
圖6說明數個曲妥珠單抗衍生ADC對數個HER2表現水準不同的細胞系之試管內細胞毒性資料(IC50)，報告單位為ng/ml抗體濃度。
圖7A至7I說明九種曲妥珠單抗衍生ADC在N87異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(kK183C+K290C)-vc0101；(B)T(kK183C)-vc0101； (C)T(K290C)-vc0101；(D)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(E)T(K290C+K334C)-vc0101；(F)T(K334C+K392C)-vc0101；(G)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；
(H)T-vc0101；(I)T-DM1。N87胃癌細胞表現高水準的HER2。
圖8A至8E說明六種曲妥珠單抗衍生ADC在HCC1954異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(B)T(K290C+K334C)-vc0101；(C)T(K334C+K392C)-vc0101；(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；
(E)T-DM1。HCC1954乳癌細胞表現高水準的HER2。
圖9A至9G說明七種曲妥珠單抗衍生ADC在JIMT-1異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(kK183C+K290C)-vc0101；(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(K290C+K334C)-vc0101；(D)T(K334C+K392C)-vc0101；
(E)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(F)T-vc0101；(G)T-DM1。JIMT-1乳癌細胞表現中/低水準的HER2。
圖10A至10D說明五種曲妥珠單抗衍生ADC在MDA-MB-361(DYT2)異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(B)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(C)T-vc0101；(D)T-DM1。MDA-MB-361(DYT2)乳癌細胞表現中/低水準的 HER2。
圖11A至11E說明五種曲妥珠單抗衍生ADC在PDX-144580病患衍生異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(kK183C+K290C)-vc0101；(B)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(D)T-vc0101；(E)T-DM1。PDX-144580病患衍生細胞係TNBC PDX模型。
圖12A至12D說明四種曲妥珠單抗衍生ADC在PDX-37622病患衍生異種移植的抗腫瘤活性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T(kK183C+K290C)-vc0101；(B)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(C)T(K297C+K334C)-vc0101；(D)T-DM1。PDX-37622病患衍生細胞係表現中度水準之HER2之NSCLC PDX模型。
圖13A至13B說明經(A)T-DM1或(B)T-vc0101處理且針對磷酸化組蛋白H3及IgG抗體染色之N87腫瘤異種移植之免疫組織化學結果。
T-vc0101觀察到旁路(Bystander)活性。
圖14說明數個曲妥珠單抗衍生ADC及游離載荷物對於在試管內經處理使產生對T-DM1抗性之細胞((N87-TM1及N87-TM2)或對T-DM1敏感之親代細胞(N87細胞)的試管內細胞毒性資料(IC50)，報告單位為nM載荷物濃度及ng/ml抗體濃度。N87胃癌細胞表現高水準的HER2。
圖15A至15G說明七種曲妥珠單抗衍生ADC 對T-DM1敏感性(N87細胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌細胞之抗腫瘤活性。(A)T-DM1；(B)T-mc8261；(C)T(297Q+K222R)-AcLysvc0101；(D)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(E)T(K290C+K334C)-vc0101；(F)T(K334C+K392C)-vc0101；(G)T(kK183C+K290C)-vc0101。
圖16A至16B說明在T-DM1敏感性(N87細胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌細胞上顯示(A)MRP1藥物流出泵及(B)MDR1藥物流出泵之蛋白質表現的西方墨點分析。
圖17A至17B說明T-DM1敏感性(N87細胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌細胞之HER2表現及結合至曲妥珠單抗。(A)顯示HER2蛋白質表現之西方墨點及(B)結合至細胞表面HER2之曲妥珠單抗。
圖18A至18D說明T-DM1敏感性(N87細胞)及抗性(N87-TM1及N87-TM2)胃癌細胞中之蛋白質表現水準之表徵。(A)523個蛋白質的蛋白質表現水準變化；(B)顯示IGF2R、LAMP1及CTSB之蛋白質表現的西方墨點；(C)顯示CAV1之蛋白質表現的西方墨點；(D)由N87及N87-TM2細胞植入而在體內產製之腫瘤中的CAV1蛋白質表現之IHC。
圖19A至19C說明由(A)T-DM1敏感性N87親代細胞；(B)T-DM1抗性N87-TM1細胞；(C)T-DM1抗性N87-TM2細胞植入而在體內產製之腫瘤對曲妥珠單抗 及各種曲妥珠單抗衍生ADC的敏感性。
圖20A至20F說明由T-DM1敏感性N87親代細胞及T-DM1抗性N87-TM2或N87-TM1細胞植入而在體內產製之腫瘤對曲妥珠單抗及各種曲妥珠單抗衍生ADC的敏感性。(A)在曲妥珠單抗或二種曲妥珠單抗衍生ADC存在下，N87腫瘤大小對時間作圖；(B)在曲妥珠單抗或二種曲妥珠單抗衍生ADC存在下，N87-TM2腫瘤大小對時間作圖；(C)在曲妥珠單抗或二種曲妥珠單抗衍生ADC存在下，N87細胞腫瘤大小倍增的時間；(D)在曲妥珠單抗或二種曲妥珠單抗衍生ADC存在下，N87-TM2細胞腫瘤大小倍增的時間；(E)在七種不同曲妥珠單抗衍生ADC存在下，N87-TM2腫瘤大小對時間作圖；(F)在第14天新增曲妥珠單抗衍生ADC下，N87-TM1腫瘤大小對時間作圖。
圖21A至21E說明在體內產製的T-DM1抗性細胞之產製及表徵。(A)N87胃癌細胞最初植入體內時對T-DM1敏感。(B)經過一段時間後，經植入之N87細胞變得對T-DM1具有抗性，但維持對(C)T-vc0101、(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101及(E)T(kK183+K290C)-vc0101之敏感性。
圖22A至22D說明四種曲妥珠單抗衍生ADC對於在體內產製之T-DM1抗性細胞(N87-TDM)相較於T-DM1敏感性親代N87細胞之試管內細胞毒性，以腫瘤體積對時間作圖。(A)T-DM1；(B)T(kK183+K290C)- vc0101；(C)T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101；(D)T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101。
圖23A至23B說明在體內產製的T-DM1抗性細胞(N87-TDM1，來自小鼠2、17及18)相較於T-DM1敏感性親代N87細胞之HER2蛋白質表現水準。(A)FACS分析及(B)西方墨點分析。未觀察到HER2蛋白質表現的顯著差異。
圖24A至24D說明在N87-TDM1(小鼠2、7及17)中之T-DM1抗性並不是由於藥物流出泵所致。(A)顯示MDR1蛋白質表現之西方墨點。T-DM1抗性細胞(N87-TDM1)及T-DM1敏感性N87親代細胞在游離藥物(B)0101；(C)多柔比星；(D)T-DM1存在下之試管內細胞毒性。
圖25A至25B說明(A)在對馬來猴投予劑量後之總Ab及曲妥珠單抗ADC(T-vc0101)或T(kK183C+K290C)部位專一性ADC二者，以及(B)對馬來猴投予劑量後之曲妥珠單抗(T-vc0101)或各種部位專一性ADC的ADC分析物的濃度對時間曲線及藥物動力學/毒物動力學。
圖26說明疏水性交互作用層析(HIC)之相對滯留值相較於大鼠中之暴露(AUC)。X軸代表HIV測得之相對滯留時間；而Y軸代表在大鼠中之藥物動力學劑量-標準化暴露(自0至336小時之抗體「曲線下面積(AUC)」，除以10mg/kg之藥物劑量)。
符號形狀表示大致的藥物裝載(DAR)：菱形=DAR 2；圓形=DAR 4。箭頭指示T(kK183C+K290C)-vc0101。
圖27說明使用T-vc0101習知接合物ADC及T(kK183C+K290C)-vc0101部位專一性ADC的毒性研究。T-vc0101在5mg/kg下誘導嚴重的嗜中性白血球減少症，然而T(kK183C+K290C)-vc0101在9mg/kg下造成最小的嗜中性白血球數下降。
圖28A至28C說明(A)T(K290C+K334C)-vc0101；(B)T(K290C+K392C)-vc0101；及(C)T(K334C+K392C)-vc0101的結晶結構。如圖28C所示，考慮載荷物幾何形狀，在K290、K334、K392中任一部位之接合，可能潛在地擾亂聚醣之整體軌跡而遠離CH2表面，使聚醣以及CH2結構本身去穩定化，因此導致CH2-CH3界面。
圖29是以3mpk之各種vc0101部位突變物ADC投藥下之腫瘤生長圖(N87)。
圖30顯示原始SEC痕跡，其說明各種部位突變物與LP#2接合時的行為。
圖31顯示實例22之ADC的血漿穩定性。含有乙醯化產物之重鏈或輕鏈(質量偏移=993)被當作「經裝載」，然而該些含有去乙醯化產物者(質量偏移=951)被當作「未經裝載」以進行DAR計算。
圖32顯示實例22之ADC的體內穩定性(以DAR測量)。
圖33顯示在WI38-VA13和HT-29細胞中以 西方墨點分析EDB+FN的表現。
圖34A至34F顯示下列在PDX-NSX-11122(高度EDB+FN表現性NSCLC病患衍生性異種移植(PDX)人癌症模型)中之抗腫瘤療效：(A)0.3、0.75、1.5及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101；(B)3mg/kg之EDB-L19-vc-0101及10mg/kg之雙硫鍵連接之EDB-L19-diS-DM1；(C)1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101與5mg/kg之雙硫鍵連接之EDB-L19-diS-C2OCO-1569；(D)分別為劑量0.3、1及3mg/kg之部位專一性接合之EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101與劑量1.5mg/kg之習知接合之EDB-L19-vc-0101(ADC1)；(E)劑量為0.3、1及3mg/kg之部位專一性接合之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101；以及(F)以3mg/kg投藥之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101組中每隻個別荷瘤小鼠之腫瘤生長抑制曲線。
圖35A至35F顯示下列在H-1975(中度至高度EDB+FN表現性NSCLC細胞系異種移植(CLX)人癌症模型)中之抗腫瘤療效：(A)0.3、0.75、1.5及3mg/mg之EDB-L19-vc-0101；(B)0.3、1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-1569；(C)分別為0.5、1.5及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和0.1、0.3及1mg/kg之EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI；(D)0.5、1.5及3mg/kg之部位專一性接合EDB-(κK183C+K290C)-vc-0101和習知接合之EDB-L19-vc-0101；(E)1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-(K94R)-vc-0101；以及(F)1及3mg/kg之EDB- (κK183C+K290C)-vc-0101和EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101。
圖36顯示3mg/kg之EDB-L19-vc-0101和EDB-L19-vc-9411在HT29(中度EDB+FN表現性結腸CLX人癌症模型)中之抗腫瘤療效。
圖37A至37B顯示0.3、1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101在下列中之抗腫瘤療效：(A)PDX-PAX-13565(中度至高度EDB+FN表現性胰臟PDX)；以及(B)PDX-PAX-12534(低度至中度EDB+FN表現性胰臟PDX)。
圖38顯示1及3mg/kg之EDB-L19-vc-0101於Ramos(中度EDB+FN表現性淋巴瘤CLX人癌症模型)中之抗腫瘤療效。
圖39A至39B顯示下列於EMT-6(小鼠同基因型乳癌模型)中之抗腫瘤療效：(A)4.5mg/kg之EDB-mut1κK183C-K290C)-vc-0101；以及(B)以4.5mg/kg投藥之EDB-(κK183C-K94R-K290C)-vc-0101組中每隻個別荷瘤小鼠之腫瘤生長抑制曲線。
圖40顯示5mg/kg之習知接合之EDB-L19-vc-0101相較於6mg/kg之部位專一性接合之EDB-mut1(κK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的絕對嗜中性白血球計數。
圖41顯示抗體X和cys突變物X(kK183C+K290C)與目標抗原之競爭結合。X和X(kK183C+K290C)係於競爭型ELISA中測試，其中目標抗原經固定在盤 上，而抗體X和cys突變物X(kK183C+K290C)二者的連續稀釋液在恆定濃度的生物素化親代抗體存在下施加。維持與ELISA盤上之目標抗原結合之生物素化親代抗體的量，係藉由施加與辣根過氧化酶接合之鏈黴抗生物素蛋白測定(見方法)。
圖42顯示Calu-6人NSCLC異種移植腫瘤於經ADC或載劑治療之雌性無胸腺小鼠中的生長曲線。各治療組中個別小鼠的平均腫瘤體積(mm3，平均值±SEM)係對開始投藥後天數作圖。
本發明關於包含用於部位專一性接合之經取代的半胱胺酸之多肽、抗體及彼之抗原結合片段。特別地，已發現抗體重鏈恆定區之位置290(依據卡巴之EU指數編號)可用於部位專一性接合，以利用針對不同目標(包括但不限於HER2)之抗體製備抗體藥物接合物(ADC)。在本文中例示之資料證明，與其他接合部位相比，接合在位置290的ADC建構體顯示優越的體內性質。
舉例來說，如實例所示，接合不同接合部位可導致不同的ADC特徵，諸如生物物理性質(例如疏水性)、生物穩定性、可接合性、以及ADC療效(例如載荷物釋放動力學以及ADC代謝)。
疏水性的連接子-載荷物，諸如實例中使用之vc-101，對ADC造成特別挑戰。已有報導，血漿清除速 率隨連接子-載荷物的疏水性增加而增加，導致體內療效降低。因此，已有提出降低整體疏水性可改善體內PK(Lyon et al,Nature Biotechnology 33,733-735(2015))。然而，本發明人經由一系列的實驗觀察到，降低疏水性並不一定與改善PK相關。實際上，在許多情況下，疏水性並不是良好PK特性的可靠預測指標。此外，基於Cys之部位專一性接合物的PK特性與轉麩醯胺酶接合物之行為不同。因此，需要新的設計方案與準則來評估理想的接合部位。
發明人的結構試驗提供一些選擇理想接合部位的初步見解。例如，在特定部位的ADC接合可能改變Fc結構域的結構，或可能因為此部位之載荷物的幾何形狀而干擾抗體的醣基化。另外，某些接合部位可提供適當的表面暴露平衡：其暴露的表面足以允許藥物之接合，但不致於過度暴露致使該藥物在體內代謝並且自血漿中過快清除。基於結構試驗，許多候選部位被識別為有潛力的接合部位(例如，重鏈290、392，輕鏈183)。
在結構試驗之後，設計並進行額外的檢定。值得注意的是，本發明人評估的幾個接合部位中，與其他接合部位相比，位置290一開始沒有顯示出優越的性質。例如，基於小鼠模型之體內藥物動力學(PK)資料無法建議位置290是特別理想的。然而，來自馬來猴的體內PK資料令人驚訝地顯示，在位置290接合的ADC分子具有優越的PK特性，讓該接合部位在臨床應用上更有利。部位 290的優點不能根據連接子-載荷物的疏水性來預測。
其他也提供優越體內PK特性的接合部位包括392(重鏈)與183(輕鏈)。
除了有利的體內PK，Cys-290接合物亦顯示非常低度的高分子量(HMW)聚集，以及有利的抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)。特別地，已有報告指出接合事件通常導致喪失ADCC功能。例如，抗CD70(SGN-70A ADC的抗體組分)已顯示ADCC、抗體依賴性細胞性吞噬作用(ADCP)、和補體依賴性細胞毒性(CDC)等功能。儘管如此，抗CD70-MMAF接合物缺乏FcγR結合(Kim et al,Biomol Ther(Seoul).2015 Nov；23(6)：493-509)。相反的，此處揭示之Cys-290 ADC接合物的ADCC功能並未受損。
另外，在本文中例示的血液學與顯微資料顯示，使用Cys-290之部位專一性接合，與習知接合物相比，亦改善ADC(例如，Ab-vc0101)誘導之毒性(諸如嗜中性白血球減少症以及骨髓毒性)。
最終，在本文中提供的實例亦顯示，視ADC分子的特定應用而定，數個候選接合部位可用來解決特定問題。例如，某些部位提供較佳的載荷物代謝，一些部位降低分子的整體疏水性，以及一些部位允許更快或更慢的連接子切割。這些首選的接合部位可被用來優化ADC分子。見實施例21及22。
1.抗體-藥物接合物(ADC)
ADC包含通常經由使用連接子與載荷藥物接合的抗體組分。習知的ADC接合策略倚賴經由在抗體重鏈及/或輕鏈上內源性發現的離胺酸或半胱胺酸，將載荷藥物隨機接合至抗體上。因此，如此得到的ADC為顯示不同藥物：抗體比(DAR)之物種的異質性混合物。相反地，此處揭示之ADC為部位專一性ADC，其在抗體重鏈及/或輕鏈上特定建構的殘基處，將載荷藥物接合至抗體。因此，部位專一性ADC是包含具有明確藥物：抗體比(DAR)之物種的均質性ADC族群。因此，部位專一性ADC顯示一致的化學計量，導致改善的接合物藥物動力學、生物分佈與安全特性。本發明的ADC包括與連接子及/或載荷物接合的本發明之抗體及多肽。
本發明提供式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中
(a)Ab係與抗原結合之抗體或其抗原結合片段，且(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物。
本發明亦包含式Ab-(L-D)p之抗體藥物接合物，其中(a)Ab係與HER2結合之抗體或其抗原結合片段，(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物，且(c)p係連接至抗體的連接子/藥物部分之數目。對於部位專一性ADC，由於ADC的均質性，p係整數。在一些實施例中，p係4。在其他實施例中，p係3。 在其他實施例中，p係2。在其他實施例中，p係1。在其他實施例中，p係大於4。
A.抗體及接合部位
本發明的多肽及及抗體以部位專一性方式與載荷物接合。為了順應這種型態的接合，恆定結構域係經修飾，以提供經建構在一或多個專一性部位之反應性半胱胺酸殘基(有時稱為「Cys」突變物)。亦揭示可用於基於轉麩醯胺酶接合之抗體，其中含有醯基供體麩醯胺酸之標籤或內源性麩醯胺酸係於轉麩醯胺酶及胺存在下藉由多肽建構而成為反應性。
一般來說，抗體重鏈或輕鏈中的區域係基於各種類別成員之區域內之相對缺乏序列變異，而經定義為「恆定」(C)區「可變」(V)區。抗體之恆定區可指稱不論是單獨或組合的抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。恆定結構域並不直接涉及抗體與抗原之結合，但是其展現多種效應功能，諸如Fc受體(FcR)結合、抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)中之抗體參與、調理作用、啟動補體依賴性細胞毒性、以及肥胖細胞去顆粒化。
抗體重鏈與輕鏈的恆定區與可變區經摺疊成結構域。免疫球蛋白輕鏈上的恆定區通常稱為「CL結構域」。重鏈上的恆定結構域(例如絞鏈、CH1、CH2或CH3結構域)稱為「CH結構域」。本發明的多肽或抗體(或其片段)的恆定區可能衍生自IgA、IgD、IgE、IgG、 IgM、或其任一同型以及其亞型和突變版本中之任一者之恆定區。
CH1結構域包括免疫球蛋白重鏈之第一個(最胺基端)恆定區結構域，其例如根據卡巴之EU指數編號自約位置118延伸至215。CH1結構域鄰近VH結構域以及免疫球蛋白重鏈分子之絞鏈區的胺基端，且並不形成免疫球蛋白重鏈之Fc區的一部份。
絞鏈區包括連接CH1結構域至CH2結構域的重鏈分子部分。此絞鏈區包含大約25個殘基並且可彎折，因此允許兩個N端抗原結合區可獨立地移動。絞鏈區可以細分成三個不同的結構域：上、中、和下絞鏈結構域。
CH2結構域包括例如依據卡巴之EU指數編號自約位置231延伸至340之免疫球蛋白分子重鏈的部份。CH2結構域很特別，因為其不與另一結構域緊密配對。反而有兩條N-連接分支碳水化合物鏈插入完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。在某些實施例中，本發明之多肽或抗體(或其片段)包含衍生自IgG分子(諸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之CH2結構域。在某些實施例中，IgG係人IgG。
CH3結構域包括自CH2結構域之N端延伸大約110個殘基之免疫球蛋白分子重鏈的部份，例如依據卡巴之EU指數編號自約位置341至447。CH3結構域基本上形成抗體的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可 從CH3結構域延伸另外的結構域以形成分子的C端部分(例如，IgM的μ鏈以及IgE的ε鏈中的CH4結構域)。在某些實施例中，本發明之多肽或抗體(或其片段)包含衍生自IgG分子(諸如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)之CH3結構域。在某些實施例中，IgG係人IgG。
CL結構域包括例如根據卡巴之EU指數編號自約位置108延伸至214之免疫球蛋白輕鏈之恆定區結構域。CL結構域鄰近VL結構域。在某些實施例中，本發明之多肽或抗體(或其片段)包含κ輕鏈恆定結構域(CLκ)。在某些實施例中，本發明之多肽或抗體(或其片段)包含λ輕鏈恆定結構域(CLλ)。CLκ具有已知多形性基因座CLκ-V/A45及CLκ-L/V83(使用卡巴編號)，因此允許多形性Km(1)：CLκ-V45/L83；Km(1,2)：CLκ-A45/L83；及Km(3)：CLκ-A45/V83。本發明之多肽、抗體及ADC可具有含有任何這些輕鏈恆定區之抗體組分。
Fc區通常包含CH2結構域及CH3結構域。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能不同，人IgG重鏈Ec區通常被定義為從Cys226或Pro230位置(依據卡巴之EU指數編號)之胺基酸殘基至彼之羧基端之片段。本發明之「Fc區」可能為天然序列Fc區或變異體Fc區。
在一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含依據卡巴之EU指數編號位置290上經取代的半胱胺酸殘基之抗體重鏈恆定結構域。如本文所公開與舉例，位置290的接合提供令人驚奇地期望的體內PK特性。
可以引入另外的半胱胺酸取代，如位置118、246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、375、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、444、或其任何組合(根據卡巴之EU指數編號)。特別是，可使用位置118、334、347、373、375、380、388、392、421、443或彼等之任何組合。殘基118在實例中亦稱為A114、A114C、C114、或114C，因為此部位之最初發表係使用卡巴編號(114)而非EU指數(118)，且自當時起已通常被該領域稱為114部位。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴之EU指數編號的位置183上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基76的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或彼等之任何組合的位置上之經建構之半 胱胺酸殘基；(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63(κ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基4、42、81、100、103或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(iii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：64(λ輕鏈)併列時，在對應SEQ ID NO：64之殘基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或彼等之任何組合的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體κ輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的111、149、188、207、210或彼等之任何組合(較佳為111或210)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基4、42、81、100、103或彼等之任何組合(較佳為殘基4或103)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體λ輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或彼等之任何組合(較佳為110、111、125、149、或155)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：64對齊時，在對應SEQ ID NO：64之殘基4、5、19、43、49、52、55、 78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或彼等之任何組合(較佳為殘基4、5、19、43、或49)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
胺基酸修飾可藉由該領域已知之任何方法進行，許多該等方法為該領域之技藝人士所廣為周知及例行。例如(但無限制之意)，胺基酸取代、刪除及插入可利用任何廣為周知之基於PCR之技術完成。胺基酸取代可藉由定點突變形成進行(見例如Zoller and Smith,1982,Nucl.Acids Res.10：6487-6500；及Kunkel,1985,PNAS 82：488)。
在需要維持抗原結合的應用中，此類修飾應該發生在不會擾亂抗體之抗原結合能力的部位。在首選的實施例中，該一或多個修飾係發生在重鏈和/或輕鏈之恆定區中。
通常，該抗體對目標之KD相較於對另一非目標分子諸如，但不限於，環境中之不相關物質或隨附物質之KD將小於2倍、較佳地小於5倍、更佳地小於10倍。更佳地，該KD相較於對非目標分子之KD將小於50倍，諸如小於100倍，或小於200倍；甚至更佳地小於500倍，諸如小於1,000倍或小於10,000倍。
此解離常數之值可藉由廣為周知之方法直接測定，甚至可計算複雜混合物之解離常數，例如藉由該些於Caceci et al.,1984,Byte 9：340-362中提出的方法。例如，KD可利用雙過濾硝化纖維素膜結合檢定建立，諸如 由Wong and Lohman,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432所揭示者。其他用於評估配體諸如抗體對目標的結合能力的標準檢定係該領域已知，包括例如ELISA、西方墨點分析、RIA、及流式細胞分析。抗體之結合動力學及結合親和性亦可藉由該領域已知之標準檢定評估，諸如使用BiacoreTM系統之表面電漿共振(SPR)。
可進行競爭性結合檢定，其中抗體與目標之結合係與該目標與該目標之另一配體(諸如另一抗體)之結合比較。發生百分之50結合抑制之濃度稱為Ki。在理想條件下，Ki等於KD。Ki值絕不會小於KD，因此可方便地以Ki之測量值取代以提供KD之上限。
本發明之抗體可具有對其目標不大於約1×10-3M之KD，諸如不大於約1×10-3M、不大於約9×10-4M、不大於約8×10-4M、不大於約7×10-4M、不大於約6×10-4M、不大於約5×10-4M、不大於約4×10-4M、不大於約3×10-4M、不大於約2×10-4M、不大於約1×10-4M、不大於約9×10-5M、不大於約8×10-5M、不大於約7×10-5M、不大於約6×10-5M、不大於約5×10-5M、不大於約4×10-5M、不大於約3×10-5M、不大於約2×10-5M、不大於約1×10-5M、不大於約9×10-6M、不大於約8×10-6M、不大於約7×10-6M、不大於約6×10-6M、不大於約5×10-6M、不大於約4×10-6M、不大於約3×10-6M、不大於約2×10-6M、不大於約1×10-6M、不大於約9×10-7M、不大於約8×10-7M、不大於約7×10-7M、不大於約6×10-7M、 不大於約5×10-7M、不大於約4×10-7M、不大於約3×10-7M、不大於約2×10-7M、不大於約1×10-7M、不大於約9×10-8M、不大於約8×10-8M、不大於約7×10-8M、不大於約6×10-8M、不大於約5×10-8M、不大於約4×10-8M、不大於約3×10-8M、不大於約2×10-8M、不大於約1×10-8M、不大於約9×10-9M、不大於約8×10-9M、不大於約7×10-9M、不大於約6×10-9M、不大於約5×10-9M、不大於約4×10-9M、不大於約3×10-9M、不大於約2×10-9M、不大於約1×10-9M、自約1×10-3M至約1×10-13M、1×10-4M至約1×10-13M、1×10-5M至約1×10-13M、自約1×10-6M至約1×10-13M、自約1×10-7M至約1×10-13M、自約1×10-8M至約1×10-13M、自約1×10-9M至約1×10-13M、1×10-3M至約1×10-12M、1×10-4M至約1×10-12M、自約1×10-5M至約1×10-12M、自約1×10-6M至約1×10-12M、自約1×10-7M至約1×10-12M、自約1×10-8M至約1×10-12M、自約1×10-9M至約1×10-12M、1×10-3M至約1×10-11M、1×10-4M至約1×10-11M、自約1×10-5M至約1×10-11M、自約1×10-6M至約1×10-11M、自約1×10-7M至約1×10-11M、自約1×10-8M至約1×10-11M、自約1×10-9M至約1×10-11M、1×10-3M至約1×10-10M、1×10-4M至約1×10-10M、自約1×10-5M至約1×10-10M、自約1×10-6M至約1×10-10M、自約1×10-7M至約1×10-10M、自約1×10-8M至約1×10-10M、或自約1×10-9M至約1×10-10M。
[131]雖然一般來說，希望在奈莫耳範圍的KD，在某些實施例中，低親和性抗體可能較佳，例如為了標靶區室中之高度表現受體並避免非標靶之結合。另外，一些治療應用可受益於具有較低結合親和性的抗體以促進抗體再循環。
本揭露之抗體應維持對其天然對應物之抗原結合能力。在一實施例中，本揭露之抗體與Cys取代前之抗體相比展現基本上相同的親和性。在另一實施例中，本揭露之抗體與Cys取代前之抗體相比展現減少的親和性。在另一實施例中，本揭露之抗體與Cys取代前之抗體相比展現增加的親和性。
在一實施例中，本揭露之抗體可能具有與Cys取代前之抗體的解離常數(KD)大約相等之KD。在一實施例中，本揭露之抗體對其同源抗原可能具有與Cys取代前之抗體的解離常數(KD)相比，高出約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、或約1000倍的KD。
在又另一實施例中，本揭露之抗體對其同源抗原可能具有與Cys取代前之抗體的KD相比，較低約1倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700 倍、約800倍、約900倍、或約1000倍的KD。
編碼用於製備本發明之ADC之抗體重鏈與輕鏈的核酸可被選殖到載體中以供表現或增殖。編碼該感興趣之抗體的序列可被維持於宿主細胞中之載體，接著該宿主細胞可被擴增及冷凍以供將來使用。
表1提供用於建構本發明之部位專一性ADC的人化HER2抗體的胺基酸(蛋白質)序列。所示之CDR係經卡巴編號定義。
表1中所示之抗體重鏈與輕鏈具有曲妥珠單抗重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。重鏈恆定區與輕鏈恆定區係衍生自曲妥珠單抗並含有一或多個修飾以於製備本發明之ADC時允許部位專一性接合。
為允許部位專一性接合而對抗體恆定區中之胺基酸序列進行之修飾係經畫底線及粗體標記。對於衍生自曲妥珠單抗之抗體的命名法係T(代表trastuzumab)，然後接修飾胺基酸的位置，該位置前後以代表野生型殘基的單字母胺基酸代碼以及現在位於衍生抗體的該位置中之殘基的單字母胺基酸代碼包夾。此命名法的兩個例外是「kK183C」和「LCQ05」，前者表示在輕(κ)鏈上之位置183已從離胺酸修飾為半胱胺酸，而後者表示含有麩醯胺酸之八個胺基酸標籤已被連接至輕鏈恆定區之C端。
表1中所示之一個修飾不用於接合。重鏈位置222(使用卡巴之EU指數)上的殘基可經改變，以導致更均質的抗體與載荷物接合物、抗體與載荷物之間更好的 分子間交聯、及/或顯著減少鏈間交聯。
Figure 109127593-A0101-12-0063-471
Figure 109127593-A0101-12-0064-472
Figure 109127593-A0101-12-0065-473
Figure 109127593-A0101-12-0066-474
Figure 109127593-A0101-12-0067-475
ADC可利用針對任何抗原的抗體組份，使用部位專一性接合，經由單獨在位置290(根據卡巴之EU指數)上或與其他位置組合之經建構之半胱胺酸製造。
在一些實施例中，抗原結合結構域(即具有所有6個CDR的可變區，或與抗體可變區具有至少百分之90同一性的相等區)，由以下組成之群組：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿巴西普(abatacept)(ORENCIA®)、阿昔單 抗(abciximab)(REOPRO®、c7E3 Fab)、阿達木單抗(Adalimumab)(HUMIRA®)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿來組單抗(alemtuzumab)(CAMPATH®、MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿非莫單抗(afelimomab)、麻安莫單抗(anatumomab mafenatox)、阿尼圖莫單抗(anetumumab)、安廬金珠單抗(anrukizumab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、阿利珠單抗(atlizumab)、阿托木單抗(atorolimumab)、巴品珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)(SIMULECT®)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)(LYMPHOSCAN®)、貝利丹抗(belimumab)(LYMPHO-STAT-B®)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝西索單抗(besilesomab)、βcept(ENBREL®)、貝伐珠單抗(bevacizumab)(AVASTIN®)、比西單抗-溴烯比妥(biciromab brallobarbital)、比佛珠單抗-美登素(bivatuzumab mertansine)、貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)(ADCETRIS®)、卡那單抗(canakinumab)(ACZ885)、美坎珠單抗(cantuzumab mertansine)、卡羅單抗(capromab)(PROSTASCINT®)、卡妥索單抗(catumaxomab)(REMOV AB®)、西利珠單抗(cedelizumab)(CIMZIA®)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX®)、克立昔單抗(clenoliximab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達昔單抗(dacliximab)、達利珠單抗(daclizumab)(ZENAP AX(®)、 地諾單抗(denosumab)(AMG 162)、地莫單抗(detumomab)、阿托度單抗(dorlimomab aritox)、多利昔單抗(dorlixizumab)、丹圖木單抗(duntumumab)、杜利木單抗(durimulumab)、杜木路單抗(durmulumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、依庫珠單抗(eculizumab)(SOLIRIS®)、埃巴單抗(edobacomab)、依決洛單抗(edrecolomab)(Mab17-1A、PANOREX®)、依法利珠單抗(efalizumab)(RAPTIVA®)、依芬古單抗(efungumab)(MYCOGRAB®)、艾西莫單抗(elsilimomab)、培戈賴莫單抗(enlimomab pegol)、西艾匹莫單抗(epitumomab cituxetan)、依法利珠單抗(efalizumab)、依匹莫單抗(epitumomab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)(REXOMUN®)、埃達珠單抗(etaracizumab)(etaratuzumab、VITAXIN®、ABEGRINTM)、艾偉單抗(exbivirumab)、法索單抗(fanolesomab)(NEUTROSPEC®)、法拉莫單抗(faralimomab)、非維珠單抗(felvizumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)(HUZAF®)、加利昔單抗(galiximab)、羅氏單抗(gantenerumab)、加維莫單抗(gavilimomab)(ABX-CBL(R))、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG®)、戈利木單抗(golimumab)(CNTO 148)、魯昔單抗(gomiliximab)、伊巴珠單抗(ibalizumab)(TNX-355)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(ZEVALIN®)、伊戈伏單抗(igovomab)、英西單抗(imciromab)、英利昔單抗(infliximab)(REMICAD E®)、伊 諾莫單抗(inolimomab)、伊珠單抗奧加米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)(YERVOY®、MDX-010)、伊妥木單抗(iratumumab)、凱利昔單抗(keliximab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來馬索單抗(lemalesomab)、來布珠單抗(lebrilizumab)、樂德木單抗(lerdelimumab)、來沙木單抗(lexatumumab)(HGS-ETR2、ETR2-ST01)、來昔木單抗(lexitumumab)、利偉單抗(libivirumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、馬帕木單抗(mapatumumab)(HGS-ETR1、TRM-I)、馬司莫單抗(maslimomab)、馬妥珠單抗(matuzumab)(EMD72000)、美泊利單抗(mepolizumab)(BOSATRIA®)、美替木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫羅木單抗(morolimumab)、莫維珠單抗(motavizumab)(NUMAXTM)、莫羅單抗(muromonab)(OKT3)、他那可單抗(nacolomab tafenatox)、他那莫單抗(naptumomab estafenatox)、那他珠單抗(natalizumab)(TYSABRI®、ANTEGREN®)、奈巴庫單抗(nebacumab)、奈瑞莫單抗(nerelimomab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)(THERACIM hR3®、THERA-CIM-hR3®、THERALOC®)、巰諾莫單抗(nofetumomab merpentan)(VERLUMA®)、奧克利丹抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗(odulimomab)、歐福杜單抗(ofatumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)(XOLAIR®)、奧戈伏單抗 (oregovomab)(OVAREX®)、奧昔珠單抗(otelixizumab)、帕吉昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗(palivizumab)(SYNAGIS®)、帕尼單抗(panitumumab)(ABX-EGF、VECTIBIX®)、帕考珠單抗(pascolizumab)、潘圖莫單抗(pemtumomab)(THERAGYN®)、帕妥珠單抗(pertuzumab)(2C4、OMNITARG®)、培克珠單抗(pexelizumab)、平妥單抗(pintumomab)、彭尼珠單抗(ponezumab)、普利昔單抗(priliximab)、普托木單抗(pritumumab)、來尼珠單抗(ranibizumab)(LUCENTIS®)、拉巴庫單抗(raxibacumab)、瑞加偉單抗(regavirumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥昔單抗(rituximab)(RITUXAN®、MabTHERA®)、羅維珠單抗(rovelizumab)、盧利珠單抗(ruplizumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司偉單抗(sevirumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、西利珠單抗(siplizumab)(MEDI-507)、索土珠單抗(sontuzumab)、司他蘆單抗(stamulumab)(Myo-029)、硫索單抗(sulesomab)(LEUKOSCAN®)、他珠單抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、帕他普莫單抗(taplitumomab paptox)、特非珠單抗(tefibazumab)(AUREXIS®)、阿替莫單抗(telimomab aritox)、替奈昔單抗(teneliximab)、替利珠單抗(teplizumab)、替西莫單抗(ticilimumab)、托珠單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®)、托利珠單抗(toralizumab)、妥司莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲美木單抗(tremelimumab)(CP-675,206)、西莫白介素單抗 (tucotuzumab celmoleukin)、妥偉單抗(tuvirumab)、烏珠單抗(urtoxazumab)、優特克單抗(ustekinumab)(CNTO 1275)、伐利昔單抗(vapaliximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗(vepalimomab)、維西珠單抗(visilizumab)(NUVION®)、伏洛昔單抗(volociximab)(M200)、伏妥莫單抗(votumumab)(HUMASPECT®)、扎魯木單抗(zalutumumab)、扎木單抗(zanolimumab)(HuMAX-CD4)、齊拉木單抗(ziralimumab)、或阿佐莫單抗(zolimomab aritox)。
在一些實施例中，抗原結合結構域包含具有六個CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，且/或與選自前述清單之抗體競爭結合。在一些實施例中，抗原結合結構域結合至與前述清單之抗體相同之表位。在一些實施例中，抗原結合結構域包含總共具有六個CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，且結合至與前述清單之抗體相同之抗原。
在一些實施例中，抗原結合結構域包含總共具有六個(6)CDR之重鏈及輕鏈可變結構域，且與選自由以下所組成之群組的抗原專一性結合：PDGFRα、PDGFRβ、PDGF、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、FGF、FGF2、HGF、KDR、FLT-1、FLK-1、Ang-2、Ang-1、PLGF、CEA、CXCL13、BAFF、IL-21、CCL21、TNF-α、CXCL12、SDF-I、bFGF、MAC-I、IL23p19、FPR、IGFBP4、CXCR3、TLR4、CXCR2、 EphA2、EphA4、EphrinB2、EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)、HER4 ErbB4或tyro2)、SC1、LRP5、LRP6、RAGE、s100A8、s100A9、Nav1.7、GLP1、RSV、RSV F蛋白質、流感HA蛋白質、流感NA蛋白質、HMGB1、CD16、CD19、CD20、CD21、CD28、CD32、CD32b、CD64、CD79、CD22、ICAM-I、FGFR1、FGFR2、HDGF、EphB4、GITR、β-類澱粉蛋白、hMPV、PIV-I、PIV-2、OX40L、IGFBP3、cMet、PD-I、PLGF、Neprolysin、CTD、IL-18、IL-6、CXCL-13、IL-IRI、IL-15、IL-4R、IgE、PAI-I、NGF、EphA2、uPARt、DLL-4、αvβ5、αvβ6、α5β1、α3β1、干擾素受體I型及II型、CD 19、ICOS、IL-17、因子II、Hsp90、IGF、IGF-I、IGF-II、CD 19、GM-CSFR、PIV-3、CMV、IL-13、IL-9、及EBV。
在一些實施例中，抗原結合結構域與TNF超家族之成員(受體或配體)專一性結合。TNF超家族成員可選自包括但不限於下列之群組：腫瘤壞死因子-α(「TNF-α」)、腫瘤壞死因子-β(「TNF-β」)、淋巴毒素-α(「LT-α」)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、4-1 BB配體、Apo-1配體(也稱為Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱為TRAIL)、Apo-3配體(也稱為TWEAK)、骨保護因子(OPG)、APRIL、RANK配體(也稱為TRANCE)、TALL-I(也稱為BIyS、BAFF或THANK)、DR4、DR5(也稱為Apo-2、TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、 TRICK2、或KILLER)、DR6、DcR1、DcR2、DcR3(也稱為TR6或M68)、CAR1、HVEM(也稱為ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-I、TNFL1、CD30、LTBr、4-1BB受體和TR9。
在一些實施例中，抗原結合結構域能與選自包括但不限於下列之群組的一或多個目標結合：5T4、ABL、ABCB5、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、AD0RA2A、聚集蛋白聚醣(Aggrecan)、AGR2、AICDA、AIFI、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、血管生成素(ANG)、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、膜聯蛋白A2(Annexin A2)、ANPEP、APC、APOC1、AR、芳香酶、ATX、AX1、AZGP1(鋅-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDF1O)、BMP4、BMP6、BMP7、BMP8、BMP9、BMP11、BMP12、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(網蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI 1(嗜酸性球趨化因子(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、遷離蛋白(exodus)-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CD1C、CD20、CD200、CD-22、CD24、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G,CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD46、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD105、CD137、CDH1(E-鈣黏素)、CDCP1CDH10、CDH12、CDH13、CDH18,CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、幾丁酵素(Chitinase)、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(緊密連接蛋白-7)、CLN3、CLU(簇蛋白(clusterin))、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CNR1、COL1 8A1、COL1A1.COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTL8、CTNNB1(b-連環蛋白)、CTSB(細胞自溶酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL 14,CXCL 16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、Cyr61、CYSLTR1、c-Met、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、ECGF15EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、ELAC2、ENG、內皮糖蛋白、ENO1、EN02、EN03、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA1O、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRIN-A3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRTN-B3、EPHB4,EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受體、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、法呢基轉移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21(諸如mimAb1)、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纖網蛋白(fibronectin))、FLT1、FLT-3、FOS、FOSL1(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GD3、GDF5、GDF8、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR1O)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、骨形態蛋白(gremlin)、GRP、GSN(膠溶素(Gelsolin))、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、刺蝟(Hedgehog)、HGF、HIF1A、HIP1、組織胺和組織胺受體、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-I、IL1O、IL1ORA、IL1ORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL1 IRA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、 IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、IL1HY1、IL1R1、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、IL1RN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23,DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4,IL4R、IL6ST(醣蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAKI、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整合素)、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KIM-1、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(頭髮特異性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦體素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LRP5、LRP6、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-I、MDK、MIB1、中期因子蛋白(midkine)、MIF、MISRII、MJP-2、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金屬硫蛋白-Ui)、mTOR、MTSS1、MUC1(黏蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神經蛋白聚醣(neurocan)、神經調節蛋白-1(neuregulin-1)、神經氈蛋白- 1(neuropilin-1)、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、N0X5、NPPB、NROB1、NR0B2、NR1D1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、OCT-1、ODZ1、OPN1、OPN2、OPRD1、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、peg-天冬醯胺酶、PF4(CXCL4)、神經叢蛋白B2(PLXNB2)、PGF、PGR、磷酸黏蛋白、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG5PLXDC1、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、pro-NGF、鞘脂激活蛋白原、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配體、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI10(ZNF144)、Ron、R0B02、RXR、選滯蛋白(selectin)、S100A2、S100A8、S100A9、SCGB 1D2(親脂素B(lipophilin B))、SCGB2A1(乳腺球蛋白2(mammaglobin 2))、SCGB2A2(乳腺球蛋白1(mammaglobin 1))、SCYE1(內皮單核細胞活化細胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺絲胺酸蛋白酶抑制劑(maspin))、SERPINE1(PAI-I)、 SERPINF1、SHIP-I、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、SULF-1、Sulf-2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反應蛋白-1)、THBS2/THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、組織因子、TIKI2、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6JLR7、TLR8、TLR9、TM4SF1、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B,TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF 18、TNFSF4(OX40配體)、TNFSF5(CD40配體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配體)、TNFSF8(CD30配體)、TNFSF9(4-1BB配體)、TOLLIP、Toll樣受體、TLR2、TLR4、TLR9、T0P2A(拓樸異構酶Iia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TRPC6、TROY、TSLP、TWEAK、酪胺酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖(versican)、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(淋巴細胞趨化因子 (lymphotactin))、XCL2(SCM-Ib)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、YY1、和ZFPM2。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與纖網蛋白(FN)之外結構域B(EDB)結合。FN-EDB係91個胺基酸的小型結構域，可經由替代剪接的機制插入纖網蛋白分子中。FN-EDB的胺基酸序列在人、馬來侯、大鼠和小鼠之間是100%保守的。FN-EDB在胚胎發育過程中過度表現並且廣泛表現在人類癌中，但幾乎無法在正常成人組織(女性生殖組織除外)中偵測出。
在某些實施例中，在本文中所述之抗體或其抗原結合片段包含以下重鏈CDR序列：(i)VH互補決定區1(CDR-H1)，其與SEQ ID NO：66或67享有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性；CDR-H2，其與SEQ ID NO：68或69享有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性；以及CDR-H3，其與SEQ ID NO：70享有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性；和/或(ii)以下輕鏈CDR序列：VL互補決定區1(CDR-L1)，其與SEQ ID NO：73享有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性；CDR-L2，其與SEQ ID NO：74享有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性；以及CDR-L3，其與SEQ ID NO：75享有至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、或至少95%之同一性。
在某些實施例中，在本文中所述之抗體或其抗原結合片段包含(i)重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO：65具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性的胺基酸序列，及/或(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO：72具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性的胺基酸序列。這些VL和VH序列的任何組合也包含在本發明中。
在某些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合片段包含Fc結構域。Fc結構域可衍生自IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG、IgE、或IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)。
在某些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合片段包含(i)重鏈，其包含與SEQ ID NO：71或77具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性的胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈，其包含與SEQ ID NO：76或78具有至少50%、至 少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一性的胺基酸序列。這些重鏈和輕鏈序列的任何組合也包含在本發明中。
本發明亦提供與本文中所述之任一抗EDB抗體或其抗原結合片段(諸如表33中所列任一抗體或其抗原結合片段)競爭結合EDB的抗體或其抗原結合片段。
本發明提供編碼本文中所述之經建構的多肽的核酸。本發明亦提供編碼包含本文中所述之經建構的多肽的抗體的核酸。
本發明亦提供包含編碼本文中所述之經建構的多肽的核酸之宿主細胞。本發明亦提供包含編碼包含本文中所述之經建構的多肽的抗體的核酸之宿主細胞。
本發明提供編碼此處揭示之任一種HER2抗體之抗體或彼之抗原結合片段的核酸，以及包含該核酸的宿主細胞。
本發明提供編碼此處揭示之任一種抗EDB抗體之抗體或彼之抗原結合片段的核酸，以及包含該核酸的宿主細胞。
本發明提供產製本文中所述之經建構的多肽，或包含該經建構的多肽之抗體或其抗原結合部分的方法。該方法包含在表現該多肽、該抗體、或其抗原結合部分的適當條件下培養宿主細胞，以及單離該多肽、或該抗 體或抗原結合片段。
B.藥物
可用於製備本發明之部位專一性ADC的藥物包括可用於治療癌的任何治療劑，其包括但不限於細胞毒性劑、細胞靜止劑、免疫調節劑和化學治療劑。細胞毒性效應係指除盡、消除及/或殺死目標細胞(即腫瘤細胞)。細胞毒性劑係指對細胞具有細胞毒性效應之劑。細胞靜止效應係指抑制細胞增生。細胞靜止劑係指對細胞具有細胞靜止效應之劑，藉以抑制特定細胞亞群(即腫瘤細胞)之生長及/或擴張。免疫調節劑係指經由產生細胞激素及/或抗體及/或調節T細胞功能來刺激免疫反應，藉以直接抑制或減少細胞亞群的生長(即腫瘤細胞)或間接地藉由允許另一劑更有療效以抑制或減少細胞亞群的生長(即腫瘤細胞)之劑。化學治療劑係指可用於治療癌之化學化合物之劑。藥物也可能為藥物衍生物，其中藥物已經被官能化以能夠與本發明的抗體接合。
在一些實施例中，藥物係膜穿透性藥物。在此類實施例中，載荷物可以誘發旁路效應，其中原本內化ADC之細胞周圍的細胞被載荷物殺滅。這發生在當載荷物自抗體釋放(即藉由切割可切割之連接子)並穿過細胞膜時，藉由擴散誘導殺滅周圍的細胞。
根據經揭示的方法，藥物係用於製備式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中(a)Ab係與特定目標結合 之抗體；且(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物。
藥物對抗體比(DAR)或藥物裝載指示每個抗體接合的藥物(D)分子的數目。本發明的抗體藥物接合物使用部位專一性接合致使在ADC組成物中基本上為具有一個DAR的均質ADC族群。在一些實施例中，該DAR係1。在一些實施例中，該DAR係2。在其他實施例中，該DAR係3。在其他實施例中，該DAR係4。在其他實施例中，該DAR大於4。
使用習知接合(而不是部位專一性接合)導致不同ADC物種之異質族群，其各自具有不同的個別DAR。以這種方式製備的ADC組成物包括複數個抗體，每個抗體接合到特定數目的藥物分子。因此，該組成物具有平均DAR。T-DM1(Kadcyla®)使用習知接合至離胺酸殘基上並且具有大約4的平均DAR，其分佈寬廣包括裝載0、1、2、3、4、5、6、7、或8個藥物分子的ADC(Kim et al.,2014,Bioconj Chem 25(7)：1223-32)。
可以經由各種習知方法測定DAR，諸如UV光譜、質譜、ELISA檢定、輻射測量法、疏水性交互作用層析法(HIC)、電泳和HPLC。
在一實施例中，本發明的ADC之藥物組份係抗有絲分裂藥物。在某些實施例中，抗有絲分裂藥物可能是耳抑素(例如0101、8261、6121、8254、6780和0131；參見下表2)。在更具體的實施例中，耳抑素藥物為2-甲 基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(也稱為0101)。
耳抑素於有絲分裂期間經由抑制微管蛋白聚合而抑制微管的形成，從而抑制細胞增生。PCT國際專利公開號WO 2013/072813(全文以引用方式併入本文中)揭示了可用於製造本發明之ADC的耳抑素並且提供生產這些耳抑素的方法。
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Figure 109127593-A0101-12-0087-477
在本發明的一些態樣中，細胞毒性劑可使用脂質體或生物相容性聚合物製造。此處所述之抗體可與生物相容性聚合物接合，以增加血清半衰期及生物活性及/或延長體內半衰期。生物相容性聚合物之實例包括水溶性聚合物，諸如聚乙二醇(PEG)或彼之衍生物及含有兩性離子之生物相容性聚合物(例如含有磷醯膽鹼之聚合物)。
C.連接子
本發明之部位專一性ADC使用連接子將藥物連接或接合抗體來製備。連接子係可被用於連接藥物及抗 體以形成抗體藥物接合物(ADC)之雙官能性化合物。該等接合物允許選擇性遞送藥物至種瘤細胞。適當之連接子包括例如可切割及不可切割之連接子。可切割之連接子通常可在細胞內之條件下被切割。自抗體切割經接合藥物的主要機制包括於溶酶體的酸性pH下水解(腙、縮醛、和順烏頭酸樣醯胺(cis-aconitate-like amides))、溶酶體酶的肽切割(細胞自溶酶和其他溶酶體酶)以及還原二硫化物。由於這些不同的切割機制，將藥物連接至抗體的機制也有很大的不同，而且可以使用任何適當的連接子。
適當的可切割連接子包括但不限於可經由細胞內蛋白酶如溶酶體蛋白酶或胞內體蛋白酶切割的肽連接子，如vc和m(H20)c-vc(下表3)。在特定的實施例中，連接子係可切割的連接子，以使得該連接子一經切割後，載荷物可誘導旁路效應。旁路效應係當膜穿透性藥物自抗體釋放(即藉由切割可切割之連接子)並穿過細胞膜時，藉由擴散誘導殺滅原本內化ADC之細胞周圍的細胞。
適當的不可切割連接子包括但不限於mc、MalPeg6、Mal-PEG2C2、Mal-PEG3C2和m(H20)c(下表3)。
其他適當之連接子包括可在特定pH或pH範圍內被水解之連接子，諸如腙連接子。其他適當之可切割連接子包括二硫化物連接子。連接子可與抗體共價連接，該共價連接之程度使得抗體必須在細胞內被降解才能讓藥物被釋放，例如mc連接子及類似物。
在本發明的特定態樣中，本發明之部位專一性ADC中的連接子是可切割的，並且可為vc。
許多與抗體接合的治療劑在水中的溶解度很小(如果可溶的話)，而這可能限制藥物在接合物上的裝載，因為接合物會產生聚集。克服這點的一個方式係添加溶解(solublizing)基團至連接子。可以使用由PEG和二肽組成的連接子製造接合物，包括連接至抗體之那些具有PEG二酸、硫羥酸、或順丁烯二醯亞胺酸的連接子、二肽間隔子、以及鍵結至蒽環或雙聯黴素類似物之胺的醯胺鍵。另一實例是用含PEG的連接子製備接合物，其以雙硫鍵與細胞毒性劑連接並且以醯胺鍵與抗體連接。併入PEG基團的方式可能有利於克服聚集與藥物裝載的限制。
Figure 109127593-A0101-12-0090-478
連接子經由如表3所示之分子的左側連接至單株抗體，而藥物經由分子的右側連接。
在某些實施例中，本發明的抗體係接合硫醇反應劑，其中反應基團係例如順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫化物、或其他硫醇反應接合配偶體(Haugland,2003,Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Molecular Probes,Inc.；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3：2； Garman,1997,Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach,Academic Press,London；Means(1990)Bioconjugate Chem.1：2；Hermanson,G.in Bioconjugate Techniques(1996)Academic Press,San Diego,pp.40-55,643-671)。
在某些實施例中，本發明提供式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物，其中(a)Ab係與特定目標結合之抗體；且(b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子，且D係藥物。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含琥珀醯亞胺基團、順丁烯二醯亞胺基團、水解的琥珀醯亞胺基團、或水解的順丁烯二醯亞胺基團。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含順丁烯二醯亞胺基團或水解的順丁烯二醯亞胺基團。順丁烯二醯亞胺諸如N-乙基順丁烯二醯亞胺被視為對氫硫基有專一性，特別是在其他基團被質子化之低於7的pH值下。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(MC)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對胺基苄氧羰基(PAB)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基4(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(SMCC)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)、或6-順丁烯二醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧羰基(MC-vc-PAB)。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含式I之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0092-482
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0092-483
W係
R1係氫或C1-C8烷基；
R2係氫或C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(iii)R3A係氫或C1-C8烷基；
R3B係C1-C8烷基；
(iv)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0092-479
，
Figure 109127593-A0101-12-0092-480
或
Figure 109127593-A0101-12-0092-481
；且
R5係
R6係氫或-C1-C8烷基。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含式IIa之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0093-484
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0093-486
W係
Figure 109127593-A0101-12-0093-485
 R1係
Y係選自下列一或多個基團：-C2-C20伸烷基-、-C2-C20雜伸烷基-、-C3-C8碳環-、-伸芳基-、-C3-C8雜環-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)-、-(C3-C8碳環)-C1-C10伸烷基 -、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)-或-(C3-C8雜環)-C1-C10伸烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、
-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、及-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-；
Figure 109127593-A0101-12-0094-487
，
Figure 109127593-A0101-12-0094-488
，
Figure 109127593-A0101-12-0094-489
，
Figure 109127593-A0101-12-0094-490
，或-NH2； Z係
G係鹵素、-OH、-SH、或-S-C1-C6烷基；R2係氫或C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(iii)R3A係氫或C1-C8烷基；
且R3B係C1-C8烷基；或
(iv)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0094-491
R5係
或R6係氫或-C1-C8烷基；
R10係氫、-C1-C10烷基、-C3-C8碳環基、-芳基、-C1-C10雜烷基、-C3-C8雜環、-C1-C10伸烷基-芳基、-伸芳基-C1-C10烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)、-(C3-C8碳環)-C1-C10烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)、或-(C3-C8雜環)-C1-C10烷基，其中R10上的芳基包含經[R7]h可選地取代之芳基；
R7每次出現時係獨立選自由F、Cl、I、Br、
NO2、CN及CF3所組成之群組；且
h係1、2、3、4或5。
較佳地，Y係選自下列一或多個基團：-C2-C20伸烷基-、-C2-C20雜伸烷基-、-C3-C8碳環-、-伸芳基-、-C3-C8雜環-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)-、-(C3-C8碳環)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)-或-(C3-C8雜環)-C1-C10伸烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-、-(OCH2CH2)1-10-C1-6烷基、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、及-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-；
較佳地，Z係
Figure 109127593-A0101-12-0095-492
，
Figure 109127593-A0101-12-0095-493
，或-NH2。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含式IIb之化合物：
Figure 109127593-A0101-12-0096-494
或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物，其中下列每次獨立出現時，
Figure 109127593-A0101-12-0096-495
W係
Figure 109127593-A0101-12-0096-496
R1係
Y係-C2-C20伸烷基-、-C2-C20雜伸烷基-、-C3-C8碳環-、-伸芳基-、-C3-C8雜環-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基、-C1-C10伸烷基-(C3-C8碳環)-、-(C3-C8碳環)-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(C3-C8雜環)-、或-(C3-C8雜環)-C1-C10伸烷基-；
Figure 109127593-A0101-12-0097-500
Z係
Figure 109127593-A0101-12-0097-501
或-NH-Ab；
Ab係抗體；
R2係氫或C1-C8烷基；
R3A及R3B係下列任一者：
(iii)R3A係氫或C1-C8烷基；
R3B係C1-C8烷基；
(iv)R3A及R3B一起係C2-C8伸烷基或C1-C8雜伸烷基；
Figure 109127593-A0101-12-0097-497
，
Figure 109127593-A0101-12-0097-498
或
Figure 109127593-A0101-12-0097-499
；且
R5係
R6係氫或-C1-C8烷基。
較佳地，Z係
Figure 109127593-A0101-12-0098-502
，
Figure 109127593-A0101-12-0098-503
，
Figure 109127593-A0101-12-0098-504
，或-NH-Ab。
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含mcValCitPABC_MMAE(「vcMMAE」)：
Figure 109127593-A0101-12-0098-505
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含mcValCitPABC_MMAD(「vcMMAD」)：
Figure 109127593-A0101-12-0098-506
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含mcMMAD(「順丁烯二醯亞胺-己醯基MMAD」)：
Figure 109127593-A0101-12-0099-507
在某些實施例中，Ab-(L-D)包含mcMMAF(「順丁烯二醯亞胺-己醯基MMAF」)：
Figure 109127593-A0101-12-0099-508
式I、IIa和IIb中使用的一般用語例如烷基、烯基、鹵烷基、雜環基的定義，應根據該等用語的尋常和慣用含義來理解。特別是，這些用語在WO 2013/072813(全文以引用方式併入本文)中從第15頁21行至第18頁14行定義。
D.製備部位專一性ADC的方法
亦提供製備本發明之抗體藥物接合物的方法。例如，生產此處揭示之部位專一性ADC的製程可包括(a)將連接子與藥物連接；(b)將連接子藥物部分與抗體接合；及(c)純化抗體接合物。
本發明之ADC使用部位專一性方法將抗體與載荷藥物接合。
在一個實施例中，部位專一性接合經由經建 構至抗體恆定區中之一或多個半胱胺酸殘基發生。製備用於經由半胱胺酸殘基進行部位專一性接合的抗體之方法，可如PCT公開號WO2013/093809(全文以引用方式併入本文)所述實施。以下一或多個位置可以改變成半胱胺酸，並因此用作接合的部位：a)重鏈恆定區上之殘基246、249、265、267、270、276、278、283、290、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、327、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、及444(依據重鏈的卡巴EU指數)，及/或b)輕鏈恆定區上之殘基111、149、183、188、207、及210(依據輕鏈的卡巴編號)。
在某些實施例中，一或多個可改變為半胱胺酸之位置為：
a)重鏈恆定區上之290、334、392及/或443(依據重鏈的卡巴EU指數)，及/或b)輕鏈恆定區上之183(依據輕鏈的卡巴編號)。
在更多特定的實施例中，依據卡巴之EU指數，在重鏈恆定區上之位置290與在輕鏈恆定區上之位置183(依據卡巴編號)被改變為用於接合的半胱胺酸。
在另一實施例中，部位專一性接合經由一或多個已經建構在抗體恆定區中的醯基供體麩醯胺酸殘基發生。
製備用於經由麩醯胺酸殘基進行部位專一性接合的抗體之方法，可如PCT公開號WO2012/059882(全文以引用方式併入本文)所述實施。可使用三種不同方式建構抗體以表現用於部位專一性接合之麩醯胺酸殘基。
含有麩醯胺酸殘基的短肽標籤可經併入輕鏈及/或重鏈之數個不同位置(即N端、C端、內部)。在第一個實施例中，含有麩醯胺酸殘基的短肽標籤可經連接至重鏈及/或輕鏈的C端。一或多個下列含有麩醯胺酸之標籤可經連接以作為用於藥物接合之醯基供體：GGLLQGPP(SEQ ID NO：45)、GGLLQGG(SEQ ID NO：46)、LLQGA(SEQ ID NO：47)、GGLLQGA(SEQ ID NO：48)、LLQ、LLQGPGK(SEQ ID NO：49)、LLQGPG(SEQ ID NO：50)、LLQGPA(SEQ ID NO：51)、LLQGP(SEQ ID NO：52)、LLQP(SEQ ID NO：53)、LLQPGK(SEQ ID NO：54)、LLQGAPGK(SEQ ID NO：55)、LLQGAPG(SEQ ID NO：56)、LLQGAP(SEQ ID NO：57)、LLQX1X2X3X4X5(其中X1係G或P，其中X2係A、G、P、或不存在，其中X3係A、G、K、P、或不存在，其中X4係G、K或不存在，且其中X5係K或不存在)(SEQ ID NO：58)、或LLQX1X2X3X4X5(其中X1係任何天然發生之胺基酸且其中X2、X3、X4、及X5係任何天然發生之胺基酸或不存在)(SEQ ID NO：59)。
在某些實施例中，GGLLQGPP(SEQ ID NO：60)可能連接到輕鏈的C端。
在某些實施例中，重鏈和/或輕鏈上的殘基可能經由定點突變改變成麩醯胺酸殘基。在某些實施例中，重鏈上位置297(使用卡巴之EU指數)的殘基可能經改變成麩醯胺酸(Q)並且因此用作接合的部位。
在某些實施例中，重鏈或輕鏈上的殘基可能經改變導致該位置之去醣基化，使得一或多個內源性麩醯胺酸變成可接近/可反應而用於接合。在某些實施例中，重鏈上位置297(使用卡巴之EU指數)的殘基可能經改變成丙胺酸(A)。在這種情況下，在重鏈位置295上的麩醯胺酸(Q)便能夠用於接合。
形成接合物的最佳反應條件可憑經驗藉由改變反應變數如溫度、pH、連接子-載荷物部分輸入、及添加物濃度來判定。接合其他藥物的適當條件可以由該領域之技藝人士於無需過度實驗的情況下判定。經由經建構之半胱胺酸殘基進行部位專一性接合係於以下實例5A中例示。經由經建構之麩醯胺酸殘基進行部位專一性接合係於以下實例5B中例示。
為了進一步增加每個抗體藥物接合物的藥物分子數目，可將藥物與聚乙二醇(PEG)(包括直鏈或分支的聚乙二醇聚合物及單體)接合。PEG單體具有式：-(CH2CH2O)-。藥物和/或肽類似物可直接或間接(即經由適當的間隔子基團，如糖)與PEG結合。PEG-抗體藥物組成物也可包括另外的親脂性及/或親水性部分，以促進藥物穩定性及在體內遞送至目標部位。製備含PEG組成物的 代表性方法可見例如美國專利第6,461,603；6,309,633；及5,648,095號。
接合後，可使用習知方法，將接合物自未接合的反應物及/或聚集形式的接合物中分離與純化出來。此可包括如粒徑排阻層析法(SEC)、超過濾/滲濾法、離子交換層析法(IEC)、層析聚焦(CF)HPLC、FPLC、或Sephacryl S-200層析法之製程。分離程序也可經由疏水性交互作用層析法(HIC)完成。合適的HIC介質包括Phenyl Sepharose 6 Fast Flow層析介質、Butyl Sepharose 4 Fast Flow層析介質、Octyl Sepharose 4 Fast Flow層析介質、Toyopearl Ether-650M層析介質、Macro-Prep甲基HIC介質或Macro-Prep三級丁基HIC介質。
表4顯示在實例部分中用於產生資料的HER2 ADC。表4中顯示的部位專一性HER2 ADC(第1至17列)為本發明之部位專一性ADC的實例。
為了製備本發明之部位專一性ADC，此處揭示之任何抗體可經由此處揭示之任何連接子，使用部位專一性技術接合此處揭示之任何藥物。在某些實施例中，連接子係可切割的(例如vc)。在某些實施例中，藥物係耳抑素(例如0101)。
本發明之多肽、抗體及ADC可經由在位置290(根據卡巴之EU指數編號)之經建構之半胱胺酸進行部位專一性接合。IgG1抗體重鏈CH2區係顯示於SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62(使用卡巴之EU指數編號之K290 係以粗體和底線標記)。
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKT K PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK(SEQ ID NO：61,CH2結構域)
Figure 109127593-A0101-12-0104-510
Figure 109127593-A0101-12-0104-509
(SEQ ID NO：62,CH2和CH3結構域)
經建構之半胱胺酸可單獨存在位置290上，或與下列位置上之一或多個經建構之半胱胺酸殘基組合：a)在重鏈恆定區上之殘基246、249、265、267、270、276、278、283、292、293、294、300、302、303、314、315、318、320、327、332、333、334、336、345、347、354、355、358、360、362、370、373、376、378、380、382、386、388、390、392、393、401、404、411、413、414、416、418、419、421、428、431、432、437、438、439、443、和444(根據卡巴之EU指數編號)，及/或b)在輕鏈恆定區上之殘基111、149、183、188、207、和210(根據卡巴編號)。
在某些實施例中，本發明之多肽、抗體及ADC可進一步包含抗體κ輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的位置183上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基76的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。此經建構之半胱胺酸也稱為「K183C」(使用卡巴編號)，並在下面以粗體及底線顯示。本發明之肽、抗體和ADC可包含λ輕鏈恆定區，其在對應人κ輕鏈恆定區之胺基酸殘基183的胺基酸位置上包含經建構的半胱胺酸殘基，稱為 如下顯示之「K183C」殘基。
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLS K ADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC(SEQ ID NO：63,Cκ恆定結構域)
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體κ輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的111、149、188、207、210或彼等之任何組合(較佳為111或210)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：63併列時，在對應SEQ ID NO：63之殘基4、42、81、100、103或彼等之任何組合(較佳為殘基4或103)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含(a)本文所揭示之多肽及(b)抗體λ輕鏈恆定區，其包含(i)在根據卡巴編號的110、111、125、149、155、158、161、185、188、189、191、197、205、206、207、208、210或彼等之任何組合(較佳為110、111、125、149、或155)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基；或(ii)當該恆定結構域與SEQ ID NO：64併列時，在對應SEQ ID NO：64之殘基4、5、19、43、49、52、55、78、81、82、84、90、96、97、98、99、101或彼等之任何組合(較佳為殘基4、5、19、43、或49)的位置上之經建構之半胱胺酸殘基。
GQPKANPTVT LFPPSSEELQ ANKATLVCLI SDFYPGAVTV AWKADGSPVK AGVETTKPSK QSNNKYAASS YLSLTPEQWK SHRSYSCQVT HEGSTVEKTV APTECS(SEQ ID NO：64,Cλ恆定結構域)
Figure 109127593-A0101-12-0106-511
2.調製劑與用途
在本文中所述之多肽、抗體、和ADC可調製成藥品調製劑。該藥品調製劑可進一步包含醫藥上可接受的載體、賦型劑或安定劑。另外，組成物可包括超過一種此處揭示之ADC。
本發明所使用之組成物可另包括醫藥上可接受之載劑、賦形劑或安定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy 21st Ed.,2005,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)以呈冷凍乾燥調製劑或水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或安定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，且可能包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇 (PEG)。如本文中所使用之「醫藥上可接受之鹽」係指分子或巨分子之醫藥上可接受之有機或無機鹽。醫藥上可接受之賦形劑另於此處說明。
本發明之一或多種ADC之各種調製劑可被用於投予，包括但不限於包含一或多種醫藥上可接受之賦形劑的調製劑。醫藥上可接受之賦形劑係為該領域所知，且係有助於投予藥理有效物質之相對惰性物質。舉例來說，賦形劑可提供外形或稠度，或作為稀釋劑。適當之賦形劑包括但不限於安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於改變滲透性之鹽類、包封劑、緩衝劑及皮膚穿透增進劑。用於非經腸及經腸藥物遞送之賦形劑以及調製劑係闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack Publishing,2000。
在本發明之一些態樣中，該等劑係經調製為供注射投予(例如腹膜內、靜脈、皮下、肌肉內等)。因此，這些劑可與醫藥上可接受之媒劑諸如鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液及類似物組合。特定給藥方案(即劑量、時間及重複性)將依特定個體及該個體之醫學病史而定。
本發明之ADC治療調製劑係經由混合具所欲純度的ADC與可選地醫藥上可接受的載劑、賦型劑或安定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed.Mack Publishing,2005)，製備成供儲存之冷凍乾燥調製劑或水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或安定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者不具毒性，可能包括 例如緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑(諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有本發明之ADC的脂質體可經由該領域已知之方法製備，諸如Eppstein,et al.,1985,PNAS 82：3688-92；Hwang,et al.,1908,PNAS 77：4030-4；和美國專利第4,485,045號和第4,544,545號所述。循環時間延長之脂質體係揭露於美國專利第5,013,556號。特別有用之脂質體可利用逆相蒸發方法以包括磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物產製。
脂質體被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
活性成分亦可被包封於藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化所製備之微膠囊中，例如分別於羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中、於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於巨乳化液中。該等技術係揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Mack Publishing,2005。
持續釋放性製品可被製備。持續釋放製劑之適當實例包括含有抗體之固相疏水性聚合物之半透性基質，該基質係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
欲用於體內投予之調製劑必須為無菌。此可輕易地藉由例如無菌過濾膜之過濾達成。治療性ADC組成物通常被置放於具有無菌接口之容器中，例如具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜脈溶液袋或小瓶。
適當之表面活性劑包括特別是非離子性劑，諸如聚氧乙烯去水山梨醇(例如TWEENTM 20、40、60、80或85)及其他去水山梨醇(例如SpanTM20、40、60、80或 85)。具有表面活性劑之組成物將方便地包括0.05至5%之間、且可在0.1至2.5%之間的表面活性劑。將了解若需要的話其他成分可被添加，例如甘露醇或其他醫藥上可接受之媒劑。
適當之乳液可利用自商業途徑獲得之脂質乳液製備，如INTRALIPIDTM、LIPOSYNTM、INFONUTROLTM、LIPOFUNDINTM和LIPIPHYSANTM。活性成分可被溶解於預先混合之乳液組成物中，或者可被溶解於油中(例如大豆油、紅花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。將瞭解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以調整乳液之張力。適當之乳液通常將含有最高20%例如介於5至20%之油。脂質乳液可包括0.1至1.0μm之間，特別是0.1至0.5μm之間的脂質微滴，並且具有5.5至8.0範圍內之pH。乳液組成物可為該些藉由混合本發明之ADC與INTRALIPIDTM或彼之成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所製備者。
本發明亦提供用於本方法之套組。本發明之套組包括一或多個包括本發明之一或多個ADC之容器及根據此處所述之本發明之任何方法之使用說明。通常，這些說明包括投予ADC以供治療性治療之描述。
有關使用本發明之ADC之說明通常包括該意圖治療之劑量、投藥計畫及投予途徑之資訊。該等容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。 本發明之套組所提供之說明通常為在標籤或包裝仿單上之書面說明(例如包含在套組中之紙張)，但機器讀取之說明(例如磁性或光學儲存磁碟上攜有之說明)亦可被接受。
本發明之套組係經適當包裝。適當包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可彎折之包裝(例如密封之美拉(Mylar)或塑膠袋)、及類似物。亦考慮的是與特殊裝置組合使用之包裝，諸如輸注裝置諸如小型泵。套組可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該容器也可能具有無菌接口(例如該容器可能為具有可被皮下注射針穿刺之塞子的靜注溶液袋或小瓶)。該組成物中之至少一種活性劑係本發明之ADC。該容器可能另包括第二醫藥活性劑。
套組可能可選地提供額外成份諸如緩衝劑及解說資訊。通常，套組包括容器及在容器上或與容器相關之標籤或包裝仿單。
本發明之ADC可用於治療性、診斷性、或非治療性目的。例如，抗體或其抗原結合片段可以當做親和性純化劑(例如用於試管內純化)、當做診斷劑(例如用於偵測關注抗原在特定細胞、組織、或血清中的表現)使用。
對於治療性應用，本發明之ADC可經由習知的技術投予至哺乳類動物(特別是人)，諸如靜脈內(作為推注或經由連續輸注一段時間)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入。抗體或抗原結合片段也適當地經由腫瘤內、腫瘤周圍、病 灶內、或病灶周圍之途徑投予。本發明之ADC可以用於預防性治療或治療性治療。
3.定義
除非本文另外加以定義，關於本發明所使用之科學性及技術性用語應具有該領域之一般技藝人士所通常了解之意義。另外，除非內文另外要求，單數用語應包括複數意義且複數用語應包括單數意義。一般來說，與此處所描述之細胞培養、組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、基因學以及蛋白質及核酸化學和雜交有關所使用之命名法及技術係該領域所廣為週知且經常使用者。
用語「L-D」是指由藥物(D)與連接子(L)連接所導致之連接子-藥物部分。用語「藥物(D)」是指可用於治療疾病的任何治療劑。藥物具有生物或可偵測的活性，例如細胞毒劑、化學治療劑、細胞靜止劑、或免疫調節劑。在癌症治療的背景下，治療劑對腫瘤具有細胞毒性效應，包括除盡、消除及/或殺滅腫瘤細胞。用語藥物、載荷物及載荷藥物可互相交換使用。在某些實施例中，治療劑對腫瘤具有細胞毒性效應，包括除盡、消除及/或殺滅腫瘤細胞。在某些實施例中，藥物係抗有絲分裂劑。在某些實施例中，藥物係耳抑素。在某些實施例中，藥物係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側 氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(也稱為0101)。在某些實施例中，藥物較佳地具有膜穿透性。
用語「連接子(L)」描述抗體與載荷藥物間之直接或間接鍵結。將連接子連接至抗體可利用多種方式達成，諸如經由表面離胺酸、還原偶合至經氧化之碳水化合物、藉由還原鏈間雙硫鍵釋放半胱胺酸殘基、建構於特定部位之反應性半胱胺酸殘基、及於轉麩醯胺酶及胺存在下藉由多肽建構而成為反應性之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤或內源性麩醯胺酸。本發明使用之部位專一性方法連接抗體與載荷藥物。在一個實施例中，接合經由經建構至抗體恆定區中之半胱胺酸殘基發生。在另一實施例中，接合經由已經a)經由肽標籤添加至抗體恆定區、b)經建構至抗體恆定區中、或c)藉由建構周圍殘基而變成可接近/可反應之醯基供體麩醯胺酸殘基發生。連接子可為可切割(即在細胞內之條件下易受切割)或不可切割的。在一些實施態樣中，連接子係可切割連接子。
抗體之「抗原結合片段」是指維持對抗原之專一性結合能力的全長抗體之片段(較佳具有實質上相同的結合親和性)。抗原結合片段之實例包括：Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)；經單離之互補決定區(CDR)；經雙硫鍵連接之Fv(dsFv)；抗遺傳型(抗Id)抗體；細胞內抗體；單鏈Fv(scFv，見例如Bird et al.Science 242：423-426(1988)及Huston et al.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))；及雙價抗體(見例如Holliger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；Poljak et al.,1994,Structure 2：1121-1123)。本發明之抗原結合片段包含本文所述之經建構之抗體恆定結構域，但不需要包含天然抗體之全長Fc區。例如，本發明之抗原結合片段可為「微抗體(minibody)」(VL-VH-CH3或(scFv-CH3)2；參見Hu et al.,Cancer Res.1996；56(13)：3055-61，及Olafsen et al.,Protein Eng Des Sel.2004；17(4)：315-23)。
抗體可變結構域中的殘基是根據卡巴來編號，卡巴係用於匯總抗體之重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。使此編號系統，實際的線性胺基酸序列可含有對應於縮短或插入可變結構域之FR或CDR的較少或額外胺基酸。例如，重鏈可變結構域可在H2之殘基52之後包括單一胺基酸插入(根據卡巴的殘基52a)以及在重鏈FR殘基82之後包括插入殘基(例如根據卡巴的殘基82a、82b、和82c)。經由抗體序列與「標準」卡巴編號序列同源區之比對可判定給定抗體的殘基之卡巴編號。各種用於分配卡巴編號的演算法可供使用。除非另外說明，在本文中使用Abysis(www.abysis.org)於2012年所發布實施的演算法分配卡巴編號至可變區。
除非另外說明，抗體之IgG重鏈恆定結構域中的胺基酸殘基係根據Edelman et al.,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中之EU指數來編號，如Kabat et al.,1991中所述，在本文中稱為「卡巴之EU指數」。通常，Fc結構域包含人IgG1恆定結構域中之從約胺基酸殘基236至約447。C編號之間的對應關係可在例如IGMT資料庫中找到。輕鏈恆定結構域的胺基酸殘基係根據Kabat et al.,1991編號。抗體恆定結構域胺基酸殘基的編號也顯示在國際專利公開號WO 2013/093809中。
在IgG重鏈恆定結構域中，卡巴之EU指數的使用之唯一例外是實例中所述的殘基A114。A114係指卡巴編號，而對應的EU指數編號為118。這是因為在最初發表此部位之部位專一性接合使用卡巴編號，並稱此部位為A114C，並且自當時起已在本領域中廣泛使用為「114」部位。見Junutula et al.,Nature Biotechnology 26,925-932(2008)。為了與本領域此部位的常見用法一致，故在實例中使用「A114」、「A114C」、「C114」或「114C」。
除非另外說明，抗體之輕鏈恆定結構域的胺基酸殘基係根據Kabat et al.,1991編號。
當經由比對查詢胺基酸序列與參考序列而殘基的位置與指定位置匹配時，查詢序列的胺基酸殘基「對應於」參考序列的指定位置(例如，SEQ ID NO：61或62的位置60，或SEQ ID No：63的位置76)。這種比對可經 由手工比對或使用廣為周知的序列比對程式如ClustalW2或「BLAST 2 Sequences」，以預設參數進行。
「Fc融合」蛋白係其中一或多個多肽可操作地連接到Fc多肽之蛋白質。Fc融合將免疫球蛋白之Fc區與融合配偶體結合起來。
本文中所使用的用語「約」是指數值的+/-10%。
本文中所使用的用語「經建構」(如經建構之半胱胺酸)與「經取代」(如經取代之半胱胺酸)可互換使用，並且係指將胺基酸突變成半胱胺酸，以產生用於將另一部分與多肽或抗體連接的接合部位。
生物寄存
本發明之代表性材料係於2015年11月17日寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,USA)。載體T(K290C)-HC具有ATCC編號PTA-122672，其包含編碼SEQ ID NO：18之重鏈序列的DNA插入物；且載體T(kK183C)-LC具有ATCC編號PTA-122673，其包含編碼SEQ ID NO：42之輕鏈序列的DNA插入物。該等寄存係根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約之規定進行。此確保自寄存日開始30年內維持存活的寄存物培養物。寄存物將依照布達佩斯條約之規定由ATCC提供，且將受限於輝瑞(Pfizer,Inc.)與ATCC之合約，該合約確保當頒發相關美 國專利或公開任何美國或外國專利申請案時(以先到者為主)，該寄存物之培養子代可永久且不受限制地供公眾使用，且確保由美國專利商標局局長依據35 U.S.C.122及該局長所依據之法則(包括37 C.F.R.1.14，特別參照886 OG 638)判定有權獲得該子代者之可得性。
本申請案之代理人同意，若該寄存中之材料的培養物在適當條件培養下死亡或遺失或毀損，一經通知應立即以另一相同材料取代該材料。不得將該寄存材料之可得性視為可藉以實施本發明而侵犯由任何政府主管機關依據該國專利法所授予之權利之許可。
實例
本發明進一步詳細描述於下列實驗實例。這些實例僅提供作為說明之目的，除非另外說明，否則並無限制之意圖。因此，本發明不應被視為受到下列實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。
實例1：製備用於接合之曲妥珠單抗(trastuzumab)衍生抗體
A.經由半胱胺酸接合
製備用於經由半胱胺酸殘基進行部位專一性接合的曲妥珠單抗衍生物之方法，大致係如PCT公開案WO2013/093809(其係以其整體納入此處)所述實施。在輕鏈(使用卡巴編號方案之183)或重鏈(使用卡巴之EU指數 之290、334、392及/或443)上的一或多個殘基係藉由部位定點突變形成，改變成半胱胺酸(C)殘基。
B.經由轉麩醯胺酶接合
製備用於經由麩醯胺酸殘基進行部位專一性接合的曲妥珠單抗衍生物之方法，大致係如PCT公開案WO2012/059882(其係以其整體納入此處)所述實施。曲妥珠單抗係經建構以表現以三種不同方法用於接合之麩醯胺酸殘基。
在第一種方法中，含有麩醯胺酸殘基之8個胺基酸殘基標籤(LCQ05)係連接至輕鏈之C端。
在第二種方法中，在重鏈上的殘基(使用卡巴之EU指數之位置297)係藉由部位定點突變形成，從天冬醯胺酸(N)改變成麩醯胺酸(Q)殘基。
在第三種方法中，在重鏈上的殘基(使用卡巴之EU指數之位置297)係從天冬醯胺酸(N)改變成丙胺酸(A)。此導致在位置297之無醣基化及在位置295之可接近/反應性內源性麩醯胺酸。
此外，一些曲妥珠單抗衍生物具有非用於接合之改變。在重鏈上之位置222的殘基(使用卡巴之EU指數之位置297)係從離胺酸(K)改變成精胺酸(R)殘基。發現K222R取代導致更同質之抗體與載荷物(payload)接合體、抗體與載荷物之間更佳之分子間交聯，及/或顯著減少與抗體輕鏈C端上之麩胺醯胺標籤的鏈間交聯。
實例2：生產表現曲妥珠單抗衍生抗體之穩定轉染細胞
為了決定該經建構之單一及雙半胱胺酸曲妥珠單抗衍生抗體變異體可於細胞中穩定表現及大規模生產，CHO細胞係經編碼九種曲妥珠單抗衍生抗體變異體(T(κK183C)、T(K290C)、T(K334C)、T(K392C)、T(κK183C+K290C)、T(κK183C+K392C)、T(K290C+K334C)、T(K334C+K392C)及T(K290C+K392C))之DNA轉染，且使用該領域廣為周知之標準程序單離穩定高生產池(pool)。為了生產用於接合試驗之T(κK183C+K334C)，使用標準方法，將HEK-293細胞(ATCC寄存編號CRL-1573)以編碼此經雙半胱胺酸建構之抗體變異體的重鏈及輕鏈DNA進行過渡性共轉染。使用二管柱製程(即蛋白質A親和性捕捉，然後TMAE管柱)或三管柱製程(即蛋白質A親和性捕捉，然後TMAE管柱及接著CHA-TI管柱)，自該濃縮CHO池起始材料單離這些曲妥珠單抗變異體。使用這些純化製程，所有經建構之半胱胺酸曲妥珠單抗衍生抗體變異體製劑含有如分析性粒徑排阻層析所測得之>97%關注峰(POI)(表5)。這些表5所示之結果證明，所有十種曲妥珠單抗衍生半胱胺酸變異體在自蛋白質A樹脂溶析後偵測到可接受水準之高分子量(HMW)聚集物種，且此非所欲之HMW物種可利用粒徑排阻層析移除。此外，該資料證明人IgG1恆定區中之蛋白質A結合部位，並未受到該等經建構之半胱胺酸殘基的存在而改變。
Figure 109127593-A0101-12-0121-512
實例3：曲妥珠單抗衍生抗體之完整性
經建構之半胱胺酸及轉麩醯胺酶變異體之分子評估係經實施，以評估相對於曲妥珠單抗野生型抗體之重要生物物理性質，以確保該等變異體可適用於標準抗體製造平台製程。
為了測定經由穩定CHO表現所生產經建構之半胱胺酸抗體變異體之純化製劑的完整性，使用非還原性毛細管膠體電泳計算尖峰之純度百分比(Caliper LabChip GXII：Perkin Elmer Waltham,MA)。結果顯示該經建構之半胱胺酸抗體變異體T(κK183C+K290C)及T(K290C+KS334C)含有低水準之類似曲妥珠單抗野生型抗體的片段及高分子質量物種(HMMS)。相對地，T(K334C+K392C)相對於其他經評估之雙建構半胱胺酸變異體，含有高水準之斷裂抗體尖峰(表6)。這些結果建議，經建構之半胱胺酸的特定組合可影響意圖用於部位專一性接合之抗體的完整性。
Figure 109127593-A0101-12-0122-513
實例4：產製載荷藥物化合物
耳抑素藥物化合物0101、0131、8261、6121、8254及6780係根據PCT公開案WO2013/072813(其係以其整體納入此處)所述之方法製造。在公開申請案中，耳抑素化合物係以表7所示之編號系統表示。
Figure 109127593-A0101-12-0122-514
根據PCT公開案WO2013/072813，藥物化合物0101係根據下列程序製造。
Figure 109127593-A0101-12-0122-515
步驟1.合成N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#53)。根據一般程序D，自#32(2.05g,2.83mmol,1eq.)於二氯甲烷(20mL,0.1M)及N,N-二甲基甲醯胺(3mL)中、胺#19(2.5g,3.4mmol,1.2eq.)、HATU(1.29g,3.38mmol,1.2eq.)及三乙胺(1.57mL,11.3mmol,4eq.)合成粗製所欲材料，該粗製所欲材料藉由矽膠層析純化(梯度：0%至55%丙酮於庚烷中)，生產呈固體之#53(2.42g,74%)。LC-MS：m/z 965.7[M+H+],987.6[M+Na+]，滯留時間=1.04分鐘；HPLC(規程A)：m/z 965.4[M+H+]，滯留時間=11.344分鐘(純度>97%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ 7.86-7.91(m,2H),[7.77(d,J=3.3Hz)及7.79(d,J=3.2Hz)，總1H],7.67-7.74(m,2H),[7.63(d,J=3.2Hz)及7.65(d,J=3.2Hz)，總1H],7.38-7.44(m,2H),7.30-7.36(m,2H),7.11-7.30(m,5H),[5.39(ddd,J=11.4,8.4,4.1Hz)及5.52(ddd,J=11.7,8.8,4.2Hz)，總1H],[4.49(dd,J=8.6,7.6Hz)及4.59(dd,J=8.6,6.8Hz)，總1H],3.13,3.17,3.18及3.24(4 s，總6H),2.90及3.00(2 br s，總3H),1.31及1.36(2 br s，總6H),[1.05(d,J=6.7Hz)及1.09(d,J=6.7Hz)，總3H]。
步驟2.合成2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3- 甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺(#54或0101)。根據一般程序A，自#53(701mg,0.726mmol)於.二氯甲烷中(10mL,0.07M)合成粗製所欲材料，該粗製所欲材料藉由矽膠層析純化(梯度：0%至10%甲醇於二氯甲烷中)。殘餘物係經二乙基醚及庚烷稀釋，並於真空中濃縮以得到呈白色固體之#54(或0101)(406mg,75%)。LC-MS：m/z743.6[M+H+]，滯留時間=0.70分鐘；HPLC(規程A)：m/z743.4[M+H+]，滯留時間=6.903分鐘(純度>97%)；1H NMR(400MHz,DMSO-d 6 )假設為旋轉異構體之混合物的特徵信號：δ[8.64(br d,J=8.5Hz)及8.86(br d,J=8.7Hz)，總1H],[8.04(br d,J=9.3Hz)及8.08(br d,J=9.3Hz)，總1H],[7.77(d,J=3.3Hz)及7.80(d,J=3.2Hz)，總1H],[7.63(d,J=3.3Hz)及7.66(d,J=3.2Hz)，總1H],7.13-7.31(m,5H),[5.39(ddd,J=11,8.5,4Hz)及5.53(ddd,J=12,9,4Hz)，總1H],[4.49(dd,J=9,8Hz)及4.60(dd,J=9,7Hz)，總1H],3.16,3.20,3.21及3.25(4 s，總6H),2.93及3.02(2 br s，總3H),1.21(s,3H),1.13及1.13(2 s，總3H),[1.05(d,J=6.7Hz)及1.10(d,J=6.7Hz)，總3H],0.73-0.80(m,3H)。
藥物化合物MMAD、MMAE及MMAF係根據PCT公開案WO 2013/072813所揭示之方法在實驗室內部製造。
藥物化合物DM1係經由美國專利第5,208,020號概述之程序自購買之美坦素醇(maytansinol)在實驗室內部製造。
實例5：曲妥珠單抗衍生抗體之生物接合
本發明之曲妥珠單抗衍生抗體係經由連接子接合載荷物以產製ADC。所使用之接合方法係部位專一性(即經由特定半胱胺酸殘基或特定麩醯胺酸殘基)或習知接合。
A.半胱胺酸部位專一性
表8之ADC係經由下述之半胱胺酸部位專一性方法接合。
Figure 109127593-A0101-12-0125-516
將500mM參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)溶液(50至100莫耳當量)加至抗體(5mg)，使得最終抗體濃度係5至15mg/mL於含有20mM EDTA之PBS中。讓反應在37℃持續進行2.5小時後，使用凝膠過濾管柱(PD-10除鹽管柱，GE Healthcare)將抗體緩衝交換至含有5mM EDTA之PBS中。將所得之在含有5mM EDTA之PBS中之抗體(5至10mg/mL)以新鮮製備之50mM DHA溶液於 1：1 PBS/EtOH中處理(最終DHA濃度=1mM至4mM)，且允許在4℃下靜置整夜。
抗體/DHA混合物係經緩衝交換至含有5mM EDTA之PBS中(該平衡緩衝液之pH係使用磷酸調整至~7.0)，且使用50KDa MW臨界旋轉濃縮裝置濃縮。將所得之在含有5mM EDTA之PBS中之抗體(抗體濃度約5至10mg/ml)以5至7莫耳當量之在DMA中之10mM順丁烯二醯亞胺載荷物處理。在靜置1.5至2.5小時後，將材料進行緩衝交換(PD-10)。實施SEC純化(若需要)以去除任何聚集材料及殘留之游離載荷物。
B.轉麩醯胺酶部位專一性
表9之ADC係經由下述之轉麩醯胺酶部位專一性方法接合。
Figure 109127593-A0101-12-0126-517
在轉醯胺反應中，抗體上之麩醯胺酸係作為醯基供體，且含胺化合物係作為醯基受體(胺供體)。將濃度33μM之經純化之HER2抗體與10至25M過量之醯基受體(範圍介於33至83.3μM之AcLysvc-0101)在2%(w/v)茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium mobaraense)轉麩醯胺酶(ACTIVATM,Ajinomoto,Japan)存在下，培養於150 mM氯化鈉及Tris HCl緩衝液pH範圍7.5至8中，且除非說明否則含有0.31mM之還原麩胱甘肽。反應條件係根據個別醯基供體調整，其中T(LCQ05+K222R)於pH 8.0下使用10M過量之醯基供體且不含還原麩胱甘肽，T(N297Q+K222R)及T(N297Q)在pH 7.5下使用20M過量之醯基供體，且T(N297A+K222R+LCQ05)在pH 7.5下使用25M過量之醯基供體。在37℃下培養16至20小時後，抗體係利用所屬技術領域中具有通常知識者已知之標準層析方法，諸如GE Healthcare之商用親和性層析及疏水性交互作用層析，於MabSelect SuReÔ樹脂或丁基瓊脂糖高性能(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上純化。
C.習知接合
表10及11之ADC係經由下述之習知接合方法接合。
Figure 109127593-A0101-12-0127-518
Figure 109127593-A0101-12-0127-519
抗體係經透析至達爾柏克(Dulbecco)氏磷酸鹽 緩衝鹽水(DPBS,Lonza)。該透析抗體係以pH 7之含有5mM 2,2',2",2"'-(乙烷-1,2-二基二氮基)四乙酸(EDTA)之PBS稀釋至15mg/mL。所得抗體係以2至3當量之參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，5mM於蒸餾水中)處理且允許於37℃下靜置1至2小時。待冷卻至室溫後，添加二甲基乙醯胺(DMA)以達到10%(v/v)總有機物。該混合物係經8至10當量之適當連接子-載荷物處理為10mM於DMA中之原液。允許該反應在室溫下進行1至2小時，再根據製造商的指示使用GE Healthcare Sephadex G-25 M緩衝交換管柱緩衝交換至DPBS(pH 7.4)中。
欲維持環閉合之材料(表10之ADC)係藉由粒徑排阻層析(SEC)使用GE AKTA Explorer系統與GE Superdex200管柱及PBS(pH 7.4)溶析液純化。最終樣本係濃縮至約5mg/mL蛋白質、經濾器滅菌，且使用如下概述之質譜條件檢查裝載狀況。
用於琥珀醯亞胺環水解之材料(表11之ADC)係使用超過濾裝置(50Kda MW臨界值)立即緩衝交換至50mM硼酸鹽緩衝液(pH 9.2)中。將所得溶液加熱至45℃達48h。所得溶液係經冷卻、經緩衝交換至PBS中，且藉由SEC純化(如下所述)以移除任何聚集材料。最終樣本係濃縮至約5mg/mL蛋白質並經濾器滅菌，且使用如下概述之質譜條件檢查裝載狀況。
D.T-DM1接合
曲妥珠單抗-類美坦素接合物(T-DM1)的結構類似曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)(Kadcyla®)。T-DM1包含經由雙官能性連接子磺酸基琥珀醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(磺酸基-SMCC)共價連接至DM1類美坦素之曲妥珠單抗抗體。磺酸基-SMCC首先在25℃下於50mM磷酸鉀、2mM EDTA、pH 6.8中，以10：1反應化學計量接合抗體上的游離胺一小時，且未結合連接子接著自該經接合之抗體除鹽。此抗體-MCC中間物接著在25℃下於50mM磷酸鉀、50mM NaCl、2mM EDTA、pH 6.8中，以10：1反應化學計量由MCC連接子抗體上之游離順丁烯二醯亞胺基端接合DM1硫化物整夜。剩餘未反應之順丁烯二醯亞胺接著係經L-半胱胺酸加帽，且該ADC係經Superdex200管柱分餾以移除非單體物種(Chari et al.,1992,Cancer Res 52：127-31)。
實例6：ADC之純化
ADC大致上係使用如下所述之粒徑排阻層析(SEC)純化及表徵。藥物裝載至所欲接合部位上之狀況係使用多種方法測定，包括如下更完整描述之質譜術(MS)、逆相HPLC、及疏水性交互作用層析(HIC)。這三種分析方法的組合提供多種驗證及定量載荷物在抗體上之裝載狀況之方式，藉以提供各接合物之DAR的正確測定值。
A.製備型SEC
ADC大致上使用SEC層析來純化，即使用Akta Explorer FPLC系統上之Waters Superdex200 10/300GL管柱，以移除蛋白質聚集體並移除留在反應混合物中之少量載荷物-連接子。偶而情況下，ADC在SEC純化之前不含聚集體及小分子，因此不經製備型SEC處理。所使用之溶析液係1mL/min流速之PBS。在這些條件下，聚集材料(在室溫下溶析約10分鐘)可輕易地與非聚集材料分離(在室溫下溶析約15分鐘)。疏水性載荷物-連接子組合常導致SEC尖峰之「向右偏移」。在不希望受到任何特定理論侷限下，此SEC尖峰位移可能是因連接子-載荷物與靜相間之疏水性交互作用所致。在某些情況下，此向右位移允許經接合之蛋白質得以自非接合蛋白質部分解出。
B.分析型SEC
分析型SEC係於Agilent 1100 HPLC上使用PBS作為溶析液進行，以評估ADC之純度及單體狀態。溶析液係於220及280nM下監測。當管柱係TSKGel G3000SW管柱(7.8×300mm，目錄編號R874803P)時，所使用之移動相係以流動速率0.9mL/min流動30分鐘之PBS。當管柱係BiosepSEC3000管柱(7.8×300mm)時，所使用之移動相係以流動速率1.0mL/min流動25分鐘之PBS。
實例7：ADC之表徵
A.質譜術(MS)
製備用於LCMS分析之樣本，其係將大約20μl之樣本(大約1mg/ml ADC於PBS中)與20μl之20mM二硫蘇糖醇(DTT)組合。在允許該混合物在室溫下靜置5分鐘之後，將樣本注射至安裝Agilent Poroshell 300SB-C8(2.1×75mm)管柱之Agilent 110 HPLC系統中。系統溫度設定為60℃。利用從20%至45%乙腈在水中(含0.1%甲酸修飾劑)之5分鐘梯度。溶析液係藉由UV(220nM)及Waters Micromass ZQ質譜儀(ESI離子化；錐孔電壓：20V；源極溫度：120℃；去溶劑化溫度：350℃)監測。含有多重帶電物種之原始圖譜係使用MassLynx 4.1軟體套件中之MaxEnt1，根據廠商說明去卷積(deconvoluted)。
B.MS測定每個抗體之裝載狀況
載荷物對抗體以製造ADC之總裝載狀況被稱為藥物抗體比或DAR。計算所製造之各ADC的DAR(表12)。
整個溶析窗(通常為5分鐘)之圖譜係經組合成單一總和圖譜(即代表整個樣本之MS的質譜)。ADC樣本之MS結果係與完全相同之非裝載對照抗體之對應MS直接比較。此允許鑑別裝載/非裝載重鏈(HC)尖峰及裝載/非裝載輕鏈(LC)尖峰。不同尖峰之比可基於下述方程式(方程式1)用於建立裝載狀況。計算係基於裝載鏈及非裝載鏈 離子化相等的假設，此假設已經被決定為大致有效之假設。
下列計算是為了建立DAR而實施：
方程式1：裝載=2*[LC1/(LC1+LC0)]+2*[HC1/(HC0+HC1+HC2)]+4*[HC2/(HC0+HC1+HC2)]
其中所示變數係下列者之相對豐度：LC0=未裝載輕鏈，LC1=單一裝載輕鏈，HC0=未裝載重鏈，HC1=單一裝載重鏈，及HC2=雙裝載重鏈。所屬技術領域中具有通常知識者將理解本發明涵蓋此計算之擴充，以涵蓋更高裝載物種諸如LC2、LC3、HC3、HC4、HC5、及類似者。
下面的方程式2係用於估計在非經建構半胱胺酸殘基上之裝載的量。就經建構Fc突變物而言，在輕鏈(LC)上之裝載在定義上被認為是非專一性裝載。再者，僅裝載LC被假設是因為意外還原HC-LC雙硫鍵(即該抗體係經「過度還原」)所致。由於大幅過量之順丁烯二醯亞胺親電子劑係用於接合反應(單一突變物大致約5當量且雙突變物10當量)，在輕鏈上之任何非專一性裝載被假設伴隨著對應量之在重鏈上之非專一性裝載發生(即該斷裂HC-LC雙硫鍵之另「一半」)。
有了這些假設，下列方程式(方程式2)係用於估計在蛋白質上之非專一性裝載的量：
方程式2：非專一性裝載=4*[LC1/(LC1+LC0)]
其中所示變數係下列者之相對豐度：LC0=未裝載輕鏈，LC1=單一裝載輕鏈。
Figure 109127593-A0101-12-0133-520
C.利用FabRICATOR®進行蛋白水解以建立裝載部位
就半胱胺酸突變ADC而言，任何非專一性裝 載親電子載荷物至抗體上係假設發生在「鏈間」亦稱為「內部」半胱胺酸殘基(即，一般而言係HC-HC或HC-LC雙硫鍵之一部分的該些殘基)。為了要分辨裝載親電子劑至Fc結構域中之經建構之半胱胺酸上與裝載至內部半胱胺酸殘基上(否則一般而言形成在HC-HC或HC-LC之間的S-S鍵結)，接合物係經已知可切割抗體之Fab結構域與Fc結構域之間之蛋白酶處理。一種此類蛋白酶係半胱胺酸蛋白酶IdeS，由Genovis以「FabRICATOR®」之名稱販售，並描述於von Pawel-Rammingen et al.,2002,EMBO J.21：1607。
簡言之，遵照製造商之建議條件，將ADC以FabRICATOR®蛋白酶處理且樣本係於37℃下培養30分鐘。製備用於LCMS分析之樣本，其係將大約20μl之樣本(大約1mg/mL於PBS中)與20μl之20mM二硫蘇糖醇(DTT)組合，且允許該混合物在室溫下靜置5分鐘。此人IgG1之處理導致三種大小範圍皆在約23至26KDa的範圍內之抗體片段：包含內部半胱胺酸之LC片段，該內部半胱胺酸一般而言形成LC-HC鏈間雙硫鍵；包含三個內部半胱胺酸之N端HC片段(其中一個一般而言形成LC-HC雙硫鍵且另外二個在抗體絞鏈區發現之半胱胺酸一般而言形成抗體之二個重鏈之間的HC-HC雙硫鍵)；及不包含反應性半胱胺酸之C端HC片段，但該些藉由突變導入此處揭示之建構體中之反應性半胱胺酸除外。樣本如上述藉由MS分析。裝載計算係以如前所述(如上)之相同方式 實施，以定量LC、N端HC及C端HC之裝載。在C端HC上之裝載被認為是「專一性」裝載，而在LC及N端HC上之裝載被認為是「非專一性」裝載。
為了交叉檢查裝載計算，一個ADC亞群亦使用替代方法(基於逆相高效液相層析[rpHPLC]及基於疏水性交互作用層析[HIC]之方法)進行裝載檢測，在下面章節中有更完整的描述。
D.逆相HPLC分析
製備用於逆相HPLC分析之樣本，其係將大約20ul之樣本(大約1mg/mL於PBS中)與20ul之20mM二硫蘇糖醇(DTT)組合。在允許該混合物在室溫下靜置5分鐘之後，將樣本注射至安裝Agilent Poroshell 300SB-C8(2.1×75mm)管柱之Agilent 1100 HPLC系統中。系統溫度設定為60℃，且溶析液係藉由UV(220nM及280nM)監測。利用從20%至45%乙腈在水中(含0.1% TFA修飾劑)之20分鐘梯度：T=0min：25%乙腈；T=2min：25%乙腈；T=19min：45%乙腈；及T=20min：25%乙腈。使用這些條件，抗體之HC及LC係經基準分離。此分析之結果指示LC大多維持未經修飾(但含有T(kK183C)及T(LCQ05)之抗體除外)，而HC係經修飾(資料未顯示)。
E.疏水性交互作用層析(HIC)
製備用於HIC分析之化合物，其係將樣本用PBS稀釋至大約1mg/ml。藉由將15μl之樣本自動注射至具有TSK-GEL丁基NPR管柱(4.6×3.5mm，2.5μm孔徑大小；Tosoh Biosciences部件#14947)之Agilent 1200 HPLC上來進行分析。該系統包括具有恆溫器之自動取樣器、管柱加熱器及UV偵測器。
梯度方法的使用如下：移動相A：1.5M硫酸銨、50mM磷酸氫二鉀(pH7)；移動相B：20%異丙基醇、50mM磷酸氫二鉀(pH 7)；T=0min.100% A；T=12min.,0% A。
滯留時間顯示於表13。選定圖譜顯示於圖2A至2E。使用部位專一性接合之ADC(T(kK183C+K290C)-vc0101、T(K334C+K392C)-vc0101及T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101)(圖1A至1C)主要顯示一個尖峰，然而使用習知接合之ADC(T-vc0101及T-DM1)(圖2D至2E)顯示差異化裝載之接合物的混合物。
Figure 109127593-A0101-12-0137-521
F.熱穩定性
示差掃描量熱儀(DCS)係用於測定經建構之半胱胺酸及轉麩醯胺酶抗體變異體及對應Aur-06380101部位專一性接合物之熱穩定性。在此分析中，以PBS-CMF pH 7.2調製之樣本係經分配至具有自動取樣器之Micr℃ al VP毛細管DSC的試樣盤(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)中，在10℃下平衡5分鐘，接著以每小時100℃的速率掃描至最高110℃。選擇16秒之過濾期。原始資料係經基準校正，該蛋白質濃度係經標準化。Origin軟體7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用於適配該資料至具有適當數量之轉換(transition)之MN2- State模型。
所有經單一及雙半胱胺酸建構之抗體變異體以及經建構之含有醯基供體麩醯胺酸之標籤之LCQ05抗體皆展現優異的熱穩定性，如由第一融化轉換(Tm1)>65℃所決定(表14)。
使用部位專一性接合方法接合0101之曲妥珠單抗衍生單株抗體亦經評估且亦顯示具有絕佳之熱穩定性(表15)。然而，T(K392C+L443C)-vc0101 ADC之Tm1最受載荷物接合之影響，因為相對於未接合之抗體，其減少4.35℃。
一併考量這些結果證明，經建構之半胱胺酸抗體變異體及含有醯基供體麩醯胺酸之標籤之抗體變異體皆為熱穩定的，且經由vc連接子部位專一性接合0101產生具有優異熱穩定性之接合物。
另外，在T(K392C+L443C)-vc0101所觀察到之相對於未接合抗體之較低熱穩定性，顯示經由vc連接子接合0101至某些經建構之半胱胺酸殘基的組合可影響ADC之穩定性。
Figure 109127593-A0101-12-0139-522
Figure 109127593-A0101-12-0139-523
實例8：ADC結合至HER2
A.直接結合
BT474細胞(HTB-20)係經胰蛋白酶消化、離心及重懸於新鮮培養基中。該等細胞接著與一系列ADC或未接合曲妥珠單抗之稀釋液以1μg/ml之起始濃度於4℃下一起培養一小時。該等細胞接著以冰冷PBS清洗二次且用抗人Alexafluor 488二級抗體(Cat# A-11013,Life technologies)培養30min。該等細胞接著以PBS清洗二次且接著重懸於PBS中。使用Accuri流式細胞儀(BD Biosciences San Jose,CA)讀取平均螢光強度。
Figure 109127593-A0101-12-0140-524
如圖3A及表16所示，ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101、T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101、T(kK183C+K290C)-vc0101、T(kK183C+K392C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101與T-DM1及曲妥珠單抗在直接結合上具有類似之結合親和力。
這表示對本發明之ADC中之抗體的修飾以及添加連接子-載荷物不顯著影響結合。
B.競爭結合(FACS)
BT474細胞係經胰蛋白酶消化、離心及重懸於新鮮培養基中。該等細胞接著與ADC或未接合曲妥珠單抗之系列稀釋液加上1μg/mL之曲妥珠單抗-PE(由eBiosciences(San Diego,CA)客製合成1：1 PE標示之曲妥珠單抗)於4℃下培養一小時。該等細胞接著以PBS清洗 二次且接著重懸於PBS中。使用Accuri流式細胞儀(BD Biosciences San Jose,CA)讀取平均螢光強度。
如圖3B所示，ADC T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101、T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101、T(kK183C+K290C)-vc0101、T(kK183C+K392C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101與T-DM1及曲妥珠單抗在與PE標示之曲妥珠單抗的競爭結合上具有類似之結合親和力。
這表示對本發明之ADC中之抗體的修飾以及添加連接子-載荷物不顯著影響結合。
實例9：ADC結合至人FcRn
本技術領域咸信，FcRn以pH依賴性方式與不論何種亞型之IgG交互作用，且藉由防止抗體進入溶酶體區室來防止抗體之降解(抗體係在溶酶體區室中降解)。因此，在選擇導入反應性半胱胺酸至野生型IgG1-Fc區中的位置時之一個考量，即為避免改變FcRn之結合性質以及包含該經建構之半胱胺酸的抗體之半衰期。
BIAcore®分析係經實施，以決定曲妥珠單抗衍生單株抗體及彼等之個別ADC與人FcRn結合之穩定狀態親和性(KD)。BIAcore®技術利用感測器之表面層的折射率變化，此等變化發生在曲妥珠單抗衍生單株抗體或彼等之個別ADC與固定在該層上之人FcRn蛋白質結合時。結合係藉由表面電漿共振(SPR)偵測自表面折射之雷射光。人FcRn係使用BirA試劑(目錄編號BIRA500, Avidity,LLC,Aurora,Colorado)特別經由經建構之Avi標籤生物素化，且經固定至鏈黴抗生物素蛋白(SA)感測器晶片上以使FcRn蛋白質能一致定向於感測器上。接著，各種濃度的曲妥珠單抗衍生單株抗體或彼等之個別ADC於20mM MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸pH 6.0中，與150mM NaCl、3mM EDTA(乙二胺四乙酸)、0.5%表面活性劑P20(MES-EP)被注射至晶片表面。在注射週期之間，使用HBS-EP+0.05%表面活性劑P20(GE Healthcare,Piscataway,NJ)pH 7.4進行表面再生。穩定狀態結合親和性係針對曲妥珠單抗衍生單株抗體或彼等之個別ADC測定，且與野生型曲妥珠單抗抗體(在IgG1 Fc區不包含半胱胺酸突變、無TGase建構標籤或載荷物之部位專一性接合)比較。
這些資料證明在本發明指示之IgG-Fc區的位置上納入經建構之半胱胺酸殘基不會改變對FcRn之親和性(表17)。
Figure 109127593-A0101-12-0143-525
實例10：ADC結合至Fcγ受體
使用部位專一性接合之ADC與人Fc-γ受體之結合係經評估，以了解接合載荷物是否改變結合進而可影響抗體相關官能性性質諸如抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)。FcγIIIa(CD16)係表現於NK細胞及巨噬細胞 上，且經由抗體結合使此受體與目標表現性細胞共嚙合(co-engagement)誘導ADCC。BIAcore®分析係用於檢測曲妥珠單抗衍生單株抗體及彼等之個別ADC與Fc-γ受體IIa(CD32a)、IIb(CD32b)、IIIa(CD16)及FcγRI(CD64)之結合。
在此表面電漿共振(SPR)檢定中，重組人表皮生長因子受體2(Her2/neu)胞外結構域蛋白質(Sino Biological Inc.,Beijing,P.R.China)係經固定於CM5晶片(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，且約300至400反應單位(RU)之曲妥珠單抗衍生單株抗體或彼之個別ADC係經捕捉。T-DM1係包括於此評估以作為陽性對照，因為其顯示保留與未接合曲妥珠單抗抗體可相比之與Fcγ受體之接合後結合性質。接下來，各種濃度的Fcγ受體FcγIIa(CD32a)、FcγIIb(CD32b)、FcγIIIa(CD16a)及FcγRI(CD64)係經注射至表面且進行結合測定。
FcγR IIa、IIb及IIIa展現快速結合/解離速率，因此感測曲線圖係經擬合至穩定狀態模型以獲得KD數值。FcγRI展現較慢的結合/解離速率，因此資料係經擬合至動力學模型以獲得KD數值。
在經建構之半胱胺酸位置290及334上接合載荷物相較於彼等之未接合對應抗體及T-DM1顯示中度喪失對FcγR的親和性，特別是對CD16a、CD32a及CD64的親和性(表18)。然而，同時接合在部位290、334及392上導致對CD16a、CD32a及CD32b而不是對CD64顯 著親和性喪失，如用T(K290C+K334C)-vc0101及T(K334C+K392C)-vc0101所觀察到(表18)。有趣的是，T(κK183C+K290C)-vc0101雖然在K290C位置上獲得載荷藥物，但仍展現可相比的與此研究所評估之所有FcγR的結合(表18)。如預期的，轉麩醯胺酶媒介接合之T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101不與任何評估的Fcγ受體結合，因為含有醯基供體麩醯胺酸之標籤的位置移除N-連接醣基化。相反地，T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101保留與Fcγ受體之完整結合，因為該含有麩醯胺酸之標籤係經建構於人κ輕鏈恆定區之內。
綜合所述，這些結果建議接合載荷物之位置可影響ADC對FcγR之結合，且可能影響該接合物之抗體官能性。
Figure 109127593-A0101-12-0145-526
實例11：ADCC活性
在ADCC檢定中，Her2表現性細胞系BT474及SKBR3係用來作為目標細胞，而NK-92細胞(衍生自一 名50歲高加索男性周邊血液單核細胞之介白素2依賴性自然殺手細胞細胞系，由Conkwest提供)或自健康捐贈者(編號179)新鮮抽取之血液所單離之人周邊血液單核細胞(PBMC)係用來作為效應細胞。
將目標細胞(BT474或SKBR3)以1×104細胞/100μl/孔放置在96孔盤中，並於37℃/5% CO2下於RPMI1640培養基中培養整夜。隔天，移除培養基，並更換為60μl檢定緩衝液(含有10mM HEPES之RPMI1640培養基)、20μl之1μg/ml抗體或ADC，接著在各孔中加入20μl之1×105(用於SKBR3)或5×105(用於BT474)之PBMC懸浮液，或在二種細胞系中皆加入2.5×105 NK92細胞，以達到效應細胞對目標細胞比率為：PBMC對BT474為50：1，或對SKBR3為25：1，NK92對二種細胞系皆為10：1。所有樣本皆運行三次(triplicate)。
檢定盤係於37℃/5% CO2下培養6小時，接著平衡至室溫。使用CytoTox-OneTM試劑在激發波長560nm及發射波長590nm下測量自細胞溶解釋放之LDH。作為陽性對照，在對照孔中添加8μL之Triton以產生最大LDH釋放。使用下式計算圖4所示之比細胞毒性(specific cytotoxicity)：
Figure 109127593-A0101-12-0146-527
「實驗(Experimental)」對應在上述任一種條件下測量之信號。
「效應自發性(Effector spontaneous)」對應在僅PBMC存在下測量之信號。
「目標自發性(Target spontaneous)」對應在僅目標細胞存在下測量之信號。
「目標最大值(Target Maximum)」對應在僅經清潔劑溶解之目標細胞存在下測量之信號。
圖4顯示曲妥珠單抗、T-DM1及vc0101 ADC接合物之測試ADCC活性。資料符合所報告之曲妥珠單抗及T-DM1之ADCC活性。由於N297Q突變係位於醣基化部位，因此預期T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101不具有ADCC活性，此預期亦在檢定中獲得證實。單突變(K183C、K290C、K334C、K392C包括LCQ05)ADC則維持ADCC活性。意外的是，在雙突變(K183C+K290C、K183C+K392C、K183C+K334C、K290C+K392C、K290C+K334C、K334C+K392C)ADC中，除了二個與K334C部位有關的雙突變ADC(K290C+K334C及K334C+K392C)以外，所有皆維持ADCC活性。
實例12：試管內細胞毒性檢定
抗體-藥物接合物係如實例3所示製備。將細胞以低密度接種於96孔盤，接著在隔天用ADC及未接合載荷物之10個濃度的3倍連續稀釋液處理二次(duplicate)。將細胞在潮濕的37℃/5% CO2培養箱中培養4天。盤係藉由與CellTiter®96 AQueous One MTS溶液(Promega,Madison,WI)一起培養1.5小時加以收集，並在波長490nm下在Victor孔盤讀取儀(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上測量吸光度。IC50數值使用採用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四參數對數模型計算，且在圖5中報告為nM載荷物濃度，在圖6中報告為ng/ml抗體濃度。IC50係顯示為+/-標準差，獨立測定次數顯示於括弧 中。
相較於基準ADC T-DM1(Kadcyla)，含有vc-0101或AcLysv-0101連接子載荷物之ADC對於Her2陽性細胞模型高度有效，且對Her2陰性細胞具有選擇性。
利用部位專一性接合曲妥珠單抗所合成之ADC顯示對Her2細胞模型之高度有效性及選擇性。值得注意的是，數種曲妥珠單抗-vc0101 ADC在中度或低度Her2表現性細胞模型中比T-DM1更為有效。例如，T(kK183C+K290C)-vc0101在MDA-MB-175-VII細胞(具有1+Her2表現)中的試管內細胞毒性IC50為351ng/ml，相較之下T-DM1為3626ng/ml(約低10倍)。對於具有2++Her2表現水準之細胞諸如MDA-MB-361-DYT2及MDA-MB-453細胞，T(kK183C+K290C)-vc0101之IC50係12至20ng/ml，相較之下T-DM1係38至40ng/ml。
實例13：異種移植模型
本發明之曲妥珠單抗衍生ADC係於N87胃癌異種移植模型、37622肺癌異種移植模型及數個乳癌異種移植模型(即，HCC 1954、JIMT-1、MDA-MB-361(DYT2)及144580(PDX)模型)中測試。下述之各模型中，第一劑皆於第1天給予。每周至少測量一次腫瘤，彼等之體積係以下式計算：腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤寬度2)(腫瘤長度)。各治療組之平均腫瘤體積(±S.E.M.)係由包括最多8至10隻動物，最少6至8隻動物加以計算。
A.N87胃癌異種移植
曲妥珠單抗衍生ADC對於人腫瘤異種移植活體內生長的效應係於免疫缺陷小鼠檢測，該等異種移植係自具有高水準HER2表現之N87細胞系(ATCC CRL-5822)建立。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu,Charles River Lab,Wilmington,MA)係經皮下植入於50%基質膠(BD Biosciences)中之7.5×106個N87細胞。當腫瘤到達250至450mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。N87胃癌模型係以PBS載劑、曲妥珠單抗ADC(0.3、1及3mg/kg)或T-DM1(1、3及10mg/kg)靜脈內投藥4次，每次相隔4天(Q4dx4)(圖7)。
資料證明曲妥珠單抗衍生ADC以劑量依賴性方式抑制N87胃癌異種移植之生長(圖7A至7H)。
如圖7I所示，T-DM1在1及3mg/kg下延緩腫瘤生長，且在10mg/kg下完全緩解腫瘤。然而，T(kK183C+K290C)-vc0101在1及3mg/kg下提供完全緩解且在0.3mg/kg下提供部分緩解(圖7A)。資料顯示在此模型中，T(kK183C+K290C)-vc0101相較於T-DM1顯著更為有效(約10倍)。
自具有DAR4之ADC(圖6E、6F及6G)獲得與183+290(圖7A)相比類似的活體內療效。此外，評估其係DAR2 ADC之單突變物(圖7B、7C及7D)。一般來說， 這些ADC比起DAR4 ADC較為無效，但是比起T-DM1則較為有效。在DAR2 ADC中，根據活體內療效資料LCQ05似乎是最有效的ADC。
B.HCC1954乳癌異種移植
HCC1954(ATCC# CRL-2338)係高度HER2表現乳癌細胞系。為了產製異種移植物，SHO母小鼠(Charles River,Wilmington,MA)係經皮下植入於50%基質膠(BD Biosciences)中之5×106個HCC1954細胞。當腫瘤到達200至250mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。HCC1954乳癌模型係以PBS載劑、曲妥珠單抗衍生ADC及陰性對照ADC靜脈內投藥Q4dx4(圖8A至8E)。
資料證明曲妥珠單抗ADC以劑量依賴性方式抑制HCC1954乳癌異種移植之生長。比較1mg/kg的劑量，vc0101接合物比起T-DM1更為有效。比較0.3mg/kg的劑量，DAR4裝載ADC(圖8B、8C及8D)比起DAR2裝載ADC更為有效(圖8A)。另外，相較於載劑對照(圖8D)，陰性對照ADC在1mg/kg下對於腫瘤生長具有非常小的影響。然而，T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101完全緩解腫瘤表示目標專一性。
C.JIMT-1乳癌異種移植
JIMT-1係表現中度/低度Her2的乳癌細胞系， 且固有地對曲妥珠單抗具有抗性。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係經皮下植入於50%基質膠(BD Biosciences)中之5×106個JIMT-1細胞(DSMZ# ACC-589)。當腫瘤到達200至250mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。JIMT-1乳癌模型係以PBS載劑、T-DM1(圖9G)、使用部位專一性接合之曲妥珠單抗衍生ADC(圖9A至9E)、使用習知接合之曲妥珠單抗衍生ADC(圖9F)及陰性對照huNeg-8.8 ADC靜脈內投藥Q4dx4。
資料證明所有測試之vc0101接合物皆以劑量依賴性方式造成腫瘤減小。這些ADC在1mg/kg下可造成腫瘤緩解。然而，T-DM1在此中度/低度Her2表現性模型中不具活性，即使在6mg/kg下。
D.MDA-MB-361(DYT2)乳癌異種移植
MDA-MB-361(DYT2)係表現中度/低度Her2的乳癌細胞系。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係以100cGy/min照射4分鐘，三天之後經皮下植入於50%基質膠(BD Biosciences)中之1.0×107個MDA-MB-361(DYT2)細胞(ATCC# HTB-27)。當腫瘤到達300至400mm3之體積時，該腫瘤被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。DYT2乳癌模型係以PBS載劑、使用部位專一性及習知接合之曲妥珠單抗衍生ADC、T-DM1及陰性對照ADC靜脈投藥Q4dx4(圖10A至10D)。
資料證明曲妥珠單抗ADC以劑量依賴性方式抑制DYT2乳癌異種移植之生長。雖然DYT2係中度/低度Her2表現細胞系，其對於微管抑制劑比其他Her2低度/中度表現性細胞系更敏感。
E.144580病患衍生乳癌異種移植
曲妥珠單抗衍生ADC對於人腫瘤異種移植活體內生長的效應係於免疫缺陷小鼠檢測，該等異種移植係自根據適當知情程序獲得之新鮮切除的144580乳房腫瘤之片段建立。當採集新鮮活體組織檢查時144580之腫瘤表徵係三陰性(ER-、PR-、及HER2-)乳癌腫瘤。144580乳癌病患衍生異種移植係於活體內皮下繼代，即在母裸鼠(Nu/Nu)中從動物至動物以片段繼代。當腫瘤到達150至300mm3之體積時，它們被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。144580乳癌模型係以PBS載劑、使用部位專一性接合之曲妥珠單抗ADC、使用習知接合之曲妥珠單抗衍生ADC及陰性對照ADC(圖11A至11E)每四天靜脈投藥共四次(Q4dx4)。
在此HER2-(依據臨床定義)之PDX模型中，T-DM1在所有測試劑量下皆無效(1.5、3及6mg/kg)(圖10E)。DAR4 vc0101 ADC(圖11A、11C及11D)的3mg/kg能夠造成腫瘤緩解(圖11C中即使在1mg/kg下亦可)。DAR2 vc0101 ADC(圖11B)在3mg/kg下比DAR4 ADC無效。然而，不像T-DM1，DAR 2 vc0101 ADC在6mg/kg 下係有效。
F.37622病患衍生非小細胞肺癌異種移植
數種ADC係於根據適當知情程序獲得之37622的病患衍生非小細胞肺癌異種移植模型中測試。37622病患衍生異種移植係於活體內皮下繼代，即在母裸鼠(Nu/Nu)中從動物至動物以片段繼代。當腫瘤到達150至300mm3之體積時，它們被分期以確保在不同處理組之間的腫瘤大小之一致性。37622 PDX模型係以PBS載劑、使用部位專一性接合之曲妥珠單抗衍生ADC、T-DM1及陰性對照ADC(圖12A至12D)每四天靜脈投藥共四次(Q4dx4)。
Her2之表現係由改良式Hercept測試進行分析，且係分類為2+，比細胞系中所見具有更高異質性。與連接子-載荷物vc0101接合之ADC(圖12A至12C)在1及3mg/kg下有效地造成腫瘤緩解。然而，T-DM1僅在10mg/kg下提供一些治療好處(圖12D)。比較10mg/kg之T-DM1與1mg/kg之vc0101 ADC的結果，vc0101 ADC似乎比T-DM1有效10倍。旁路效應對異質性腫瘤的療效來說有可能是重要的。
T-DM1 ADC之釋放代謝物經顯示係經離胺酸加蓋之mcc-DM1連接子載荷物(即Lys-mcc-DM1)，其係膜不可穿透性化合物(Kovtun et al.,2006,Cancer Res 66：3214-21；Xie et al.,2004,J Pharmacol Exp Ther 310：844)。然而，自T-vc0101 ADC釋放之代謝物係耳抑素0101，其係膜穿透性高於Lys-mcc-DM1之化合物。經釋放之ADC載荷物殺死鄰近細胞之能力稱為旁路效應(bystander effect)。由於膜穿透性載荷物之釋放，因此T-vc0101能夠誘發強烈旁路效應，而T-DM1則否。圖13顯示N87細胞系異種移植腫瘤的免疫組織化學分析，該等腫瘤接收單劑量T-DM1 6mg/kg(圖XA)或T-vc0101 3mg/kg(圖XB)，接著在96小時之後收集並以福馬林固定處理。腫瘤切片係針對人IgG染色以偵測結合至腫瘤細胞之ADC，以及針對磷酸化組蛋白H3(pHH3)染色以偵測有絲分裂細胞，以讀取二種ADC之載荷物的假定作用機制。
在二例中，ADC皆在腫瘤周圍偵測到。在T-DM1處理腫瘤中(圖13A)，大部分的pHH3陽性腫瘤細胞位於ADC附近。然而，在T-vc0101處理腫瘤中(圖13B)，大部分的pHH3陽性腫瘤細胞位於超過ADC的位置(黑色箭頭指出少數實例)且係在腫瘤內部。此建議具有可切割連接子及膜穿透性載荷物之ADC可在活體內誘發強烈的旁路效應。
實例14：試管內(in vitro)T-DM1抗性模型
A.產製試管內T-DM1抗性細胞
N87細胞係繼代至二個不同的角瓶，且各角瓶係經完全相同的抗性產製規程處理，以能夠獲得生物雙重 物(duplicate)。將細胞暴露至大約IC80濃度(10nM載荷物濃度)的T-DM1接合物五個週期3天，之後為大約4至11天的無處理恢復期。在五個週期的10nM之T-DM1接合物之後，將細胞以類似方式暴露至六個額外的100nM T-DM1週期。該程序意圖模擬在診間通常使用細胞毒性治療劑以最大耐受劑量慢性、多週期(投藥/停藥)投藥，然後是恢復期。自N87衍生之親代細胞稱為N87，經過慢性暴露T-DM1之細胞稱為N87-TM。N87-TM細胞在4個月內發展出中至高水準之藥物抗性。在週期處理大約3至4個月、持續藥物暴露不再增加抗性水準之後，移除藥物選擇壓力。之後使培養細胞系中之反應及表型維持穩定大約3至6個月。之後，偶而觀察到以細胞毒性檢定測量之抗性表型強度減少，在這種情形下，將早期繼代之冷凍保存T-DM1抗性細胞解凍以進行額外試驗。所有報告之表徵在移除T-DM1選擇壓力之後進行至少2至8週，以確保細胞穩定。在模型發展之後大約1至2年間，收集衍生自單一選擇的各種解凍的冷凍保存族群資料，以確保結果的一致性。
進行胃癌細胞系N87對曲妥珠單抗-類美坦素(maytansinoid)抗體-藥物接合物(T-DM1)之抗性選擇，該選擇係藉由以個別細胞系之大約IC80(約10nM載荷物濃度)的劑量之處理週期來進行。親代N87細胞固有地對接合物(IC50=1.7nM載荷物濃度；62ng/ml抗體濃度)敏感(圖14)。將二個親代N87細胞族群暴露至處理週期，且在 僅大約四個月100nM T-DM1暴露週期之後，這二個族群(以下稱為N87-TM-1及N87-TM-2)變成對於ADC分別具有相較於親代細胞114及146倍之抗性(圖14及圖15A)。
有趣的是，觀察到對於對應未接合類美坦素游離藥物DM1的最小交叉抗性(約2.2至2.5X)(圖14)。
B.細胞毒性試驗
ADC係如實例3所示製備。未接合美坦素(maytansine)類似物(DM1)及耳抑素(auristatin)類似物係由Pfizer Worldwide Medicinal Chemistry(Groton,CT)製備。其他標準照護化學治療劑購自Sigma(St.Louis,MO)。將細胞以低密度接種於96孔盤，接著在隔天用ADC及未接合載荷物之10個濃度的3倍連續稀釋液處理二次(duplicate)。將細胞在潮濕的37℃/5% CO2培養箱中培養4天。盤係藉由與CellTiter®96 AQueous One MTS溶液(Promega,Madison,WI)一起培養1.5小時加以收集，並在波長490nm下在Victor孔盤讀取儀(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上測量吸光度。IC50數值係使用採用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四參數對數模型計算。
對其他曲妥珠單抗衍生ADC之交叉抗性資料係經測定。觀察到對許多由不可切割連接子及具有抗微管蛋白作用機制之遞送載荷物所組成之曲妥珠單抗衍生ADC的顯著交叉抗性(圖14)。例如，在N87-TM相較於N87-親代細胞中，觀察到T-mc8261(圖14及圖15B)及T- MalPeg8261(圖14)(彼等分別代表經由不可切割之順丁烯二醯亞胺基己醯基或Mal-PEG連接子連接至曲妥珠單抗之基於耳抑素之載荷物)的效力分別減少>330倍及>272倍。在N87-TM細胞中，觀察到對T-mcMalPegMMAD(另一種具有不同的不可切割連接子遞送單甲基海兔毒素(monomethyl dolastatin,MMAD)之曲妥珠單抗ADC)超過235倍的抗性(圖14)。
值得注意的是，觀察到當載荷物經由可切割之連接子遞送時，N87-TM細胞系維持對載荷物之敏感性，即使這些藥物在功能上抑制類似的目標(即微管去聚合化)。克服抗性之ADC實例包括但不限於T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101(圖14及圖15C)、T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101(圖14及圖15D)、T(K290C+K334C)-vc0101(圖10及圖11E)、T(K334C+K392C)-vc0101(圖14及圖15F)及T(kK183C+K290C)-vc0101(圖14及圖15G)。這些代表遞送耳抑素類似物0101，但其中載荷物係於細胞內藉由蛋白水解切割vc連接子而釋放之基於曲妥珠單抗之ADC。
為了決定這些ADC抗性癌細胞是否對其他療法具有廣泛抗性，N87-TM細胞模型係使用一組具有各種作用機制之標準照護化學治療劑處理。一般來說，微管及DNA功能之小分子抑制劑維持對N87-TM抗性細胞系有效(圖14)。雖然這些細胞係經處理使產生對遞送微管去聚合化劑類似物美坦素之ADC的抗性，但很少或沒有觀察 到對數種微管蛋白去聚合化劑或聚合化劑之交叉抗性。類似地，兩種細胞系皆維持對干擾DNA功能之藥劑之敏感性，包括拓撲異構酶抑制劑、抗代謝物劑、及烷化/交聯劑。一般來說，N87-TM細胞並非對廣泛範圍之細胞毒素具有抗性，因此排除可能模擬藥物抗性之一般性生長或細胞週期缺陷。
二個N87-TM族群亦維持對於對應未接合藥物(即DM1及0101；圖14)之敏感性。因此，經處理使產生對曲妥珠單抗-類美坦素接合物具有抗性之N87-TM細胞展示對經由不可切割連接子遞送之其他基於微管之ADC之交叉抗性，但仍維持對未接合微管抑制劑及其他化學治療劑之敏感性。
為了測定在N87-TM細胞中對T-DM1抗性之分子機制，測定MDR1及MRP1藥物流出泵之蛋白質表現水準。此係因為小分子微管蛋白抑制劑係MDR1及MRP1藥物流出泵之已知受質(Thomas and Coley,2003,Cancer Control 10(2)：159-165)。測定來自親代N87及N87-TM抗性細胞之全細胞溶解物的這二種蛋白質的蛋白質表現水準(圖16)。免疫墨點分析顯示N87-TM抗性細胞不顯著過度表現MRP1(圖16A)或MDR1(圖16B)蛋白質。綜合所述，這些資料結合N87-TM細胞缺乏對藥物流出泵已知受質(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多柔比星(doxorubicin))之交叉抗性，建議藥物流出泵過度表現並不是N87-TM細胞中之T-DM1抗性的分子機制。
由於ADC之作用機制需要結合至特定抗原，因此抗原除盡或減少抗體結合可能是造成N87-TM細胞中之T-DM1抗性的原因。為了決定N87-TM細胞中是否顯著除盡T-DM1之抗原，比較親代N87及N87-TM抗性細胞之全細胞溶解物之HER2蛋白質表現水準(圖17A)。免疫墨點分析顯示N87-TM細胞相較於親代N87細胞不具有明顯減少量之HER2蛋白質表現。
結合至N87-TM細胞之細胞表面HER2抗原之抗體的量係經決定。在一項使用螢光激活細胞分選之細胞表面結合研究中，N87-TM細胞確實具有結合至細胞表面抗原之曲妥珠單抗約50%之下降(圖17B)。由於N87細胞係高度表現HER2蛋白質之癌細胞系(Fujimoto-Ouchi et al.,2007,Cancer Chemother Pharmacol 59(6)：795-805)，在這些細胞中HER2抗體結合減少約50%可能不代表在N87-TM細胞中造成對T-DM1抗性之機制。支持此解釋之證據係在於，N87-TM抗性細胞維持對其他具有不同連接子及載荷物之HER2結合性曲妥珠單抗衍生ADC之敏感性(圖14)。
為了以無偏差之方式決定T-DM1抗性的可能機制，親代N87及N87-TM抗性細胞模型係經由蛋白質體方式進行分析，以全面性識別可能造成T-DM1抗性之膜蛋白質表現水準之變化。觀察到523個蛋白質在兩個細胞系模型中有顯著的表現水準之變化(圖18A)。要驗證入選的這些預測蛋白質的變化，以N87以及N87-TM全細胞溶 解物進行在N87-TM細胞中(相對於N87細胞)預測為表現不足(IGF2R,LAMP1,CTSB)(圖18B)以及過量表現(CAV1)(圖18C)的蛋白質的免疫墨點。將N87和N87-TM-2細胞經皮下植入NGS小鼠中產製體內腫瘤，以評估體內觀察到的蛋白質變化是否模擬試管內觀察到的蛋白質變化。與N87腫瘤相比，N87-TM-2腫瘤保留CAV1蛋白質的過量表現(圖18D)。雖然在兩個模型中的小鼠基質皆呈現CAV1染色是可預期的，但只在N87-TM-2模型中看到上皮CAV1染色。
C.活體內療效試驗
為了判定在細胞培養中觀察到的抗性是否在體內重現，親代N87細胞與N87-TM-2細胞被擴增並注射入雌性NOD scid γ(NSG)免疫不全小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)的側腹中，小鼠獲自The Jackson Labotatory(Bar Harbor,ME)。在小鼠右側腹皮下注射N87或N87-TM細胞懸浮液(每次注射7.5×106細胞與50%基質膠)。當腫瘤到達約0.3克(~250mm3)時，小鼠被隨機分入研究組。T-DM1接合物或載劑在第0天用生理食鹽水靜脈投予，並重複投予總共4次，每次相隔4天(Q4Dx4)。每週測量腫瘤並按體積=(寬度×寬度×長度)/2計算質量。進行時間對事件(腫瘤倍增)分析，並利用對數等級(Mantel-Cox)檢定來評估顯著性。在這些研究中，所有處理組的小鼠皆未觀察到體重減輕。
小鼠用以下劑處理：(1)載劑對照PBS；(2)13mg/kg的曲妥珠單抗抗體，然後45mg/kg；(3)6mg/kg的T-DM1；(4)10mg/kg的T-DM1；(5)10mg/kg的T-DM1，然後3mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101；(6)3mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101。監測腫瘤大小，結果顯示於圖20。N87(圖19和圖20A)和N87-TM-2(圖19和圖20B)腫瘤顯示出類似試管內細胞毒性檢定所見之ADC療效曲線(圖19和圖20B)，其中N87-TM藥物抗性細胞對T-DM1具有抗性，但仍對具可切割連接子之曲妥珠單抗衍生ADC有反應。事實上，對T-DM1具有抗性且生長至大約1克的腫瘤，轉而用T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101治療時得到有效緩解(圖20B)。在本研究之時間對事件分析中，在N87模型中，T-DM1 6和10mg/kg防止大於50%的小鼠發生腫瘤倍增至少60天，但T-DM1在N87-TM-2模型中無法如此(圖20C和20D)。T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101在3mg/kg之劑量下，於研究期間(約80天)防止小鼠N-87與N87-TM兩種腫瘤的任何腫瘤倍增(圖20C和20D)。
在另一研究中，在試管內克服T-DM1抗性之所有可切割連接之ADC，在對T-DM1無反應的此N87-TM2腫瘤模型中保持有效(圖19和圖20E)。
接著評估T(kK183+K290C)-vc0101 ADC是否可以抑制對TDM1有抗性的腫瘤生長。經載劑或T-DM1處理的N87-TM腫瘤在這些治療期間持續生長，然而在第 14天轉而用T(kK183C+K290C)-vc0101治療的腫瘤立即得到緩解(圖20F)。
實例15：體內T-DM1抗性模型
A.產製體內T-DM1抗性細胞
所有動物研究均由Pfizer Pearl River Institutional Animal Care and Use Committee根據既定指南核准。為了產製異種移植物，母裸鼠(Nu/Nu)係經7.5×106 N87細胞於50%基質膠(BD Biosciences)之皮下植入。當平均腫瘤體積到達約300mm3時，將動物隨機分成兩組：1)載劑對照組(n=10)和2)T-DM1處理組(n=20)。T-DM1 ADC(6.5mg/kg)或載劑(PBS)在第0天用生理食鹽水靜脈投予動物，然後每週投藥6.5mg/kg最長達30週。每週測量腫瘤兩次或一次，並按體積=(寬度 x 寬度 x 長度)/2計算質量。在這些研究中，所有處理組的小鼠皆未觀察到體重減輕。
在T-DM1處理下，當個別腫瘤體積到達約600mm3時(為隨機分配時腫瘤原始大小加倍)，動物被視為具有抗性或復發。與對照組比較，最初大部分腫瘤對T-DM1處理有反應，如圖21A所示。更具體而言，20隻小鼠中有17隻最初對T-DM1處理有反應，但顯著數量的腫瘤(20中之13)在T-DM1處理下復發。經過一段時間，植入的N87腫瘤細胞變得對T-DM1具有抗性(圖21B)。收集最初對T-DM1處理沒有反應的三個腫瘤，由IHC測 定Her2表現，表示沒有HER2表現變化。剩餘10個復發腫瘤如下所述。
最初對T-DM1處理有反應然後復發的4個腫瘤，在第77天(小鼠1和16)、第91天(小鼠19)、第140天(小鼠6)轉而用每週2.6mg/kg的T-vc0101處理。如圖19C所示，在體內產製的T-DM1抗性腫瘤對T-vc0101有反應，表示獲得的T-DM1抗性腫瘤對vc0101 ADC處理具敏感性。
最初對T-DM1處理有反應然後復發的另外3個腫瘤，在第110天轉而用每週2.6mg/kg的T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101處理(小鼠4、13、和18)。如圖21D所示，在體內產製的T-DM1抗性腫瘤也對T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101具反應。後續的實驗經實施以評估T(kK183C+K290C)-vc0101獲得類似的結果，如圖21E所示，這表示體內產製的T-DM1抗性腫瘤對T(kK183C+K290C)-vc0101處理具敏感性。
總而言之，經後續處理的所有T-DM1抗性腫瘤對vc0101 ADC處理皆為敏感(7中之7)，表示體內抗性T-DM1腫瘤可用可切割vc0101接合物處理。
將最初對T-DM1有反應然後復發的另外三個腫瘤(如圖21B所示之小鼠7、17、和2)切除以用於試管內表徵。在試管內培養經切除的腫瘤2至5個月之後，評估這些細胞對T-DM1的抗性並進行試管內表徵(參見本實例下面的B和C部分)。
B.細胞毒性試驗
將經T-DM1處理而復發並於試管內培養的細胞(如本實例A部分所述)接種至96孔盤中，接著隔天用ADC或未接合載荷物的4倍連續稀釋液投藥。將細胞在潮濕的37℃/5% CO2培養箱中培養96小時。將CellTiter Glo溶液(Promega,Madison,WI)加入盤中並在波長490nm下在Victor孔盤讀取儀(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上測量吸光度。IC50數值係使用採用XLfit(IDBS,Bridgewater,NJ)之四參數對數模型計算。
細胞毒性篩選結果總結在表19和20。當與親代細胞相比，細胞對T-DM1(圖22A)具抗性但對可切割vc0101接合物T-vc0101(資料未顯示)、T(kK183C+K290C)-vc0101(圖22B)、T(LCQ05+K222R)-AcLysvc0101(圖22C)、和T(N297Q+K222R)-AcLysvc0101(圖22D)(表19)具敏感性。T-DM1抗性細胞令人意外地對親代載荷物DM1及0101載荷物(表20)具敏感性。
Figure 109127593-A0101-12-0164-227
Figure 109127593-A0101-12-0165-228
C.以FACS和西方墨點分析Her2表現
Her2表現係於經T-DM1處理而復發並於試管內培養的細胞(如本實例A部分所述)中表徵。對於FACS分析，細胞係經胰蛋白酶消化、離心及重懸於新鮮培養基中。該等細胞接著與5μg/mL之曲妥珠單抗-PE(由eBiosciences(San Diego,CA)客製合成1：1 PE標示之曲妥珠單抗)於4℃下培養一小時。該等細胞接著以PBS清洗二次且接著重懸於PBS中。使用Accuri流式細胞儀(BD Biosciences San Jose,CA)讀取平均螢光強度。
對於西方墨點分析，將細胞使用RIPA溶解緩衝液(具有蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑)在冰上溶解15分鐘，接著渦流，並在微量離心機中4℃下以最大速度離心。收集該上清液，並將4X樣本緩衝液與還原劑加至樣本中以標準化每個樣本中的總蛋白。樣本係於4至12% Bis tris膠上運行並轉移至硝化纖維素膜上。將膜封閉1小時並在4℃下以HER2抗體(Cell Signalling,1：1000)培養過夜。然後將膜以1X TBST清洗3次並且以抗小鼠HRP抗體(Cell Signalling,1：5000)培養1小時，清洗3次並探 測。
經FACS(圖23A)與西方墨點(圖23B)評估，T-DM1復發性腫瘤之HER2表現水準與對照腫瘤(無T-DM1處理)類似。
D. T-DM1抗性不是由於藥物流出泵的表現
西方墨點顯示細胞系並未表現MDR1(圖24A)並且細胞對MDR-1受質游離藥物0101沒有抗性(圖24B)。沒有觀察到對多柔比星的抗性(圖24C)表示抗性機制不是經由MRP1。然而，細胞仍然對游離DM1(圖24D)具有抗性。
實例16：藥物動力學(PK)
向馬來猴IV推注投予劑量5或6mg/kg之習知或部位專一性vc0101抗體藥物接合物之後，測定其暴露。使用配體結合檢定(LBA)測量總抗體(總Ab；接合mAb和未接合mAb的測量值)和ADC(至少接合一個藥物分子的mAb)的濃度。除了使用AcLysvc0101的T(LCQ05)之外，其他所有情況皆使用vc0101製造ADC。使用習知接合(非部位專一性接合)自曲妥珠單抗製造ADC。
在對馬來猴投予劑量後之總Ab以及曲妥珠單抗ADC(T-vc0101)(5mg/kg)或T(kK183C+K290C)部位專一性ADC(6mg/kg)的濃度對時間曲線、藥物動力學/毒物動力學(圖25A和表21)。與習知接合物相比時， T(kK183C+K290C)部位專一性ADC的暴露具有同時增加的暴露及穩定性。
在對馬來猴投予劑量後，對曲妥珠單抗(T-vc0101)(5mg/kg)或T(kK183C+K290C)、T(LCQ05)、T(K334C+K392C)、T(K290C+K334C)、T(K290C+K392C)及T(kK183C+K392C)部位專一性ADC(6mg/kg)的ADC分析物進行濃度對時間曲線及藥物動力學/毒物動力學分析(圖25B及表21)。與使用習知接合的曲妥珠單抗ADC相比，幾個部位專一性ADC(T(LCQ05)、T(kK183C+K290C)、T(K290C+K392C)、和T(kK183C+K392C))有較高的暴露。然而，其他兩個部位專一性ADC(T(K290C+K334C)及T(K334C+K392C))沒有比曲妥珠單抗ADC具有更高的暴露，表示並非所有部位專一性ADC都將具有比習知接合製造的曲妥珠單抗ADC更好的藥物動力學性質。
Figure 109127593-A0101-12-0168-229
實例17：疏水性交互作用層析之相對滯留值相較於大鼠中之暴露(AUC)
疏水性是蛋白質之物理性質，其可用疏水性交互作用層析法(HIC)加以評估，且蛋白質樣本基於它們的相對疏水性會有不同的滯留時間。ADC與它們個別的抗體比較可藉由計算相對滯留時間(RRT)進行，該相對滯留時間即是ADC之HIC滯留時間除以個別抗體之HIC滯留時間的比例。高度疏水性ADC具有較高的RRT，並且這些ADC的藥物動力學性質可能也較不佳，特別是較低的曲線下面積(AUC，或暴露)。將具有不同部位突變之 ADC的HIC值與其等在大鼠中測量之AUC相比時，觀察到圖26的分布。
RRT
Figure 109127593-A0101-12-0169-446
1.9的ADC顯示較低的AUC值，然而具有較低RRT的ADC傾向具有較高的AUC，雖然這關係並非直接。在ADC T(kK183C+K290C)-vc0101觀察到具有相對較高的RRT(平均值為1.77)，因此預期具有相對較低之AUC。令人意外地，所觀察到之AUC相對為高，因此無法顯而易見地自疏水性資料預測此ADC之暴露。
實施例18：毒性試驗
在兩個獨立探索毒性試驗中，總共10隻雄性與雌性馬來猴分成5個劑量組(1隻/性別/劑量)，係經每三週一次IV投藥(試驗第1、22、和43天)。在試驗的第46天(第3次投予劑量後3天)，將動物安樂死並按指定規程收集血液與組織樣本。
在生存中和屍檢後進行臨床觀察、臨床病理學、巨觀與微觀病理學評估。對於解剖病理學的評估，以主觀、相對、研究特定之基礎，記錄組織病理學發現的嚴重性。
在3和5mg/kg馬來猴探索毒性研究中，在第一次投藥後第11天，T-vc0101造成暫時但明顯(390/μl)至嚴重(40/μl至無法檢出)的嗜中性白血球減少症。相反的，在任何測試時間點，所有經9mg/kg之T(kK183C+K290C)-vc0101投藥的馬來猴具有無至最小的嗜中性白血球減少症，其嗜中性白血球計數遠高於500/μl(圖27)。事 實上，與載劑對照組相比，經T(kK183C+K290C)-vc0101投藥的動物在第11天與14天顯示平均的嗜中性白血球計數(>1000μL)。
在顯微鏡下，經3和5mg/kg T-vc0101投藥的馬來猴骨髓中具化合物相關之M/E比增加。增加的骨髓球系細胞/紅血球系細胞(M/E)比由減少的紅血球系細胞前驅物，結合增加的主要成熟顆粒性白血球所組成。相比之下，在6和9mg/kg下，只有經6mg/kg/劑量之T(kK183C+K290C)-vc0101投藥的雄性具最小至輕度的成熟顆粒性白血球之細胞數目增加(資料未顯示)。
因此，血液學與顯微資料明顯顯示，基於部位專一性突變技術的ADC接合物T(kK183C+K290C)-vc010明顯改善T-vc010誘導的骨髓毒性與嗜中性白血球減少症。
實例19：ADC結晶結構
得到T(K290C+K334C)-vc0101、T(K290C+K392C)-vc0101、和T(K334C+K392C)-vc0101的結晶結構。選擇這些特定ADC用於結晶學，是因為接合K290C+K334C和K334C+K392C雙半胱胺酸變異體消除ADCC活性，但K290C+K392C則否。
用於結晶學之接合Fc區係使用木瓜酵素切割ADC製備。使用相同條件：100mM NaCitrate pH 5.0+100mM MgCl2+15% PEG 4K，得到三個接合IgG1-Fc區 之相同型態的結晶。
保存於PDB中的野生型人IgG1-Fc結構相對相似，顯示CH2-CH2結構域經由Asn297-連接聚醣(碳水化合物或聚醣天線)彼此接觸，並且CH3-CH3結構域形成一個在結構之間相對恆定的穩定界面。Fc結構以「封閉」或「打開」構形存在，並且去醣基化Fc結構採用「打開」結構構形，因此證明是由聚醣天線將CH2區保持在一起。此外，未接合Phe241Ala-IgG1 Fc突變體公開結構(Yu et al.“Engineering Hydrophobic
Protein-Carbohydrate interactions to fine-tune monoclonal antibodies”.JACS 2013)顯示一個部分無序的CH2結構域，因為此突變導致CH2-聚醣界面以及CH2-CH2界面之去穩定化(因芳族Phe殘基不能穩定碳水化合物)。
人IgG Fc區「CH2結構域」(亦稱為「Cγ2」結構域)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2結構域很特別，因為其不與另一結構域緊密配對。反而有兩條N-連接分支碳水化合物鏈插入完整天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。目前推測認為碳水化合物可以提供結構域-結構域配對的替代作用，並幫助穩定CH2結構域(Burton et al.,1985,Molec.Immunol.22：161-206)。
「CH3結構域」包含Fc區中位於CH2結構域C端的殘基片段(即從IgG的約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。
T(K290C+K334C)-vc0101和T(K290C+K392C)-vc0101兩者Fc區之解析結構相似，顯示Fc二聚體含有高度有序之一個CH2和兩個CH3(如野生型Fc)。然而，它們也含有一個與聚醣連接的無序CH2(圖28A和圖28B)。一個CH2結構域較高程度的去穩定化係歸因於接合部位與聚醣天線之間的近距離。考慮0101載荷物幾何形狀，在K290、K334、K392中任一部位之接合，可能擾亂聚醣之整體軌跡而遠離CH2表面，使聚醣以及CH2結構本身去穩定化，因此導致CH2-CH2界面(圖28C)。相對於WT-Fc、Phe241Ala-Fc、或去醣基化-Fc，這些0101部位專一性地接合雙半胱胺酸-Fc-變異體具有較高程度的異質性。當經建構之半胱胺酸變異體位置被映射在與FcγR型IIb複合的WT-Fc結構上，其顯示在C334的接合可能直接干擾與FcγRIIb的結合(圖28C)。這種由突變或接合引起的CH2位置異質性可能導致FcRIIb結合顯著的降低。因此，這些結果建議，構形異質性或0101與IgG1-Fc之中某些經建構半胱胺酸組合的接合，可能影響含有K334C部位的雙半胱胺酸變異體的ADCC活性，或者兩者皆可能造成此影響。
實例20：在其他抗體使用部位專一性接合
用於製備本發明之部位專一性HER2 ADC的部位與修飾可以用在針對其他抗原的抗體上，並且仍然導致優於習知接合之ADC的改善療效。
使用習知接合以及部位專一性接合，將抗體A(針對腫瘤相關抗原)製成ADC。在二例中，使用的連接子皆為vc，使用的藥物皆為耳抑素0101。對於部位專一性接合，將抗體輕鏈上的K183部位以及抗體重鏈CH2區中的K290部位(使用卡巴之EU指數)改變成半胱胺酸(C)以允許接合連接子/載荷物。
用於製備部位專一性ADC的方法類似於該些用於製備T(kK183C+K290C)-vc0101(同上)的方法。接合效率為61%，接合抗體的平均DAR為4，具有與T(kK183C+K290C)-vc0101相似的HIC-RRT曲線。
評估部位專一性接合物(SSC)的熱穩定性，SSC最低熔點為65℃，表示具有足夠的穩定性。也評估SSC與其目標腫瘤抗原的結合，並與未接合的抗體相比，基於ELISA結合檢定中沒有偵測到結合能力降低，表示與載荷物連接子vc0101接合後保留良好的結合親和性。
接著在具腫瘤抗原表現升高的腫瘤細胞系中評估試管內細胞毒性。在使用多個腫瘤細胞系的細胞毒性檢定中，SSC具有與習知ADC可相比的細胞毒性效力。體內療效試驗進一步在異種移植腫瘤模型中執行，該模型用過度表現腫瘤抗原的腫瘤細胞接種。在一個模型中，使用3mg/kg劑量水準之SSC，在每週投予兩次共4次之後導致腫瘤完全緩解。維持腫瘤緩解直到最後一次投藥之後約60天，觀察到腫瘤再生長。相對地，雖然習知ADC用相同投藥計畫，4次投藥後也導至腫瘤緩解，但在最後一 次投藥之後約30天觀察到腫瘤再生長，比用SSC早得多。在其他腫瘤模型的療效試驗中，觀察到類似的維持較佳腫瘤緩解療效的發現。這些資料指示，基於kK183C+K290C之抗體A部位專一性接合物與習知製備的ADC相比，在投藥動物中維持更好的暴露，表示改善SSC穩定性導致更好的藥物動力學參數。
實例21。不同接合部位導致不同ADC性質
A.合成cys-突變物ADC的一般程序：
使用以下兩個LP：
Figure 109127593-A0101-12-0174-230
Figure 109127593-A0101-12-0174-231
在pH 7.4，50mM磷酸鹽緩衝液中製備含有納入經建構半胱胺酸殘基(如下表所示)的曲妥珠單抗溶液。加入PBS、EDTA(0.5M原液)、和TCEP(0.5M原液)致最終蛋白質濃度為10mg/mL、最終EDTA濃度為20mM，以及最終TCEP濃度大約6.6mM(100莫耳當量)。允許反應在室溫下靜置48小時，然後使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照製造商說明緩衝交換至PBS中。所得溶液用約50當量的脫氫抗壞血酸鹽(50mM原液在1：1 EtOH/水中)處理。允許抗體在4℃下靜置過夜，隨後使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照製造商說明緩衝交換至PBS中。對一些突變物，採用稍微改變之上述程序。
將如此製備之抗體用含10% DMA(vol/vol)的PBS稀釋至約2.5mg/mL，並經DMA中之10mM LP#1原液(10莫耳當量)處理。在室溫下2小時之後，將混合物緩衝交換至PBS中(依照上述)並且在Superdex200管柱上以粒徑排阻層析法純化。單體流份經濃縮和濾器滅菌得到最終ADC。產品表徵請參閱下表22。
Figure 109127593-A0101-12-0175-232
B.接合實例之一般分析方法：
LCMS：管柱=Waters BEH300-C4,2.1×100mm(P/N=186004496)；儀器=Acquity UPLC具SQD2質譜偵測器；流速=0.7mL/min；溫度=0℃；緩衝液A=水+0.1%甲酸；緩衝液B=乙腈+0.1%甲酸。梯度在2分鐘內自3%B運行至95%B，在95%B保持0.75分鐘，然後在3% B下再平衡。注射前立即用TCEP或DTT還原樣本。以LCMS(400至2000道耳頓)監測洗出液，並且使用MaxEnt1將蛋白質尖峰去卷積。DAR報告為重量平均裝載。
SEC：管柱：Superdex200(5/150 GL)；移動相：磷酸鹽緩衝鹽水含2%乙腈，pH 7.4；流速=0.25mL/min；溫度=室溫；儀器：Agilent 1100 HPLC。
HIC：管柱：TSKGel丁基NPR，4.6mm×3.5cm(P/N=S0557-835)；緩衝液A=1.5M硫酸銨含10mM磷酸鹽，pH 7；緩衝液B=10mM磷酸鹽，pH 7+20%異丙醇；流速=0.8mL/min；溫度=室溫；梯度=12分鐘內自0%B至100%B，保持100%B 2分鐘，然後用100%A再平衡；儀器：Agilent 1100 HPLC。
C.測定部位專一性vc0101接合物的疏水性
以疏水性交互作用層析法(上述方法)評估ADC#1至ADC#16，以決定不同接合物的相對疏水性。已有報導ADC疏水性與總抗體暴露相關。
與未修飾的抗體相比，部位334、375、和392的接合物展現最小滯留時間位移，而部位421、443、和347的接合物顯示最大滯留時間位移。計算每個ADC相對疏水性，將ADC滯留時間除以未修飾抗體滯留時間，因此得到「相對滯留時間」或「RRT」。RRT大約1表示該ADC具有與未修飾抗體大約相同的疏水性。每個ADC的RRT顯示於表22。
D.部位專一性vc0101接合物的ADC血漿穩定性
將ADC樣本(約1.5mg/mL)稀釋到小鼠、大鼠、和人類血漿中，得到50μg/mL ADC於血漿中之最終溶液。樣本在37℃，5% CO2下培養並且於三個時間點(0、24小時、和72小時)取等分試樣。將每個時間點取自血漿培養的ADC樣本(25μL)，用IgG0在37℃下去醣基化1小時。去醣基化後，加入捕捉抗體(生物素化山羊抗人類IgG1 Fcγ片段專一性，濃度為1mg/mL於小鼠及大鼠血漿中；或生物素化抗曲妥珠單抗抗體，濃度為1mg/mL於人類血漿中)並且將該混合物在37℃加熱1小時，之後第二個小時在室溫下溫和的搖動。將Dynabead MyOne鏈黴抗生物素蛋白T1磁珠加入樣本並在室溫下溫和搖動培養1小時。樣本盤接著用200μL PBS+0.05% Tween-20、200μL PBS和HPLC等級水清洗。用55μL之2%甲酸(FA)(v/v)洗脫經結合之ADC。每個樣本取50μL等分試樣轉移至新盤，然後加入另外5μL的200mM TCEP。
以Xevo G2 Q-TOF質譜儀連接nanoAcquity UPLC(Waters)，使用BEH300 C4,1.7μm,0.3×100mm iKey管柱執行完整蛋白質分析。移動相A(MPA)由0.1% FA在水中(v/v)組成，移動相B(MPB)由0.1% FA在乙腈中(v/v)組成。層析分離係在流速0.3μL/min下，使用MPB在7分鐘內從5%至90%之線性梯度達成。LC管柱溫度設定為85℃。用MassLynx軟體版本4.1進行資料收集。質量收集範圍從700Da至2400Da。用Biopharmalynx版本1.33實施包括去卷積的資料分析。
監測一段時間內的裝載與琥珀醯亞胺之開環(a+18道耳頓尖峰)。裝載資料報告為與0小時DAR相比之DAR損失%。開環資料係報告為與存在於72小時之總物種相比的開環物種的%。幾個部位突變物導致非常穩定的ADC(334C、421C、和443C)而一些部位損失顯著量的連接子-載荷物(380C和114C)。開環率在各部位間變化顯著。幾個部位如392C、183C、和334C導致非常少的開環；而其他部位如421C、388C、和347C導致快速且自發性的開環。
導致快速且自發性開環的部位可能對產製具低疏水性及/或增加PK暴露的接合物有用。該發現對於環穩定性與血漿穩定性相關的普遍理解背道而馳。因此在一些態樣中，當使用高疏水性連接子-載荷物時，在421C、388C、和347C中之一或多個部位之接合特別有利。在一 些態樣中，高疏水性是1.5或更高的相對滯留時間(RRT)值(以HIC測量)。在一些態樣中，高疏水性是1.7或更高的RRT值。在一些態樣中，高疏水性是1.8或更高的RRT值。在一些態樣中，高疏水性是1.9或更高的RRT值。在一些態樣中，高疏水性是2.0或更高的RRT值。
Figure 109127593-A0101-12-0179-233
E.部位專一性vc0101接合物之麩胱甘肽穩定性
將ADC樣本稀釋到麩胱甘肽水溶液中，得一最終GSH濃度為0.5mM與最終蛋白質濃度為約0.1mg/mL在pH 7.4磷酸鹽緩衝液中。然後將樣本在37℃下培養，並在三個時間點取出等分試樣以測定DAR(T-0、T-3天、T-6天)。來自每個時間點的等分試樣以TCEP處理並用LC-MS依照實例#21.A所述方法加以分析。
監測一段時間內的裝載與琥珀醯亞胺之開環(a+18道耳頓尖峰)。裝載資料報告為與0小時DAR相比之DAR損失%。(表24)開環資料係報告為與存在於72小時之總物種相比的開環物種的%。幾個部位突變物導致非常 穩定的ADC(334C、421C、和443C)而一些部位損失顯著量的連接子-載荷物(380C和114C)。開環率在各部位間變化顯著。幾個部位如392C、183C、和334C導致非常少的開環；而其他部位如421C、388C、和347C導致顯著開環。此檢定的結果與血漿穩定性結果十分相關(實例21.D)，表示硫醇媒介之去接合是血漿中載荷物損失之主要途徑。綜合起來，這些結果建議特定部位諸如334、443、290、和392可能特別適用於可通過硫醇媒介之去接合而快速損失之載荷物-連接子的接合。這樣的載荷物-連接子包括該些利用一般順丁烯二醯亞胺-己醯基(mc)和順丁烯二醯亞胺-己醯基-ValCit(vc)鍵聯者(例如vc-101、vc-MMAE、mc-MMAF等)。
Figure 109127593-A0101-12-0180-234
F.選定部位專一性vc0101接合物在小鼠之藥物動力學評估
無荷瘤無胸腺雌性nu/nu(裸)小鼠(6至8週齡)獲自Charles River Laboratories。所有使用小鼠的程序均 由實驗動物照顧及使用委員會根據既定指南核准。對小鼠(n=3或4)投予單次靜脈內劑量3mg/kg基於抗體組分的ADC。投藥後0.083、6、24、48、96、168、和336小時，自每隻小鼠尾靜脈收集血液樣本。以LBA測定總抗體(TAb)和ADC濃度，其中使用綿羊抗人IgG抗體來捕捉，使用山羊抗人IgG抗體來測定TAb或者使用抗載荷物抗體用來測定ADC。使用Watson LIMS版本7.4(Thermo)分析每隻動物之血漿濃度資料。暴露因部位而異。由290C和443C突變物製成的ADC展現最低暴露，而由κ-183C和392C部位製成的ADC展現最高暴露。對於許多應用而言，具高暴露的部位可能是首選，因這將導致治療劑存續時間增加。然而，對於某些應用而言，可首選使用具較低暴露的接合物(如290C和443C)。具體而言，需要較低暴露(即較低PK)的應用可包含但不限於在腦、CNS、和眼睛中之使用。適應症包括癌症，特別是腦癌、CNS癌症和/或眼癌。
Figure 109127593-A0101-12-0181-235
G.部位專一性vc0101接合物之細胞自溶酶切割
將細胞自溶酶B用6mM二硫蘇糖醇(DTT)在150mM醋酸鈉，pH溫度37℃下活化15分鐘。然後取50ng活化細胞自溶酶-B與20uL的1mg/mL ADC混合於最終濃度2mM DTT、50mM醋酸鈉，pH 5.2中。在37℃下培養20分鐘、1h、2h、和4h之後，使用10uM E-64半胱胺酸蛋白酶抑制劑(在pH 8.5，250mM硼酸鹽緩衝液中)淬熄反應。在檢定之後，使用TCEP還原樣本並且使用實例21A所述條件以LC/MS分析。資料顯示連接子切割速率主要取決於接合的部位。特定部位切割非常快速，如443C、388C、和290C；而其他部位切割非常緩慢，如334C、375C、和392C。在一些態樣中，接合至使其本身適合緩慢切割的部位可能有利。在其他態樣中，快速切割是首選。舉例來說，快速地釋放載荷物以減少在胞內體中花費的時間是較適合的。在進一步態樣中，快速載荷物切割可能有利地允許載荷物在接合分子所無法穿透處的穿透，如某些實質腫瘤處。在進一步態樣中，快速切割可允許載荷物被遞送至不表現抗體之抗原的鄰近細胞，因此允許治療例如異質腫瘤。
Figure 109127593-A0101-12-0183-236
H.部位專一性vc0101接合物之熱穩定性
將ADC用含10mM EDTA的PBS(pH 7.4)稀釋為0.2mg/mL。將ADC置於密閉小瓶中並加熱至45℃。以1週為間隔取出等分試樣(10μL)，藉由粒徑排阻層析法(SEC)評估一段時間內所形成的高分子量物種(HMWS)與低分子量物種(LMWS)之水準。SEC條件概述於實例21.A。在這些條件下，單體在約3.6分鐘時洗脫。單體尖峰左側任何洗脫的蛋白質材料被當作HMWS，並且單體尖峰右側任何洗脫的蛋白質材料被當作LMWS。結果顯示於下表27。選定ADC顯示優異熱穩定性，諸如κ-183C、375C、和334C；而其他ADC顯示顯著的分解，諸如443C和392C+443C。
Figure 109127593-A0101-12-0184-237
I.各種vc0101部位突變物之療效
抗體-藥物接合物之體內療效試驗在使用N87細胞系之目標表現性異種移植模型中實施。將50%基質膠中大約750萬個腫瘤細胞經皮下植入6至8週齡裸鼠中，直到腫瘤大小到達介於250至350mm3。藥物通過推注尾靜脈注射投藥。動物係經注射10、3、或1mg/kg之抗體藥物接合物總共四次，每4天一次(在第1、5、9、和13天)。每週測量所有實驗動物之體重變化。前50天，每週用測徑器測量腫瘤體積兩次，之後每週測量一次，並且用以下公式計算：腫瘤體積=(長度×寬度2)/2。動物在腫瘤體積到達2500mm3之前被人道處死。在第一週治療後，通常觀察到腫瘤大小減少。治療終止後，持續監測動物的腫瘤再生長(長達治療後100天)。來自3mpk投藥組的資 料顯示在圖29。從388C和347C突變物產製的ADC展現出比從334C、κ-183C、392C、和443C突變物產製的ADC略低的效力。
J.昂塞拉黴素(uncialamycin)載荷物與各種突變物之接合
如實例#1所述，製備一組用於接合之曲妥珠單抗半胱胺酸突變物。得到的突變物(5mg/mL)以LP#2(6莫耳當量)於含10% DMA的PBS中處理。在室溫下2h後，反應經LCMS評估以測定裝載，並經SEC評估以測定適當摺疊和不產生聚集。結果總結在表28，原始SEC結果顯示在圖30。
可以看出，多種部位突變物導致表現良好的單體ADC(334C、375C、和392C)。其他部位突變物無法裝載(例如246C、k149C、k111C)、產生聚集(例如443C、421C、347C)、或導致可能部分解摺疊之晚洗脫ADC(例如380C、388C、290C、和k183C)。
綜合所述，這些結果建議特定載荷物可能需要優化以識別導致生物物理穩定與正確摺疊ADC之部位。
Figure 109127593-A0101-12-0186-238
K.總結
如實例證明，接合部位可影響LP去接合、LP代謝、tAb暴露、連接子切割速率、ADC聚集、ADC疏水性、和體內PK特性。
視ADC分子的特定應用而定，數個候選接合部位可用來解決特定問題。例如，假如需要較低的疏水性，部位334、375、392或彼等之組合可能是較佳的，因與未修飾的抗體相比，它們在滯留時間上展現最小位移。在另一實例中，導致快速且自發性開環的部位(例如421C、388C、347C、或或彼等之組合)可能對產製具低疏水性及/或增加PK暴露的接合物有用。部位諸如334、443、290、392或彼等之組合可能特別適用於可通過硫醇媒介之去接合而快速損失之載荷物-連接子的接合。
實例22：部位專一性微管溶素ADC
A.合成cys-突變物ADC的一般程序：
使用以下兩個LP。基於微管溶素的LP的詳細合成方案在2016年2月1日申請之美國臨時專利申請案62/289,485中詳細敘述，並且全文以引用方式併入本文中。
Figure 109127593-A0101-12-0187-239
Figure 109127593-A0101-12-0187-240
方法A：市售赫賽汀(HERCEPTIN)抗體與連接子載荷物經內部雙硫鍵接合。曲妥珠單抗抗體溶液(約15mg/mL)係於含50mM EDTA的50mM磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.0)中製備。參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)係以於蒸餾水中之5mM溶液添加(約2.0莫耳當量)。將所得溶液加熱至37℃達1h。待冷卻後，將反應以適當體積的PBS和二甲基乙醯胺(DMA)處理，使所得溶液在含約10% DMA(vol/vol)的PBS中達約5mg/mL。適當的連接子載 荷物係以於DMA中之10mM原液添加(約7當量)，並允許反應於室溫下靜置或溫和攪拌。70分鐘後，使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照製造商說明，將反應緩衝交換至PBS中。將獲得的材料稍微濃縮(用超過濾裝置)並且在Superdex200管柱上以粒徑排阻層析法純化。單體流份經濃縮和濾器滅菌得到最終ADC。
方法B：連接子-載荷物與含經建構半胱胺酸殘基之曲妥珠單抗抗體之部位專一性接合。在pH 7.4，50mM磷酸鹽緩衝液中製備含有納入經建構半胱胺酸殘基如部位118、334、和392(使用卡巴之EU指數，見WO2013093809)的曲妥珠單抗溶液。加入PBS、EDTA(0.5M原液)、和TCEP(0.5M原液)致最終蛋白質濃度為約10mg/mL、最終EDTA濃度為約20mM，以及最終TCEP濃度大約6.6mM(100莫耳當量)。允許反應在室溫下靜置2至48小時，然後使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照製造商說明緩衝交換至PBS中。替代方法如滲濾或透析亦可用於特定情況中。所得溶液用約50當量的脫氫抗壞血酸鹽(50mM原液在1：1 EtOH/水中)處理。允許抗體在4℃下靜置過夜，隨後使用GE PD-10 Sephadex G25管柱依照製造商說明緩衝交換至PBS中。同樣地，替代方法如滲濾或透析亦可用於特定情況中。
將如此製備之抗體用含10% DMA(vol/vol)的PBS稀釋至約2.5mg/mL，並經DMA中之10mM適當連接子-載荷物原液(10莫耳當量)處理。在室溫下2小時之 後，將混合物緩衝交換至PBS中(依照上述)並且在Superdex 200管柱上以粒徑排阻層析法純化。單體流份經濃縮和濾器滅菌得到最終ADC。
Figure 109127593-A0101-12-0189-241
Figure 109127593-A0101-12-0189-242
B.試管內細胞檢定程序
將目標表現性(BT474(乳癌)、N87(胃癌)、HCC1954(乳癌)、MDA-MB-361-DYT2(乳癌))細胞或不表現(HT-29)細胞接種至96孔細胞培養盤24小時後進行處理。將細胞以10個濃度的3倍連續稀釋抗體-藥物接合物或游離化合物(無抗體接合至藥物)處理兩次。處理後96小時，細胞存活性係以CellTiter 96® AQueousOne Solution Cell Proliferation MTS Assay(Promega)測定。相對細胞存活性係測定為未處理對照之百分比。IC50數值係使用採用XLfit v4.2之四參數對數模型#203計算。結果顯示於表31。
Figure 109127593-A0101-12-0190-243
C. ADC之試管內血漿穩定性檢定
將ADC樣本(約1.5mg/mL)稀釋到小鼠血漿(Lampire Biological Laboratories)中，得到10% ADC、90%血漿之最終溶液。分析三個時間點以測定它們的 DAR(T-0、T-24hr和T-48hr)。在每個時間點進行免疫沉澱製程以富集ADC。簡言之，每個等分試樣以20% MPER(Thermo Fisher Scientific)1：1稀釋並加入等量的生物素化小鼠抗人Fc抗體和山羊抗人κ抗體(SouthernBiotech)。樣本在4℃下培養二小時，然後加入鏈黴抗生物素蛋白親和素Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)。樣本在KingFisher儀器上，以由10% MPER、0.05% TWEEN 20、和兩次PBS組成的四個清洗步驟處理。用0.15%甲酸洗脫珠上的ADC。樣本用2M Tris pH 8.5將pH值調整至7.8，並用PNGaseF(New England Biolabs)移除其N-連接聚醣。樣本用TCEP還原並以LC-MS，藉由993(母體)相對於951(去乙醯化)之質量偏移高度，分析乙醯水解ADC之%。結果顯示於圖31。結果說明，微管溶素LP#3與首選部位如K334C和K392C的連接可導致改善ADC血漿穩定性。這進而可能導致改善的體內暴露與改善的療效。
咸信藉由這些部位賦予的改善穩定性，將適用於其他受代謝性質不佳所苦的載荷物類別。
D. ADC體內穩定性
血液樣本係於最終ADC投藥後72小時自N87異種移植試驗中之選定荷瘤小鼠中獲得。從3mpk投藥組取得樣本。如此獲得之ADC樣本係以PNGase(New England Biolab)在37℃下處理1小時進行去醣基化。培養後，加入捕捉抗體(生物素化山羊抗人Fc 1.0mg/mL, Jackson ImmunoResearch)，並且將混合物在37℃下加熱一小時，之後第二個小時在室溫下溫和的搖動。將Dynabead MyOne鏈黴抗生物素蛋白T1珠(Invitrogen)加入樣本並在室溫下溫和搖動培養至少30分鐘。樣本盤接著用200μL PBS+0.05% Tween 20、200μL PBS、和HPLC等級水清洗。用55μL之2%甲酸(v/v)洗脫經結合之ADC。每個樣本取五十微升等分試樣轉移至新盤，然後加入另外5μtL的200mM TCEP。
以Xevo G2 QTof質譜儀連接Nano Acquity(waters)和BEH300 C4,1.7μm，0.3×100mm管柱(Waters)，使用Masslynx v4.1版作為收集軟體，執行完整蛋白質分析。管柱溫度設定為85℃。移動相A由0.1% TFA(TFA)在水中組成。移動相B由TFA在乙腈：1-丙醇(1：1,v/v)中組成。層析分離係在流速18μL/min下，使用移動相B在7分鐘內從5至90%之線性梯度達成。用Biopharmalynx版本1.33(Waters)實施包括去卷積的資料分析。結果顯示於表32。結果指示，與絞鏈(習知)接合物ADC#T1相比，在334部位的微管溶素接合物(ADC#T3)具改善的體內穩定性。
Figure 109127593-A0101-12-0192-244
E.體內N87腫瘤異種移植模型：
抗體-藥物接合物之體內療效試驗利用使用N87細胞系之目標表現性異種移植模型實施。在療效試驗中，將50%基質膠中750萬個腫瘤細胞經皮下植入6至8週齡裸鼠中，直到腫瘤大小到達介於250至350mm。通過推注尾靜脈注射進行投藥。根據腫瘤對治療的反應，對動物注射1至10mg/mL抗體藥物接合物，每四天一次共治療四次。每週測量所有實驗動物之體重變化。前50天，每週用測徑器測量腫瘤體積兩次，之後每週測量一次，並且用以下公式計算：腫瘤體積5=(長度×寬度)/2。動物在腫瘤體積到達2500mm之前被人道處死。在第一週治療後，觀察到腫瘤大小減少。治療終止後，可持續監測動物的腫瘤再生長。測試ADC #T1和#T3在N87小鼠異種移植體內篩選模型中之結果顯示在圖32。結果說明，LP#3與首選部位如K334C的連接可導致改善體內療效。與ADC#T1(習知絞鏈接合物)相比，改善療效可能是改善ADC#T3(334C接合物)的ADC穩定性的結果。值得注意的是，儘管事實上ADC#T3之DAR為ADC#T1的一半，但ADC#T3的療效顯著大於ADC#T1。
實例23：使用抗EDB抗體之部位專一性ADC
在這個實例中，基於抗EDB抗體之ADC的療效與PK曲線係經研究。例示性抗EDB抗體L19之序列，係顯示於表33。本實例中提供的資料也包括其中導入某些突變(其不影響L19的結合親和性)的L19突變物。 這些突變物的CDR序列與L19的完全相同。舉例來說，EDB-(H16-K222R)是用來進行基於轉麩醯胺酶的ADC接合的L19突變物。這些ADC與總體來說以EDB為目標的ADC之額外細節，係於2016年10月17日申請之美國臨時專利申請案62/409,081中詳細敘述，並且全文以引用方式併入本文中。
Figure 109127593-A0101-12-0195-245
23.1.EDB ADC的試管內結合
為了評估抗EDB抗體和ADC與EDB的相對結合，將0.5或1μg/ml於PBS中的人7-EDB-89塗佈至 MaxiSorp 96孔盤中並在4℃下溫和搖動培養過夜。然後將盤倒空，用200μl PBS清洗，並在室溫下用100μl封閉液(Blocking Buffer)(ThermoScientific)封閉3小時。移除封閉液，用PBS清洗孔，並與100μl以ELISA檢定緩衝液(EAB；0.5% BSA/0.02% Tween-20/PBS)連續稀釋(4倍)的抗EDB抗體或ADC一起培養。將盤的第一行空出，並將盤的最後一行填充EAB作為空白對照組。使該孔盤於室溫下培養3小時。移除試劑並用200μl於PBS中之0.03% Tween-20(PBST)清洗盤。將以EAB稀釋5000倍的抗人IgG-Fc-HRP(Thermo/Pierce)100μl加到孔中並在室溫下培養15分鐘。該孔盤用200μl PBST清洗，然後加入100μl BioFX TMB(Fisher)，允許顏色在室溫下顯色4分鐘。該反應用100μl的0.2N硫酸終止，並用Victor孔盤讀取儀(Perkin Elmer,Waltham,MA)讀取450nm處的吸光度。
表34提供抗EDB抗體和ADC與人7-EDB-89蛋白質片段(以ELISA格式結合至96孔盤)的相對結合。以EDB為目標的所有抗體和ADC，皆以在19pM至58pM之範圍內的類似親和性結合至目標蛋白。相對地，非以EDB為目標的抗體和ADC具有>10,000pM之高EC50值。
Figure 109127593-A0101-12-0197-246
23.2抗EDB ADC的試管內細胞毒性
細胞培養。WI38-VA13是獲自ATCC之經SV40轉形的人類肺纖維母細胞，並維持在補充有10% FBS、1% MEM非必需胺基酸、1%丙酮酸鈉、100單位/ml青黴素-鏈黴素、和2mM GlutaMax的MEM Eagles培養基(Cell-Gro)中。HT29衍生自人結直腸癌(ATCC)並維持在補充有10% FBS和1%麩醯胺酸的DMEM培養基中。
EDB+ FN轉錄物偵測。為了進行EDB+ FN的基因表現與轉錄物分析，用TrypLE Express(Gibco)從細胞培養瓶解離吸附增生的WI38-VA13和HT29細胞。使用RNeasy Mini試劑組(Qiagen)自該收集的細胞沉澱物純化 總RNA。在RNA純化期間，殘餘的DNA以RNase-Free DNase Set(Qiagen)移除。使用高容量的RNA-to-cDNA試劑組(Applied Biosystems)將總RNA逆轉錄成cDNA。使用具UNG之TaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystems)，以定量即時PCR分析cDNA。EDB+ FN1信號係藉由TaqMan引子Hs01565271_m1偵測，並用來自ACTB(TaqMan引子Hs99999903_m1)和GAPDH(TaqMan引子Hs99999905_m1)兩者信號的平均值標準化。所有引子來自ThermoFisher Scientific。顯示來自代表性實驗的資料。
藉由西方墨點法偵測EDB+ FN蛋白質。為了以西方墨點法偵測EDB+ FN，藉由細胞刮取收集吸附增生的WI38-VA13和HT29細胞。在具蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology)中製備細胞溶解物。在具蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的RIPA溶解緩衝液或2X細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technology)中製備腫瘤溶解物。
蛋白質溶解物以SDS-PAGE分析，然後以西方墨點法分析。將蛋白質轉移至硝化纖維素膜，然後以5%牛乳/TBS封閉，隨後與EDB-L19抗體和抗GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)在4℃下培養過夜。清洗過後，將抗EDB墨點與ECL HRP連接抗人IgG二級抗體(GE Healthcare)在室溫下培養1小時。清洗後，EDB+ FN信號以Pierce ECL 2西方墨點法受質(Thermo Scientific)顯色 並用X射線軟片偵測。抗GAPDH墨點與接合有Alexa Fluor 680的抗兔IgG二級抗體(Invitrogen)於封閉液中在室溫下培養1小時。清洗後，以LI-COR Odyssey影像系統偵測該GAPDH信號。使用Bio-Rad GS-800 Calibrated Imaging Densitometer進行EDB西方墨點的密度測定分析，並且使用Quantity One版本4.6.9的軟體定量。顯示來自代表性實驗的資料。
圖33顯示在WI38-VA13和HT29細胞中以西方墨點分析EDB+ FN1的表現。當於試管內生長時，EDB+ FN於WI38-VA13細胞系中表現，但不在HT29結腸癌細胞系中表現。
藉由流動式細胞測量術偵測EDB+ FN蛋白質。EDB-L19抗體被使用來藉由流動式細胞測量術測量WI38-VA13或HT29細胞的細胞表面上之EDB+ FN表現。細胞藉由非酵素細胞解離緩衝液(Gibco)解離，並在冰上以冷流動式緩衝液(FB,3% BSA/PBS+Ca+Mg)培養以封閉。該細胞然後與一級抗體在冰上於FB中培養。培養後，以冷PBS-Ca-Mg清洗細胞，然後以存活性染色(Biosciences)培養來區別生存細胞與死亡細胞(根據製造商程序)。信號以BDFortessa流式細胞儀分析並且使用BD FACS DIVA軟體分析資料。顯示來自代表性實驗的資料。
表35總結西方墨點、qRT-PCR和流動式細胞測量術的結果。資料證明WI38-VA13是EDB+ FN陽性， HT29是EDB+ FN陰性。
Figure 109127593-A0101-12-0200-247
試管內細胞毒性試驗。增生的WI38-VA13或HT29細胞係使用非酵素細胞解離緩衝液自培養瓶中收集，並且以1000細胞/孔的96孔盤(Corning)在加濕室(37℃，5% CO2)中培養過夜。隔天，將細胞用抗EDB ADC或同型物對照組非EDB結合性ADC處理，方法為加入10個濃度的50μl的3X原液兩次(in duplicate)。在一些實驗中，細胞以1500細胞/孔接種並且在同一天處理。然後將細胞與抗EDB ADC或同型物對照組非EDB結合性ADC培養四天。收集當天，將50μl的Cell Titer Glo(Promega)加入細胞並在室溫下培養0.5小時。發光係於Victor孔盤讀取儀(Perkin Elmer,Waltham,MA)上測量。相對細胞存活性係測定為未處理對照孔之百分比。IC50數值係使用採用XLfit v4.2(IDBS)之四參數對數模型#203計算。
表36顯示在WI38-VA13(EDB+ FN陽性腫瘤細胞系)與HT29結腸癌細胞(EDB+ FN陰性腫瘤細胞系)上實施之細胞毒性檢定中，抗EDB ADC處理之IC50(抗體的ng/ml)。抗EDB ADC在EDB+ FN表現性細胞系中誘導細胞死亡。所有具vc-0101連接子-載荷物的抗EDB ADC有 類似的IC50值，範圍約從184ng/ml到216ng/ml(EDB-L19-vc-0101、EDB-(λK183C-K290C)-vc-0101、EDB-mut1-vc-0101、EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101)。
陰性對照組vc-0101 ADC的效力實質上較低，其IC50值比抗EDB-vc-0101 ADC高約70至200倍。所有vc-0101 ADC在EDB+ FN陰性腫瘤細胞系HT29中，具有更高(46至83倍)的IC50值。因此，抗EDB ADC的試管內的細胞毒性係依賴EDB+ FN的表現。
其他具有「vc」蛋白酶可切割連接子之基於耳抑素的抗EDB ADC(EDB-L19-vc-9411和EDB-L19-vc-1569)在WA38-VA13細胞中也顯示有效的細胞毒性，與相對應的陰性對照組ADC相比，具有約50至180倍的高選擇性；以及與非表現性細胞系相比，約25至140倍的選擇性。EDB-L19-diS-DM1 ADC與vc-0101 ADC具類似的效力，然而，與陰性對照組ADC(約3倍)和HT29細胞(約0.9倍)相比，具有遠遠較低的選擇性。
Figure 109127593-A0101-12-0202-248
23.3：部位專一性EDB ADC的體內療效
抗EDB ADC係於細胞系異種移植(CLX)、病患衍生異種移植(PDX)和同基因型腫瘤模型中評估。使用如本文先前所述之免疫組織化學(IHC)檢定，偵測EDB+ FN的表現。
為產製CLX模型，將8×106至10×106個H-1975、HT29、或Ramos腫瘤系細胞經皮下植入雌性無胸腺裸小鼠中。將用來接種的Ramos和H-1975細胞分別懸浮在50%和100%基質膠(BD Biosciences)中。對於Ramos模型，在細胞接種之前，動物接受全身照射(4Gy)以促進腫瘤的建立。
當平均腫瘤體積到達約160至320mm3時，將動物隨 機分入治療組，每組8至10隻小鼠。ADC或載劑(PBS)在第0天靜脈投予動物，然後每4天投藥一次，共4至8次劑量。每週測量腫瘤一次或兩次並按體積(mm3)=(寬度×寬度×長度)/2計算腫瘤體積。監測動物體重4至9週，在任何治療組中沒有觀察到動物體重減輕。
為產製PDX模型，從供體動物收集腫瘤並將約3×3mm腫瘤片段，使用10針規套管針皮下植入雌性無胸腺裸小鼠(PDX-NSX-11122模型)或NOD SCID小鼠(PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534模型)側腹。當平均腫瘤體積到達約160至260mm3時，將小暑隨機分入治療組，每組7至10隻小鼠。ADC或載劑(PBS)投藥方案與投予途徑及腫瘤測量程序與前述CLX模型相同。監測動物體重5至14週，在任何治療組中沒有觀察到動物體重減輕。腫瘤生長抑制以平均腫瘤大小±SEM作圖。
EDB+ FN之表現。如表37所示，EDB+ FN在H-1975、HT29和Ramos之CLX模型、PDX-NSX-11122、PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534之PDX模型和EMT-6同基因型腫瘤模型中的表現，係於IHC檢定中經由EDB-L19抗體的結合及隨後偵測來測量。CLX HT-29是中度表現性CLX，然而當於試管內檢測時為陰性，因為在CLX中之蛋白質的表現主要衍生自腫瘤基質。
Figure 109127593-A0101-12-0204-249
PDX-NSX-11122 NSCLC PDX。各種ADC的效應係於PDX-NSX-11122(表現高度EDB+ FN之人類癌症NSCLC PDX模型)中評估。圖34A顯示EDB-L19-vc-0101(ADC1)在0.3、0.75、1.5和3mg/kg下的抗腫瘤活性。資料證明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以劑量依賴方式在3mg/kg和1.5mg/kg下顯示腫瘤緩解。
比較vc連接ADC與雙硫鍵連接ADC的抗腫瘤療效。圖34B和34C分別顯示3mg/kg的EDB-L19-vc-0101(ADC1)與10mg/kg的雙硫鍵連接EDB-L19-diS-DM1(ADC5)抗腫瘤活性的比較，以及1和3mg/kg的EDB-L19-vc-0101(ADC1)與5mg/kg的雙硫鍵連接EDB-L19-diS-C2OCO-1569(ADC6)抗腫瘤活性的比較。如圖34B和34C所示，與同型陰性對照組ADC及使用雙硫鍵連接子產製的ADC(即EDB-L19-diS-DM1與EDB-L19-dis-C2OCO-1569)相比，EDB-L19-vc-0101(ADC1)證明有更大的療效。另外，荷瘤動物以EDB-L19-vc-0101(ADC1)治療，在1mg/kg下可延緩腫瘤生長，在3mg/kg下可完全緩解腫瘤。資料證明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以劑量依 賴方式抑制PDX-NSX-11122 NSCLC異種移植物之生長。
評估部位專一性與習知接合的ADC的活性。圖34D顯示部位專一性接合EDB-(λK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)與習知接合EDB-L19-vc-0101(ADC1)分別在劑量0.3、1、和3mg/kg以及劑量1.5mg/kg下的抗腫瘤療效比較。基於劑量水準的療效是可相比的，且EDB-(λK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)以劑量依賴方式導致腫瘤緩解。
評估具有各種突變之vc-0101抗EDB ADC的活性。圖34E顯示部位專一性接合EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在劑量0.3、1和3mg/kg下的抗腫瘤療效。EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在1和3mg/kg下誘導腫瘤緩解。圖34F顯示在圖34E中投藥3mg/kg的EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)組之10隻個別荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制曲線。在研究結束時(95天)，3mg/kg組中的10隻小鼠有8隻小鼠(80%)的腫瘤完全與持久性緩解。
H-1975 NSCLC CLX。各種vc連接耳抑素和CPI的ADC的效應係於H-1975(中度至高度EDB+ FN表現性人類癌症NSCLC CLX模型)中評估。圖35A顯示所評估之EDB-L19-vc-0101(ADC1)在0.3、0.75、1.5和3mg/mg下的抗腫瘤活性。資料證明EDB-L19-vc-0101(ADC1)以劑量依賴方式在3mg/kg及低至1.5mg/kg下顯示腫瘤緩解。圖35B顯示EDB-L19-vc-0101(ADC1)和 EDB-L19-vc-1569(ADC10)在0.3、1和3mg/kg下之抗腫瘤活性評估。資料證明EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-1569(ADC10)以劑量依賴方式顯示腫瘤緩解。
比較vc連接耳抑素ADC與CPI ADC的抗腫瘤活性。如圖35C所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI(ADC9)分別在0.5、1.5和3mg/kg以及0.1、0.3和1mg/kg下評估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-(H16-K222R)-AcLys-vc-CPI(ADC9)皆在所評估最高劑量下顯示腫瘤緩解。
評估部位專一性與習知接合的抗EDB ADC的活性。圖35D顯示部位專一性接合EDB-(λK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)與習知接合EDB-L19-vc-0101(ADC1)在劑量0.5、1.5、和3mg/kg下的抗腫瘤療效比較。基於劑量水準的療效是可相比的，且EDB-(λK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)以劑量依賴方式導致腫瘤緩解。
評估具有各種突變之vc-0101抗EDB ADC的活性。圖35E顯示EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-mut1-vc-0101(ADC3)在1和3mg/kg下的抗腫瘤療效。圖35F顯示部位專一性EDB-(λK183C+K290C)-vc-0101(ADC2)和EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在1和3mg/kg下的抗腫瘤療效。這4個ADC在H-1975模型中證明具有類似的療效，不論它們是否包含λK183C-K290C突變。另外，所有測試ADC都導致強健的抗腫瘤 療效，包括在3mg/kg下的腫瘤緩解。這些資料證明λK183C-K290C突變之導入，不會負面地影響ADC的療效。
HT29結腸CLX。各種vc連接耳抑素ADC的效應係於HT29(中度EDB+ FN表現性人類癌症結腸CLX模型)中評估。如圖36所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-9411(ADC7)係測試在3mg/kg下之抗腫瘤活性。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-L19-vc-9411(ADC7)兩者皆在3mg/kg劑量下顯示腫瘤隨著時間緩解。
PDX-PAX-13565和PDX-PAX-12534胰臟PDX。EDB-L19-vc-0101(ADC1)的抗腫瘤療效係於人類胰臟PDX模型中評估。如圖37A所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)係以0.3、1和3mg/kg於PDX-PAX-13565(中度至高度EDB+FN表現性胰藏PDX)中評估。如圖37B所示，EDB-L19-vc0101(ADC1)係以0.3、1和3mg/kg於PDX-PAX-12534(低度至中度EDB+FN表現性胰臟PDX)中評估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)在兩個胰臟PDX模型評估中皆依劑量依賴方式證明腫瘤緩解。
Ramos淋巴癌CLX。EDB-L19-vc-0101(ADC1)的抗腫瘤療效係於Ramos(中度EDB+ FN表現性淋巴瘤CLX模型)中評估。EDB-L19-vc-0101(ADC1)係在1和3mg/kg下評估抗腫瘤活性。如圖38所示，EDB-L19-vc-0101(ADC1)依劑量依賴方式在劑量3mg/kg下顯示腫瘤緩解。
EMT-6乳房同基因型模型。EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)之抗腫瘤療效係於EMT-6(在免疫活性背景下之小鼠同基因型乳癌模型)中評估。如圖39A所示，EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在4.5mg/kg下證明腫瘤生長抑制。腫瘤生長抑制係以十一隻荷瘤動物中之平均腫瘤大小±SEM作圖。圖39B顯示在投藥4.5mg/kg的EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)組之11隻個別荷瘤小鼠的腫瘤生長抑制曲線。
在研究結束時(34天)，4.5mg/kg組中的11隻小鼠有9隻小鼠(82%)的腫瘤完全與持久性緩解。
23.4：部位專一性EDB ADC的藥物動力學(PK)
習知接合EDB-L19-vc-0101(ADC1)與部位專一性接合EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)接合的抗體藥物接合物的暴露，係分別在馬來猴中以靜脈(IV)推注劑量投予5或6mg/kg之後測定。使用配體結合檢定(LBA)測量總抗體(總Ab；接合mAb和未接合mAb的測量值)、ADC(至少接合一個藥物分子的mAb)的濃度，並使用質譜儀測量經釋放之載荷物0101的濃度。總Ab和ADC濃度的定量係藉由配體結合檢定(LBA)使用具螢光偵測之Gyrolab®工作站之達成。所使用的生物素化捕捉蛋白質為綿羊抗hIgG，且偵測抗體係用於總抗體之Alexa Fluor 647山羊抗hIgG或用於ADC之Alexa Fluor 647抗 0101mAb(資料經Watson 7.4版LIMS系統處理)。使用蛋白質沉澱製備用於未接合載荷物分析之體內樣本，並且注射至使用正Turbo IonSpray電噴灑離子化(ESI)以及多反應監測(MRM)模式之AB Sciex API5500(QTRAP)質譜儀上。743.6→188.0以及751.6→188.0的躍遷(transition)分別用於分析物與氘化內部標準物。資料收集與處理係以Analyst軟體版本1.5.2(Applied Biosystems/MDS Sciex,Canada)進行。
以EDB-L19-vc-0101 ADC(5mg/kg)與EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101 ADC(6mg/kg)投藥至馬來猴之總Ab、ADC和經釋放之載荷物的藥物動力學係顯示於表38。與習知接合物相比，部位專一性接合之EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101 ADC的暴露顯示出增加的暴露(以劑量標準化AUC測量為約2.3倍增加)與增加的接合穩定性。接合穩定性係藉由將部位專一性接合EDB-mut2(λK183C-K290C)-vc-0101 ADC與習知EDB-L19-vc-0101 ADC相比，而分別具有較高的ADC/Ab比(84%對75%)和較低的經釋放載荷物暴露(劑量標準化AUC；0.0058對0.0082μg*h/mL)二者來評估。NA=不適用。
Figure 109127593-A0101-12-0210-250
23.5：部位專一性EDB ADC的毒性試驗
在Wistar-Han大鼠與馬來猴的探索性重複劑量(Q3Wx3)試驗中，表徵了習知的EDB-L19-vc-0101(ADC1)和部位專一性接合的EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的非臨床安全性特性。大鼠和馬來猴被視為適用於毒性評估的藥學相關非臨床物種，乃因其與人EDB+ FN有100%蛋白質序列同源性，以及抗體EDB-L19(Ab1)和EDB-mut1(λK183C-K290C)(Ab4)對大鼠、人和猴子具有類似的結合親和性(以Biacore檢定，如實例2所示)。
在Wistar Han大鼠與馬來猴中分別評估最高達10和5mg/kg/劑量的EDB-L19-vc-0101(ADC1)，並在馬來猴中評估最高達12mg/kg/劑量的EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)。大鼠或猴子每三週(第1、22、和43天)靜脈投藥一次並且在第46天(第3次劑量後3天)被安樂死。評估動物的臨床症狀、體重變化、食物消耗、臨床病理學參數、器官重量、和巨觀與顯微觀察。在這些 試驗中，注意到動物並無死亡情形或臨床狀況的顯著改變。
在大鼠和猴子中之EDB+ FN表現性組織/器官中，沒有目標依賴性毒性之跡象。在兩個物種中，主要的毒性為可逆的骨髓抑制與相關的血液學變化。在猴子中，用習知接合EDB-L19-vc-0101(ADC1)在5mg/kg/劑量下見到明顯暫時的嗜中性白血球減少症，然而用部位專一性接合EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)在6mg/kg/劑量下只見到對嗜中性白血球計數之最小影響，如表39和圖40所示。點代表平均值，誤差槓代表與平均值±1個標準偏差(SD)。
資料證明部位專一性接合顯著緩解骨髓抑制。EDB-L19-vc-0101(ADC1)和EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)的毒性特性和這些接合物的目標非依賴性效應一致，並且EDB-L19-vc-0101(ADC1)與EDB-mut1(λK183C-K290C)-vc-0101(ADC4)之最高非嚴重毒性劑量(HNSTD)分別測定為
Figure 109127593-A0101-12-0211-447
5mg/kg/劑量和
Figure 109127593-A0101-12-0211-448
12mg/kg/劑量。
Figure 109127593-A0101-12-0211-251
實例24：具有以腫瘤抗原為目標的抗體之部位專一性ADC
24.1.產製部位專一性ADC接合物
24.1.1 產製雙cyc突變物(kK183C+K290C)。
為了證實雙cys突變物kK183C+K290C所媒介的部位專一性藥物接合，賦予與習知抗體藥物接合物相比顯著的效益，研究另一個針對腫瘤相關抗原的抗體，稱為抗體X(以下簡稱X)。抗體X係從其小鼠親代抗體人化而來。為了製備具耳抑素0101之部位專一性抗體藥物接合物，我們產製了在κ輕鏈上具kK183C突變與在hIgG1重鏈恆定區上具K290C突變的X-hIgG1/kappa。抗體X和其雙cys突變物版本X(kK183C+K290C)的兩個蛋白質製品係經產製，並在競爭ELISA中評估它們與目標抗原的相對結合活性。在此檢定中，抗體X與cys突變物X(kK183C+K290C)皆被測試它們與它們的共同親代抗體競爭與固定在ELISA盤上之目標抗原結合之能力。如圖41所示，抗體X和X(kK183C+K290C)具有相等的與目標抗原競爭結合之活性，表示在重鏈與輕鏈恆定區之cys突變不會影響抗體對目標抗原的結合活性。
方法
競爭性ELISA。96孔盤(高度結合CoStar盤)係經目標抗原Fc融合蛋白塗佈。經封閉液(1%牛血清白蛋白於PBST中)1至3連續稀釋抗體X和cys突變物X(kK183C+K290C)溶液，係於恆定濃度的生物素化親代抗 體存在下加入盤。在培養2小時後，清洗孔盤並加入以封閉液稀釋5000倍之經HRP接合之鏈黴抗生物素蛋白(Southern Biotech)。允許與鏈黴抗生物素蛋白培養40分鐘，之後以TMB溶液顯色10分鐘。顯色反應以添加0.18M H2SO4停止，並測量450nM之吸光度。資料作圖及分析係利用Microsoft Excel及Graphpad-Prism軟體進行。
24.1.2 產製X-vc0101和X(kK183C+K290C)-vc0101接合物
24.1.2.1 產製習知ADC(X-vc0101)
藉由三(2-羧基乙基)膦(TCEP)部分還原抗體X，接著使經還原的半胱胺酸殘基與順丁烯二醯亞胺官能化連接子-載荷物vc0101反應來製備習知的ADC。具體而言，抗體經由添加2.2倍莫耳過量之TCEP於100mMHEPES緩衝液pH 7.0及1mM二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)於37℃下部分還原2小時。該vc0101接著被添加至反應混合物，連接子-載荷物/抗體之比係7：1，並在15% v/v之二甲基乙醯胺(DMA)存在下在25℃下再反應1小時。N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)被添加以封端未反應之硫醇，接著加入L-半胱胺酸以淬熄任何未反應之連接子-載荷物。該反應混和物在4℃下在PBS(pH 7.4)中透析過夜，並用粒徑排阻層析法(SEC；AKTA avant，Superdex 200樹脂)純化。純化的ADC經緩衝交換至20mM組胺 酸、85mg/mL蔗糖pH5.8中並儲存在-70℃下。ADC經由分析SEC表徵以求純度；經由HIC和LC-ESI MS計算藥物-抗體比(DAR)。蛋白濃度係經由UV分光光度計測定。
24.1.2.2 產製部位專一性ADC X(kK183C+K290C)-vc0101
經建構之雙cys突變物X(kK183C+K290C)係經12倍莫耳過量之TCEP於100mM HEPES緩衝液pH 7.0及1mM DTPA中在37℃下完全還原6小時，接著除鹽以移除過量TCEP。該經還原之抗體於2mM去氫抗壞血酸(DHA)中在4℃下培養16小時以重新形成鏈間雙硫鍵。在除鹽後，以連接子-載荷物/抗體莫耳比10：1加入順丁烯二醯亞胺官能化連接子-載荷物vc0101，並在15% v/v之二甲基乙醯胺(DMA)存在下在25℃下再反應2小時。反應混合物經由疏水性交互作用層析法(HIC，AKTA avant，丁基HP樹脂)除鹽與純化。純化的ADC經緩衝交換至20mM組胺酸、85mg/mL蔗糖pH5.8中並儲存在-70℃下。ADC經由SEC表徵以求純度；經由HIC、逆相UPLC和LC-ESI MS計算DAR。蛋白濃度係經由UV分光光度計測定。
24.1.2.3 ADC藥物分布
製備用於HIC分析之化合物，其係將樣本用PBS稀釋至大約1mg/ml。藉由將15μl之樣本自動注射 至具有TSK-GEL丁基NPR管柱(4.6×3.5mm，2.5μm孔徑大小；Tosoh Biosciences部件#14947)之Agilent 1200 HPLC上來進行分析。該系統包括具有恆溫器之自動取樣器、管柱加熱器及UV偵測器。梯度方法的使用如下：移動相A：1.5M硫酸銨、50mM磷酸氫二鉀(pH7)；移動相B：20%異丙基醇、50mM磷酸氫二鉀(pH 7)；T=0min.100% A；T=12min.0% A。
藥物分布特性顯示於表40。雖然兩個ADC顯示類似的平均DAR，但是使用部位專一性接合之ADC(X(κK183C+K290C)-vc0101)主要顯示一個尖峰(94%是4 DAR)，而使用習知接合之ADC(X-vc0101)顯示不同裝載接合物之混合物(51%是4 DAR)。這種均質的藥物分布特性是部位專一性ADC相較於習知ADC的主要優點。
Figure 109127593-A0101-12-0215-252
24.2. J145 ADC作為單一藥劑在Calu-6人類非小細胞肺癌細胞系異種移植模型中的評估
對荷瘤動物投予3mg/kg的ADC X-vc0101(習知接合物)與ADC X(kK183C+K290C)-vc0101，在第15天最後一劑候選藥物之後兩組皆導致腫瘤緩解，平均腫瘤體積分別為60mm3和53mm3。在試驗第26天，載劑組被安樂死時，兩個治療組均顯示一致的腫瘤緩解。從第47 天至第58天，習知接合物組中的五隻動物有兩隻脫離治療效果並且描述為生長迅速，然而X(kK183C+K290C)-vc0101一致地顯示腫瘤緩解。在第58天，習知接合物和ADC X(kK183C+K290C)-vc0101的平均腫瘤體積分別為825mm3和23mm3。(表41和圖42)
到試驗第61天，習知ADC組基於腫瘤體積超過3520mm3處死而失去一隻動物。X(kK183C+K290C)-vc0101組顯示一致的腫瘤緩解直到第82天，隨後顯示腫瘤再生長，到試驗結束時所存在的最大質量為試驗第111天的1881mm3。(表41和圖42)
ADC X(kK183C+K290C)-vc0101在3mg/kg Q4DX4之投藥方案下，對Calu-6人類NSCLC CDX模型顯示一致的抗腫瘤效果直到試驗第82天。在試驗初期時間點，ADC X-vc0101顯示可相比的腫瘤細胞殺滅，然而在試驗期間到第47天腫瘤脫離治療效果並且大小迅速增加。
結論是ADC X(kK183C+K290C)-vc0101在Calu-6人類NSCLC CDX模型中具有較好的抗腫瘤活性，有較多動物存活直到第111天。
Figure 109127593-A0101-12-0217-253
方法
腫瘤異種移植開始於七隻5至8週齡雌性無胸腺裸小鼠世代，每隻小鼠右側腹皮下注射0.1毫升體積之5×106Calu-6(ATCC,Cat#HTB-56)人類肺腫瘤細胞，其懸浮在由含10%胎牛血清(HyClone#SH30088.03HI)之 Eagle’s Minimum Essential Medium(ATCC,Cat#30-2003)培養基製成之50%基質膠(BD Biosciences,Cat#356234)中。當平均腫瘤大小達100至150mm3時開始測試物品的投藥，其中按(mm3)=(a×b2/2)計算腫瘤體積，其中「b」是最小直徑，「a」是最大直徑。
腫瘤體積與體重資料每週收集兩次。第一次投藥後30小時與最後一次(第四次)投藥後30小時，自每組兩隻小鼠收集血液樣本(各10μl)。將血液稀釋到190μL HBS-EP緩衝液中並立即儲存在-80℃下。自收集血液的相同動物中，於最後一次(第四次)投藥後30小時以屍檢收集腫瘤團塊並快速冷凍。
將ADC X(kK183C+K290C)-vc0101以6mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、和0.3mg/kg的劑量，依照Q4D×4投藥計畫(每四天投予一次共四次)靜脈投予至荷瘤動物。
將ADC X-vc0101(習知接合物)以3mg/kg的劑量，依照Q4D×4投藥計畫(每四天投予一次共四次)靜脈投予至荷瘤動物。
24.3.藥物動力學試驗。
X-vc0101及X(kK183C+K290C)-vc0101在相同劑量水準6mg/kg下，顯示可相比的PK/TK特性，包括Cmax、暴露(AUC)和半衰期(t1/2)(表42)。X-vc0101和X(kK183C+K290C)-vc0101兩者在6mg/kg下，以及 X(kK183C+K290C)-vc0101在額外更高劑量9和12mg/kg下當暴露到達高得多的水準時，都觀察到類似的總Ab與ADC之暴露水準(即AUC)。這表示在動物中投藥的兩種ADC化合物於整個實驗期間保持大部分完整，且兩種化合物在體內具類似的穩定性。
Figure 109127593-A0101-12-0219-254
方法
在IV推注投予6mg/kg的X-vc0101或6、9和12mg/kg的X(kK183C+K290C)-vc0101)至馬來猴之後，測定習知(X-vc0101)或部位專一性(X(kK183C+K290C)-vc0101)抗體藥物接合物(ADC)的暴露。血漿樣本係在投藥前、在IV投予各劑量後0.25、6、24、72、168、336和504小時收集。使用配體結合檢定(LBA)測定總抗體(總Ab；接合mAb和未接合mAb的測量值)和ADC(至少接合一個藥物分子的mAb)的濃度。各劑量的藥物動力學(PK)/毒物動力學(TK)參數係自X-vc0101和X(kK183C+K290C)-vc0101兩者之總Ab及ADC之濃度對時間曲線計算(表 42)。
24.4.毒性試驗
在兩個獨立探索毒性試驗中，雄性與雌性馬來猴係經每三週一次IV投藥(試驗第1、22、和43天)。在試驗的第46天(第3次投予劑量後3天)，將動物安樂死並按指定規程收集血液與組織樣本。在生存中和屍檢後進行臨床觀察、臨床病理學、巨觀與微觀病理學評估。對於解剖病理學的評估，以主觀、相對、研究特定之基礎，記錄組織病理學發現的嚴重性。
在這些試驗之一中，以6mg/kg/劑量的載劑或X-hIgG1-vc0101投予馬來猴(2隻/性別/組)。在另一試驗中，以6、9、和12mg/kg/劑量的載劑或X(kK183C+K290C)-vc0101投予猴子(1隻/性別/組)。投予6mg/kg/劑量的X-hIgG1-vc0101的一隻雄性和一隻雌性猴子在試驗第11天被選擇性地安樂死，因臨床症狀與臨床病理學資料表明嚴重發熱性嗜中性白血球減少症。相比之下，在觀察到類似暴露的相同劑量水準下(見先前部分)，所有投予X(kK183C+K290C)-vc0101的馬來猴存活直到試驗第46天進行排定屍檢。在6mg/kg劑量下的骨髓顯微結果中，所有投予X-hIgG1-vc0101的馬來猴(總共4隻)具有化合物相關之最小至中度全細胞類型(骨髓球系細胞和紅血球系細胞)之細胞數減少；然而在投予X(kK183C+K290C)-vc0101的馬來猴(總共2隻)的骨髓中沒有顯微結果。在觀察到高 得多的暴露水準之9和12mg/kg較高劑量下，僅在投予9mg/kg/劑量的X(kK183C+K290C)-vc0101的馬來猴(總共2隻)骨髓中發現最小至輕度之骨髓球系細胞/紅血球系細胞(M/E)比增加，此主要係因成熟嗜中性細胞數增加與紅血球系細胞譜系之細胞數減少；但在投予12mg/kg/劑量的X(kK183C+K290C)-vc0101的猴子(總共2隻)中則無。
Figure 109127593-A0101-12-0221-255
因此，死亡率與顯微資料顯示，基於部位專一性突變技術的ADC接合物X(kK183C+K290C)-vc0101明顯改善X-hIgG1-vc0101誘導的骨髓毒性與嗜中性白血球減少症。
實例25：具抗體1.1之部位專一性ADC
25.1.製備用於部位專一性接合之抗體1.1
製備用於經由反應性半胱胺酸殘基之部位專一性接合的1.1抗體之方法，大致係如PCT公開案WO2013/093809所述實施。將κ輕鏈恆定區上的一個殘基 (使用卡巴編號方案的K183)與IgG1重鏈恆定區上的一個殘基(使用卡巴之EU指數的K290)以定點突變改變為半胱胺酸(C)殘基。
25.2.生產穩定轉染細胞以表現Her2-PT經建構半胱胺酸變異體抗體
為生產用於接合試驗的1.1-κK183C-K290C，CHO細胞係經編碼1.1-κK183C-K290C之DNA轉染，並且使用該領域廣為周知之標準程序單離穩定高生產池。使用三管柱製程，即蛋白質A親和性捕捉、然後TMAE管柱及接著CHA-TI管柱，自經濃縮CHO池起始材料中單離1.1-κK183C-K290C。使用這些純化製程，1.1-κK183C-K290C製劑含有如分析性粒徑排阻層析所測得之98.6%關注峰(POI)(表44)。表44結果顯示在1.1-κK183C+K290C自蛋白質A樹脂洗脫後，偵測到可接受水準的高分子質量物種(HMMS)，而且這種非所欲之HMMS物種可使用TMAE與CHA-TI層析法移除。該資料亦證明人類IgG1恆定區中之蛋白質A結合部位，並未受到在位置290(EU指數編號)之經建構之半胱胺酸殘基的存在而改變。
Figure 109127593-A0101-12-0222-256
25.3.抗體1.1之部位專一性接合
順丁烯二醯亞胺官能化連接子-載荷物與1.1-κK183C-K290C之接合，係藉由以15倍莫耳過量之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)於100mM之HEPES(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸緩衝液)pH 7.0及1mM二伸乙三胺五乙酸(DTPA)中於37℃完全還原抗體6小時，接著除鹽以移除多餘的TCEP而達成。該經還原之1.1-κK183C-K290C抗體於1.5mM去氫抗壞血酸(DHA)、100mM HEPES pH 7.0及1mM DTPA中在4℃下培養16小時以重新形成鏈間雙硫鍵。所欲之連接子-載荷物被添加至該反應混合物，該連接子-載荷物/抗體之莫耳比為7，在15% v/v之二甲基乙醯胺(DMA)存在下在25℃下再反應1小時。經過1小時之培養期後，6倍過量之L-Cys被添加以淬熄任何未反應之連接子-載荷物。該反應混合物經由疏水性交互作用層析法(HIC)，使用丁基瓊脂糖HP管柱(GE Lifesciences)純化。該方法利用1M KPO4、50mM Tris pH 7.0來結合，並以50mM Tris,pH 7.0經10CV洗脫ADC。進一步表徵該ADC，經由粒徑排阻層析法(SEC)分析純度，以疏水交互作用層析法(HIC)及液體層析電噴灑離子化串聯質譜(LC-ESI MS)或逆相層析法(RP)計算藥物-抗體比(裝載量或DAR)。ADC與它們個別的抗體比較可藉由計算相對滯留時間(RRT)進行，該相對滯留時間即是ADC之HIC滯留時間除以個別抗體之HIC滯留時間的比例。蛋白濃度係經由UV分光光度計測定。表45結果 顯示，1.1-κK183C-K290C經建構半胱胺酸抗體有效地接合順丁烯二醯亞胺官能化連接子-載荷物vc0101，產生均質之ADC，具有預測與期望數量的載荷物(即DAR 3.9)。
Figure 109127593-A0101-12-0224-257
25.4. 1.1-kK183C-K290C抗體和1.1-kK183C-K290C-vc0101 ADC的生物分析表徵
25.4.1 熱穩定性
示差掃描量熱儀(DCS)係用於測定1.1-kK183C-K290C抗體及對應Aur-06380101部位專一性接合物之熱穩定性。在此分析中，以20mM組胺酸pH 5.8、8.5%蔗糖、0.05mg/ml EDTA調製之樣本係經分配至具有自動取樣器之Micr℃ al VP毛細管DSC的試樣盤(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)中，在10℃下平衡5分鐘，接著以每小時100℃的速率掃描至最高110℃。選擇16秒之過濾期。原始資料係經基準校正，該蛋白質濃度係經標準化。Origin軟體7.0(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用於適配該資料至具有適當數量之轉換(transition)之MN2-State模型。
1.1-kK183C-K290C抗體展現優異的熱穩定性，其第一熔融轉變(Tm1)為72.78℃，且所生成之1.1- kK183C-K290C-vc0101部位專一性接合物(SSC)顯示良好及可相比的穩定性，本文中所述之T-kK183C-K290C-vc0101和EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101 SSC兩者經測定之第一熔融轉變(Tm1)皆>65℃(表46)。一併考量這些結果證明，經建構之半胱胺酸1.1-(kK183C-K94R-K290C)抗體為熱穩定的，且經由vc連接子部位專一性接合0101產生具有良好熱穩定性之接合物。
Figure 109127593-A0101-12-0225-258
25.4.2 1.1-kK183C-K290C抗體及對應之部位專一性耳抑素0101接合物之完整性
實施非還原性Caliper毛細管膠體電泳(Caliper LabChip GXII：Perkin Elmer Waltham,MA)分析以測定1.1-kK183C-K290C抗體和對應之vc0101部位專一性接合物的純度與完整性。結果顯示半胱胺酸建構之1.1-kK183C-K290C抗體展現良好的完整性，%IgG為>96%，且類似的部位專一性接合物製劑含有<8%的斷裂ADC。1.1-kK183C-K290C-vc0101部位專一性接合物之完整性高於使用替代方法(即粒徑排阻層析法對疏水性交互作用層析法)純化之EDB-(kK183C-K94R-K290C)-vc0101觀察到的完整性，並且相對於使用習知接合方法製備的ADC(即 EDB-L19-vc-0101)有顯著改善(如表47所示)。這些結果支持，經由分別在IgG1和κ恆定區上之經建構之半胱胺酸K290C和K183C的部位專一性接合所產出之ADC，與使用抗體恆定區內之內源性半胱胺酸之習知接合方法所製備者相比，具有顯著改善之完整性。
Figure 109127593-A0101-12-0226-259
25.5.1.1-kK183C-K290C-vc0101之藥物動力學(PK)
向馬來猴IV推注投予劑量6或12mg/kg之部位專一性接合1.1-κK183C+K290C-vc0101 ADC後，測定其暴露。使用配體結合檢定(LBA)測量總抗體(總Ab；接合Ab和未接合Ab的測量值)和ADC(至少接合一個藥物分子的Ab)的濃度。
總Ab和1.1-κK183C+K290C-vc0101部位專一性ADC之濃度對時間曲線和藥物動力學/毒物動力學係如表48所示。1.1-κK183C+K290C-vc0101 ADC的暴露大致依劑量依賴方式增加。
另外，κK183C+K290C-vc0101 ADC的暴露與在本文中所述曲妥珠單抗部位專一性接合物T(kK183C+K290C) 類似且可相比，當與習知接合的ADC相比，其暴露與穩定性兩者皆增加(表44)。
Figure 109127593-A0101-12-0227-260
Figure 109127593-A0101-12-0228-261
Figure 109127593-A0101-12-0229-262
Figure 109127593-A0101-12-0229-263
Figure 109127593-A0101-12-0230-264
Figure 109127593-A0101-12-0231-265
本發明在以上個別部分中提及的各種特徵和實施例，可在經必要修正之後(mutatis mutandis)，視情況適用於其他部分。因此，在一個部分中闡明的特徵可與其他部分中闡明的特徵視情況合併。此處之所有引證文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書、及引證序列編號)以及該等引證文獻中所引證之文獻，整體以引用方式併入本文中。若一或多篇該等納入文獻及類似材料與本申請案有不同或衝突之處，包括但不限於經定義之用語、用語之使用、經描述之技術或該類似物，以本申請案為主。
<110> 美商輝瑞股份有限公司(Pfizer Inc.)
<120> 用於部位專一性接合之抗體和抗體片段
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<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 1
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<213> 人工序列
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<223> 合成建構體
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 26
Figure 109127593-A0101-12-0265-324
Figure 109127593-A0101-12-0266-326
Figure 109127593-A0101-12-0267-327
<210> 27
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 27
Figure 109127593-A0101-12-0267-328
Figure 109127593-A0101-12-0268-329
Figure 109127593-A0101-12-0269-330
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 28
Figure 109127593-A0101-12-0269-331
Figure 109127593-A0101-12-0270-332
Figure 109127593-A0101-12-0271-333
<210> 29
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 29
Figure 109127593-A0101-12-0271-334
Figure 109127593-A0101-12-0272-335
<210> 30
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 30
Figure 109127593-A0101-12-0273-336
Figure 109127593-A0101-12-0274-337
Figure 109127593-A0101-12-0275-338
<210> 31
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 31
Figure 109127593-A0101-12-0275-339
Figure 109127593-A0101-12-0276-340
<210> 32
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 32
Figure 109127593-A0101-12-0276-341
Figure 109127593-A0101-12-0277-342
Figure 109127593-A0101-12-0278-343
<210> 33
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 33
Figure 109127593-A0101-12-0279-344
Figure 109127593-A0101-12-0280-345
<210> 34
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 34
Figure 109127593-A0101-12-0280-346
Figure 109127593-A0101-12-0281-347
Figure 109127593-A0101-12-0282-348
<210> 35
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 35
Figure 109127593-A0101-12-0282-349
Figure 109127593-A0101-12-0283-350
Figure 109127593-A0101-12-0284-351
<210> 36
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 36
Figure 109127593-A0101-12-0284-352
Figure 109127593-A0101-12-0285-353
Figure 109127593-A0101-12-0286-354
<210> 37
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 37
Figure 109127593-A0101-12-0286-355
Figure 109127593-A0101-12-0287-356
Figure 109127593-A0101-12-0288-358
<210> 38
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 38
Figure 109127593-A0101-12-0288-359
Figure 109127593-A0101-12-0289-360
Figure 109127593-A0101-12-0290-361
<210> 39
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 39
Figure 109127593-A0101-12-0290-362
Figure 109127593-A0101-12-0291-363
<210> 40
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 40
Figure 109127593-A0101-12-0292-364
Figure 109127593-A0101-12-0293-365
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 41
Figure 109127593-A0101-12-0294-366
<210> 42
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 42
Figure 109127593-A0101-12-0294-367
Figure 109127593-A0101-12-0295-368
<210> 43
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 43
Figure 109127593-A0101-12-0296-369
<210> 44
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 44
Figure 109127593-A0101-12-0296-370
Figure 109127593-A0101-12-0297-371
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 45
Figure 109127593-A0101-12-0297-372
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 46
Figure 109127593-A0101-12-0298-373
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 47
Figure 109127593-A0101-12-0298-374
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 48
Figure 109127593-A0101-12-0298-375
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 49
Figure 109127593-A0101-12-0298-376
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 50
Figure 109127593-A0101-12-0299-377
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 51
Figure 109127593-A0101-12-0299-378
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 52
Figure 109127593-A0101-12-0299-379
<210> 53
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 53
Figure 109127593-A0101-12-0299-380
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 54
Figure 109127593-A0101-12-0300-381
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 55
Figure 109127593-A0101-12-0300-382
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 56
Figure 109127593-A0101-12-0300-383
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 57
Figure 109127593-A0101-12-0300-384
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be Gly or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be Ala,Gly,Pro,or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be Ala,Gly,Lys,Pro,or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be Gly,Lys or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be Lys or absent
<400> 58
Figure 109127593-A0101-12-0301-385
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acids or absent
<400> 59
Figure 109127593-A0101-12-0302-386
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 60
Figure 109127593-A0101-12-0302-387
<210> 61
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 61
Figure 109127593-A0101-12-0302-388
Figure 109127593-A0101-12-0303-389
<210> 62
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 62
Figure 109127593-A0101-12-0303-390
Figure 109127593-A0101-12-0304-391
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 63
Figure 109127593-A0101-12-0304-392
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 64
Figure 109127593-A0101-12-0305-393
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 65
Figure 109127593-A0101-12-0305-394
Figure 109127593-A0101-12-0306-395
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 66
Figure 109127593-A0101-12-0306-396
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 67
Figure 109127593-A0101-12-0306-397
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 68
Figure 109127593-A0101-12-0307-398
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 69
Figure 109127593-A0101-12-0307-399
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 70
Figure 109127593-A0101-12-0307-400
<210> 71
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 71
Figure 109127593-A0101-12-0307-401
Figure 109127593-A0101-12-0308-402
Figure 109127593-A0101-12-0309-403
<210> 72
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 72
Figure 109127593-A0101-12-0310-404
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 73
Figure 109127593-A0101-12-0310-405
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 74
Figure 109127593-A0101-12-0310-406
Figure 109127593-A0101-12-0311-408
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 75
Figure 109127593-A0101-12-0311-409
<210> 76
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 76
Figure 109127593-A0101-12-0311-410
Figure 109127593-A0101-12-0312-411
<210> 77
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 77
Figure 109127593-A0101-12-0312-412
Figure 109127593-A0101-12-0313-413
Figure 109127593-A0101-12-0314-414
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 78
Figure 109127593-A0101-12-0314-416
Figure 109127593-A0101-12-0315-417
<210> 79
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 79
Figure 109127593-A0101-12-0315-418
Figure 109127593-A0101-12-0316-419
<210> 80
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 80
Figure 109127593-A0101-12-0316-420
<210> 81
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 81
Figure 109127593-A0101-12-0316-422
Figure 109127593-A0101-12-0317-423
<210> 82
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 82
Figure 109127593-A0101-12-0317-424
Figure 109127593-A0101-12-0318-425
<210> 83
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 83
Figure 109127593-A0101-12-0318-426
Figure 109127593-A0101-12-0319-428
<210> 84
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成建構體
<400> 84
Figure 109127593-A0101-12-0319-429

Claims (17)

  1. 一種與HER2結合之抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中(i)該重鏈包含重鏈恆定區和重鏈可變區，且(ii)該輕鏈包含輕鏈恆定區和輕鏈可變區，且其中：
    (1)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：2、3及4之3個CDR；
    (2)該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：17、5、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39；
    (3)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：8、9及10之3個CDR；且
    (4)該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：41、11或43，
    唯當該重鏈恆定區係SEQ ID NO：5時，該輕鏈恆定區不是SEQ ID NO：11。
  2. 如請求項1之抗體，其包含：
    (a)SEQ ID NO：17之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：41之該輕鏈恆定區；
    (b)SEQ ID NO：5之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：41之該輕鏈恆定區；
    (c)SEQ ID NO：17之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (d)SEQ ID NO：21之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (e)SEQ ID NO：23之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (f)SEQ ID NO：25之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (g)SEQ ID NO：27之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (h)SEQ ID NO：23之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：41之該輕鏈恆定區；
    (i)SEQ ID NO：25之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：41之該輕鏈恆定區；
    (j)SEQ ID NO：27之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：41之該輕鏈恆定區；
    (k)SEQ ID NO：29之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (l)SEQ ID NO：31之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (m)SEQ ID NO：33之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：43之該輕鏈恆定區；
    (n)SEQ ID NO：35之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (o)SEQ ID NO：37之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；
    (p)SEQ ID NO：39之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：11之該輕鏈恆定區；或
    (q)SEQ ID NO：13之該重鏈恆定區和SEQ ID NO：43之該輕鏈恆定區。
  3. 如請求項1之抗體，其包含：
    (a)SEQ ID NO：18、6、14、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40之該重鏈；和
    (b)SEQ ID NO：42、12或44之該輕鏈，
    唯當該重鏈係SEQ ID NO：6時，該輕鏈不是SEQ ID NO：12。
  4. 如請求項3之抗體，其包含：
    (a)SEQ ID NO：18之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕鏈；
    (b)SEQ ID NO：6之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕鏈；
    (c)SEQ ID NO：18之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (d)SEQ ID NO：22之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (e)SEQ ID NO：24之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (f)SEQ ID NO：26之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (g)SEQ ID NO：28之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (h)SEQ ID NO：24之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕鏈；
    (i)SEQ ID NO：26之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕 鏈；
    (j)SEQ ID NO：28之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕鏈；
    (k)SEQ ID NO：30之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (l)SEQ ID NO：32之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (m)SEQ ID NO：34之該重鏈和SEQ ID NO：44之該輕鏈；
    (n)SEQ ID NO：36之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (o)SEQ ID NO：38之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；
    (p)SEQ ID NO：40之該重鏈和SEQ ID NO：12之該輕鏈；或
    (q)SEQ ID NO：14之該重鏈和SEQ ID NO：44之該輕鏈。
  5. 如請求項4之抗體，其包含SEQ ID NO：18之該重鏈和SEQ ID NO：42之該輕鏈。
  6. 一種抗體藥物接合物(ADC)，其包含如請求項1至5中任一項之抗體。
  7. 如請求項6之ADC，其具有式Ab-(L-D)，其中：
    (a)Ab係該抗體；且
    (b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係連接子且D係藥物。
  8. 如請求項7之ADC，其中該連接子係可切割者。
  9. 如請求項7之ADC，其中該連接子係選自由vc、mc、MalPeg6、m(H20)c及m(H20)cvc所組成之群組。
  10. 如請求項9之ADC，其中該連接子係vc。
  11. 如請求項6至10中任一項之ADC，其中該藥物具膜穿透性。
  12. 如請求項6至11中任一項之ADC，其中該藥物係耳抑素(auristatin)。
  13. 如請求項12之ADC，其中該耳抑素係選自由下列所組成之群組：
    (i)2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
    (ii)2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
    (iii)2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1- {(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺三氟乙酸鹽；
    (iv)2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-側氧基-3-苯基丙-2-基]胺基}-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
    (v)2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
    (vi)2-甲基-L-脯胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺三氟乙酸鹽；
    (vii)N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；
    (viii)N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-羥基-1-苯基丙-2-基]胺基}-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺；及
    (ix)N-甲基-L-纈胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯基乙基]胺基}1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基丙基]吡咯啶-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺，或
    (x)彼等任一之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
  14. 如請求項13之ADC，其中該耳抑素係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物。
  15. 一種具有式Ab-(L-D)之抗體藥物接合物(ADC)，其中：
    (a)Ab係與HER2結合之抗體且包含重鏈和輕鏈，該重鏈包含SEQ ID NO：18且該輕鏈包含SEQ ID NO：42；且
    (b)L-D係連接子-藥物部分，其中L係vc之連接子且D係2-甲基丙胺醯基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-側氧基-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]胺基}丙基]吡咯啶-1-基}-5-甲基-1-側氧基庚-4-基]-N-甲基-L-纈胺醯胺或彼之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物之耳抑素。
  16. 一種醫藥組成物，其包含：
    (1)如請求項1至5中任一項之抗體或如請求項6至15中任一項之抗體藥物接合物(ADC)；和
    (2)醫藥上可接受之載劑。
  17. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或如請求項6至15中任一項之抗體藥物接合物(ADC)於製備藥物之用途，該藥物係用於治療個體之癌症。
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